ES2838074T3 - Bacterias de ácido láctico resistentes a los fagos - Google Patents

Bacterias de ácido láctico resistentes a los fagos

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Abstract

Un método para el aislamiento de mutantes insensibles a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus que comprende las etapas de: a. inactivar el mecanismo de resistencia CRISPR de la cepa parental; b. exponer la cepa parental obtenida en la etapa a) a un bacteriófago; c. aislar mutantes insensibles a bacteriófagos; d. comparar los loci de CRISPR de la cepa parental con los loci de CRISPR de los mutantes insensibles a bacteriófagos; y e. seleccionar mutantes insensibles a bacteriófagos cuyos loci de CRISPR son idénticos a los loci de CRISPR de la cepa parental.

Description

DESCRIPCIÓN
Bacterias de ácido láctico resistentes a los fagos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para la construcción de mutantes de Streptococcus thermophilus insensibles a bacteriófagos, mediante el cual se atenúa un sistema de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), lo que conduce a que se confiera resistencia a los fagos mediante un mecanismo alternativo.
Antecedentes de la invención
La bacteria del ácido láctico termofílica Streptococcus thermophilus se usa ampliamente como cultivo iniciador para mejorar la textura y el sabor de muchos productos de yogur y queso (Mora et al. (2002) Genetic diversity and technological properties of Streptococcus thermophilus strains isolated from dairy products. J Appl Microbiol, 93, 278­ 287). Sin embargo, la depredación constante por (bacterio)fagos sigue siendo una causa importante de pérdidas económicas en la industria láctea en todo el mundo - a pesar del creciente conocimiento genético y tecnológico tanto de los hospedantes como de los fagos (Goh, YJ et al (2011) Specialized adaptation of a lactic acid bacterium to the milk environment: the comparative genomics of Streptococcus thermophilus LMD-9. Microb Cell Fact, 10 Suppl 1, S22). Para protegerse contra pérdidas de este tipo, es necesario desarrollar mutantes insensibles a bacteriófagos (BIMs) robustos y diversos de iniciadores de S. thermophilus para uso en rotación.
Las defensas del hospedante contra el ataque de bacteriófagos están frecuentemente mediadas por los sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) en S. thermophilus (Mills, S. et al. (2010). CRISPR analysis of bacteriophage-insensitive mutants (BIMs) of industrial Streptococcus thermophilus--implications for starter design. J Appl Microbiol, 108, 945-955), de los cuales hay cuatro tipos conocidos en esta especie bacteriana (Sinkunas, T et al. (2013). In vitro reconstitution of Cascade-mediated CRISPR immunity in Streptococcus thermophilus. EMBO J, 32, 385-394.). Sin embargo, se cree que solo CRISPR1 y CRISPR3 son activos en S. thermophilus, siendo los únicos dos sistemas que han demostrado proporcionar inmunidad adquirida contra los fagos (Sinkunas, T. et al., 2013). CRISPR1 y 3 se clasifican como sistemas de Tipo II, según la estructura y composición del gen cas locus espaciador de repetición. El mecanismo por el cual los sistemas CRISPR1 y CRISPR3 proporcionan inmunidad frente al ataque de bacteriófagos se ha caracterizado bien, y sigue la unión del fago y la inyección de ADN en la célula hospedante.
Dupuis, M.E., et al. (2013). CRISPR-Cas and restriction-modification systems are compatible and increase phage resistance. Nature Communications, DOI:10.1038/ncomms3087, describen que los sistemas de modificación de restricción (R-M) y CRISPR-Cas son compatibles y actúan juntos para aumentar la resistencia global a los fagos de una célula bacteriana mediante la escisión de sus respectivos sitios diana.
El ADN no nativo activa los productos génicos asociados a CRISPR (Cas) para seleccionar como diana e incorporar un segmento corto de nucleótidos derivado de fagos (“espaciador”) en el locus espaciador repetido adyacente en el cromosoma del hospedante, un mecanismo que se presume que está mediado por el gen cas7 (Barrangou, R., et al. (2007) . CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 315, 1709-1712). Posteriormente, el sistema selecciona como diana y degrada el genoma viral entrante a través de la actividad del producto génico asociado a CRISPR (Cas) 9 (Sapranauskas, R., et al. (2011). The Streptococcus thermophilus CRISPR/Cas system provides immunity in Escherichia coli. Nucleic acids research, 39, 9275-9282). Por esta razón, cas9 se describe ahora como el gen “distintivo” de los sistemas CRISPR Tipo II (Makarova, K. S., et al. (2011). Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nature Reviews Microbiology, 9, 467-477) a los que pertenecen tanto CRISPR1 como 3.
Se cree que, de los cuatro sistemas, la resistencia mediada por CRISPR1 está favorecida por S. thermophilus, debido a una mayor frecuencia de incorporación de espaciadores en este locus en algunas cepas (Deveau, H., et al. (2008) ). Phage response to CRISPR-encoded resistance in Streptococcus thermophilus. Journal of bacteriology, 190, 1390-1400; Mills et al (2010. A pesar de la eficacia del sistema CRISPR1 para proporcionar inmunidad adquirida a S. thermophilus contra los fagos atacantes, la confianza en este mecanismo natural en un entorno industrial no es favorable. Deveau et al. (2008) mostraron que para evadir el sistema CRISPR1, el fago atacante simplemente necesita poseer un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en el segmento del que deriva el espaciador inicial - lo que destaca la frecuente inestabilidad del sistema. Es evidente la necesidad de un mecanismo alternativo y más estable de resistencia a los fagos (y un método para seleccionarlo). Por estas razones, se seleccionaron dos de los genes (cas cas7y cas9), que forman parte del sistema CRISPR1-Cas, para la inactivación dirigida en este estudio.
El método de emplear constructos de plásmidos de ARN antisentido (anteriormente denominado micARN) para inhibir la expresión de genes específicos en bacterias y bacteriófagos ha sido bien establecido (Coleman, J. et al. (1985). A novel immune system against bacteriophage infection using complementary RNA (micRNA). Nature, 315, 601-603; Kim y Batt, (1991). Antisense mRNA-Mediated Bacteriophage Resistance in Lactococcus lactis subsp.
lactis. Appl Environ Microbiol, 57, 1109-1113. El plásmido pNZ44 de número elevado de copias de L. lactis fue ideado por McGrath, S. et al (2001) (Improvement and optimization of two engineered phage resistance mechanisms in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol, 67, 608-616) para optimizar una estrategia antisentido para silenciar los genes de fagos implicados en la replicación del ADN, aumentando así la resistencia del hospedante a los fagos. Sin embargo, hasta donde sabemos, el sistema no se ha utilizado para inactivar genes CRISPR-Cas antes de la infección por bacteriófagos. La presente invención proporciona un método para sesgar la generación de BIMs espontáneos de una manera que favorezca un mecanismo de resistencia independiente de CRISPR. La invención también detalla un método mediante el cual se puede seleccionar un mutante resistente a fagos que contiene elementos tanto CRISPR como no CRISPR.
Descripción detallada de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona un método para la construcción de un mutante insensible a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus, que comprende las etapas de
a. inactivar el mecanismo de resistencia CRISPR de la cepa parental;
b. exponer la cepa parental obtenida en la etapa a) a un bacteriófago;
c. aislar mutantes insensibles a bacteriófagos;
d. opcionalmente: comparar los loci de CRISPR de la cepa parental con los loci de CRISPR de los mutantes insensibles a bacteriófagos; y
e. opcionalmente: seleccionar mutantes insensibles a bacteriófagos cuyos loci de CRISPR sean idénticos a los loci de CRISPR de la cepa parental.
El mutante insensible a bacteriófagos se denominará BIM en el resto del texto.
La ventaja del método de la invención es que los BIMs han adquirido su resistencia a los fagos debido a un mecanismo diferente al mecanismo de resistencia CRISPR. Para evitar que en la etapa b) del método se generen BIMs con CRISPR, se debe inactivar el mecanismo de resistencia CRISPR en la etapa a).
Etapa a) - Según una realización preferida del método de la invención, el mecanismo de resistencia CRISPR se inactiva introduciendo en la cepa parental uno o más constructos de ADN que comprenden un promotor seguido de uno o más genes cas o una parte de los mismos, o una secuencia nucleotídica al menos 90% idéntica al gen cas en la orientación inversa, de modo que el gen cas se transcribe en el correspondiente ARN antisentido que posteriormente se une al ARNm cas diana, silenciando así el gen cas.
El promotor puede ser cualquier promotor adecuado, tal como pNZ44, derivado de Lactococcus lactis (McGrath et al., 2001).
Los genes cas adecuados que pueden usarse son genes cas asociados con cualquier sistema CRISPR funcional, siempre que la función que realiza sea esencial para la incorporación de espaciadores adicionales y/o la ejecución exitosa de la inmunidad adquirida contra los fagos atacantes. Las realizaciones preferidas son cas7 y cas9, asociados al sistema CRISPR1 en S. thermophilus, o cas5/csn1, casi o csn2 asociado con CRISPR3. En el método de la invención se puede usar una secuencia nucleotídica que comprende solo una parte del gen cas, por ejemplo al menos 100 pares de bases, o al menos 200 pares de bases, o al menos 300 pares de bases. La ventaja de este método es aumentar la eficacia con la que se construyen los plásmidos antisentido utilizando un inserto más corto. Sin embargo, preferiblemente se usa el gen cas de longitud completa para lograr la máxima eficacia del silenciamiento génico después de la transcripción a ARNm. Además, en el método de la invención se puede usar una secuencia nucleotídica que sea al menos 90% idéntica, más preferiblemente al menos 91%, más preferiblemente al menos 92%, más preferiblemente al menos 93%, más preferiblemente al menos 94%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, más preferiblemente al menos 98%, más preferiblemente al menos 99%, y lo más preferible 100% idéntico a la secuencia nucleotídica del gen cas o la parte del mismo que se utilice.
En una realización preferida, el mecanismo de resistencia CRISPR se inactiva introduciendo en la cepa parental uno o más constructos de ADN que comprenden un promotor seguido de dos o más genes cas o una parte de los mismos.
También se pueden usar dos o más constructos de ADN en la etapa a), por lo que cada constructo de ADN puede comprender el mismo gen cas o uno diferente. Este método puede proporcionar una ventaja significativa al inactivar dos o más sistemas CRISPR-Cas funcionales simultáneamente, con el fin de descartar una posible transferencia de actividad de un sistema CRISPR1 inactivado a CRISPR3 o 4, que es igualmente indeseable por las razones expuestas anteriormente.
Según otra realización preferida del método de la invención, el mecanismo de resistencia CRISPR se inactiva introduciendo en la cepa parental uno o más constructos de ADN que comprenden una proteína Cas9 catalíticamente inactiva y uno o más ARN de guía única (ARNgu) para la represión transcripcional del uno o más genes cas en la cepa parental de Streptococcus thermophilus. El gen que codifica la proteína Cas9 catalíticamente inactiva y un ARN de guía único personalizable (ARNgu) se coexpresan, y el complejo Cas9-ARNgu puede unirse a elementos de ADN complementarios al ARNgu y puede causar un bloqueo estérico que detiene el alargamiento del transcrito por la ARN polimerasa, lo que da como resultado la represión del gen cas9. Se ha demostrado que este método es capaz de reprimir genes diana, por ejemplo en Escherichia coli (Qi. S. et al. (2013) Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression Cell. Feb 28; 152(5): 1173-83). Este sistema, que se denomina interferencia de CRISPR (CRISPRi) por Qi L.S. et al., puede reprimir eficazmente la expresión de genes diana en Escherichia coli, sin efectos detectables fuera de la diana. CRISPRi se puede usar para reprimir múltiples genes diana simultáneamente, y sus efectos son reversibles.
Etapa b) - La exposición de la cepa parental obtenida en la etapa a) a un bacteriófago puede llevarse a cabo en cualquier medio adecuado, por ejemplo en una disolución acuosa tal como una disolución acuosa amortiguada o en un medio de agar blando o en leche. En una realización preferida, la exposición de la cepa parental a un bacteriófago se lleva a cabo en un medio de agar blando. En otra realización preferida, la exposición de la cepa parental a un bacteriófago se lleva a cabo en leche. La leche se puede incubar durante la noche o hasta que se observe coagulación. La cepa parental utilizada en el método de la invención puede tratarse previamente para aumentar la diversidad genética y aumentar el número de los BIMs. Este pretratamiento se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis química o mediante irradiación con luz UV. La cepa parental - opcionalmente pretratada - puede exponerse a un tipo de bacteriófago o a múltiples bacteriófagos diferentes, por ejemplo, a 2, 3, 4 o 5 tipos diferentes de bacteriófagos.
Etapa (c) - La suspensión o la leche incubada (coagulada) obtenida en la etapa (a) del método de la invención se puede sembrar en placas de agar. Después de incubar las placas de agar a una temperatura a la que puede crecer Streptococcus thermophilus, pueden aparecer colonias que representan los BIMs. Las colonias se pueden purificar para obtener un BIM de una sola cepa según métodos conocidos en la técnica.
Etapa (d) - En la etapa (d) del método de la invención, los loci de CRISPR de los BIMs obtenidos en la etapa (c) del método de la invención se analizan para determinar su longitud (en pares de bases) y/o se secuencian y se comparan con los loci de CRISPR de la cepa parental sensible a bacteriófagos.
Etapa (e) - En la etapa (e) del método de la invención solo se seleccionan aquellos BIMs de los cuales los loci de CRISPR son idénticos a los loci de CRISPR de la cepa parental. La ventaja del método de la invención es que los BIMs seleccionados han adquirido un mecanismo de resistencia a fagos que es diferente de CRISPR, y por lo tanto se basa en un mecanismo de resistencia a fagos alternativo. Como resultado, los BIMs obtenidos mediante el método de la invención tienen una resistencia a fagos más estable en comparación con un BIM de CRISPR del cual se sabe que los fagos pueden evolucionar rápidamente para superar estas adiciones de espaciadores mediante alteraciones de un solo nucleótido en la región genómica apropiada.
En otra realización del método de la invención, el uno o más constructos de ADN que se introdujeron en la etapa a) del método de la invención se pueden eliminar después de la etapa e). La ventaja de esta etapa es que el mecanismo de defensa CRISPR vuelve a ser activo contra los bacteriófagos.
La cepa parental de Streptococcus thermophilus usada en el método de la invención puede ser sensible o insensible al bacteriófago, tal como insensible debido a la adición previa de un espaciador CRISPR. En el caso de una cepa parental sensible, la inactivación del mecanismo de defensa CRISPR evita la formación de BIMs de CRISPR en la etapa b) del método de la invención. En el caso de la cepa parental insensible (tal como debido a la adición previa de un espaciador CRISPR), la cepa parental primero se vuelve sensible mediante la inactivación del mecanismo de defensa CRISPR, que entonces también previene la formación de fagos que han superado el mecanismo de defensa mediado por CRISPR en la etapa b) del método de la invención. Esto puede conducir a un BIM que sea resistente a uno o más fagos mediante mecanismos tanto CRISPR como no CRISPR.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un mutante insensible a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus, en el que la cepa parental se depositó como CBS 138555 o como CBS 139996, en el que los loci de CRISPR del mutante insensible a bacteriófagos son idénticos a los loci de CRISPR de la cepa parental de Streptococcus thermophilus, y que se pueden obtener mediante el método del primer aspecto de la invención.
Alternativamente, la presente invención se refiere a un mutante insensible a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus, en el que la cepa parental se depositó como CBS 138555 o como CBS 139996, en el que los loci de CRISPR del mutante insensible a bacteriófagos no son idénticos a los loci de CRISPR de la cepa parental de Streptococcus thermophilus, y mutante insensible a bacteriófagos el cual comprende además un mecanismo de resistencia a bacteriófagos no mediado por CRISR. Preferiblemente, el mecanismo de resistencia a bacteriófagos no mediado por CRISPR no es un sistema de modificación de restricción. Preferiblemente, el mecanismo de resistencia a bacteriófagos no mediado por CRISPR es un mecanismo de resistencia derivado de Streptococcus thermophilus, o preferiblemente derivado de la cepa parental de Streptococcus thermophilus. La ventaja de utilizar mecanismos de resistencia tanto CRISPR como no CRISPR en un BIM es una resistencia mejorada a los fagos. Los llamados BIMs de “doble obstáculo” tienen una resistencia a fagos más amplia, es decir, una defensa contra varios bacteriófagos diferentes. Además, los BIMs de doble obstáculo tienen una mayor robustez frente a los fagos, mostrando resistencia durante varias rondas de exposición a un bacteriófago.
En una realización preferida, el presente mutante insensible a bacteriófagos tiene una velocidad de sedimentación aumentada (o un peso de pelete aumentado) y/o una formación de cadena aumentada en comparación con la cepa parental de Streptococcus thermophilus. Preferiblemente, el presente mutante insensible a bacteriófagos tiene un aumento de peso de pelete de al menos 10% del peso de pelete de la cepa parental, más preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 100%, preferiblemente al menos 150%, más preferiblemente al menos 200%, más preferiblemente al menos 250%, incluso más preferiblemente al menos 300%, y lo más preferible al menos 350% del peso de pelete de la cepa parental. Preferiblemente, el presente mutante insensible a bacteriófagos tiene un aumento porcentual de la longitud de cadena promedio o de células promedio por cadena (CPC) de al menos 50%, más preferiblemente al menos 100%, preferiblemente al menos 150%, más preferiblemente al menos 200%, más preferiblemente al menos 250%, incluso más preferiblemente al menos 300%, y lo más preferible al menos 350% de las CPC promedio de la cepa parental.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la producción de un producto lácteo tal como un producto lácteo fermentado o queso, que comprende el uso de uno o más de los mutantes insensibles a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus sensible a bacteriófagos, en el que la cepa parental se depositó como CBS 138555 o como CBS 139996, como se describe aquí anteriormente.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona el uso del mutante insensible a bacteriófagos derivado de una cepa parental de Streptococcus thermophilus sensible a bacteriófagos, en el que la cepa parental se depositó como CBS 138555 o como CBS 139996, como se describe aquí anteriormente, en un procedimiento para la producción de un producto lácteo, tal como leche fermentada o queso.
Leyendas de las figuras
Figura 1 - Preparaciones plasmídicas de la cepa 100-E de S. thermophilus y derivados. Líneas 1, 10: Escalera de ADN de escala completa de 1 kb (Fisher Scientific, U.S.A.), L2: progenitor 100-E, L3: BIM100-E-D1A-L7, L4: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44, L5: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas7i, L6: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i, L7: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i (curado), L8: BIM100-E-D1A-L5, L9: BIM100-E-D1A-L5::pNZ44+100-ECas9i.
Figura 2 - Amplificación por PCR de las regiones MCS de pNZ44. Líneas 1, 12: Escalera de ADN de escala completa de 1 kb, L2: ADN plasmídico de pNZ44 (control positivo; indicado por una flecha), L3: progenitor 100-E, L4: BIM100-E-D1A-L7, L5: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44, L6: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas7i, L7: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i, L8: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i (curado), L9: BIM100-E-D1A-L5, L10: BIM100-E-D1A-L5::pNZ44+100-ECas9i, L11: Control negativo.
Figura 3 - Obtención de la huella digital mediante RAPD con GTG de cepas parentales de S. thermophilus, BIMs y transformantes utilizados en este estudio. Línea 1: Escalera de ADN de escala completa de 1 kb (, L2: progenitor 100-E, L3: 100-E::pNZ44+100-ECas7i, L4: 100-E::pNZ44+100-ECas9i, L5: BIM100-E-D1A-L7, L6: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44, L7: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas7i, L8: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i, L9: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i (curado), L10: BIM100-E-D1A-L5, L11: BIM100-E-D1A-L5::pNZ44+100-ECas9i, L12: Control negativo.
Figura 4 - Amplificación por PCR de loci de CRISPR (C1, C2, C3) de la cepa 100-E de S. thermophilus y sus derivados. Línea 1: Escalera de ADN de escala completa de 1 kb, L2: progenitor 100-E C1, L3: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i C1, Líneas 4, 7 y 10: controles negativos, L5: progenitor 100-E C2, L6: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i C2, L8: progenitor 100-E C3, L9: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i C3.
Figura 5 - Sedimentación observada de la cepa progenitora 100-E de S. thermophilus (a) y sus BIMs derivados. (b) BIM100-E-D1A-L-7 (CRISPR BIM), (c) BIM100-E-D1A-L-5 (no-CRISPR BIM).
Figura 6 - Imágenes representativas de cadenas celulares de S. thermophilus 100-E (y BIMs derivados) visualizadas mediante microscopía de barrido láser confocal. (a) 100-E WT, (b) BIM100-E-D1A-L7, (c) BIM100-E-D1A-L5, (d) BIM100-E-DH51, (e) BIM100-E-DH61.
Figura 7 - Amplificación por PCR de las regiones MCS de pNZ44. Línea 1: Escalera de ADN de escala completa de 1 kb, L2: ADN plasmídico de pNZ44 (control positivo), L3: control negativo, L4: 100-E WT, L5: BIM100-E-D1A-L7, L6: BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas7i, L7: BIM100-E-DH51, L8: BIM100-E-DH61.
Figura 8 - Perfil de sedimentación observado de S. thermophilus 100-E y BIMs derivados. (a) 100-E WT, (b) BIM100-E-D1A-L7, (c) BIM100-E-DH51, (d) BIM100-E-DH61.
Figura 9 - Obtención de la huella digital mediante RAPD con GTG de la cepa parental 100-E de S. thermophilus y BIMs derivados. Línea 1; 8: Escala de ADN de escala completa de 1kb, L2: 100-E WT, L3: BIM100-E-D1A-L5, L4: BIM100-E-D1A-L7, L5: BIM100-E-DH51, L6: BIM100-E-DH61, L7: control negativo.
Figura 10 - Obtención de la huella digital mediante RAPD con GTG de la cepa parental 100-F de S. thermophilus y transformantes. Línea 1: Escalera de ADN de escala completa de 1 kb, L2: 100-F WT, L3: BIM100-F-NGBD1A-L2, L4: BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44, L5: BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i, L6: BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i (curado), L7: control negativo.
Figura 11 - Amplificación por PCR de las regiones MCS de pNZ44. Líneas 1: Escalera de ADN de escala completa de 1 kb, L2: ADN plasmídico de pNZ44 (control positivo), L3: control negativo, L4:100-F WT, L5: BIM100-F-NGBD1A-L2, L6: BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44, L7: BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i, L8: BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i (curado).
Figura 12 - Obtención de la huella digital mediante RAPD con GTG de la cepa parental 100-F de S. thermophilus y transformantes. Línea 1; 8: Escalera de ADN de escala completa 1 kb, L2: 100-F WT, L3: 100-FWT::pNZ44 (control plasmídico), L4: 100-F::pNZ44+100-FCas7i, L5: 100-F::pNZ44+100-F2Casi, L6: 100-F::pNZ44+100-F2CasSWi, L7: control negativo.
Figura 13 - Amplificación por PCR de las regiones MCS de pNZ44. Línea 1: Escalera de ADN de escala completa de 1 kb, L2: 100-F WT, L3: control negativo, L4: ADN plasmídico de pNZ44 (control positivo), L5: 100-FWT::pNZ44 (control plasmídico), L6: 100-F::pNZ44+100-FCas7i, L7: 100-F::pNZ44+100-F2Casi, L8: 100-F::pNZ44+100-F2CasSWi.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Condiciones de crecimiento bacteriano
Cepas individuales de S. thermophilus se cultivaron habitualmente a partir de lotes de leche desnatada reconstituida (RSM) al 20%, lotes de glicerol al 20% (Sigma Aldrich, Alemania) o de una sola colonia durante la noche (ON) a 42°C en Caldo M17 (Oxoid, Reino Unido) suplementado con lactosa al 0,5% (LM17) o en placas que contienen agar técnico 10 g/l (Merck, Alemania). En ensayos de recuento de fagos, adaptado de Lillehaug, D. ((1997) An improved plaque assay for poor plaque-producing temperate lactococcal bacteriophages. J Appl Microbiol, 83, 85-90). El caldo LM17 se complementó con glicina al 0,25% (Oxoid, Reino Unido), CaCl210 mM (Oxoid, Reino Unido) y agar técnico de 10 g/l (base de agar sólido) o 4 g/l (recubrimiento semisólido). El agar semisólido se esterilizó en autoclave a 121 °C durante 15 minutos o hirviéndolo durante 7 minutos en un microondas, mientras que el agar sólido se hirvió durante 7 minutos en un microondas. L. lactis NZ9000 se mantuvo como anteriormente con las siguientes modificaciones: los cultivos durante la noche (ON) se hicieron crecer a 30°C con la sustitución de glucosa (Sigma-Aldrich, Alemania) en lugar de lactosa. Todos los transformantes se mantuvieron como anteriormente con la adición de cloranfenicol (Sigma-Aldrich, Alemania) hasta una concentración final de 5 mg/ml (L/GM17 Cm5).
2. Aislamiento y selección de bacteriófagos
Se obtuvieron y analizaron muestras de suero de plantas lácteas que producen productos lácteos fermentados para detectar la presencia de fagos contra S. thermophilus 100-E usando el ensayo de manchas descrito a continuación en “Ensayos de bacteriófagos”. Las placas individuales definidas se aislaron mediante purificación de dos placas únicas sobre superposiciones semisólidas. Después, los fagos se propagaron como sigue: se inocularon 10 ml de caldo LM17 (1%) con un cultivo ON reciente de la cepa hospedante apropiada, y se incubaron a 42°C durante 1,0­ 2,5 horas. Después, se añadió una sola placa al cultivo en crecimiento, se mezcló bien, y se incubó durante 2-4 horas más. El cultivo lisado se centrifugó, y el sobrenadante se filtró (0,45 mm). El sobrenadante filtrado se utilizó como lote de fagos para ensayos posteriores. La Tabla 1 resume los fagos que se obtuvieron de esta manera.
Tabla 1. Una lista de cepas y fagos usados en este estudio
Cepa Descripción Fuente Streptococcus thermophilus 100-E Cepa parental DSM, Países Bajos L. lactis NZ9000 Vector de transformación a) BIM100-E-D1A-L7 BIM mediado por CRISPR UCC, Cork, Irlanda BIM100-E-D1A-L5 BIM no CRISPR
BIM100-E-DH51 BIM de doble obstáculo
BIM100-E-DH61 BIM de doble obstáculo
Streptococcus thermophilus 100-F Cepa parental DSM, Países Bajos BIM100-F-NGBD1A-L2 BIM mediado por CRISPR UCC, Cork, Irlanda Fago Descripción Fuente j100-E-D1A-L Fago virulento de S. thermophilus 100-E DSM, Países Bajos j100-E-D2A-L “
j100-E-D3A-L “
j100-E-D4A-L “
jSTV84-D1A-L Fago virulento de S. thermophilus 100-F
jSTV88-D1A-L “
jNGB-D1A-L “
a) Fernandez, L., et al (2000). Cloning, characterization, controlled overexpression, and inactivation of the major tributyrin esterase gene of Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol, 66, 1360-1368.
Streptococcus thermophilus 100-E = DS64900 se depositó el 15 de julio de 2014 en la Centraal Bureau for Schimmelcultures, Uppsalalaan 8, 3508 AD en Utrecht, Países Bajos, y recibió el número de depósito CBS138555. Streptococcus thermophilus 100-F = DS64985 se depositó el 6 de mayo de 2015 en la Centraal Bureau for Schimmelcultures, Uppsalalaan 8, 3508 AD en Utrecht, Países Bajos, y recibió el número de depósito CBS139996.
3. BIMs de S. thermophilus 100-E y 100-F
Se generaron BIMs contra el fago j100-E-D1A-L mediante la adición de 500 pl de cultivo ON reciente de S. thermophilus 100-E y 10 a 100 pl de lisado de fagos sin diluir como se indica (fagos aislados de una sola placa, título aprox. 1 x 10345*7 ufp/ml) a 4 ml de agar LM17 blando, seguido de la extensión de esta suspensión sobre agar sólido. En el caso de 100-F, y cuando se aislaron BIMs insuficientes usando incubación ON, la cantidad de cultivo añadida se aumentó a 1000 pl y la cantidad de lisado de fagos a 100 pl. Las colonias, que representan posibles BIMs, que crecen en la capa superior, se purificaron dos veces en una sola colonia y se sometieron a ensayos de fagos y secuenciación CRISPR como se describe a continuación. Para 100-E, se obtuvieron así dos BIMs y seleccionaron para la caracterización (véase más abajo): S. thermophilus BIM100-E-D1A-L5 y BIM100-E-D1A-L7. También se generaron de esta manera otros dos BIMs, derivados de BIM100-E-D1A-L7 (BIM100-E-DH51 y BIM100-E-DH61; Tabla 1). Todos los BIMs de 100-F (Tabla 1) se generaron de esta manera, con las modificaciones indicadas anteriormente. Cuando se generó un número insuficiente de BIMs utilizando este método, el procedimiento se repitió utilizando la cepa WT o la cepa transformada apropiada hasta que se aisló un número aceptable de BIMs.
4. Ensayos de bacteriófagos
Los ensayos de manchas se realizaron sembrando la capa de agar semisólido LM17 con 500 pl de cultivo ON reciente y aplicando 10 pl de lisado de fagos en un formato de cuadrícula, como se describe por Dupont, K., et al, J. (2005) (Detection of lactococcal 936-species bacteriophages in whey by magnetic capture hybridization PCR targeting a variable region of receptor-binding protein genes. J Appl Microbiol, 98, 1001-1009). A continuación, las placas se dejaron secar y se incubaron anaeróbicamente ON a 42°C. Se asumió que una zona clara indicaba la lisis mediada por fagos del césped bacteriano por el fago aplicado y se registró como “+”, mientras que la ausencia de lisis se registró como “-”.
Para el recuento de fagos, se realizaron ensayos de placa añadiendo 500 pl de cultivo y 10 pl de lisado de fagos puro o diluido apropiadamente a 4 ml de agar semisólido, seguido del cultivo en placas de agar LM17 como se describió anteriormente con incubación posterior ON a 42°C. La eficacia de la formación de placas (EOP) se calculó dividiendo el título obtenido de un fago dado en la cepa de ensayo entre el título del mismo fago en la cepa parental.
5. Cribado por PCR y secuenciación del locus de CRISPR
Todos los BIMs generados se sometieron a estudios de perfil por PCR para confirmar su relación con la cepa parental relevante de la que derivaron, ya sea por PCR mediante RAPD o mediante secuenciación del locus de CRISPR. La PCR mediante RAPD se realizó en colonias individuales de cada cepa parental y BIM como plantilla para la reacción, y utilizando el cebador de perfil ‘(GTG)5’ RAPD (Gevers, D., et al. (2001). Applicability of rep-PCR fingerprinting for identification of Lactobacillus species. FEMS Microbiol Lett, 205, 31-36). Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 952C x 10 min, seguido de 30 ciclos de 952C x 15 s, 40°C x 30 s, y 72°C durante 8 min, con una etapa de extensión final de 72°C durante 16 min.
Los BIMs generados se purificaron, y los loci de CRISPR se amplificaron mediante PCR y se secuenciaron para determinar adquisiciones o alteraciones en el contenido del espaciador de los BIMs. Las matrices de repeticiones/espaciadores CRISPR-1, CRISPR-2 y CRISPR-3 para cada cepa se amplificaron individualmente utilizando una sola colonia de la cepa adecuada como material de plantilla para la PCR y los cebadores descritos anteriormente por Horvath, P et al. (2008). Diversity, activity and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. Journal of bacteriology, 190, 1401-1412). Los cebadores que se dirigen al locus de CRISPR4 de 100-F se diseñaron específicamente para esta cepa, ya que no hay ningún homólogo de CRISPR4 presente en 100-E. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 95°C x 10 min, seguido de 30 ciclos de 95°C x 15 s, 55°C x 15 s, y 72°C durante 2 min 45 s (CRISPR-1) o 1 min 10 s (CRISPR-2, CRISPR-3 y CRISPR-4), con una etapa de extensión final de 72°C durante 10 min.
Los productos generados por PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1% (Fisher Scientific, USA) y se purificaron usando un kit de centrifugación de purificación de PCR (Genomed, Alemania). MWG Biotech realizó la secuenciación de Sanger (de todos los productos de PCR y plásmidos) para verificar la integridad de todos los constructos plasmídicos y para comparar las secuencias de los loci de CRISPR de los BIMs con las de la cepa parental correspondiente (Eurofins, Alemania). Para los loci de CRISPR, esto se realizó mediante secuenciación dirigida utilizando cebadores sintéticos basados en un espaciador único de cada matriz de repetición/espaciador en las regiones internas de las secuencias de los loci de CRISPR, cuando fuera necesario. Las CRISPRs se ensamblaron utilizando el programa Seqman (DNAstar), y las matrices CRISPR se visualizaron utilizando el programa buscador de CRISPR en línea (http://crispr.u-psud.fr).
Tabla 2. Cebadores de PCR utilizados en este estudio
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6. Preparación de células competentes
Las células competentes se prepararon como se describe por Holo y Nes ((1989). High-Frequency Transformation, by Electroporation, of Lactococcus lactis subsp. cremoris Grown with Glycine in Osmotically Stabilized Media. Appl Environ Microbiol, 55, 3119-3123), con las siguientes modificaciones: Una serie de tubos que contienen 10 ml de caldo LM17 o GM17 (para L. lactis) y concentraciones variables (de 0,2% a 2,4%) ya sea de glicina (Sigma-Aldrich, Alemania) o treonina (Sigma-Aldrich, Alemania) se prepararon y se inocularon (1%) con un cultivo ON reciente. Los tubos se incubaron a 42°C ON, y se examinaron para determinar su crecimiento. Para preparar células competentes se usó caldo LM17 que contenía sacarosa al 0,5% (Sigma-Aldrich, Alemania; SLM17) suplementado con el nivel más alto de glicina o treonina tolerado por las cepas. Posteriormente, se inocularon (2%) 50 ml de caldo SLM17 o SGM17 suplementado con 1% de glicina (NZ9000), 2% (100-E) o 0,8% (100-F) de treonina, con la cepa apropiada, y se incubaron hasta que se alcanzó una OÜ600nm de aproximadamente 0,5. En el caso de 100-E, se añadió ampicilina (Sigma-Aldrich, Alemania) hasta una concentración final de 20 mg/ml, y la incubación continuó durante 1 hora más. Todas las etapas desde este punto en adelante se realizaron a 4°C o en hielo. Las células se centrifugaron a 4500 rpm durante 15 minutos para peletizarlas, y se desechó el sobrenadante. A continuación, las células se lavaron dos veces en 15 ml de disolución helada de sacarosa 0,5 M/glicerol al 10% (Sigma-Aldrich, Alemania; SG). Finalmente, las células se resuspendieron en 1 ml de SG, y se almacenaron inmediatamente alícuotas de 100 ml a -80°C hasta la electrotransformación como se describe a continuación.
7. Construcción de vectores plasmídicos antisentido
Los cebadores de PCR utilizados para amplificar cas7, csn2 o cas9 a partir de S. thermophilus 100-E o 100-F se enumeran en la Tabla 2, y se diseñaron para incorporar todo el gen relevante, incluyendo la secuencia de Shine-Dalgarno (SD). Para asegurarse de que se produjo un producto antisentido, todos los genes cas se clonaron en el plásmido pNZ44 (que contiene un marcador de gen de resistencia al cloranfenicol) en la orientación inversa con respecto al promotor p44, como se describe por McGrath, et al. (2001). En el caso de pNZ44 100-F2Casi, el gen csn2 se clonó directamente detrás del promotor p44, seguido de cas7, mientras que en el constructo pNZ44 100-F2CasSWi, cas7 se clonó directamente detrás del promotor p44, seguido de csn2. En primer lugar, el producto del gen cas apropiado se amplificó por PCR a partir de S. thermophilus 100-E o 100-F. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 95°C x 10 min, seguido de 30 ciclos de 95°C x 15 s, 55°C x 15 s, y 72°C durante 3 min 15 s (cas9) o 1 min 10 s (cas7, csn2), con una etapa de extensión final de 72°C durante 10 min. A continuación, los productos se purificaron usando el kit de purificación de productos de PCR JetQuick (Genomed, Alemania). El ADN del plásmido pNZ44 se aisló de Lactococcus lactis NZ9000 :: pNZ44 utilizando el kit Miniprep de plásmido GeneJet (Thermo Scientific, U.S.A.). Los productos de PCR y el plásmido se restringieron por separado ON a temperatura ambiente (RT) usando las enzimas de restricción (Roche, Alemania) PstI y NcoI (cas7 derivado de 100-E) o XbaI (cas9 derivado de 100-E). La mezcla de reacción fue la siguiente: 50 pl de plásmido/producto, 2 pl de cada enzima de restricción, 20 pl de amortiguador H (Roche, Alemania), 126 pl de H2O). Los productos restringidos se sometieron a examen electroforético para comprobar su integridad y estimar cantidades relativas (para la ligación, se consideró ideal una relación aproximada de inserto a vector de 4:1). La ligación del inserto y el vector se realizó incubando 1 pl de T4 ADN ligasa (Roche, Alemania), 1 pl de amortiguador de ligasa (Roche, Alemania), 6 pl de inserto y 2 pl de vector, ON a RT. Para los constructos pNZ44+100-F2Casi y pNZ44+100-F2CasSWi, se usaron 3 pl de cada inserto apropiado en la reacción de ligación. Los constructos antisentido utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 3.
Tabla 3. Constructos antisentido utilizados en este estudio
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8. Electrotransformación y selección de transformantes
Antes de la transformación, los constructos se dializaron usando filtros de membrana MF de 0,025 pm (Merck Millipore, Alemania) durante 10 minutos contra agua estéril desionizada (sdH2O). Todos los constructos se generaron en L. lactis NZ9000 antes de su posterior transferencia a S. thermophilus 100-E o 100-F. La electrotransformación se realizó usando células competentes recién preparadas como se describió anteriormente, con las siguientes modificaciones: las células competentes se descongelaron en hielo durante 5 minutos, se añadieron 10 pl de constructo, y la disolución se mezcló suavemente. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 2 mm preenfriada (Cell Projects, Reino Unido) y se sometió a electroporación en las siguientes condiciones: 1,75 kV (S. thermophilus) o 2,0 kV (L. lactis)/200 ohmios/25 pF. Se añadieron inmediatamente 950 pl de caldo de recuperación (LM17 o GM17 con la adición de MgCl220 mM y CaCl22 mM (Sigma-Aldrich, Alemania)), y las células transformadas se recuperaron a 30°C (L. lactis) o 42°C (S. thermophilus) durante 2,5 horas. 100 pl de células transformadas sin diluir, y, cuando sea apropiado, diluidas, se sembraron en placas de selección de antibióticos (LM17 o GM17 que contenían 5 pg/ml de cloranfenicol (Sigma-Aldrich, Alemania); L/GM17 Cm5), y se incubaron ON a la temperatura apropiada.
Las colonias que representan transformantes potenciales se seleccionaron mediante PCR utilizando un cebador directo diseñado en dirección 5’ del sitio de clonación múltiple (MCS) del plásmido pNZ44 y el cebador de inserto “directo” apropiado (Tabla 2), para reducir la incidencia de detección de falsos positivos. Los supuestos transformantes se purificaron en placas de agar LM17 Cm5 y se sometieron a secuenciación CRISPR, ensayos de sensibilidad a fagos (como se describió anteriormente) y secuenciación de plásmidos, que se realizó utilizando cebadores diseñados fuera del MCS de pNZ44 (pNZ44fwd y rev; Tabla 2).
9. Curado de plásmidos
Con el fin de curar los vectores de pNZ44 y de derivados de pNZ44 introducidos, los transformantes seleccionados se sometieron a cuatro pasadas ON a 42°C en LM17 sin la adición de cloranfenicol. A continuación, los cultivos nocturnos se diluyeron en serie diez veces en una disolución de Ringer de % de concentración (Merck, Alemania), o se realizó un rayado en placa, y se evaluó la sensibilidad de las colonias individuales al cloranfenicol mediante el rayado en placas de agar LM17 Cm5. Las colonias rayadas que no mostraron crecimiento en LM17 Cm5 pero que crecieron en LM17 se definieron como presuntos transformantes curados y se sometieron a validación por PCR CRISPR y preparación plasmídica como se describe anteriormente.
10. Ensayos de sedimentación
Las cepas de S. thermophilus se cultivaron rutinariamente a partir de lotes de glicerol al 10%, lotes de leche desnatada reconstituida (RSM) al 20%, o de colonias individuales durante la noche a 42°C en caldo LM17 (como se describe en la sección 1 de los MATERIALES Y MÉTODOS). Las cepas parentales y los BIMs se trataron de forma idéntica y, después de incubar durante la noche a 42°C, se realizó una evaluación visual de los cultivos para observar las características de crecimiento de los cultivos en caldo. El fenotipo se consideró relevante solo si se observó de manera consistente que los cultivos sedimentaban en la base del tubo o a lo largo de la pared del mismo. En todos los casos, se observó que la cepa parental sedimentaba en un grado marcadamente reducido después del crecimiento durante la noche. Para el ensayo de densidad óptica, la OD600nm de 1 ml de cada cultivo (tomado de la parte superior del tubo de ensayo) después de la incubación ON se midió usando un espectrofotómetro DU 730 (Beckman Coulter, U.S.A.).
11. Ensayos microscópicos
La evaluación morfológica y la comparación de las cepas parentales y los BIMs derivados se realizaron mediante montaje en húmedo. Se colocaron 5 pl de cultivo reciente nocturno en un portaobjetos de vidrio (por duplicado), y se colocó inmediatamente un cubreobjetos encima de la muestra. Después, cada muestra se visualizó con un aumento de 63X usando un microscopio de barrido láser confocal y un Zeiss LSM 5 Exciter (Carl Zeiss, Jena, Alemania; excitación 488 nm). El porcentaje de aumento en la longitud de la cadena o de células por cadena (CPC) de BIMs derivados con respecto a las cepas parentales se calculó en primer lugar determinando el número medio de células individuales por cadena en todas las muestras contando al menos 20 cadenas por cepa. El aumento medio de longitud se expresó entonces como un porcentaje utilizando la siguiente fórmula: (CPCmutante - CPCparental)/CPCparental x 100%). En este y en todos los casos, se utilizó la prueba de la t de Student para datos no apareados para determinar diferencias significativas entre los conjuntos de datos de la cepa parental y de los BIMs derivados.
12. Ensayo de Heap Lawrence
La robustez de la resistencia a los fagos se evaluó usando un ensayo denominado “Heap-Lawrence” como sigue. Se preparó un cultivo durante la noche (ON) de las cepas a evaluar (tipo salvaje más BIMs) inoculando 250 pl de RSM al 10% con 50 ul de cultivo madre, y se incubó O/N a 42°C. Al día siguiente, el cultivo ON se diluyó 5 veces con RSM al 10% reciente, se añadieron 50 pl de cultivo diluido a un MTP que contenía 650 pl de RSM al 10%. Se dejó que las células crecieran durante 1 hora, y entonces se añadió un lisado de fago de título elevado. La cepa y el fago se incubaron a 42°C. La acidificación se monitorizó después de 6-8 h, tras lo cual las cepas y los fagos se dejaron ON. Al día siguiente, las MTPs se centrifugaron a 4000 rpm durante 10 minutos, y el sobrenadante, que contenía los fagos, se transfirió a un tubo greiner. Parte del sobrenadante se mezcló 1:1 con lisado de fagos en un tubo nuevo. Esta mezcla de fagos se usó entonces como fuente de fagos en otra ronda de Heap-Lawrence como se describió para el día 2. El procedimiento se repitió durante muchos ciclos, permitiendo así que los fagos se adaptaran a superar la resistencia a fagos de la cepa. Al monitorizar el número de ciclos que necesita un fago para volverse virulento (indicado por la incapacidad de las cepas para acidificar la leche) se obtiene una indicación de la robustez frente a los fagos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Silenciamiento CRISPR de cepas parentales y de mutantes insensibles a bacteriófagos (BIMs) de S. thermophilus 100-E
1. Silenciamiento de cas9 en BIMs de S. thermophilus 100-E
1.1. Generación y análisis de CRISPR de 100-E y de BIMs no CRISPR
Bacteriófagos contra S. thermophilus 100-E (4 en total) y BIMs contra estos fagos se aislaron como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Dos BIMs, S. thermophilus BIM100-E-D1A-L5 y BIM100-E-D1A-L7, se seleccionaron para análisis adicionales mediante ensayo de placa y secuenciación CRISPR, cuyos resultados se muestran en las Tablas 4 y 5, respectivamente.
Tabla 4. Eficiencias relativas de formación de placas (EOP) de fagos de la cepa 100-E de Streptococcus thermophilus y de BIMs derivados.
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Tabla 5: Sumario del contenido de loci de repetición/espaciador CRISPR en la cepa 100-E de S. thermophilus y BIMs derivados.
Figure imgf000012_0001
Los resultados anteriores muestran que los mecanismos responsables de la resistencia a j100-E-D1A-L en BIM100-E-D1A-L5 y BIM100-E-D1A-L7 son diferentes.
BIM100-E-D1A-L5 se puede definir como un “BIM no CRISPR” debido al hecho de que el locus de repetición/espaciador CRISPR es 100% idéntico a la cepa parental en los tres loci secuenciados (tabla 5), combinado con la aparente ausencia de cualquier loci de CRISPR-Cas adicional en el genoma secuenciado completo. Además, el perfil de sedimentación (Figura 5; Tabla 11), tipificado aquí (y en todos los casos) por agregación celular en la parte inferior del tubo de cultivo ON, y el aumento relativo de la longitud de la cadena celular (Figura 6; Tabla 10) indican que este BIM ha sufrido una mutación en un receptor de fagos que es un componente de la envoltura celular.
En el caso de BIM100-E-D1A-L7, se concluyó que el mecanismo CRISPR confería insensibilidad a j100-E-D1A-L, debido a la adición de un espaciador en el extremo líder del locus de repetición/espaciador CRISPR1 (Tabla 5). Este espaciador de 30 pb mostró una homología del 100% con una región que abarca el codón de inicio de un gen que codifica una proteína recombinasa RecT en el genoma del fago j100-E-D1A-L, que se usó en la exposición. Este segmento exacto de 30 pb no se encontró en los genomas de ninguno de los otros tres fagos que infectan S. thermophilus 100-E (datos no mostrados). Esta conclusión está respaldada por la ausencia total en BIM100-E-D1A-L7 del perfil de sedimentación distintivo (Figura 5; Tabla 11), y el aumento de la longitud de la cadena celular (Figura 6, Tabla 10), indicativo de una mutación en un componente de la envoltura celular (como se ve en BIM100-E-D1A-L5 y en los BIMs de doble obstáculo a continuación).
1.2. Transformación, curado y sensibilidades a fagos de BIM100-E-D1A-L5 y BIM100-E-D1A-L7
S. thermophilus BIM100-E-D1A-L5 y BIM100-E-D1A-L7 se transformaron utilizando pNZ44+100-ECas9i y pNZ44, pNZ44+100-ECas7i y pNZ44+100-ECas9i, recién aislados, respectivamente, y los transformantes potenciales se seleccionaron usando la PCR confirmatoria como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Cuatro presuntos transformantes, BIM100-E-D1A-L5::pNZ44+100-ECas9i (control sin CRISPR), BIM100-E-D1A-L7::pNZ44 (control plasmídico), BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas7i (para uso en la generación de BIMs de “doble obstáculo”, véase la sección 1.3) y BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i (prueba de principio), se seleccionaron para validación y análisis adicional.
BIM100-E-D1A-L5::pNZ44+100-ECas9i y BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i se sometieron a preparación plasmídica (Figura 1), PCR de MCS de pNZ44 (Figura 2), PCR de tipaje mediante RAPD con GTG (Figura 3) y PCR de CRISPR (Figura 4), seguido de secuenciación, así como a secuenciación plasmídica con fines de validación y como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. El examen electroforético de la preparación plasmídica (Figura 1) mostró claramente que el ADN plasmídico, que se supone que es pNZ44+100-ECas9i, se había introducido en BIM100-E-D1A-L5 y BIM100-E-D1A-L7 en comparación con la cepa parental y los BIMs originales que no mostraron plásmidos nativos o introducidos. El MCS de pNZ44, tanto en el constructo plasmídico original como en el antisentido, también se amplificó (Figura 2) y mostró una clara diferencia de tamaño, correspondiendo la diferencia al tamaño del gen cas9 de S. thermophilus 100-E. El ADN plasmídico purificado se sometió posteriormente a secuenciación como se describe en los MATERIALES Y MÉTODOS, y mostró la adición del gen cas9 de S. thermophilus 100-E en la orientación inversa entre los sitios de restricción PstI y XbaI en el vector plasmídico pNZ44 en ambos transformantes. Finalmente, se amplificaron los loci de CRISPR de BIM100-E-D1A-L5::pNZ44+100-ECas9i y BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i (Figura 4) y se sometieron a secuenciación. El contenido de espaciador CRISPR de cada transformante fue 100% idéntico a cada BIM original respectivo, lo que confirma la derivación directa.
Los transformantes BIM100-E-D1A-L5::pNZ44+100-ECas9i y BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i se sometieron a ensayos de sensibilidad a fagos como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS, cuyos resultados se muestran en la Tabla 6. Los resultados muestran claramente la supresión de la resistencia adquirida a fagos de BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i, a pesar de la retención del espaciador CRISPR extra eficaz mencionado anteriormente. Esta supresión de la resistencia no se observó para BIM100-E-D1A-L5::pNZ44+100-ECas9i, destacando la independencia de CRISPR1 del mecanismo de resistencia a fagos de BIM100-E-D1A-L5.
Tabla 6. Eficiencias relativas de de formación de placas (EOP) de fagos de la cepa 100-E, BIM derivado y transformante de Streptococcus thermophilus.
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A continuación, el transformante BIM100-E-D1A-L7::pNZ44+100-ECas9i se sometió a curado plasmídico como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Tras el examen electroforético, el derivado curado mostró un contenido de plásmido idéntico al del S. thermophilus 100-E parental y BIMs originales (es decir, sin plásmidos nativos o introducidos; Figura 1). El derivado curado se sometió entonces a ensayos de sensibilidad a fagos como se describe (Tabla 6), cuyos resultados muestran la restauración de la resistencia adquirida a j100-E-D1A-L del BIM100-E-D1A-L7 original.
1.3 - Reducción de la incidencia de BIM mediada por CRISPR en la generación de BIM 100-E
Para reducir la incidencia de alteraciones del espaciador CRISPR durante la generación de BIMs, S. thermophilus 100-E (parental) se transformó con ADN de pNZ44+100-ECas7i o pNZ44+100-ECas9i recién aislado, y los transformantes resistentes a Cm se cribaron como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Se realizó la generación de BIMs, los BIMs supuestos se purificaron, y los CRISPRs 1 y 3 se amplificaron como se describe en los MATERIALES Y MÉTODOS. CRISPR2 se omitió de este experimento debido a su aparente redundancia en S. thermophilus, y solo el extremo líder de cada locus se secuenció debido al sesgo significativo en la incorporación iterativa del espaciador en los dos sistemas CRISPR restantes (Horvath et al., 2008). La secuenciación se realizó desde el extremo líder de los loci de CRISPR 1 y 3 de un total de 90 presuntos BIMs (30 derivados usando 100-E parental, 30 usando 100-E:: pNZ44+100-ECas7i, y 30 usando 100-E:: pNZ44+100-ECas9i - derivándose cada 10 BIMs a partir de tres experimentos separados), utilizando los cebadores directos que se muestran en la Tabla 2 (Seq IDs 1, 7, y 9). Se secuenciaron al menos 800 bp (CRISPR1) o 500 bp (CRISPR3) para cada BIM potencial. Se omitieron dos secuencias CRISPR3 debido a datos deficientes. Los resultados del experimento de la generación de BIMs silenciados con cas se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7. Sumario de alteraciones de CRISPR en presuntos BIMs usando S. thermophilus 100-E parental y cepas silenciadas con cas7 y cas9.
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De los resultados anteriores se desprende claramente que existe una reducción significativa en la incidencia de alteraciones de CRISPR en los BIMs derivados de 100-E utilizando los transformantes silenciados tanto con cas7 como con cas9. Cabe señalar que ambos constructos silenciadores están diseñados para actuar sobre genes cas asociados con CRISPR1 - por esta razón se puede explicar alguna transferencia de actividad a CRISPR3 (como lo demuestra el ligero aumento en las alteraciones de CRISPR3).
1.4 - Generación de un BIM de “doble obstáculo” de S thermophilus 100-E
Para obtener BIMs de 100-E que sean resistentes a fagos tanto por el mecanismo de acción del sistema CRISPR como por una presunta mutación en un componente de la envoltura celular que actúa como receptor de fagos, se generaron los denominados BIMs de “doble obstáculo” (DH) de 100-E (BIM100-E-DH51 and BIM100-E-DH61; Tabla 1). Se consideró que BIM100-E-D1A-L7 es un BIM mediado por CRISPR “puro”, debido a la eficacia del método de silenciamiento CRISPR para restaurar la sensibilidad a f100-E-D1A-L (Tabla 6). Por este motivo, se aplicó BIM100-E-D1A-L7 en la generación de los BIMs DH.
De la Tabla 6 se desprende claramente que el mecanismo CRISPR proporciona a BIM100-E-D1A-L7 resistencia contra f100-E-D1A-L únicamente, mientras que f100-E-D2A-L, f100-E-D3A-L y f100-E-D4A-L retienen la capacidad de infectar el BIM. Esta sensibilidad se aprovechó durante la generación de los BIM DH. BIM100-E-D1A-L7 se transformó en primer lugar con el plásmido silenciador Cas7, pNZ44+100-ECas7i (Tabla 3; Figura 7), para aumentar la frecuencia de la selección secundaria de BIMs no CRISPR. A continuación, el BIM se sometió a una exposición a fagos usando f100-E-D2A-L, y se purificaron varios BIMs potenciales como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Los BIMs potenciales seleccionados se cribaron sobre la base de la sensibilidad de los fagos y las secuencias CRISPR, así como el perfil de sedimentación y la longitud de la cadena, que son indicadores de BIMs potenciales que albergan mutaciones en la pared celular. Los BIMs de doble obstáculo se sometieron a curado plasmídico (Figura 7) como se describió anteriormente antes de los ensayos de sensibilidad a fagos.
Tabla 8: Sumario del contenido de loci de repetición/espaciador CRISPR en S. thermophilus cepa 100-E y BIMs derivados.
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Tabla 9. Eficiencias relativas de formación de placas (EOP) de fagos de Streptococcus thermophilus cepa 100-E y BIMs derivados.
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Tabla 10. Células por cadena (CPC) relativas de cepa parental y BIMs de S. thermophilus cepa 100-E.
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BIM100-E-DH51 y BIM100-E-DH61 pueden definirse como BIMs de “doble obstáculo” por dos razones. En primer lugar, se descubrió que los tres loci de repetición/espaciador CRISPR secuenciados eran 100% idénticos a BIM100-E-D1A-L7 (Tabla 8), combinado con la aparente ausencia de cualquier loci de CRISPR-Cas adicional en el genoma. Esto indica que un mecanismo distinto al sistema CRISPR proporcionó resistencia adicional a los fagos j100-E-D2A-L, j100-E-D3A-L y j100-E-D4A-L que no se observó en BIM100-E-D1A-L7. Además, el perfil de sedimentación (Figura 8; Tabla 11) y el aumento relativo de la longitud de la cadena celular (Figura 6; Tabla 10) indican que estos BIMs han sufrido una mutación en el componente de la envoltura celular que actúa como receptor de fagos. La combinación de los “obstáculos” CRISPR y no CRISPR para la infección por fagos en una cepa en este caso conduce a la definición de BIMs de doble obstáculo.
Tabla 11. Densidades ópticas de cultivos en caldo durante toda la noche
de S. thermophilus 100-E y BIMs derivados.
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1.5 - Ensayo de Heap Lawrence de un BIM de “doble obstáculo” de S. thermophilus 100-E
Para evaluar la robustez frente al fago de un BIM CRISPR proporcionado, un BIM no CRISPR y un BIM de doble obstáculo (DH), los BIMs se sometieron a un ensayo de Heap Lawrence contra el fago j100-E-D1A-L como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS, cuyos resultados se muestran en la tabla 12 a continuación.
Tabla 12. Sumario de datos de Heap Lawrence frente al fago j100-E-D1A-L
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Es evidente a partir de los resultados anteriores que se obtiene una mayor robustez frente a los fagos para un BIM no CRISPR, BIM100-E-D1A-L5, en vista de BIM CRISPR, BIM100-E-D1A-L7. Además, los resultados anteriores muestran que un BIM de doble obstáculo, BIM100-E-DH51 y BIM100-E-DH61, proporciona una mayor robustez adicional frente a fagos. En otras palabras, la combinación de diferentes mecanismos resistentes a los fagos funciona de forma sinérgica aumentando la robustez frente a fagos contra el fago j100-E-D1A-L.
Ejemplo 2
Silenciamiento CRISPR de cepa parental y mutantes insensibles a los bacteriófagos (BIMs) de S. thermophilus 100-F
2. Silenciamiento de cas9 en BIMs de S. thermophilus 100-F
2.1. Generación y análisis de BIMs CRISPR de 100-F
Bacteriófagos contra S. thermophilus 100-F (3 en total; Tabla 1) y BIMs contra estos fagos se aislaron como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Se seleccionó un BIM, S. thermophilus BIM100-F-NGBD1A-L2, para un análisis adicional mediante ensayo de placa y secuenciación CRISPR, cuyos resultados se muestran en las Tablas 13 y 14, respectivamente.
Tabla 13. Eficiencias relativas de formación de placas (EOP) de fagos de Streptococcus thermophilus cepa 100-F y BIMs derivados.
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Tabla 14. Sumario del contenido de loci de repetición/espaciador CRISPR en S. thermophilus cepa 100-F y BIMs derivados.
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Los resultados anteriores indican que la insensibilidad observada de BIM100-F-NGBD1A-L2 a al menos dos de los tres fagos 100-F se confirió por el mecanismo CRISPR, debido a la adición de un espaciador en el extremo líder del locus de repetición/espaciador CRISPR1. Este espaciador de 30 pb mostró una homología del 100% con una región en una proteína hipotética en los módulos de replicación de los fagos jSTV84-D1A-L y jNGB-D1A-L (que se usó en la exposición). El genoma de jSTV88-D1A-L no estaba disponible para análisis de esta manera.
2.2. Transformación, curado y sensibilidades a fagos de BIM100-F-NGBD1A-L2
S. thermophilus BIM100-F-NGBD1A-L2 se transformó usando pNZ44 y pNZ44+100-FCas9i, recientemente aislados, y los transformantes resistentes a Cm se cribaron y después se verificaron usando la PCR confirmatoria como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Se seleccionaron dos presuntos transformantes, BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44 (control plasmídico) y BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i (prueba de principio), para la validación y análisis.
BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44 y BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i se sometieron a preparación plasmídica seguido de secuenciación, PCR de MCS de pNZ44 (Figura 11), PCR de CRISPR seguido de secuenciación (Tabla 14) y secuenciación plasmídica con fines de validación y como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. La amplificación por PCR de las regiones MCS de pNZ44 de todas las cepas (Figura 12) mostró claramente que un producto de aproximadamente 500 pb, que se presume que es la región MCS de pNZ44, se había introducido en BIM100-F-NGBD1A-L2, en comparación con el BIM original parental que no mostraba productos plasmídicos nativos u otros introducidos. El MCS de pNZ44 tanto en el plásmido original como en los constructos antisentido también se amplificó (Figura 11) y mostró una clara diferencia de tamaño, correspondiendo la diferencia al tamaño del gen cas9 de S. thermophilus 100-F. El ADN plasmídico purificado se sometió posteriormente a secuenciación como se describe en los MATERIALES Y MÉTODOS, y mostró la adición del gen cas9 de S. thermophilus 100-F en la orientación inversa entre los sitios de restricción PstI y XbaI en el vector plasmídico pNZ44 en ambos transformantes. Finalmente, los loci de CRISPR de BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44 y BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i se amplificaron y se sometieron a secuenciación. El contenido de espaciador CRISPR de cada transformante fue 100% idéntico a BIM100-F-NGBD1A-L2, lo que confirma la derivación directa. Esto también se confirmó mediante la obtención del perfil por PCR mediante RAPD con GTG (Figura 10).
Los transformantes BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44 y BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i se sometieron a ensayos de sensibilidad a fagos como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS, cuyos resultados se muestran en la Tabla 15. Los resultados muestran claramente la supresión de la resistencia a fagos adquirida de BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i, a pesar de la retención del espaciador CRISPR mencionado anteriormente. Esta supresión de la resistencia no se observó para el fago jSTV88-D1A-L. Debido a la falta de disponibilidad de la secuencia genómica completa de este fago, no fue posible confirmar la presencia de una secuencia de protoespaciador idéntica en el genoma. Considerando la ausencia de espaciadores adicionales en los loci de CRISPR2, CRISPR3 o CRISPR4, es probable que la resistencia de BIM100-F-NGBD1A-L2 a jSTV88-D1A-L sea conferida por un mecanismo diferente a CRISPR.
Tabla 15. Transformación, curado y sensibilidades a fagos
de BIMs CRISPR y CRISPR silenciada de 100-F
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A continuación, el transformante BIM100-F-NGBD1A-L2::pNZ44+100-FCas9i se sometió a curado plasmídico como se describe en MATERIALES Y MÉTODOS. Tras el examen electroforético de los productos de PCR de MCS del plásmido pNZ44, el derivado curado mostró un perfil idéntico al de. S. thermophilus 100-F parental y BIM100-F-NGBD1A-L2 original (es decir, sin producto; Figura 11). El derivado curado también mostró un patrón de PCR mediante RAPD idéntico a su BIM parental (Figura 10). El derivado curado se sometió entonces a ensayos de sensibilidad a fagos como se describe (Tabla 15), cuyos resultados muestran la restauración de la resistencia adquirida a jSTV84-D1 A-L y jNGB-D1 A-L del BIM100-F-NGBD1A-L2 original.
2.3 - Silenciamiento simultáneo de múltiples genes cas para lograr una incidencia de BIM mediada por CRISPR reducida durante la generación de BIM 100-F
Se observó previamente que S. thermophilus 100-F produce una alta frecuencia de BIMs mediados por CRISPR durante la generación de BIMs. Para obtener BIMs no mediados por CRISPR, se tuvo que reducir la incidencia de BIM mediados por CRISPR en esta cepa. Con este fin, los plásmidos pNZ44+100-FCas7i, pNZ44+100-F2Casi y pNZ44+100-F2CasiSW se introdujeron individualmente en la cepa 100-F por electrotransformación, y los transformantes se cribaron en cada caso para determinar la resistencia a Cm, y después se verificaron como se describe en los MATERIALES Y MÉTODOS. Todas las cepas mostraron un perfil de pCr mediante RAPD con GTG idéntico (Figura 12), lo que confirma la derivación directa. Los resultados de una PCR confirmatoria de MCS de pNZ44 (Figura 13) muestran claramente la introducción de plásmidos en los respectivos transformantes, correlacionándose el tamaño del producto de PCR con el tamaño del inserto en todos los casos. La generación de BIMs se realizó utilizando estos transformantes, los presuntos BIMs se purificaron, y los CRISPRs 1, 3 y 4 se amplificaron como se describe en los MATERIALES Y MÉTODOS. Como se describió para la cepa 100-E, CRISPR 2 se omitió de este análisis debido a su aparente redundancia en S. thermophilus, y solo el extremo líder de cada locus de CRISPR fue secuenciado debido al sesgo significativo en la incorporación iterativa del espaciador en los dos sistemas restantes (y, se puede suponer, CRISPR 4) (Horvath et al., 2008). La secuenciación se realizó desde el extremo líder de los loci de CRISPR 1,3 y 4 de un total de 46 presuntos BIMs (10 derivados del progenitor 100-F, 10 de la cepa de control 100-F:: pNZ44, 6 de la cepa 100-F:: pNZ44+100-FCas7i, 10 de la cepa 100-F::pNZ44+100-F2Casi, y 10 de la cepa 100-F::pNZ44+100-F2CasiSW), utilizando los cebadores directos que se muestran en la Tabla 2 (Seq IDs 1, 9 y 18). Se secuenciaron al menos 400 pb de cada locus para cada BIM potencial, que, combinado con la obtención del perfil mediante RAPD con GTG (anteriormente), sirvió para confirmar la derivación directa de cada transformante (y BIM) de la cepa parental 100-F. Los resultados del experimento de generación de BIM con cas silenciado se resumen en la Tabla 16.

Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un método para el aislamiento de mutantes insensibles a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus que comprende las etapas de:
a. inactivar el mecanismo de resistencia CRISPR de la cepa parental;
b. exponer la cepa parental obtenida en la etapa a) a un bacteriófago;
c. aislar mutantes insensibles a bacteriófagos;
d. comparar los loci de CRISPR de la cepa parental con los loci de CRISPR de los mutantes insensibles a bacteriófagos; y
e. seleccionar mutantes insensibles a bacteriófagos cuyos loci de CRISPR son idénticos a los loci de CRISPR de la cepa parental.
2. Método según la reivindicación 1, que comprende exponer la cepa parental obtenida en a) a un único tipo de bacteriófago.
3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el mecanismo de resistencia CRISPR se inactiva mediante un método seleccionado del grupo que consiste en:
a. introducir en la cepa parental uno o más constructos de ADN que comprenden un promotor seguido de uno o más genes cas o una parte del mismo o una secuencia nucleotídica al menos 90% idéntica al gen cas en la orientación inversa de modo que el gen cas se transcribe en el correspondiente ARN antisentido que posteriormente se une al ARNm cas diana, silenciando así el gen cas;
b. introducir en la cepa parental uno o más constructos de ADN que comprenden una proteína Cas9 catalíticamente inactiva y uno o más ARN guía (ARNgu) para la represión transcripcional de uno o más genes cas en la cepa parental de Streptococcus thermophilus.
4. Un método según la reivindicación 3, en el que se elimina el constructo de ADN.
5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cepa parental de Streptococcus thermophilus es sensible al bacteriófago.
6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cepa de Streptococcus thermophilus parental es insensible al bacteriófago.
7. Un mutante insensible a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus, en el que los loci de CRISPR del mutante insensible a bacteriófagos son idénticos a los loci de CRISPR de la cepa parental de Streptococcus thermophilus y se puede obtener mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, y en el que dicha cepa parental de Streptococcus thermophilus es una cepa de Streptococcus thermophilus que se depositó como CBS138555 o como CBS139996.
8. Un mutante insensible a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus, en el que los loci de CRISPR del mutante insensible a bacteriófagos no son idénticos a los loci de CRISPR de la cepa parental de Streptococcus thermophilus, y mutante insensible a bacteriófagos el cual comprende además una resistencia a bacteriófagos no mediada por CRISPR, y en el que dicha cepa parental de Streptococcus thermophilus es una cepa de Streptococcus thermophilus que se depositó como CBS138555 o como CBS139996.
9. Un mutante insensible a bacteriófagos de una cepa parental de Streptococcus thermophilus según la reivindicación 7 u 8, en el que el mutante insensible a bacteriófagos tiene una velocidad de sedimentación aumentada y/o una formación de cadenas aumentada en comparación con la cepa parental de Streptococcus thermophilus.
10. Procedimiento para la producción de un producto lácteo tal como un producto lácteo fermentado o queso, que comprende el uso de uno o más de los mutantes insensibles a bacteriófagos de la cepa parental de Streptococcus thermophilus según se define en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9.
11. Uso del mutante insensible a bacteriófagos de la cepa parental de Streptococcus thermophilus como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en un procedimiento para la producción de un producto lácteo, tal como leche fermentada o queso.
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