CN102905517A

CN102905517A - 基因开关组合物及使用方法

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Publication number: CN102905517A
Application number: CN2011800202455A
Authority: CN
Inventors: J.方; W.J.戈登-凯姆; K.S.罗; K.E.麦克布里德; B.麦戈尼格尔; C.西蒙斯
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc; EIDP Inc
Priority date: 2010-04-23
Filing date: 2011-04-14
Publication date: 2013-01-30
Also published as: US20140243203A1; WO2011133387A1; AU2011243085A1; AR080938A1; MX2012012211A; RU2012149891A; BR112012027150A2; US20110287936A1; ZA201207449B; EP2560473A1; CA2796670A1

Abstract

本发明提供了涉及使用磺酰脲类介导的基因表达控制的组合物和方法。组合物包括磺酰脲类响应化学开关，其中所述基因表达受磺酰脲类化合物的调控。组合物也包括编码多肽的多核苷酸、以及构建体、载体、原核和真核细胞、和真核生物，所述真核生物包括包含所述多核苷酸、和/或通过所述方法产生的植物和种子。也提供了调控细胞或生物中受关注的多核苷酸表达的方法、以及改变基因组的方法，包括植物或植物细胞中的基因组。

Description

基因开关组合物及使用方法

以电子方式提交的序列表参考

所述序列表的正式文本经由EFS-Web以电子方式提交，它是ASCII格式的序列表，文件名为403014seqlist.txt，创建于20 11年4月12日，并且大小为1.36MB，与所述说明书同时提交。在这一ASCII格式的文件中包含的序列表为所述说明书的部分并且全文以引用方式并入本文。

发明领域

本发明涉及分子生物学领域，更具体地讲涉及基因表达的调控。

发明背景

四环素操纵子系统包含阻遏物和操纵子元件，其最初从细菌中分离得到。所述操纵子系统受到存在的四环素的严格控制，并且自身调控tetA和tetR基因的表达水平。tetA的产物从细胞中除去四环素。tetR的产物为结合至操纵子元件的阻遏物，在不存在四环素的情况下K_d为约10pM，从而阻止tetA和tetR的表达。

已经修改了这个系统以控制其它受关注的多核苷酸的表达，和/或用于其它生物中(主要用于动物系统中)。基于Tet的操纵子系统已经在植物中具有有限的用途，这至少部分地为由于诱导剂的问题，其通常为抗生素化合物，并且对光敏感。

需要调控生物质受关注的序列的表达。提供了基因开关组合物及响应化合物如磺酰脲类化合物调控表达的方法。

发明概述

提供了涉及使用磺酰脲类介导的基因表达控制的组合物和方法。组合物包括磺酰脲类响应化学开关，其中所述基因表达受磺酰脲类化合物的调控。组合物也包括编码多肽的多核苷酸、阻抑型启动子、以及构建体、载体、原核和真核细胞、和生物，包括包含任何组分、和/或通过任何方法产生的植物、植物细胞和种子。也提供了调控细胞或生物中受关注的多核苷酸表达的方法、以及改变基因组(包括植物或植物细胞中的基因组)的方法。

本发明包括以下实施方案。

1.用于调控植物中或种子中包含的植物细胞中的表达的方法，所述方法包括：

(a)提供包含磺酰脲类调控的基因开关的植物细胞，所述基因开关控制受关注的多核苷酸的表达，其中所述植物细胞为耐磺酰脲类植物细胞；以及；

(b)提供调控所述基因开关的磺酰脲类化合物，其中所述磺酰脲类化合物通过叶施用、灌根施用、出苗前施用、出苗后施用、或种子处理施用来提供。

2.实施方案1的方法，其中所述受关注的多核苷酸的表达改变所述植物细胞的表型。

3.实施方案1或2的方法，其中所述受关注的多核苷酸的表达改变所述植物细胞的基因型。

4.实施方案1-3中任一项的方法，其中提供所述磺酰脲类化合物激活所述受关注的多核苷酸的表达。

5.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。

6.实施方案5的方法，其中所述植物细胞来自玉米、稻、高粱、甘蔗、大麦、燕麦、小麦、草坪草、大豆、低芥酸菜籽、棉、烟草、向日葵、红花、或苜蓿。

7.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述磺酰脲类调控的基因开关包含可操作地连接至受关注的多核苷酸的阻抑型启动子，其中所述阻抑型启动子包含tet操纵子。

8.实施方案1-7中任一项的方法，其中所述磺酰脲类调控的基因开关包含选自SEQ ID NO：855、856、857、858、859和860的阻抑型启动子、或与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的阻抑型启动子。

9.实施方案1-8中任一项的方法，其中所述磺酰脲类化合物包括嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、或噻唑基脲类化合物。

10.实施方案9的方法，其中所述磺酰脲类化合物包括氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、或砜嘧磺隆。

11.实施方案1-10中任一项的方法，其中所述受关注的多核苷酸编码特异性地结合至靶核酸序列的多肽。

12.实施方案11的方法，其中所述多肽为重组酶、整合酶、核酸酶、归巢内切核酸酶、或锌指核酸酶。

13.实施方案1-12中任一项的方法，其中所述磺酰脲类调控的基因开关包含磺酰脲类反应性阻遏物，其包含SEQ ID NO：3-419中任一种的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：3-419中的任一种具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。

14.磺酰脲类调控的基因开关控制受关注的多核苷酸的表达，其中所述受关注的多核苷酸编码特异性地结合DNA序列的多肽，或编码切割DNA序列的多肽。

15.实施方案14的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述编码的多肽为重组酶、整合酶、核酸酶、归巢内切核酸酶、或锌指核酸酶。

16.实施方案14或15的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述磺酰脲类基因开关包含磺酰脲类反应性阻遏物，其中所述磺酰脲类反应性阻遏物可操作地连接至在所述植物中有活性的启动子，其中所述启动子为组成型启动子、组织优选的启动子、发育阶段优选的启动子、诱导型启动子、或阻抑型启动子。

17.实施方案16的磺酰脲类调控的基因开关，其中

(a)所述组成型启动子为MTH启动子、EF1a启动子、PIP启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、或35S CaMV启动子；

(b)所述组织优选的启动子为分生组织优选的启动子、胚芽优选的启动子、叶优选的启动子、根优选的启动子、花药优选的启动子、花粉优选的启动子、或花优选的启动子；

(c)所述发育阶段优选的启动子为早期胚芽启动子、晚期胚芽启动子、发芽优选的启动子、或衰老优选的启动子；

(d)所述诱导型启动子为化学物质诱导型启动子、病原体诱导型启动子、热应激启动子、干旱胁迫启动子、光诱导型启动子、渗压剂诱导型启动子、或金属诱导型启动子；或者，

(e)所述阻抑型启动子为四环素阻抑型启动子、或乳糖阻抑型启动子。

18.实施方案16或17的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述受关注的多核苷酸或所述磺酰脲类反应性阻遏物可操作地连接至包含至少一种四环素操纵子序列的阻抑型启动子。

19.实施方案18的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述阻抑型启动子为组成型启动子、组织优选的启动子、或发育阶段优选的启动子。

20.实施方案19的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述阻抑型启动子为35S CaMV启动子、肌动蛋白启动子、EF1A启动子、MMV启动子、dMMV启动子、MP1启动子、或BSV启动子。

21.实施方案20的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述阻抑型启动子包含如SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862中所示的多核苷酸序列、或与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的多核苷酸序列。

22.实施方案16的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述磺酰脲类反应性阻遏物包含SEQ ID NO：3-419中任一种的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：3-419中的任一种具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。

23.转基因植物、转基因植物细胞、或转基因种子，其包含实施方案14-22中任一项的磺酰脲类调控的基因开关。

24.实施方案23的转基因植物、转基因植物细胞、或转基因种子，其中所述转基因植物、所述转基因植物细胞、或所述转基因种子来自单子叶植物或双子叶植物。

25.实施方案24的转基因植物、转基因植物细胞、或转基因种子，其中所述单子叶植物或双子叶植物来自玉米、稻、高粱、甘蔗、大麦、燕麦、小麦、草坪草、大豆、低芥酸菜籽、棉、烟草、向日葵、红花、或苜蓿。

26.重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含阻抑型启动子，其中所述阻抑型启动子在植物细胞中是有活性的，并且所述阻抑型启动子包括可操作地连接至至少一种操纵子序列的肌动蛋白启动子、EF1A启动子、MMV启动子、dMMV启动子、MP1启动子、或BSV启动子。

27.实施方案26的重组多核苷酸，其中所述阻抑型启动子包含如SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862中所示的多核苷酸序列、或与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的多核苷酸序列。

28.用于调控细胞中的表达的方法，所述方法包括：

(a)提供包含受调控的基因开关的细胞，所述基因开关控制受关注的多核苷酸的表达，其中所述基因开关包含实施方案26或27的阻抑型启动子；以及；

(b)提供调控所述基因开关的配体化合物，其中配体化合物包括四环素、磺酰脲类、或它们的任何类似物。

29.重组多核苷酸，其包含可操作地连接至编码磺酰脲类反应性阻遏物的多核苷酸的阻抑型启动子。

30.实施方案29的重组多核苷酸，其中所述编码的磺酰脲类反应性阻遏物包含SEQ ID NO：3-419中任一种的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：3-419中的任一种具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。

31.实施方案29的重组多核苷酸，其中所述阻抑型启动子为可操作地连接至至少一种操纵子序列的肌动蛋白启动子、MMV启动子、dMMV启动子、MP1启动子、或BSV启动子。

32.实施方案29-31中任一项的重组多核苷酸，其中所述阻抑型启动子包含如SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862中所示的多核苷酸序列、或与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的多核苷酸序列。

附图简述

图1：概述了多代磺酰脲类阻遏物改组库的来源多样性、库设计、hit多样性和群偏差。破折号(“-”)指示在该库中的该位点处未导入不同氨基酸。X指示寡核苷酸库设计用于在该库中的该位点处导入全部不同氨基酸(20个氨基酸中的任何一个)。以粗体表示的残基指示在选择期间的偏差，较大的字体指示在选择群中的偏差程度较大。括号中的残基指示选择的突变。系统发育的多样性集合源自34个四环素阻遏物序列的大家族。

图2：例示启动子：操纵子设计。图片A示出在将tet操纵子置于序列中之前和之后的dMMV启动子。图片B示出在将tet操纵子置于序列中之前和之后的EF1A2启动子。

图3：例示在加入tet操纵子之前和之后的启动子活性。每幅图的y-轴为通过荧光素酶测定法测得的相对光照单位。图片A比较35SCaMV启动子+/-tet操纵子。图片B比较MMV启动子+/-tet操纵子。图片C比较EF1A2启动子+/-tet操纵子。图片D比较dMMV启动子+/-tet操纵子。

图4：例示阻遏物和/或配体调控包含tet操纵子的启动子。每幅图的y-轴为通过荧光素酶测定法测得的相对光照单位。

图5：提供了基因开关元件、组合物和组合的实例。Pro指示任何启动子，Pro/Op指示任何阻抑型启动子，POI为受关注的多核苷酸，并且RS指示重组位点。

图6：示例性的自动调控构建体。

图7：瞬时表达的对照和自动调控构建体。

图8：瞬时表达的对照和自动调控构建体。

图9：在烟草的转基因自动调控品系中dsRED活化对胺苯磺隆的剂量响应。

发明详述

化学调控的表达工具已经证明对研究基因功能和多种生物系统中的调控是有价值的。当不能特异性地调控转基因或转基因由于负效应而不能连续表达时，这些系统允许测试受关注的任何基因在培养体系或完整生物体中的表达效应。这些系统本质上提供进行“脉冲”或“脉冲-追踪”基因表达测试的机会。化学开关介导的表达系统允许在活化或灭活靶序列后立即测试基因组学、蛋白质组学、和/或代谢物组学响应。这些类型的测试不能用组成型的、发育的、或组织特异的表达系统来容易地完成。化学开关技术也可提供用于基因治疗的手段。

化学开关系统可在商业上应用，例如用于农业生物技术。对于农业目的，期望能够控制环境中的转基因的表达和/或基因流，例如抗除草剂性基因，尤其在其中靶作物的杂草近亲存在的情况下更是如此。此外，具有活性化学开关机构家族将能够进行单转基因作物的性状目录管理，例如，根据客户需求经由特定化学活化可使用一个生产品系递送选择的性状。此外，使用化学物质控制杂交保持能够流水化杂交种子的生产。

广泛用于动物系统的基于Tet阻遏物(TetR)的基因开关系统已经在植物基因系统中具有有限的使用，这部分是由于活化剂配体的问题。四环素阻遏物已经经重新设计以特异性地识别磺酰脲类化合物而不是四环素化合物，同时保留了特异性的结合四环素操纵子序列的能力。通过基于理性建模的多轮库设计和改组，已经开发出了磺酰脲类反应性阻遏物(SuR)。提供了涉及使用磺酰脲类反应性阻遏物的组合物和方法。

化学开关或基因开关包括两个组件。一个组件包括编码阻遏物的多核苷酸，第二组件包括可操作地连接至受关注的多核苷酸的阻抑型/诱导型启动子。受关注的多核苷酸的表达任选地通过提供合适的化学配体进行控制。阻抑型/诱导型启动子(下文称为阻抑型启动子)包含至少一个操纵子序列，阻遏物多肽特异性地结合至其上，所述阻遏物控制该启动子的转录活性。有用的阻遏物包括在不存在化学配体的情况下特异性地结合操纵子的那些、在化学配体的存在下特异性地结合操纵子的具有逆表型的那些、以及融合到激活因子或结构域上以控制活性的那些。

基因开关的活性可通过选择开关中使用的元件的组合进行控制。这些包括但不限于可操作地连接至阻遏物的启动子、阻遏物、可操作地连接至受关注的多核苷酸的阻抑型启动子、以及任选地受关注的多核苷酸。还通过施用的化学配体的选择、剂量、条件、和/或时间提供控制。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达能够进行较严格的控制、在不同组织或细胞中进行控制、受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中阻遏物可操作地连接至组成型启动子。在一些实例中阻遏物可操作地连接至非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。

在一些实例中基因开关还可包括附加的元件。在一些实例中，一个或多个附加的元件可提供如下手段：通过其受关注的多核苷酸的表达能够进行较严格的控制、在不同组织或细胞中进行控制、受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中那些元件包括位点特异性重组位点、位点特异性重组酶、或它们的组合。

在一些实例中，基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、连接至受关注的多核苷酸的启动子、侧接位点特异性重组位点的序列、和可操作地连接至位点特异性重组酶的阻抑型启动子，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是切除侧接重组位点的序列。在一些实例中，切除产生启动子和受关注的多核苷酸之间可操作的连接。在一些实例中，可操作地连接至受关注的多核苷酸的启动子为非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。

例如基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、连接至受关注的多核苷酸的启动子、侧接位点特异性重组位点的序列、和位点特异性重组酶，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是切除侧接重组位点的序列。在一些实例中，切除产生阻抑型启动子和受关注的多核苷酸之间可操作的连接。在一些实例中，侧接重组位点的序列包含重组酶表达盒。在一些实例中启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、或胚芽中表达。在一些实例中所述切除发生在亲本、细胞、组织、或组织培养物中使得子代遗传切除后的产物。

在一些实例中，基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、可操作地连接至侧接位点特异性重组位点的受关注多核苷酸的启动子、和可操作地连接至位点特异性重组酶的阻抑型启动子，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是切除侧接重组位点的序列。在一些实例中，可操作地连接至受关注的多核苷酸的启动子为非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。

在另一个实例中，基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、连接至受关注的多核苷酸的启动子、侧接位点特异性重组位点的序列、和可操作地连接至位点特异性重组酶的阻抑型启动子，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是倒置侧接重组位点的序列。在一些实例中，倒置产生启动子和受关注的多核苷酸之间可操作的连接。在一些实例中，可操作地连接至受关注的多核苷酸的启动子为非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。在一些实例中所述倒置发生在亲本、细胞、组织、或组织培养物中使得子代遗传倒置后的产物。

例如基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、连接至受关注的多核苷酸的启动子、侧接位点特异性重组位点的序列、和位点特异性重组酶，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是倒置侧接重组位点的序列。在一些实例中，倒置产生阻抑型启动子和受关注的多核苷酸之间可操作的连接。在一些情况下，侧接位点特异性重组位点的序列为受关注的多核苷酸。在一些情况下，侧接位点特异性重组位点的序列为阻抑型启动子。在一些实例中，提供了重组酶表达盒，其中所述重组酶可操作地连接至非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。在一些实例中所述倒置发生在亲本、细胞、组织、或组织培养物中使得子代遗传倒置后的产物。

在一些实例中，基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、可操作地连接至侧接位点特异性重组位点的受关注多核苷酸的启动子、和可操作地连接至位点特异性重组酶的阻抑型启动子，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是倒置侧接重组位点的序列。在一些实例中，可操作地连接至受关注的多核苷酸的启动子为非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。

磺酰脲类反应性阻遏物(SuR)包括任何阻遏物多肽，其与操纵子序列的结合受包含磺酰脲类化合物的配体的控制。在一些实例中，所述阻遏物在不存在磺酰脲类配体的情况下特异性地结合操纵子。在一些实例中，所述阻遏物在存在磺酰脲类配体的情况下特异性地结合操纵子。在存在配体的情况下结合至操纵子的阻遏物有时称为反式阻遏物。在一些实例中组合物包括特异性地结合四环素操纵子的SuR多肽，其中所述特异性地结合受磺酰脲类化合物的调控。在一些实例中组合物包括分离的磺酰脲类阻遏物(SuR)多肽，其包含对野生型四环素阻遏物配体结合域的至少一个氨基酸取代，其中所述SuR多肽或其多聚体特异性地结合包含操纵子序列的多核苷酸，其中阻遏物-操纵子的结合通过存在或不存在磺酰脲类化合物进行调控。在一些实例中，组合物包括包含配体结合域的分离磺酰脲类阻遏物，所述结合域包含对融合到异源操纵子DNA结合域的野生型四环素阻遏物配体结合域的至少一个氨基酸取代，所述异源操纵子DNA结合域特异性地结合包含操纵子序列或其衍生物的多核苷酸，其中阻遏物-操纵子的结合通过存在或不存在磺酰脲类化合物进行调控。可使用任何操纵子DNA结合域，包括但不限于来自阻遏物的操纵子DNA结合域，包括tet、lac、trp、phd、arg、LexA、phiCh1阻遏物、lambda C1和Cro阻遏物、噬菌体X阻遏物、MetJ、phirltrro、phi434 C1和Cro阻遏物、RafR、gal、ebg、uxuR、exuR、ROS、SinR、PurR、FruR、P22C2、TetC、AcrR、Betl、Bm3R1、EnvR、QacR、MtrR、TcmR、Ttk、YbiH、YhgD和mu Ner、或Interpro家族中的DNA结合域，包括但不限于IPR001647、IPR010982和IPR011991。

在一些实例中组合物包括分离的磺酰脲类阻遏物(SuR)多肽，其包含对野生型四环素阻遏物的至少一个氨基酸取代，其中所述SuR多肽或其多聚体特异性地结合包含四环素操纵子序列的多核苷酸，其中阻遏物-操纵子的结合通过存在或不存在磺酰脲类化合物进行调控。

野生型阻遏物包括四环素类A、B、C、D、E、G、H、J和Z阻遏物。发现TetR(A)类的一个实例在Tn1721转座子上并且以GenBank登录号X61307保藏，以gi48198交叉引用，具有编码蛋白登录号CAA43639，以gi48195和UniProt登录号Q56321交叉引用。发现TetR(B)类的一个实例在Tn10转座子上并且以GenBank登录号X00694保藏，以gi43052交叉引用，具有编码蛋白登录号CAA25291，以gi43052和UniProt登录号P04483交叉引用。发现TetR(C)类的一个实例在pSC101质粒上并且以GenBank登录号M36272保藏，以gi150945交叉引用，具有编码蛋白登录号AAA25677，以gi150946交叉引用。发现TetR(D)类的一个实例在奥道奈兹沙门氏菌(Salmonella ordonez)中and dep并且以GenBank登录号X65876保藏，以gi49073交叉引用，具有编码蛋白登录号CAA46707，以gi49075和UniProt登录号P0ACT5及P09164交叉引用。发现TetR(E)类的一个实例分离自大肠杆菌转座子Tn10并且以GenBank登录号M34933保藏，以gi155019交叉引用，具有编码蛋白登录号AAA98409，以gi155020交叉引用。发现TetR(G)类的一个实例分离自鳗弧菌(Vibrio anguillarium)并且以GenBank登录号S52438保藏，以gi262928交叉引用，具有编码蛋白登录号AAB24797，以gi262929交叉引用。发现TetR(H)类的一个实例在分离自多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)的质粒pMV111上并且以GenBank登录号U00792保藏，以gi392871交叉引用，具有编码蛋白登录号AAC43249，以gi392872交叉引用。发现TetR(J)类的一个实例分离自奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)并且以GenBank登录号AF038993保藏，以gi4104704交叉引用，具有编码蛋白登录号AAD12754，以gi4104706交叉引用。发现TetR(Z)类的一个实例在分离自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的质粒pAGI上并且以GenBank登录号AF121000保藏，以gi4583389交叉引用，具有编码蛋白登录号AAD25064，以gi4583390交叉引用。在一些实例中野生型四环素阻遏物为B类四环素阻遏物。在一些实例中野生型四环素阻遏物为D类四环素阻遏物。

在一些实例中磺酰脲类阻遏物(SuR)多肽包含在野生型四环素阻遏物的配体结合域中的一个氨基酸取代。在B和D类野生型TetR蛋白中，氨基酸残基6-52代表DNA结合域。残留的蛋白质涉及配体结合和随后的变构。对于B类TetR，残基53-207代表配体结合域，而残基53-218包含D类TetR的配体结合域。在一些实例中SuR多肽包含在野生型TetR(B)蛋白的配体结合域中的一个氨基酸取代。在一些实例中SuR多肽包含在野生型TetR(B)蛋白SEQ ID NO：1的配体结合域中的一个氨基酸取代。

在一些实例中分离的SuR多肽包含一个氨基酸或氨基酸的任何组合，其对应于选自如图1中所示的氨基酸多样性的等同氨基酸位点，其中如图1中所示的氨基酸残基位点对应于野生型TetR(B)的氨基酸编号。在一些实例中，分离的SuR多肽包含配体结合域，其包含至少10％，20％，30％，40％，50％，55％，60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的如图1中所示的氨基酸残基，其中所述氨基酸残基位点对应于使用野生型TetR(B)的氨基酸编号的等同位点。在一些实例中，分离的SuR多肽包含至少10％，20％，30％，40％，50％，55％，60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的如图1中所示的氨基酸残基，其中所述氨基酸残基位点对应于使用野生型TetR(B)的氨基酸编号的等同位点。在一些实例中野生型TetR(B)为SEQ ID NO：1。

在一些实例中分离的SuR多肽包含配体结合域，其包含在某一残基位点处的氨基酸取代，所述残基位点选自位点55、60、64、67、82、86、100、104、105、108、113、116、134、135、138、139、147、151、170、173、174、177和它们的任何组合，其中所述氨基酸残基位点和取代对应于使用野生型TetR(B)的氨基酸编号的等同位点。在一些实例中分离的SuR多肽还包含在选自109、112、117、131、137、140、164和它们的任何组合的残基位点处的氨基酸取代。在一些实例中野生型TetR(B)为SEQ ID NO：1。

在一些实例中分离的SuR多肽具有与如SEQ ID NO：1的氨基酸残基53-207所例示的野生型TetR(B)的配体结合域至少约50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比对方法经配体结合域的全长进行测定。在一些实例中全序列比对方法使用GAP算法和BLOSUM62计分矩阵，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和Length Weight 2。

在一些实例中分离的SuR多肽具有与如SEQ ID NO：1例示的野生型TetR(B)至少约50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比对方法经多肽的全长进行测定。在一些实例中全序列比对方法使用GAP算法和BLOSUM62计分矩阵，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和Length Weight2。

组合物包括分离的SuR多肽，其具有与选自SEQ ID NO：3-419的SuR多肽的配体结合域至少约50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比对方法经配体结合域的全长进行测定。在一些实例中全序列比对方法使用GAP算法和BLOSUM62计分矩阵，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAPWeight 8和Length Weight 2。

在一些实例中，分离的SuR多肽具有与选自SEQ ID NO：3-419的SuR多肽至少约50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比对方法经多肽的全长进行测定。在一些实例中全序列比对方法使用GAP算法和BLOSUM62计分矩阵，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和Length Weight2。

在一些实例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能够与L7-1A04(SEQ IDNO：220)、L1-22(SEQ ID NO：7)、L1-29(SEQ ID NO：10)、L1-02(SEQ IDNO：3)、L1-07(SEQ ID NO：4)、L1-20(SEQ ID NO：6)、L1-44(SEQ IDNO：13)、L6-3A09(SEQ ID NO：402)、L6-3H02(SEQ ID NO：94)、L7-4E03(SEQ ID NO：403)、L10-84(B12)(SEQ ID NO：404)、或L13-46(SEQID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少200、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、或750的BLAST二进制值(bit score)，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)的多肽序列进行最佳比对以产生至少374的BLAST二进制值、与L1-22(SEQ ID NO：7)的多肽序列进行最佳比对以产生至少387的BLAST二进制值、与L1-29(SEQ ID NO：10)的多肽序列进行最佳比对以产生至少393的BLAST二进制值、与L1-07(SEQ ID NO：4)的多肽序列进行最佳比对以产生至少388的BLAST二进制值、与L6-3A09(SEQ ID NO：402)的多肽序列进行最佳比对以产生至少381的BLAST二进制值、与L7-4E03(SEQ ID NO：403)的多肽序列进行最佳比对以产生至少368的BLAST二进制值、或与L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少320的BLAST二进制值，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)、L1-22(SEQ ID NO：7)、L1-29(SEQ ID NO：10)、L1-02(SEQ ID NO：3)、L1-07(SEQ ID NO：4)、L1-20(SEQ ID NO：6)、L1-44(SEQ ID NO：13)、L6-3A09(SEQ ID NO：402)、L6-3H02(SEQ ID NO：94)、L7-4E03(SEQ IDNO：403)、L10-84(B12)(SEQ ID NO：404)、或L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性通过BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1进行测定。在一些实例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)的多肽序列进行最佳比对以产生至少88％的序列同一性、与L1-22(SEQ ID NO：7)的多肽序列进行最佳比对以产生至少92％的序列同一性、与L1-07(SEQ ID NO：4)的多肽序列进行最佳比对以产生至少93％的序列同一性、与L1-20(SEQ ID NO：6)的多肽序列进行最佳比对以产生至少93％的序列同一性、与L1-44(SEQID NO：13)的多肽序列进行最佳比对以产生至少93％的序列同一性、与L6-3H02(SEQ ID NO：94)的多肽序列进行最佳比对以产生至少90％的序列同一性、与L10-84(B12)(SEQ ID NO：404)的多肽序列进行最佳比对以产生至少86％的序列同一性、或与L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少86％的序列同一性，其中所述序列同一性通过BLAST比对利用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1进行测定。在一些实例中使用全序列比对方法利用GAP算法和BLOSUM62计分矩阵测定百分比同一性，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和Length Weight 2。在一些实例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能够与L7-1A04(SEQ IDNO：220)、L1-22(SEQ ID NO：7)、L1-29(SEQ ID NO：10)、L1-02(SEQ IDNO：3)、L1-07(SEQ ID NO：4)、L1-20(SEQ ID NO：6)、L1-44(SEQ IDNO：13)、L6-3A09(SEQ ID NO：402)、L6-3H02(SEQ ID NO：94)、L7-4E03(SEQ ID NO：403)、L10-84(B12)(SEQ ID NO：404)、或L13-46(SEQID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、750、800、850、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、或1200的BLAST相似性评分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能够与L1-29(SEQ ID NO：10)的多肽序列进行最佳比对以产生至少1006的BLAST相似性评分、与L1-07(SEQ ID NO：4)的多肽序列进行最佳比对以产生至少996的BLAST相似性评分、与L6-3A09(SEQ ID NO：402)的多肽序列进行最佳比对以产生至少978的BLAST相似性评分、与L7-4E03(SEQ ID NO：403)的多肽序列进行最佳比对以产生至少945的BLAST相似性评分、或与L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少819的BLAST相似性评分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)、L1-22(SEQ ID NO：7)、L1-29(SEQ ID NO：10)、L1-02(SEQ ID NO：3)、L1-07(SEQ ID NO：4)、L1-20(SEQ ID NO：6)、L1-44(SEQ ID NO：13)、L6-3A09(SEQ ID NO：402)、L6-3H02(SEQ ID NO：94)、L7-4E03(SEQ IDNO：403)、L10-84(B12)(SEQ ID NO：404)、或L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-60、e-70、e-75、e-80、e-85、e-90、e-95、e-100、e-105、e-106、e-107、e-108、e-109、e-110、e-111、e-112、e-113、e-114、e-115、e-116、e-117、e-118、e-119、e-120、或e-125的BLAST e-值评分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中SuR多肽包含氨基酸序列，其能够与L1-02(SEQ ID NO：3)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-112的BLAST e-值评分、与L1-07(SEQ ID NO：4)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-111的BLAST e-值评分、与L1-20(SEQ ID NO：6)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-111的BLAST e-值评分、与L6-3A09(SEQ ID NO：402)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-108的BLAST e-值评分、与L7-4E03(SEQ ID NO：403)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-105的BLAST e-值评分、或与L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-90的BLAST e-值评分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中所述多肽选自SEQ ID NO：3-419。

在一些实例中分离的SuR多肽包含配体结合域，其来自选自SEQ IDNO：3-419的多肽。在一些实例中分离的SuR多肽包含选自SEQ IDNO：3-419的氨基酸序列。在一些实例中分离的SuR多肽选自SEQ IDNO：3-419，并且磺酰脲类化合物选自氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆和噻吩磺隆。

在一些实例中分离的SuR多肽具有对磺酰脲类化合物大于0.1nM和小于10μM的平衡结合常数。在一些实例中分离的SuR多肽具有对磺酰脲类化合物至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM但是小于10μM的平衡结合常数。在一些实例中分离的SuR多肽具有对磺酰脲类化合物至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM但是小于1μM的平衡结合常数。在一些实例中分离的SuR多肽具有对磺酰脲类化合物大于0nM、但是小于0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM或10μM的平衡结合常数。在一些实例中所述磺酰脲类化合物是氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、砜嘧磺隆和/或噻吩磺隆。

在一些实例中分离的SuR多肽具有对操纵子序列大于0.1nM和小于10μM的平衡结合常数。在一些实例中分离的SuR多肽具有对操纵子序列至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM但是小于10μM的平衡结合常数。在一些实例中分离的SuR多肽具有对操纵子序列至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM但是小于1μM的平衡结合常数。在一些实例中分离的SuR多肽具有对操纵子序列大于0nM、但是小于0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM或10μM的平衡结合常数。在一些实例中所述操纵子序列为Tet操纵子序列。在一些实例中所述Tet操纵子序列为TetR(A)操纵子序列、TetR(B)操纵子序列、TetR(D)操纵子序列、TetR(E)操纵子序列、TetR(H)操纵子序列、或它们的功能衍生物。

分离的SuR多肽特异性地结合磺酰脲类化合物。磺酰脲类分子包含磺酰脲部分(-S(O)2NHC(O)NH(R)-)。在磺酰脲类除草剂中，磺酰脲部分的磺酰基端直接或通过氧原子或任选取代的氨基或亚甲基连接至通常取代的环状或无环的基团上。在磺酰脲桥基对面的末端，氨基(其可能具有取代基如甲基(R为CH3)代替氢)连接至杂环基团上，通常为对称的嘧啶或三嗪环，具有一个或两个取代基如甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基和卤素。磺酰脲类除草剂可为游离酸或盐的形式。在游离酸形式中，桥基上的磺酰胺氮不是去质子化的(即，-S(O)2NHC(O)NH(R)-)，而在盐形式中，桥基上的磺酰胺氮是去质子化的(即，-S(O)2NC(O)NH(R)-)，并且存在阳离子，通常为碱金属或碱土金属阳离子，最常见的为钠或钾的阳离子。磺酰脲类化合物包括例如以下类的化合物：如嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、噻唑基脲类化合物和药品如抗糖尿病药物，以及它们的盐和其它衍生物。嘧啶基磺酰脲类化合物的实例包括酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、氯嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、氯吡嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺胺磺隆、烟嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、氟嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆和它们的盐及衍生物。三嗪基磺酰脲类化合物的实例包括氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、胺苯磺隆、碘磺隆、甲基碘磺隆、甲磺隆、甲磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、噻磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆、氟胺磺隆、三氟甲磺隆和它们的盐及衍生物。噻唑基脲类化合物的实例包括丁噻隆、磺噻隆、特丁噻草隆、噻氟隆、噻苯隆和它们的盐及衍生物。抗糖尿病药物的实例包括乙酰苯磺酰环己脲、氯磺丙脲、甲糖宁、甲磺氮草脲、格列甲嗪、格列齐特、格列本脲(优降糖)、格列喹酮、格列美脲和它们的盐及衍生物。在一些实例中分离的SuR多肽特异性地结合多于一种的磺酰脲类化合物。在一些实例中磺酰脲类化合物选自氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、噻磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆和砜嘧磺隆。

组合物还包括编码SuR多肽的分离多核苷酸，所述SuR多肽特异性地结合四环素操纵子，其中所述特异性地结合受磺酰脲类化合物的调控。在一些实例中分离的多核苷酸编码磺酰脲类阻遏物(SuR)多肽，其包含在野生型四环素阻遏物的配体结合域中的氨基酸取代。在B和D类野生型TetR蛋白中，氨基酸残基6-52代表DNA结合域。残留的蛋白质涉及配体结合和随后的变构。对于B类TetR，残基53-207代表配体结合域，而残基53-218包含D类TetR的配体结合域。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含在野生型TetR(B)蛋白的配体结合域中的氨基酸取代。在一些实例中多核苷酸编码SuR多肽，其包含在SEQ ID NO：1的野生型TetR(B)蛋白的配体结合域中的氨基酸取代。

在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，所述多肽包含选自如图1中所示的氨基酸多样性的一个氨基酸或氨基酸的任何组合，其中所述氨基酸残基位点对应于使用例示为SEQ ID NO：1的野生型TetR(B)的氨基酸编号的等同位点。在一些实例中，分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含配体结合域，其包含至少10％，20％，30％，40％，50％，55％，60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的如图1中所示的氨基酸残基，其中所述氨基酸残基位点对应于使用野生型TetR(B)的氨基酸编号的等同位点。在一些实例中，分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含至少10％，20％，30％，40％，50％，55％，60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的如图1中所示的氨基酸残基，其中所述氨基酸残基位点对应于使用野生型TetR(B)的氨基酸编号的等同位点。在一些实例中野生型TetR(B)为SEQ ID NO：1。

在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含配体结合域，所述配体结合域包含在某一残基位点处的氨基酸取代，所述残基位点选自位点55、60、64、67、82、86、100、104、105、108、113、116、134、135、138、139、147、151、170、173、174、177和它们的任何组合，其中所述氨基酸残基位点和取代对应于使用野生型TetR(B)的氨基酸编号的等同位点。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，所述多肽还包含在残基位点处的氨基酸取代，所述残基位点选自109、112、117、131、137、140、164以及它们的任何组合。在一些实例中野生型TetR(B)多肽序列为SEQ ID NO：1。

在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其具有与如SEQ IDNO：1的氨基酸残基53-207所示的配体结合域至少约50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比对方法经配体结合域的全长进行测定。在一些实例中全序列比对方法是GAP和BLOSUM62计分矩阵，其中所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和Length Weight 2。

在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其具有与SEQ IDNO：1至少约50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比对方法经多肽的全长进行测定。在一些实例中全序列比对方法是GAP和BLOSUM62计分矩阵，其中所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和Length Weight 2。

在一些实例中分离的多核苷酸包括在严格杂交条件下选择性杂交编码SuR多肽的多核苷酸的核酸序列。选择性杂交的多核苷酸是与对非靶序列的杂交相比，对靶序列的结合水平为背景至少2倍的多核苷酸。严格条件是序列依赖性的和条件依赖性的。典型的严格条件是其中盐浓度为约0.01至1.0M，pH 7.0-8.3，温度为30℃，用于短探针(例如10-50个核苷酸)，或约60℃，用于长探针(例如大于50个核苷酸)。严格条件可包括甲酰胺或其它去稳定剂。示例性的中等严格条件包括在37℃于40-45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在55-60℃下用0.5×至1×SSC洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃于50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，以及在60-65℃用0.1×SSC洗涤。

特异性受到杂交后洗涤条件的影响，通常经由离子强度和温度来影响。对于DNA-DNA杂交体，T_m可以用Meinkoth & Wahl(1984)AnalBiochem 138：267-284的公式计算出近似的：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M为单价阳离子的体积摩尔浓度，％GC为DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form为杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L为以碱基对表示的杂交体的长度。对核酸杂交的详尽指导可在见于下列文献：Tijssen，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic AcidProbes，第I部分，第2章“Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays”，Elsevier，New York(1993)；以及Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，GreenePublishing and Wiley-Interscience，New York(1995)。在一些实例中，编码SuR多肽的分离的多核苷酸在中等严格条件或高等严格条件下特异性地杂交SEQ ID NO：420-836的多核苷酸。

在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含氨基酸序列，其能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)、L1-22(SEQ ID NO：7)、L1-29(SEQ IDNO：10)、L1-02(SEQ ID NO：3)、L1-07(SEQ ID NO：4)、L1-20(SEQ IDNO：6)、L1-44(SEQ ID NO：13)、L6-3A09(SEQ ID NO：402)、L6-3H02(SEQID NO：94)、L7-4E03(SEQ ID NO：403)、L10-84(B12)(SEQ ID NO：404)、或L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少200、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、或750的BLAST二进制值(bit score)，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含的氨基酸序列能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)的多肽序列进行最佳比对以产生至少374的BLAST二进制值、与L1-22(SEQ ID NO：7)的多肽序列进行最佳比对以产生至少387的BLAST二进制值、与L1-29(SEQ IDNO：10)的多肽序列进行最佳比对以产生至少393的BLAST二进制值、与L1-07(SEQ ID NO：4)的多肽序列进行最佳比对以产生至少388的BLAST二进制值、与L6-3A09(SEQ ID NO：402)的多肽序列进行最佳比对以产生至少381的BLAST二进制值、与L7-4E03(SEQ ID NO：403)的多肽序列进行最佳比对以产生至少368的BLAST二进制值、或与L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少320的BLAST二进制值，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含的氨基酸序列能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)、L1-22(SEQID NO：7)、L1-29(SEQ ID NO：10)、L1-02(SEQ ID NO：3)、L1-07(SEQ IDNO：4)、L1-20(SEQ ID NO：6)、L1-44(SEQ ID NO：13)、L6-3A09(SEQ IDNO：402)、L6-3H02(SEQ ID NO：94)、L7-4E03(SEQ ID NO：403)、L10-84(B12)(SEQ ID NO：404)、或L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性通过BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1进行测定。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含的氨基酸序列能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)的多肽序列进行最佳比对以产生至少88％的序列同一性、与L1-22(SEQ ID NO：7)的多肽序列进行最佳比对以产生至少92％的序列同一性、与L1-07(SEQ IDNO：4)的多肽序列进行最佳比对以产生至少93％的序列同一性、与L1-20(SEQ ID NO：6)的多肽序列进行最佳比对以产生至少93％的序列同一性、与L1-44(SEQ ID NO：13)的多肽序列进行最佳比对以产生至少93％的序列同一性、与L6-3H02(SEQ ID NO：94)的多肽序列进行最佳比对以产生至少90％的序列同一性、与L10-84(B 12)(SEQ ID NO：404)的多肽序列进行最佳比对以产生至少86％的序列同一性、或与L13-46(SEQ IDNO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少86％的序列同一性，其中所述序列同一性通过BLAST比对利用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1进行测定。在一些实例中使用全序列比对方法利用GAP算法和BLOSUM62计分矩阵测定百分比同一性，所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和LengthWeight 2。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含的氨基酸序列能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)、L1-22(SEQ ID NO：7)、L1-29(SEQ ID NO：10)、L1-02(SEQ ID NO：3)、L1-07(SEQ ID NO：4)、L1-20(SEQ ID NO：6)、L1-44(SEQ ID NO：13)、L6-3A09(SEQ ID NO：402)、L6-3H02(SEQ ID NO：94)、L7-4E03(SEQ ID NO：403)、L10-84(B12)(SEQ IDNO：404)、或L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、600、750、800、850、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1100、1110、1120、1130、1140、1150、1160、1170、1180、1190、或1200的BLAST相似性评分，其中BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含的氨基酸序列能够与L1-29(SEQ ID NO：10)的多肽序列进行最佳比对以产生至少1006的BLAST相似性评分、与L1-07(SEQ IDNO：4)的多肽序列进行最佳比对以产生至少996的BLAST相似性评分、与L6-3A09(SEQ ID NO：402)的多肽序列进行最佳比对以产生至少978的BLAST相似性评分、与L7-4E03(SEQ ID NO：403)的多肽序列进行最佳比对以产生至少945的BLAST相似性评分、或与L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少819的BLAST相似性评分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中分离的多核苷酸编码SUR多肽，其包含的氨基酸序列能够与L7-1A04(SEQ ID NO：220)、L1-22(SEQ ID NO：7)、L1-29(SEQID NO：10)、L1-02(SEQ ID NO：3)、L1-07(SEQ ID NO：4)、L1-20(SEQ IDNO：6)、L1-44(SEQ ID NO：13)、L6-3A09(SEQ ID NO：402)、L6-3H02(SEQID NO：94)、L7-4E03(SEQ ID NO：403)、L10-84(B12)(SEQ ID NO：404)、或L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-60、e-70、e-80、e-85、e-90、e-95、e-100、e-105、e-106、e-107、e-108、e-109、e-110、e-111、e-112、e-113、e-114、e-115、e-116、e-117、e-118、e-119、e-120、或e-125的BLAST e-值评分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含的氨基酸序列能够与L1-02(SEQID NO：3)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-112的BLAST e-值评分、与L1-07(SEQ ID NO：4)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-111的BLAST e-值评分、与L1-20(SEQ ID NO：6)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-111的BLAST e-值评分、与L6-3A09(SEQ ID NO：402)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-108的BLAST e-值评分、与L7-4E03(SEQ ID NO：403)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-105的BLAST e-值评分、或与L13-46(SEQ ID NO：405)的多肽序列进行最佳比对以产生至少e-90的BLAST e-值评分，其中所述BLAST比对使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1。在一些实例中分离的多核苷酸编码选自SEQ ID NO：3-419的多肽。在一些实例中分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：420-836的多核苷酸序列或其互补多核苷酸。

在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含的配体结合域来自选自SEQ ID NO：3-419的多肽。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽，其包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO：3-419。在一些实例中编码的SuR多肽选自SEQ ID NO：3-419，并且磺酰脲类化合物选自氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆和噻磺隆。在一些实例中分离的多核苷酸包含SEQ ID NO：420-836的多核苷酸序列或其互补多核苷酸。

在一些实例中分离的SuR多核苷酸编码SuR多肽，其具有对磺酰脲类化合物大于0.1nM和小于10μM的平衡结合常数。在一些实例中编码的SuR多肽具有对磺酰脲类化合物至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM但是小于10μM的平衡结合常数。在一些实例中编码的SuR多肽具有对磺酰脲类化合物至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM但是小于1μM的平衡结合常数。在一些实例中编码的SuR多肽具有对磺酰脲类化合物大于0nM、但是小于0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM或10μM的平衡结合常数。在一些实例中所述磺酰脲类化合物为氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆和/或噻吩磺隆化合物。

在一些实例中分离的SuR多核苷酸编码SuR多肽，其具有对操纵子序列大于0.1nM和小于10μM的平衡结合常数。在一些实例中编码的SuR多肽具有对操纵子序列至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM但是小于10μM的平衡结合常数。在一些实例中编码的SuR多肽具有对操纵子序列至少0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM但是小于1μM的平衡结合常数。在一些实例中编码的SuR多肽具有对操纵子序列大于0nM、但是小于0.1nM、0.5nM、1nM、10nM、50nM、100nM、250nM、500nM、750nM、1μM、5μM、7μM或10μM的平衡结合常数。在一些实例中所述操纵子序列为Tet操纵子序列。在一些实例中tet操纵子序列为TetR(A)操纵子序列、TetR(B)操纵子序列、TetR(D)操纵子序列、TetR(E)操纵子序列、TetR(H)操纵子序列或它们的功能衍生物。在一些实例中分离的多核苷酸编码SuR多肽、重组酶、或受关注的性状，其包含密码子组成特征，代表特定宿主细胞或宿主细胞细胞器的密码子优选要求。在一些实例中分离的多核苷酸包含原核生物优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含细菌优选的密码子。在一些实例中所述细菌为大肠杆菌或农杆菌属。在一些实例中分离的多核苷酸包含质体优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含真核生物优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含核优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含植物优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含单子叶植物优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含玉米、稻、高粱、大麦、小麦、裸麦、柳枝稷、甘蔗、草坪草和/或燕麦优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含双子叶植物优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含大豆、向日葵、红花、芸苔属、苜蓿、拟南芥属、烟草属植物和/或棉优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含酵母优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含哺乳动物优选的密码子。在一些实例中分离的多核苷酸包含昆虫优选的密码子。

组合物也包括与编码SuR多肽、表达盒、复制子、载体、T-DNA、DNA库、宿主细胞、组织和/或生物的多核苷酸完全互补的分离的多核苷酸，所述生物包含编码SuR多肽的多核苷酸和/或互补序列或衍生物。在一些实例中所述多核苷酸稳定地掺入宿主细胞、组织和/或生物的基因组。在一些实例中所述宿主细胞为原核生物细胞，包括大肠杆菌和农杆菌属菌株。在一些实例中所述宿主为真核生物，包括例如酵母、昆虫、植物和哺乳动物。

也提供了包含至少一个操纵子序列的阻抑型启动子。从这些启动子开始的表达受结合所述操纵子序列的阻遏物的控制，其中阻遏物与操纵子的结合受存在或不存在化学配体的调控。在一些实例中，阻抑型启动子包含至少一个tet操纵子序列。阻遏物包括tet阻遏物和磺酰脲类调控的阻遏物。tet阻遏物与tet操纵子的结合受四环素化合物及其类似物的调控。磺酰脲类反应性阻遏物与tet操纵子的结合受磺酰脲类化合物及其类似物的控制。在一些实例中，所述阻抑型启动子包含tet操纵子序列，其位于TATA框的5’或3’0-30个核苷酸的范围内。在一些实例中，tet操纵子序列位于TATA框的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0nt范围内。在一些实例中tet操纵子序列可与TATA框序列部分重叠。在一些实例中tet操纵子序列为SEQ ID NO：848。在一些实例中所述启动子在植物细胞中有活性。在一些实例中所述启动子为组成型启动子。在其它实例中所述启动子为非组成型启动子。在一些实例中所述非组成型启动子为组织优选的启动子。在一些实例中组织优选的启动子主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种子、胚乳、或胚芽中表达。在一些实例中所述启动子为植物肌动蛋白启动子、香蕉条纹病毒启动子(BSV)、MMV启动子、增强MMV启动子(dMMV)、植物P450启动子、或延伸因子1a(EF1A)启动子。在一些实例中所述启动子为植物肌动蛋白启动子(SEQ IDNO：849)、香蕉条纹病毒启动子(BSV)(SEQ ID NO：850)、紫茉莉花叶病毒启动子(MMV)(SEQ ID NO：851)、增强MMV启动子(dMMV)(SEQ IDNO：852)、植物P450启动子(MP1)(SEQ ID NO：853)、或延伸因子1a(EF1A)启动子(SEQ ID NO：854)。在一些实例中，所述阻抑型启动子包含两个tet操纵子序列，其中所述第1 tet操纵子序列位于TATA框5’0-30nt范围内，而第2tet操纵子序列位于TATA框3’0-30nt范围内。在一些实例中，第一和/或第二tet操纵子序列位于TATA框的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0nt范围内。在一些实例中第一和/或第二tet操纵子序列可部分地与TATA框序列重叠。在一些实例中所述第一和/或第二tet操纵子序列为SEQ ID NO：848。在一些实例中，阻抑型启动子包含三个tet操纵子序列，其中所述第1tet操纵子序列位于TATA框5’0-30nt范围内，第2tet操纵子序列位于TATA框3’0-30nt范围内，而第3tet操纵子位于转录起始位点(TSS)0-50nt范围内。在一些实例中，第1和/或第2tet操纵子序列位于TATA框的20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0nt范围内。在一些实例中，第3tet操纵子序列位于TSS的50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0nt范围内。在一些实例中第3tet操纵子位于TSS的5’。在一些实例中第3tet操纵子序列可与TSS序列部分重叠。在一些实例中所述第1、第2和/或第3tet操纵子序列为SEQ ID NO：848。在一些实例中所述启动子为植物肌动蛋白启动子(actin/Op)(SEQ ID NO：855)、香蕉条纹病毒启动子(BSV/Op)(SEQ IDNO：856)、紫茉莉花叶病毒启动子(MMV/Op)(SEQ ID NO：857)、增强MMV启动子(dMMV/Op)(SEQ ID NO：858)、植物P450启动子(MP1/Op)(SEQ ID NO：859)、或延伸因子1a(EF1A/Op)启动子(SEQ IDNO：860)。在一些实例中所述启动子包含的多核苷酸序列具有与SEQ IDNO：885、856、857、858、859、或860至少约50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述启动子保留阻抑型启动子的活性。在一个具体实例中，所述启动子包含的多核苷酸序列具有与SEQ ID NO：885、856、857、858、859、或860至少95％的序列同一性，其中所述启动子保留阻抑型启动子的活性。具有“阻抑型启动子活性”的启动子将指导可操作地连接的多核苷酸的表达，其中它指导转录的能力依赖存在或不存在化学配体(即，四环素化合物、磺酰脲类化合物)和阻遏物。

还提供了使用基因开关组合物和/或其元件的方法。在一个实例中，提供了调控宿主细胞中受关注多核苷酸的转录的方法，所述方法包括：提供包含可操作地连接至阻抑型启动子的受关注多核苷酸的细胞，所述启动子包含至少一个四环素操纵子序列；提供SuR多肽并且提供磺酰脲类化合物，从而调控受关注的多核苷酸的转录。可使用任何宿主细胞，包括例如原核细胞如细菌，以及真核细胞，包括酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞。在一些实例中提供所述SuR多肽包括使细胞接触表达盒，所述表达盒包含在细胞中有功能的启动子，其可操作地连接至编码SuR多肽的多核苷酸。在一些实例中使用所述方法以激活受关注的多核苷酸的表达。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达在不同组织或细胞中被激活、受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中受关注的多核苷酸主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在特定时间发生，其包括但不限于种子或植物发育阶段、营养生长阶段、再生阶段、环境条件响应时、害虫或病原体响应时、化合物响应时、或它们的任何组合。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达在不同组织或细胞中被减少、抑制、或阻止，这可能受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中受到抑制。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在特定时间发生抑制，其包括但不限于种子或植物发育阶段、营养生长阶段、再生阶段、环境条件响应时、害虫或病原体响应时、化合物响应时、或它们的任何组合。

在另一个实例中，提供了调控宿主细胞中受关注多核苷酸的转录的方法，所述方法包括：提供包含可操作地连接至阻抑型启动子的受关注多核苷酸的细胞，所述启动子包含至少一个四环素操纵子序列；提供TetR多肽并且提供四环素化合物，从而调控受关注的多核苷酸的转录。在一些实例中所述阻抑型启动子为植物肌动蛋白启动子、香蕉条纹病毒启动子(BSV)、MMV启动子、增强MMV启动子(dMMV)、植物P450启动子、或延伸因子1a(EF1A)启动子。在一些实例中所述启动子为植物肌动蛋白启动子(actin/Op)(SEQ ID NO：855)、香蕉条纹病毒启动子(BSV/Op)(SEQ ID NO：856)、紫茉莉花叶病毒启动子(MMV/Op)(SEQ IDNO：857)、增强MMV启动子(dMMV/Op)(SEQ ID NO：858)、植物P450启动子(MP1/Op)(SEQ ID NO：859)、或延伸因子1a(EF1A/Op)启动子(SEQID NO：860)。在一些实例中所述启动子包含的多核苷酸序列具有与SEQID NO：885、856、857、858、859、或860至少约50％60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述启动子保留阻抑型启动子的活性。在一个具体实例中，所述启动子包含的多核苷酸序列具有与SEQ ID NO：885、856、857、858、859、或860至少95％的序列同一性，其中所述启动子保留阻抑型启动子的活性。

可使用任何宿主细胞，包括例如原核细胞如细菌，以及真核细胞，包括酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞。在一些实例中提供所述TetR多肽包括使细胞接触表达盒，所述表达盒包含在细胞中有功能的启动子，其可操作地连接至编码TetR多肽的多核苷酸。在一些实例中使用所述方法以激活受关注的多核苷酸的表达。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达在不同组织或细胞中被激活、受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中受关注的多核苷酸主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在特定时间发生，其包括但不限于种子或植物发育阶段、营养生长阶段、再生阶段、环境条件响应时、害虫或病原体响应时、化合物响应时、或它们的任何组合。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达在不同组织或细胞中被减少、抑制、或阻止，这可能受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中受到抑制。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在特定时间发生抑制，其包括但不限于种子或植物发育阶段、营养生长阶段、再生阶段、环境条件响应时、害虫或病原体响应时、化合物响应时、或它们的任何组合。

方法包括严格和/或特异性地控制受关注的多核苷酸的表达。通过选择开关中使用的元件组合调控严格性和/或特异性。这些包括但不限于可操作地连接至阻遏物的启动子、阻遏物、可操作地连接至受关注的多核苷酸的阻抑型启动子、以及任选地受关注的多核苷酸。还通过施用的化学配体的选择、剂量、条件和/或时间提供控制。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达能够进行较严格的控制、在不同组织或细胞中进行控制、受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中阻遏物可操作地连接至组成型启动子。在一些实例中阻遏物可操作地连接至非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中受到调控。这些方法提供了改变细胞、组织、植物和/或种子的表型和/或基因型的手段。改变的基因型包括对植物基因组中任何序列的任何可遗传的改变。改变的表型包括其中单元、组织、植物和/或种子表现出与其未改变状态不同的特性或性状的任何情况。改变的表型包括但不限于不同的生长习性、改变的花的颜色、改变的相对成熟度、改变的产量、改变的能育性、改变的花期、改变的病害耐受性、改变的昆虫耐受性、改变的除草剂耐受性、改变的胁迫耐受性、改变的水耐受性、改变的耐旱性、改变的种子特性、改变的形态、改变的农学特性、改变的代谢、改变的基因表达谱、改变的倍数性、改变的作物质量、改变的饲料质量、改变的青贮饲料质量、改变的加工特性等。

在一些实例中，所述方法使用基因开关，其可包含附加的元件。在一些实例中，一个或多个附加的元件可提供如下手段：通过其受关注的多核苷酸的表达能够进行较严格的控制、在不同组织或细胞中进行控制、受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中那些元件包括位点特异性重组位点、位点特异性重组酶、或它们的组合。

在一些方法中，基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、连接至受关注的多核苷酸的启动子、侧接位点特异性重组位点的序列、和可操作地连接至位点特异性重组酶的阻抑型启动子，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件为切除侧接重组位点的序列。在一些实例中，切除产生启动子和受关注的多核苷酸之间可操作的连接。在一些实例中，可操作地连接至受关注的多核苷酸的启动子为非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中受到调控。

在其它方法中，基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、连接至受关注的多核苷酸的启动子、侧接位点特异性重组位点的序列、和位点特异性重组酶，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是切除侧接重组位点的序列。在一些实例中，切除产生阻抑型启动子和受关注的多核苷酸之间可操作的连接。在一些实例中，侧接重组位点的序列包含重组酶表达盒。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中受到调控。在一些实例中所述切除发生在亲本中使得子代遗传切除后的产物。

在一些实例中，基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、可操作地连接至侧接位点特异性重组位点的受关注多核苷酸的启动子、和可操作地连接至位点特异性重组酶的阻抑型启动子，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是切除侧接重组位点的序列。在一些实例中，可操作地连接至受关注的多核苷酸的启动子为非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中受到调控。

在另一个实例中，所述方法包括提供基因开关，其包含编码阻遏物的多核苷酸、连接至受关注的多核苷酸的启动子、侧接位点特异性重组位点的序列、和可操作地连接至位点特异性重组酶的阻抑型启动子，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是倒置侧接重组位点的序列。在一些实例中，倒置产生启动子和受关注的多核苷酸之间可操作的连接。在一些实例中，可操作地连接至受关注的多核苷酸的启动子为非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中受到调控。在一些实例中所述倒置发生在亲本中使得子代遗传倒置后的产物。

在其它方法中，提供的基因开关可包含编码阻遏物的多核苷酸、连接至受关注的多核苷酸的启动子、侧接位点特异性重组位点的序列、和位点特异性重组酶，所述重组酶特异性地识别位点特异性重组位点并实施重组事件。在一些实例中，重组事件是倒置侧接重组位点的序列。在一些实例中，倒置产生阻抑型启动子和受关注的多核苷酸之间可操作的连接。在一些情况下，侧接位点特异性重组位点的序列为受关注的多核苷酸。在一些情况下，侧接位点特异性重组位点的序列为阻抑型启动子。在一些实例中，提供了重组酶表达盒，其中所述重组酶可操作地连接至非组成型启动子，包括但不限于组织优选的启动子、诱导型启动子、阻抑型启动子、发育阶段优选的启动子、或具有多于一种这些特性的启动子。在一些实例中受关注的多核苷酸主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。在一些实例中所述倒置发生在亲本中使得子代遗传倒置后的产物。

在其它实例中，提供了用于改变基因型或表型的方法。在一些实例中，所述方法包括提供包含可操作地连接至阻抑型启动子的受关注多核苷酸的细胞，所述启动子包含至少一个四环素操纵子序列；提供SuR多肽并提供磺酰脲类化合物，从而改变细胞的基因型和/或表型。可使用任何宿主细胞，包括例如原核细胞如细菌，以及真核细胞，包括酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞。在一些实例中提供所述SuR多肽包括使细胞接触表达盒，所述表达盒包含在细胞中有功能的启动子，其可操作地连接至编码SuR多肽的多核苷酸。在一些实例中使用所述方法以激活受关注的多核苷酸的表达。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达在不同组织或细胞中被激活、受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中受关注的多核苷酸主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中表达。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在特定时间发生，其包括但不限于种子或植物发育阶段、营养生长阶段、再生阶段、环境条件响应时、害虫或病原体响应时、化合物响应时、或它们的任何组合。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达在不同组织或细胞中被减少、抑制、或阻止，这可能受限于选择的组织或细胞类型、受限于特定的发育阶段、受限于特定的环境条件、和/或受限于特定代的植物或其子代。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在根、叶、茎、花、穗丝、花药、花粉、分生组织、种系、种子、胚乳、胚芽、或子代中受到抑制。在一些实例中，受关注的多核苷酸的表达主要在特定时间发生抑制，其包括但不限于种子或植物发育阶段、营养生长阶段、再生阶段、环境条件响应时、害虫或病原体响应时、化合物响应时、或它们的任何组合。

在另一个实例中，提供了改变宿主细胞的基因型或表型的方法，所述方法包括：提供包含可操作地连接至阻抑型启动子的受关注多核苷酸的细胞，所述启动子包含至少一个四环素操纵子序列；提供TetR多肽并且提供四环素化合物，从而调控受关注的多核苷酸的转录。在一些实例中所述阻抑型启动子为植物肌动蛋白启动子、香蕉条纹病毒启动子(BSV)、MMV启动子、增强MMV启动子(dMMV)、植物P450启动子、或延伸因子1a(EF1A)启动子。在一些实例中所述启动子为植物肌动蛋白启动子(actin/Op)(SEQ ID NO：855)、香蕉条纹病毒启动子(BSV/Op)(SEQID NO：856)、紫茉莉花叶病毒启动子(MMV/Op)(SEQ ID NO：857)、增强MMV启动子(dMMV/Op)(SEQ ID NO：858)、植物P450启动子(MP1/Op)(SEQ ID NO：859)、或延伸因子1a(EF1A/Op)启动子(SEQ IDNO：860)。在一些实例中所述启动子包含的多核苷酸序列具有与SEQ IDNO：885、856、857、858、859、或860至少约50％，60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述启动子保留阻抑型启动子的活性。在一个具体实例中，所述启动子包含的多核苷酸序列具有与SEQ ID NO：885、856、857、858、859、或860至少95％的序列同一性，其中所述启动子保留阻抑型启动子的活性。

在一些实例中，所述磺酰脲类化合物为嘧啶基磺酰脲类化合物(例如酰嘧磺隆、四唑嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲磺胺磺隆、烟嘧磺隆、嘧苯胺磺隆、环氧嘧磺隆、氟嘧磺隆、吡嘧磺隆、砜嘧磺隆、甲嘧磺隆、磺酰磺隆和三氟啶磺隆)；三嗪基磺酰脲类化合物(例如氯磺隆、醚磺隆、胺苯磺隆、碘磺隆、甲磺隆、氟磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯磺隆、氟胺磺隆和三氟甲磺隆)；或噻唑基脲类化合物(例如氯酯磺草胺、双氯磺草安、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺)。例如所述磺酰脲类化合物可为氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、或砜嘧磺隆。

在一些实例中所述磺酰脲类化合物为胺苯磺隆。在一些实例中提供的胺苯磺隆的浓度为约0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、200或500μg/mL。在一些实例中，所述SuR多肽具有配体结合域，其与SEQ ID NO：205-419的SuR多肽至少50％，60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比对方法经多肽的全长进行测定。在一些实例中全序列比对方法是GAP和BLOSUM62计分矩阵，其中所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和Length Weight 2。在一些实例中所述多肽具有配体结合域，其来自选自SEQ ID NO：205-419的多肽。在一些实例中所述多肽选自SEQ ID NO：205-419。在一些实例中所述多肽由SEQ ID NO：622-836的多核苷酸编码。

在一些实例中所述磺酰脲类化合物为氯磺隆。在一些实例中提供的氯磺隆的浓度为约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、200或500μg/mL。在一些实例中，所述SuR多肽具有配体结合域，其与SEQ ID NO：14-204的SuR多肽至少50％，60％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％的序列同一性，其中所述序列同一性使用全序列比对方法经多肽的全长进行测定。在一些实例中全序列比对方法是GAP和BLOSUM62计分矩阵，其中所述GAP算法的氨基酸序列同一性和序列相似性的默认参数为GAP Weight 8和Length Weight 2。在一些实例中所述多肽具有配体结合域，其来自选自SEQ ID NO：14-204的多肽。在一些实例中所述多肽选自SEQ ID NO：14-204。在一些实例中所述多肽由SEQ ID NO：431-621的多核苷酸编码。

严格调控基因表达的能力提供了控制工程化性状表达和分配的手段。此类系统可防止转基因流入非转基因作物或其它植物。提供了化学调控的基因开关、基因开关组件和使用方法。使用蛋白建模、DNA改组和筛选转化四环素阻遏物以特异性地识别磺酰脲类化合物。对于农业应用，磺酰脲类化合物可在韧皮部流动并且为可商购获得的，从而为用作开关配体化学物质提供了良好的基础。在多轮建模和DNA改组后，已经产生了特异性识别SU化学物质的阻遏物，其几乎与野生型TetR识别同源诱导剂相当。这些多肽包含真实的磺酰脲类阻遏物(SuR)，其已经经确认在植物中展示SuR开关系统的功能。虽然在农业环境中得到例证，这些方法和组合物可广泛用于其它环境和生物。

一般来讲，其中所用的化学物质快速透过并且被生物中的所有细胞类型察觉，但是不干扰任何内源性调节网络的基因开关系统将是最有用的。其它特性包括传感器组件的行为，例如调控严格性和在存在或不存在诱导剂情况下的响应。一般来讲，在不存在诱导剂的情况下具有“关闭”状态的严格调控并且在存在诱导剂的情况下具有快速强烈响应的开关系统为优选的。

Tn10-操纵子的表达由tet阻遏物与其操纵子序列的结合调控(Beck等人，(1982)J Bacteriol 150：633-642；Wray & Reznikoff(1983)J Bacteriol156：1188-1191)。四环素阻遏物对tet操纵子的高度特异性、四环素及其衍生物的高效率诱导、诱导剂的低毒性、以及四环素易于透过大多数细胞的能力是在真核细胞的体细胞基因调控中应用tet系统的基础，所述真核细胞来自动物(Wirtz & Clayton(1995)Science 268：1179-1183；Gossen等人，(1995)Science 268：1766-1769)、人(Deuschle等人，(1995)Mol Cell Biol 15：1907-1914；Furth等人，(1994)PNAS91：9302-9306；Gossen & Bujard(1992)PNAS 89：5547-5551；Gossen等人，(1995)Science 268：1766-1769)和植物细胞培养物(Wilde等人，(1992)EMBO J 11：1251-1259；Gatz等人，(1992)Plant J 2：397-404；Roder等人，(1994)Mol Gen Genet 243：32-28；Ulmasov等人，(1997)Plant MolBiol 35：417-424)。

已经设计出了四环素操纵子/阻遏物系统的许多变型。例如，通过将阻遏物融合到转录反式激活结构域如单纯疱疹病毒VP16和tet阻遏物上，开发出了基于将tet阻遏物转化成激活因子的一个系统(tTA，Gossen& Bujard(1992)PNAS 89：5547-5551)。在这个系统中，在不存在四环素的情况下通过将tTA结合至tet操纵子序列上激活小型启动子，并且四环素灭活反式作用子并抑制转录。这个系统已经被用于植物(Weinmann等人，(1994)Plant J 5：559-569)、大鼠心脏(Fishman等人，(1994)J ClinInvest 93：1864-1868)和小鼠(Furth等人，(1994)PNAS 91：9302-9306)。然而，有迹象显示嵌合tTA融合蛋白在进行有效的基因调控所需的水平上对细胞有毒性(Bohl等人，(1996)Nat Med 3：299-305)。

包含启动子的有用tet操纵子还包括本领域已知的那些(参见例如Matzke等人，(2003)Plant Mol Biol Rep 21：9-19；Padidam(2003)Curr OpPlant Biol 6：169-177；Gatz & Quail(1988)PNAS 85：1394-1397；Ulmasov等人，(1997)Plant Mol Biol 35：417-424；Weinmann等人，(1994)Plant J5：559-569)。可将一个或多个tet操纵子序列添加到启动子上以产生四环素诱导型启动子。在一些实例中已经将至多7个tet操纵子导入小型启动子序列的上游，并且以反式施用的TetR::VP16融合激活结构域仅在不存在诱导剂的情况下激活表达(Weinmann等人，(1994)Plant J5：559-569；Love等人，(2000)Plant J 21：579-588)。开发了使用CaMV 35S启动子的用于植物的广泛测试的四环素调控表达系统(Gatz等人，(1992)Plant J 2：397-404)，其具有导入到接近TATA框(3XOpT 35S)的三个tet操纵子。3XOpT 35S启动子一般在烟草属植物和马铃薯中具有功能，然而据报道也在番茄和拟南芥中有毒性和不良的植物表型(Gatz(1997)Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48：89-108；Corlett等人，(1996)Plant Cell Environ 19：447-454)。另一个因素是四环素相关的化学物质在光照下快速降解，其趋于限制它在实验室条件下的测试用途。

化学调控的基因开关的一个特性为其对同源配体的敏感性。当如本文所述使用负控制的系统时，一个潜在地改善配体响应的方法为自动调控阻遏物的表达。数学上已经预测负性自动调控将不仅减少基因表达的变动，而且增强涉及阻遏物分子的调控回路中的信号响应时间(Savageau(1974)Nature 252：542-549)。这一原则在使用合成基因回路的大肠杆菌中得到证明(Rosenfeld等人，(2002)J Mol Biol 323：785-793)。最近Nevozhay等人将这一发现扩展到较低等的真核生物(酵母)，他们通过比较建成的具有和不具有自动调控的四环素阻遏物和荧光蛋白报告基因系统的合成基因网络完成上述工作(Nevozhay(2009)Proc NatlAcad Sci USA 106：5123-5128)。

阻遏物的模块化构造和螺旋-转角-螺旋DNA结合域的共性允许产生具有改变的DNA结合特异性的SuR多肽。例如，可通过融合SuR配体结合域到可供选择的DNA结合域上改变DNA结合特异性。例如，可将来自TetR D类的DNA结合域融合到SuR配体结合域上以产生SuR多肽，其特异性地结合包含D类四环素操纵子的多核苷酸。在一些实例中可使用DNA结合域变体或衍生物。例如，可使用来自TetR变体的DNA结合域，所述变体特异性地识别tetO-4C操纵子或tetO-6C操纵子(Helbl & Hillen(1998)J Mol Biol 276：313-318；Helbl等人，(1998)J MolBiol 276：319-324。当在相同细胞中选择两个不同的操纵子特异性阻遏物变体作为目标以防止异源二聚化时，由螺旋α8和α10在两个亚基中形成的四螺旋束可被取代以确保二聚反应特异性(例如Rossi等人，(1998)Nat Genet 20：389-393；Berens & Hillen(2003)Eur J Biochem270：3109-3121)。在另一个实例中，来自LexA阻遏物的DNA结合域与GAL4融合，其中这个杂交蛋白识别大肠杆菌和酵母中的LexA操纵子(Brent & Ptashne(1985)Cell 43：729-736)。在另一个实例中，434阻遏物的所有推定的DNA结合或DNA识别R-基被P22阻遏物的相应位点取代。杂交阻遏物434R[α3(P22R)]的操纵子结合特异性在体内和体外进行测试，并且每个测试显示这一434的靶向改变将DNA结合特异性从434操纵子变为P22操纵子(Wharton & Ptashne(1985)Nature 316：601-605)。通过产生特异性识别嵌合P22/434操纵子序列的野生型434R和434R[α3(P22R)]的异源二聚体进一步发展了这一研究(Hollis等人，(1988)PNAS 85：5834-5838)。在另一个实例中，AraC蛋白N-末端的半部分与LexA阻遏物DNA结合域融合。所得AraC:LexA嵌合二聚体结合LexA操纵子并以阿拉伯糖响应方式阻遏LexA操纵子：β-半乳醣苷酶融合基因的表达(Bustos & Schleif(1993)PNAS 90：5638-5642)。

为了使用方便和获得高通量，常期望在微生物中筛选/选择期望的改性核酸，例如在细菌如大肠杆菌或单细胞真核生物如酵母，包括酿酒酵母(S.cerevisiae)、裂殖酵母(S.pombe)、毕赤酵母(P.pastoris)或原生生物如南极冰藻(Chlamydomonas)、或在模型细胞系统如SF9、Hela、CHO、BMS、BY2、或其它细胞培养系统中进行筛选。在某些情况下，可期望在植物细胞或植物中进行筛选，包括植物细胞或外植体培养系统或模型植物系统如拟南芥属或烟草属植物。在一些实例中通过筛选表达单独的或作为基因融合构建体一部分的不同改性核酸宿主细胞组提高生产能力。可将任何显示显著活性的组进行去卷积以鉴定表达期望活性的单克隆。

提供了包含一个或多个核酸序列如基因开关、包含至少一个tet操纵子的植物启动子、编码SuR多肽的多核苷酸、和/或受关注的多核苷酸的重组构建体。所述构建体包含载体，例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等，其中已经插入了多核苷酸。在一些实例中，所述构建体还包含调控序列，包括例如可操作地连接至所述序列的启动子。合适的载体是为人们所熟知的并且包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；复制子；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体、病毒DNA如牛痘病毒、腺病毒、鸡痘病毒、伪狂犬病病毒、腺病毒、腺病毒相关的病毒、逆转录病毒、双生病毒、TMV、PVX、其它植物病毒、Ti质粒、Ri质粒及多种其它病毒或质粒。

所述载体可任选地包含一个或多个选择性标记基因以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状。通常选择性标记基因将编码抗生素或抗除草剂性。合适的基因包括编码抗生素奇放线菌素或链霉素抗性(例如aadA基因)、链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII或NPTIII)基因、潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因的那些基因。附加的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶或真核细胞培养物的新霉素抗性和四环素或氨苄青霉素抗性。编码除草剂抗性的基因包括抑制谷氨酰胺合酶作用的那些基因，例如提供对草甘膦抗性的草胺膦或basta(例如bar基因)、EPSPS、GOX、或GAT，提供对磺酰脲类除草剂抗性的突变体ALS(乙酰乳酸合酶)、或任何其它已知基因。

在细菌系统中许多表达载体为可用的。此类载体包括但不限于多功能大肠杆菌克隆和表达载体如BLUESCRIPT(Stratagene)；pIN载体(VanHeeke & Schuster(1989)J Biol Chem 264：5503-5509)；pET载体(Novagen，Madison Wis.)等。相似地，在酿酒酵母(S.cerevisiae)中可使用多种包含组成型或诱导型启动子如α因子、醇氧化酶和PGH的载体以产生多肽。参见Ausubel & Grant等人，(1987)Meth Enzymol 153：516-544。可在哺乳动物宿主细胞中使用多种表达系统，包括基于病毒的系统如腺病毒和劳氏肉瘤病毒(RSV)系统。可使用任何数量的商业或公开可用的表达系统或它们的衍生物。

在植物细胞中可通过整合进植物染色体或细胞器或来自游离体或病毒核酸的细胞质的表达盒驱动表达。已经描述了多个植物来源的调控序列，包括指导以组织特异性方式表达的序列，例如TobRB7、马铃薯块茎特异蛋白(patatin)B33、GRP基因启动子、rbcS-3A启动子等。作为另外一种选择，可通过瞬时表达植物病毒载体的外来序列获得高水平的表达，例如TMV、BMV、复染色体病毒包括WDV等。

用于在高等植物中表达核酸的典型载体为已知的，包括源自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导(Ti)质粒的载体，如Rogers等人，(1987)Meth Enzymol 153：253-277所述。示例性的根癌农杆菌(A.tumefaciens)载体包括质粒pKYLX6和pKYLX7，如Schardl等人，(1987)Gene 61：1-11，和Berger等人，(1989)PNAS 86：8402-8406所述，以及质粒pB 101.2(例如购自Clontech Laboratories，Palo Alto，Calif.的质粒)。可使用多种已知的植物病毒作为载体，包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、复染色体病毒、雀麦花叶病毒和烟草花叶病毒。

基因开关、启动子、TetOp阻抑型植物启动子、重组酶、和/或SuR可用于控制受关注的多核苷酸的表达。受关注的多核苷酸可为任何所关注序列，包括但不限于转录调控元件、翻译调控元件、着丝粒元件、端粒元件、编码多肽的序列、编码mRNA的序列、编码tRNA的序列、编码rRNA的序列、编码引导基因沉默的序列、核酶、融合蛋白、复制载体、可筛选的标记等。受关注的多核苷酸的表达可用于诱导编码RNA和/或多肽的表达，或反过来抑制编码RNA、RNA靶序列和/或多肽的表达。在具体的实例中，受关注的多核苷酸包含引导基因沉默的序列，包括但不限于编码RNAi前体、编码活性RNAi剂、miRNA、反义多核苷酸、核酶、或任何其它沉默分子以及它们的组合的序列。在具体的实例中，所述多核苷酸序列可包含编码植物激素、植物防御蛋白、营养转运蛋白、生物结合蛋白、期望输入性状、期望输出性状、胁迫抗性基因、抗除草剂性基因、病害/病原体抗性基因、雄性不育、发育基因、调控基因、DNA修复基因、转录调控基因、生物合成多肽、或受关注的任何其它多核苷酸和/或多肽、以及它们的组合的多核苷酸。生物合成多肽为涉及细胞中的任何生物、细胞、代谢、合成和/或分解代谢途径的任何多肽。在一些实例中，受关注的多核苷酸编码的多肽特异性地结合靶核酸序列，其实例包括但不限于编码重组酶、整合酶、切除酶、转座酶、阻遏物、逆阻遏物、活化剂、核酸酶、核酸内切酶、核酸外切酶、归巢内切核酸酶、锌指蛋白、锌指核酸酶、转录因子、聚合酶、连接酶等的多核苷酸。在一些实例中，多肽特异性地结合靶核酸序列，其切除由序列组合物和/或接近的特定序列组合物限定的特定序列或靠近特定序列的至少一条链(例如IIS型限制性核酸酶，如FokI)。例如受关注的多核苷酸能够编码在特定序列切割DNA核酸分子的多肽。在一些实例中，受关注的多核苷酸编码的多核苷酸特异性地结合目标核酸序列，其实例包括但不限于反义多核苷酸、miRNA前体、miRNA等。

特异性结合指分子结合、双联、或杂交到特定目标分子上，其结合水平显著高于与非目标分子的结合水平。一般来讲，特异性结合水平比非特异性背景结合水平高至少2倍。特异性结合包括化学分子、多肽、或多核苷酸与任何目标化学制品、靶多肽、或靶多核苷酸的结合。

组合物和方法可使用任何启动子。例如，多核苷酸编码SuR多肽、重组酶、受关注的多核苷酸、或任何能可操作地连接至组成型、组织优选的、诱导型、发育的、暂时的和/或空间调控的或其它启动子的其它序列，包括来自在植物细胞中有功能的植物病毒或其它病原体的那些。植物中使用的多种启动子参见Potenza等人，(2004)In Vitro Cell Dev BiolPlant 40：1-22。示例性的启动子包括但不限于35S CaMV启动子(Odell等人，(1995)Nature 313：810-812)、S-腺苷甲硫氨酸合酶启动子(SAMS)(例如在US 7,217,858和US2008/0026466中公开的那些)、紫茉莉花叶病毒启动子(例如Dey & Maiti(1999)Plant Mol Biol 40：771-782；Dey &Maiti(1999)Transgenics 3：61-70)、延伸因子启动子(例如US2008/0313776和US2009/0133159)、香蕉条纹病毒启动子、肌动蛋白启动子(例如McElroy等人，(1990)Plant Cell 2：163-171)、TobRB7启动子(例如Yamamoto等人，(1991)Plant Cell 3：371)、马铃薯块茎特异蛋白(patatin)启动子(例如马铃薯块茎特异蛋白(patatin)B33，Martin等人，(1997)PlantJ 11：53-62)、核酮糖1，5-二磷酸羧化酶启动子(例如rbcS-3A，参见例如Fluhr等人，(1986)Science 232：1106-1112，和Pellingrinischi等人，(1995)Biochem Soc Trans 23：247-250)、泛素启动子(例如Christensen等人，(1992)Plant Mol Biol 18：675-689，和Christensen &Quail(1996)Transgen Res 5：213-218)、金属硫蛋白启动子(例如US2010/0064390)、Rab17启动子(例如Vilardell等人，(1994)Plant MolBiol 24：561-569)、伴球蛋白启动子(例如Chamberland等人，(1992)PlantMol Biol 19：937-949)、质膜内在蛋白(PIP)启动子(例如Alexandersson等人，(2009)Plant J 61：650-660)，脂质转移蛋白(LTP)启动子(例如US2009/0158464、US2009/0070893、和US2008/0295201)、γ-玉米醇溶蛋白基因启动子(Gamma-zein)启动子(例如Uead等人，(1994)Mol CellBiol 14：4350-4359)、γkafarin启动子(例如Mishra等人，(2008)Mol BiolRep 35：81-88)、球蛋白启动子(例如Liu等人，(1998)Plant Cell Rep17：650-655)、豆球蛋白启动子(例如US7211712)、早期胚乳启动子(EEP)(例如US2007/0169226和US2009/0227013)、B22E启动子(例如Klemsdal等人，(1991)Mol Gen Genet 228：9-16)、油质蛋白启动子(例如Plant等人，(1994)Plant Mol Biol 25：193-205)、早期丰富蛋白(EAP)启动子(例如US 7,321,031)、晚期胚胎形成丰富(LEA)蛋白(例如Hva1，Straub等人，(1994)Plant Mol Biol 26：617-630；Dhn和WSI18，Xiao &Xue(2001)Plant Cell Rep 20：667-673)、In2-2启动子(De Veylder等人，(1997)Plant Cell Physiol 38：568-577)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)启动子(例如WO93/01294)、PR启动子(例如Cao等人，(2006)Plant Cell Rep6：554-560，和Ono等人，(2004)Biosci Biotech Biochem 68：803-807)、ACE1启动子(例如Mett等人，(1993)Proc Natl Acad Sci USA90：4567-4571)、甾类化合物反应性启动子(例如Schena等人，(1991)ProcNatl Acad Sci USA 88：10421-10425，和McNellis等人，(1998)Plant J14：247-257)、乙醇诱导型启动子(例如AlcA，Caddick等人，(1988)NatBiotechnol 16：177-180)、雌二醇诱导型启动子(例如Bruce等人，(2000)Plant Cell 12：65-79)、XVE雌二醇诱导型启动子(例如Zao等人，(2000)Plant J 24：265-273)、VGE甲氧虫酰肼诱导型启动子(例如Padidam等人，(2003)Transgen Res 12：101-109)、或TGV地塞米松诱导型启动子(例如Bohner等人，(1999)Plant J 19：87-95)。

可获得任何多核苷酸(包括分离或重组的受关注的多核苷酸)、编码SuR的多核苷酸、重组酶位点、编码重组酶的多核苷酸、调控区、内含子、启动子、和包含TetOp序列的启动子，并且通过任何标准方法测定它们的核苷酸序列。可化学合成全长多核苷酸或者从化学合成的寡核苷酸装配而成(Kutmeier等人，(1994)BioTechniques 17：242)。从寡核苷酸进行装配通常涉及合成重叠寡核苷酸、退火并连接那些寡核苷酸以及PCR扩增连接产物。作为另外一种选择，可分离或从合适来源产生多核苷酸，所述来源包括从组织或细胞中产生的cDNA库、基因组库、或从宿主中通过使用序列3’和5’末端特定引物的PCR扩增直接分离、或通过使用受关注的多核苷酸特异性的核苷酸探针。然后可使用标准方法将通过PCR生成的扩增核酸分子克隆进可复制的克隆载体中。还可使用任何标准方法操纵所述多核苷酸，包括重组DNA技术、载体构建、诱变和PCR(参见例如Sambrook等人，(1990)Molecular Cloning，ALaboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY；Ausubel等人，Eds.(1998)Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，NY)。

当多核苷酸、多肽或其它组分部分或完全地从其正常结合的组分(其它蛋白、核酸、细胞、合成试剂等)中分离出来时，它们是“分离的”。当核酸或多肽为人工制成的或工程化得到、或源自人工或工程化的蛋白或核酸时，它们是“重组的”例如，插入载体或任何其它异源位置如重组生物的基因组，使得它不与通常侧接天然存在的多核苷酸的核苷酸序列相关联的多核苷酸为重组多核苷酸。在体外或体内从重组多核苷酸中表达的蛋白质为重组多肽的实例。同样地，天然不存在的多核苷酸序列，例如天然存在的基因的变体为重组序列。例如，本发明包括包含阻抑型启动子的重组多核苷酸，所述启动子包含可操作地连接至编码磺酰脲类反应性阻遏物的多核苷酸的至少一个操纵子序列或阻抑型启动子。

在一些实例中，重组多核苷酸可包含可操作地连接至编码磺酰脲类反应性阻遏物的多核苷酸的阻抑型启动子，其中所述阻抑型启动子包含一个tet操纵子。在一些实例中，编码的磺酰脲类反应性阻遏物包含SEQID NO：3-419中任一种的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：3-419中的任一种具有至少85％(例如至少85％，90％，95％，97％，99％，100％)的序列同一性的氨基酸序列。阻抑型启动子可包含可操作地连接至至少一种操纵子序列的肌动蛋白启动子、MMV启动子、dMMV启动子、MP1启动子、或BSV启动子。在一些实例中，阻抑型启动子包含如SEQ IDNO：855、856、857、858、859、860或862中所示的多核苷酸序列、或如本文所述与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的多核苷酸序列。

一旦多核苷酸或多肽接近至少一个细胞内部，可使用将序列导入细胞或生物的任何方法。将序列导入植物的方法是已知的并且包括但不限于稳定转化、瞬时转化、病毒介导的方法、以及有性繁殖。稳定掺入指示导入的多核苷酸被整合进基因组并且能够被子代遗传。瞬时转化指示导入的序列不整合进基因组，使得子代不能从宿主得到遗传。可使用任何手段整合任何基因开关元件或它们的组合，例如可操作地连接至包含TetOp的启动子的SuR和受关注的多核苷酸，包括例如稳定转化、瞬时转化、细胞融合、有性杂交或它们的任何组合。

转化规程以及用于将多肽或多核苷酸序列导入植物内的规程可以根据被作为转化目标的植物或植物细胞的类型而改变。将多肽和多核苷酸导入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques 4：320-334和美国专利6,300,543)、电穿孔(Riggs等人，(1986)PNAS 83：5602-5606、农杆菌属介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBOJ 3：2717-2722)、弹道粒子加速(美国专利4,945,050、5,879,918、5,886,244和5,932,782；Tomes等人，(1995)in Plant Cell，Tissue and Organ Culture：Fundamental Methods，ed.Gamborg & Phillips(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-926)。也参见Weissinger等人，(1988)Ann Revgenet 22：421-477；Sanford等人，(1987)ParticulateScience and Technology 5：27-37；Christou等人，(1988)Plant Physiol87：671-674；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev Biol27P：175-182(soybean)；Singh等人，(1998)Theor Appl Genet 96：319-324；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-740；Klein等人，(1988)PNAS85：4305-4309；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-563；美国专利5,240,855、5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)Plant Physiol91：440-444；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-839；Hooykaas-VanSlogteren等人，(1984)Nature 311：763-764；美国专利5,736,369；Bytebier等人，(1987)PNAS 84：5345-5349；De Wet等人，(1985)The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，ed.Chapman等人，(Longman，New York)，第197-209页；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Rep 9：415-418；Kaeppler等人，(1992)Theor Appl Genet 84：560-566；D′Halluin等人，(1992)PlantCell 4：1495-1505；Li等人，(1993)Plant Cell Rep 12：250-255；Christou和Ford(1995)Ann Bot 75：407-413和Osjoda等人，(1996)Nat Biotechnol14：745-750。作为另外一种选择，可通过将植物与病毒或病毒核酸接触来将多核苷酸导入植物内。经由病毒DNA或RNA分子将多核苷酸导入植物的方法是已知的，参见例如美国专利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931；和Porta等人，(1996)Mol Biotech5：209-221。

术语植物包括植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物、从中可再生出植物的植物细胞或植物组织培养物、植物愈伤组织、在植物或植物部分中完整的植物块和植物细胞如胚芽、花粉、胚珠、种子、胚乳、分生组织、叶、花、茎、果实、仁、穗、壳、荚、杆、根、根尖、花药等。也包括再生植株的子代、变体和突变体再生植株。

在一些实例中，可通过转化质体或引导SuR转录物或多肽进入质体将SuR导入质体。取决于所需的产物和/或用途，可使用转化核或质体的任何方法。质体转化提供如下优点：包括高转基因表达、对转基因表达的控制、表达多顺反子信息的能力、经由同源重组的位点特异性整合、消除转基因沉默和位点效应、经由单亲质体基因遗传和在细胞器中对表达多肽的螯合作用控制转基因传染，这能够消除对细胞质组件可能的不利影响(例如参见包括Heifetz(2000)Biochimie 82：655-666；Daniell等人，(2002)Trends Plant Sci 7：84-91；Maliga(2002)Curr Op Plant Biol5：164-172；Maliga(2004)Ann Rev Plant Biol 55-289-313；Daniell等人，(2005)Trends Biotechnol 23：238-245；以及Verma和Daniell(2007)PlantPhysiol 145：1129-1143)。

质体转化的方法和组合物是为人们所熟知的，例如，转化方法包括(Boynton等人，(1988)Science 240：1534-1538；Svab等人，(1990)PNAS87：8526-8530；Svab等人，(1990)Plant Mol Biol 14：197-205；Svab等人，(1993)PNAS 90：913-917；Golds等人，(1993)Bio/Technology 11：95-97；O’Neill等人，(1993)Plant J 3：729-738；Koop等人，(1996)Planta199：193-201；Kofer等人，(1998)In Vitro Plant 34：303-309；Knoblauch等人，(1999)Nat Biotechnol 17：906-909)；以及质体转化载体、元件和选择(Newman等人，(1990)Genetics 126：875-888；Goldschmidt-Clermont，(1991)Nucl Acids Res 19：4083-4089；Carrer，等人，(1993)Mol Gen Genet241：49-56；Svab等人，(1993)PNAS 90：913-917；Verma和Daniell(2007)Plant Physiol 145：1129-1143)。

用于控制质体中的基因表达的方法和组合物是为人们所熟知的，包括(McBride等人.(1994)PNAS 91：7301-7305；

等人，(2005)Plant CellPhysiol 46：1462-1471；Heifetz(2000)Biochemie 82：655-666；Surzycki等人，(2007)PNAS 104：17548-17553；美国专利5,576,198和5,925,806；WO 2005/0544478)，以及将多核苷酸和/或多肽导入质体的方法和组合物，包括翻译融合到转运肽中(例如，Comai等人，(1988)J Biol Chem263：15104-15109)。

SuR多核苷酸和多肽经由易于进入细胞的化学诱导剂提供调控质体基因表达的手段。例如，使用用于叶绿体的T7表达系统(McBride等人，(1994)PNAS 91：7301-7305)，SuR可用于控制核T7聚合酶表达。作为另外一种选择，可将SuR调控的启动子整合进质体基因组并可操作地连接至受关注的多核苷酸和表达并从核基因组输入的SuR、或整合进所述质体。在所有情况下，磺酰脲类化合物用于有效地调控受关注的多核苷酸。磺酰脲类化合物可根据本领域任何已知的适用方法来施用。例如磺酰脲类化合物可用于叶施用、灌根施用、出苗前施用、出苗后施用、或种子处理施用。

阻抑型启动子经由易于进入细胞的化学诱导剂提供调控质体基因表达的手段。TetR或SuR调控的启动子包括但不限于SEQ IDNO：855-860或如本文所述的启动子，其具有与SEQ ID NO：855-860至少95％的序列同一性，可将其整合进质体基因组并可操作地连接至受关注的多核苷酸和表达并从核基因组输入的阻遏物、或整合进所述质体。在所有情况下，四环素化合物或磺酰脲类化合物用于有效地调控受关注的多核苷酸。

任何类型的细胞和/或生物，无论是原核的或真核的，可与基因开关组件、基因开关组合物和/或方法一起使用。例如，任何细菌细胞系统可用所述组合物进行转化。例如大肠杆菌、农杆菌属和其它细菌细胞转化、质粒制备和噬菌体使用的方法详见例如Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人(eds.)(1994)a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley和Sons，Inc.)。

基因开关组件、基因开关组合物和/或系统可与任何真核细胞系一起使用，包括酵母、原生生物、藻类、昆虫细胞、禽类细胞或哺乳动物细胞。例如，多种商业和/或公开可用的酿酒酵母菌株是可用的，用于转化这些细胞的质粒同样如此。例如，菌株购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC，Manassas，VA)并且包括YeastGenetic Stock Center目录，其在1998年移至ATCC。其它酵母品系如裂殖酵母(S.pombe)和毕赤酵母(P.pastoris)等也是可用的。例如，酵母转化、质粒制备等方法详见例如Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人，(eds.)(1994)a joint venture between Greene PublishingAssociates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，具体见Unit 13)。酵母的转化方法包括原生质球转化、电穿孔和醋酸锂方法。酵母的一种通用高效转化方法在Gietz和Woods((2002)Methods Enzymol 350：87-96)中进行了描述，该方法使用醋酸锂、PEG 3500和载体DNA。

基因开关组件和/或基因开关组合物可用于哺乳动物细胞如CHO、HeLa、BALB/c、成纤维细胞、小鼠胚胎干细胞等。多种可商购获得的感受态细胞系和质粒是为人们所熟知的并且易得的，例如得自ATCC(Manassas，VA)。用于转化和哺乳动物细胞转化的分离多核苷酸可通过本领域已知的任何方法获得。例如哺乳动物和其它真核细胞转化、质粒制备、及病毒使用的方法详见例如Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel等人，(eds.)(1994)a joint venture between GreenePublishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，具体见Unit 9)。例如，多种方法是可用的，例如磷酸钙转染、电穿孔、DEAE葡聚糖转染、脂质体介导的转染、显微注射、以及病毒技术。

任何植物物种可与基因开关组件、基因开关组合物、和/或方法一起使用，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。植物的实例包括但不限于玉米(Zea mays)、芸苔属物种(例如油菜、芜菁、芥菜)、蓖麻、棕榈、苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、裸麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor、Sorghum vulgar)、小米(例如珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、粟(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusinecoracana)、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamus tinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草属植物(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、棉(Gossypiumbarbadense、Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihotesculenta)、咖啡(Coffea属物种)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananascomosus)、柑橘(Citrus属物种)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camelliasinensis)、香蕉(Musa属物种)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、番木瓜果(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳大利亚坚果(Macadamia integrifolia)、杏(Prunus amygdalus)、甜菜(Betavulgaris)、甘蔗(Saccharum属物种)、拟南芥、燕麦(Avena属)、大麦(Hordeum属)、豆科植物如瓜尔豆、刺槐豆、葫芦巴、四季豆、豇豆、绿豆、蚕豆、小扁豆和鹰嘴豆、蔬菜、观赏植物、草本植物和针叶树。蔬菜包括西红柿(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactucasativa)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Pisium属物种、Lathyrus属物种)、和黄瓜属物种如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃花(Rhododendron属物种)、八仙花(Macrophylla hydrangea)、木槿(Hibiscus rosasanensis)、蔷薇(Rosa属物种)、郁金香(Tulipa属物种)、水仙花(Narcissus属物种)、矮牵牛花(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthus caryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。针叶树包括松树，例如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)；异叶铁杉(Tsuga canadensis)、北美云杉(Picea glauca)、红杉(Sequoiasempervirens)、冷杉如银枞(Abies amabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)以及雪松如西岸红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄桧(Chamaecyparisnootkatensis)。

已经转化过的植物细胞和/或组织可使用常规方法在植物中生长(参见例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Rep 5：81-84)。然后这些植物可生长并自花授粉、回交和/或远交，并且所得子代具有鉴定的期望特性。可培养两代或更多代以确保特性得到稳定保持和遗传，然后收获种子。提供了用这种方法转化的种子，其具有基因开关组件、阻遏物、阻抑型启动子、基因开关系统、受关注的多核苷酸、重组酶、重组事件最终产物、和/或编码稳定掺入它们的基因组的SuR的多核苷酸。还可表征具有稳定掺入DNA构建体的植物和/或种子的表达、农学特性和拷贝数。

序列同一性可用于比较两个多核苷酸或多肽序列的一级结构、描述第一序列相对于第二序列的一级结构、和/或描述序列关系如变体和同源物。序列同一性测量两个序列当比对最大符合性时的相同残基数。可使用计算机实施的算法分析序列关系。两个或更多个多核苷酸或两个或更多个多肽间的序列关系可通过计算序列的最佳比对并给比对的匹配和空位评分来确定，这产生百分比序列同一性和百分比序列相似性。多核苷酸关系也可基于比较其每个编码的多核苷酸的进行描述。用于比较或分析序列的许多程序和算法是已知的。除非另作说明，本文提供的序列同一性/相似性值指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，San Diego，CA)获得的值，使用以下参数：核苷酸序列的％同一性和％相似性使用GAPWeight 50和Length Weight 3，以及nwsgapdna.cmp计分矩阵；氨基酸序列的核苷酸序列的％同一性和％相似性使用GAP Weight 8和LengthWeight 2，以及BLOSUM62计分矩阵(Henikoff & Henikoff(1992)PNAS89：10915-10919)。GAP使用Needleman & Wunsch(1970)J Mol Biol48：443-453的算法，以找出两个完整序列之间使匹配数最大化和空位数最小化的比对结果。

作为另外一种选择，多核苷酸和/或多肽可使用其它序列工具进行评估。例如，可使用BLAST比对工具评估多核苷酸和/或多肽。局部比对空位简单地由一对序列片段组成，比较每个序列。Smith-Waterman或Sellers算法的变型将找到评分不能通过延伸或修剪改善的所有片段对，它们称为高分片段对(HSP)。BLAST比对的结果包括统计测量以指出BLAST评分可期望仅出自偶然的可能性。原始评分S从与每个比对序列相关联的空位和取代数计算得到，其中较高的相似性评分指示较显著的比对结果。取代评分通过查找表提供(参见PAM，BLOSUM)。空位评分通常计算为G(空位开放罚分)和L(空位延伸罚分)的总数。对于空位的长度n，空位罚分将为G+Ln。空位罚分G和L为经验值，但是习惯上为G选择高值(10-15)并且为L选择低值(1-2)。二进制值S’源自原始比对评分S，其中使用的评分系统的统计学特性已经被纳入计算。针对所述评分系统对二进制值进行归一化，因此它们可用于比较不同搜索的比对评分。E值或期望值描述具有相似评分的序列将在数据库中偶然出现的可能性。预测具有等同评分或比S更好的评分的不同比对的数量，期望所述评分在数据库搜索中偶然出现。E值越小，比对结果越显著。例如，具有e^-117的E值的比对意味着具有类似评分的序列几乎不可能完全偶然地出现。此外，需要随机氨基酸对比对的期望评分为负值，否则长比对将趋于具有独立的高评分，无论比对的片段是否相关。此外，BLAST算法使用合适的取代矩阵、核苷酸或氨基酸并且对于空位比对使用空位形成和延伸罚分。例如，多肽序列的BLAST比对和比较通常使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1完成。除非另外指明，BLAST分析的报告评分使用BLOSUM62矩阵、空位存在罚分11和空位延伸罚分1完成。

UniProt蛋白质序列数据库为功能和结构蛋白数据的数据库，并且提供稳定的、全面的、完整分类的、注解丰富和精确的蛋白质序列知识库，其具有广泛的交叉引用和科学界可自由访问的查询界面。UniProt位点具有一个工具UniRef，其提供的蛋白质集具有与数据库中的受关注蛋白质序列50％、90％或100％的序列同一性。例如使用TetR(B)(UniProt参考P04483)提供18个蛋白质的集合，它们具有与P04483 90％的序列同一性。

四环素阻遏物的特性、结构域、基序和功能是为人们所熟知的，它们是标准技术和测定法评估的任何来源的阻遏物(包含一个或多个氨基酸取代)。D类TetR蛋白的结构包含10个α螺旋，其具有连接环和转角。3个N-末端螺旋形成DNA-结合HTH结构域，其与其它DNA结合蛋白中的HTH基序取向相反。该蛋白的核心由螺旋5-10形成，包含二聚体界面结构域，并且每个单体包含用于配体/结合位点的结合袋和二价阳离子辅因子(Kisker等人，(1995)J Mol Biol 247：260-180；Orth等人，(2000)Nat Struct Biol 7：215-219)。任何氨基酸变化可包含非保守或保守氨基酸取代。保守取代一般指交换一个氨基酸与另一个具有相似化学和/或结构特性的氨基酸(参见例如Dayhoff等人，(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure，Natl Biomed Res Found，Washington，DC)。已经根据评估的特性开发了不同的类似氨基酸类别，所述特性如酸性对碱性、极性对非极性、两亲性等，并且当评估任何取代或取代组合的可能效应时，可使用它们。

已经鉴定和/或溯源了多个TetR变体并且广泛地研究了它们。在四环素阻遏物系统中，已经广泛使用多种突变、修改形式和/或它们的组合的效应广泛地表征和/或改变四环素阻遏物的特性，例如辅因子结合、配体结合常数、动力学和解离常数、操纵子结合序列限制、协同性、结合常数、动力学和解离常数以及融合蛋白活性和特性。变体包括在四环素或其类似物的存在下具有结合操纵子序列的反式表型的TetR变体、具有改变的操纵子结合特性的变体、具有改变的操纵子序列特异性的变体和具有改变的配体特异性及融合蛋白的变体。参见例如Isackson &Bertrand(1985)PNAS 82：6226-6230；Smith & Bertrand(1988)J Mol Biol203：949-959；Altschmied等人，(1988)EMBO J 7：4011-4017；Wissmann等人，(1991)EMBO J 10：4145-4152；Baumeister等人，(1992)J Mol Biol226：1257-1270；Baumeister等人，(1992)Proteins 14：168-177；Gossen &Bujard(1992)PNAS 89：5547-5551；Wasylewski等人，(1996)J Protein Chem15：45-58；Berens等人，(1997)J Biol Chem 272：6936-6942；Baron等人，(1997)Nucl Acids Res 25：2723-2729；Helbl & Hillen(1998)J Mol Biol276：313-318；Urlinger等人，(2000)PNAS 97：7963-7968；Kamionka等人，(2004)Nucl Acids Res 32：842-847；Bertram等人，(2004)J Mol MicrobiolBiotechnol 8：104-110；Scholz等人，(2003)J Mol Biol 329：217-227；和US2003/0186281。

实施例

提供以下实施例以示出了本发明的一些实施方案，但是不应将其视为限制或换句话讲受任何方面、实施方案、元件或它们的任何组合的限制。对本领域技术人员来说任何方面、实施方案、元件、或它们的任何组合的修改形式是显而易见的。

实施例1：磺酰脲类反应性阻遏物(SuR)

A.计算模型

D类四环素阻遏物的3-D晶体结构(分离自大肠杆菌；结合TET的二聚体，1DU7(Orth等人，(2000)Nat Struct Biol 7：215-219)；和结合DNA的二聚体，1QPI(Orth等人，(2000)Nat Struct Biol 7：215-219)，用作通过计算机用噻磺隆(Ts，

)分子在配体结合袋中取代四环素(TET)分子的设计架构。TET和磺酰脲类(SU)一般是大小类似的并且具有基于芳族环的结构，其具有氢键供体和受体。然而，在四环素家族和SU家族分子之间存在显著差异。TET是内部刚性的并且是相当平的，具有一个有羟基和酮基的高氢键面，logP～-0.3。磺酰脲类(SU)具有较高的柔性和芳香性，有一个通常连接取代苯、吡啶、或噻吩(在

的情况下)的核心磺酰基-脲部分，一侧具有取代的嘧啶或另一侧具有1，3，5-三嗪。虽然具有不同的功能基团，

的logP与TET的logP相似(在pH 7为～0.02)。最好构成的

分子通过在计算机上在TetR结合袋中的分子建模进行定位。基于这个模型，测定出十七个氨基酸残基位点(来自单体A的60、64、82、86、100、104、105、113、116、134、135、138和139以及来自单体B的位点147、151、174和177，使用TetR(B)编号)足够接近对接的

以进入结合表面。使用计算机侧链优化以设计在17个位点的每一个处的氨基酸组，认为这些位点是与SU结合最相容的。库位点处的氨基酸选择通过空间和物理化学方面的考虑进行确定，从而使配体对接到模型配体袋中。这产生在17个位点(4、5、4、4、5、3、8、11、10、10、8、8、7、9、6、7和5)具有氨基酸的库，设计的总库大小为4×10¹³。

选择来自Tn10的野生型B类TetR作为起始分子以产生改组衍生物(SEQ ID NO：2)。它与在计算机设计中使用的序列略有不同(P0ACT4，D类，对于其高分辨率晶体结构1DU7是可用的)，但是仅轻微的影响配体结合。

商业合成编码TetR的起始多核苷酸并且加入限制性位点以方便库构造和进一步的操纵(DNA2.0，Menlo Park，California，USA)。加入的限制性位点包括5’末端的NcoI位点、配体结合域(LBD)5’的SacI位点和在终止密码子之后的AscI位点。库构造可定位在～480bp的DNA片段内，该片段包含配体结合区域以避免在其它区域如DNA结合域中的非故意的突变。合成基因可操作地连接阿拉伯糖诱导型启动子P_BAD的下游，使用NcoI/AscI以产生TetR表达载体pVER7314。在编码区5’末端的NcoI位点添加所述编码区导致甘氨酸插入到氨基酸位点一(SEQ IDNO：2)的N-末端甲硫氨酸之后。除非另外指明，这一序列用作所有测定法中的野生型TetR对照，并且观察到的活性等同于无丝氨酸插入的TetR(SEQ ID NO：1)。然而，所有提到的氨基酸位点和设计并观察到的改变使用野生型TetR(B)氨基酸编号(207aa)，例如SEQ ID NO：1。

B.库设计

由于在许多彼此贴近的位点处的大量设计的取代，计算的库(表1，设计库)不易用小量简并密码子编码。为此原因，在实验室中加工并测试的序列库特征在于在6/17位点处的设计氨基酸组、在1/17位点处的略微扩大、以及在10/17位点处的完全简并(NNK密码子)(表1)。T这导致高得多的序列多样性，总计3×10¹⁹个序列。

表1：

残基	野生型残基	设计库	实际库
				60	L	A L K M	A L K M
64	H	A N Q H L	A N Q H L
				82	N	A N S T	A N S T
86	F	M F W Y	M F W Y
				100	H	H M F W Y	全部20个aa
104	R	A R G	A R G
				105	P	A N D G P S T V	全部20个aa
113	L	A R N D Q E K M S T V	A R N D Q E K M S T V I P L G H
				116	Q	A R N Q E I K M T V	全部20个aa
134	L	A R I L K M F W Y V	全部20个aa
				135	S	A R N Q H K S T	A R N Q H K S T
138	G	A H K M F S Y W	全部20个aa
				139	H	A R Q H L K Y	全部20个aa
147	E	A R Q E H L K M Y	全部20个aa
				151	H	A Q H K I L	全部20个aa
174	I	A R Q E L K M	全部20个aa
				177	F	A R L K M	全部20个aa

通过重叠延伸设计并装配库1寡核苷酸(Ness等人，(2002)NatBiotech 20：1251-1255)以生成由SacI/AscI限制性位点界定的PCR片段。装配所有库片段的条件如下：将构成库的寡核苷酸归一化以浓缩成10μM，然后混合相同的体积以产生10μM集合。库片段的PCR扩增在六个相同的25μl反应体系中进行，其包含：1μM汇集的库寡核苷酸；0.5μM各种拯救引物：L1：5’和L1：3’和200μM dNTP，在Herculase II引导反应中(Stratagene，La Jolla，CA，USA)。PCR条件为98℃1分钟(初始变性)，随后为25个如下循环：95℃变性20秒，在45℃和55℃(梯度)之间退火45秒，然后在72℃延伸模板30秒。最终在72℃延伸5分钟，完成反应。通过用SacI/AscI消化从PBAD-tetR表达载体pVER7314中切除野生型TetR(B)。pVER7314主链片段用小牛肠磷酸酶处理并纯化，然后完全延伸的库片段集(～500bp)用SacI/AscI限制性酶消化并插入以生成L1质粒库。给得自库L1的大约50个随机克隆测序并将信息汇集以进行质量控制。结果显示提供了几乎所有靶向多样性组的氨基酸(数据未示出)。测序结果显示17％的序列包含终止密码子。这小于预测的27％(例如10个具有1/32密码子的位点为终止密码子，1-(31/32)¹⁰～27％)。此外，序列分析显示13％的克隆具有移码，这是由于重叠延伸过程中的错误。因此，总体上大约30％的库由编码截短多肽的克隆组成。

C.筛选建立

为了测试库与噻磺隆(Ts)反应的稀有克隆，开发了基于大肠杆菌的灵敏基因筛选。该筛选是建立的测定体系的修改形式(Wissmann等人，(1991)Genetics 128：225-232)。该筛选由阻遏物预筛选及随后的诱导筛选组成。对于阻遏物预筛选，开发了一种基因级联，从而使编码卡那霉素抗性的nptIII基因处于lac启动子的控制之下。lac启动子受到Lac阻遏物的阻遏，该蛋白由lacI编码，其表达继而受到tet启动子(PtetR)的控制。tet启动子受到TetR的阻遏，其阻止LacI的产生并因此最终使卡那霉素的表达受到抑制。

因为tet调节子具有双启动子，一个启动子用于tetR，一个启动子用于tetA，相同的菌株用编码报告酶β-半乳醣苷酶的大肠杆菌lacZ基因进行工程化，该酶处于tetA启动子(PtetA)的控制之下。双调节子编码lacI和lacZ，然后它由强转录终止子界定：大肠杆菌RNA核糖体操纵子终止子rrnB T1-T2(Ghosh等人，(1991)J Mol Biol 222：59-66)和大肠杆菌RNA聚合酶亚基C终止子rpoC，使得在任一个tet启动子方向的伪转录阅读将不会干扰任何其它转录物的表达。在功能TetR的存在下，所述菌株表现出lac^-表型并且菌落能够容易地被新型化学物质与X-gal诱导，其中诱导提供增强的蓝色菌落颜色。此外，在液体培养物中用新型化学物质诱导能够通过使用β-半乳醣苷酶测定法与色度或荧光底物一起进行定量测量。

为了使SU化合物更好地渗入大肠杆菌(Robert LaRossa-DuPont：personal communication)，宿主菌株tolC基因座用收到的Plac-nptIII报告基因敲除。强转录终止子T22来自鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)噬菌体P22，它位于lac启动子的上游以防止条件型卡那霉素抗性标记的下调遗漏表达。最终工程化菌株的名称为大肠杆菌KM3。

将改组tetR LBD的种群克隆进基于Ap^r/ColE1的载体pVER7314中，该载体在P_BAD启动子之后。t这被设计用于使人们能够通过改变生长培养基中的阿拉伯糖浓度来精密控制TetR的表达(Guzman等人，(1995)J Bacteriol 177：4121-4130)。尽管受到P_BAD启动子的控制，TetR蛋白在缺乏加入的阿拉伯糖的情况下的表达水平足以能够选择有卡那霉素抗性的菌株KM3。然而，可通过加入阿拉伯糖增加表达，例如如果期望测定严格性发生改变时。

D.库筛选

在装配L1寡核苷酸并收集载体pVER7314后，在不存在目标配体(“apo-阻遏物”)将所得库转化到大肠杆菌菌株KM3中并置于包含50μg/mL羧苄青霉素的LB平板上以选择库质粒，并且该平板包含60μg/mL的卡那霉素以选择活性阻遏物种群。这个选择种群的DNA序列分析指示这个步骤高度富集了多个库位点。此外，这个步骤消除了具有早熟终止密码子和/或移码突变的克隆。随后，在

(Ts)的存在下筛选这些apo-阻遏物序列以获得阻遏物活性的改变，这通过将来自384-孔样式的液体培养物的Km^r预选种群重复接种到M9琼脂上，所述琼脂包含0.1％的甘油作为碳源，0.04％的酸水解酪素(以防止由施用磺酰脲类引起的支链氨基酸缺乏)，50μg/mL的羧苄青霉素用于质粒维持，0.004％X-gal用于检测β-半乳醣苷酶活性，以及20μg/mL的+/-SU诱导剂Ts。从一组接近20,000个菌落中鉴定初始hits，筛选所述菌落以获得在30℃孵育2天后对Ts的响应。然后在相同条件下但是在96-孔样式中鉴定的十四个推定hits再进行测试。DNA序列分析揭示克隆L1-3和L1-19是相同的并且最强的响应hits(L-2、-3(19)、-5、-9、-11和-20)在多个库位点处具有显著的丰度，说明直接或间接地涉及配体相互作用。然后再筛选相同库以再鉴定10个hits，从而克隆总数达到23个。

随后在相同平板测定样式中用一组九个登记为商用的磺酰脲类(SU)化合物(表2)筛选全部23个推定hits，发现其中11个hits对其它SU配体响应显著(表3)。对于这一实验，编码L1hits或wt TetR(SEQ IDNO：2)的大肠杆菌克隆以96-孔样式排列并且印在包含或不包含20μg/ml的测试SU化合物的M9X-gal测定培养基中。在30℃下生长48小时后将所述平板数码拍照并将菌落颜色强度转化成β-半乳醣苷酶活性的相对值。使用的诱导剂：20ppm的噻吩磺隆(Ts)、甲磺隆(Ms)、甲嘧磺隆(Sm)、胺苯磺隆(Es)、苯磺隆(Tb)、氯嘧磺隆(Ci)、烟嘧磺隆(Ns)、砜嘧磺隆(Rs)、氯磺隆(Cs)，并用0.4μM的去水四环素(atc)作为阳性对照以诱导wt TetR。一些磺酰脲类化合物，尤其是氯嘧磺隆、胺苯磺隆、和氯磺隆是比起始配体更强的活化剂。

表2：

表3

对库1的初始筛选也检测了具有反式阻遏物活性(SEQ IDNO：412-419)的库成员，其中所述多肽在SU配体的存在下结合操纵子。这些hits示出了在无SU配体的情况下的β-半乳醣苷酶表达，当加入所述配体如噻吩磺隆时所述表达大幅减少。随后在如上所述的相同平板测定样式中用一组九个登记为商用的磺酰脲类(SU)化合物(表3)筛选这些hits，发现其中8个hits对其它SU配体响应显著(表4)。

表4：

E.关联第一轮改组结果与结构模型

在多数库位点发生显著的富集，其中富集包括偏爱特定氨基酸以及偏排斥特定氨基酸。初始筛选涉及用于鉴定阻遏物和去阻遏物功能的两个阶段。富集发生在筛选的两个阶段。在第一阶段，位点通过选择“apo阻遏物”，即，在缺乏配体的情况下阻遏基因转录的蛋白富集。在第二阶段，位点通过选择“活化剂”，即，在配体的存在下允许基因转录的蛋白富集。位点可通过选择判据、两个判据、或不选择判据富集。对阻遏物活性的第一轮筛选结果如下所述：

完成多轮库设计和改组。在序列表中提供了所得多核苷酸和编码的SuR。

概述

图1提供了在得自筛选测定的活性SuR中导入的多样性和观察到的氨基酸的综述。即使一些位点受到强烈的偏爱(即，在选择种群中较频繁的被观察到)(用较大的粗体指示)，在全hit种群中观察到完整的导入多样性。

实施例2：磺酰脲类阻遏物配体结合域融合

本文提供了来自磺酰脲类阻遏物的配体结合域，其能够与供选择的DNA结合域结合以产生更多选择性地和特异性地结合其它DNA序列的磺酰脲类阻遏物(例如Wharton和Ptashne(1985)Nature 316：601-605)。已经公布了多个结构域交换实验，展示了这种方法的适用范围和灵活性。一般来讲，操纵子结合域或特定氨基酸/操纵子接触来自不同阻遏物系统的残基，它们将被使用，但是也可使用其它DNA结合域。例如，可使用任何标准分子生物学方法或其组合构建编码TetR(D)/SuR嵌合多肽的多核苷酸，所述嵌合多肽由来自TetR(D)(例如氨基酸残基1-50)的DNA结合域和来自TetR(B)的SuR残基(例如氨基酸残基51-208的配体结合域组成，所述方法包括限制性酶消化和连接、PCR、合成寡核苷酸、诱变或重组克隆。例如，编码包含TetR(D)/SuR嵌合体的SuR的多核苷酸可通过PCR进行构建(Landt等人，(1990)Gene 96：125-128；Schnappinger等人，(1998)EMBO J 17：535-543)并被克隆进合适的表达盒和载体。可取代任何其它TetOp结合域以产生特异性结合同源tet操纵子序列的SuR。

此外，可使用来自变体TetR的突变体TetO^c结合域，所述变体对组成型操纵子序列(tetO-4C和tetO-6C)具有抑制子活性(参见例如Helbl& Hillen(1998)J Mol Biol 276：313-318；and Helbl等人，(1998)J Mol Biol276：319-324)。此外，可改变编码这些DNA结合域的多核苷酸以改变它们的操纵子结合特性。例如，可改组多核苷酸以增强对野生型或改性tet操纵子序列的结合强度或特异性，或用于选择对新操纵子序列的特异性结合。

可通过融合SuR阻遏物或SuR配体结合域到激活结构域上来制造附加的变体。已经使用Tet阻遏物开发出此类系统。例如，一个系统经由将阻遏物融合到转录反式激活结构域如单纯疱疹病毒VP16和tet阻遏物上，将tet阻遏物转化成激活因子(tTA，Gossen & Bujard(1992)PNAS89：5547-5551)。所述阻遏物融合与小型启动子联合使用，该启动子在缺乏四环素的情况下通过结合tTA至tet操纵子序列上而被激活。四环素灭活所述反式作用子并抑制转录。

实施例3：操纵子结合

为了确认磺酰脲类配体与改性阻遏物分子直接结合并引起去阻遏，进行体外tet操纵子凝胶迁移(gel shift)研究。

进行EsR变体的电泳凝胶迁移测定(EMSA)以监测与tet操纵子(tetO)序列的结合和对诱导剂Es与Cs的络合物的响应。TetO由合成的包含48bp tetO的片段组成，该片段通过杂交寡核苷酸tetO1(SEQ ID NO：837)：

5’-CCTAATTTTTGTTGACACTCTATCATTGATAGAGTTATTTTACCACTC-3’

和互补寡核苷酸tetO2(SEQ ID NO：838)：

5’-GGATTAAAAACAACTGTGAGATAGTAACTATCTCAATAAAATGGTGAG-3’形成

tet操纵子用粗体示出。

使用寡核苷酸及其相同大小的互补序列(不包含回文序列)作为对照(SEQ ID NO：839)：

5’-CCTAATTTTTGTTGACTGTGTTAGTCCATAGCTGGTATTTTACCACTC-3’

和互补寡核苷酸(SEQ ID NO：840)：

5’-GGATTAAAAACAACTGACACAATCAGGTATCGACCATAAAATGGTGAG-3’

在有或无诱导剂的情况下五pmol的TetO或对照DNA与指示量的胺苯磺隆阻遏物(L7A11，SEQ ID NO：409)或BSA对照在包含20mMTris-HCl(pH8.0)和10mM EDTA的复杂缓冲液中混合。在加载到凝胶上之前，在室温下孵育混合物0.5小时。反应物在Novex 6％DNA延迟凝胶(Invitrogen)中电泳，温度为室温，38V，在0.5X TBE缓冲液中进行约2小时。通过溴化乙锭染色检测DNA。这些结果(未示出)展示改性的阻遏物结合操纵子DNA并且以诱导剂特异性和剂量依赖的方式从操纵子序列中释放出来。

实施例4：结合和解离常数

使用Biacore^TM SPR技术(Biacore，GE Healthcare，USA)进一步表征选择的SU阻遏物的操纵子和配体的结合、亲和和解离动力学。该技术基于面等离子体共振(SPR)，这是一种光学现象，能够实时检测未标记的作用物。可使用基于SPR的生物传感器测定活性物质浓度、筛选并表征亲和力和动力学。

相互作用的动力学，即络合物形成速率(k_a)和解离速率(k_d)，可从传感图信息中测定。如果结合当样品通过制备好的传感器表面上时发生，在传感图中的响应增强。如果达到平衡，看到恒定信号。用缓冲液替换所述样品引起结合的分子分离以及响应降低。Biacore评估软件通过将数据载入相互作用模型产生k_a和k_d值。

相互作用的亲和力作为样品浓度的函数从平衡(看到恒定信号)时的结合水平中测定。亲和力也可从动力学测量中测定。对于简单的1∶1相互作用，平衡常数K_D为动力学速率常数k_d/k_a的比率。

A.操纵子结合阻遏物的特征

阻遏物	k_a(M^-1s^-1)	K_d(s^-1)	K_D(nM)
				Wt TetR	3.3×10⁵	3.0×10^-3	9.0±1.0
L7-1C03-A5	4.7×10⁴	7.8×10^-3	150±5
				L7-3E03-D1	5.5×10⁴	1.1×10^-2	200±50
L7-1F08-A11	7.1×10⁴	1.7×10^-2	250±120
				L7-1G06-B2	4.6×10⁴	1.9×10^-2	430±160

B.SU结合阻遏物的特征

实施例5：植物测定

A.本生烟草(Nicotiana benthamiana)叶渗入测定

开发了植物中的瞬时测定系统以在测试转基因植物之前快速确认植物中的候选SU-响应化学物质开关系统的功能。开发出了基于农杆菌属(Agrobacterium)的叶渗入测定法以量度阻遏和去阻遏活性。报告基因和效应子(阻遏物)农杆菌属菌株的混合物渗入本生烟草(N.benthamiana)叶，使得在效应子的存在下报告基因活性降低了～90％，然后在用诱导剂处理后去阻遏。

选择两个胺苯磺隆阻遏物EsR A11和EsR D01以测试对胺苯磺隆联合野生型TetR对照物的剂量响应。三个测试菌株通过用三个不同的基于T-DNA的载体转化根癌农杆菌(A.tumefaciens)EHA105而得到。构建包含二元载体的农杆菌属菌株，其具有35S::tetO-Renilla荧光素酶报告基因和dPCSV-tetR或-SuR效应子变体。除了这些测试培养物外，还将包含dMMV-GFP T-DNA的现有农杆菌属菌株加到测定混合物中以监测取样目的的农杆菌属感染的进程。

为了测试化学开关激活系统，包含10％35S::tetO-ReLuc报告基因Agro，10％dMMV-GFP Agro和80％dPCSV-wt tetR Agro的测试农杆菌属培养物的混合物渗入本生烟草(N.benthamiana)叶并在生长室中共培养36小时。然后切除渗入的叶并将叶柄置于水中(阴性对照)或测试浓度的诱导剂中，并且再共培养36小时。测定感染叶区域的Renilla荧光素酶活性并与诱导剂处理比较。结果显示报告对于所有测试阻遏物，无诱导剂处理(水对照组)的基因活性(～90％)受到显著阻抑，以及在低至0.02ppm Es的诱导剂浓度下EsR D01阻遏物的显著但不完全的诱导。在0.2ppm Es下EsR’s被完全诱导，而TetR仅在2.0ppm的去水四环素下被完全诱导。

B.烟草(N.tabacum)BY-2细胞化学开关测定法

I除了叶测定之外，还期望有一种植物内的测定法以能够进行高通量的筛选。使用烟草BY-2细胞培养物在96-孔的样式中设计类似于叶测定的系统。用dMMV-HRA构建体转化BY-2细胞培养物，使得该培养物将经受靶磺酰脲类测试化合物的处理。所得细胞系生长并对200ppb的氯磺隆具有完全抗性。

C.大豆中的磺酰脲类响应化学开关

任何转化规程、培养技术、大豆来源和培养基、以及分子克隆技术可与所述组合物和方法一起使用。

i.转化并再生大豆(Glycine max)

通过粒子枪轰击产生转基因大豆品系(Klein等人，Nature327：70-73(1987)；美国专利公开4,945,050)，使用BIORAD BiolisticPDS 1000/He仪器和质粒或片段DNA。大豆植株的转化和再生利用下列储备液和培养基：

储备液：

100X硫酸盐储备液：37.0g MgSO4.7H2O，1.69g MnSO4.H2O，0.86gZnSO4.7H2O，0.0025g CuSO4.5H2O

100X卤化物储备液：30.0g CaCl2.2H2O，0.083g KI，0.0025gCoCl2.6H2O

100X P，B，Mo储备液：18.5g KH2PO4，0.62g H3BO3，0.025gNa2MoO4.2H2O

100X Fe EDTA储备液：3.724g Na2EDTA，2.784g FeSO4.7H2O

2，4-D储备液：10mg/mL 2，4-二氯苯氧乙酸

B5维生素，1000X储备液：100.0g肌醇，1.0g烟酸，1.0g盐酸吡哆醇，10g盐酸硫胺素。

培养基(每升)：

SB199固体培养基：1个包装的MS盐(Gibco/BRL，目录号11117-066)，1mL B5维生素1000X储备液，30g蔗糖，4mL 2，4-D(40mg/L最终浓度)，pH 7.0，2g固化剂

SB1固体培养基：1个包装的MS盐(Gibco/BRL，目录号11117-066)，1mL B5维生素1000X储备液，31.5g葡萄糖，2mL 2，4-D(20mg/L最终浓度)，pH 5.7，8g TC琼脂

SB196：10mL各种上述储备液1-4，1mL B5维生素储备液，0.463g(NH4)2SO4，2.83g KNO3，1mL 2，4D储备液，1g天冬酰胺，10g蔗糖，pH 5.7

SB71-4：Gamborg’s B5盐，20g蔗糖，5g TC琼脂，pH 5.7。

SB103：1pk.Murashige & Skoog盐混合物，1mL B5维生素储备液，750mg MgCl2六水合物，60g麦芽糖，2g固化剂，pH5.7。

SB166：向SB103添加5g/L的活性炭而成。

每个月诱导大豆胚胎生成悬浮培养物两次，每次诱导间隔5-7天。将种植45至55天后的存活大豆植株的带有未成熟种子的豆荚摘下，将其去壳后置入一个灭菌后的Magenta盒子中。大豆种子进行消毒处理，所述处理通过将它们在具有1滴象牙香皂的5％v/v CLOROX^TM溶液中振荡15分钟进行。种子使用2个1升瓶的无菌蒸馏水漂洗，将那些小于3mm的种子置于单个显微镜载片上。切下种籽的小末端，并将子叶挤出种籽壳。子叶被转入含SB199培养基的平板(每板25-30个子叶)培养2周，然后转入SB 1培养2至4周。用纤维带包裹平板。此次之后，将次级胚切下，并置于SB196液体培养基中7天。

大豆胚胎生成悬浮培养物(cv.Jack)培养于50mL液体SB196培养基，培养条件为150rpm摇床培养、26℃和按16：8小时昼/夜光周期以60-85μE/m2/s光强用白色冷光荧光灯照射。每7天至两周通过接种大约50mg组织到35mL新鲜液体SB196中对培养物进行传代培养(优选的传代培养间隔为每隔7天)。

用于轰击的DNA的准备：

完整的质粒DNA或DNA片段仅包含受关注的重组DNA表达盒(s)，其可用于粒子枪轰击方法。对于每十七次轰击转化，每种DNA质粒制备包含每碱基对1至90皮克(pg)的质粒DNA的85μL悬液。两个重组DNA质粒如下所述共沉淀到金颗粒上。将悬浮液中的DNA加到50μl的10-60mg/mL 0.6μM金颗粒悬浮液中，然后与50μl CaCl2(2.5M)和20μl亚精胺(0.1M)混合。混合物振荡混匀5秒，用微离心机离心5秒，去除上清。然后用150μl 100％乙醇洗涤DNA包被颗粒一次，涡旋并沉淀，然后重悬在85μl的无水乙醇中。然后将五μL该DNA包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。

将约150-250mg已培养两周的悬浮培养物置入一个空的60mm ×15mm皮氏培养皿，并用移液器将残留的液体自上述组织吸走。将该组织置于距离保留筛网约3.5英寸的地方，并且轰击每个组织培养皿一次。膜破裂压力设定为650psi并将腔室抽成-28英寸汞柱。

在轰击后，分开来自每个轰击培养皿的组织并将每个培养皿的轰击组织置于液体培养物维持培养基的两个SB 196烧瓶中。轰击后七天，每个烧瓶中的液体培养基用补充有100ng/ml选择剂(选择培养基)的新鲜SB196培养物维持培养基置换。使用磺酰脲类(SU)化合物选择转化的大豆细胞，所述化合物如2氯代N((4甲氧基6甲基1，3，5三嗪2基)氨基羰基)苯磺酰胺(常用名：DPX-W4189和氯磺隆)。氯磺隆(Cs)为DuPont磺酰脲类除草剂

中的活性成分。每两周更换包含SU的选择培养基，持续6-8周。在6-8周的选择期后，观察从未转化的坏死胚芽发生簇上生长的绿色转化组织的岛状物。分离这些推定的转基因事件并保存在具有100ng/mL Cs的SB196液体培养基中再培养2-6周，每隔1-2周改变培养基以生成新的无性繁殖的转化胚芽悬浮培养物。胚芽经总计大约8-12周接触Cs。然后可将悬浮培养物作为未成熟胚进行传代培养和维持，也通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。

体细胞胚在成熟培养基上四周(1周在SB 166上，随后3周在SB103上)后变得适于发芽。然后从成熟培养基中移除它们并在空皮氏培养皿中干燥至多七天。然后将干燥的胚胎种植于SB714培养基中，胚胎可在上述相同的光照和温度条件下于其中萌发。将发芽的胚转移到罐装培养基中并生长至成熟，用于种子生产。

ii.载体构建和测试

使用标准方法制备质粒并使用限制性核酸内切酶和琼脂糖凝胶纯化将质粒从这些质粒DNA片段中分离。每个DNA片段包含三个盒。盒1为报告基因表达盒；盒2为阻遏物表达盒；以及，盒3为表达盒，其提供HRA基因。在盒2中测试的阻遏物在表5中进行了描述。合成包含阻遏物编码区的多核苷酸以包含植物优选的密码子。在所有情况下盒1包含35S的花椰菜花叶病毒启动子，其具有三个tet操纵子，它们被导入到接近TATA框的区域(Gatz等人，(1992)Plant J 2：397-404(3XOpT35S))，该区域驱动在35S花椰菜花叶病毒3’终止子区域之后的DsRed的表达。在所有情况下盒三包含S-腺苷甲硫氨酸合酶启动子，其后接HRA版本的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，随后是大豆ALS 3’终止子。HRA版本的ALS基因赋予对磺酰脲类除草剂的抗性。EF1A1为如US2008/0313776所述的大豆翻译延伸因子EF1α的启动子。

表5：

DNA片段用于如上所述的大豆转化。再生植物并从嫩叶中收获叶盘(～0.5cm)。在包含0ppm、0.5ppm或5ppm胺苯磺隆的SB103液体培养基中孵育叶盘2-5天。胺苯磺隆(产品编号PS-2183)购自ChemService(West Chester，PA)并溶解在10mM NaOH或10mM NH₄OH中。每天在具有DsRed带通滤波器的分析显微镜下检查叶盘。给存在的DsRed进行视觉评分。

在0时表达DsRed的植物评分为遗漏。在五天后不表达DsRed的植物评分为阴性。在加入胺苯磺隆后表达DsRed的植物评分为可诱导。得自实验的结果示于表6中。

表6：

名称	别名	总事件	％遗漏	％阴性	％可诱导
						PHP37586A	CHSW004	12	33	33	33
PHP37587A	CHSW005	28	7	50	43
						PHP37588A	CHSW006	6	0	0	100
PHP37589A	CHSW007	9	0	22	78
						PHP39389A	CHSW010*	19	5	26	42
PHP39390A	CHSW011*	35	0	17	57

*在这些情况下，来自一些事件的总计未达到100％的多个植物受到检查，并且在一些情况下，来自这些事件的不同植物表现不同。

阻遏物响应胺苯磺隆，这证明受到DsRed表达的诱导。源自前四个片段的植物在培养三天后显示出DsRed的视觉上的效应。源自后两个片段的植物在培养两天后显示出DsRed的视觉上的效应。给存在DsRed在视觉上评分，但是这通过Western印迹分析，使用来自Abcam(Cambridge，MA)的兔多克隆抗体(ab41336)对选择的转化子进行确认。

如上所述从选择的转化体中收获打孔叶并在具有0、5、50、250和500ppb胺苯磺隆的SB 103培养基中培养。在所有的胺苯磺隆浓度下，叶在培养三天后显示出DsRed在视觉上的效应。在最低浓度(5ppb)下，存在的DsRed被限制在接近叶盘外部边缘的“晕”中。

使植物成熟。因为大豆是自我施肥的，如果在转化期间仅产生一个转基因基因座，将期望源自这些植物的T1种子分离出1野生型：2半合子：1纯合体。种植来自五个不同事件的十六个种子并使它们发芽。从幼苗收集打孔叶并在具有0和5ppm胺苯磺隆的SB103培养基中培养。叶盘进行DsRed表达评分，并将0和3天的结果在表7中示出。

表7：

D.玉米中的磺酰脲类响应化学开关

为了评估植物中的SU-响应化学开关系统，构建RFP报告基因构建体并将其经由农杆菌属转化到玉米细胞中，使用以下T-DNA构型：

RB-35S/TripleOp/Pro::RFP-Ubi Pro::EsR-HRA盒-PAT盒-LB。

使用标准的分子生物学和克隆技术构建具有上述构型的T-DNA载体，其包含选择的3轮SU阻遏物(EsR)。合成包含阻遏物编码区的多核苷酸以包含植物优选的密码子。该构建体概述如下：

构建体ID	SU阻遏物别名(EsR)	SU阻遏物SEQ ID
			PHP37707	L7-1C3-A5	408
PHP37708	L7-1F8-A11	409
			PHP37709	L7-1G6-B2	410
PHP37710	L7-3E3-D1	411

报告基因构建体T-DNA包含CaMV35S启动子，其具有两个侧接TATA框的tet操纵子和一个邻近转录起始位点的下游区域(Gatz等人，(1992)Plant J 2：397-404)，驱动红色荧光蛋白基因、泛素驱动的SU阻遏物(EsR)、包含SU抗性的玉米HRA基因的表达盒和用于选择的moPAT表达盒的表达。

不成熟的胚用标准方法和培养基进行转化。简而言之，从玉米中分离不成熟的胚并使其接触农杆菌属的悬浮液以转化包含T-DNA的磺酰脲类表达盒到至少其中一个不成熟胚的至少一个细胞中。，将不成熟的胚浸入农杆菌属悬浮液以启动接种，培养七天。然后将胚转移到包含羧苄青霉素的培养基中以杀灭任何残余的农杆菌。接下来，在包含羧苄青霉素和双丙氨磷(选择剂)的培养基中培养接种的胚，并且回收生长的转化愈伤组织。然后愈伤组织在转移到土壤以产生成熟植物之前，在固体培养基上再生成试管苗。将来自每个构建体的大约10个单拷贝事件送至温室。

为了评估去阻遏，将愈伤组织转移到具有和不具有胺苯磺隆和氯磺隆的培养基中，并且在显微镜下观察RFP荧光(未示出)。多数事件去阻遏并且在测试的三轮阻遏物之间无明显差异。为了评估植物中的去阻遏，单拷贝植物的种子在存在胺苯磺隆的情况下发芽并且观察荧光及拍照。作为阳性对照，包含相同表达盒构型PHP37707-10，但是用UBI::TetR取代UBI::EsR的载体被转化到玉米不成熟胚中并测试强力霉素诱导。当在1mg/l强力霉素的存在下生长时，转基因愈伤组织和包含TetR表达盒的植物诱导类似5-6天的一段时间。

E.稻中的磺酰脲类响应化学开关

成熟的稻种经表面消毒并置于愈伤组织诱导培养基上(Chu(N6)盐，Eriksson’s维生素，0.5mg/L硫胺素，2mg/L 2，4-D，2.1g/L脯氨酸，30g/L蔗糖，300mg/L酪蛋白水解产物，和100mg/L肌醇，调节至pH 5.8)。在一周后，使用农杆菌属LBA4404转化愈伤组织，递送以下T-DNA：

RB-35S PRO：3xTetOp：dsRED::pinII+35S PRO::Adh内含子::ESR(L13-2-23)::UBI TERM+Sb-ALS PRO::HRA::pinII-LB

在视觉上选择RFP+愈伤组织在100ppb胺苯磺隆上生长的转基因事件。在抗除草剂后，形成明显的红色愈伤组织，将所述愈伤组织转移到无胺苯磺隆的培养基上，并且该愈伤组织长出这一培养基，不表现出红色荧光(即，阻遏已经被再次形成)。然后将非荧光的事件转移到包含不同量磺酰脲类(SU)的培养基平板上。对于所述对照，其无SU，用包含100或500ppb氯磺隆和100或500ppb胺苯磺隆的处理剂进行附加处理，在诱导处理20小时后，以相同曝光拍摄显微图像并评分(参见实施例7的评分准则)，如下表所示。

处理	RFP评分
		对照(无SU)	0
100ppb氯磺隆	0-1
		100ppb胺苯磺隆	1-2
500ppb氯磺隆	2-3
		500ppb胺苯磺隆	4

这些结果清楚地显示在不存在配体的情况下，在稻愈伤组织中表达RFP受到有效地阻遏，并且在加入配体后，发生不同程度的去阻遏，产生RFP荧光。胺苯磺隆的诱导水平比氯磺隆更高，并且500ppb的处理剂用于两种配体时的诱导水平比100ppb处理剂的诱导水平更高。

实施例6：受控的表达开关系统

任何转化规程、培养技术、植物、外植体、种子、或组织源、培养基、构建体元件、分子克隆技术和诊断方法可与所述组合物和方法一起使用。

使用多个构建体元件，如常见的缩略词所示。为方便起见，简述这些元件。本领域的技术人员能够选择供选择的元件，它们提供相似的功能和/或特性。在一些实施例中，使用荧光报告基因如DsRED、AmCYAN、ZsGREEN、和ZsYELLOW，它们均购自Clontech(Mountain View，CA)。使用来自CaMV的元件，包括启动子(35S Pro、35SCaMV)、增强子(35SEnh)、和/或终止子(35S 3’、CaMV35S 3’、35S term)。一些盒包括内含子，例如来自玉米的醇脱氢酶内含子(Adh1内含子)。使用多种终止子，包括来自泛素基因的终止子(ubi 3’，ubi term)、来自农杆菌属(nosterm，nos 3’)的胭脂碱合酶终止子、来自马铃薯的蛋白酶抑制蛋白终止子(pinII 3’，pinII term)、或来自大豆的乙酰乳酸合酶(ALS)终止子(GmALS3’，ALS term)。除了已经描述的那些，启动子包括来自高粱(S.bicolor)(SbALS pro)的ALS启动子。编码区包括提供SU抗性(HRA)的乙酰乳酸合酶(ALS)变体、发育基因如胚珠发育蛋白(ODP2)(参见例如美国专利7,579,529)、具有改变密码子的重组酶如FLP或Cre(moFLP，moCre)(参见例如美国专利6,720,475、美国专利6,262,341)。其它元件包括重组位点如FRT位点或lox位点，其中FRT1指野生型最小FRT位点，loxP指野生型最小lox位点，并且其它名称指非野生型最小位点。缩写RB和LB分别指农杆菌属T-DNA的右边界和左边界序列。

A.玉米中胺苯磺隆诱导的愈伤组织启动

来自玉米自交体PHN46的不成熟的玉米胚如实施例5D所述使用农杆菌属进行转化，所述农杆菌属包含：

RB-BSV(AY)PRO::tetOp::Adh1内含子::ODP2::pinII+35S ENH::ALSPRO::HRA::pinII+Ubi Pro::ESR(3E3)::pinII-LB.

在100μg/l氯磺隆上选择事件，并且试管苗在缺乏SU化合物的情况下再生。当试管苗高度大约为20cm时，将叶切成大约2-4mm的横截面并置于胚胎形成培养基+/-100mg/L氯磺隆上。经过接下来的两周，对照培养基(无SU)上的叶碎片坏死及凋亡，但是在包含氯磺隆的培养基上叶碎片从叶部分产生愈伤组织。

B.胺苯磺隆在玉米中诱导的重组

1.切除

受关注的多核苷酸的表达可受到居间片段的诱导切除的控制，从而产生或改善与表达控制元件的功能性连接。

玉米的不成熟胚和成熟胚来源的稻愈伤组织如上所述进行转化。用农杆菌属LBA4404共转化每个胚，所述农杆菌包含以下两个T-DNA，它们每个在分离的质粒上：

RB-35S PRO:tetOp::Adh内含子::moCRE::pinII+35S PRO::Adh内含子::ESR(L13-2-23)::Ubi14TERM+UBI PRO::Ubi内含子::moPAT::pinII-LB

RB-Ubi Pro::SbALS::pinII+Ubi Pro:loxP:AmCYAN::pinII-loxP:ZsYELLOW::pinII-LB

在农杆菌属转化后，在包含3mg/L双丙氨磷的培养基上选择转基因事件。回收抗除草剂的、发蓝色荧光的共转化愈伤组织并测试其SU诱导切除。将愈伤组织分开转移到培养基+/-250μg/L胺苯磺隆上。对于稻和玉米，在一周后对照物(无SU)的愈伤组织继续仅表达AmCYAN(发蓝色荧光)，而在250μg/L胺苯磺隆的存在下生长的愈伤组织观察到黄色荧光，指示切除了AmCYAN并激活了ZsYELLOW的表达。

2.倒置

可使用在正向和反向反应中具有不等活性的重组位点以稳定地触发化学开关。此类重组位点的实施例是可用的，例如参见Albert等人，(1995)Plant J 7:649-659(以引用方式并入本文)。

玉米不成熟胚与农杆菌属LBA4404共转化，所述农杆菌包含以下2个T-DNA，它们每个在分离的质粒上：

RB-35S PRO:tetOp::Adh内含子::moCRE::pinII+35S PRO::Adh内含子::ESR(L13-2-23)::Ubi14 TERM+UBI PRO::Ubi内含子::moPAT::pinII-LB

RB-Ubi Pro::SbALS::pinII+Ubi Pro:lox66:AmCYAN::pinII+pinII(反向)::ZsYELLOW(反向)::lox71(反向)-LB

在转化后，在包含3mg/L双丙氨磷的培养基上选择转基因事件。回收抗除草剂的、发蓝色荧光的共转化愈伤组织并测试其SU诱导的倒置。将愈伤组织分开转移到培养基+/-250μg/L胺苯磺隆上。在一周后，在对照培养基(无SU)上的愈伤组织将继续仅表达AmCYAN(发蓝色荧光)，而在250μg/L胺苯磺隆的存在下生长的愈伤组织将具有仅发黄色荧光的部分，指示倒置并激活ZsYELLOW表达。

3.位点特异性整合

玉米不成熟胚用农杆菌属LBA4404转化，所述农杆菌包含以下FLP构建体：

RB-35S PRO:tetOp::Adh内含子::moFLP::pinII+35S PRO::Adh内含子::ESR(L13-2-23)::Ubi14TERM+Ubi Pro::SbALS::pinII+loxP-Rab17PRO::moCRE::pinII+UBI PRO::Ubi内含子::moPAT::pinII-loxP-LB

在标准玉米胚形成培养基+3mg/L双丙氨磷上选择愈伤组织事件8周，这时将所述愈伤组织转移到干燥滤纸上2-3天以诱导Cre重组酶表达并从转基因基因座上切除Cre和moPAT表达盒。在解离诱导的选择性标记切除后，将所述愈伤组织移至无双丙氨磷的成熟和再生培养基上。再生植物是自花授粉的并且子代据分析恢复了纯合转基因事件。

T1子代包含两拷贝的FLP构建体基因座，它们杂交到对于SSI靶为纯合的植物中：

RB-Ubi Pro:FRT1:AmCYAN::pinII+Ubi Pro:GAT::pinII-FRT6-LB.

所得子代包含一拷贝的诱导FLP重组酶和一拷贝的靶位点。当不成熟胚长度为1.2mm时分离它们并在250ppb的胺苯磺隆上培养3天。在诱导的moFLP表达3天后，将所述胚移至高渗培养基(560M)中并用包含FRT1::moPAT::pinII+Ubi Pro:YFP::pinII-FRT6的供体载体轰击。

在轰击后，在无选择除草剂的560P培养基+250ppb胺苯磺隆上再培养胚一周。在导入时，FLP重组酶有利于用moPAT::pinII+UbiPro:YFP::pinII取代CFP::pinII+Ubi Pro:GAT::pinII，将愈伤组织表型从{CFP+，GAT+}变成{YFP+，PAT+}。轰击后一周，从SU培养基中移出胚并置于培养基+3mg/L双丙氨磷上。回收抗双丙氨磷的、发黄色荧光的位点特异性整合事件并再生能繁殖的玉米植株。

C.在大豆中诱导的基因沉默

使用标准方法制备质粒并使用限制性核酸内切酶和琼脂糖凝胶纯化将质粒从这些质粒DNA片段中分离。每个DNA片段将包含五个盒：

盒1包含编码玉米在35S花椰菜花叶病毒启动子的控制下优化Cre重组酶的序列(参见例如美国专利6,262,341，该专利以引用方式并入本文)，所述启动子具有三个tet操纵子，它们被导入到邻近TATA框的区域(Gatz等人，(1992)Plant J 2：397-404(3XOpT 35S))；

盒2包含编码沉默构建体的序列，在这种情况下人工miRNA在紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子的控制下包含大豆microRNA159主链和FAD2-1b miRNA(参见US2009/0155910，该专利以引用方式并入本文)。将盒3插入启动子和盒2的沉默构建体之间；

盒3包含在35S花椰菜花叶病毒启动子控制下并侧接LOXP位点的潮霉素抗性基因；

盒4为阻遏物表达盒；和

盒5为表达盒，其提供HRA基因。

盒4和盒5分别等同于盒2和盒3，并且在实施例5C中进行了描述。在SEQ ID NO：847中给出了整个DNA片段的序列。

DNA片段将用于如上述实施例5C的大豆转化。将再生植物并收集种子。这些种子将用胺苯磺隆处理并种植。将收集T2种子并使用标准GC-质谱仪方法测定其脂肪酸水平。期望用胺苯磺隆处理将引起Cre重组酶的诱导，其将切除盒3。然后这允许表达盒2并沉默受关注的基因。在这种情况下受关注的基因是脂肪酸去饱和酶2-1并且沉默引起种子中积聚的油酸(18∶1)量增加。

本领域的技术人员理解159-FAD2-1b的人工microRNA可用引导基因沉默的任何受关注多核苷酸取代。这包括但不限于人工microRNA、RNAi构建体、siRNA构建体、有义沉默构建体、反义沉默构建体、引起双链-RNA产生的构建体、核酶、和工程化的RnaseP构建体。此外驱动盒2或另一个盒的启动子可为组成型(如该处所示)或者可为组织优选的、发育阶段优选的启动子、诱导型启动子或阻抑型启动子。例如胚芽优选的启动子如大豆伴球蛋白启动子可用于盒2。

实施例7：包含Tet操纵子的植物启动子

评估并工程化多个植物启动子以包含tet操纵子序列。一般来讲，将三拷贝的tet操纵子序列(SEQ ID NO：848)置于所述启动子中。操纵子序列的定位基本上基于植物中广泛使用的35S-TripleOp启动子建模(Gatz等人，(1992)Plant J 2：397)。然而，供选择的构型是可能的，包括用于设计配体调控的启动子的tet操纵子的数量、位置和/或序列，它们可根据功能、启动子类型、启动子序列、启动子保守性、物种和其它准则而不同(参见例如Berens & Hillen(2003)Eur J Biochem 270：3109；Gatz & Quail(1998)PNAS 85：1394-1397；Gatz等人，(1991)Mol Gen Genet227：229-237；Frohberg等人，(1991)PNAS 88：10470-10474)。

通过分析一个或多个相关候选启动子以鉴定任何保守区域以及定位包括TATA-框、Y-区、和转录起始位点(TSS)的基序来评估选择的启动子。在一些实施例中，这些基序中的一个或多个不能被清楚地鉴定。目的是为了混入tet操纵子序列以获得最大的预测功能，同时最小化对序列、保守区、基序、和基序间和/或保守区之间的间隔区的破坏。混入侧接预测TATA框的两个操纵子序列，并且第三个操纵子邻近转录起始位点或与之重叠。操纵子的最终位置和间隔取决于启动子序列和基序。当可能的时候，操纵子序列的定位最小化改变，因此将发生序列取代而不是插入。在设计操纵子在启动子中的位置后，再分析所得序列以确认初始的启动子基序通过分析方法和算法进行预测。

一般来讲，tet操纵子序列位于TATA框任一边的若干个核苷酸范围内，并且在一些情况下与TATA框序列或转录起始位点(TSS)有短的重叠。第三操纵子位于邻近转录起始位点的第二操纵子的下游。第三操纵子通常位于TSS的下游，并且在某些情况下具有与TSS序列的一些重叠。从这些启动子开始的活性能够使用任何四环素化合物/四环素阻遏物系统、和/或使用任何磺酰脲类化合物/磺酰脲类阻遏物系统进行控制。

紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子具有单(SEQ ID NO：851)和双增强子结构域(dMMV)(SEQ ID NO：852)(Dey & Maiti(1999)Plant Mol Biol40：771-782；Dey & Maiti(1999)Transgenics 3：61-70)，分析该启动子以鉴定保守序列区和推定的基序。这些启动子序列一般如上文所述进行修改以避免破坏任何保守区域或基序并包括三拷贝的tet操纵子(SEQ IDNO：848)以产生受调控的启动子MMV::tetOp(SEQ ID NO：857)和dMMV::tetOp(SEQ ID NO：858)。启动子设计如图2A所示。第二tet操纵子具有与预测的转录起始位点(TSS)的小重叠。从这些启动子开始的活性能够使用任何四环素化合物/四环素阻遏物系统、和/或使用任何磺酰脲类化合物/磺酰脲类阻遏物系统进行控制。

与六个其它BSV分离启动子序列一起分析香蕉条纹病毒AcuminataYunan(BSV(AY))启动子(SEQ ID NO：850)以鉴定保守序列区和推定基序。所述分析鉴定多个保守区域和推定的TATA框、TSS、以及Y-区。BSV(AY)启动子序列一般如上文所述进行修改以包括三拷贝的tet操纵子(SEQ ID NO：848)，从而产生受调控的启动子BSV::tetOp(SEQ IDNO：856)。再分析设计的序列的预测TATA框和TSS。

来自大豆(SEQ ID NO：854)的EF1A2启动子与另一个大豆启动子、两个拟南芥属(Arabidopsis)启动子、以及两个苜蓿属(Medicago)EF1A启动子序列一起分析以鉴定保守序列区域和基序。基于这一分析，设计三拷贝tet操纵子(SEQ ID NO：848)的位置以产生受调控的启动子EF1A2::tetOp(SEQ ID NO：860)。再分析设计的启动子以确认保留了上文鉴定的TATA框和TSS。启动子设计如图2A所示。

水稻肌动蛋白启动子(SEQ ID NO：849)与来自玉米的肌动蛋白启动子和来自高粱的启动子一起分析。基于这一分析，设计三拷贝tet操纵子(SEQ ID NO：848)的位置以产生受调控的启动子OsActin::tetOp(SEQID NO：855)。再分析设计的启动子的上文鉴定的基序，包括TATA框和TSS。

使用MPSS数据和EST分布以开发启动子短列表，所述启动子看起来好像在玉米分生组织中表达并且在愈伤组织中无活性。MPSS数据鉴定了92个潜在的分生组织特异性基因。这些基因中的七个具有在它们的启动子内的推定TATA框。七个基因中的两个用EST表示，仅有其中一个具有明确定义的TATA框。这个启动子驱动玉米p450基因的表达，将其称为MP1(SEQ ID NO：853)。如上所述分析全长玉米、高粱和稻MP1启动子以鉴定保守序列、基序、TATA框和转录起始位点。三拷贝的tet操纵子序列(SEQ ID NO：848)定位在侧接TATA框处并正处在转录起始位点的下游，仔细避免保守基序产生受调控的启动子MP1：tetOp(SEQ IDNO：859)。再分析设计的启动子以确认保留了上文鉴定的TATA框和TSS。

使用表征的35SCaMV(SEQ ID NO：861)和35SCaMV::tetOP(SEQ IDNO：862)启动子作为对照评估未改变的和设计的MMV、dMMV、和EF1A2启动子的活性。经由在本生烟草(Nicotiana benthamiana)叶中的农杆菌属(Agrobacterium)介导的瞬时表达分析来分析启动子活性。本生烟草(N.benthamiana)叶用荧光素酶报告基因构建体感染，所述构建体受改性或未改性启动子的控制。测试构建体是相同的，不同的是测试启动子序列(Pro)。T测试构建体包含以下可操作地连接的组分：

RB-Pro-RLuc-UBQ3-EF1A-NptII-EF1A3’-LB

定量改性和未改性启动子的相对光照单位(图3)，并且将改性版本的启动子活性测定为未改性启动子活性的百分比(ProOp/Pro)。所述结果显示所有改性启动子仍为活性的，但是活性发生降低，这是加入tet操纵子序列的结果。在这一测定中，35S:tetOp具有作为35S启动子约25％的活性，EF1A2:tetOp具有EF1A2启动子约30％的活性，MMV:tetOp具有MMV启动子约60％的活性，而dMMV:tetOp具有dMMV启动子约50％的活性。

这些相同启动子的磺酰脲类化合物/SuR调控通过用上述测试构建体和农杆菌属菌株共转染本生烟草(N.benthamiana)叶进行分析，所述农杆菌菌株包含磺酰脲类阻遏物表达构建体(pVER7555)：

RB-dMMV-SuR-UBQ14-EF1A-NptII-ScCAL13’-LB

或对照构建体(pVER7549)：

RB-dPCSV-FLuc-UBQ3-EF1A-NptII-EF1A3’-LB

用对照(H₂O)和磺酰脲类配体(胺苯磺隆，Es)测试阻遏和去阻遏。数据展示所有启动子，包括对照35S::tetO启动子，发生相似程度的阻遏和去阻遏(图4)。

合成BSV::tetOp启动子和MP1::tetOp启动子并将它们克隆进表达盒中，所述表达盒驱动用于测试的DsRED(RFP)基因的表达。对于所有RFP表达的比较，并列型比较在实验中进行，这通过拍摄相同曝光的组织显微照片并和定性分级荧光强度完成，评分见下表。DsRED蛋白是非常稳定的(具有相对长的半衰期)，并且甚至在细胞中的低表达水平能够随着时间而积聚。因此，当在缺乏配体的情况下观察到无荧光或低水平的荧光时，这可能代表具有相对严格的阻遏的转基因事件发生。

打分	描述
		0	无荧光
1	弱荧光
		2	中等强度
3	强荧光
		4	非常亮的荧光

如实施例5D中一般所述，玉米不成熟胚用农杆菌属转化。产生包含两个T-DNA中的其中一个的转化体，如下所示：

RB-BSV:tetOp::Adh内含子::dsRed+ALS:HRA+Ubi:ESR(3E3)-LB

RB-35S:tetOp::Adh内含子::dsRed+ALS:HRA+Ubi::ESR(3E3)-LB

使用30、100、或500μg/L的氯磺隆选择转基因事件。氯磺隆一般为活性较低的胺苯磺隆阻遏物诱导剂，具有低大约10倍的活性。六周后，在这三个不同水平的氯磺隆上，在30μg/l处理剂中观察到非常低水平的诱导RFP(评分＝0)。在100μg/l处理剂中观察到小部分RFP荧光，并且虽然荧光亮度强于30μg/L的处理剂，它仍旧是非常弱的。在500μg/l处理剂中，大部分的愈伤组织具有闪亮的荧光。因此，随着细胞培养期间配体浓度的提高，观察到相应的RFP去阻遏的增加。

实施例8：基因开关的自动调控

可使用任何基因开关的组合，包括但不限于一个或多个磺酰脲类反应性阻遏物、四环素反应性阻遏物、或提供的包含四环素操纵子的启动子。

为了测定是否自动调控将增强配体诱导的植物基因表达，构建用于比较来自自动调控的或组成型表达的EsR(L13-23)的dsRED调控转化载体并在瞬时表达测定中测试。标准载体pVER7385(35SOp-dsRED-UBQ3/35S-EsR(L13-23)-UBQ14/SAMS-HRA)表达来自35SOp启动子的dsRED和来自组成型35S启动子的阻遏物。自动调控的测试载体pVER7384基本上与pVER7385相同，不同的是dsRED和EsR均受相同35SOp启动子的控制。第二个自动调控的测试载体pVER7374不同于pVER7384，因为在实施例7中描述的受调控的MMV::Op启动子用于取代35SOp启动子(图6)。包括附加的对照载体pVER7578(35SOp-dsRED-UBQ3/dMMV-EsR(L7-A11)-UBQ14/SAMS-HRA)并且之前显示在本生烟草(N.benthamiana)叶中递送诱导的dsRED表达。这个载体不同于pVER7385，因为强dMMV启动子驱动阻遏物L7-A11的表达。使用标准克隆技术构建所有载体。将每个载体转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)AGL1中，然后在本生烟草(N.benthamiana)中通过强迫渗入叶进行瞬时表达分析。对于每个实施例，测试菌株以80∶20的比率混合，菌株包含用于归一化表达的组成型ZsGREEN载体。每个样品渗入每个半叶一次，在每个半叶上重复这一过程，并且在分离叶上重复相同模式。在共培养2天后，从植物中切除叶，切下叶脉线和切边，置于H₂O或1ppm胺苯磺隆中两天。所有样品平行暴露于水或诱导剂处理，并且重复一次。在处理后使用Typhoon激光扫描器(GE Healthcare，Piscataway，NJ)给所述叶拍照用于dsRED和zsGREEN表达。DsRED(BD Sciences，Clontech)表达使用激发波长532nm和发射波长580nM进行定量。ZsGREEN(BD Sciences，Clontech)表达使用激发波长488nm和发射波长520nm进行定量。数据显示dsRED的诱导比表达自动调控的阻遏物的载体更强(图7)。数据也显示具有调控dsRED和阻遏物的相同启动子以获得增强的诱导不是必需的。

通过将测试农杆菌属培养物真空渗入菜豆(Phaseolus vulgaris)的第一片真叶进行第二次瞬时测定。这通过将植物的完整叶承受部分浸入测试培养物烧杯中来完成，测试培养物由测试菌株与包含组成型ZsGREEN载体的50∶50混合物组成，所述载体用于归一化表达。在这个实验中所述测试限于载体pVER7384、pVER7385和pVER7578。结果显示自动调控的构建体pVER7384受到比两个标准载体中任一个更好的诱导(图8)。相同叶样品的ZsGREEN表达模式指示这一效应不能归因于渗入叶总表达能力的差异。此外，所述结果展示自动调控对配体诱导的植物基因表达的效应不是一个试验植物系统独有的，而可能是所有植物表达宿主通用的。

为了证实这一现象也应用于转基因植物，用测试载体转化烟草属植物并分析植物叶组织对诱导剂的敏感性。使用上述质粒pVER7384和pVER7385测试自动调控对组成型阻遏物表达，使用相同的改组阻遏物变体：EsR(L13-23)。质粒pHD1119、pHD1120和pHD1121基本上与pVER7384相同，不同的是它们编码改组阻遏物变体EsR(L15-1)、EsR(L15-20)和EsR(L15-36)。使用标准克隆技术构建所有载体。将所有载体转化到负触发根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，并且每个新菌株随后用于与64个烟草‘Petite Havana’叶外植体一起共培养。在共培养后，将组织置于具有用于选择存在的连接‘SAMS-HRA’基因的50ppb灭草烟(imazapyr)的培养基上，所述基因编码所有乙酰乳酸合酶的等位基因，它对磺酰脲类和咪唑啉酮除草剂具有交叉抗性。灭草烟代替磺酰脲类化合物用作选择剂，因为这个除草剂将不诱导开关，仅作为选择剂。分析来自每个共培养实验的转化枝的遗漏dsRED表达水平。仅仅无(或最小)遗漏dsRED表达的那些品系进行进一步诱导分析。将来自每个事件的叶盘(除了那些来自pVER7385的叶盘)置于0、5、10、25和50ppb胺苯磺隆(Es)上并在25℃光照下培养。将来自pVER7385共培养转化事件的叶盘置于0和50ppb胺苯磺隆上并与其它叶一起平行培养。在培养24小时后，给叶盘拍照并对相对dsRED表达评分。如图9所示，在50ppb Es无pVER7385(非自动调控的阻遏物)的叶碎片表达显著的dsRED活性，而所有来自自动调控的阻遏物的样品显示一些去阻遏程度，开始于低至5ppb的诱导剂，并且一些在10ppb Es发生强表达。结果展示自动调控对配体诱导的植物基因表达的效应是在转基因植物中可再现的。

冠词“一个”和“一种”指一个或多个，多于冠词语法意义上所指的一个。以举例的方式，“一个元件”指一个或多个元件。在说明书中提及的所有书、杂志、专利公布和授权书指示本领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被特定地和个别地指示全文以引用方式并入本文。虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实例较详细地描述了前述发明，但是显然可以在权利要求书范围内实施一些改变和修饰。这些实施例和描述是例证性的并且不应理解为对所附权利要求的范围的限制。

Claims

2.权利要求1的方法，其中所述受关注的多核苷酸的表达改变所述植物细胞的表型。

3.权利要求1或2的方法，其中所述受关注的多核苷酸的表达改变所述植物细胞的基因型。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中提供所述磺酰脲类化合物激活所述受关注的多核苷酸的表达。

5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述植物细胞来自单子叶植物或双子叶植物。

6.权利要求5的方法，其中所述植物细胞来自玉米、稻、高粱、甘蔗、大麦、燕麦、小麦、草坪草、大豆、低芥酸菜籽、棉、烟草、向日葵、红花、或苜蓿。

7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述磺酰脲类调控的基因开关包含可操作地连接至受关注的多核苷酸的阻抑型启动子，其中所述阻抑型启动子包含tet操纵子。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述磺酰脲类调控的基因开关包含选自SEQ ID NO：855、856、857、858、859和860的阻抑型启动子、或与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的阻抑型启动子。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述磺酰脲类化合物包括嘧啶基磺酰脲类化合物、三嗪基磺酰脲类化合物、或噻唑基脲类化合物。

10.权利要求9的方法，其中所述磺酰脲类化合物包括氯磺隆、胺苯磺隆、噻吩磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、烟嘧磺隆、或砜嘧磺隆。

11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述受关注的多核苷酸编码特异性地结合至靶核酸序列的多肽。

12.权利要求11的方法，其中所述多肽为重组酶、整合酶、核酸酶、归巢内切核酸酶、或锌指核酸酶。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述磺酰脲类调控的基因开关包含磺酰脲类反应性阻遏物，所述磺酰脲类反应性阻遏物包含SEQID NO：3-419中任一种的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：3-419中的任一种具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。

14.磺酰脲类调控的基因开关，所述基因开关控制受关注的多核苷酸的表达，其中所述受关注的多核苷酸编码特异性地结合DNA序列的多肽，或编码切割DNA序列的多肽。

15.权利要求14的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述编码的多肽为重组酶、整合酶、核酸酶、归巢内切核酸酶、或锌指核酸酶。

16.权利要求14或15的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述磺酰脲类基因开关包含磺酰脲类反应性阻遏物，其中所述磺酰脲类反应性阻遏物可操作地连接至在所述植物中有活性的启动子，其中所述启动子为组成型启动子、组织优选的启动子、发育阶段优选的启动子、诱导型启动子、或阻抑型启动子。

17.权利要求16的磺酰脲类调控的基因开关，其中

18.权利要求16或17的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述受关注的多核苷酸或所述磺酰脲类反应性阻遏物可操作地连接至包含至少一种四环素操纵子序列的阻抑型启动子。

19.权利要求18的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述阻抑型启动子为组成型启动子、组织优选的启动子、或发育阶段优选的启动子。

20.权利要求19的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述阻抑型启动子为35S CaMV启动子、肌动蛋白启动子、EF1A启动子、MMV启动子、dMMV启动子、MP1启动子、或BSV启动子。

21.权利要求20的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述阻抑型启动子包含如SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862中所示的多核苷酸序列、或与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的多核苷酸序列。

22.权利要求16的磺酰脲类调控的基因开关，其中所述磺酰脲类反应性阻遏物包含SEQ ID NO：3-419中任一种的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：3-419中的任一种具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。

23.转基因植物、转基因植物细胞、或转基因种子，其包含权利要求14-22中任一项的磺酰脲类调控的基因开关。

24.权利要求23的转基因植物、转基因植物细胞、或转基因种子，其中所述转基因植物、所述转基因植物细胞、或所述转基因种子来自单子叶植物或双子叶植物。

25.权利要求24的转基因植物、转基因植物细胞、或转基因种子，其中所述单子叶植物或双子叶植物来自玉米、稻、高粱、甘蔗、大麦、燕麦、小麦、草坪草、大豆、低芥酸菜籽、棉、烟草、向日葵、红花、或苜蓿。

27.权利要求26的重组多核苷酸，其中所述阻抑型启动子包含如SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862中所示的多核苷酸序列、或与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的多核苷酸序列。

28.用于调控细胞中的表达的方法，所述方法包括：

(a)提供包含受调控的基因开关的细胞，所述基因开关控制受关注的多核苷酸的表达，其中所述基因开关包含权利要求26或27的阻抑型启动子；以及；

30.权利要求29的重组多核苷酸，其中所述编码的磺酰脲类反应性阻遏物包含SEQ ID NO：3-419中任一种的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：3-419中的任一种具有至少85％的序列同一性的氨基酸序列。

31.权利要求29的重组多核苷酸，其中所述阻抑型启动子为可操作地连接至至少一种操纵子序列的肌动蛋白启动子、MMV启动子、dMMV启动子、MP1启动子、或BSV启动子。

32.权利要求29-31中任一项的重组多核苷酸，其中所述阻抑型启动子包含如SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862中所示的多核苷酸序列、或与SEQ ID NO：855、856、857、858、859、860或862具有至少95％的序列同一性的多核苷酸序列。