KR20150003819A

KR20150003819A - 식물 조절 요소 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20150003819A
Application number: KR1020147032104A
Authority: KR
Inventors: 제프리 아렌스; 쇼바 쉐리안; 폴 제이. 로이다; 린다 엘. 루트피야; 웨이 우; 지알리 시에
Original assignee: 몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Priority date: 2012-04-20
Filing date: 2013-04-10
Publication date: 2015-01-09
Also published as: BR112014026070A2; US20160298127A1; US20130283478A1; AR118749A2; RU2014146581A; ZA201407521B; BR112014026070B1; ES2743917T3; US9663793B2; AP2014008019A0; CN104364370A; MX360938B; CO7121318A2; AU2013249599A1; IN2014DN09067A; RU2639275C2; US10167481B2; JP2015514422A; AU2013249599B2; CA2871010A1

Abstract

본 발명은 식물에서 유전자 발현을 조절하는데 유용한 DNA 분자 및 구축물, 및 그의 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물, 식물 세포, 식물 부분 및 종자를 또한 제공하며, 그의 사용 방법도 제공한다.

Description

식물 조절 요소 및 그의 용도 {PLANT REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF}

관련 출원에 대한 참조

본원은 2012년 4월 20일에 출원된 미국 가출원 번호 61/635,945 및 2013년 3월 14일에 출원된 미국 정식 출원 번호 13/830,403을 우선권 주장하며, 이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열목록 삽입

파일명 "MONS326WO_ST25.txt"에 함유된 서열 목록은 22 킬로바이트 (마이크로소프트 윈도우즈(Microsoft Windows)®에서 측정시)이며, 2013년 4월 10일에 작성되었고, 본원과 함께 전자 파일로 제출되며, 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 식물 분자 생물학 및 식물 유전 공학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 식물에서 유전자 발현을 조절하는데 유용한 DNA 분자에 관한 것이다.

조절 요소는 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사를 조절함으로써 유전자 활성을 조절하는 유전 요소이다. 이러한 요소는 프로모터, 리더, 인트론 및 3' 비번역 영역을 포함하고, 식물 분자 생물학 및 식물 유전 공학 분야에 유용하다.

저온 및 습윤 스트레스 조건에서의 발아 동안 식물에게 이점을 부여하는 트랜스진을 발현하는 트렌스제닉 작물은 이러한 트랜스진의 발현에 가장 유익한 조직에서 발현 패턴을 보유하는 조절 요소를 필요로 한다. 이러한 조절 요소는, 저온 및/또는 습윤 조건 하에 종자가 발아하는 경우에 신속하게 작용할 수 있는 트랜스진 산물의 저장을 가능하게 할 뿐만 아니라 발아 및 실생 정착의 초기 단계 동안 발현을 제공하도록 발생 중인 종자에서 충분히 발현되어야 한다. 따라서, 본 발명은 발생 및 발아 중인 종자에서 보다 높은 수준의 발현이 입증되고, 저온 및/또는 습윤 발아 조건 하에서 이익을 제공하는 트랜스진 발현을 구동하는데 사용될 수 있는 신규 조절 요소를 제공한다.

본 발명은 식물에서 사용하기 위한 신규 유전자 조절 요소를 제공한다. 본 발명은 또한 조절 요소를 포함하는 DNA 구축물을 제공한다. 본 발명은 또한 조절 요소를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다. 서열은 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 상태로 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 본원에서 제공되는 조절 서열에 대해 이종일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 조절 요소 서열은 따라서, 특정한 실시양태에서, 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 것으로 규정될 수 있다. 본 발명은 또한 조절 요소, 조절 요소를 포함하는 DNA 구축물, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포, 식물 및 종자를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열에 적어도 약 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및 (c) 유전자 조절 활성을 갖는, 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열은 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동하게 연결된 것인 DNA 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, DNA 분자는 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 DNA 서열에 적어도 약 90 퍼센트 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, DNA 분자는 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 DNA 서열에 적어도 95 퍼센트 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, DNA 서열은 유전자 조절 활성을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 농경학상 관심 유전자를 포함한다. 다른 실시양태에서, 농경학상 관심 유전자는 식물에서 제초제 내성 또는 해충 저항성을 부여한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열에 적어도 약 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및 (c) 유전자 조절 활성을 갖는, 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열은 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동하게 연결된 것인 이종 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포를 제공한다. 실시양태에서, 트랜스제닉 식물 세포는 단자엽 식물 세포 또는 쌍자엽 식물 세포일 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열에 적어도 약 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및 (c) 단편은 유전자 조절 활성을 갖는, 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 분자를 포함하며, 여기서 상기 서열은 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동하게 연결된 것인 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 이러한 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분의 임의의 세대의 자손 식물을 제공하며, 자손 식물 또는 부분은 상기 기재된 바와 같은 DNA 분자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 기재된 바와 같은 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자를 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 서열 1, 6 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 조절 발현 요소 그룹을 포함하며, 여기서 상기 전사 조절 발현 요소 그룹은 서열 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것인 트랜스진 카세트를 제공한다. 한 실시양태에서, 트랜스진 카세트는 서열 1로 제시되는 전사 조절 발현 요소 그룹을 포함하며, 여기서 상기 전사 조절 발현 요소 그룹은 서열 10으로 제시되는 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 트랜스진 카세트는 서열 6으로 제시되는 전사 조절 발현 요소 그룹을 포함하며, 여기서 상기 전사 조절 발현 요소 그룹은 서열 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 트랜스진 카세트는 서열 8로 제시되는 전사 조절 발현 요소 그룹을 포함하며, 여기서 상기 전사 조절 발현 요소 그룹은 서열 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열에 적어도 약 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및 (c) 유전자 조절 활성을 갖는, 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열은 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 것인 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분을 수득하고, 그로부터 범용 산물을 생산하는 것을 포함하는, 범용 산물을 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 범용 산물은 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡물, 전분, 종자, 굵은 곡분, 고운 곡분, 바이오매스 또는 종자 오일이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열에 적어도 약 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열; (b) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및 (c) 유전자 조절 활성을 갖는, 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열은 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 것인 트랜스제닉 식물을 수득하고, 식물을 재배하는 것을 포함하며, 여기서 전사가능한 폴리뉴클레오티드가 발현되는 것인, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는 방법을 제공한다.

도 1은 상이한 트랜스진 카세트 배위에 의해 부여된 트랜스제닉 발생 중인 옥수수 배아 및 내배유 조직에서의 β-글루쿠로니다제 (GUS) 발현을 보여준다. 각각의 트랜스진 카세트 배위는 실시예 3의 표 3에 제시된 바와 같이, 전사 조절 발현 요소 그룹 EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (서열 6) 및 EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (서열 8) 및 3' UTR T-Os.CLUS33428_1-1:1:1 (서열 11), T-Os.Mth-1:1:1 (서열 12) 및 T-Os.Ara5-1:1:1 (서열 13)에 작동가능하게 연결된 GUS 코딩 서열로 구성된다.
도 2는 상이한 트랜스진 카세트 배위에 의해 부여된 트랜스제닉 옥수수의 선택된 조직에서의 β-글루쿠로니다제 (GUS) 발현을 보여준다. 각각의 트랜스진 카세트 배위는 실시예 3의 표 3에 제시된 바와 같이, 전사 조절 발현 요소 그룹 EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (서열 6) 및 EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (서열 8), 및 3' UTR T-Os.CLUS33428_1-1:1:1 (서열 11), T-Os.Mth-1:1:1 (서열 12) 및 T-Os.Ara5-1:1:1 (서열 13)에 작동가능하게 연결된 GUS 코딩 서열로 구성된다.

서열의 간단한 설명

서열 1 - 인트론, I-Zm.DnaK-1:1:1 (서열 5)에 작동가능하게 연결된 리더, L-Zm.Nac-1:1:1 (서열 4)의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터, P-Zm.Nac-1:1:2 (서열 3)로 구성된 전사 조절 발현 요소 그룹 또는 EXP, EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1의 서열.

서열 2 - 리더, L-Zm.Nac-1:1:1 (서열 4)의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터, P-Zm.Nac-1:1:2 (서열 3)로 구성된 서열.

서열 3 - 프로모터, P-Zm.Nac-1:1:2의 서열.

서열 4 - 리더, L-Zm.Nac-1:1:1의 서열.

서열 5 - 인트론, I-Zm.DnaK-1:1:1의 서열.

서열 6 - 인트론, I-Os.FBA-1-1:1:1 (서열 7)에 작동가능하게 연결된 리더, L-Zm.Nac-1:1:1 (서열 4)의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터, P-Zm.Nac-1:1:2 (서열 3)로 구성된 전사 조절 발현 요소 그룹 또는 EXP, EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1의 서열.

서열 7 - 인트론, I-Os.FBA-1-1:1:1의 서열.

서열 8 - 인트론, I-Os.Cab-1-1:1:1 (서열 9)에 작동가능하게 연결된 리더, L-Zm.Nac-1:1:1 (서열 4)의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터, P-Zm.Nac-1:1:2 (서열 3)로 구성된 전사 조절 발현 요소 그룹 또는 EXP, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1의 서열.

서열 9 - 인트론, I-Os.Cab-1-1:1:1의 서열.

서열 10 - 3' UTR, T-AGRtu.nos-1:1:13의 서열.

서열 11 - 3' UTR, T-Os.CLUS33428_1-1:1:1의 서열.

서열 12 - 3' UTR, T-Os.Mth-1:1:1의 서열.

서열 13 - 3' UTR, T-Os.Ara5-1:1:1의 서열.

서열 14 - β-글루쿠로니다제 마커 유전자의 코딩 서열.

서열 15 - 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터 및 리더를 포함하는 전사 조절 발현 요소 그룹 또는 EXP, EXP-CaMV.35S:1:1의 서열.

서열 16 - 벼 액틴 1 프로모터, 리더 및 인트론을 포함하는 전사 조절 발현 요소 그룹 또는 EXP, EXP-Os.Act1:1:1의 서열.

발명의 상세한 설명

본 발명은 식물 종으로부터 유익한 유전자 조절 활성을 갖는 신규 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명은 또한, 조절 요소를 포함하는 DNA 구축물뿐만 아니라, 조절 요소를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포, 식물 및 종자를 제공한다. 이들 폴리뉴클레오티드 분자의 뉴클레오티드 서열은 서열 1, 2, 3, 4, 6 및 8로서 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드 분자의 설계, 구축 및 사용이 본 발명에서 제공된다. 이들 폴리뉴클레오티드 분자는, 예를 들어 식물 조직에서 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현에 영향을 미쳐 트랜스제닉 식물에서 유전자 발현 또는 코딩된 유전자 산물의 활성을 선택적으로 조절할 수 있다. 본 발명은 또한 조절 요소를 제조 및 사용하는 방법, 프로모터 및/또는 다른 개시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 구축물, 및 그를 제조 및 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포, 식물 및 종자, 뿐만 아니라 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

본 발명에 따른 DNA 서열은 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결되어 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 본원에서 제공되는 조절 서열에 대해 이종일 수 있다. 본 발명에 의해 제공되는 조절 요소 서열은 따라서, 특정한 실시양태에서, 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 것으로 규정될 수 있다.

하기 정의 및 방법은 본 발명을 보다 잘 규정하고 본 발명의 실시에 있어서 당업자에게 지침이 되도록 제공된다. 달리 나타내지 않는 한, 용어는 관련 당업자들에 의해 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다.

DNA 분자

본원에 사용된 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자"는 게놈 또는 합성 기원의 이중 가닥 DNA 분자, 즉 5' (상류) 말단에서부터 3' (하류) 말단까지 판독되는 데옥시리보뉴클레오티드 염기 또는 폴리뉴클레오티드 분자 중합체를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "DNA 서열"은 DNA 분자의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 명명법은 WIPO 표준 ST.25 (1998)의 표, 부록 2, 표 1 및 3에 기재되고 미국 연방 규정집 § 1.822의 표제 37에 상응한다.

본원에 사용된 용어 "단리된 DNA 분자"는 그의 천연 또는 자연 상태에서 정상적으로 그와 회합되어 있는 다른 분자로부터 적어도 부분적으로 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 용어 "단리된"은 그의 천연 또는 자연 상태에서 정상적으로 DNA 분자에 플랭킹하는 핵산 중 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 따라서, 예를 들어 재조합 기술의 결과로서, 정상적으로는 회합되어 있지 않은 조절 서열 또는 코딩 서열에 융합된 DNA 분자는 본원에서 단리된 것으로 간주된다. 이러한 분자는 숙주 세포의 염색체 내로 통합되었을 때, 또는 다른 DNA 분자와 함께 핵산 용액 중에 존재될 때, 이들이 그의 천연 상태에 있는 것이 아니라는 점에서 단리된 것으로 간주된다.

본 발명에 개시된 바와 같은 DNA 분자 또는 그의 단편을 단리 및 조작하기 위해 당업자에게 널리 공지되어 있는 임의의 수의 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 기술을 사용하여, 특정한 출발 DNA 분자를 증폭하고/하거나 본래의 분자의 변이체를 생산할 수 있다. DNA 분자 또는 그의 단편은 또한 다른 기술에 의해, 예컨대 화학적 수단에 의한 단편의 직접적인 합성에 의해 수득할 수 있으며, 이는 통상적으로는 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 실시된다.

본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 최적으로 정렬된 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 최적으로 정렬된 2개의 폴리펩티드 서열이 동일한 정도를 지칭한다. 최적의 서열 정렬은 2개의 서열, 예를 들어 참조 서열 및 또 다른 서열을 수동적으로 정렬하여 적절한 내부 뉴클레오티드 삽입, 결실 또는 갭을 사용함으로써 서열 정렬에서 매칭되는 뉴클레오티드 개수가 최대가 되도록 함으로써 이루어진다. 본원에 사용된 용어 "참조 서열"은 서열 1, 2, 3, 4, 6 및 8의 폴리뉴클레오티드 서열로서 제공되는 서열을 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "퍼센트 서열 동일성" 또는 "퍼센트 동일성" 또는 "% 동일성"은 동일성 분율 x 100이다. 참조 서열과 최적으로 정렬된 서열에 대한 "동일성 분율"은 최적 정렬에서 매칭되는 뉴클레오티드 개수를 참조 서열에서의 뉴클레오티드의 총 개수, 예를 들어 전장의 전체 참조 서열에서의 뉴클레오티드의 총 개수로 나눈 값이다. 따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은 서열 1, 2, 3, 4, 6 및 8로서 본원에 제공되는 참조 서열에 최적으로 정렬될 때 참조 서열에 대해 적어도 약 85 퍼센트 동일성, 적어도 약 90 퍼센트 동일성, 적어도 약 95 퍼센트 동일성, 적어도 약 96 퍼센트 동일성, 적어도 약 97 퍼센트 동일성, 적어도 약 98 퍼센트 동일성, 또는 적어도 약 99 퍼센트 동일성을 갖는 서열을 포함하는 DNA 분자를 제공한다. 특정한 실시양태에서, 이러한 서열은 유전자-조절 활성을 갖는 것으로서 규정될 수 있다.

조절 요소

조절 요소는 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자, 즉 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 능력을 갖는 것이다. 따라서, 용어 "유전자 조절 활성"은 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미침으로써 상기 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현 패턴에 영향을 미칠 수 있는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 전사 조절 발현 요소 그룹 (EXP)은 작동가능하게 연결된 발현 요소, 예컨대 인핸서, 프로모터, 리더 및 인트론으로 구성될 수 있다. 따라서, 전사 조절 발현 요소 그룹은, 예를 들어 차례로 인트론 서열의 5'에 작동가능하게 연결되는, 리더 서열의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터로 구성될 수 있다. 인트론 서열은 천연 서열의 제1 인트론/엑손 스플라이스 접합점에서 시작되는 서열로 구성될 수 있고, 전사와 생성된 전사체의 적절한 프로세싱을 용이하게 하기 위한 목적으로 적절한 인트론/엑손 프로세싱을 제공하기 위해 제2 인트론/엑손 스플라이스 접합부를 포함하는 소형 리더 단편으로 추가로 구성될 수 있다. 리더 및 인트론은 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 뿐만 아니라 생성된 전사된 RNA의 번역에도 긍정적인 영향을 미칠 수 있다. 프로세싱전 RNA 분자는 리더 및 인트론을 포함하는데, 이는 전사된 RNA의 전사후 프로세싱 및/또는 전사된 RNA 분자의 세포 핵으로부터 세포질로의 유출에 영향을 미칠 수 있다. 전사된 RNA 분자의 전사후 프로세싱 이후에 리더 서열은 최종 메신저 RNA의 일부분으로서 유지될 수 있고, 메신저 RNA 분자의 번역에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다.

조절 요소, 예컨대 프로모터, 리더, 인트론 및 전사 종결 영역은 유전자 조절 활성을 가지며, 살아있는 세포에서의 전반적인 유전자 발현에서 필수적인 부분으로서의 역할을 하는 DNA 분자이다. 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자, 즉 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 능력을 갖는 것을 지칭한다. 따라서, 식물에서 기능하는 단리된 조절 요소, 예컨대 프로모터 및 리더는 유전 공학 방법을 통해 식물의 표현형을 변형하는데 유용하다.

조절 요소는 그의 발현 패턴 효과 (정성적 및/또는 정량적으로), 예를 들어 긍정적 또는 부정적 효과 및/또는 구성적 또는 다른 효과, 예컨대 그의 시간상, 공간상, 발생상, 조직, 환경적, 생리학상, 병리학상, 세포 주기 및/또는 화학 반응 발현 패턴, 및 그의 임의의 조합, 뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 지시에 의한 효과를 특징으로 할 수 있다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조절하는 조절 요소로서 유용할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "유전자 발현 패턴"은 작동가능하게 연결된 DNA 분자의 전사된 RNA 분자로의 임의의 전사 패턴이다. 전사된 RNA 분자는 번역되어 단백질 분자를 생산할 수 있거나, 또는 안티센스 또는 다른 조절 RNA 분자, 예컨대 mRNA, dsRNA, tRNA, rRNA, miRNA 등을 제공할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "단백질 발현"은 전사된 RNA 분자의 단백질 분자로의 임의의 번역 패턴이다. 단백질 발현은 그의 시간상, 공간상, 발생상, 또는 형태상의 품질, 뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 지시를 특징으로 할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "프로모터"는 일반적으로 RNA 폴리머라제 II 및 다른 단백질 (트랜스-작용 전사 인자)의 인식 및 결합에 수반되어 전사를 개시하는 DNA 분자를 지칭한다. 프로모터는 초기에 유전자의 게놈 카피의 5' 비번역 영역 (5' UTR)으로부터 단리될 수 있다. 별법으로, 프로모터는 합성적으로 생산 또는 조작된 DNA 분자일 수 있다. 프로모터는 또한 키메라, 즉 2가지 이상의 이종 DNA 분자의 융합을 통해 생산된 프로모터일 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 프로모터는 서열 3, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이러한 분자 및 그의 임의의 변이체 또는 유도체는 프로모터 활성을 포함하는 것으로서, 즉 숙주 세포, 예컨대 트랜스제닉 식물에서 프로모터로서 작용할 수 있는 것으로서 추가로 정의된다. 추가의 구체적 실시양태에서, 단편은 그것이 유래된 출발 프로모터 분자가 보유한 프로모터 활성을 나타내는 것으로서 정의될 수 있거나, 또는 단편은 기초 전사 수준을 제공하고, 전사 개시를 위한 RNA 폴리머라제 II 복합체의 인식 및 결합을 위한 TATA 박스 또는 등가 서열로 구성된 "최소 프로모터"를 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 프로모터 서열의 단편을 제공한다. 프로모터 단편은 상기 기재된 바와 같은 프로모터 활성을 포함할 수 있고, 단독으로 또는 키메라 프로모터의 구축에서와 같이 다른 프로모터 및 프로모터 단편과의 조합으로 유용할 수 있다. 구체적 실시양태에서, 본원에 개시된 프로모터 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자의 적어도 약 50, 95, 150, 250, 500, 750개, 또는 적어도 약 1000개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 프로모터 단편을 제공한다.

서열 3으로 제시되는 프로모터로부터 유래된 조성, 예컨대 내부 또는 5' 결실은, 예를 들어 발현에 대하여 긍정적 또는 부정적 영향을 갖는 요소를 제거하고/거나; 발현에 대하여 긍정적 또는 부정적 영향을 갖는 요소를 복제하고/거나; 발현에 대하여 조직- 또는 세포-특이적 영향을 갖는 요소를 복제 또는 제거하는 것을 포함하는, 발현을 개선시키거나 변경시키는 당업계 공지의 방법을 사용하여 생산할 수 있다. TATA 박스 요소 또는 그의 등가 서열 및 하류 서열이 제거된 3' 결실로 구성된, 서열 3으로 제시되는 프로모터로부터 유래된 조성은, 예를 들어 인핸서 요소 제작을 위해 사용될 수 있다. 발현에 대하여 긍정적 또는 부정적인; 조직 특이적인; 세포 특이적인; 또는 시기 특이적인 (예컨대, 비제한적으로, 일주기 리듬) 영향을 갖는 임의의 요소를 제거하기 위해 추가로 결실시킬 수 있다. 서열 3으로 제시되는 프로모터 및 그로부터 유래된 단편 또는 인핸서는 서열 3으로 제시되는 프로모터 및 다른 인핸서 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 것으로부터 유래된 단편 또는 인핸서로 구성된 키메라 전사 조절 요소 조성을 제작하기 위해 사용될 수 있다. 특정한 트랜스진의 목적하는 발현 측면에 대한 본원에 기재된 변형, 중복 또는 결실의 효능은 안정하고 일시적인 식물 검정, 예컨대 본원의 작업 실시예에 기재된 검정에서 실험적으로 시험되어 그 결과를 평가할 수 있으며, 이는 출발 분자에서 행해진 변화 및 변화의 목적에 따라 달라질 수 있다.

본원에 사용된 용어 "리더"는 유전자의 게놈 카피의 5' 비번역 영역 (5' UTR)으로부터 단리되고, 일반적으로 전사 출발 부위 (TSS)와 단백질 코딩 서열 출발 부위 사이의 뉴클레오티드 절편으로서 정의되는 DNA 분자를 지칭한다. 별법으로, 리더는 합성적으로 생산 또는 조작된 DNA 요소일 수 있다. 리더는 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조절하기 위한 5' 조절 요소로서 사용될 수 있다. 리더 분자는 이종 프로모터와 함께 또는 그의 천연 프로모터와 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 프로모터 분자는 따라서 그의 천연 리더에 작동가능하게 연결될 수 있거나, 또는 이종 리더에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 리더는 서열 4 또는 그의 단편 또는 변이체로 제시된다. 구체적 실시양태에서, 이러한 서열은 예를 들어 트랜스제닉 식물 세포를 포함하여, 숙주 세포에서 리더로서 작용할 수 있는 것으로서 규정되는 것으로 제공될 수 있다. 한 실시양태에서, 이러한 서열은 리더 활성을 포함하는 것으로서 디코딩된다.

서열 4로서 제시되는 리더 서열 (5' UTR)은 조절 요소로 구성될 수 있거나, 또는 트랜스진의 전사 또는 번역에 영향을 미칠 수 있는 2차 구조를 취할 수 있다. 이들 리더 서열은 본 발명에 따라 트랜스진의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 키메라 조절 요소를 제작하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 서열 4로서 제시되는 리더 서열은 트랜스진의 전사 또는 번역에 영향을 미치는 키메라 리더 서열을 제작하기 위해 사용될 수 있다.

외래 유전자를 새로운 식물 숙주 내로 도입하여도, 유입하는 유전자가 항상 고도로 발현되는 것은 아니다. 또한, 복합 형질을 다룰 경우에, 때로는 공간상 또는 시간상 상이한 발현 패턴으로 여러 유전자를 조절할 필요가 있다. 인트론이 주로 이러한 조절을 제공할 수 있다. 그러나, 하나의 식물에서 동일한 인트론의 다중 사용은 단점이 있는 것으로 나타났다. 이러한 경우에, 적절한 재조합 DNA 요소의 구축을 위해 기본 제어 요소의 집합을 가질 필요가 있다. 발현 증진 특성을 갖는 것으로 당업계에 공지되어 있는 인트론의 수는 제한적이며, 따라서 대안이 필요하다.

서열 5, 7, 및 9로서 제시되는 인트론 중 임의의 것으로부터 유래된 조성은 시스 조절 요소의 내부 결실 또는 중복으로 구성될 수 있다. 추가로, 인트론/엑손 스플라이스 접합부를 포함하는 5' 및 3' 서열의 변경은 프로모터 + 리더 또는 키메라 프로모터 + 리더 및 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 경우에 발현 또는 발현의 특이성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 인트론/엑손 스플라이스 접합부를 포함하는 5' 및 3' 영역의 변경은 또한 메신저 RNA의 프로세싱 및 스플라이싱 이후에 생성된 전사체에서 생산되는 가성 출발 및 종결 코돈이 도입될 가능성을 줄이기 위해 행해질 수 있다. 트랜스진의 발현에 대한 인트론의 효과를 결정하기 위해 인트론을 작업 실시예에 기재된 바와 같이 실험적으로 시험할 수 있다.

본 발명에 따라, 프로모터 또는 프로모터 단편을 공지된 프로모터 요소의 존재, 즉 DNA 서열 특성, 예컨대 TATA-박스 및 다른 공지된 전사 인자 결합 부위 모티프에 대해 분석할 수 있다. 이러한 공지된 프로모터 요소의 확인은 본래의 프로모터와 유사한 발현 패턴을 갖는 프로모터의 변이체를 설계하기 위해 당업자에 의해 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "인핸서" 또는 "인핸서 요소"는 전체적인 발현 패턴의 측면을 부여하지만, 단독으로는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 구동하기에 통상적으로 불충분한, 시스 작용하는 전사 조절 요소 (시스 요소)를 지칭한다. 프로모터와 달리, 인핸서 요소는 통상적으로는 전사 출발 부위 (TSS), 또는 TATA 박스 또는 등가 서열은 포함하지 않는다. 프로모터는 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 전사에 영향을 미치는 하나 이상의 인핸서 요소를 자연적으로 포함할 수 있다. 단리된 인핸서 요소는 프로모터에 융합되어 키메라 프로모터 시스-요소를 생산할 수 있으며, 이는 유전자 발현의 전체적인 조절 측면을 부여한다. 프로모터 또는 프로모터 단편은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사에 영향을 미치는 하나 이상의 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 다수의 프로모터 인핸서 요소는 DNA-결합 단백질에 결합하고/거나, DNA 위상에 영향을 미침으로써 RNA 폴리머라제의 DNA 주형에의 접근을 선택적으로 허용 또는 제한하거나, 또는 전사 개시 부위에서의 이중 나선의 선택적인 개방을 용이하게 하는 국소 입체형태를 생성하는 것으로 여겨진다. 인핸서 요소는 전사를 조절하는 전사 인자에 결합하는 작용을 할 수 있다. 일부 인핸서 요소는 1종을 초과하는 전사 인자에 결합하고, 전사 인자는 1종을 초과하는 인핸서 도메인과 상이한 친화도로 상호작용할 수 있다. 인핸서 요소는 결실 분석, 즉 5' 말단 또는 내부에서부터 프로모터까지의 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시키는 것; DNase I 풋프린팅, 메틸화 간섭, 전기영동 이동성-변화 검정, 라이게이션 매개 PCR에 의한 생체내 게놈 풋프린팅, 및 다른 통상의 검정을 사용하는 DNA 결합 단백질 분석; 또는 통상의 DNA 서열 비교 방법, 예컨대 BLAST와 함께 표적 서열 또는 표적 모티프로서 공지된 시스-요소 모티프 또는 인핸서 요소를 사용하는 DNA 서열 유사성 분석을 포함하는, 다수의 기술에 의해 확인할 수 있다. 인핸서 도메인의 정밀한 구조는 하나 이상의 뉴클레오티드의 돌연변이유발법 (또는 치환)에 의해 또는 다른 통상의 방법에 의해 추가로 연구할 수 있다. 인핸서 요소는 화학적 합성에 의해, 또는 이러한 요소를 포함하는 조절 요소로부터의 단리에 의해 수득될 수 있고, 하위서열 조작을 용이하게 하는데 유용한 제한 효소 부위를 함유하는 측면에 위치하는 추가의 뉴클레오티드와 함께 합성될 수 있다. 따라서, 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조절하기 위한 본원에 개시된 방법에 따른 인핸서 요소의 설계, 구축 및 사용은 본 발명에 포함된다.

식물에서, 유전자 구축물에 일부 인트론을 포함하게 되면, 인트론을 포함하지 않는 구축물에 비해 mRNA 및 단백질 축적은 증가하게 된다. 이러한 효과를 유전자 발현의 "인트론 매개 증진" (IME)이라고 명명하였다 (문헌 [Mascarenhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920]). 식물에서 발현을 자극하는 것으로 공지된 인트론은 옥수수 유전자 [예를 들어, tubA1, Adh1, Sh1, Ubi1 (문헌 [Jeon et al., Plant Physiol. 123:1005-1014, 2000; Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200, 1987; Vasil et al., Plant Physiol. 91:1575-1579, 1989; Christiansen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689, 1992])], 및 벼 유전자 (예를 들어, salt, tpi: 문헌 [McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990; Xu et al., Plant Physiol. 106:459-467, 1994])에서 확인되었다. 유사하게, 쌍자엽 식물 유전자, 예컨대 페튜니아 (예를 들어, rbcS), 감자 (예를 들어, st-ls1) 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) (예를 들어, ubq3 및 pat1)로부터의 인트론은 유전자 발현율을 상승시키는 것으로 밝혀졌다 (문헌 [Dean et al., Plant Cell 1:201-208, 1989; Leon et al., Plant Physiol. 95:968-972, 1991; Norris et al., Plant Mol Biol 21:895-906, 1993; Rose and Last, Plant J.11:455-464, 1997]). 인트론의 스플라이스 부위 내에서의 결실 또는 돌연변이가 유전자 발현을 감소시키는 것으로 나타났으며, 이는 IME를 위해서는 스플라이싱이 필요할 수 있음을 나타낸다 (문헌 [Mascarenhas et al., Plant Mol Biol. 15:913-920, 1990; Clancy and Hannah, Plant Physiol. 130:918-929, 2002]). 그러나, 에이. 탈리아나(A. thaliana)로부터의 pat1 유전자의 스플라이스 부위 내에서의 점 돌연변이에 의해 밝혀진 바와 같이, 쌍자엽 식물에서 특정의 IME에는 이러한 스플라이싱이 요구되지 않는다 (문헌 [Rose and Beliakoff, Plant Physiol. 122:535-542, 2000]).

재조합 발현 카세트 내로의 몇몇 인트론의 삽입이 발현을 증진시키는데 실패했기 때문에 (예를 들어, 쌍자엽식물 유전자로부터의 인트론, 예컨대 완두콩 유래의 rbcS 유전자, 콩 유래의 phaseolin 유전자 및 솔라눔 투베로숨(Solanum tuberosum) 유래의 stls-1 유전자 및 옥수수 유전자로부터의 인트론 (adh1 유전자의 제9 인트론, 및 hsp81 유전자의 제1 인트론)), 인트론에 의한 유전자 발현의 증진은 일반적인 현상은 아니다 (문헌 [Chee et al., Gene 41:47-57, 1986; Kuhlemeier et al., Mol Gen Genet 212:405-411, 1988; Mascarenhas et al., Plant Mol. Biol. 15:913-920, 1990; Sinibaldi and Mettler, In WE Cohn, K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42. Academic Press, New York, pp 229-257, 1992; Vancanneyt et al., Mol. Gen. Genet. 220:245-250, 1990]). 따라서, 트랜스제닉 식물에서 비-내인성 유전자 또는 내인성 유전자의 유전자 발현 수준을 조작하기 위해 모든 인트론을 사용할 수 있는 것은 아니다. 주어진 유전자의 발현율을 증진시키기 위해서는 어떤 특성 또는 어떤 특정한 서열 특징이 인트론 서열 내에 존재해야 하는지에 대해 선행 기술에는 알려져 있는 바가 없고, 따라서 이종 방식으로 사용될 경우에, 주어진 식물 인트론이 IME를 야기하는지 여부를 예측한다는 것은 불가능하다.

본원에 사용된 용어 "키메라"는 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합시킴으로써 생산되는 단일 DNA 분자를 지칭하는 것으로서, 제1 DNA 분자도 제2 DNA 분자도 통상적으로 그러한 배위로, 즉 서로 융합되어 있는 배위로는 발견되지 않을 것이다. 따라서 키메라 DNA 분자는 자연에서 달리 통상적으로 발견되지 않는 신규한 DNA 분자이다. 본원에 사용된 용어 "키메라 프로모터"는 이러한 DNA 분자의 조작을 통해 생산된 프로모터를 지칭한다. 키메라 프로모터는 2개 이상의 DNA 단편을 조합할 수 있고, 예를 들어 프로모터를 인핸서 요소에 융합한 것일 수 있다. 따라서, 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조절하기 위한 본원에 개시된 방법에 따른 키메라 프로모터의 설계, 구축 및 사용은 본 발명에 포함된다.

본원에 사용된 용어 "변이체"는 제1 DNA 분자와 조성이 유사하지만 동일하지는 않은 제2 DNA 분자를 지칭하며, 여전히 제2 DNA 분자는 제1 DNA 분자의 일반적인 기능성, 즉 동일하거나 유사한 발현 패턴은 그대로 유지한다. 변이체는 제1 DNA 분자의 단축형 또는 말단절단된 버전일 수 있고/거나, 제1 DNA 분자의 서열의 변경된 버전, 예컨대 상이한 제한 효소 부위 및/또는 내부 결실, 치환, 및/또는 삽입을 포함하는 것일 수 있다. "변이체"는 또한 참조 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 조절 요소를 포괄할 수 있으며, 여기서 유도체 조절 요소는 상응하는 모 조절 분자에 비해 더 큰, 또는 더 작은, 또는 등가의 전사 또는 번역 활성을 가진다. 또한, 조절 요소 "변이체"는 박테리아 및 식물 세포 형질전환에서 자연적으로 발생하는 돌연변이로 인한 변이체를 포괄할 것이다. 본 발명에서, 서열 1, 2, 3, 4, 6 및 8로서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열은 본래의 조절 요소의 일반적인 기능성, 즉 동일하거나 유사한 발현 패턴은 그대로 유지하면서 본래의 조절 요소의 폴리뉴클레오티드 서열과 유사하지만 동일하지 않은 조성의 변이체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 본 발명의 변이체의 생산은 본 개시내용에 비추어 당업계의 통상적인 기술에 충분히 속하며, 본 발명의 범위 내에 포함된다. 키메라 조절 요소 "변이체"는 참조 서열과 동일한 구성성분 요소를 포함하지만, 키메라 조절 요소를 포함하는 구성성분 요소는 당업계에 공지된 다양한 방법, 예컨대 제한 효소 소화 및 라이게이션, 라이게이션 독립적 클로닝, 증폭 동안 PCR 산물의 모듈화된 어셈블리, 또는 조절 요소의 직접적인 화학적 합성, 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 작동가능하게 연결될 수 있다. 생성된 키메라 조절 요소 "변이체"는 참조 서열의 동일한 구성성분 요소 또는 동일한 구성성분 요소의 변이체로 구성될 수 있지만, 구성성분 부분들이 작동가능하게 연결되도록 하는 연결 서열 또는 서열들을 포함하는 서열 또는 서열들에서 상이할 수 있다. 본 발명에서, 서열 1, 2, 3, 4, 6 및 8로서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열은 참조 서열을 제공하며, 여기서 참조 서열을 포함하는 구성성분 요소는 당업계에 공지된 방법에 의해 연결될 수 있고, 박테리아 및 식물 세포 형질전환에서 자연적으로 발생하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 및/또는 삽입 또는 돌연변이를 포함할 수 있다.

구축물

본원에 사용된 용어 "구축물"은 임의의 공급원으로부터 유래된 것으로서, 게놈 통합 또는 자율 복제가 가능하고, 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 분자가 기능상 작동 방식으로 연결되어 있는, 즉 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는, 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 자율 복제 폴리뉴클레오티드 분자, 파지, 또는 선형 또는 환형 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "벡터"는 형질전환 목적을 위해, 즉 이종 DNA의 숙주 세포 내로의 도입을 위해 사용될 수 있는 임의의 재조합 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미한다. 본 발명에 따른 벡터는 상기 언급된 분자 중 임의의 것으로부터 단리된 발현 카세트 또는 트랜스진 카세트를 포함할 수 있다. 본 발명을 수행하는데 유용한 발현 카세트 또는 트랜스진 카세트는 서열 10, 11, 12, 또는 13으로 제시되는 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된, 서열 1, 6 또는 8로서 제시되는 전사 조절 발현 요소 그룹 ("EXP")으로 구성된다.

본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미칠 수 있도록 분자가 배열되어 있는 것인, 제2 분자에 연결된 제1 분자를 지칭한다. 2개의 분자는 단일의 인접한 분자의 부분일 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있고, 인접해 있을 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있다. 예를 들어, 프로모터가 세포에서 관심의 대상이 되는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사를 조절하는 경우에, 프로모터는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. 리더가, 예를 들어 코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드에 대한 리더로서의 역할을 할 수 있을 경우에, 리더는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다.

한 실시양태에서, 본 발명의 구축물은 T-DNA의 식물 세포의 게놈 내로의 통합을 허용하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 세포에 의해 제공되는 전달 분자와 함께, T-DNA를 포함하는 에이. 투메파시엔스로부터 단리된 Ti 플라스미드의 우측 경계 (RB 또는 AGRtu.RB) 및 좌측 경계 (LB 또는 AGRtu.LB) 영역을 갖는 이중 Ti 플라스미드 경계 DNA 구축물로서 제공될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,603,061 참조). 구축물은 또한 박테리아 세포에서 복제 기능 및 항생제 선택을 제공하는 플라스미드 백본 DNA 절편, 예를 들어 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 복제 기점, 예컨대 ori322, 광범위한 숙주 범위의 복제 기점, 예컨대 oriV 또는 oriRi, 및 선택 마커에 대한 코딩 영역, 예컨대 스펙티노마이신 또는 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여하는 Tn7 아미노글리코시드 아데닐트랜스퍼라제 (aadA)를 코딩하는 Spec/Strp, 또는 겐타미신 (Gm, Gent) 선택 마커 유전자를 함유할 수 있다. 식물 형질전환을 위해, 숙주 세균 균주는 종종 에이. 투메파시엔스 ABI, C58, 또는 LBA4404이지만; 식물 형질전환의 당업자에게 공지된 다른 균주가 본 발명에서 기능할 수 있다.

전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 단백질 산물로서 번역 및 발현되는 기능성 mRNA 분자로 전사되는 방식으로 구축물을 조립하고 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 실시를 위해, 구축물 및 숙주 세포의 제조 및 사용을 위한 통상적인 조성물 및 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3^rd edition Volumes 1, 2, and 3, J. Sambrook, D.W. Russell, and N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000] 참조). 재조합 벡터를 특히 식물 형질전환에 적합하게 만드는 방법은 비제한적으로, 미국 특허 번호 4,971,908; 4,940,835; 4,769,061; 및 4,757,011의 전문에 기재되어 있는 것을 포함한다. 이러한 유형의 벡터는 또한 과학 문헌 (예를 들어, [Rodriguez, et al., Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, 1988; 및 Glick et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, FL., 1993] 참조)에 검토되어 있다. 고등 식물에서의 핵산 발현에 유용한 전형적인 벡터는 당업계에 널리 공지되어 있고, 에이. 투메파시엔스의 종양-유발 (Ti) 플라스미드로부터 유래된 벡터를 포함한다 (문헌 [Rogers et al., Methods in Enzymology 153: 253-277, 1987]). pCaMVCN 전달 제어 벡터를 비롯한, 식물 형질전환에 유용한 다른 재조합 벡터가 또한 과학 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5824-5828, 1985] 참조).

본원에 제공된 것들 중 임의의 것을 비롯한 다양한 조절 요소가 구축물에 포함될 수 있다. 임의의 이러한 조절 요소는 다른 조절 요소와 조합하여 제공될 수 있다. 이러한 조합은 바람직한 조절 특징이 생성될 수 있도록 설계 또는 변형될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 구축물은 3' 전사 종결 분자에 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함한다.

본 발명의 구축물은 본원에 제공되거나 당업계에 공지되어 있는 임의의 프로모터 또는 리더를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 프로모터는 이종 비-번역 5' 리더, 예컨대 열 쇼크 단백질 유전자로부터 유래된 것에 작동가능하게 연결될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,659,122 및 5,362,865 참조). 별법으로, 본 발명의 리더는 이종 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 전사체 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다 (미국 특허 번호 5,352,605 참조).

본원에 사용된 용어 "인트론"은 유전자의 게놈 카피로부터 단리 또는 확인될 수 있고, 일반적으로는 번역 이전의 mRNA 프로세싱 동안 스플라이스 아웃되는 영역인 것으로 정의될 수 있는 DNA 분자를 지칭한다. 별법으로, 인트론은 합성적으로 생산 또는 조작된 DNA 요소일 수 있다. 인트론은 작동가능하게 연결된 유전자의 전사에 영향을 미치는 인핸서 요소를 함유할 수 있다. 인트론은 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 조절하는 조절 요소로서 사용될 수 있다. DNA 구축물은 인트론을 포함할 수 있고, 인트론은 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자 서열와 관련하여 이종일 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있다. 당업계의 인트론의 예는 벼 액틴 인트론 (미국 특허 번호 5,641,876) 및 옥수수 HSP70 인트론 (미국 특허 번호 5,859,347)을 포함한다. 본 발명을 실시하는데 유용한 인트론은 서열 5, 7 및 9를 포함한다. 추가로, 인트론/엑손 경계 서열을 변형하는 경우에, 메신저 RNA의 최종 전사체로의 프로세싱 동안 원치 않는 개시 코돈이 형성될 가능성을 제거하기 위해 스플라이스 부위 (GT)의 5' 말단의 바로 앞의 뉴클레오티드 서열 AT 또는 뉴클레오티드 A 및 각각 스플라이스 부위 (AG)의 3' 말단의 바로 다음의 뉴클레오티드 G 또는 뉴클레오티드 서열 TG의 사용을 피하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 인트론의 5' 또는 3' 말단 스플라이스 접합부위 주변 서열은 이러한 방식으로 변형할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "3' 전사 종결 분자" 또는 "3' UTR"은 전사 동안 mRNA 분자의 3' 비번역 영역 (3' UTR)을 생산하는데 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. mRNA 분자의 3' 비번역 영역은 특이적 절단 및 3' 폴리아데닐화 (폴리A 테일)에 의해 생성될 수 있다. 3' UTR은 전사가능한 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있고, 그의 하류에 위치할 수 있으며, 폴리아데닐화 신호, 및 전사, mRNA 프로세싱, 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 폴리A 테일은 mRNA 안정성 및 번역 개시의 면에서 기능하는 것으로 여겨진다. 당업계의 3' 전사 종결 분자의 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (문헌 [Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 4803-4807, 1983] 참조); 밀 hsp17 3' 영역; 완두콩 루비스코 소형 서브유닛 3' 영역; 목화 E6 3' 영역 (미국 특허 번호 6,096,950); WO/0011200 A2에 개시되어 있는 3' 영역; 및 코익신 3' UTR (미국 특허 번호 6,635,806)이다.

3' UTR은 전형적으로 특정 유전자의 재조합 발현을 위한 유익한 용도가 발견된다. 동물계에서, 3' UTR의 기구는 잘 정의되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Zhao et al., Microbiol Mol Biol Rev 63:405-445, 1999; Proudfoot, Nature 322:562-565, 1986; Kim et al., Biotechnology Progress 19:1620-1622, 2003; Yonaha and Proudfoot, EMBO J. 19:3770-3777, 2000; Cramer et al., FEBS Letters 498:179-182, 2001; Kuerstem and Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637, 2003]). 형질 성능을 방해할 수 있는 형질-비관련 (하류) 서열의 원치않는 전사를 방지하기 위해 효과적인 RNA 전사의 종결이 요구된다. 다중 유전자 발현 카세트를 (예를 들어 하나의 T-DNA 내에서) 서로에 대해 국소적으로 근접하게 배열하면, 독립적인 삽입과 비교하여 상기 구축물에서 하나 이상의 유전자의 유전자 발현이 억제될 수 있다 (문헌 [Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334, 2001]). 이는 예를 들어, 모든 카세트로부터의 강력한 유전자 발현이 요구되는 경우에, 적절한 발현 수준을 달성하는 것을 방해할 수 있다.

식물에서, 명확하게 정의된 폴리아데닐화 신호 서열은 알려져 있지 않다. 하세가와(Hasegawa) 등은 (문헌 [Plant J. 33:1063-1072, 2003]) 시험관내 및 니코티아나 실베스트리스(Nicotiana sylvestris)의 생체내 시스템 둘 다에서 보존적 폴리아데닐화 신호 서열을 확인할 수 없었고, 1차 (비-폴리아데닐화된) 전사체의 실제 길이를 측정할 수 없었다. 약한 3' UTR은, 이웃 발현 카세트에 위치하는 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있는 번역-초과를 생성할 수 있다 (문헌 [Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334, 2001]). 전사 종결의 적절한 제어를 통해 하류에 위치하는 서열 (예를 들어, 다른 발현 카세트)로의 번역-초과를 막을 수 있고, 추가로는 RNA 폴리머라제를 효율적으로 재순환시켜 유전자 발현을 개선시킬 수 있다. 전사의 효율적인 종결 (DNA로부터 RNA 폴리머라제 II의 유리)은 전사 재시작을 위한 전제 조건이 되며, 따라서 이는 전체 전사체 수준에 직접적으로 영향을 미칠 수 있다. 전사 종결에 이어 성숙한 mRNA는 합성 및 주형 부위로부터 세포질로 방출된다. 진핵 mRNA는 생체내에서 폴리(A) 형태로 축적되고, 이는 통상의 방법에 의한 전사 종결 부위의 검출을 곤란하게 한다. 그러나, 효과적인 3' UTR을 용이하게 예측할 수 있게 하는 보존된 서열이 존재하지 않는다는 점에서 생물정보학적 방법에 의해 기능성이고 효율적인 3' UTR을 예측하는 것은 곤란하다.

실용적 관점에서 볼 때, 트랜스진 카세트에서 사용되는 3' UTR이 특정의 특성을 보유하는 것이 유익할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따라 유용한 3' UTR은 트랜스진의 전사를 효율적이고 효과적으로 종결시킬 수 있고, 다중 카세트가 하나의 T-DNA에 존재하는 경우에, 또는 T-DNA가 이웃 염색체 DNA로 삽입되어 있는 경우에서와 같이, 또 다른 트랜스진 카세트로 구성될 수 있는 임의의 이웃 DNA 서열로의 전사체의 번역-초과를 막을 수 있다. 최적으로, 3' UTR은 트랜스진의 발현을 구동시키는데 사용되는 프로모터, 리더 및 인트론에 의해 부여되는 전사 활성의 감소를 초래하지 않아야 한다. 식물 생명공학에서, 3' UTR은 종종 형질전환된 식물로부터 추출된 역전사 RNA의 증폭 반응을 프라이밍시키는데 사용되고, (1) 일단 식물 염색체 내로 통합되고 나면, 트랜스진 카세트의 전사 활성 또는 발현을 평가하는 데; (2) 식물 DNA 내의 삽입 카피수를 평가하는 데; 및 (3) 육종 이후 생성된 종자의 접합성을 평가하는데 사용될 수 있다. 3' UTR은 또한 삽입된 카세트의 무손상을 규명하기 위해 형질전환된 식물로부터 추출된 DNA의 증폭 반응에도 사용될 수 있다.

식물에서 트랜스진의 발현을 제공하는데 유용한 3' UTR은, 예를 들어 빅 블루스템 (안드로포곤 게라르디이(Andropogon gerardii)), 깃털 잔디 [사카룸 라베나에(Saccharum ravennae) (에리안투스 라베나에(Erianthus ravennae))], 강아지풀 (세타리아 비리디스(Setaria viridis)), 테오신트 (제아 메이스(Zea mays) 아종 멕시카나(mexicana)), 조 (세타리아 이탈리카(Setaria italica)), 또는 율무 (코익스 라크리마-조비(Coix lacryma-jobi))로부터 유래된 종자, 꽃 및 임의의 다른 조직으로부터 단리된 메신저 RNA로 제작된 cDNA 라이브러리에서 발현된 서열 태그 (EST)의 발현에 기초하여 확인할 수 있다. cDNA의 라이브러리는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여, 꽃 조직, 종자, 잎, 뿌리 또는 다른 식물 조직을 사용하여 식물 종으로부터 단리된 조직으로부터 제작할 수 있다. 생성된 cDNA는 당업계에 공지된 다양한 서열분석 방법을 사용하여 서열분석된다. 생물정보 소프트웨어, 예컨대 clc_ref_assemble_complete 버전 2.01.37139 (CLC 바이오 USA(CLC bio USA), 02142 매사추세츠주 캠브리지))를 사용하여 생성된 EST를 클러스터로 조립한다. 각 클러스터에 대한 cDNA 리드 개수를 계수하여 각 클러스터의 전사체의 존재비를 측정한다. 확인된 3' UTR은 cDNA 서열로부터 유래된 서열, 뿐만 아니라 게놈 DNA로부터 유래된 서열로 구성될 수 있다. cDNA 서열을 사용하여 프라이머를 설계할 수 있고, 이어서 제조업체의 프로토콜에 따라 구축된 게놈워커(GenomeWalker)™ (클론테크 래보러토리즈, 인크(Clontech Laboratories, Inc), 캘리포니아주 마운틴 뷰) 라이브러리와 함께 사용하여 상응하는 게놈 DNA 서열의 3' 영역을 클로닝하여 보다 긴 종결 서열을 제공할 수 있다. 각 조직 라이브러리에 대해 관찰된 서열 리드의 직접 계수 또는 정규화된 계수에 의해 전사체의 상대적인 존재비를 분석하여 발현 패턴의 특성을 추론할 수 있다. 예를 들어, 일부 3' UTR은 잎 조직보다 뿌리 조직의 전사체에서 더 풍부하게 발견될 수 있다. 이는 전사체가 뿌리에서 고도로 발현되며, 뿌리 발현 특성은 프로모터, 리더, 인트론 또는 3' UTR의 전사 조절에서 기인할 수 있음을 시사한다. 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에서의 발현 특성에 의해 확인된 3' UTR의 실험적 시험은 이러한 특정 기관, 조직 또는 세포 유형에서 발현을 증진시키는 3' UTR을 확인시켜줄 수 있다. 본 발명을 실시하는데 유용한 3' UTR은 서열 9, 10, 11 및 12로서 제공된다.

구축물 및 벡터는 또한 단백질 산물을 특히 엽록체, 백색체, 또는 다른 색소체 소기관; 미토콘드리아; 퍼옥시좀; 공포; 또는 세포외 위치로 표적화하는데 유용한 연결된 펩티드를 발현하는 통과 펩티드 코딩 서열을 포함할 수 있다. 엽록체 통과 펩티드의 사용에 관한 설명은, 미국 특허 번호 5,188,642 및 5,728,925를 참조한다. 엽록체 국재화된 단백질 다수가 핵 유전자로부터 전구체로서 발현되고, 엽록체 통과 펩티드 (CTP)에 의해 엽록체로 표적화된다. 이러한 단리된 엽록체 단백질의 예는 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제의 소형 서브유닛 (SSU), 페레독신, 페레독신 옥시도리덕타제, 집광 복합체 단백질 I 및 단백질 II, 티오레독신 F, 에놀피루빌 쉬키메이트 포스페이트 신타제 (EPSPS)와 회합된 것, 및 미국 특허 번호 7,193,133에 기재되어 있는 통과 펩티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 비-엽록체 단백질은 이종 CTP와의 단백질 융합의 사용에 의해 엽록체로 표적화될 수 있고, CTP는 단백질을 엽록체로 표적화하는데 충분하다는 것이 생체내 및 시험관내에서 입증되었다. 적합한 엽록체 통과 펩티드, 예컨대 아라비돕시스 탈리아나 EPSPS CTP (CTP2) (문헌 [Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987] 참조) 또는 페튜니아 하이브리다(Petunia hybrida) EPSPS CTP (CTP4) (문헌 [della-Cioppa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986] 참조)의 혼입이 트랜스제닉 식물에서 이종 EPSPS 단백질 서열을 엽록체로 표적화시키는 것으로 밝혀졌다 (미국 특허 번호 5,627,061; 5,633,435; 및 5,312,910; 및 EP 0218571; EP 189707; EP 508909; 및 EP 924299 참조).

전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자

본원에 사용된 용어 "전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자"는 RNA 분자로 전사될 수 있는 임의의 DNA 분자를 지칭하며, 단백질 코딩 서열을 갖는 것 및 유전자 억제에 유용한 서열을 갖는 RNA 분자를 생산하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "트랜스진"은 적어도 게놈에서의 그의 위치와 관련하여 숙주 세포에 대해 이종인 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자 및/또는 숙주 세포의 현 또는 임의의 이전 세대에서 세포의 게놈 내로 인공적으로 혼입된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다.

본 발명의 프로모터는 프로모터 분자와 관련하여 이종인 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "이종"은 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 분자의 조합으로서, 이러한 조합이 자연에서는 통상적으로 발견되지 않는 경우의 것을 지칭한다. 예를 들어, 2개의 분자는 상이한 종으로부터 유래될 수 있고/거나, 2개의 분자는 상이한 유전자, 예를 들어 동일한 종으로부터의 상이한 유전자 또는 상이한 종으로부터의 동일한 유전자로부터 유래될 수 있다. 따라서, 이러한 조합이 자연에서는 통상적으로 발견되지 않는다면, 즉 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 상기 프로모터 분자와 조합되어 자연 발생적으로 작동가능하게 연결된 것이 아니라면, 프로모터는 작동가능하게 연결된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 대하여 이종이다.

전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 일반적으로 RNA 전사체의 발현이 요구되는 임의의 DNA 분자일 수 있다. 이러한 RNA 전사체의 발현은 생성된 mRNA 분자의 번역 및 이어서 단백질 발현을 야기할 수 있다. 별법으로, 예를 들어 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 궁극적으로 특정 유전자 또는 단백질의 발현을 감소시키도록 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 이는 안티센스 방향으로 배향된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 사용함으로써 달성될 수 있다. 당업자는 이러한 안티센스 기술을 사용하는 것에 익숙하다. 간략하게, 안티센스 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 전사됨에 따라, RNA 산물은 세포내 상보적인 RNA 분자에 하이브리드되어 격리시킨다. 이러한 이중 RNA 분자는 세포의 번역 기구에 의해 단백질로 번역될 수 없고, 세포 내에서 분해된다. 임의의 유전자는 이러한 방식으로 음성적으로 조절될 수 있다.

따라서, 본 발명의 한 실시양태에서, 서열 1, 2, 3, 4, 6 및 8로서 제공되는 조절 요소는 구축물이 식물 세포의 게놈으로 통합될 경우에 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 전사를 목적하는 수준으로 또는 목적하는 패턴으로 조절하기 위해, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된다. 한 실시양태에서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 유전자의 단백질 코딩 영역을 포함하고, 프로모터는 단백질 산물로서 번역되고 발현되는 RNA 분자의 전사에 영향을 미친다. 또 다른 실시양태에서, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 유전자의 안티센스 영역을 포함하고, 프로모터는 안티센스 RNA 분자, 이중 가닥 RNA, 또는 다른 유사 억제성 RNA 분자의 전사에 영향을 미쳐 표적 숙주 세포에서 관심의 대상이 되는 특정 RNA 분자의 발현을 억제한다.

농경학상 관심 유전자

본 발명에 따른 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 농경학상 관심 유전자일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "농경학상 관심 유전자"는 특정한 식물 조직, 세포, 또는 세포 유형에서 발현될 경우에, 예컨대 식물 형태, 생리, 성장, 발생, 수율, 산물, 영양상 프로파일, 질환 또는 해충 저항성, 및/또는 환경 또는 화학물질 내성과 연관된 바람직한 특성을 부여하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 농경학상 관심 유전자는 수율 단백질, 스트레스 내성 단백질, 발생 조절 단백질, 조직 분화 단백질, 분열조직 단백질, 환경 반응성 단백질, 노화 단백질, 호르몬 반응성 단백질, 탈리 단백질, 공급원 단백질, 침하 단백질, 개화 조절 단백질, 종자 단백질, 제초제 내성 단백질, 질환 내성 단백질, 지방산 생합성 효소, 토코페롤 생합성 효소, 아미노산 생합성 효소, 살충 단백질, 또는 임의의 다른 작용제, 예컨대 억제를 위해 특정한 유전자를 표적화하는 안티센스 또는 RNAi 분자를 코딩하는 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 농경학상 관심 유전자의 산물은 식물 생리 또는 대사에 영향을 미치도록 식물 내에서 작용할 수 있거나, 식물을 섭식하는 해충의 먹이에서 살충제로서 작용할 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에서, 프로모터는 농경학상 관심 유전자인 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 프로모터가 작동가능하게 연결되도록 구축물 내로 혼입된다. 농경학상 유익한 형질을 부여하기 위해 농경학상 관심 유전자의 발현이 바람직할 수 있다. 비제한적으로, 유익한 농경학상 형질은, 예를 들어 제초제 내성, 곤충 방제, 변형된 수율, 진균성 질환 내성, 바이러스 내성, 선충류 내성, 박테리아성 질환 내성, 식물 성장 및 발생, 전분 생산, 변형된 오일 생산, 높은 오일 생산, 변형된 지방산 함량, 높은 단백질 생산, 과일 숙성, 증진된 동물 및 인간 영양, 생체중합체, 환경적 스트레스 내성, 제약 펩티드 및 분비성 펩티드, 개선된 프로세싱 형질, 개선된 소화력, 효소 생산, 향미, 질소 고정, 하이브리드 종자 생산, 섬유 생산, 및 생물연료 생산 등을 포함할 수 있다. 당업계에 공지된 농경학적 관심 유전자의 예는 제초제 내성 (미국 특허 번호 6,803,501; 6,448,476; 6,248,876; 6,225,114; 6,107,549; 5,866,775; 5,804,425; 5,633,435; 및 5,463,175), 증가된 수율 (미국 특허 번호 USRE38,446; 6,716,474; 6,663,906; 6,476,295; 6,441,277; 6,423,828; 6,399,330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; 및 5,716,837), 곤충 방제 (미국 특허 번호 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521,442; 6,501,009; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658; 5,880,275; 5,763,245; 및 5,763,241), 진균성 질환 내성 (미국 특허 번호 6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; 및 6,506,962), 바이러스 내성 (미국 특허 번호 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; 및 5,304,730), 선충류 내성 (미국 특허 번호 6,228,992), 박테리아성 질환 내성 (미국 특허 번호 5,516,671), 식물 성장 및 발생 (미국 특허 번호 6,723,897 및 6,518,488), 전분 생산 (미국 특허 번호 6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; 6,476,295), 변형된 오일 생산 (미국 특허 번호 6,444,876; 6,426,447; 및 6,380,462), 높은 오일 생산 (미국 특허 번호 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; 및 6,476,295), 변형된 지방산 함량 (미국 특허 번호 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; 및 6,459,018), 높은 단백질 생산 (미국 특허 번호 6,380,466), 과일 숙성 (미국 특허 번호 5,512,466), 증진된 동물 및 인간 영양 (미국 특허 번호 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; 및 6,171,640), 생체중합체 (미국 특허 번호 USRE37,543; 6,228,623; 및 5,958,745, 및 6,946,588), 환경적 스트레스 내성 (미국 특허 번호 6,072,103), 제약 펩티드 및 분비성 펩티드 (미국 특허 번호 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; 및 6,080,560), 개선된 프로세싱 형질 (미국 특허 번호 6,476,295), 개선된 소화력 (미국 특허 번호 6,531,648), 낮은 라피노스 (미국 특허 번호 6,166,292), 산업적 효소 생산 (미국 특허 번호 5,543,576), 개선된 풍미 (미국 특허 번호 6,011,199), 질소 고정 (미국 특허 번호 5,229,114), 잡종 종자 생산 (미국 특허 번호 5,689,041), 섬유 생산 (미국 특허 번호 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; 및 5,869,720) 및 생체연료 생산 (미국 특허 번호 5,998,700)을 위한 것을 포함한다.

별법으로, 농경학상 관심 유전자는 예를 들어 안티센스 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,107,065 참조); 억제성 RNA ("RNAi", 예를 들어 공개된 출원 US 2006/0200878 및 US 2008/0066206 및 미국 특허 출원 번호 11/974,469에 기재되어 있는 것과 같은 miRNA, siRNA, 트랜스-작용 siRNA, 및 단계별 sRNA에 의해 매개되는 메카니즘을 통한 유전자 발현 조절 포함); 또는 공동억제-매개 메카니즘을 통해 내인성 유전자의 유전자 발현을 표적화하여 조절하는 RNA 분자를 코딩함으로써 상기 언급된 식물의 특성 또는 표현형에 영향을 미칠 수 있다. RNA는 또한 목적하는 내인성 mRNA 산물을 절단하도록 조작된 촉매성 RNA 분자일 수 있다 (예를 들어, 리보자임 또는 리보스위치; 예를 들어 US 2006/0200878 참조). 따라서, 농경학상 중요한 관심 표현형 또는 형태 변화에 영향을 미치는 전사된 RNA 분자를 코딩하는 임의의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 본 발명을 실시하는데 유용할 수 있다. 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 유전자를 억제할 수 있는 분자로 전사되도록 하는 방식으로 구축물을 구축하고, 이를 세포 내로 도입시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 식물 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해 안티센스 배향된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 구축물을 사용하는 전사후 유전자 억제는 미국 특허 번호 5,107,065 및 5,759,829에 개시되어 있고, 식물에서 유전자 발현을 조절하기 위해 센스 배향된 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 구축물을 사용하는 전사후 유전자 억제는 미국 특허 번호 5,283,184 및 5,231,020에 개시되어 있다. 식물 세포에서의 전사가능한 폴리뉴클레오티드의 발현은 또한 식물 세포를 섭식하는 식물 해충, 예를 들어 딱정벌레 해충으로부터 단리된 조성물 (미국 특허 공개 번호 US20070124836) 및 선충류 해충으로부터 단리된 조성물 (미국 특허 공개 번호 US20070250947)을 억제하는데 사용될 수 있다. 식물 해충은 절지동물 해충, 선충류 해충, 및 진균 또는 미생물 해충을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 구축물 내로 혼입시키기 위한 예시적인 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는, 예를 들어 표적 종 이외의 다른 종으로부터의 DNA 분자 또는 유전자, 또는 동일 종에서 유래된 것이거나, 또는 동일 종에 존재하지만 고전적 생식 또는 육종 기술 이외의 유전 공학 방법에 의해 수용자 세포 내로 혼입된 유전자를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 분자의 유형은 이미 식물 세포에 존재하고 있는 폴리뉴클레오티드 분자, 또 다른 식물로부터의 폴리뉴클레오티드 분자, 상이한 유기체로부터의 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 외부에서 생성된 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 유전자의 안티센스 메시지를 함유하는 폴리뉴클레오티드 분자, 또는 인공, 합성, 또는 그 외 트랜스진의 변형된 버전을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

선택 마커

본원에 사용된 용어 "마커"는 그의 발현 또는 그의 결실이 일부 방법을 통해 스크리닝될 수 있거나, 또는 점수화될 수 있는 임의의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 지칭한다. 본 발명을 실시하는데 사용하기 위한 마커 유전자는 β-글루쿠로니다제 (미국 특허 번호 5,599,670에 기재되어 있는 GUS), 녹색 형광 단백질 및 그의 변이체 (미국 특허 번호 5,491,084 및 6,146,826에 기재되어 있는 GFP), 항생제 내성을 부여하는 단백질, 또는 제초제 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 카나마이신 (nptII), 히그로마이신 B (aph IV), 스트렙토마이신 또는 스펙티노마이신 (aad, spec/strep) 및 겐타마이신 (aac3 및 aacC4)에 대한 내성을 부여하는 단백질을 코딩하는 것을 비롯한 유용한 항생제 내성 마커가 당업계에 널리 공지되어 있다. 트랜스제닉 식물 내성이 입증되고 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 제초제는 하기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 아미노-메틸-포스폰산, 글리포세이트, 글루포시네이트, 술포닐우레아, 이미다졸리논, 브로목시닐, 달라폰, 디캄바, 시클로헥산디온, 프로토포르피리노겐 옥시다제 억제제, 및 이속사스플루톨 제초제. 제초제 내성에 수반되는 단백질을 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자는 당업계에 공지되어 있고, 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제를 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자 (미국 특허 번호 5,627,061; 5,633,435; 6,040,497; 및 5,094,945에 기재되어 있는 글리포세이트 내성에 대한 EPSPS); 글리포세이트 옥시도리덕타제 및 글리포세이트-N-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자 (미국 특허 번호 5,463,175에 기재되어 있는 GOX; 미국 특허 공개 번호 20030083480에 기재되어 있는 GAT, 미국 특허 공개 번호 20030135879에 기재되어 있는 디캄바 모노옥시게나제); 브로목시닐 니트릴라제를 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자 (미국 특허 번호 4,810,648에 기재되어 있는 브로목시닐 내성에 대한 Bxn); 노르플루라존 내성에 대해 문헌 [Misawa, et al. (Plant Journal 4:833-840, 1993; 및 Plant Journal 6:481-489, 1994]에 기재되어 있는 피토엔 데새투라제 (crtI)를 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자; 술포닐우레아 제초제 내성에 대해 문헌 [Sathasiivan, et al. (Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990]에 기재되어 있는 아세토히드록시산 신타제 (AHAS, 일명 ALS)를 코딩하는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자; 및 글루포시네이트 및 비알라포스 내성에 대해 문헌 [DeBlock, et al. (EMBO Journal 6:2513-2519, 1987)]에 기재되어 있는 bar 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 프로모터 분자는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 글리포세이트 내성 EPSPS, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라제, 히드록시페닐 피루베이트 데히드로게나제, 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 달라폰 데할로게나제, 브로목시닐 내성 니트릴라제, 안트라닐레이트 신타제, 아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제, 아세틸 CoA 카르복실라제, 글리포세이트 옥시도리덕타제, 및 글리포세이트-N-아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는, 연결되어 있는 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 발현시킬 수 있다.

형질전환된 세포를 확인 또는 선택하기 위한 수단으로서 그의 분비가 검출될 수 있는, 분비가능한 마커를 코딩하는 유전자도 또한 "선택 마커"라는 용어에 포함된다. 그 예는 항체 상호작용에 의해 확인될 수 있는 분비가능한 항원, 또는 심지어는 촉매적으로 검출될 수 있는 분비가능한 효소를 코딩하는 마커를 포함한다. 선택 분비 마커 단백질은 (예를 들어 ELISA에 의해) 검출가능한 소형 확산성 단백질, 세포외 용액 중에서 검출가능한 소형 활성 효소 (예를 들어 알파-아밀라제, 베타-락타마제, 포스피노트리신 트랜스퍼라제), 또는 세포벽에 삽입되거나 포획된 단백질 (예컨대, 연장부 발현 단위에서 발견되는 것과 같은 리더 서열을 포함하는 단백질, 또는 담배 PR-S로도 공지되어 있는 담배 발병기전 관련 단백질)을 포함하는, 다수의 부류로 나뉜다. 다른 가능한 선택 마커 유전자는 당업자에게 자명할 것이며, 본 발명에 포함된다.

세포 형질전환

용어 "형질전환"은 핵산의 수용자 숙주로의 도입을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "숙주"는 박테리아, 진균 또는 식물의 임의의 세포, 조직, 기관 또는 자손을 비롯한 박테리아, 진균 또는 식물을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 따른 숙주 세포는 임의의 세포 또는 유기체, 예컨대 식물 세포, 조류 세포, 조류, 진균 세포, 진균, 박테리아 세포, 곤충 세포 등일 수 있다. 한 실시양태에서, 숙주 및 형질전환된 세포는 식물, 아스페르길루스(Aspergillus), 효모, 곤충, 박테리아 및 조류로부터의 세포를 포함할 수 있다. 특히 관심대상인 식물 조직 및 세포는 원형질체, 캘러스, 뿌리, 괴경, 종자, 줄기, 잎, 실생, 배아 및 화분을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "형질전환된"은 외래 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 구축물이 그 내부로 도입된 세포, 조직, 기관 또는 유기체를 지칭한다. 도입된 폴리뉴클레오티드 분자가 후손에게로 유전되도록 도입된 폴리뉴클레오티드 분자는 수용자 세포, 조직, 기관 또는 유기체의 게놈 DNA로 통합될 수 있다. "트랜스제닉" 또는 "형질전환된" 세포 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손, 및 교배에서 이러한 트랜스제닉 유기체를 모체로서 사용하고, 외래 폴리뉴클레오티드 분자의 존재로 인해 변경된 표현형을 나타내는 육종 프로그램으로부터 생산된 자손을 포함한다. 용어 "트랜스제닉"은 하나 이상의 이종 폴리핵산 분자를 함유하는 박테리아, 진균, 또는 식물을 지칭한다.

폴리핵산 분자를 식물 세포 내로 도입하기 위한 많은 방법이 존재한다. 방법은 일반적으로 적합한 숙주 세포를 선택하는 단계, 숙주 세포를 재조합 벡터로 형질전환시키는 단계, 및 형질전환된 숙주 세포를 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 방법은 박테리아 감염 (예를 들어 아그로박테리움), 2원 박테리아 인공 염색체 벡터, (예를 들어 PEG-매개 형질전환, 건조/억제-매개 DNA 흡수, 전기천공, 탄화규소 섬유와의 교반, 및 DNA로 코팅된 입자의 가속화 등 (문헌 [Potrykus, et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 205, 1991]에서 검토됨)을 통한) DNA 직접 전달을 포함한다.

DNA 분자를 세포 내에 도입하기 위한 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명의 실시에 있어서 식물 DNA 구축물을 식물 게놈 내로 도입하는 것에 의해 식물 세포를 형질전환시키는 방법 및 물질은 임의의 널리 공지되고 입증된 방법을 포함할 수 있다. 임의의 형질전환 방법이 본 발명의 하나 이상의 프로모터 및/또는 구축물로 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용될 수 있다.

재생된 트랜스제닉 식물을 자가 수분시켜 동형접합 트랜스제닉 식물을 제공할 수 있다. 별법으로, 재생된 트랜스제닉 식물로부터 수득된 화분을 비-트랜스제닉 식물, 바람직하게는 농경학상 중요한 종의 순계와 교배시킬 수 있다. 다른 형질 및 작물에 대해 통상적으로 사용되는 육종 방법에 대한 설명은 여러 참고 서적들 중 하나에서 찾아볼 수 있으며, 예를 들어 문헌 [Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98, 1960; Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399, 1979; Sneep and Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation, 1979; Fehr, Soybeans: Improvement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249, 1987; Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376, 1987]을 참조한다. 역으로, 비-트랜스제닉 식물로부터의 화분을 사용하여 재생된 트랜스제닉 식물을 수분시킬 수 있다.

형질전환된 식물을 관심 유전자의 존재 및 본 발명의 조절 요소에 의해 부여된 발현 수준 및/또는 프로파일에 대해 분석할 수 있다. 당업자는 형질전환된 식물을 분석하는데 이용가능한 다수의 방법을 알고 있다. 예를 들어, 식물 분석 방법은 서던 블롯 또는 노던 블롯, PCR-기반 접근, 생화학적 분석, 표현형 스크리닝 방법, 현장 평가 및 면역진단 검정을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 택맨(TaqMan)® (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티)) 시약 및 제조업체에 의해 기재된 방법, 및 택맨® 시험 매트릭스를 사용하여 결정된 PCR 사이클 횟수를 사용하여 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자의 발현을 측정할 수 있다. 별법으로, 인베이더(Invader)® (써드 웨이브 테크놀로지스(Third Wave Technologies), 위스콘신주 매디슨)) 시약 및 제조업체에 의해 기재된 방법을 사용하여 트랜스진 발현을 평가할 수 있다.

본 발명의 식물의 종자는 생식력있는 트랜스제닉 식물로부터 수확할 수 있고, 이를 사용하여 본 발명의 구축물을 포함하고 농경학상 관심 유전자를 발현하는 잡종 식물 계통을 비롯한 본 발명의 형질전환된 식물의 자손 세대를 성장시킬 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 식물의 부분을 제공한다. 식물의 부분은, 비제한적으로, 잎, 줄기, 뿌리, 괴경, 종자, 내배유, 배주 및 화분을 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 포함하고, 이를 제공한다.

트랜스제닉 식물은 트랜스제닉 폴리뉴클레오티드 분자를 따라 그의 자손에게로 전해질 수 있다. 자손은 조상 식물로부터 유래된 트랜스진을 포함하는 임의의 재생가능한 식물의 부분 또는 종자를 포함한다. 트랜스제닉 식물은 바람직하게는 형질전환된 폴리뉴클레오티드 분자에 대해 동형접합이고, 유성 생식의 결과로서 상기 서열은 모든 자손에게로 전달된다. 자손은 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 종자로부터 성장될 수 있다. 이어서, 이들 추가의 식물을 자가 수분시켜 식물의 순수 육종 계통을 생성할 수 있다. 이들 식물로부터의 자손을 무엇보다도 유전자 발현에 대해 평가한다. 유전자 발현은 여러 통상적인 방법, 예컨대 웨스턴 블롯팅, 노던 블롯팅, 면역 침전법 및 ELISA에 의해 검출할 수 있다.

이에 본 발명은 일반적으로 기재되었는 바, 달리 언급하지 않는 한 예시를 통해 제공되며, 본 발명을 그로 제한하고자 하는 것은 아닌 하기의 실시예를 참조함으로써 본 발명을 보다 용이하게 이해할 수 있을 것이다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명자에 의해 본 발명을 실시함에 있어 기능을 잘 수행하는 것으로 발견된 기술을 나타낸다. 그러나, 본 개시내용에 비추어 개시된 구체적 실시양태에 많은 변화가 가해질 수 있고, 여전히 본 발명의 취지 및 범위로부터 벗어남이 없이 비슷하거나 유사한 결과를 수득할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이며, 따라서 첨부된 도면에 기재되거나 제시된 모든 사항은 제한적인 의미가 아닌 예시적인 것으로 해석되어야 한다.

실시예

실시예 1

제아 메이스로부터 단리된 조절 요소 및 상응하는 전사 조절 발현 요소 그룹

조절 요소를 제아 메이스로부터 단리하고, 제아 메이스 조절 요소를 포함하는 전사 조절 발현 요소 그룹 (EXP) 서열을 구축하였다.

미국 북부에서 4월 초에 일찍 옥수수 종자를 심는 것은 옥수수 종자에 대한 잠재적으로 해로운 위험을 제기한다. 예를 들어, 장기간의 저온 및 습윤 필드 조건은 최적의 발아 및 실생 정착을 막을 수 있다. 전사체 프로파일링 및 후속 특성화를 통해, 종자 발생 및 발아에 유용한 발현 패턴이 입증된 몇몇 후보 유전자를 확인하였다. 본원에서 각각 P-Zm.Nac-1:1:2 (서열 3) 및 L-Zm.Nac-1:1:1 (서열 4)로 지칭되는 후보 유전자로부터의 프로모터 및 리더를 옥수수 게놈 DNA로부터 증폭시키고, 클로닝하고, 서열분석하였다.

증폭 프라이머를 독점적이며 공개된 게놈 및 EST 서열에 기초하여 설계하고, 이어서 이것을 제조업체의 프로토콜에 따라 구축된 게놈워커^TM (클론테크 래보러토리즈, 인크, 캘리포니아주 마운틴 뷰) 라이브러리와 함께 사용하여 상응하는 게놈 DNA 서열의 5' 영역을 클로닝하였다. 이 서열을 사용하여, 유전자에 대해 5' 영역 내에서 조절 요소를 생체정보학적으로 확인하였다. 이러한 분석 결과에 의해, 조절 요소는 유전자의 코딩 서열의 상류인 5' 서열 내인 것으로 규정되었다. 이어서 프라이머를 설계하여 조절 요소를 증폭시켰다. 각 조절 요소에 상응하는 DNA 분자를 독특한 제한 효소 부위를 함유하는 프라이머 및 제아 메이스로부터 단리된 게놈 DNA와 함께 표준 PCR 조건을 사용하여 증폭시켰다. 이렇게 클로닝된 서열은 프로모터 및 제아 메이스 유전자에 대한 단백질-코딩 영역 상류의 5' UTR 서열을 포함하였다. 생성된 DNA 단편을 표준 DNA 클로닝 방법을 사용하여 기본 식물 발현 벡터에 라이게이션하고, 서열분석하였다.

확인된 전사 조절 발현 요소 그룹 ("EXP")의 서열을 본원에서 서열 1, 6 및 8로서 제공하며, 이는 하기 표 1에 열거된 바와 같다. 프로모터 서열을 본원에서 서열 2로서 제공한다. 리더 서열은 본원에서 서열 3으로서 제공한다. 인트론 서열은 본원에서 서열 4, 6 및 8로서 제공한다.

<표 1> 다양한 초종으로부터 단리된 전사 조절 발현 요소 그룹 ("EXP"), 프로모터, 리더 및 인트론

표 1에 제시된 바와 같이, 예를 들어 EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (서열 1)로 명명된 전사 조절 발현 요소 그룹 (EXP)은, 제아 메이스로부터 단리된 성분과 함께, 인트론 요소, I-Zm.DnaK-1:1:1 (서열 5)의 5'에 작동가능하게 연결된 리더 요소, L-Zm.Nac-1:1:1 (서열 4)의 5'에 작동가능하게 연결된 프로모터 요소, P-Zm.Nac-1:1:2 (서열 3)를 포함한다. 다른 EXP는 표 1에 요약된 바와 같이 이와 유사하게 연결된다.

실시예 2

F1 트랜스제닉 옥수수에서 GUS를 구동하는 EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (서열 1)의 분석

옥수수 식물을 β-글루쿠로니다제 (GUS) 트랜스진의 발현을 구동하는 전사 조절 발현 요소 그룹, EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (서열 1)을 함유하는 식물 발현 벡터 pMON73501로 형질전환시키고, 생성된 식물을 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다.

EXP 서열을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 식물 2원 형질전환 플라스미드 구축물로 클로닝하였다. 생성된 식물 발현 플라스미드 구축물, pMON73501은 에이. 투메파시엔스로부터의 우측 경계 영역, 3' UTR 영역 T-AGRtu.nos-1:1:13 (서열 10)의 5'에 작동가능하게 연결된, β-글루쿠로니다제에 대한 코딩 서열 (GUS, 서열 14)에 작동가능하게 연결된 전사 조절 발현 요소 그룹 EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (서열 1)을 시험하기 위한 제1 트랜스진 카세트; CaMV 35S 프로모터, EXP-CaMV.35S:1:1 (서열 15)에 의해 구동되는 제초제 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택에 사용되는 제2 트랜스진 선택 카세트, 및 에이. 투메파시엔스로부터의 좌측 경계 영역을 함유하였다. 생성된 플라스미드를 사용하여 옥수수 식물을 형질전환시켰다.

옥수수 식물을 GUS 발현 벡터, pMON73501로 형질전환시켰다. 단일 카피 삽입에 대해 선택된 R₀ 세대 형질전환체를 비-형질전환된 LH244 식물과 교배하여 형질전환체의 F1 집단을 생산하였다. 발생 과정에 걸쳐 선택된 조직에서 GUS 발현 수준을 측정하였다. 본 연구에 사용된 F1 조직은 이하를 포함한다: 침윤된 종자 배아, 침윤된 종자 내배유, 발아후 (DAG) 3일째의 뿌리 및 자엽초; V3 단계의 잎 및 뿌리; V7 단계의 뿌리 및 성숙한 잎; VT 단계 (옥수수 수염이 나는 시기, 생식 이전)의 뿌리, 성숙 및 노쇠한 잎, 속대, 실크, 절간, 꽃밥, 및 화분; 수분후 (DAP) 7일째의 낟알 및; 21 및 35 DAP의 배아 및 내배유. 선택된 조직 샘플은 또한 건조 및 저온 스트레스 조건에 노출된 F1 식물에 대해 분석되었다. V3 뿌리 및 잎 조직을 저온 및 건조 노출 이후, 뿐만 아니라 저온 노출로부터 회복 후 2일째 (2 DAR)에 샘플링하였다.

건조 스트레스는 F1, V3 식물에서 물 함량이 충분히 급수한 식물의 본래 물 함량의 적어도 50%만큼 감소되도록 4일 동안 급수를 보류하는 것에 의해 유도하였다. 건조 프로토콜은 본질적으로 하기 단계로 구성되었다. V3 단계 식물에서 물을 고갈시켰다. 옥수수 식물이 건조 상태를 겪음에 따라, 잎의 형상은 통상의 건강하고 접히지 않은 외양에서 주맥 관다발에서 접힘을 보이고 잎 끝에서 줄기 쪽을 볼 때 V자형으로 보이는 잎으로 변할 것이다. 형태 면에서 이러한 변화는 통상적으로 급수 중단 후 대략 2일에 일어나기 시작했고, 앞선 실험에서 급수 중단 전 화분의 중량 및 급수하지 않은 식물에서 잎 말림 형태가 관찰될 때의 화분의 중량에 의해 측정시, 약 50%의 물 손실과 연관된 것으로 보였다. 식물은 잎이 잎의 내측 말림 (V자형)에 의해 입증되는 시듦을 보일 때 건조 조건 하에 있는 것으로 간주되었다. 이러한 스트레스 수준은 준-치사 스트레스의 형태인 것으로 간주된다. 일단 각각의 식물이 상기 규정된 바와 같이 건조 유도를 보이면, 식물을 파괴하여 뿌리 및 잎 샘플 둘 다를 취하였다. 각각의 벡터에 대해 4종의 식물을 사용하고, 하기 기재된 바와 같이 GUS 측정치를 수득하였다.

건조에 더하여, pMON73501로 형질전환된 F1 발아 실생 및 F1, V3 단계 식물을 또한 저온 조건에 노출시켜 조절 요소가 GUS의 저온-유도된 발현을 나타내는지를 결정하였다. 각각의 10회의 형질전환 사건의 6개의 종자로부터 유래된 60개의 종자에 대해 저온 조건 하에서의 유전자 발현의 유도를 시험하였다. 종자는 페트리 플레이트 내의 물로 포화된 여과지 상에서 발아되었다. 발아 3일 후에, 발아된 실생이 담긴 페트리 디쉬를 10℃로 설정된 어두운 성장 챔버 내에 24시간 동안 두어 실생을 저온 스트레스에 노출시켰다. 24-시간의 말미에, 뿌리 및 자엽초 조직을 하기 기재된 바와 같이 정량적 GUS 발현에 대해 샘플링하였다. 전체 식물에 대해 V3 단계에서의 저온 스트레스 하에서의 GUS 발현의 유도를 시험하였다. 각각의 10회의 형질전환 사건으로부터의 2종의 식물로 구성된 20종의 V3 단계 옥수수 식물을 성장 챔버 내에서 12℃의 온도에 24시간 동안 노출시켰다. 성장 챔버 내의 식물을 800 μmol/m²·s의 백색광 플루언스 하에 10시간의 백색광 및 14시간의 암흑의 광 주기로 성장시켰다. 저온 노출 후, 정량적 GUS 발현에 대해 잎 및 뿌리 조직을 샘플링하였다.

형질전환된 식물의 정성적 발현 분석을 위해 조직화학적 GUS 분석을 사용하였다. 전체 조직 절편을 적절한 시간 동안 GUS 염색 용액 X-Gluc (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-b-글루쿠로니드) (1 mg/ml)와 함께 인큐베이션시키고, 헹구고, 청색 염색에 대하여 육안으로 검사하였다. 직접 육안 검사함으로써 또는 선택된 식물 기관 및 조직을 사용하여 현미경 하에 검사함으로써 GUS 활성을 정성적으로 측정하였다.

정량 분석을 위해, 형질전환된 옥수수 식물의 선택된 조직으로부터 전체 단백질을 추출하였다. 총 단백질의 1 마이크로그램을 형광 기질 4-메틸륨벨리페릴-β-D-글루쿠로니드 (MUG)와 함께 총 반응 부피 50 μl로 사용하였다. 마이크로맥스 리더(Micromax Reader)가 장착된 플루오로맥스-3(Fluoromax-3) (호리바(Horiba); 일본 교토)을 사용하고, 슬릿 폭을 여기시에는 2 nm로, 방출시에는 3nm로 설정하여, 365 nm에서의 여기, 445 nm에서의 방출로 형광을 측정하였다.

하기 표 2는 pMON73501로 형질전환된 F1 식물에서 선택된 조직에서의 GUS 발현의 평균 수준을 보여준다.

<표 2> pMON73501로 형질전환된, F1 세대 형질전환된 옥수수 식물의 선택된 조직 및 처리의 평균 GUS 발현 값

표 2에서 보여지는 바와 같이, 프로모터 및 리더 P-Zm.Nac-1:1:2 (서열 2) 및 L-Zm.Nac-1:1:1 (서열 3)을 포함하는 EXP 서열, EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (서열 1)에 의해 구동된 발현과 관련하여 현저한 특징은, 샘플링된 다른 조직에 비해 침윤된 종자 배아 및 내배유 조직에서 관찰되는 보다 높은 수준의 발현이다. 이러한 높은 수준의 발현은 저온 및 습윤 스트레스 조건에 대한 보호를 제공하는데 유용한 트랜스진을 발현하는 발아 중인 종자에게 이점을 부여할 수 있다. 발현은 또한, 다른 조직에 비해 초기 종자 발생 동안의 배아 및 내배유 (21 및 35 DAP)에서 보다 높았다. 이러한 발현 패턴은 또한 생성된 종자의 발아 및 성장을 용이하게 하는데 유익할 수 있다. 예를 들어, 종자 발생의 초기 단계 동안 발현되는 제아 메이스 Nac 프로모터 및 리더에 작동가능하게 연결된 트랜스진의 발현으로부터 유래된 단백질 또는 산물은 저온 또는 습윤 조건에서의 발아 시 신속한 사용을 위해 저장되도록 발생 중인 종자에서의 단백질 또는 유래된 산물의 축적을 허용할 것이다. 발아 시의 발현은 저온 및 습윤 스트레스 조건 하에서의 임계 시점에 추가의 단백질 또는 유래된 산물의 발현을 가능하게 함으로써 목적하는 트랜스진을 구동하는 종자에게 추가의 이점을 제공할 것이다. 저온에 대한 약한 유도가 또한 본 실험 중 V3 잎 및 뿌리에서 관찰되었다.

실시예 3

R0 트랜스제닉 옥수수에서 GUS를 구동하는 조절 요소의 분석

옥수수 식물을 β-글루쿠로니다제 (GUS) 트랜스진의 발현을 구동하는 EXP 서열을 함유하는 식물 발현 벡터로 형질전환시키고, 생성된 식물을 GUS 단백질 발현에 대해 분석하였다. 전사 조절 발현 요소 그룹을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 식물 2원 형질전환 플라스미드 구축물 내로 클로닝하였다.

생성된 식물 발현 플라스미드 구축물은 에이. 투메파시엔스로부터의 우측 경계 영역, 3' 종결 영역 (표 3에 나타냄)의 5'에 작동가능하게 연결된, β-글루쿠로니다제에 대한 코딩 서열 (GUS, 서열 14)에 작동가능하게 연결된 EXP 서열 (표 3에 나타냄)로 구성된 EXP 서열 및 3' UTR 조합을 시험하기 위한 제1 트랜스진 카세트; 제초제 글리포세이트에 대한 내성을 부여하는 형질전환된 식물 세포의 선택에 사용되는 제2 트랜스진 선택 카세트 (CP4, US RE39247, 벼 액틴 1 프로모터, EXP-Os.Act1:1:1, 서열 16에 의해 구동됨), 및 에이. 투메파시엔스로부터의 좌측 경계 영역을 함유하였다. 생성된 플라스미드를 사용하여 옥수수 식물을 형질전환시켰다. 표 3은 플라스미드 명칭, 표 1에서도 기재되어 있는 전사 조절 발현 요소 그룹, 및 GUS 코딩 서열과 작동가능한 연결로 위치한 3' UTR을 열거한다. 각각의 플라스미드 구축물은 프로모터 및 리더 P-Zm.Nac-1:1:2 (서열 3) 및 L-Zm.Nac-1:1:1 (서열 4)와 작동가능한 연결로 위치한 특정 인트론 및 3' UTR로 구성된 독특한 트랜스진 카세트 배위로 구성되었다.

<표 3> GUS 플라스미드 구축물 및 상응하는 전사 조절 발현 요소 그룹 및 3' UTR.

당업계에 공지된 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 사용하여 식물을 형질전환시켰다. 조직화학 및 정량적 GUS 분석을 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 수행하였다. 옥수수 식물 내로 형질전환된 각각의 GUS 트랜스진 카세트에 대해 관찰된 평균 R₀ GUS 발현을 하기 표 4에 제시한다.

<표 4> 뿌리 및 잎 조직에서의 평균 R₀ GUS 발현

실시예 2에서 수득된 결과와 일치하게, 표 4는 발현이 트랜스진 카세트의 모든 4종에 대해 발생 중인 배아 (21 DAP)에서 가장 높음을 보여주었다. 도 1은 각각의 트랜스진 카세트 배위에 의해 부여된 상이한 발현 패턴을 예시한다. 발생 중인 배아에서의 발현은 다른 3종의 트랜스진 카세트와 관련하여 3' UTR, T-Os.Ara5-1:1:1 (서열 13)에 작동가능하게 연결된 EXP 서열, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (서열 8)로 구성된 트랜스진 카세트의 경우에 가장 높았다. 3' UTR, T-Os.Mth-1:1:1 (서열 12)에 작동가능하게 연결된 전사 조절 발현 요소 그룹, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (서열 8)로 구성된 발현 카세트로 형질전환된 식물의 발생 중인 배아 및 내배유에서 유사한 발현 수준이 관찰되었다. 3' UTR, T-Os.Mth-1:1:1 (서열 12)에 작동가능하게 연결된 전사 조절 발현 요소 그룹, EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (서열 6)로 구성된 트랜스진 카세트의 경우에, 내배유에서의 발현은 배아에서의 발현에 비해 훨씬 낮았다. 3' UTR, T-Os.CLUS33428_1-1:1:1 (서열 11)에 작동가능하게 연결된 전사 조절 발현 요소 그룹, EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (서열 6)로 구성된 트랜스진 카세트의 경우에, 배아에서의 발현은 내배유에서의 발현에 비해 더 낮았다. 각각의 트랜스진 카세트 배위는 발생 중인 R₀ 종자에서 독특한 발현 패턴을 제공하였다.

4종의 상이한 트랜스진 카세트로 형질전환된 식물의 뿌리, 잎, 꽃밥 및 실크, 뿐만 아니라 발생 중인 종자에서의 발현 차이를 또한 관찰하였다. 도 2는 상기 기재된 각각의 조직에서 각각의 트랜스진 카세트 배위에 의해 부여된 상이한 발현 패턴을 예시한다. 예를 들어, 잎 발현은 EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (서열 6)을 포함하는 트랜스진 카세트에 비해 EXP 서열, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (서열 8)로 구성된 트랜스진 카세트에서 더 높았다. 꽃밥 발현은 3' UTR, T-Os.CLUS33428_1-1:1:1 (서열 11)에 작동가능하게 연결된 전사 조절 발현 요소 그룹, EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (서열 6) 및 3' UTR, T-Os.Mth-1:1:1 (서열 12)에 작동가능하게 연결된 전사 조절 발현 요소 그룹, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (서열 8)로 구성된 2종의 트랜스진 카세트에서 더 높았다. 각각의 4종의 트랜스진 카세트 배위는 R₀ 형질전환체에서 독특한 발현 패턴을 제공하였다.

본 발명의 원리가 예시되고 기재되어 있으므로, 본 발명이 이러한 원리에 벗어나지 않으면서 배열 및 세부사항에서 변형될 수 있음은 당업자에게 분명할 것이다. 본 발명자들은 특허청구범위의 취지 및 범위 내에 있는 모든 변형을 특허청구한다. 본원에서 인용되는 모든 간행물 및 공개된 특허 문서는 각각의 개별 간행물 또는 특허 출원이 참조로 포함되어 있다고 구체적이고 개별적으로 명시된 바와 같은 정도로 본원에서 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Monsanto Technology LLC Ahrens, Jeffrey E. Cherian, Shoba Loida, Paul J. Lutfiyya, Linda L. Wu, Wei Xie, Jiali <120> PLANT REGULATORY ELEMENTS AND USES THEREOF <130> MONS:326WO <140> Unknown <141> 2013-04-10 <150> 61/635,945 <151> 2012-04-20 <150> 13/830,403 <151> 2013-03-14 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2305 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group <400> 1 gaggtgcata aggctggcaa gacgacagtt aggaacgcat gcgagcgagg ttgacggacg 60 cgataaggtt agcgcatgcg tcgaacgcgg gctggcgagg gtggaaggca tgataaggct 120 attgggtagc gcaaaatgtg tagacagcgg gcgagtgagg atggcagtgg tggcatgcat 180 ggacgcggtt ggagcatacg cgacaagaat ggagcacgac gtagatttcg ggaggccgtg 240 gttggagcgc ccgcgggcga gatggcggcc atggttagag cgcccgtggt tacgggtggg 300 ttcatggcga gcggaggggt tgcaagattt ccagggcgct cgggtcggtt gcaagctcca 360 cggtggaggc gtgacggaga cgacgtgggg agggaggtcg tggggaaatt cggacgagca 420 gaggcgtggc aggtgtggca tggggaggga ggtcgcgggg agggcgcagg gaggtggcat 480 ggggagggag gctggggacg aagatgatgt gggcccagag ggacgcggga caaagaattg 540 cgtatgataa 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gaacctacac agcaatacga gaaatgtgta atttggtgct 240 tagcggtatt tatttaagca catgttggtg ttatagggca cttggattca gaagtttgct 300 gttaatttag gcacaggctt catactacat gggtcaatag tatagggatt catattatag 360 gcgatactat aataatttgt tcgtctgcag agcttattat ttgccaaaat tagatattcc 420 tattctgttt ttgtttgtgt gctgttaaat tgttaacgcc tgaaggaata aatataaatg 480 acgaaatttt gatgtttatc tctgctcctt tattgtgacc ataagtcaag atcagatgca 540 cttgttttaa atattgttgt ctgaagaaat aagtactgac agtattttga tgcattgatc 600 tgcttgtttg ttgtaacaaa atttaaaaat aaagagtttc ctttttgttg ctctccttac 660 ctcctgatgg tatctagtat ctaccaactg acactatatt gcttctcttt acatacgtat 720 cttgctcgat gccttctccc tagtgttgac cagtgttact cacatagtct ttgctcattt 780 cattgtaatg cagataccaa gcgg 804 <210> 6 <211> 2232 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group <400> 6 gaggtgcata aggctggcaa gacgacagtt aggaacgcat gcgagcgagg ttgacggacg 60 cgataaggtt agcgcatgcg tcgaacgcgg gctggcgagg gtggaaggca tgataaggct 120 attgggtagc gcaaaatgtg tagacagcgg gcgagtgagg atggcagtgg tggcatgcat 180 ggacgcggtt ggagcatacg cgacaagaat ggagcacgac gtagatttcg ggaggccgtg 240 gttggagcgc ccgcgggcga gatggcggcc atggttagag cgcccgtggt tacgggtggg 300 ttcatggcga gcggaggggt tgcaagattt ccagggcgct cgggtcggtt gcaagctcca 360 cggtggaggc gtgacggaga cgacgtgggg agggaggtcg tggggaaatt cggacgagca 420 gaggcgtggc aggtgtggca tggggaggga ggtcgcgggg agggcgcagg gaggtggcat 480 ggggagggag gctggggacg aagatgatgt gggcccagag ggacgcggga caaagaattg 540 cgtatgataa cgggttgatt cgtagaattt taggcggtat ttataaaaat gacgcaggac 600 agccattggt actgatactt taatatagta gagaagagat ataaattagg acgggtacaa 660 caagaccaca cgtactaaca tttttttttg tcacaggctg ctctaataca tatctctatg 720 ataagcgagc tagggatgct agcgtgtcca tttgattcct atataaatct ccaattatag 780 ctgtagcaat taatttaata aacacccaac aatagatcaa atctcatagc aaatcataat 840 catgaatgct ccaaaatcag ctagctggct ctcccttatc ttcgtttttc cttcttctcc 900 tgcaacgaaa agaaaaaaaa agaaaagaaa agaaaacggc cgcttgtggt actaactccc 960 aactacgcac ctaccgcgcg cataactctt ggccgcctgc cctcatcacc tccgcgtcgc 1020 cgtcgactca tccttatcct ccccatcacg ctcaccccgc gcccgcaccg cgccatccgt 1080 actttcccgg ccgccccacc gctggccgcc ccgacgtgtc gcgccgccac cggaaggtcc 1140 cgggccgtcg ggcgggcaga gcgcctgcag cggtggaccc acgccacgct gacgcgggcg 1200 cgcgtccgtc caagaaacct gacgtaagca gtgacagaat tggcgccgcc tctcggcgtc 1260 cacgtgtcgt ggtcaacctg tcagagtggg gctccgtgtg tgcgctaccg caggggcccg 1320 gcgcacgggc cacacgtgtc gcggtcgacc gcggctataa atgcccggct ccgcactcgg 1380 aacaagtttc aagctctcct cccctcttcc taccattagc agtagccaca gccagaacac 1440 cagcagacag cagcatcagc agggaggaac acctgcaggc ctacgctgac aagctgactc 1500 tagcagatcc tctagaacca tcttccacac actcaagcca cactattgga gaacacacag 1560 ggacaacaca ccataagatc tcaagaccgc ggtatgcttt ctgaatatca tccgtactgt 1620 tctatggttt ttggcatgca tttgtttcct ctttatatca atgacaagtg aaggaacttt 1680 atgtagtttt atgatagata taagcacttt atcgtcagga aatcaaatag gatgtgcagt 1740 caagctaagt tatatatagc agaattcagt gaacataaaa cacttgtttt gatataacat 1800 gattcaaata tactggcatc tctagttcaa atctactctt caaagttata taatgcattt 1860 gaaggaaaat ttctatcttc aacttcacag aaagcaaaat agatatgatt tgtgtatacc 1920 aaatgaactt agagactcaa aatatactag taatacattt gtaaactcga catctgcatc 1980 aagacatgac atgggttaac cactagcagt tgtaaggata aagcatgaag cattcatgtg 2040 tcctgcttat gttctatgaa ccatctgcag gtcataattc agaagaaaag tttggaactt 2100 ctaatcctac aacataacaa gcatactttt atcaactttg gataataaat tcttaagatg 2160 agtttttcat tcaattatgg ttcagaacta gaagattaaa aactttatcc ttcttgctgt 2220 agaaaaccat tg 2232 <210> 7 <211> 651 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 7 caagaccgcg gtatgctttc tgaatatcat ccgtactgtt ctatggtttt tggcatgcat 60 ttgtttcctc tttatatcaa tgacaagtga aggaacttta tgtagtttta tgatagatat 120 aagcacttta tcgtcaggaa atcaaatagg atgtgcagtc aagctaagtt atatatagca 180 gaattcagtg aacataaaac acttgttttg atataacatg attcaaatat actggcatct 240 ctagttcaaa tctactcttc aaagttatat aatgcatttg aaggaaaatt tctatcttca 300 acttcacaga aagcaaaata gatatgattt gtgtatacca aatgaactta gagactcaaa 360 atatactagt aatacatttg taaactcgac atctgcatca agacatgaca tgggttaacc 420 actagcagtt gtaaggataa agcatgaagc attcatgtgt cctgcttatg ttctatgaac 480 catctgcagg tcataattca gaagaaaagt ttggaacttc taatcctaca acataacaag 540 catactttta tcaactttgg ataataaatt cttaagatga gtttttcatt caattatggt 600 tcagaactag aagattaaaa actttatcct tcttgctgta gaaaaccatt g 651 <210> 8 <211> 1629 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chimeric transcriptional regulatory expression element group <400> 8 gaggtgcata aggctggcaa gacgacagtt aggaacgcat gcgagcgagg ttgacggacg 60 cgataaggtt agcgcatgcg tcgaacgcgg gctggcgagg gtggaaggca tgataaggct 120 attgggtagc gcaaaatgtg tagacagcgg gcgagtgagg atggcagtgg tggcatgcat 180 ggacgcggtt ggagcatacg cgacaagaat ggagcacgac gtagatttcg ggaggccgtg 240 gttggagcgc ccgcgggcga gatggcggcc atggttagag cgcccgtggt tacgggtggg 300 ttcatggcga gcggaggggt tgcaagattt ccagggcgct cgggtcggtt gcaagctcca 360 cggtggaggc gtgacggaga cgacgtgggg agggaggtcg tggggaaatt cggacgagca 420 gaggcgtggc aggtgtggca tggggaggga ggtcgcgggg agggcgcagg gaggtggcat 480 ggggagggag gctggggacg aagatgatgt gggcccagag ggacgcggga caaagaattg 540 cgtatgataa cgggttgatt cgtagaattt taggcggtat ttataaaaat gacgcaggac 600 agccattggt actgatactt taatatagta gagaagagat ataaattagg acgggtacaa 660 caagaccaca cgtactaaca tttttttttg tcacaggctg ctctaataca tatctctatg 720 ataagcgagc tagggatgct agcgtgtcca tttgattcct atataaatct ccaattatag 780 ctgtagcaat taatttaata aacacccaac aatagatcaa atctcatagc aaatcataat 840 catgaatgct ccaaaatcag ctagctggct ctcccttatc ttcgtttttc cttcttctcc 900 tgcaacgaaa agaaaaaaaa agaaaagaaa agaaaacggc cgcttgtggt actaactccc 960 aactacgcac ctaccgcgcg cataactctt ggccgcctgc cctcatcacc tccgcgtcgc 1020 cgtcgactca tccttatcct ccccatcacg ctcaccccgc gcccgcaccg cgccatccgt 1080 actttcccgg ccgccccacc gctggccgcc ccgacgtgtc gcgccgccac cggaaggtcc 1140 cgggccgtcg ggcgggcaga gcgcctgcag cggtggaccc acgccacgct gacgcgggcg 1200 cgcgtccgtc caagaaacct gacgtaagca gtgacagaat tggcgccgcc tctcggcgtc 1260 cacgtgtcgt ggtcaacctg tcagagtggg gctccgtgtg tgcgctaccg caggggcccg 1320 gcgcacgggc cacacgtgtc gcggtcgacc gcggctataa atgcccggct ccgcactcgg 1380 aacaagtttc aagctctcct cccctcttcc taccattagc agtagccaca gccagaacac 1440 cagcagacag cagcatcagc agggaggaac acctgcaggc ctacacgctg acaagctgac 1500 tctagcagat ctccctgcca aggtatatat gctgattgat ttctactctt cctcaattca 1560 aaattgaaag atattatgct gatctggtta aatttatgtt tggtttggtt tggtttcagc 1620 aaggtgctg 1629 <210> 9 <211> 117 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 9 ccctgccaag gtatatatgc tgattgattt ctactcttcc tcaattcaaa attgaaagat 60 attatgctga tctggttaaa tttatgtttg gtttggtttg gtttcagcaa ggtgctg 117 <210> 10 <211> 253 <212> DNA <213> Agrobacterium tumefaciens <400> 10 gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg 60 atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg taataattaa catgtaatgc 120 atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc cgcaattata catttaatac 180 gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct 240 atgttactag atc 253 <210> 11 <211> 380 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 11 tcgatcaatc gatcacgtcg tcgtctcggc tcgtcatcaa tcgcgatcga tcggtcgttt 60 tcacctaata ataatataat catatgtgtg tgtgcaaaga ataacgaatt aacctcccca 120 agcttcatgt atgcatacat gcatcgttag tgcatgtgtc cctgatcatg ggtctctggg 180 ggaggatcat gttgtgtcgt gtgtcggctg tgtctcggtt atcgtcttat cgatttcgat 240 catatcggcc aattgttgtc gcgctggcca cgtatatgta cttgatcgat gaccgagaaa 300 ctcctaggtc aatctgtgtg ttcatatata catcagtcca ataaatcgat cgttaattat 360 attacaaagt tttcgcattt 380 <210> 12 <211> 300 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 12 ggccaaggcg atctatgact gaattgccaa tgcaccagcc tgtctacatg atgaataaat 60 aaagagtcca tccagtgtga tggctcatgc ctgtgtgagt gtgactgaat ccatcagtgt 120 gtgtgtgtgt ttgtgtcaac catgtgtgaa tcaggtgtca aaaatcgtgg ctggaaatcc 180 atgtggtttc tagctttatg taaatgttgt ttgtgaaata taaatattgt tttgtgtatg 240 tgaattttac tctctcattt ttctcttgca ctcaccattc tattatagta atttttttaa 300 <210> 13 <211> 213 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 13 ctaggctact gtagctagct gtgcatgtat gtggtgtggt tactaaaata attagtgttt 60 tccttttgtt tggaagcata tgtgtggtga ataaatgatg aactccgatg ttcctctcta 120 taaatcttga tgattcgcta gctatccgta cgtcgttgtt ctttgatttg atgatgagat 180 tgaaaaatgg aatgtcatgc taaggagggt gcc 213 <210> 14 <211> 1812 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Codon redesigned coding sequence <400> 14 atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120 gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180 cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240 ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300 aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360 tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420 cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480 ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540 aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 600 tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg 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1500 atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 1560 tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 1620 agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 1680 ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 1740 gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 1800 ggcaaacaat ga 1812 <210> 15 <211> 324 <212> DNA <213> Cauliflower mosaic virus <400> 15 ccgatcctac ctgtcacttc atcaaaagga cagtagaaaa ggaaggtggc acctacaaat 60 gccatcattg cgataaagga aaggctatca ttcaagatgc ctctgccgac agtggtccca 120 aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga agacgttcca accacgtctt 180 caaagcaagt ggattgatgt gatacttcca ctgacgtaag ggatgacgca caatcccact 240 atccttcgca agacccttcc tctatataag gaagttcatt tcatttggag aggacacgct 300 gaaatcacca gtctctctct acaa 324 <210> 16 <211> 1399 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 16 tcgaggtcat tcatatgctt gagaagagag tcgggatagt ccaaaataaa acaaaggtaa 60 gattacctgg tcaaaagtga aaacatcagt taaaaggtgg tataaagtaa aatatcggta 120 ataaaaggtg gcccaaagtg aaatttactc ttttctacta ttataaaaat tgaggatgtt 180 tttgtcggta ctttgatacg tcatttttgt atgaattggt ttttaagttt attcgctttt 240 ggaaatgcat atctgtattt gagtcgggtt ttaagttcgt ttgcttttgt aaatacagag 300 ggatttgtat aagaaatatc tttagaaaaa cccatatgct aatttgacat aatttttgag 360 aaaaatatat attcaggcga attctcacaa tgaacaataa taagattaaa atagctttcc 420 cccgttgcag cgcatgggta ttttttctag taaaaataaa agataaactt agactcaaaa 480 catttacaaa aacaacccct aaagttccta aagcccaaag tgctatccac gatccatagc 540 aagcccagcc caacccaacc caacccaacc caccccagtc cagccaactg gacaatagtc 600 tccacacccc cccactatca ccgtgagttg tccgcacgca ccgcacgtct cgcagccaaa 660 aaaaaaaaga aagaaaaaaa agaaaaagaa aaaacagcag gtgggtccgg gtcgtggggg 720 ccggaaacgc gaggaggatc gcgagccagc gacgaggccg gccctccctc cgcttccaaa 780 gaaacgcccc ccatcgccac tatatacata cccccccctc tcctcccatc cccccaaccc 840 taccaccacc accaccacca cctccacctc ctcccccctc gctgccggac gacgagctcc 900 tcccccctcc ccctccgccg ccgccgcgcc ggtaaccacc ccgcccctct cctctttctt 960 tctccgtttt tttttccgtc tcggtctcga tctttggcct tggtagtttg ggtgggcgag 1020 aggcggcttc gtgcgcgccc agatcggtgc gcgggagggg cgggatctcg cggctggggc 1080 tctcgccggc gtggatccgg cccggatctc gcggggaatg gggctctcgg atgtagatct 1140 gcgatccgcc gttgttgggg gagatgatgg ggggtttaaa atttccgccg tgctaaacaa 1200 gatcaggaag aggggaaaag ggcactatgg tttatatttt tatatatttc tgctgcttcg 1260 tcaggcttag atgtgctaga tctttctttc ttctttttgt gggtagaatt tgaatccctc 1320 agcattgttc atcggtagtt tttcttttca tgatttgtga caaatgcagc ctcgtgcgga 1380 gcttttttgt aggtagaag 1399

Claims

a) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열에 적어도 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및
c) 유전자 조절 활성을 갖는, 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열은 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동하게 연결된 것인 DNA 분자.
제1항에 있어서, 상기 서열이 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 DNA 서열에 적어도 90 퍼센트 서열 동일성을 갖는 것인 DNA 분자.
제1항에 있어서, 상기 서열이 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 DNA 서열에 적어도 95 퍼센트 서열 동일성을 갖는 것인 DNA 분자.
제1항에 있어서, DNA 서열이 유전자 조절 활성을 포함하는 것인 DNA 분자.
제1항에 있어서, 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자가 농경학상 관심 유전자를 포함하는 것인 DNA 분자.
제5항에 있어서, 농경학상 관심 유전자가 식물에서 제초제 내성을 부여하는 것인 DNA 분자.
제5항에 있어서, 농경학상 관심 유전자가 식물에서 해충 저항성을 부여하는 것인 DNA 분자.
a) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열에 적어도 85 퍼센트 서열 동일성을 갖는 서열;
b) 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열을 포함하는 서열; 및
c) 유전자 조절 활성을 갖는, 서열 1, 2, 3, 4, 6 또는 8 중 임의의 서열의 단편
으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하며, 여기서 상기 서열은 이종의 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자에 작동하게 연결된 것인 이종 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포.
제8항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물 세포가 단자엽 식물 세포인 트랜스제닉 식물 세포.
제8항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물 세포가 쌍자엽 식물 세포인 트랜스제닉 식물 세포.
제1항의 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분.
제1항의 DNA 분자를 포함하는, 제11항의 트랜스제닉 식물의 자손 식물 또는 그의 부분.
제1항의 DNA 분자를 포함하는 트랜스제닉 종자.
서열 1, 6 및 8로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 조절 발현 요소 그룹을 포함하며, 여기서 상기 전사 조절 발현 요소 그룹은 서열 10, 11, 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것인 트랜스진 카세트.
제14항에 있어서, 서열 1로 제시되는 전사 조절 발현 요소 그룹을 포함하며, 여기서 상기 전사 조절 발현 요소 그룹이 서열 10으로 제시되는 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것인 트랜스진 카세트.
제14항에 있어서, 서열 6으로 제시되는 전사 조절 발현 요소 그룹을 포함하며, 여기서 상기 전사 조절 발현 요소 그룹이 서열 11 및 12로 이루어진 군으로부터 선택된 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것인 트랜스진 카세트.
제14항에 있어서, 서열 8로 제시되는 전사 조절 발현 요소 그룹을 포함하며, 여기서 상기 전사 조절 발현 요소 그룹이 서열 12 및 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 3' UTR에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것인 트랜스진 카세트.
제11항에 따른 트랜스제닉 식물 또는 그의 부분을 수득하고, 그로부터 범용 산물을 생산하는 것을 포함하는, 범용 산물의 생산 방법.
제18항에 있어서, 범용 산물이 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡물, 전분, 종자, 굵은 곡분, 고운 곡분, 바이오매스 또는 종자 오일인 방법.
제11항에 따른 트랜스제닉 식물을 수득하고, 식물을 재배하는 것을 포함하며, 여기서 전사가능한 폴리뉴클레오티드가 발현되는 것인, 전사가능한 폴리뉴클레오티드 분자를 발현하는 방법.