BR112014026070B1 - Molécula de dna, cassete de transgene e processo de expressão de uma molécula de polinucleotídeo - Google Patents

Abstract

ELEMENTOS REGULADORES DE PLANTA E SEUS USOS. A presente invenção refere-se a moléculas de DNA e construções, e suas sequências de nucleotídeos, úteis para modulação de expressão de gene em plantas. Plantas transgênicas, células de plantas, partes de plantas, e sementes compreendendo as moléculas de DNA operavelmente ligadas a polinucleotídeos que podem ser transcritos heterólogos também são providos, como são processos de seus usos.

Description

Referência a Pedidos de Patente Relacionados

[001] Este pedido de patente reivindica o benefício de pedido de patente não provisório United States No. 61/635 945, depositado em 20 de abril de 2012, e pedido de patente não provisório United states No. 13/830 403, depositado em 14 de março de 2013, que são aqui incorporados por referência em suas totalidades.

Incorporação de Listagem de Sequências

[002] A listagem de sequências que está contida no arquivo cha mado "MONS326WO_ST25.txt", que é de 22 kilobytes (como medido em Microsoft Windows) e foi criado em 10 de abril de 2013, é depositado com o mesmo através de sujeição eletrônica e é aqui incorporado por referência.

Campo da Invenção

[003] A presente invenção refere-se ao campo de biologia mole cular de planta e engenharia genética de planta. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a moléculas de DNA úteis para modulação de expressão de genes em plantas.

Antecedentes da Invenção

[004] Elementos reguladores são elementos genéticos que regu lam atividade de gene através de modulação de transcrição de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada operacionalmente. Tais elementos incluem promotores, líderes, introns, e regiões 3’ não traduzidas e são úteis no campo de biologia molecular de planta e engenharia genética de planta.

[005] Colheitas transgênicas expressando transgenes que confe rem uma vantagem a uma planta durante germinação em condições de tensão úmida e frio requerem elementos reguladores que possuam padrões de expressão em tecidos que são mais benéficos para a expressão de tais transgenes. Tais elementos reguladores devem ser suficientemente expressos na semente em desenvolvimento de modo a permitir a estocagem de produtos de transgene que possam atuar rapidamente quando a semente germina sob condições frias e/ou úmidas, assim como prover expressão durante os estágios iniciais de germinação e estabelecimento de plântula. Da mesma maneira, a presente invenção provê novos elementos reguladores que demonstram maiores níveis de expressão no desenvolvimento e germinação de semente e podem ser usados para dirigir expressão de transgenes que proporcionam benefícios sob condições de germinação no frio e/ou umidade.

Sumário da Invenção

[006] A presente invenção provê novos elementos reguladores de gene para uso em plantas. A presente invenção também provê construções de DNA compreendendo os elementos reguladores. A presente invenção também provê células de planta transgênica, plantas, e sementes compreendendo os elementos reguladores. As sequências podem ser providas ligadas operacionalmente a uma molécula de poli- nucleotídeo que pode ser transcrita. Em uma realização, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita pode ser heteróloga com relação a um sequência reguladora aqui provida. Uma sequência de elemento regulador provida pela invenção assim pode, em realizações particulares, ser definida como operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. A presente invenção também provê processos de fabricação e uso de elementos reguladores, as construções de DNA compreendendo os elementos reguladores, e as células de plantas transgênicas, plantas e sementes compreendendo os elementos reguladores ligados operacionalmente a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita.

[007] Em um aspecto, a invenção provê uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência com pelo menos cerca de 85 porcento de identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; (b) uma sequência compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; e (c) um fragmento de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8, onde o fragmento tem atividade reguladora de gene, onde a referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita, heteró- loga. Em uma realização, a molécula de DNA tem pelo menos cerca de 90 porcento de identidade de sequência para a sequência de DNA de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8. Em outra reali-zação, a molécula de DNA tem pelo menos 95 porcento de identidade de sequência para a sequência de DNA de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8. Em outra realização, a sequência de DNA compreende atividade reguladora de gene. Ainda em outra realização, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga compreende um gene de interesse agronômico. Em outras realizações, o gene de interesse agronômico confere tolerância a herbicida ou resistência a peste em plantas.

[008] Em outro aspecto, a presente invenção provê uma célula de planta transgênica compreendendo uma molécula de DNA heteróloga compreendendo uma sequência selecionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência com pelo menos cerca de 85 porcento de identidade de sequência para qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; (b) uma sequência compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; e (c) um fragmento de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8, onde o fragmento tem atividade reguladora de gene, onde a referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Em realizações, a célula de planta transgênica pode ser uma célula de planta monocotiledônea ou uma célula de planta dicotiledônea.

[009] Em outras realizações, a invenção provê uma planta trans- gênica, ou sua parte, compreendendo uma molécula de DNA selecionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência com pelo menos cerca de 85 porcento de identidade de sequência para qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; (b) uma sequência compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; e (c) um fragmento de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8, onde o fragmento tem atividade reguladora de gene, onde a referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga. Em outra realização, a invenção provê uma planta de progênie de qualquer geração de uma tal planta transgênica, ou uma sua parte, onde a planta ou parte de progênie compreende a molécula de DNA como descrita acima. Ainda em outra realização, a invenção provê uma semente transgênica, onde a semente compreende molécula de DNA como descrita acima.

[010] Em outro aspecto, a invenção provê um cassete transgêni- co compreendendo um grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 6, e 8, onde o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição está operacionalmente ligado a uma sequência codificante heteró- loga que está operacionalmente ligada a uma UTR 3’ selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 11, e 13. Em uma realização, o cassete transgene compreende o grupo de elementos de exprtessão reguladora de transcrição apresentado como SEQ ID NO: 1, onde o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição está operacionalmente ligado a uma sequência codificante heteróloga que está operacionalmente ligada à UTR 3’ apresentada como SEQ ID NO: 10. Em outra realização, o cassete transgene compreende o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição apresentado como SEQ ID NO: 6, onde o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição está operacionalmente ligado a uma sequência codifi- cante heteróloga que está operacionalmente ligada a uma UTR 3’ selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 11 e 12. Ainda em outra realização, o cassete transgene compreende o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição apresentado como SEQ ID NO: 8, onde o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição está operacionalmente ligado a uma sequência codificante hete- róloga que está operacionalmente ligada a uma UTR 3’ selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12 e 13. Em outra realização, a invenção provê um processo de produção de um produto de mercadoria compreendendo obtenção de uma planta transgênica ou sua parte compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência com pelo menos cerca de 85 porcento de identidade de sequência com qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; (b) uma sequência compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; (c) um fragmento de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8, onde o fragmento tem atividade reguladora de gene, onde a referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga, e produzindo o produto de mercadoria a partir da mesma. Em uma realização, o produto de mercadoria é concentrado de proteína, isolado de proteína, grão, amido, sementes, farinha, refeição, biomassa, ou óleo de semente.

[011] Em outro aspecto a invenção provê um processo de ex pressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita compreendendo obtenção de uma planta transgênica compreendendo uma sequência de DNA selecionada do grupo consistindo em: (a) uma sequência com pelo menos cerca de 85 porcento de identidade de se- quência para qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, ou 8; (b) uma sequência compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8; e (c) um fragmento de qualquer uma de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8, onde o fragmento tem atividade reguladora de gene, onde a referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga, e cultivo de planta, onde o polinucleotídeo que pode ser transcrito é expresso.

Breve Descrição das Figuras

[012] A Fig. 1 - mostra expressão de beta - glicuronidase (GUS) em tecidos de endosperma e embrião de milho transgênico em desen-volvimento proporcionada por diferentes configurações de cassete de transgene. Cada configuração de cassete transgene é compreendida por sequência codificante de GUS operacionalmente ligada aos grupos de elementos de expressão reguladora de transcrição EXP- Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (SEQ ID NO:6) e EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (SEQ ID NO:8) e as 3' UTRs T-Os.CLUS33428_1-1:1:1 (SEQ ID NO:11), T-Os.Mth-1:1:1 (SEQ ID NO:12), e T-Os.Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO:13), como mostrado na Tabela 3 de Exemplo 3.

[013] A Fig. 2 - mostra expressão de beta - glicuronidase (GUS) em tecidos selecionados de milho transgênico proporcionada através de diferentes configurações de cassete transgene. Cada configuração de cassete transgene é compreendida pela sequência de codificação de GUS operacionalmente ligada aos grupos de elementos de expressão reguladora de transcrição EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (SEQ ID NO:6) e EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (SEQ ID NO:8), e as 3' UTRs T- Os.CLUS33428_1-1:1:1 (SEQ ID NO:11), T-Os.Mth-1:1:1 (SEQ ID NO:12), e T-Os.Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO:13), como mostrado na Tabela 3 de Exemplo 3.

Breve Descrição das Sequências

[014] SEQ ID NO: 1 - sequência de um grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição ou EXP, EXP- Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1, compreendido por promotor, P-Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO: 3), que está operacionalmente ligado 5’ ao líder, L- Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4), que está operacionalmente ligado ao intron, I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 5).

[015] SEQ ID NO: 2 - sequência do promotor, P-Zm.Nac-1:1:2.

[016] SEQ ID NO: 3 - sequência compreendendo o promotor, P- Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO:2), que é operacionalmente ligado em 5’ ao líder, L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO:4).

[017] SEQ ID NO: 4 - sequência do líder, L-Zm.Nac-1:1:1.

[018] SEQ ID NO: 5 - sequência do intron, I-Zm.DnaK-1:1:1.

[019] SEQ ID NO: 6 - sequência de um grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição ou EXP, EXP- Zm.Nac+Os.FBA:1:1, que é compreendido por promotor, P-Zm.Nac- 1:1:2 (SEQ ID NO: 2), que está operacionalmente ligado 5’ ao líder, L- Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4), que está operacionalmente ligado ao intron, I-Os.FBA-1-1:1:1 (SEQ ID NO: 7).

[020] SEQ ID NO: 7 - sequência do intron, I-Os.FBA-1-1:1:1.

[021] SEQ ID NO: 8 - sequência de um grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição ou EXP, EXP-Zm.Nac+Os.Cab- 1:1:1, que é compreendido pelo promotor, P-Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO: 2), que está operacionalmente ligado 5’ ao lidero, L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4), que está operacionalmente ligado ao intron, I-Os.Cab- 1-1:1:1 (SEQ ID NO: 9).

[022] SEQ ID NO: 9 - sequência do intron , I-Os.FBA-1-1:1:1.

[023] SEQ ID NO: 10 - sequência de UTR 3’, T-AGRtu.nos- 1:1:13.

[024] SEQ ID NO: 11 - sequência da UTR 3’, T- Os.CLUS33428_1-1:1:1.

[025] SEQ ID NO: 12 - sequência da UTR 3’, T-Os.Mth-1:1:1.

[026] SEQ ID NO: 13 - sequência da UTR 3’, T-Os.Ara5-1:1:1.

[027] SEQ ID NO; 14 - sequência codificante do gene marcador beta-glicuronidase.

[028] SEQ ID NO: 15 - sequência de um grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição ou EXP, EXP-Os.Act1:1:1, com-preendendo o promotor actina 1 de arroz, líder, e intron.

Descrição detalhada da Invenção

[029] A presente invenção provê novas moléculas de polinucleo- tídeo tendo atividade reguladora de gene benéfica a partir de espécies de plantas. A invenção também provê construções de DNA compreendendo os elementos reguladores, assim como células de plantas transgênicas, plantas, e sementes compreendendo os elementos reguladores. As sequências de nucleotídeos destas moléculas de polinu- cleotídeos são providas como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, e 8. O desenho, construção, e uso destas moléculas de polinucleotídeos são providos pela invenção. Estas moléculas de polinucleotídeos são capazes de, por exemplo, afetar a expressão de uma molécula de polinucleotí- deo que pode ser transcrita ligada operacionalmente em tecidos de plantas, e por isso regular seletivamente atividade ou expressão de gene de um produto gene codificado em plantas transgênicas. A presente invenção também provê processos de mascaramento e uso de elementos reguladores, as construções de DNA compreendendo os promotores e/ou outras sequências de nucleotídeos mostradas, e processos para preparação e uso dos mesmos. A invenção também provê células de plantas transgênicas, e sementes compreendendo os elementos reguladores operacionalmente ligados a uma molécula de po- linucleotídeo que pode ser transcrita, assim como células hospedeiras transformadas.

[030] As sequências de DNA de acordo com a presente inven cão podem ser providas ligadas operacionalmente a uma sequência de polinucleotídeo que pode ser transcrita. Em uma realização, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita pode ser heteróloga com relação a uma sequência reguladora aqui provida. Uma sequência de elemento regulador provida pela invenção pode assim, em particulares realizações, ser definida como operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga.

[031] As seguintes definições e processos são providos para me lhor definição de presente invenção e para orientar aqueles versados na técnica na prática da presente invenção. A menos que notado de outro modo, termos são para serem entendidos de acordo com utilização convencional por aqueles versados na técnica relevante. Moléculas de DNA

[032] Como aqui usado, o termo "DNA" ou "molécula de DNA" refere-se a uma molécula de DNA de fita dupla de origem genômica ou sintética, isto é, um polímero de bases desoxirribonucleotídeos ou uma molécula de polinucleotídeo, lida a partir da extremidade 5’ (à montante) para a extremidade 3’ (jusante). Como aqui usado, o termo "sequência de DNA" refere-se à sequência de nucleotídeos de uma molécula de DNA. A nomenclatura aqui usada corresponde àquela de Title 37 of the United States Code of Federal Regulations § 1,822, e mostrada nas tabelas em WIPO Standard ST,25 (1998), Appendix 2, Tables 1 e 3.

[033] Como aqui usado, o termo "molécula de DNA isolada" refe re-se a uma molécula de DNA separada pelo menos parcialmente de outras moléculas normalmente associadas com a mesma em seu estado nativo ou natural. Em uma realização, o termo "isolada" refere-se a uma molécula de DNA que está pelo menos parcialmente separada de alguns dos ácidos nucléicos que normalmente flanqueiam a molécula de DNA em seu estado nativo ou natural. Assim, moléculas de DNA fundidas a sequências reguladoras ou codificantes com as quais elas não são normalmente associadas, por exemplo, como o resultado de técnicas recvombi nantes, são aqui consideradas isoladas. Tais moléculas são consideradas isoladas quando integradas no cromossoma de uma célula hospedeira ou presentes em uma solução de ácido nucléico com outras moléculas de DNA, em que elas não estão em seu estado nativo.

[034] Qualquer número de processos bem conhecidos por aque les versados na técnica pode ser usado para isolar e manipular uma molécula de DNA, ou seu fragmento, como mostrado na presente invenção. Por exemplo, tecnologia de reação de cadeia polimerase (PCR) pode ser usada para amplificar uma particular molécula de DNA de partida e/ou para produzir variantes da molécula original. Moléculas de DNA, ou seus fragmentos, também podem ser obtidas através de outras técnicas, tal como através de síntese direta de fragmento por meios químicos, como é comumente praticado através de uso de um sintetizador de oligonucleotídeo automático.

[035] Como aqui usado, o termo "identidade de sequência" refe re-se à extensão na qual duas sequências de polinucleotídeos otimamente alinhadas ou duas sequências de polipeptídeos otimamente alinhadas são idênticas. Um ótimo alinhamento de sequências é criado através de alinhamento manual de duas sequências, por exemplo, uma sequência referência e uma outra sequência, para maximizar o número de emparelhamentos no alinhamento de sequências com apropriadas inserções, supressões, ou folgas de nucleotídeos internos. Como aqui usado, o termo "sequência referência" refere-se a uma sequência provida como as sequências de polinucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, e 8.

[036] Como aqui usado, o termo "porcentagem de identidade de sequências" ou "porcentagem de identidade" ou "% de identidade" é a fração de identidade multiplicada por 100. A "fração de identidade" pa ra uma sequência otimamente alinhada com uma sequência referência é o número de emparelhamentos de nucleotídeos no alinhamento ótimo, dividido pelo número total de nucleotídeos na sequência referência, por exemplo, o número total de nucleotídeos no inteiro comprimento da sequência referência. Assim, em uma realização, a invenção provê uma molécula de DNA compreendendo uma sequência que, quando otimamente alinhada a uma sequência referência, aqui provida como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, e 8, tem pelo menos 85 porcento de identidade, pelo menos cerca de 90 porcento de identidade, pelo menos cerca de 95 porcento de identidade, pelo menos cerca de 96 porcento de identidade, pelo menos cerca de 97 porcento de identidade, pelo menos cerca de 98 porcento de identidade , ou pelo menos cerca de 99 porcento de identidade ára a sequência referência. Em particulares realizações, tais sequências podem ser definidas como tendo atividade reguladora de gene. Elementos Reguladores

[037] Um elemento regulador é uma molécula de DNA tendo ati vidade reguladora de gene, isto é, uma que tem a habilidade para afetar a transcrição e/ou tradução de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada operacionalmente. O termo "atividade reguladora de gene" assim refere-se à habilidade para afetar o padrão de expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada afetando a transcrição e/ou tradução daquela molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada operacionalmente. Como aqui usado, um grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição (EXP) pode ser compreendido por elementos de expressão, tais como aperfeiçoadores, promotores, líderes, e introns, ligados operacionalmente. Assim, um grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição pode ser compreendido, por exemplo, por um promotor ligado operacionalmente 5’ a uma sequên- cia líder, que por sua vez está operacionalmente ligada 5’ a uma sequência intron. A sequência intron pode ser compreendida por uma sequência começando no ponto da primeira junção de ligação de in- tron/exon da sequência nativa e ainda pode ser compreendida por um fragmento líder pequeno compreendendo a segunda junção de emenda de intron/exon de modo a prover próprio processamento de in- tron/exon para facilitar transcrição e próprio processamento do resultante transcrito. Líderes e introns podem afetar positivamente transcrição de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada assim como tradução do resultante RNA transcrito. A molécula de RNA pré-processada compreende líderes e introns, que podem afetar o processamento pós-transcricional do RNA transcrito e/ou a exportação da molécula de RNA transcrito a partir do núcleo da célula no citoplasma. Seguindo processamento pós-transcricional da molécula de RNA transcrito, a sequência líder pode ser retida como parte do RNA mensageiro final e pode afetar positivamente a tradução da molécula de RNA mensageiro.

[038] Elementos reguladores tais como promotores, líderes, in trons, e regiões de término de transcrição são moléculas de DNA que têm atividade reguladora de gene e desempenham uma parte integral na expressão total de genes em células vivas. O termo "elemento regulador" refere-se a uma molécula de DNA tendo atividade reguladora de gene, isto é, uma que tem a habilidade para afetar a transcrição e/ou tradução de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada operacionalmente. Elementos reguladores isolados, tais como promotores e líderes, que funcionam em plantas são por isso úteis para modificação de fenótipos de plantas através de processos de engenharia genética.

[039] Elementos reguladores podem ser caracterizados por seus efeitos de padrão de expressão (qualitativa e/ou quantitativamente), por exemplo, efeitos positivos ou negativos e/ou constitutivos ou outros, tais como através de seu padrão de expressão temporal, espacial, desenvolvimental, tecido, ambiental, fisiológico, patológico, ciclo de célula, e/ou quimicamente responsivo, e qualquer combinação dos mesmos, assim como através de indicações quantitativas ou qualitativas. Um promotor pode ser útil como um elemento regulador para mo-dulação de expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada operacionalmente. Como aqui usado, um "padrão de expressão de gene" é qualquer padrão de transcrição de uma molécula de DNA ligada operacionalmente em uma molécula de RNA transcrita. A molécula de RNA transcrita pode ser traduzida para produzir uma molécula de proteína ou pode prover uma molécula de RNA antissentido ou outra reguladora, tal como mRNA, um dsRNA, um tRNA, um rRNA, um miRNA e semelhantes.

[040] Como aqui usado, o termo "expressão de proteína" é qual quer padrão de tradução de uma molécula de RNA transcrita em uma molécula de proteína. Expressão de proteína pode ser caracterizada por suas qualidades temporais, espaciais, desenvolvimentais ou morfológicas, assim como através de indicações quantitativas ou qualitativas. Como aqui usado, o termo "promotor" refere-se genericamente a uma molécula de DNA que está envolvida em reconhecimento e ligação de RNA polimerase II e outras proteínas (fatores de transcrição trans-atuantes) para início de transcrição. Um promotor pode ser inicialmente isolado a partir da região não traduzida 5’ (5’ UTR) de uma cópia genômica de um gene. Alternativamente, promotores podem ser moléculas de DNA produzidas ou manipuladas sinteticamente. Promotores também podem ser quiméricos, isto é, um promotor produzido através de fusão de duas ou mais moléculas de DNA heterólogas. Um promotor útil na prática da presente invenção pode incluir SEQ ID NO: 3, ou seus fragmentos ou variantes. Em específicas realizações da in- venção, tais moléculas e quaisquer suas variantes ou derivados como aqui descritos são ainda definidos como compreendendo atividade promotora, isto é, são capazes de atuar como um promotor em uma célula hospedeira, tal como em uma planta transgênica. Ainda em outras realizações específicas, um fragmento pode ser definido como exibindo atividade promotora possuída pela molécula promotora de partida da qual ele é derivado, ou um fragmento pode compreender um "promotor mínimo" que provê um nível basal de transcrição e é compreendido por uma caixa TATA ou sequência equivalente para reconhecimento e ligação do complexo RNA polimerase II para início de transcrição.

[041] Em uma realização, a invenção provê fragmentos de uma sequência promotora como aqui mostrada. Fragmentos promotores podem compreender atividade promotora como descrito acima, e podem ser úteis sozinhos ou em combinação com outros promotores e fragmentos de promotores, tal como em construção de promotores quiméricos. Em específicas realizações, fragmentos de um promotor são providos compreendendo pelo menos cerca de 50, 95, 150, 250, 500, 750, ou pelo menos cerca de 1000 nucleotídeos contíguos, ou maiores, de uma molécula de polinucleotídeo tendo atividade promotora aqui mostrada.

[042] Composições derivadas do promotor apresentado como SEQ ID NO: 3, tais como supressões 5’ ou internas, por exemplo, podem ser produzidas usando processos conhecidos na técnica para aperfeiçoar ou alterar expressão, incluindo através de remoção de elementos para ter efeitos positivos ou negativos sobre expressão; duplicação de elementos para ter efeitos positivos ou negativos sobre expressão; e/ou duplicação ou remoção de elementos para ter efeitos específicos de tecido ou célula sobre expressão. Composições derivadas do promotor apresentado como SEQ ID NO: 3, compreendida por supressões 3’ onde o elemento caixa TATA ou sua sequência equivalente e sequência à jusante é removida pode ser usada, por exemplo, para obter elementos aperfeiçoadores. Ainda supressões podem ser feitas para remoção de quaisquer elementos que tenham efeitos positivos ou negativos; específicos de tecido; específico de célula; ou específicos de tempo (tais como, mas não limitado a, ritmos circadianos) sobre expressão. O promotor apresentado como SEQ ID NO: 3 e fragmentos ou aperfeiçoadores derivados do mesmo podem ser usados para obtenção de composições de elemento regulador transcricional quimérico compreendidas pelo promotor apresentado como SEQ ID NO: 3 e os fragmentos ou aperfeiçoadores derivados dali a partir de operacionalmente ligados a outros aperfeiçoadores e promotores. A eficácia das modificações, duplicações ou supressões aqui descritas sobre os desejados aspectos de expressão de um particular transgene pode ser testada empiricamente em ensaios de planta estáveis e transientes, tais como aqueles descritos nos presentes exemplos de trabalho, de modo a validar os resultados, que podem variar dependendo de mudanças feitas e o objetivo da mudança na molécula de partida.

[043] Como aqui usado, o termo "líder" refere-se a uma molécula de DNA isolada da região 5’ não traduzida (5’ UTR) de uma cópia ge- nômica de um gene r genericamente definida como um segmento de nucleotídeo entre o sítio de início de transcrição (TSS) e o sítio de início de sequência codificando proteína. Alternativamente, líderes podem ser elementos DNA manipulados ou produzidos sinteticamente. Um líder pode ser usado como um elemento regulador 5’ para modulação de expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita ligada operacionalmente. Moléculas líderes podem ser usadas com um promotor heterólogo ou com seu promotor nativo. Moléculas promotoras da presente invenção assim podem ser operacionalmente ligadas a seu líder nativo ou podem ser operacionalmente liga- das a um líder heterólogo. Um líder útil na prática da presente invenção é apresentado como SEQ ID NO: 4 ou seus fragmentos ou variantes. Em específicas realizações, tais sequências podem ser providas definidas como sendo capazes de atuar como um líder em uma célula hospedeira, incluindo, por exemplo, uma célula de planta transgênica. Em uma realização, tais sequências são decodificadas como compreendendo atividade líder.

[044] A sequência líder (5’ UTR) apresentada como SEQ ID NO: 4 pode ser compreendida por elementos reguladores ou pode adotar estruturas secundárias que podem ter um efeito sobre transcrição ou tradução de um transgene. Esta sequência líder pode ser usada de acordo com a presente invenção para obtenção de elementos reguladores quiméricos que afetam transcrição ou tradução de um transgene. Em adição, a sequência líder apresentada como SEQ ID NO: 4 pode ser usada para obtenção de sequências líderes quiméricas que afetam transcrição ou tradução de um transgene.

[045] A introdução de um gene estranho em um hospedeiro plan ta novo nem sempre resulta em alta expressão do gene que está entrando. Além disso, se lidando com características complexas, algumas vezes é necessário modular vários genes com padrão de expressão espacial ou temporariamente diferente. Introns podem principalmente prover tal modulação. Entretanto, múltiplos usos do mesmo intron em uma planta foram mostrados exibirem desvantagens. Naqueles casos, é necessário ter uma coleção de elementos controles básicos para a construção de apropriados eles DNA recombinantes. O número de introns conhecidos na técnica tendo propriedades de aperfeiçoamento de expressão é limitado, e assim, alternativas são necessárias.

[046] Composições derivadas de qualquer um dos introns apre sentados como SEQ ID NOs: 5, 7, e 9 podem ser compreendidas por supressões internas ou duplicações de elementos reguladores cis. Adicionalmente, alterações das sequências 5’ e 3’ compreendendo as junções de emenda de íntron/exon podem ser usadas para aperfeiçoar expressão ou especificidade de expressão quando operacionalmente ligadas a um promotor + líder ou promotor quimérico + líder e sequência codificante. Alterações nas regiões 5’ e 3’ compreendendo a junção de emenda de intron/exon também podem ser feitas para reduzir o potencial para introdução de início falso e códon de interrupção produzidos no resultante transcrito após processamento e emenda do RNA mensageiro. Os introns podem ser testados empiricamente como descrito nos exemplos de trabalho para determinar o efeito de intron sobre expressão de um transgene.

[047] De acordo com a presente invenção, um promotor ou frag mento de promotor pode ser analisado para a presença de elementos promotores conhecidos, isto é, características de sequência de DNA, como caixa TAT e outros motivos de sítio de ligação de fator de transcrição conhecidos. Identificação de tais elementos promotores conhecidos pode ser usada por aqueles versados na técnica para desenho de variantes de um promotor tendo um padrão de expressão similar ao promotor original.

[048] Como aqui usado, o termo "aperfeiçoador" ou "elemento aperfeiçoador" refere-se a um elemento reguldor de transcrição atuan- do-cis (um elemento cis), que confere um aspecto do padrão de expressão total, mas é usualmente insuficiente sozinho para acionar transcrição de uma sequência de polinucleotídeo ligada operacionalmente. Diferente de promotores, elementos aperfeiçoadores usualmente não incluem um sítio de partida de transcrição (TSS), ou caixa TAT ou sequência equivalente. Um promotor pode compreender naturalmente um ou mais elementos aperfeiçoadores que afetam a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos ligada operacionalmente. Um elemento aperfeiçoador isolado também pode ser fundido a um promotor para produzir elemento-cis promotor quimérico, que confere um aspecto da modulação total de expressão de gene. Um promotor ou fragmento de promotor pode compreender um ou mais elementos aperfeiçoadores que afetam a transcrição de genes operacionalmente ligados. Muitos elementos aperfeiçoadores promotores são acreditados ligarem proteínas de ligação de DNA e/ou afetarem topologia de DNA, produzindo conformações locais que permitem ou restringem seletivamente acesso de RNA polimerase ao molde DNA, ou que facilitam abertura seletiva da hélice dupla no sítio de iniciação de transcrição. Um elemento aperfeiçoador pode funcionar para ligar fatores de transcrição que regulam transcrição. Alguns elementos aperfeiçoado- res ligam mais de um fator de transcrição, e fatores de transcrição podem interagir com diferentes afinidades com mais de um domínio de aperfeiçoador. Elementos aperfeiçoadores podem ser identificados através de um número de técnicas, incluindo análise de supressão, isto é, supressão de um ou mais nucleotídeos a partir da extremidade 5’ ou interna para um promotor, análise de proteína de ligação de DNA usando pegada de DNase I, interferência de metilação, ensaios de desvio - mobilidade de eletroforese, pegada genômica in vivo através de PCR mediada por ligação, e outros ensaios convencionais; ou através de análise de similaridade de sequência de DNA usando conhecidos motivos de elemento-cis ou elementos aperfeiçoadores como uma sequência alvo ou motivo alvo com convencionais processos de comparação de sequência de DNA, tal como BLAST. A estrutura fina de um domínio aperfeiçoador ainda pode ser estudada através de muta- gênese (ou substituição) de um ou mais nucleotídeos ou através de outros processos convencionais. Elementos aperfeiçoadores podem ser obtidos através de síntese química ou através de isolamento a partir de elementos reguladores que incluem tais elementos, e eles po- dem ser sintetizados com adicionais nucleotídeos flanqueando que contêm sítios de enzima de restrição úteis para facilitar subsequente manipulação. Assim, o desenho, construção, e uso de elementos aper- feiçoadores de acordo com os processos aqui mostrados para modulação de expressão de moléculas de polinucleotídeos que podem ser transcritas ligadas operacionalmente são abrangidos pela presente invenção.

[049] Em plantas, a inclusão de alguns introns em construções de genes conduz a aumentada acumulação de proteína e mRNA em relação a construções carecendo de intron. Este efeito foi chamado "aper- feiçoamnto mediado por intron" (IME) de expressão de gene (Masca- renhas et al., (1990) Plant Mol. Biol. 15:913-920). Introns conhecidos estimularem expressão em plantas foram identificados em genes de milho [por exemplo, tubA1, Adh1, Sh1, Ubi1 (Jeon et al., Plant Physio. 123:1005-1014, 2000; Callis et al., Genes Dev. 1:1183-1200, 1987; Vasil et al., Plant Physiol. 91:1575-1579, 1989; Christiansen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689, 1992) and in rice genes (e.g., salt, tpi: McElroy et al., Plant Cell 2:163-171, 1990; Xu et al., Plant Physiol. 106:459-467, 1994). Similarmente, introns de genes de plantas dicoti- ledôneas tais como petúnia (por exemplo, rbcS), batata (por exemplo, st-ls1) e Arabidopsis thaliana (por exemplo, ubq3 e pat1) foram verificados elevarem taxas de expressão de gene (Dean et al., Plant Cell 1:201-208, 1989; Leon et al., Plant Physiol. 95:968-972, 1991; Norris et al., Plant Mol Biol 21:895-906, 1993; Rose and Last, Plant J. 11:455464, 1997). Foi mostrado que supressões ou mutações dentro de sítios de emenda de um intron reduzem expressão de gene, indicando que emenda pode ser necessária para IME (Mascarenhas et al., Plant Mol Biol., 15:913-920, 1990; Clancy and Hannah, Plant Physiol. 130:918-929, 2002). Entretanto, tal emenda não é requerida para um certo IME em plantas dicotiledôneas, como mostrado por mutações de ponto dentro de sítios de emenda do gene pat1 de A.thaliana (Rose and Beliakoff, Plant Physiol. 122:535-542, 2000).

[050] Aperfeiçoamento de expressão de gene por introns não é um fenômeno genérico porque algumas inserções de introns em cassetes de expressão recombinantes falham para aperfeiçoar expressão (por exemplo, introns de genes de dicot tal como gene rbcS de ervilha, o gene faseolina de feijão, e o gene stls-1 de Solanum tuberosum) e introns de genes de milho (o nono intron do gene adh1, e o primeiro intron do gene hsp81) (Chee et al., Gene 41:47-57, 1986; Kuhlmeier et al., Mol gen Genet 212:405-411, 1988; Mascarenhas et al., Plant Mol Biol. 15:913-920, 1990; Sinibaldi and Mettler, In EW Cohn, K Moldave, eds., Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology, Vol 42, Academic Press, New York, pp 229-257, 1992; Vancanneyt et al., Mol. Gen. Genet. 220:245-250, 1990). Por isso, nem todo intron pode ser empregado para manipular o nível de expressão de gene de genes não endógenos ou genes endógenos em plantas transgênicas. Que características ou específicas características de sequências têm de estar presentes em uma sequência de intron de modo a aperfeiçoar a taxa de expressão de um dado gene não são conhecidas na técnica anterior, e por isso não é possível prever se um dado intron de planta, quando usado heterologamente causará IME.

[051] Como aqui usado, o termo "quimérico" refere-se a uma mo lécula de DNA simples produzida por fusão de uma primeira molécula de DNA a uma segunda molécula de DNA, onde nem a primeira nem a segunda molécula de DNA pode normalmente ser encontrada naquela configuração, isto é, fundida à outra. A molécula de DNA quimérica é assim uma nova molécula de DNA de outro modo normalmente não encontrada em natureza. Como aqui usado, o termo "promotor quimérico" refere-se a um promotor produzido através de tal manipulação de moléculas de DNA. Um promotor quimérico pode combinar dois ou mais fragmentos de DNA, por exemplo, a fusão de um promotor a um elemento aperfeiçoador. Assim, o desenho, construção, e uso de promotores quiméricos de acordo com os processos aqui mostrados para modulação de expressão de moléculas de polinucleotídeos que podem ser transcritas ligadas operacionalmente são abrangidos pela presente invenção.

[052] Como aqui usado, o termo "variante" refere-se a uma se gunda molécula de DNA que é similar em composição, mas não idêntica a, uma primeira molécula de DNA, e ainda a segunda molécula de DNA ainda mantém a funcionalidade genérica, isto é, o mesmo ou similar padrão de expressão, da primeira molécula de DNA. Uma variante pode ser uma versão mais curta ou truncada da primeira molécula de DNA e/ou uma versão alterada da sequência da primeira molécula de DNA, tal como uma com diferentes sítios de enzima de restrição e/ou supressões internas, substituições, e/ou inserções. Uma "variante" também pode abranger um elemento regulador tendo uma sequência de nucleotídeos compreendendo uma substituição, supressão, e/ou inserção de um ou mais nucleotídeos de uma sequência referência, onde o elemento regulador derivado tem mais ou menos ou equivalente atividade transcricional ou traducional que a correspondente molé-cula reguladora parente. As "variantes" de elemento regulador também abrangerão variantes surgindo de mutações que ocorrem naturalmente em transformação de célula de planta e bactérias. Na presente invenção, uma sequência de polinucleotídeos provida como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, e 8 pode ser usada para criar variantes que são similares em composição, mas não idêntica à sequência de polinucleotídeo do elemento regulador original, enquanto ainda mantendo a funcionalidade genérica, isto é, o mesmo ou similar padrão de expressão, do elemento regulador original. Produção de tais variantes da presente invenção está bem dentro do conhecimento comum da técnica à luz da exposi- ção e é abrangida no escopo da presente invenção. "Variantes" de elemento regulador quimérico compreendem os mesmos elementos constituintes como uma sequência referência, mas os elementos constituintes compreendendo o elemento regulador quiméricopodem ser operativamente ligados através de vários processos conhecidos na técnica, tais como digestão com enzima de restrição e ligação, clonagem independente de ligação, montagem modular de produtos de PCR durante amplificação, ou síntese química direta do elemento regulador, assim como outros processos conhecidos na técnica. A resultante "variante" de elemento regulador quimérico pode ser compreendida pelos mesmos, ou variantes dos mesmos, elementos constituintes da sequência referência mas difere na sequência ou sequências que compreendem a sequência de ligação ou sequências que permitem as partes constituintes serem operativamente ligadas. Na presente invenção, uma sequência de polinucleotídeos provida como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, ou 8 provê uma sequência referência onde os elementos constituintes que compreendem a sequência referência podem ser ligados por processos conhecidos na técnica e podem compreender substituições, supressões, e/ou inserções de um ou mais nucleotídeos ou mutações que ocorrem naturalmente em transformação de célula bacteriana ou de planta. Construções

[053] Como aqui usado, o termo "construção" significa qualquer molécula de polinucleotídeo recombinante tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, molécula de polinucleotídeo replicando autonomamente, fago, ou molécula de polinucleotídeo RNA ou DNA de fita simples ou fita dupla linear ou circular, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de polinucleotídeo, onde uma ou mais molécula de poli- nucleotídeos foram ligadas em uma maneira funcionalmente operativa, isto é, ligadas operativamente. Como aqui usado, o termo "vetor" significa qualquer construção de polinucleotídeo recombinante que pode ser usada para o propósito de transformação, isto é, a introdução de DNA heterólogo em uma célula hospedeira. Um vetor de acordo com a presente invenção pode incluir um cassete de expressão ou cassete transgene isolado a partir de qualquer uma das moléculas mencionadas anteriormente. Cassetes de expressão ou cassetes transgene úteis na prática da invenção são compreendidos por grupos de elementos de expressão reguladora de transcrição ("EXPs") apresentados como SEQ ID NOs: 1, 6, ou 8 ligados operacionalmente a uma sequência codificante heteróloga, que está operacionalmente ligada às UTRs 3’ apresentadas como SEQ ID NOs: 10, 11, 12, ou 13.

[054] Como aqui usado, o termo "ligado operacionalmente" refe re-se a uma primeira molécula ligada a uma segunda molécula, onde as moléculas são arranjadas de modo que a primeira molécula afeta a função da segunda molécula. As duas moléculas podem ou não ser parte de uma molécula contígua única e podem ou não ser adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita se o promotor modula transcrição da molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita de interesse em uma célula. Um líder, por exemplo, está operacionalmente ligado a sequência codificante quando ele é capaz de servir como um líder para o polipeptídeo codificado pela sequência codificante.

[055] Construções da presente invenção podem ser providas, em uma realização, como construções de DNA de borda de plasmídeo Ti duplo que têm regiões de borda direita (RB ou AGRtu.RB) e borda esquerda (LB ou AGRtu.LB) do plasmídeo Ti isolado de Agrobacterium tumefaciens compreendendo um T-DNA, que junto com moléculas de transferência providas pelas células de A. tumefaciens permitem a integração do T-DNA no genoma de uma célula de planta (ver, por exemplo, patente U.S. 6 603 061). As construções também podem conter os segmentos de DNA de cadeia principal de plasmídeo que provêm função de replicação e seleção de antibiótico nas células bac- terianas, por exemplo, uma origem de replicação de Escherichia coli tal como ori322, uma origem de replicação de ampla faixa de hospedeiro tal como oriV ou oriRi, e uma região codificante para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica uma Tn7 aminoglico- sídeo adenil transferase (aadA) conferindo resistência para um gene marcador selecionável spectinomicina ou streptomicina, ou uma gen- tamicina (Gm, Gent). Para transformação de planta, a linhagem bacte- riana hospedeira é frequentemente A. tumefaciens ABI, C58, ou LBA4404; entretanto, outras linhagens conhecidas por aqueles versados na técnica de transformação de planta podem funcionar na presente invenção.

[056] Processos são conhecidos na técnica para montagem e introdução de construções em uma célula em uma maneira tal que a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita seja transcrita em uma molécula de mRNA funcional que é traduzida e expressa como um produto proteína. Para a prática da presente invenção, composições e processos convencionais para preparação e uso de construções e células hospedeiras são bem conhecidos por aqueles versados na técnica (ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes 1, 2 and 3, J. Sambrook, D.W. Russell, e N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000). Processos para fabricação de vetores recombinantes particularmente apropriados para trans-formação de planta incluem, sem limitação, aqueles descritos nas patentes U.S. 4 971 908; 4 940 835; 4 769 061; e 4 757 011 em suas totalidades. Estes tipos de vetores também foram revistos na literatura científica (ver, por exemplo, Rodriguez, et al., Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, 1988; e Glick et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton, FL., 1993). Típicos vetores úteis para expressão de ácidos nucléicos em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo (Ti) de indução de tumor de A. tumefaciens (Rogers et al., Methods in Enzymology 153:253-277, 1987). Outros vetores recombinantes úteis para transformação de planta, incluindo o vetor controle de transferência pCaMVCN, também foram descritos na literatura científica (ver, por exemplo, Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-5828, 1985).

[057] Vários elementos reguladores podem ser incluídos em uma construção incluindo qualquer um daqueles aqui providos. Quaisquer tais elementos reguladores podem ser providos em combinação com outros elementos reguladores. Tais combinações podem ser designadas ou modificadas para produção de desejáveis características reguladoras. Em uma realização, construções da presente invenção compreendem pelo menos um elemento regulador ligado operacionalmente a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita operacionalmente ligada a uma molécula de término de transcrição 3’.

[058] Construções da presente invenção podem incluir qualquer promotor ou lidero aqui provido ou conhecido na técnica. Por exemplo, um promotor da presente invenção pode ser operacionalmente ligado a um líder 5’ não traduzido heterólogo tal como um derivado de um gene de proteína de choque térmico (ver, por exemplo, patentes U.S. Nos. 5 659 122 e 5 362 865). Alternativamente, um líder da presente invenção pode ser operacionalmente ligado a um promotor heterólogo tal como o promotor transcrito 35S de vírus mosaico de couve-flor (CaMV) (ver, patente US 5 352 605).

[059] Como aqui usado, o termo "intron" refere-se a uma molécu la e DNA que pode ser isolada ou identificada a partir da cópia genô- mica de um gene e pode ser genericamente definida como um região emendada durante processamento de mRNA antes de tradução. Alternativamente, um intron pode ser um elemento DNA sinteticamente produzido ou manipulado. Um intron pode conter elementos aperfeiço- adores que afetam a transcrição de genes ligados operacionalmente. Um intron pode ser usado como um elemento regulador para modulação de expressão de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita, ligada operacionalmente. Uma construção de DNA pode compreender um intron, e o intron pode ou não ser heterólogo com relação à sequência de molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita. Exemplos de introns na técnica incluem o intron actina de arroz (patente U.S. No. 5 641 876) e o intron HSP70 de milho (patente U.S. 5 859 347). Introns úteis na prática da presente invenção incluem SEQ ID NOs: 5, 7, e 9. Ainda, quando modificando sequências de limite de intron/exon, pode ser preferível evitar o uso de sequência de nu- cleotídeos AT ou o nucleotídeo A justo antes da extremidade 5’ do sítio de remoção (GT) e o nucleotídeo G ou a sequência de nucleotídeos TG, respectivamente, imediatamente após extremidade 3’ do sítio de remoção (AG) para eliminar o potencial de indesejados códons de par-tida formados durante processamento do RNA mensageiro no transcrito final. A sequência ao redor de sítios de junção de remoção de extremidade 5’ ou 3’ do intron pode ser assim modificado desta maneira.

[060] Como aqui usado, o termo "molécula de término de trans crição 3’" "3’ UTR" refere-se a uma molécula de DNA que é usada durante transcrição para produzir a região não traduzida 3’ (3’ UTR) de uma molécula de ARNm. A região não traduzida 3’ de uma molécula de RNAm pode ser gerada através de específica clivagem e poliadeni- lação 3’ (cauda poliA). Uma UTR 3’ pode ser operacionalmente ligada a, e localizada à jusante de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita e pode incluir polinucleotídeos que provêm um sinal de poliadenilação e outros sinais reguladores capazes de afetar transcrição, processamento de ARNm, ou expressão de gene. Caudas poliA são pensadas funcionarem em estabilidade de ARNm e em iniciação de tradução. Exemplos de moléculas de término de transcrição 3’ na técnica são a região 3’ de nopalina sintase (ver, Fraley, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803-4807, 1983); região 3’ de hsp17 de trigo; região 3’ de subunidade pequena de rubisco de ervilha; região 3’ de E6 de algodão (patente U.S. 6 096 950); regiões 3’ mostradas em WO/0011200 A2; e a UTR 3’ de coixina (patente U.S. 6 635 806).

[061] UTRs 3’ tipicamente encontram uso benéfico para a ex pressão recombinante de genes específicos. Em sistemas animais, maquinaria de UTRs 3’ foi bem definida (por exemplo, Zhao et al., Microbiol Mol Biol Ver 63:405-445, 1999; Proudfoot, Nature 322:562-565, 1986; Kim et al., Biotechnology Progress 19:1620-1622, 2003; Yonaha and Proudfoot, EMBO J. 19:3770-3777, 2000; Cramer et al., FEBS Letters 498:179-182, 2001; Kuerstem and Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637, 2003). Terminação efetiva de transcrição de RNA é requerida para evitar indesejada transcrição de sequências não relacionadas com características (jusante), o que pode interferir com desempenho de característica. Arranjo de múltiplos cassetes de expressão de gene em proximidade local de um para outro (por exemplo, dentro de um T-DNA) pode causar supressão de expressão de gene de um ou mais genes na referida construção em comparação a inserções independentes (Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334, 2001). Isto pode interferir com obtenção de adequados níveis de expressão, por exemplo, em casos onde forte expressão de gene a partir de todos os cassetes é desejada.

[062] Em plantas, sequências sinais de poliadenilação claramen te definidas não são conhecidas. Hasegawa et al. (Plant J. 33:10631072, 2003) não foram capazes de identificar sequências sinais de po- liadenilação conservadas em ambos sistemas in vitro e in vivo em Ni- cotiana sylvestris e determinar o real comprimento do transcrito primário (não poliadenilado). Uma UTR 3’ fraca pode gerar leitura - através, o que pode afetar a expressão dos genes localizados em cassetes de expressão vizinhos (Padidam and Cao, BioTechniques 31:328-334, 2001). Apropriado controle de término de transcrição pode prevenir leitura - através em sequências (por exemplo, outros cassetes de expressão) localizadas a jusante e ainda pode permitir eficiente reciclagem de RNA polimerase, para aperfeiçoar expressão de gene. Eficiente terminação de transcrição (liberação de RNA Polimerase II a partir de DNA) é pré-requisito para reinício de transcrição e pelo que afeta diretamente o nível total de transcrito. Subsequente ao término de transcrição, o ARNm maduro é liberado do sítio de síntese e molde para o citoplasma. mRNAs eucarióticos são acumulados como formas poli(A) in vivo, tornando difícil detectar sítios de terminação transcricio- nal através de processos convencionais. Entretanto, previsão de UTRs 3’ funcionais e eficientes através de processos de bioinformática é difícil em que não existem sequências conservadas para permitir fácil previsão de uma UTR 3’ efetiva.

[063] A partir de um ponto de vista prático, pode ser benéfico que uma UTR 3’ usada em um cassete transgene possua certas características. Por exemplo, uma UTR 3’ útil de acordo com a presente invenção pode eficiente e efetivamente terminar transcrição do transgene e evitar leitura - através do transcrito em qualquer sequência de DNA vizinha, que pode ser compreendida por um outro cassete transgene, como no caso de cassetes múltiplos residindo em um T-DNA, ou o DNA cromossômico vizinho no qual o T-DNA foi inserido. A UTR 3’otimamente não deve causar uma redução na atividade transcricio- nal proporcionada pelo promotor, líder, e introns que são usados para dirigir expressão do transgene. Em biotecnologia de planta, a UTR 3’ é frequentemente usada para iniciação de reações de amplificação de RNA transcrito reverso extraído da planta transformada e pode ser usada para (1) avaliar a atividade transcricional ou expressão da cassete transgene uma vez integrado no cromossoma de planta; (2) avaliar o número de cópias de inserções dentro de DNA de planta; e (3) avaliar zigosidade da resultante semente após geração. A UTR 3’ também pode ser usada em reações de amplificação de DNA extraído da planta transformada para caracterizar a natureza intacta do cassete inserido.

[064] UTRs 3’ úteis em provimento de expressão de um transge ne em plantas podem ser identificadas baseadas na expressão de etiquetas de sequência expressa (ESTs) em bibliotecas de cDNA fabricadas de RNA mensageiro isolado de semente, flor, ou quaisquer outros tecidos derivados de, por exemplo, Big bluestem (Andropogon ge- rardii), Plume Grass [Saccharum ravennae (Erianthus ravennae)], Green bristlegrass (Setaria viridis), Teosinte (Zea mays subsp. mexicana), Foxtail millet (Setaria italica), ou Coix (Coix lacryma-jobi). Usando processos conhecidos por aqueles versados na técnica, bibliotecas de cDNA podem ser fabricadas a partir de tecidos isolados de espécies de plantas usando tecido de flor, semente, folha, raiz, ou outros tecidos de planta. Os resultantes cDNAs são sequenciados usando vários processos de sequenciamento conhecidos na técnica. As resul-tantes ESTs são montadas em cachos usando software de bioinformá- ticatal como clc_ref_assemble_complete versão 2,01,37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142). Abundância de transcrito de cada cacho é determinada por contagem de número de leituras de cDNA para cada cacho. As UTRs 3’ identificadas podem ser compreendidas por sequência derivada de sequência de cDNA, assim como sequência derivada de DNA genômico. Uma sequência de cDNA pode ser usada para projetar iniciadores, que então podem ser usados com bibliotecas GenomeWalker (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA) construídas seguindo o protocolo de fabricante para clonar a região 3’ da correspondente sequência de DNA genômico para prover uma sequência de terminação mais longa. Análise de relativa abundância de transcrito tanto por contagens diretas como contagens normalizadas de leituras de sequências observadas para cada biblioteca de tecido pode ser usada para inferir propriedades sobre padrões de expressão. Por exemplo, algumas UTRs 3’ podem ser encontradas em transcritos mais abundantes em tecido de raiz antes que tecido de folha. Isto sugere que o transcrito é altamente expresso em raiz e que as propriedades de expressão em raiz podem ser atribuíveis à regulação transcricional do promotor, o líder, os introns ou a UTR 3’. Testes empíricos de UTRs 3’ identificadas pelas propriedades de expressão dentro de específicos órgãos, tecidos ou tipos de células podem resultar na identificação de UTRs 3’ que aperfeiçoam expressão naqueles específicos órgãos, tecidos ou tipos de células. UTRs 3’ úteis na prática da invenção são providas como SEQ ID NOs: 9, 10, 11, e 12.

[065] Construções e vetores também podem incluir uma sequên cia codificando peptídeo de trânsito que expressa um peptídeo ligado que é útil para alvejar um produto proteína, particularmente para um cloroplasto, leucoplasto, ou outra organela de plastídeo; mitocôndria; peroxissoma; vacúolo; ou uma localização extracelular. Para descrição do uso de peptídeos de trânsito cloroplastos, ver patentes U.S. Nos. 5 188 642 e 5 728 925. Muitas proteínas localizadas em cloroplasto são expressas a partir de genes nucleares como precursores e são alvejadas para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP). Exemplos de tais proteínas de cloroplasto isoladas incluem, mas não são limitadas àquelas associadas com a subunidade pequena (SSU) de ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase, ferredoxina, ferredo- xina óxido redutase, a proteína I e proteína II de complexo de colheita de luz, tiorredoxina F, enol piruvil shikimate fosfato sintase (EPSPS), e peptídeos de trânsito descritos na patente U.S. 7 193 133. Foi demonstrado in vivo e in vitro que proteínas não cloroplasto podem ser alvejadas para o cloroplasto através de uso de fusões de proteína com CTP heterólogo e que o CTP é suficiente para alvejar uma proteína para o cloroplasto. Incorporação de um apropriado peptídeo de trânsito de cloroplasto tal com o Arabidopsis thaliana EPSPS CTP (CTP2) (ver, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:437-442, 1987) ou Petúnia hybrida EPSPS CTP (CTP4) (ver, della-Cioppa et al., proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-6877, 1986) foi mostrado alvejar sequências de proteína EPSPS heterólogas para cloroplastos em plantas transgênicas (ver, patentes U.S. 5 627 061; 5 633 435; e 5 312 910; e EP 0218571; EP 189707; EP 508909; e EP 924299). Moléculas de polinucleotídeos que podem ser transcritas

[066] Como aqui usado, o termo "molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita" refere-se a qualquer molécula de DNA capaz de ser transcrita em uma molécula de RNA, incluindo, mas não limitado àquelas tendo sequências codificando proteína e aquelas produzindo moléculas de RNA tendo sequências úteis para supressão de gene. Um "transgene" refere-se a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga para uma célula hospedeira pelo menos com relação a sua localização no genoma e/ou uma molécula de polinucle- otídeo que pode ser transcrita incorporada artificialmente em um ge- noma de célula hospedeira na atual ou qualquer geração anterior da célula.

[067] Um promotor da presente invenção pode ser operacional mente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que é heteróloga com relação à molécula de promotor. Como aqui usado, o termo "heteróloga" refere-se à combinação de duas ou mais moléculas de polinucleotídeos quando tal combinação não é normal- mente encontrada na natureza. Por exemplo, as duas moléculas podem ser derivadas de espécies diferentes e/ou as duas moléculas podem ser derivadas de diferentes genes, por exemplo, diferentes genes das mesmas espécies, ou os mesmos genes de espécies diferentes. Um promotor é assim heterólogo com relação a uma molécula de poli- nucleotídeo que pode ser transcrita ligada operacionalmente se uma tal combinação não é normalmente encontrada na natureza, isto é, que molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita não está ocorrendo naturalmente ligada operacionalmente em combinação com aquela molécula promotora.

[068] A molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita gene ricamente pode ser qualquer molécula de DNA para a qual expressão de um transcrito RNA é desejada. Tal expressão de um transcrito RNA pode resultar em tradução da resultante molécula de mRNA e assim expressão de proteína. Alternativamente, por exemplo, uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita pode ser desenhada para por último causar diminuída expressão de um específico gene ou proteína. Em uma realização, isto pode ser realizado através de uso de uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que está orientada na direção antissentido. Aqueles versados na técnica são familiares com o uso de tal tecnologia antissentido. Em resumo, quando a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita é transcrita, o produto RNA hibridiza para e sequestra uma molécula de RNA complementar dentro da célula. Esta molécula de RNA duplex não pode ser traduzida em uma proteína pela maquinaria de tradução de célula e é degradada na célula. Qualquer gene pode ser regulado negativamente desta maneira.

[069] Assim, em uma realização da presente invenção, um ele mento regulador, provido como SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 6, e 8 está operacionalmente ligado a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita de modo a modular transcrição da molécula de polinu- cleotídeo que pode ser transcrita em um nível desejado ou em um padrão desejado quando a construção é integrada no genoma de uma célula de planta. Em uma realização, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita compreende uma região codificando proteína de um gene, e o promotor afeta a transcrição de uma molécula de RNA que é traduzida e expressa como um produto proteína. Em outra realização, a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita compreende uma região antissentido de um gene, e o promotor afeta a transcrição de uma molécula de RNA antissentido, RNA de fita dupla ou outra molécula de RNA inibidora similar de modo a inibir expressão de uma específica molécula de RNA de interesse em uma célula hospedeira alvo. Genes de Interesse Agronômico

[070] Moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas de acordo com a presente invenção podem ser genes de interesse agronômico. Como aqui usado, o termo "gene de interesse agronômico" refere-se a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que, quando expressa em um particular tecido de planta, célula, ou tipo de célula, confere uma desejável característica, tal como uma associada com morfologia de planta, fisiologia, crescimento, desenvolvimento, rendimento, produto, perfil nutricional, resistência a doença ou peste, e/ou tolerância ambiental ou química. Genes de interesse agronômico incluem, mas não são limitados àqueles codificando uma proteína de rendimento, uma proteína de resistência a tensão, uma proteína de controle de desenvolvimento, uma proteína de diferenciação de tecido, uma proteína de meristema, uma proteína responsiva ambientalmente, uma proteína de senescência, uma proteína respon- siva a hormônio, uma proteína de abscissão, uma proteína fonte, uma proteína sink, uma proteína de controle de flor, uma proteína de se- mente, uma proteína de resistência a herbicida, uma proteína de resistência a doença, uma enzima biossintética de ácido graxo, uma enzima biossintética de tocoferol, uma enzima biossintética de aminoácido, uma proteína pesticida, ou qualquer outro agente, tal como uma molécula de RNAi ou antissentido alvejando um particular gene para supressão. O produto de um gene de interesse agronômico pode atuar dentro de planta de modo a causar um efeito sobre a fisiologia ou metabolismo de planta, ou pode atuar como um agente pesticida na dieta de uma peste que se alimenta sobre a planta.

[071] Em uma realização da presente invenção, um promotor é incorporado em uma construção de modo que o promotor seja ligado operacionalmente a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que é um gene de interesse agronômico. A expressão do gene de interesse agronômico é desejável de modo a conferir uma característica agronomicamente benéfica. Sem limitação, uma característica agronômica benéfica pode incluir, por exemplo, tolerância a herbicida, controle de inseto, rendimento modificado, resistência de doença de fungo, resistência a vírus, resistência a nematódeo, resistência a doença bacteriana, crescimento e desenvolvimento de planta, produção de amido, produção de óleo modificada, alta produção de óleo, teor modificado de ácido graxo, alta produção de proteína, amadurecimento de fruto, aperfeiçoada nutrição animal e humana, biopolíme- ros, resistência de tensão ambiental, peptídeos farmacêuticos e peptí- deos secretáveis, aperfeiçoadas características de processamento, aperfeiçoada capacidade de digestão, produção de enzima, aroma, fixação de nitrogênio, produção de semente híbrida, produção de fibra, e produção de biocombustível, entre outras. Exemplos de genes de interesse agronômico conhecidos na técnica incluem aqueles para resistência a herbicida (patentes U.S. 6 803 501, 6 448 476, 6 248 876; 6 225 114; 6 107 549; 5 866 775; 5 804 425; 5 633 435; e 5 463 175), rendimento aumentado (patentes U.S USRE38 446; 6 716 474; 6 663 906; 6 476 295; 6 441 277; 6 423 828; 6 399 330; 6,372,211; 6,235,971; 6,222,098; e 5,716,837), controle de insetos (patentes U.S. 6,809,078; 6,713,063; 6,686,452; 6,657,046; 6,645,497; 6,642,030; 6,639,054; 6,620,988; 6,593,293; 6,555,655; 6,538,109; 6,537,756; 6,521,442; 6,501,009; 6,468,523; 6,326,351; 6,313,378; 6,284,949; 6,281,016; 6,248,536; 6,242,241; 6,221,649; 6,177,615; 6,156,573; 6,153,814; 6,110,464; 6,093,695; 6,063,756; 6,063,597; 6,023,013; 5,959,091; 5,942,664; 5,942,658; 5,880,275; 5,763,245; e 5,763,241), resistência de doença de fungos (patentes U.S. 6,653,280; 6,573,361; 6,506,962; 6,316,407; 6,215,048; 5,516,671; 5,773,696; 6,121,436; 6,316,407; e 6,506,962), resistência a vírus (patentes U.S. 6,617,496; 6,608,241; 6,015,940; 6,013,864; 5,850,023; e 5,304,730), resistência a nematodeo (patente U.S. 6,228,992), resistência a doença bacteria- na (patente U.S. 5,516,671), crescimento e desenvolvimento de planta (patentes U.S. 6,723,897 e 6,518,488), produção de amido (patentes U.S. 6,538,181; 6,538,179; 6,538,178; 5,750,876; e 6,476,295), produção modificada de óleo (patentes U.S. 6,444,876; 6,426,447; e 6,380,462), alta produção de óleo (patentes U.S. 6,495,739; 5,608,149; 6,483,008; e 6,476,295), teor modificado de ácido graxo (patentes U.S. 6,828,475; 6,822,141; 6,770,465; 6,706,950; 6,660,849; 6,596,538; 6,589,767; 6,537,750; 6,489,461; e 6,459,018), alta produção de proteína (patente U.S. 6,380,466), amadurecimento de fruto (patente U.S. 5,512,466), aperfeiçoada nutrição animal e humana (patentes U.S. 6,723,837; 6,653,530; 6,5412,59; 5,985,605; e 6,171,640), biopolímeros (patentes U.S. USRE37,543; 6,228,623; 5,958,745; e 6,946,588), resistência a tensão ambiental (patente U.S. 6,072,103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (patentes U.S 6,812,379; 6,774,283; 6,140,075; e 6,080,560), características de processamento aperfeiçoadas (patente U.S. 6,476,295), capacidade de digestão aperfeiçoada (patente U.S. 6,531,648), baixo teor de rafinose (patente U.S. 6,166,292), produção industrial de enzima (patente U.S. 5,543,576), aperfeiçoado aroma (patente U.S. 6,011,199), fixação de nitrogênio (patente U.S. 5,229,114), produção de semente híbrida (patente U.S 5,689,041), produção de (patentes U.S. 6,576,818; 6,271,443; 5,981,834; e 5,869,720) e produção de biocombustível (patente U.S. 5,998,700).

[072] Alternativamente, um gene de interesse agronômico pode afetar a característica ou fenótipo de planta mencionado acima através de codificação de uma molécula de RNA que causa a modulação alvejada de expressão de gene de um gene endógeno, por exemplo, via antissentido (ver, por exemplo, patente U.S. 5 107 065); RNA inibidor ("RNAi", incluindo modulação de expressão de gene via mecanismos mediados por miRNA, siRNA, siRNA de atuação - trans, e sRNA em fase, por exemplo, como descrito em pedidos de patente publicados US 2006/0200878 e US 2008/0066206, e em pedido de patente U.S. 11/974 469); ou mecanismos mediados por co-supressão. O RNA também pode ser uma molécula de RNA catalítica (por exemplo, uma ribozima ou riboswitch; ver, por exemplo, US 2006/0200878) engenhei- rada para clivar um desejado produto de mRNA endógeno. Assim, qualquer molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita que codifica uma molécula de RNA transcrita que afeta um fenótipo agronomi- camente importante ou mudança de morfologia de interesse pode ser útil para a prática da presente invenção. São conhecidos processos na técnica para a construção e introdução de construções em uma célula em uma maneira tal que a molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita é transcrita em uma molécula que é capaz de causar supressão de gene. Por exemplo, supressão de gene pós-transcricional usando uma construção com uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita orientada antissentido para regular expressão de gene em células de plantas é mostrada nas patentes U.S. 5 107 065 e 5 759 829, e supressão de gene pós-transcricional usando uma construção com uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita orientada - sentido para regular expressão de gene em plantas é mostrada em patentes U.S. 5 283 184 e 5 231 020. Expressão de um poli- nucleotídeo que pode ser transcrito em uma célula de planta também pode ser usada para suprimir pestes se alimentando sobre a célula de planta, por exemplo, composições isoladas de pestes de coleópteros (publicação de patente U.S. US20070124836) e composições isoladas de pestes de nematódeos (publicação de patente U.S. US20070250947). Pestes de plantas incluem, mas não são limitadas a pestes de artrópodes, pestes de nematódeos, e pestes de fungos ou micróbios. Moléculas de polinucleotídeo que podem ser transcritas exemplares para incorporação em construções da presente invenção incluem, por exemplo, moléculas de DNA ou genes de outras espécies que não as espécies ou genes alvos que se originam com ou estão presentes nas mesmas espécies, mas são incorporadas em células receptoras através de processos de engenharia genética antes que técnicas clássicas de cultivo ou reprodução. O tipo de molécula de po- linucleotídeo pode incluir, mas não é limitado a, uma molécula de poli- nucleotídeo que já está presente na célula de planta, uma molécula de polinucleotídeo de uma outra planta, uma molécula de polinucleotídeo de um organismo diferente, ou uma molécula de polinucleotídeo gerada externamente, tal como uma molécula de polinucleotídeo contendo uma mensagem antissentido de um gene, ou uma molécula de polinu- cleotídeo codificando uma versão artificial, sintética, ou de outro modo modificada, de um transgene. Marcadores Selecionáveis

[073] Como aqui usado o termo "marcador" refere-se a qualquer molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita cuja expressão, ou sua falta, pode ser selecionada ou classificada de alguma maneira. Genes marcadores para uso na prática da presente invenção incluem, mas não são limitados a moléculas de polinucleotídeos que podem ser transcritas codificando beta-glicuronidase (GUS, descrita em patente U.S. 5 599 670), proteína fluorescente verde e suas variações (GFP, descrita em patentes U.S. 5 491 084 e 6 146 826), proteínas que conferem resistência a antibiótico, ou proteínas que conferem tolerância a herbicida. Marcadores de resistência a antibióticos úteis, incluindo aqueles codificando proteínas conferindo resistência a canamicina (nptII), higromicina B (aph IV), streptomicina ou spectinomicina (aad, spec/strep) e gentamicina (aac3 e aacC4), são bem conhecidos na técnica. Herbicidas para os quais tolerância de planta transgênica foi demonstrada e para os quais o processo da presente invenção pode ser aplicado, podem incluir, mas não são limitados a: ácido amino metil fosfônico, glifosato, glufosinato, sulfonil uréias imidazolinonas, bromo- xinil, dalapom, dicamba, ciclo hexanodiona, inibidores de protoporfiri- nogênio oxidase, e herbicidas isoxasflutol. Moléculas de polinucleotí- deos que podemser transcritas codificando proteínas envolvidas em tolerância a herbicida são conhecidas na técnica, e podem incluir, mas não são limitadas a, uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita codificando 5-enol piruvil shikimate-3-fosfato sintase (EPSPS para tolerância a glifosato, descrita em patentes U.S. 5 627 061; 5 633 435; 6 040 497; e 5 094 945); uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita codificando uma glifosato óxido redutase e uma glifosato-N-acetil transferase (GOX, descrita em patente U.s. 5 463 175; GAT, descrita em publicação de patente U.S. 20030083480; e dicamba mono oxigenase, descrita em publicação de patente U.S. 20030135879); uma molécula de polinucleotídeo que pode ser trans-crita codificando bromoxinil nitrilase (Bxn para tolerância a bromoxinil, descrita em patente U.S. 4 810 648); uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita codificando fitoeno desaturase (crtI) descrita em Misawa, et al. (Plant Journal 4:833-840, 1993; e Plant Journal 6:481-489, 1994) para tolerância a norflurazon; uma molécula de poli- nucleotídeo que pode ser transcrita codificando aceto hidroxiácido sin- tase (AHAS, aka ALS) descrita em Sathasiivan, et al. (Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990) para tolerância para herbicidas sulfoinil uréia; e o gene bar descrito em DeBlock, et al. (EMBO Journal 6:2513-2519, 1987) para tolerância glufosinato e bialafos. As moléculas promotoras da presente invenção podem expressar moléculas de polinucleotídeos que podem ser transcritas ligadas que codificam fosfinotricina acetil transferase, EPSPS resistente a glifosato, aminoglicosídeo fosfotrans- ferase, hidroxi fenil piruvato desidrogenase, higromicina fosfotransfe- rase, neomicina fosfotransferase, dalapon desalogenase, bromoxinil resistente nitrilase, antranilato sintase, ariloxi alcanoato dioxigenases, acetil CoA carboxilase, glifosato óxido redutase e glifosato-N-acetil transferase.

[074] Incluídos no termo "marcadores selecionáveis" estão tam bém genes que codificam um marcador que pode ser secretado cuja secreção pode ser detectada como um meio de identificação ou seleção para células transformadas. Exemplos incluem marcadores que codificam um antígeno que pode ser secretado que pode ser identificado por interação de anticorpo, ou mesmo enzimas que podem ser secretadas que podem ser detectadas cataliticamente. Proteínas marcadoras secretadas selecionáveis caem em um número de classes, incluindo proteínas que podem ser difundidas, pequenas que são de- tectáveis (por exemplo, através de ELISA), pequenas enzimas ativas que são detectáveis em solução extracelular (por exemplo, alfa- amilase, beta-lactamase, fosfinotricina transferase), ou proteínas que são inseridas ou arrastadas na parede de célula (tais como proteínas que incluem uma sequência líder tais como aquelas encontradas na unidade de expressão de extensão ou proteínas relacionadas a pato- gênese de tabaco, também conhecidas como tabaco PR-S). Outros genes marcadores selecionáveis possíveis serão aparentes para aqueles versados na técnica e são abrangidos pela presente invenção. Transformação de Célula

[075] O termo "transformação" refere-se à introdução de ácido nucléico em um hospedeiro receptor. Como aqui usado, o termo "hospedeiro" refere-se a uma bactéria, um fungo, ou uma planta, incluindo quaisquer células, tecido, órgãos, ou progênie da bactéria, fungo, ou planta. Por exemplo, uma célula hospedeira de acordo com a presente invenção pode ser qualquer célula ou organismo, tal como uma célula de planta, célula de alga, alga, célula de fungo, fungos, célula de bactéria, célula de inseto ou semelhantes. Em uma realização, células hospedeiras e transformadas podem incluir células de: plantas, Sper- gillus, leveduras, insetos, bactérias e algas. Tecidos e células de plantas de particular interesse incluem, mas não são limitadas a, protoplas- tos, calli, raízes, tubérculos, sementes, caules, folhas, plântulas, embriões, e pólen.

[076] Como aqui usado, o termo "transformada" refere-se a uma célula, tecido, órgão, ou organismo no qual uma molécula de polinu- cleotídeo estranha, tal como uma construção, foi introduzida. A molécula de polinucleotídeo introduzida pode ser integrada no DNA genô- mico da célula, tecido, órgão ou organismo receptor de modo que a molécula de polinucleotídeo introduzida seja herdada por subsequente progênie. Uma célula ou organismo "transgênico" ou "transformado" também inclui progênie da célula ou organismo e progênie produzida a partir de um programa de cultivo empregando um tal organismo trans- gênico como um parente em um cruzamento e exibindo um fenótipo alterado resultante da presença de uma molécula de polinucleotídeo estranha. O termo transgênico refere-se a uma bactéria, fungo ou planta contendo uma ou mais moléculas de ácido polinucléico heteró- logas.

[077] Existem muitos processos para introdução de moléculas de ácido polinucléico em células de planta. O processo pode compreender genericamente as etapas de seleção de uma apropriada célula hospedeira, transformação de célula hospedeira com um vetor recom- binante, e obtenção de uma célula hospedeira transformada. Processos apropriados incluem infecção de bactéria (por exemplo, Agrobacterium), vetores de cromossoma artificial bacteriano binário, liberação direta de DNA (por exemplo, via transformação mediada por PEG, tomada de DNA mediada por dessecação/inibição, eletroporação, agitação com fibras de carbeto de silício, e aceleração de partículas revestidas com DNA, etc. (revista em Potrykus et al., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42:205, 1991).

[078] Tecnologia para introdução de uma molécula de DNA em células é bem conhecida por aqueles versados na técnica. Processos e materiais para transformação de células de planta através de introdução de uma construção de DNA de planta em um genoma de planta na prática desta invenção podem incluir qualquer um dos processos bem conhecidos e demonstrados. Quaisquer processos de transformação podem ser utilizados para transformar uma célula hospedeira com um ou mais promotores e/ou construções da presente invenção.

[079] Plantas transgênicas regeneradas podem ser auto- polinizadas para provimento de plantas homozigoto. Alternativamente, pólen obtido das plantas transgênicas regeneradas pode ser cruzado com plantas não transgênicas, preferivelmente linhas inatas de espécies agronomicamente importantes. Descrições de processos de cultivo que são comumente usados para diferentes características e colheitas podem ser encontradas em um de vários livros de referência, ver, por exemplo, Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98, 1960; Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc., NY, 369-399, 1979; Sneep and Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen (ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation, 1979; Fehr, Soybeans: Im-provement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph, 16:249, 1987; Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol. 1) and Crop Species Soybean (Vol. 2), Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co., NY, 360-376, 1987. Ao contrário, pólen de plantas não transgênicas pode ser usado para polinizar as plantas transgênicas regeneradas.

[080] As plantas transformadas podem ser analisadas para a presença dos genes de interesse e o nível de expressão e/ou perfil conferido pelos elementos reguladores da presente invenção. Aqueles versados na técnica estão cientes dos numerosos processos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Por exemplo, processos para análises de plantas incluem, mas não são limitados a Southern blots ou northern blots, abordagens baseadas em PCR, análises bioquímicas, processos de seleção fenotípica, avaliações de campo, e ensaios imunodiagnósticos. A expressão de uma molécula de polinu- cleotídeo que pode ser transcrita pode ser medida usando reagentes e processos TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA) como descrito pelo fabricante e tempos de ciclo de PCR determinados usando o TaqMan Testing Matrix. Alternativamente, os reagentes e processos Invader (Third Wave Technologies, Madison, WI) como descritos pelo fabricante podem ser usados para avaliar expressão de transgene.

[081] As sementes de plantas desta invenção podem ser colhidas de plantas transgênicas férteis e usadas para crescimento de gerações de progênie de plantas transformadas desta invenção, incluindo linhas de plantas híbridas compreendendo a construção desta invenção e expressando um gene de interesse agronômico.

[082] A presente invenção também provê partes das plantas da presente invenção. Partes de plantas, sem limitação, incluem folhas, caules, raízes, tubérculos, sementes, endosperma, óvulo, e pólen. A invenção também inclui e provê células de plantas transformadas que compreendem uma molécula de ácido nucléico da presente invenção.

[083] A planta transgênica pode passar a molécula de polinucleo- tídeo transgênica para sua progênie. Progênie inclui qualquer parte de planta regenerável ou semente compreendendo o transgene derivado de uma planta ancestral. A planta transgênica é preferivelmente ho- mozigoto para a molécula de polinucleotídeo transformada e transmite este sequência para toda descendência como um resultado de reprodução sexual. Progênie pode ser crescida a partir de sementes produzidas pela planta transgênica. Estas plantas adicionais então podem ser auto-polinizadas para geração de uma linha de cultivo verdadeira de plantas. A progênie destas plantas é avaliada entre outras coisas para expressão de gene. A expressão de gene pode ser detectada através de vários processos comuns como western blotting, northern blotting, imuno-precipitação, e ELISA.

[084] Tendo agora descrito genericamente a invenção, a mesma será mais facilmente entendida com referência aos exemplos que se seguem os quais são providos por meio de ilustração, e não são pretendidos serem limitantes da presente invenção, a menos que especificado. Deve ser apreciado por aqueles versados na técnica que as técnicas mostradas nos exemplos que se seguem representam técnicas descobertas pelos inventores para funcionarem bem na prática da invenção. Entretanto, aqueles versados na técnica devem, à luz da presente exposição, apreciar que muitas mudanças podem ser feitas nas específicas realizações que são mostradas e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem fugir do espírito e escopo da invenção, por isso toda matéria mostrada nos desenhos acompanhantes é para ser interpretada como ilustrativa e não em um sentido limitante. Exemplos Exemplo 1 Elementos reguladores isolados de Zea mays e correspondentes grupos de elementos de expressão reguladora de transcrição

[085] Elementos reguladores foram isolados de Zea mays, e se quências de grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição (EXP) compreendendo os elementos reguladores de Zea mays foram construídas.

[086] Plantio inicial de sementes de milho no início de Abril no norte de U.S. possui potenciais riscos prejudiciais para sementes de milho. Por exemplo, condições de campo úmidas e frio prolongado podem evitar ótima germinação e estabelecimento de plântula. Através de formação de perfil de transcrito e subsequente caracterização, vários genes candidatos foram identificados que demonstraram um padrão de expressão útil para o desenvolvimento e germinação de semente. O promotor e líder de um gene candidato, aqui referido como P-Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO: 2) e L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4), respectivamente, foram amplificados a partir de DNA genômico de milho, e clonados e sequenciados.

[087] Iniciadores de amplificação foram desenhados baseado em sequências EST e genômicas públicas e proprietárias, os quais foram então usados com bibliotecas GenomeWalker (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) construídas seguindo o protocolo de fabricante para clonar a região 5’ da correspondente sequência de DNA ge- nômico. Usando esta sequência, elementos reguladores foram identificados com bioinformática dentro da região 5’ para o gene. Usando os resultados desta análise, elementos reguladores foram definidos dentro de sequência 5’ à montante da sequência codificante do gene. Iniciadores foram então desenhados para amplificar os elementos regu- ladores. A correspondente molécula de DNA para cada elemento regulador foi amplificada usando condições padrões de PCR com iniciadores contendo sítios de enzima de restrição únicos e DNA genômico isolado de Zea mays. Esta sequência clonada compreendeu o promotor e sequência UTR 5’ à montante da região codificando proteína para o gene de Zea mays. O resultante fragmento de DNA foi ligado em vetores de expressão de planta base usando processos de clonagem de DNA padrões e sequenciado.

[088] Sequências dos grupos de elementos de expressão regula dora de transcrição identificados ("EXPs") são aqui providas como SEQ ID NOs: 1, 6, e 8, como listadas na Tabela 1 abaixo. Uma sequência promotora é aqui provida como SEQ ID NO:2. Uma sequência líder é aqui provida como SEQ ID NO: 4. Sequências intron são aqui providas como SEQ ID NOs: 5, 7, e 9. Tabela 1.Grupos de elementos de expressão reguladora de transcrição ("EXPs"), promotor, líderes, e introns isolados de várias espécies de grama

[089] Como mostrado na Tabela 1, por exemplo, o grupo de ele mentos de expressão reguladora de transcrição (EXP) designado EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 1), com componentes isolados de Zea mays, compreende um elemento promotor, P-Zm.Nac- 1:1:2 (SEQ ID NO: 2), ligado operacionalmente 5’ a um elemento líder, L-Zm.Nac-1:1:1 (SE ID NO: 4), ligada operacionalmente 5’ a um elemento intron, I-Zm.DnaK-1:1:1 (SEQ ID NO: 5). Outros EXPs são similarmente ligados, como esboçado na Tabela 1. Exemplo 2 Análises de EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 1) dirigindo GUS em F1 de milho transgênico

[090] Plantas de milho transformadas com o vetor de expressão de planta pMON73501, contendo o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição, EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 1) dirigindo expressão do transgenebeta-glicuronidase (GUS), e as resultantes plantas foram analisadas para expressão de proteína GUS.

[091] A sequência EXP foi clonada em construções de plasmídeo de transformação binária de planta usando processos conhecidos na técnica. A resultante construção de plasmídeo de expressão em planta, pMON73501, conteve uma região de borda direita de A. tumefaci- ens, um primeiro cassete transgene para testar o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição EXP-Zm.Nac+Zm.DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 1) ligado operacionalmente a um sequência codificante para beta-glicuronidase (GUS, SEQ ID NO: 14), ligada operacionalmente para região UTR 5’ para 3’ T-AGRtu.nos-1:1:13 (SEQ ID NO: 10); um segundo cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de planta transformadas que confere resist~encia para o herbicida glifosato dirigido pelo promotor 35S CaMV, EXP- CaMV,35S:1:1 (SEQ ID NO: 15), e uma região de borda esquerda de A. tumefaciens. O resultante plasmídeo foi usado para transformar plantas de milho.

[092] Plantas de milho foram transformadas com o vetor de ex pressão GUS, pMON73501. Transformante de geração R0, selecionados para inserções de cópia simples foram cruzados com plantas LH244 não transformadas para produção de uma população F1 de transformantes. Níveis de expressão de GUS foram medidos em tecidos selecionados sobre o curso de desenvolvimento. Os tecidos F1 usados para este estudo incluíram: embrião de semente embutido, en- dosperma de semente embutido, raiz, e coleoptide em 3 dias após germinação (DAG); folha e raiz em estágio V3; raiz e folha madura em estágio V7; raiz, folhas maduras e senescentes, sabugo, seda, inter- nódulo, antera, e pólen em estágio VT (em tasseling, antes de reprodução); núcleo 7 dias após polinização (DAP) e; embrião e endosper- ma 21 e 35 DAP. Amostras de tecidos selecionadas também foram analisadas para plantas F1 expostas a condições de tensão de frio e seca. Raiz V3 e tecido de folha foram amostrados após exposição a frio e seca, assim como dois dias após recuperação de exposição a frio (2 DAR).

[093] Tensão de seca foi induzida em plantas F1, V3 através de interrupção de rega por 4 dias permitindo que o teor de água seja reduzido por pelo menos 50% do teor de água original da planta inteiramente aguada. O protocolo de seca foi essencialmente compreendido pelas seguintes etapas. Plantas de estágio V3 foram privadas de água. Quando uma planta de milho experimenta seca, a forma da folha mudará da aparência usual saudável e desdobrada para uma folha demonstrando dobra no feixe vascular de metade de nervura e aparecimento de uma forma V quando vista da ponta da folha para o caule. Esta mudança em morfologia usualmente começa a ocorrer em aproximadamente 2 dias após o término de regar e foi mostrada em expe-rimentos iniciais para ser associada com perda de água ao redor de 50% como medida por peso de potes antes de cessar a adição de água e peso de potes quando a morfologia de folha curvada foi observada em plantas sem água. Plantas foram consideradas estarem sob condições de seca, quando as folhas mostraram murchamento como evidenciado por uma curvatura para dentro (forma de V) da folha. Este nível de tensão é considerado ser uma forma de tensão sub-letal. Uma vez a planta tenha demonstrado indução de seca como definida acima, a planta foi destruída para aquisição de amostras de raiz e folha. Quatro plantas para cada vetor foram usadas e medições de GUS tomadas como descrito abaixo.

[094] Em adição a seca, plântulas de germinação F1 e plantas de estágio V3, F1 transformadas com pMON73501 também foram expostas a condições de frio para determinar se os elementos reguladores demonstraram expressão de GUS induzida por frio. Sessenta sementes derivadas de seis sementes de cada um de 10 eventos de transformação foram testadas para indução de expressão de gene sob condições frias. As sementes foram germinadas em placas de Petri sobre papel de filtro saturado com água. Três dias após germinação, as plântulas foram expostas a tensão de frio através de colocação de placas de Petri contendo as plântulas germinadas na câmara de crescimento escura colocada a 10oC por 24 horas. No fim do período de 24 horas, os tecidos de coleóptilos e raiz foram amostrados para expressão quantitativa de GUS como descrito abaixo. Plantas inteiras foram testadas para indução de expressão de GUS sob tensão de frio em estágio V3. Vinte plantas de milho de estágio V3, compreendidas por 2 plantas de cada um de 10 eventos de transformação, foram expostas a uma temperatura de 12oC em uma câmara de crescimento por 24 horas. Plantas na câmara de crescimento foram crescidas sob uma luz branca de 800 umoles/m2.s com um ciclo de luz de dez horas de luz branca e 14 horas de escuridão. Após exposição ao frio, tecidos de folha e raiz foram amostrados para expressão quantitativa de GUS.

[095] Análise histoquímica de GUS foi usada para análise de ex pressão qualitativa de plantas transformadas. Seções de tecido inteiro foram incubadas com solução de manchamento de GUS X-Gluc (5- bromo-4-cloro-3-indolil-b-glicuronídeo) (1 mg/mL) por um apropriado comprimento de tempo, rinsadas, e inspecionadas visualmente para coloração azul. Atividade de GUS foi determinada qualitativamente através de inspeção visual direta ou inspeção sob um microscópio usando tecidos e órgãos de plantas selecionados.

[096] Para análise quantitativa, proteína total foi extraída de teci dos selecionados de plantas de milho selecionadas. Um micrograma de proteína total foi usado com o substrato fluorogênico 4-metil umbeli- feril-beta-D-glicuronídeo (MUG) em um volume de reação total de 50 microlitros. Fluorescência foi medida com excitação em 365 nm, emissão em 445 nm, usando um Fluoromax-3 (Horiba; Kyoto, Japão) com Micromax Reader, com largura de fenda fixada em excitação de 2 nm e emissão de 3 nm.

[097] A Tabela 2 abaixo mostra o nível médio de expressão de GUS em tecidos selecionados em plantas F1 transformadas com pMON73501. Tabela 2.valores de expressão de GUS médios de tecidos selecionados e tratamentos de geração F1 de plantas de milho transformadas, transformadas com pMON73501

Continuação

[098] Como visto na Tabela 2, uma característica chocante com relação a expressão dirigida pela sequência EXP, EXP-Zm.Nac+Zm. DnaK:1:1 (SEQ ID NO: 1), compreendendo o promotor e líder P- Zm.Nac-1:1:2 (SEQ ID NO: 2) e L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO:4) foi o maior nível de expressão observado em embriões de semente absor- vida e tecidos de endosperma em relação a outros tecidos amostrados. Este alto nível de expressão pode conferir vantagens para germinação de sementes expressando transgenes úteis em promoção de proteção contra condições de tensão úmida e frio. Expressão também foi maior em relação aos outros tecidos no embrião e endosperma durante desenvolvimento inicial de semente (21 a 35 DAP). Um tal padrão de expressão também pode ser vantajoso para facilitar germinação e crescimento da resultante semente. Por exemplo, proteína ou produtos derivados da expressão de transgenes ligados operacionalmente ao promotor Nac de Zea mays e líder expresso durante os estágios iniciais de desenvolvimento de semente podem permitir a acumulação de proteína ou produtos derivados na semente em desenvolvimento para ser estocada para rápido uso com germinação em condições frias ou úmidas. Expressão com germinação pode prover adicionais vantagens para a semente dirigindo os desejados transgenes através de permissão de expressão de adicional proteína ou produto derivado em um tempo crítico sob condições de tensão de frio e umidade. Uma lve indução para frio também foi observada em folha e raiz V3 neste experimento. Exemplo 3 Análise de elementos reguladores dirigindo GUS em milho transgênico R0

[099] Plantas de milho foram transformadas com vetores de ex pressão contendo sequências EXP dirigindo expressão do transgene beta-glicuronidase (GUS), e as plantas resultantes foram analisadas para expressão de proteína GUS. Os grupos de elementos de expressão reguladora de transcrição foram clonados em construções de plasmídeo de transformação binária de planta usando processos conhecidos na técnica.

[0100] As construções de plasmídeo de expressão em planta re- sultantes contiveram uma região de borda direita de A. tumefaciens, um primeiro cassete transgene para testar sequência EXP e uma combinação UTR 3’ compreendida por uma sequência EXP (indicada na Tabela 3), ligada operacionalmente a uma sequência codificando beta-glicuronidase (GUS, SEQ ID NO: 14), ligada operacionalmente 5’ para uma região de terminação 3’ (indicada na tabela 3); um segundo cassete de seleção de transgene usado para seleção de células de planta transformadas que confere resistência para o herbicida glifosato (CP4, US RE39247, dirigida pelo promotor Actina 1 de arroz, EXP- Os.Act1:1:1, SEQ ID NO: 16), e uma região de borda esquerda de A. tumefaciens. Os resultantes plasmídeos foram usados para transformar plantas de milho. A Tabela 3 lista as designações de plasmídeos, os grupos de elementos de expressão reguladora de transcrição, que também são descritos na Tabela 1, e as UTRs 3’ que foram colocadas em ligação operável com a sequência codificando GUS. Cada construção de plasmídeo foi compreendida por uma configuração de cassete de transgene única compreendida por específicos introns e UTRs 3’ colocadas em ligação operável com o promotor e líder P-Zm.Nac-1:1:2 SEQ ID NO: 2) e L-Zm.Nac-1:1:1 (SEQ ID NO: 4). Tabela 3:construções de plasmídeo GUS e correspondentes grupos de elementos de expressão reguladora de transcrição

[0101] Plantas foram transformadas usando processos de trans formação mediada por Agrobacterium conhecidos na técnica. Análise de GUS histoquímicas e quantitativas foram realizadas como descrito no Exemplo 2 acima. A expressão de GUS R0 média observada para cada cassete de transgene GUS transformado em plantas de milho é apresentada na Tabela 4 abaixo. Tabela 4.Expressão média de GUS R0 em tecido de raiz e folha

[0102] Consistente com os resultados obtidos no Exemplo 2, a Ta bela 4 mostra que expressão foi mais alta no embrião em desenvolvimento (21 DAP) para todos os quatro cassetes transgenes. A Fig. 1 ilustra os diferentes padrões de expressão que foram conferidos por cada configuração de cassete transgene. Expressão no embrião em desenvolvimento foi mais alta para o cassete transgene compreendido por sequência EXP, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (SEQ ID NO: 8), que foi operacionalmente ligada à UTR 3’, T-Os.Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO: 13) com relação aos outros três cassetes transgenes. Níveis similares de expressão foram observados no embrião em desenvolvimento e endosperma de plantas transformadas com o cassete de expressão compreendido pelo grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (SEQ ID NO: 8), que foi ope-racionalmente ligado À UTR 3’, T-Os.Mth-1:1:1 (SEQ ID NO: 12). Para o cassete transgene compreendido pelo grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição, EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (SEQ ID NO:6), que foi operacionalmente ligado à UTR 3’, T-Os.Mth-1:1:1 (SEQ ID NO12), expressão no endosperma foi muito menor em relação à expressão no embrião. Para o cassete transgene compreendido pelo grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição, EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (SEQ ID NO: 6), que foi operacionalmente ligado À UTR 3’, T-Os.CLUS33428_1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11), expressão no embrião foi menor em relação à expressão no endosperma. Cada configuração de cassete transgene proporcionou um padrão único de expressão na semente R0 em desenvolvimento.

[0103] Diferenças de expressão na raiz, folha, antera, e seda, as sim como a semente em desenvolvimento de plantas transformadas com os quatro cassetes transgenes diferentes, também foram observadas. A Fig. 2 ilustra os diferentes padrões de expressão que foram conferidos por cada configuração de cassete transgene em cada um dos tecidos descritos acima. Por exemplo, expressão em folha foi maior naqueles cassetes transgenes compreendidos pela sequência EXP, EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (SEQ ID NO: 8) em relação aos cassetes transgenes compreendendo EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (SEQ ID NO: 6). Expressão em antera foi maior nos dois cassetes transgenes compreendidos pelo grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição, EXP-Zm.Nac+Os.FBA:1:1 (SEQ ID NO: 6), que foi operacionalmente ligado à UTR 3’, T.Os.CLUS33428_1-1:1:1 (SEQ ID NO: 11) e o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição , EXP-Zm.Nac+Os.Cab-1:1:1 (SEQ ID NO: 8), que foi operacionalmente ligado à UTR 3’, T-Os. Mth-1:1:1 (SEQ ID NO: 12). Cada uma das quatro configurações de cassete transgene proporcionou padrões de expressão únicos nos transformantes R0.

[0104] Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente inven ção, deve ser aparente para aqueles versados na técnica que a invenção pode ser modificada em arranjo e detalhe sem se fugir de tais princípios. Nós reivindicamos todas as modificações que estejam dentro de espírito e escopo das reivindicações. Todas as publicações e documentos de patentes publicados aqui citados são aqui incorporados por referência para a mesma extensão, como se cada publicação individual ou pedido de patente seja especificamente e individualmente indicado a ser incorporado por referência.

Claims (8)

1. Molécula de DNA recombinante, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência de DNA compreendendo SEQ ID NO: 2; em que a referida sequência está operacionalmente ligada a uma molécula de polinucleotídeo que pode ser transcrita heteróloga.

2. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de polinucleotí- deo que pode ser transcrita heteróloga compreender um gene de interesse agronômico.

3. Molécula de DNA recombinante de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que (i) o gene de interesse econômico confere tolerância a herbicida em plantas; ou (ii) o gene de interesse agronômico confere resistência a peste em plantas.

4. Cassete de transgene, caracterizado pelo fato de que compreende um grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 6, e 8, onde o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição está operacionalmente ligado a uma sequência codificante heteróloga que está operacionalmente ligada a uma UTR 3’ selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 11, 12, e 13.

5. Cassete transgene de acordo com a reivindicação 4, ca-racterizado pelo fato de que compreende a molécula de DNA apresentada como SEQ ID NO: 1, em que a molécula de DNA é operacionalmente ligada a uma sequência codificante heteróloga que está operacionalmente ligada à UTR 3’ apresentada como SEQ ID NO: 10.

6. Cassete transgene de acordo com a reivindicação 4, ca-racterizado pelo fato de que compreende o grupo de elementos de ex- pressão reguladora de transcrição apresentado como SEQ ID NO: 6, onde o grupo de elementos de expressão reguladora de transcrição está operacionalmente ligado a uma sequência codificante heteróloga que está operacionalmente ligada à UTR 3’ selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 11 e 12.

7. Cassete transgene de acordo com a reivindicação 4, ca-racterizado pelo fato de que compreende a molécula de DNA apresentada como SEQ ID NO: 8, em que a molécula de DNA é operacionalmente ligada a uma sequência codificante heteróloga que é operacionalmente ligada à UTR 3’ selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12 e 13.

8. Processo de expressão de uma molécula de polinucleo- tídeo que pode ser transcrita, caracterizado pelo fato de que compreende a obtenção de uma planta transgênica compreendendo a molécula de DNA como definida na reivindicação 1, em que o polinucleotí- deo que pode ser transcrito é expresso.

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