CN117209565A - Cd56特异性结合多肽及其在病毒载体改造和基因治疗中的应用 - Google Patents
Cd56特异性结合多肽及其在病毒载体改造和基因治疗中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了CD56特异性结合多肽及其在病毒载体改造和基因治疗中的应用，属于生物技术领域。NK细胞作为主要的抗病毒细胞，其被病毒侵染的效率一直偏低。CD56是NK细胞的常见表型标记物，本发明筛选获得多个与CD56特异性结合的多肽，并用分子生物学的手段将这些结合CD56的多肽整合到AAV病毒衣壳蛋白的表面，获得工程化改造的AAV。细胞侵染实验证明，工程化改造的AAV可以高效、特异性地侵染NK细胞。实际应用中，这些多肽可以用于开发新型病毒载体，以高效侵染和改造NK细胞；另一方面，这些多肽改造的工程化AAV为开发在体内靶向NK细胞的基因疗法创造了可能。
Description
技术领域
本发明涉及CD56特异性结合多肽及其在病毒载体改造和基因治疗中的应用，属于生物技术领域。
背景技术
自然杀伤细胞(NK细胞)是一类特殊的免疫细胞，主要是在机体抵御感染和控制肿瘤生长方面发挥重要作用。NK细胞具有自发性杀伤活性，可以直接识别并杀伤病变细胞，而无需预先识别特定抗原。科学家们已经开展了许多基于NK细胞改造的细胞疗法，通过基因工程在NK细胞表面引入特殊的配体、受体或识别特定靶点的抗体，旨在增强NK细胞的杀伤能力、增加其活性和持久性，以更有效地对抗肿瘤。
常规的NK细胞疗法涉及收集、处理原代NK细胞或NK细胞系，在体外使用基因工程技术(包括腺病毒、逆转录病毒、慢病毒、AAV等)来引入特定外源基因，使改造的NK细胞具备更广泛的抗肿瘤靶向性，然后将改造的NK细胞扩增后输入病人体内杀灭肿瘤。尽管通过体外改造NK细胞的疗法在临床应用中取得了一定的成功，但它存在一些缺陷和挑战。首先，NK细胞作为主要的防御性抗病毒细胞，多数病毒对其感染的效率都比较低，体外改造往往采用转染能力较强的逆转录病毒(retrovirus)或慢病毒(lentivirus)，以较大的MOI计量，并且采用特殊的辅助试剂(如RetroNectin或Vectofusin-1等)来实现可接受的转染效率，但这些因素都提高了细胞改造的成本，并增加了治疗潜在的安全风险。其次，体外改造NK细胞还面临细胞获取的限制，细胞质量和数量的限制，以及细胞操控和改造的复杂性等问题，这些因素都增加了NK细胞治疗的成本，使其成为一种大多数医疗机构都无法完成的医疗手段。
相比于体外改造NK细胞，如果能在体内直接改造NK细胞，将实现多种理论优势。首先，体内治疗避免了体外培养和扩增NK细胞的复杂过程，简化了治疗流程并提高了操作的便利性。其次，在人体的血液循环系统中直接改造NK细胞，可以实现工程化NK细胞在整个体内范围内的广泛分布，从而更有效地靶向肿瘤细胞，这种全身性的分布可使改造的NK细胞更好地适应肿瘤异质性和转移性的特点，增加治疗效果。从理论上讲，静脉注射高效识别NK细胞的AAV(腺相关病毒)，是实现体内NK细胞工程化改造的理想方法。AAV是一类非致病的单链DNA病毒，属于侵染人类和其他哺乳动物的常见病毒，其在自然界中具有高度的稳定性和广泛的细胞感染性，能够有效地传递基因到目标细胞中。重要的是，不同于腺病毒和逆转录病毒，AAV在实现外源基因持久表达的同时，不会引起明显的病理反应，具有良好的安全性。这些独特的特性为AAV用于基因治疗提供了许多优势，并在基因治疗中被广泛应用。
常规AAV侵染NK细胞的效率非常低，要实现用AAV在体对NK细胞进行基因改造，关键在于如何获得能够高效和特异性侵染NK细胞的AAV病毒衣壳，即获得具有NK细胞靶向性的AAV。之前有科学家采用在AAV表面引入抗体，用以识别细胞表面标志蛋白的方法，增加AAV针对特殊细胞类型的靶向性(Eichhoff AM et al.2019Molecular Therapy-Methods&Clinical Development 211-220)。但由于抗体体积巨大，往往对AAV的病毒衣壳的结构造成不可控的改变，不适合病毒的大规模生产，其巨大的体积也会增加AAV的免疫原性，更容易造成免疫反应，因此AAV工程领域倾向于寻找更小的可以靶向AAV的元件。相比于抗体，多肽可以通过特定的序列和空间构型与靶标分子相互结合，形成稳定的配体-受体复合物。这种特异性结合可以实现对特定靶标的高亲和力和选择性，从而使AAV能够更精确地靶向到特定组织、器官或细胞表面的受体。此外，多肽体积远小于抗体，对AAV的生产包装过程影响较低，并且具有较低的免疫原性和毒性风险，更容易被机体代谢和清除，减少了不良反应的可能性。总之，其较小的体积、灵活性、特异性结合能力以及可定制化的特点，使得多肽成为一种有前景的实现AAV药物靶向性的策略。
CD56又称神经细胞粘附分子1(NCAM1)，是一种膜结合蛋白，属于免疫球蛋白超家族。在免疫学领域，CD56通常被认为是自然杀伤(NK)细胞的标志蛋白，因为它广泛表达于NK细胞的细胞表面。从理论上讲，只要找到对CD56具有高亲和力的特异性结合肽，就能够通过在病毒(如腺病毒、逆转录病毒、AAV等)外壳表面插入这些CD56特异性结合肽，增强这些病毒对NK细胞的靶向特异性，进而增强这些病毒侵染NK细胞的能力，降低体外改造NK细胞时对病毒滴度的要求，甚至免除对转染增强试剂的依赖。更进一步，通过静脉注射表面带有CD56特异性结合肽的AAV，将目的基因在人体的血液内直接递送到NK细胞，就有可能实现在体内直接改造NK细胞的目标。
如何找到CD56特异性结合多肽是实现病毒对NK细胞靶向性的关键。到目前为止，除了抗体以及较大的蛋白配体(例如Hongxing Huang等人报道的Natein蛋白Immunobiology 2020,225 151982)，尚未见到特异性结合CD56的短肽被报道。
发明内容
为解决包括AAV在内的多种天然病毒侵染NK细胞的效率过低且缺乏特异性的问题，本发明提供了多种可以特异性结合NK细胞表面标志蛋白CD56的多肽，以及这些多肽在基因治疗中的潜在应用,目的在于提高AAV等病毒载体对NK细胞的侵染效率和识别特异性。本发明的多肽片段有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与NK细胞相关的基础医学研究、生物学研究，以及细胞治疗等多个领域。
本发明的第一个目的是提供一种CD56特异性结合多肽，所述CD56特异性结合多肽为以下任一种：
(1)SEQ ID NO.1-9任一项所示的序列，或与其同源性不低于85％的序列；
(2)含有(1)中任一序列且长度为8-22个氨基酸的序列。
进一步地，含有(1)中任一序列且长度为8-22个氨基酸的序列为：如SEQ IDNO.10-12所示的氨基酸序列，或与其同源性不低于85％的序列。
本发明的第二个目的是提供编码上述CD56特异性结合多肽的核酸。
本发明的第三个目的是提供携带上述CD56特异性结合多肽的重组载体。
进一步地，所述载体可为病毒载体或非病毒载体。
进一步地，本发明提供一种携带上述CD56特异性结合多肽的重组AAV病毒。
本发明的第四个目的是提供含有上述CD56特异性结合多肽的细胞。
进一步地，所述细胞可为动物细胞、植物细胞、真菌、细菌等。
本发明的第五个目的是提供一种提高载体侵染自然杀伤细胞能力的方法，对所述载体进行改造使其携带上述CD56特异性结合多肽。
进一步地，所述载体可为病毒载体或非病毒载体。
进一步地，所述非病毒载体包括但不限于脂质体、纳米颗粒等药物递送载体。
进一步地，病毒类型包括但不限于AAV，腺病毒(adenovirus)，逆转录病毒(retrovirus)，慢病毒(lentivirus)，痘苗病毒，麻疹病毒，单纯疱疹病毒HSV，水泡性口炎病毒VSV，甲病毒或alpha病毒，流感病毒等，通过插入突变或替换突变，在病毒衣壳表面引入CD56特异性结合多肽，使病毒载体获得高效侵染高表达CD56的NK细胞的能力。
进一步地，AAV可以是包括AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV12,AAV843,AAVbb2,AAVcyS,AAVrh10,AAVrh20,AAVrh39,AAVrh43,AAVrh64,AAVhu37,AAV3B,AAVhu48,AAVhu43,AAVhu44,AAVhu46,AAVhu19,AAVhu20,AAVhu23,AAVhu22,AAVhu24,AAVhu21,AAVhu27,AAVhu28,AAVhu29,AAVhu63,AAVhu64,AAVhu13,AAVhu56,AAVhu57,AAVhu49,AAVhu58,AAVhu34,AAVhu45,AAVhu47,AAVhu51,AAVhu52,AAVhu T41,AAVhu S17,AAVhu T88,AAVhu T71,AAVhu T70,AAVhu T40,AAVhu T32,AAVhu T17,AAVhuLG15,AAVhu9,AAVhu10,AAVhu11,AAVhu53,AAVhu55,AAVhu54,AAVhu7,AAVhu18,AAVhu15,AAVhu16,AAVhu25,AAVhu60,AAVch5,AAVhu3,AAVhu1,AAVhu4,AAVhu2,AAVhu61,AAVrh62,AAVrh48,AAVrh54,AAVrh55,AAVcy2,AAVrh35,AAVrh37,AAVrh36,AAVcy6,AAVcy4,AAVcy3,AAVcy5,AAVrh13,AAVrh38,AAVhu66,AAVhu42,AAVhu67,AAVhu40,AAVhu41,AAVrh40,AAVrh2,AAVbb1,AAVhu17,AAVhu6,AAVrh25,AAVpi2,AAVpi3,AAVrh57,AAVrh50,AAVrh49,AAVhu39,AAVrh58,AAVrh61,AAVrh52,AAVrh53,AAVrh51,AAVhu14,AAVhu31,AAVhu32,AAVrh34,AAVrh33,AAVrh32,Avian AAV ATCC VR-865,Avian AAV strain DA-1,BovineAAV等在内的多种血清型。
进一步地，通过插入突变或替换突变在病毒衣壳表面引入CD56特异性结合多肽，具体地，在病毒衣壳VP蛋白表面的任意loop区插入CD56特异性结合多肽，或用CD56结合特异性多肽替换病毒衣壳VP蛋白表面loop区原有的氨基酸序列。以AAV9 VP1蛋白为例，其编码氨基酸的588，454，498，263等多个位点及其附近氨基酸(或该位点上下游加减五个氨基酸)所处的loop区，以及其他AAV血清型上与这些位点对应的loop区均可。
进一步地，NK细胞包括从机体外周血获得的原代NK细胞，从脐带血经过筛选、诱导和扩增获得的脐带血NK细胞，从诱导多能性干细胞(iPS)或多能造血干细胞(HSCs)经过诱导、扩增得到的NK细胞，也包括体外培养的NK细胞系，如NK92、NKL，KHYG-1，YT，NKG等。获得的工程化改造AAV可以特异性侵染NK原代细胞或NK细胞系，但侵染其他细胞，如Jurkat为例的T细胞系的效率没有明显上升。
本发明的第六个目的是提供一种工程化改造自然杀伤细胞的方法，包括采用携带上述CD56特异性结合多肽的载体(病毒载体或非病毒载体，优选为病毒载体)侵染自然杀伤细胞的步骤，载体上含有用于改造的分子。体内或体外改造均可，优选地，病毒为AAV病毒、逆转录病毒或慢病毒。
本发明的第七个目的是提供上述CD56特异性结合多肽、核酸、重组载体、细胞在制药领域中的应用。
本发明中采用噬菌体展示技术筛选获得多个CD56特异性结合多肽。通过基因改造，我们将这些多肽插入不同AAV的表面，得到工程化改造的AAV可以高效、特异性的侵染CD56高表达的NK细胞。这一工作不但有助于提高多种病毒在体外侵染NK细胞的效率，也为开发用于静脉注射，从体内改造NK细胞的AAV疗法创造了条件。
进一步地，所述药物包括但不限于治疗药物(如抗肿瘤药物)、预防药物、检测药物等。
进一步地，所述药物优选为静脉注射药物。
进一步地，在递送工具上组装CD56特异性结合多肽可在体内或体外靶向NK细胞，实现对NK细胞进行高效的基因改造，特异性激活NK细胞的杀伤能力、增加其活性和持久性。
本发明的有益效果：
1)本发明通过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，成功获得多个与NK细胞表面标志蛋白CD56特异性结合的多肽序列。具体地，利用基于M13噬菌体的7氨基酸多肽展示系统，通过带有人CD56胞外结构域的重组蛋白进行多轮淘选和验证，获得多个结合CD56的7氨基酸多肽。然后将这些7氨基酸肽的序列，或者多个7氨基酸肽的组合序列，通过基因工程插入AAV9衣壳蛋白表面的loop区，获得的工程化AAV具有高效侵染NK细胞系的能力；而相同侵染条件下，这些工程化AAV侵染代表T细胞的Jurkat细胞系的能力没有提高，说明改造的AAV具有NK细胞特异性。进一步实验表明，在不同AAV血清型以及AAV表面不同位点插入这些多肽，都可以提高病毒对NK细胞的侵染效率。
2)本发明的方法有两个重要用途：一方面可以用于提高包括AAV在内的多种病毒对NK细胞的侵染效率，降低在体外对NK细胞或NK细胞系进行基因改造的成本；更重要的是，这种高效特异性侵染NK细胞系的工程化AAV，能够用于在体内直接对循环系统中的NK细胞进行基因改造，为在体的细胞疗法创造了条件，具有潜在的治疗多种疾病的能力。
附图说明
图1-4为生物层干涉法测定展示7氨基酸多肽的噬菌体单克隆与CD56-Hisx6融合蛋白的相互作用。Phd-7肽展示文库经过三轮淘选后，用Gator测定的64(8x 8)个经过扩增的随机克隆与CD56-His探针的相互作用，其中18个克隆表现出快结合和慢解离的结合特性。
图5为FACS显示CD56在NK细胞系NK92上高表达，而在对照的人白血病T淋巴细胞系Jurkat表面表达很少。
图6-10为8种在VP蛋白588位带有CD56结合7肽插入的AAV6重组病毒侵染NK92细胞系的效率均高于野生型AAV6；同样条件下，这些改造的AAV6侵染Jurkat细胞的效率不变或下降。
图11-12为测定4种在VP蛋白588位带有组合多肽插入的AAV6重组病毒侵染NK92和Jurkat细胞系的效率。
图13为AAV6野生型和带有CD56结合多肽的AAV6突变体在相同MOI下平行侵染NK92和Jurkat的效率比较。
图14-15为4种在VP蛋白454位带有组合多肽插入的AAV6重组病毒侵染NK92和Jurkat细胞系的效率。
图16为采用CD56结合多肽改造的AAV9可以高效、特异性侵染NK92细胞系结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1淘选与CD56结合的多肽展示噬菌体
本发明使用的Ph.D.TM-7噬菌体多肽展示文库购自New England Biolabs Inc.(NEB#E8211S)，该文库基于常用的M13噬菌体，并通过基因工程在编码噬菌体衣壳蛋白PIII的N端增加随机的7氨基酸多肽，包装产生的每个噬菌体表面带有5个拷贝突变的pIII蛋白。根据供应商的说明，该文库有1E9种不同多肽序列，每10ul文库中有1E11个噬菌体，是该文库多样性的100倍。
本发明使用的两种带有CD56胞外结构域的融合蛋白均购自三优生物(SanyouInc.)，分别是带有Hisx6标签的CD56-His(Cat#PHA427)，和带有人Fc结构域的CD56-Fc(Cat#PHA426)。
为了获得具有CD56结合特异性的多肽，将400ul 8ug/ml的CD56-Fc融合蛋白与10ul PhD-7噬菌体文库混合，旋转仪上室温旋转1小时；之后加入500ul用PBS-BSA溶液封闭的Protein A MagBeads MX(GeneScript#L00672-4)悬浮液，放旋转仪上室温旋转1h。用PBS洗涤磁珠5次后，加入0.2mL100mM triethylamine(TEA)三乙胺溶液洗脱结合的噬菌体，中和后侵染对数生长期的宿主大肠杆菌K12ER2738，用PEG沉淀法收集扩增的噬菌体。
将第一轮淘选收集的噬菌体扩增收集后，采用同样的方法进行第二轮和第三轮淘选。三轮淘选之后，将TEA洗脱的噬菌体进行稀释，侵染E.coli K12 ER2738后悬浮于加热溶解的Top Agar，随后立刻倒入带有IPTG-X-gal的LB平板，用蓝白斑筛选法挑取噬菌斑用于进一步的分析和测序。
实施例2验证淘选获得的多肽展示噬菌体与CD56重组蛋白的结合
挑取三轮淘选后蓝白斑筛选获得的蓝色单克隆，加入1ml对数生长期的E.coliK12 ER2738菌液中，37℃摇床培养4-5h，离心收集上清，用PEG/NaCl沉淀后，200ul PBS溶解获得噬菌体悬液。
为了验证淘选获得的噬菌体是否带有结合CD56的多肽，使用Gator Prime系统(Gator Bio)v2.7.3.0728(https://www.gatorbio.com/)进行了生物层干涉法(BLI)测定，评估噬菌体颗粒与CD56融合蛋白的结合特异性。具体地，将玻璃anti-His探针(Gator Bio)首先浸入Q缓冲液(Gator Bio)约30秒，得到基线信号。然后，将探针装载8μg/ml稀释于Q缓冲液中的CD56-Hisx6融合蛋白，持续180秒，然后进行30秒的Q缓冲液洗涤步骤。接下来，将结合CD56-Hisx6的探针与扩增回收的噬菌体单克隆溶液结合，持续300秒，然后进行300秒的解离步骤。结合和解离曲线通过GatorPrime(Gator Bio)软件绘制和计算，得出挑取的噬菌体单克隆与CD56-His探针的结合情况。
随机挑取64个噬菌体单克隆进行扩增和结合测定，Gator分析的结果见图1-4。如图所示，64个克隆中有18个在BLI测定中表现出对CD56-His探针的快速结合和较为缓慢的解离，说明其与探针存在一定的特异性相互作用，对这18个噬菌体进行了基因测序，并对获得多肽序列中的8个序列进行了验证，验证如下表所示。
表1CD56结合噬菌体克隆测序获得的8个7肽序列
实施例3用CD56结合多肽对AAV6进行工程化改造
为了找到可以提高NK细胞侵染特异性的片段，将编码表2中多肽的DNA片段分别克隆到AAV6囊膜蛋白的编码基因上。实验采用的质粒pAAV6-Cap6由本公司全合成构建，上面带有编码AAV6 VP蛋白的CAP6基因。根据AAV工程化改造的惯例，首先选择位于AAV6 VP1(Uniprot数据库ID#O56137)蛋白的588-589位点之间进行多肽插入，该位点位于衣壳表面一个突出的loop区。我们设计了带有目的片段的引物，通过同源重组的方法将外源多肽插入588-Ser和589-Thr之间，获得的重组质粒均经过测序和比对验证。
AAV病毒包装采用经典的三质粒转染法。包括1)编码REP-CAP野生型及插入突变基因的表达质粒pAAV6-Cap6-WT、pAAV6-Cap6-RP1、pAAV6-Cap6-RP2、pAAV6-Cap6-RP3、pAAV6-Cap6-RP4、pAAV6-Cap6-RP5、pAAV6-Cap6-RP6、pAAV6-Cap6-RP7、pAAV6-Cap6-RP8，2)编码E4/E2A/VA/L4/L5的辅助质粒pADdeltaF6(Helper plasmid)，3)编码带有CAG启动子的EGFP报告基因的转移质粒pAV-CAG(transfer plasmid)，三种质粒等比例混合后，转染在带有10％FBS的DMEM培养基中贴壁培养的HEK-293细胞，72小时后收集细胞培养上清，室温3000g离心10分子以去除细胞碎片，之后用0.22um的过滤器过滤除菌。样品中病毒滴度采用qPCR方法测定，检测所用上游引物为fwd ITR primer：5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT，检测所用下游引物为rev ITR primer：5'-CGGCCTCAGTGAGCGA。
实施例4测定多肽改造的重组病毒侵染NK细胞的效率
高表达CD56的人NK细胞系NK92购自上海细胞库，作为对照的人白血病T淋巴细胞系Jurkat购自南京科佰生物技术公司，细胞培养均在含有5％二氧化碳的37℃培养箱中进行，并采用供应商提供的定制培养基。细胞转染之前，我们分别用PE荧光标记的抗人CD56单克隆抗体(Biolegend#318306)和Alexa Fluor 700荧光标记的抗人CD3单克隆(BD#557917)对两个细胞系进行染色，然后用流式细胞技术(FACS)分析细胞表面标志蛋白的含量，并用FlowJo分析结果。结果显示，NK92细胞表面CD56的表达量很高，符合NK细胞系的特征，而对照的Jurkat细胞只有少量细胞有低水平的CD56表达(图5)。
经过验证的Jurkat和NK92细胞分别培养至对数生长期，细胞计数后将细胞转移至6孔板培养皿中，每孔细胞数100,000个，向其中加入含有3E8 vg的AAV病毒悬液，以控制每孔的感染复数(MOI,multiplicity of infection)为3E3。将侵染中的细胞在37℃培养72小时，离心收集细胞，采用流式细胞仪测定EGFP荧光信号，并用FlowJo分析结果(图6-10)。
在3E3的MOI下，AAV6野生型及多肽插入突变侵染NK92和Jurkat细胞系的效率总结如表2所示。
表2野生型及带有7肽插入的工程化改造AAV6侵染Jurkat细胞系和NK92细胞系的效率
结果显示，野生型AAV6侵染NK92的效率非常低，在3E3的MOI下，仅有0.8％的NK92细胞表达EGPF荧光，这也与已知的NK细胞系难以被AAV侵染相一致；相比而言，野生型AAV6侵染Jurkat的效率较好，在3E3的MOI下，大约9.9％的Jurkat细胞表达EGFP荧光。
在8种带有CD56结合多肽插入的工程化AAV6突变体中，每个突变病毒侵染NK92细胞系的效率均较野生型有不同程度的升高，其中带有RP8(ILKMSRR)插入的突变体AAV6-588-RP8、带有RP1(RTKNTHR)插入的突变体AAV6-588-RP1、以及带有RP2(LRITRTM)插入的突变体AAV6-588-RP2，它们侵染NK92的效率较野生型AAV6升高12-15倍，均达到了10％以上；其他克隆也较野生型AAV6升高了3-9倍，说明本发明的CD56结合多肽有助于AAV6高效侵染NK细胞系。另一方面，这些突变体侵染Jurkat细胞的效率和野生型AAV6相比均没有升高，说明CD56结合多肽插入带来的侵染效率提高与细胞表面CD56高表达有关，具有NK细胞特异性。
值得注意的是，无论在588位点插入哪种多肽，工程化AAV突变体侵染Jurkat细胞的效率均出现显著下降，相比于野生型AAV6高达9.9％的侵染效率，同等感染复数(MOI)下插入突变的侵染效率均未超过4％。
实施例5用多肽组合对AAV6进行工程化改造并测定病毒侵染NK细胞的效率
由于筛选获得的CD56结合多肽序列各不相同，我们猜测这些多肽结合CD56蛋白的表位也不相同，从理论上讲，如果将不同肽段组合插入AAV表面，可能进一步提高病毒侵染NK细胞的效率。为了验证这种猜测，我们进一步分析了筛选得到的18种7氨基酸多肽，根据序列相似性进行了组合，拼接出了4种新的组合多肽，其长度从9-11氨基酸不等，组合多肽的序列如下表3所示。
表3组合多肽序列
| 编号 | 序列组合多肽序列 | SEQ ID |
| CP9 | RNRNLRMMMIS | SEQ ID NO.9 |
| CP10 | STQIHIRRKRP | SEQ ID NO.10 |
| CP11 | LSKKMMMHR | SEQ ID NO.11 |
| CP12 | ILKMSRRSLHL | SEQ ID NO.12 |
采用同样的方法，将编码这些组合多肽的核苷酸序列克隆到AAV6病毒衣壳VP蛋白588-589位点之间，用三质粒法包装重组AAV，并且在相同的侵染倍数(MOI＝3E3)下侵染NK92和Jurkat细胞，侵染结果如图11-12所示。
结果显示，带有组合多肽的AAV6突变体，它们侵染NK92细胞的效率进一步提高，特别是带有组合肽CP12(ILKMSRRSLHL)的插入突变侵染NK92的效率达到30.0％，相比同条件下野生型0.8％的侵染效率提高了300倍以上。另一方面，这些在588位带有组合多肽的AAV侵染Jurkat细胞的效率并没有升高，再次说明多肽插入带来的高效侵染有NK细胞特异性。
将8种筛选获得的7肽和4种组合多肽改造的AAV6的侵染效率与野生型AAV6做了比较，结果整理如图13。结果显示，CD56结合多肽或多肽组合改造的AAV侵染NK92细胞系的效率均显著升高，而它们侵染Jurkat细胞的效率未见升高或显著下降。
实施例5在不同位点插入CD56结合多肽改造AAV6并测定病毒侵染NK细胞的效率
为了检验CD56结合肽提高AAV6侵染NK细胞的作用是否为588位点特异性，我们在病毒衣壳表面的454位点进行了同样的组合多肽插入。454位点位于病毒衣壳表面另一个突出的loop区。通过基因改造，在编码AAV6病毒VP衣壳蛋白分子的454位分别插入CD56结合7肽RP1(RTKNTHR)、RP2(LRITRTM)或组合肽CP11(LSKKMMMHR)、CP12(ILKMSRRSLHL)，以此包装了四种新的工程化AAV6重组病毒。我们进一步检测这些改造病毒侵染NK92和Jurkat细胞系的效率，并与同条件下野生型AAV6的侵染结果作比较，结果如图14-15所示。
结果显示，同样的多肽插入AAV6的454位点也能显著提高病毒侵染NK细胞的效率，而同条件下侵染Jurkat细胞的效率没有升高。此外，在病毒的另一个loop区(263位点)进行了类似的插入突变，结果显示这些多肽都能特异性地提高病毒侵染NK92细胞系的能力(结果未展示)。这说明CD56结合多肽、或多肽组合提高病毒侵染NK细胞系的能力由多肽本身序列决定，只要其能够在AAV表面正常展示，就能够提高病毒对CD56高表达NK细胞的侵染效率。
实施例6用多肽对AAV9进行工程化改造并测定该AAV9的侵染NK细胞的效率
为了检验CD56结合多肽能否提高其他AAV血清型侵染NK细胞的能力，我们用基因工程的手段，将CD56结合肽RP1(RTKNTHR)和组合肽CP12(ILKMSRRSLHL)分别插入AAV9病毒衣壳(Uniprot数据库ID#Q6JC40)的588位点，获得了两种工程化改造的AAV9血清型。采用同样的侵染实验，比较了带有多肽插入的AAV9与野生型AAV9侵染NK92细胞和Jurkat细胞的能力，结果如图16所示。
结果显示，与AAV6相似，野生型AAV9侵染NK细胞的效率也非常低，在3E3的侵染倍数(MOI)下，仅有0.05％的NK92细胞被野生型AAV9侵染。令人惊讶的是，同等MOI下，带有CD56结合肽RP1的AAV9，其侵染NK92细胞的效率达到20.3％，而带有组合肽CP12的AAV9侵染NK92细胞的阳性率更是超过了30％，升高的比率均超过300倍。同样的条件下，这两种突变AAV9侵染Jurkat细胞的效率仅较野生型AAV9提高了2-3倍。
以上结果说明，本发明报道的CD56结合多肽或者这些多肽的组合，可以提高不同AAV血清型侵染NK细胞的效率。从理论上讲，这些多肽结合CD56的能力可以用于改造各种病毒类基因递送工具(包括AAV、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒等)和非病毒类基因递送工具(包括脂质体、纳米颗粒等)，通过增加细胞表面标志蛋白CD56的结合，显著提高基因改造NK细胞的效率。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种CD56特异性结合多肽，其特征在于，所述CD56特异性结合多肽为以下任一种：
(1)SEQ ID NO.1-9任一项所示的序列，或与其同源性不低于85％的序列；
(2)含有(1)中任一序列且长度为8-22个氨基酸的序列。
2.根据权利要求1所述的CD56特异性结合多肽，其特征在于，含有(1)中任一序列且长度为8-22个氨基酸的序列为：SEQ ID NO.10-12所示的氨基酸序列，或与其同源性不低于85％的序列。
3.编码权利要求1或2所述CD56特异性结合多肽的核酸。
4.携带权利要求1或2所述CD56特异性结合多肽的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述载体为病毒载体或非病毒载体。
6.含有权利要求1或2所述CD56特异性结合多肽的细胞。
7.一种提高载体侵染自然杀伤细胞能力的方法，其特征在于，对所述载体进行改造使其携带权利要求1或2所述CD56特异性结合多肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当载体为病毒载体时，通过插入突变或替换突变在病毒衣壳蛋白表面引入CD56特异性结合多肽。
9.一种工程化改造自然杀伤细胞的方法，其特征在于，采用携带权利要求1或2所述CD56特异性结合多肽的载体侵染自然杀伤细胞，所述载体上含有用于改造的分子。
10.权利要求1或2所述CD56特异性结合多肽、权利要求3所述核酸、权利要求4或5所述重组载体、或权利要求6所述细胞在制药领域中的应用。
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