CN114574416A - 一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法和应用，该重组谷氨酸棒状杆菌是将切胶回收的indigiodine合成酶基因片段连接到DpnI消化的线性化载体穿梭质粒上，再转化导入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞获取重组质粒pHG08，后再导入到谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中构建而成。本发明的重组谷氨酸棒状杆菌在生产蓝色天然染料过程中，其自身能够提供谷氨酸，不需要额外添加，减少前体供应，降低成本。

Description

一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法 和应用

技术领域

本发明涉及一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

染料是人们生活、工业生产等不可缺少的重要物质，早期是从植物中提取，但天然染料提取工艺复杂，成本较高；随着工业的发展，通过化学合成方式获得染料，染料色泽鲜艳，成本较低，但生物毒性高，在自然界很难降解，对生态环境的破坏较大；而且近年来，环境和能源问题越来越受到社会关注，人们更偏向于环境友好的、可持续发展的有利于人类健康的高品质生活，尤其对无毒环保型染料的呼声越来越高；以生物合成的方式采用工程菌株生产染料逐渐发展起来，但是现有的一些生物合成，前体供应量较大，时间周期长，成本较高。

谷氨酸棒杆菌属于放线菌目棒状杆菌属，是一种好氧的、无芽胞的、细胞为短小棒状呈“八”字排列的革兰氏阳性菌，是公认的安全菌株，主要用于各种氨基酸、有机酸、高级醇等小分子的生产；由于谷氨酸棒杆菌自身含有丰富的谷氨酸，可作为优良宿主为生产一种蓝色染料提供充足的前体。因此，为减少前体供应，降低成本，节能环保，缩短时间周期，本发明提供了一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌，该重组谷氨酸棒状杆菌在生产蓝色天然染料过程中，其自身能够提供谷氨酸，不需要额外添加，减少前体供应，降低成本。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌，是将切胶回收的indigiodine合成酶基因片段连接到DpnI消化的线性化载体穿梭质粒上，再转化导入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞获取重组质粒pHG08，后再导入到谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中构建而成。

进一步地，所述穿梭质粒为pPIC9K、pXMJ19、pBE2的一种；其中所述pPIC9K的核苷酸序列为SEQIDNO.6所示，所述pXMJ19的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，所述pBE2的核苷酸序列为SEQIDNO.8所示；优选地，穿梭质粒为pXMJ19。

进一步地，所述Indigiodine合成酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1~SEQIDNO.5任一序列所示。

进一步地，所述谷氨酸棒状杆菌感受态细胞为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞或谷氨酸棒状杆菌ATCC9114感受细胞的一种或两种。

本发明还提供了一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，包括以下步骤：

S1、谷氨酸棒状杆菌感受态细胞的构建：先将接种量为1%的谷氨酸棒状杆菌甘油活化接种于10ml的LBG液体培养基中，在30℃、100rpm下振荡培养10~20h，获得谷氨酸棒状杆菌LBG培养液；再取3ml该谷氨酸棒状杆菌LBG培养液接种于50~150ml的Epo液体培养基中，在20~40℃、50~150rpm下振荡培养使OD600达到一定值，获得谷氨酸棒状杆菌Epo培养液，并将其置于冰浴中10~60min，后在4℃、4000rpm下进行冷冻离心，去除上清液，收集菌体，向菌体中添加10~50ml的10%甘油溶液，重悬菌体，冷冻离心，重复2~5次，再收集菌体，向收集的菌体中添加1~5ml的10%甘油溶液，重悬菌体，获得谷氨酸棒状杆菌感受态细胞；

S2、重组质粒pHG08的构建：先以穿过质粒模板，加入引物Ⅰ进行PCR扩增，再经DpnI消化，获得线性化载体穿梭质粒；再以indigiodine合成酶基因的质粒为模板，加入引物Ⅱ进行PCR扩增，再经切胶回收，获得indigiodine合成酶基因片段；接着通过In-Fusion试剂盒将线性化载体穿梭质粒和indigiodine合成酶基因片段进行连接，获得连接产物L；然后取10μl连接产物L以化学转化法导入100μl的谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中，再均匀涂布在琼脂糖平板上，并在37℃下倒置培养，长出菌落，挑取单菌落，在质粒小提试剂盒提取单菌落中的质粒，获得生产蓝色天然染料的重组质粒pHG08；

S3、重组谷氨酸棒状杆菌的构建：先向50μl谷氨酸棒状杆菌感受态细胞加入1~10μl重组质粒pHG08，轻微震动混匀，迅速转移至0.1cm电击杯中，在电压1.8kV下电击5ms，加入0.5~3ml的LBHIS液体培养基，混合转移，置于30~50℃的水浴中热激2~10min，再在20~40℃、50~500rpm下培养0.5~3h，获得谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液，并将其涂布于LBHIS固体平板上，在20~40℃下培养12~36h，后挑取单菌落，在电子显微镜下检测菌株的生长状态，生长良好，获得生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌菌株，并保藏于甘油中，菌株终浓度为10~40%，获得生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌甘油种。

其中，LBG液体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，其余为纯水，pH值7.0；Epo液体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，吐温-80 1g，其余为纯水，pH值7.0，在温度121℃下灭菌20min，后加入无菌的异烟肼4 g和甘氨酸30 g；LBHIS液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0；LBHIS固体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，琼脂20g；脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0。

进一步地，在步骤S1中的OD600值为0.4~1.2。

进一步地，在步骤S2中，PCR扩增条件：95℃变性、55-65℃退火、72℃延伸，循环35次。

进一步地，在步骤S2中，当pPIC9K为穿梭质粒时，引物Ⅰ为pPIC9K-i-F/pPIC9K-i-R，pPIC9K-i-F的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示，pPIC9K-i-R的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示，引物Ⅱ为pPIC9K-IndC-F/pPIC9K-IndC-R，pPIC9K-IndC-F的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示，pPIC9K-IndC-R的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；当pXMJ19为穿梭质粒，引物Ⅰ为pXMJ19-i-F/pXMJ19-i-R，pXMJ19-i-F的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示，pXMJ19-i-R的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示，引物Ⅱ为pXMJ19-IndC-F/pXMJ19-IndC-R，pXMJ19-IndC-F的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示，pPIC9K-IndC-R的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；当pBE2为穿梭质粒，引物Ⅰ为pBE2-i-F/pBE2-i-R，pBE2-i-F的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示，pBE2-i-R的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示，引物Ⅱ为pBE2-IndC-F/pBE2-IndC-R，pBE2-IndC-F的核苷酸序列如SEQIDNO.19所示，pBE2-IndC-R的核苷酸序列如SEQIDNO.20所示。

本发明还提供了一种重组谷氨酸棒状杆菌生产蓝色天然染料的应用方法，包括以下步骤：

（1）取生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌甘油种，进行平板划线，在30℃下培养12~36h，挑取单菌落，置于LBHIS液体培养基中，在30~50℃、50~500rpm下振荡培养使OD600达到一定值，获得重组谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液；

（2）取1~10ml重组谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液转接到发酵培养基中，在30~50℃、50~500rpm下发酵培养，发酵至2~15h时，添加终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，持续培养10~50h，获得蓝色发酵液，分离纯化，获得蓝色天然染料。

其中，发酵培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0；LBHIS液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0；LBG固体平板上的LBG固体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，其余为纯水，pH值7.0。

进一步地，步骤（1）中的OD600值为1.0~3.5。

本发明的有益效果：本发明的重组谷氨酸棒状杆菌是通过以穿梭质粒为载体连接indigiodine合成酶基因片段，导入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞获取重组质粒，再导入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中构建获得；相比于现有生产蓝色染料的方式，使用本发明的重组谷氨酸棒状杆菌生产蓝色天然染料时，其自身能够提供谷氨酸，不需要额外添加，减少前体供应，降低成本；同时相比于化学合成技术，本发明的重组谷氨酸棒状杆菌生产蓝色天然染料，绿色无污染，节能环保，是环境友好型材料。

附图说明

图1为本发明的实施例5构建的连接产物L的核酸电泳图；

图2为本发明的实施例6构建的连接产物L的核酸电泳图；

图3为本发明的实施例7构建的连接产物L的核酸电泳图；

图4为本发明的实施例12构建的重组谷氨酸棒状杆菌电子显微镜检测图；

图5为本发明的实施例13构建的重组谷氨酸棒状杆菌电子显微镜检测图；

图6为本发明的实施例14构建的重组谷氨酸棒状杆菌电子显微镜检测图；

图7为本发明生产蓝色染料的发酵液。

具体实施方式

为了对本发明作出更加清楚完整地说明，下面用具体实施例说明本发明，但并不是对发明的限制。

实施例1 谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞的构建

具体如下：步骤1、将接种量为1%的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032甘油活化接种于10ml的LBG液体培养基中，在30℃、100rpm的摇床培养10h，获得谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的LBG培养液；

步骤2、取3ml该谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的LBG培养液接种于50ml的Epo液体培养基中，在20℃、50rpm的摇床培养至OD600值为0.4，获得谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Epo培养液；

步骤3、将该谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的Epo培养液转入无菌离心管中置于冰浴中10min，后在4℃、4000rpm的离心机中冷冻离心，去除上清液，收集菌体，向菌体中添加10ml的10%甘油溶液，重悬菌体，重复冷冻离心清洗5次，再收集菌体，向收集的菌体中添加1ml的10%甘油溶液，重悬菌体，获得谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞。

实施例2谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞的构建

本实施例2的构建步骤和实例1的构建步骤相同，不同之处如表1所示，获得谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞。

实施例3谷氨酸棒状杆菌ATCC9114感受态细胞的构建

本实施例3的构建步骤和实例1的构建步骤相同，不同之处如表1所示，获得谷氨酸棒状杆菌ATCC9114感受态细胞。

实施例4谷氨酸棒状杆菌ATCC9114感受态细胞的构建

本实施例4的构建步骤和实例1的构建步骤相同，不同之处如表1所示，获得谷氨酸棒状杆菌ATCC9114感受态细胞。

表1

所使用的培养基的配方：

（1）LBG液体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，其余为纯水，pH值7.0；（2）Epo液体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，吐温-80 1g，其余为纯水，pH值7.0，在温度121℃下灭菌20min，后加入无菌的异烟肼4 g和甘氨酸30 g；（3）LBHIS液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0。

所使用的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032、谷氨酸棒状杆菌ATCC9114在中国科学院菌种保藏中心购买获得。

实施例5 生产蓝色天然染料的重组质粒pHG08的构建

具体如下：步骤1、以pXMJ19穿过质粒为模板，该pXMJ19的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，使用pXMJ19-i-F/pXMJ19-i-R引物Ⅰ在95℃变性、55-65℃退火、72℃延伸、循环35次的条件下PCR扩增，再经DpnI消化，获得线性化载体穿梭质粒；

步骤2、以核苷酸序列SEQIDNO.2所示的indigiodine合成酶基因的质粒为模板，使用pXMJ19-IndC-F/pXMJ19-IndC-R引物Ⅱ在95℃变性、55-65℃退火、72℃延伸、循环35次的条件下进行PCR扩增，再经切胶回收，获得indigiodine合成酶基因片段；

步骤3、通过In-Fusion试剂盒将线性化载体穿梭质粒和indigiodine合成酶基因片段进行连接，获得连接产物L，该连接产物L经核酸电泳测试，结果如图1所示，属于细菌种属；

步骤4、取10μl连接产物L以化学转化法导入100μl的实施例2的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞中，后将谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞均匀涂布在琼脂糖平板上，在37℃下倒置培养，长出菌落，后挑取单菌落，在质粒小提试剂盒提取单菌落中的质粒，获得生产蓝色天然染料的重组质粒pHG08。

实施例6~实施例11 为生产蓝色天然染料的重组质粒pHG08的构建，其构建步骤和实例5的构建步骤相同，不同之处如表2所示。

表2

所使用的pPIC9K的核苷酸序列为SEQIDNO.6所示，pXMJ19的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，pBE2的核苷酸序列为SEQIDNO.8所示；Indigiodine合成酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1~SEQIDNO.5任一序列所示。

所使用的引物的序列如下表3所示。

表3

Primer名称	引物序列(5'to3')
		pPIC9K-i-F	attggtgccagcctgttaaca
pPIC9K-i-R	gcggcaaatttttagcggcgg
		pPIC9K-IndC-F	acaggatgttgaggcgtttatac
pPIC9K-IndC-R	gagcgtttttctggcgtggcgatg
		pXMJ19-i-F	ctgcaggtcgactctagagg
pXMJ19-i-R	aagcttaattaattctgtttcctg
		pXMJ19-IndC-F	aggaaacagaattaattaagcttatgtcagttgaaacaattcc
pXMJ19-IndC-R	cctctagagtcgacctgcagtcaatagtttggagtcttac
		pBE2-i-F	tcaccgggcttaacccgacg
pBE2-i-R	atcattggtatgttagaccat
		pBE2-IndC-F	ccccggcgaaacgccttacgc
pBE2-IndC-R	gcgcgatgttgctctggtgcaaaa

所使用的In-Fusion试剂盒是由Takara公司生产。

实施例12 重组谷氨酸棒状杆菌的构建

步骤1、取1~10μl实施例5构建的重组质粒pHG08向50μl实施例2构建的谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞加入，轻微震动混匀，迅速转移至0.1cm电击杯中，在1.8kV的电转化仪进行电击5ms，加入0.5~3ml的LBHIS液体培养基，混合后转移到离心管，置于45℃的水浴锅中热激5min，再在35℃、100rpm的摇床培养2.5h，获得谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液；

步骤2、将谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液涂布于LBHIS固体平板上，在35℃培养30h，后挑取单菌落，在电子显微镜下检测菌株的生长状态，生长良好，如图4所示，获得生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌菌株；

步骤3、将获得的生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌菌株保藏于甘油中，菌株终浓度为10~40%，获得生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌甘油种。

实施例13~实施例18 为重组谷氨酸棒状杆菌的构建，其构建步骤和实例12的构建步骤相同，不同之处如表4种示。

表4

所使用的培养基配方：

（1）LBHIS液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0；（2）LBHIS固体平板上的LBHIS固体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，琼脂20g；脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0。

实施例19 重组谷氨酸棒状杆菌生产蓝色天然染料的应用

具体如下：步骤1、取接种量为1%的实施例12构建的生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌甘油种涂布于LBG固体平板上，进行平板划线，置于30℃下培养24h，后挑取单菌落，置于10ml的LBHIS液体培养基中，在40℃、350rpm摇床振荡培养至OD600值为3，获得重组谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液；

步骤2、取8ml重组谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液转接到发酵培养基中，在40℃、350rpm摇床发酵培养，发酵至12h时，添加终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，持续培养40h，获得发酵液，发酵液呈深蓝色，分离纯化，获得蓝色天然染料。

实施例20~26 为重组谷氨酸棒状杆菌生产蓝色天然染料的应用，其应用方法和实例19的应用方法相同，不同之处如表5所示。

表5

所使用的培养基配方：

（1）LBHIS液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0；（2）发酵培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0；（3）LBG固体平板上的LBG固体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl10g，琼脂20g，其余为纯水，pH值7.0。

综上所述，通过本发明构建的重组谷氨酸棒状杆菌能够发酵生产得到蓝色发酵液，可以用于蓝色天然染料的生产，绿色环保，能够持续发展；其中，以pXMJ19作为载体，构建获得的重组谷氨酸棒状杆菌生产得到的蓝色染料的颜色较深，本发明优选pXMJ19。本发明的构建方法，将切胶回收的indigiodine合成酶基因片段连接到DpnI消化的线性化载体穿梭质粒上，再转化导入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞获取重组质粒pHG08，后再导入到谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中构建，获得的重组谷氨酸棒状杆菌，能够生产蓝色天然染料；相比于现有生物生产方式大都以大肠杆菌作为宿主，存在额外添加前天谷氨酸、前体供应量较大、时间周期长、成本较高的不足，本发明的重组谷氨酸棒状杆菌生产蓝色天然染料时，重组谷氨酸棒状杆菌自身能够提供谷氨酸，不需要额外添加，能够减少前体供应，降低成本；相比于化学合成染料的技术，存在生物毒性高、自然界很难降解、破坏生态环境的不足，本发明重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法及应用方法绿色无污染，节能环保，可在工业生产中持续发展，具有良好的社会效益和经济效益。

最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

序列表

<110> 南京合谷生命生物科技有限公司

<120> 一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌及其构建方法和应用

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 225

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas rubra

<400> 1

atgccacatg tagatattca ttattttgcg tgcccggttt ctgacatagc aaaagaagcc 60

attgcacaaa ccattacggc aattctgagt aaagagctca attgcggtga agaagtgatt 120

tcagttgcct tgtgccctca agtacctgag gactggcagc aaaacgtata ccagccgtta 180

attacggcgc aaaaagataa actgattaaa tttccaaatt actaa 225

<210> 2

<211> 4470

<212> DNA

<213> Dickeya aquatica

<400> 2

atggacaaca acatctcgta tcacgctttt aattatcctg ttttggtatt gaataaagga 60

ttgctgccag acaatgatgc catgtcacaa cgccgttatg tgttgtcggc attaatattg 120

gcaatatcgc gccttacccg gcatgaagaa ttgatagtgg gttttgcgct accacaacaa 180

gaacagaacg attggcaacg tattgccggt gttcagcaac acatgctggc gttaaacctg 240

catgtgaata gcaccacggc actggccggg tttagccatg ctattgcggc ctggttaagg 300

cctgaccggg tgtctgatga aaaccctatt ggtgccagcc tgttaacact caaggatcac 360

cattcgctgc acgaggtagc tgacctgacg ctttattggc agccgccgca agataatgac 420

ccggtgcggg cgatagcgtg ccatgtgcat gagagtgacg aagcctttag ggtgacgctg 480

cgtattaacc ccgagcgttt ttctggcgtg gcgatgcagc gcctgcctgc ggtttggcaa 540

ctgatcacca cctttatcgc ccatcatccg gcggcaacgc tgcgagacat ccgcctgctg 600

gatgacaccg aactgcaacg cgtattgcat gactttaacc agaccgaccg gcactggccc 660

ggaccggtac atctggttga tcagctaaaa cagcgcgtca tgcagcatcc gttgcgaacc 720

gcggtggtgt ttcgggaaca tgcgctgagt tacgccgggc tctaccagca agccggcgcg 780

ctggctcact atttgcgggc caataccacc gcagataatc cgtgtgtcgg gttgttcgtt 840

gagccctcat tggccttgat gacgggggcc tggggcattc tcatggccgg ctgtgcctat 900

ctgccgttgt cgccggaata cccgcaagag cggctggcct atatgctgga agacagccgt 960

accaccctcg tttttaccga accacattta cgtgaaaccc tgctggcgct ggccccgccg 1020

ggggtaacag tggtcacgcc acaggatgtt gaggcgttta tacatgcaca agggaatgtg 1080

ttagcgcaag cgcctgcgct ggcgattgac ccgcacgatt tggcgtatgt gatttacacc 1140

tctggcagca ccggtaaacc caaaggggtg atggttgagc accatagcat acgcaatcaa 1200

atgtgctggc tggcagagac gtttgcactg aacgaagaga cggtgatttt acaaaaaaca 1260

ccgatgagtt ttgatgccgc gcaatgggag attctggctc cagcgtgtgg ctgtcaggtg 1320

gttatggggg aaccgggcgt atatcgcaac ccggaacaac tgatagacat gctggcggaa 1380

tttcaggtca ccacattgca atgcgttccc acgctattgc aggcactgct ggacactgag 1440

cgcatggccg agtgccgggc tctgcggcaa atttttagcg gcggtgaggc gttgcaaaaa 1500

catctggcgc aggcttgcct ggattctctg cccgaatgtg agctcatcaa cctgtatggc 1560

ccgaccgagt gcaccatcaa cagttcggcc tttcgggtgg cgcgtgagcg gctcaacgcc 1620

gggcctgata cgttatccat cggtaagccg gtggcaaaca cccgttatta cattctcgat 1680

aactgcctga cgccggtggc gctggggcag gtcggggagc tgtatatcgg cggagagggc 1740

gtggcgcgtg gctacctgca tcgtgaggca ttgagcgccg agcgctttat tgctgacccg 1800

tttacccatg ctgacccgct ggcccggctc tataaaaccg gcgatctggc ctgctggaat 1860

gacgatggta cggtgcagta cattggccgg gccgataatc aggtcaagct gcgtggttat 1920

cgtatcgagc tcgatgaaat tcgctcagcg attgaaaccc accactgggt aaaaacggcc 1980

gcggttattc tcaaacaaga cccgttcacc ggctatcaga acctgattgc gtttattgag 2040

cttaatgcgc gcgaggccgc gctgatggat caaggcaatc acggcacaca tcatcaatcc 2100

aaggcgaata aagcgcaggt gatgatgcaa ctggagaaca aaggctgccg ggaatttccg 2160

gctgacagcc agccttatac gctggcgctc cccggtaagc agccggatga aaagcaggcc 2220

agcaccgcct tttcgcgcaa aacctatcgc ttttatgatg ccggtgcggc gagccgtgag 2280

gatattctgg cactgctgcg cgcgccactg ctgacggtaa cgccccgcca gccagagagc 2340

ctgacgtggc aggagctggg ttacgtttta cgctaccttg gccagttcac cagtaccgag 2400

cggttattac ccaaatacac ctatgcctcg ccgggggcgt tgtacgccac acaggtctat 2460

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tccacaactc tctggagagt aggcaccaac aaacacagat ccagcgtgtt gtacttgatc 2700

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gcgtacaatt tcaacccttg gcaactgcac agcttggttg tgaacagcat cttcaattct 2880

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cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 8580

ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 8640

taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 8700

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atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 8880

gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 8940

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<210> 7

<211> 6601

<212> DNA

<213> pXMJ19

<400> 7

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cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 120

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aagggcatgt ctcaggaact gactggctcc gctactaaaa ccgcgtctaa ggggtcgtac 3660

acgccgtttc agatgttgga tatgttggcc gatcaaagcg acgccggcga ggatatggac 3720

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tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 5040

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ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc 5340

gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 5400

cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 5460

ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 5520

tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 5580

ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 5640

ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 5700

gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 5760

tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 5820

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gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 5940

cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 6000

gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 6060

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cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 6240

tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 6300

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cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 6420

tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 6480

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atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 6600

t 6601

<210> 8

<211> 9495

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gacgcagatc gggaacactg aaaaataaca gttattattc gagatctaac atccaaagac 60

gaaaggttga atgaaacctt tttgccatcc gacatccaca ggtccattct cacacataag 120

tgccaaacgc aacaggaggg gatacactag cagcagaccg ttgcaaacgc aggacctcca 180

ctcctcttct cctcaacacc cacttttgcc atcgaaaaac cagcccagtt attgggcttg 240

attggagctc gctcattcca attccttcta ttaggctact aacaccatga ctttattagc 300

ctgtctatcc tggcccccct ggcgaggttc atgtttgttt atttccgaat gcaacaagct 360

ccgcattaca cccgaacatc actccagatg agggctttct gagtgtgggg tcaaatagtt 420

tcatgttccc caaatggccc aaaactgaca gtttaaacgc tgtcttggaa cctaatatga 480

caaaagcgtg atctcatcca agatgaacta agtttggttc gttgaaatgc taacggccag 540

ttggtcaaaa agaaacttcc aaaagtcggc ataccgtttg tcttgtttgg tattgattga 600

cgaatgctca aaaataatct cattaatgct tagcgcagtc tctctatcgc ttctgaaccc 660

cggtgcacct gtgccgaaac gcaaatgggg aaacacccgc tttttggatg attatgcatt 720

gtctccacat tgtatgcttc caagattctg gtgggaatac tgctgatagc ctaacgttca 780

tgatcaaaat ttaactgttc taacccctac ttgacagcaa tatataaaca gaaggaagct 840

gccctgtctt aaaccttttt ttttatcatc attattagct tactttcata attgcgactg 900

gttccaattg acaagctttt gattttaacg acttttaacg acaacttgag aagatcaaaa 960

aacaactaat tattcgaagg atccaaacga tggtcgcttg gtggtctttg tttctgtacg 1020

gtcttcaggt cgctgcacct gctttggctc atcgaagagc ttaattatat tccccagaac 1080

atcaggttaa tggcgttttt gatgtcattt tcgcggtggc tgagatcagc cacttcttcc 1140

ccgataacgg agaccggcac actggccata tcggtggtca tcatgcgcca gcttttatcc 1200

ccgatatgca ccaccgggta aagttcacgg gagactttat ctgacagcag acgtgcactg 1260

gccaggggga tcaccatccg tcgcccgggc gtgtcaataa tatcactctg tacatccaca 1320

aacagacgat aacggctctc tcttttatag gtgtaaacct taaactgcat agcatacctc 1380

tttttgacat acttcgggta tacatatcag tatatattct tataccgcaa aaatcagcgc 1440

gcaaatacgc atactgttat ctggctttta gtagcgaaaa aaccccgccg aagcggggtt 1500

ttttgcggct cttcgtaatt cgccttagat atgactgttc ctcagttcaa gttgggcact 1560

tacgagaaga ccggtcttgc tagattctaa tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg 1620

agagatgcag gcttcatttt tgatactttt ttatttgtaa cctatatagt ataggatttt 1680

ttttgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc ttgctcctga tcagcctatc tcgcagctga 1740

tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa tcattcgagt ttgatgtttt tcttggtatt 1800

tcccactcct cttcagagta cagaagatta agtgagacgt tcgtttgtgc aagcttatcg 1860

ataagcttta atgcggtagt ttatcacagt taaattgcta acgcagtcag gcaccgtgta 1920

tgaaatctaa caatgcgctc atcgtcatcc tcggcaccgt caccctggat gctgtaggca 1980

taggcttggt tatgccggta ctgccgggcc tcttgcggga tatcgtccat tccgacagca 2040

tcgccagtca ctatggcgtg ctgctagcgc tatatgcgtt gatgcaattt ctatgcgcac 2100

ccgttctcgg agcactgtcc gaccgctttg gccgccgccc agtcctgctc gcttcgctac 2160

ttggagccac tatcgactac gcgatcatgg cgatcacacc cgtcctgtgg atctatcgaa 2220

tctaaatgta agttaaaatc tctaaataat taaataagtc ccagtttctc catacgaacc 2280

ttaacagcat tgcggtgagc atctagacct tcaacagcag ccagatccat cactgcttgg 2340

ccaatatgtt tcagtccctc aggagttacg tcttgtgaag tgatgaactt ctggaaggtt 2400

gcagtgttaa ctccgctgta ttgacgggca tatccgtacg ttggcaaagt gtggttggta 2460

ccggaggagt aatctccaca actctctgga gagtaggcac caacaaacac agatccagcg 2520

tgttgtactt gatcaacata agaagaagca ttctcgattt gcaggatcaa gtgttcagga 2580

gcgtactgat tggacatttc caaagcctgc tcgtaggttg caaccgatag ggttgtagag 2640

tgtgcaatac acttgcgtac aatttcaacc cttggcaact gcacagcttg gttgtgaaca 2700

gcatcttcaa ttctggcaag ctccttgtct gtcatatcga cagccaacag aatcacctgg 2760

gaatcaatac catgttcagc ttgagacaga aggtctgagg caacgaaatc tggatcagcg 2820

tatttatcag caataactag aacttcagaa ggcccagcag gcatgtcaat actacacagg 2880

gctgatgtgt cattttgaac catcatcttg gcagcagtaa cgaactggtt tcctggacca 2940

aatattttgt cacacttagg aacagtttct gttccgtaag ccatagcagc tactgcctgg 3000

gcgcctcctg ctagcacgat acacttagca ccaaccttgt gggcaacgta gatgacttct 3060

ggggtaaggg taccatcctt cttaggtgga gatgcaaaaa caatttcttt gcaaccagca 3120

actttggcag gaacacccag catcagggaa gtggaaggca gaattgcggt tccaccagga 3180

atatagaggc caactttctc aataggtctt gcaaaacgag agcagactac accagggcaa 3240

gtctcaactt gcaacgtctc cgttagttga gcttcatgga atttcctgac gttatctata 3300

gagagatcaa tggctctctt aacgttatct ggcaattgca taagttcctc tgggaaagga 3360

gcttctaaca caggtgtctt caaagcgact ccatcaaact tggcagttag ttctaaaagg 3420

gctttgtcac cattttgacg aacattgtcg acaattggtt tgactaattc cataatctgt 3480

tccgttttct ggataggacg acgaagggca tcttcaattt cttgtgagga ggccttagaa 3540

acgtcaattt tgcacaattc aatacgacct tcagaaggga cttctttagg tttggattct 3600

tctttaggtt gttccttggt gtatcctggc ttggcatctc ctttccttct agtgaccttt 3660

agggacttca tatccaggtt tctctccacc tcgtccaacg tcacaccgta cttggcacat 3720

ctaactaatg caaaataaaa taagtcagca cattcccagg ctatatcttc cttggattta 3780

gcttctgcaa gttcatcagc ttcctcccta attttagcgt tcaacaaaac ttcgtcgtca 3840

aataaccgtt tggtataaga accttctgga gcattgctct tacgatccca caaggtggct 3900

tccatggctc taagaccctt tgattggcca aaacaggaag tgcgttccaa gtgacagaaa 3960

ccaacacctg tttgttcaac cacaaatttc aagcagtctc catcacaatc caattcgata 4020

cccagcaact tttgagttgc tccagatgta gcacctttat accacaaacc gtgacgacga 4080

gattggtaga ctccagtttg tgtccttata gcctccggaa tagacttttt ggacgagtac 4140

accaggccca acgagtaatt agaagagtca gccaccaaag tagtgaatag accatcgggg 4200

cggtcagtag tcaaagacgc caacaaaatt tcactgacag ggaacttttt gacatcttca 4260

gaaagttcgt attcagtagt caattgccga gcatcaataa tggggattat accagaagca 4320

acagtggaag tcacatctac caactttgcg gtctcagaaa aagcataaac agttctacta 4380

ccgccattag tgaaactttt caaatcgccc agtggagaag aaaaaggcac agcgatacta 4440

gcattagcgg gcaaggatgc aactttatca accagggtcc tatagataac cctagcgcct 4500

gggatcatcc tttggacaac tctttctgcc aaatctaggt ccaaaatcac ttcattgata 4560

ccattattgt acaacttgag caagttgtcg atcagctcct caaattggtc ctctgtaacg 4620

gatgactcaa cttgcacatt aacttgaagc tcagtcgatt gagtgaactt gatcaggttg 4680

tgcagctggt cagcagcata gggaaacacg gcttttccta ccaaactcaa ggaattatca 4740

aactctgcaa cacttgcgta tgcaggtagc aagggaaatg tcatacttga agtcggacag 4800

tgagtgtagt cttgagaaat tctgaagccg tatttttatt atcagtgagt cagtcatcag 4860

gagatcctct acgccggacg catcgtggcc gacctgcagg gggggggggc gctgaggtct 4920

gcctcgtgaa gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca 4980

gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt 5040

gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt 5100

caactcagca aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg 5160

ctctgccagt gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa 5220

tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc 5280

tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg 5340

tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata 5400

aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc 5460

ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca 5520

ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga 5580

tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc 5640

agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt 5700

ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg 5760

atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca 5820

tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca 5880

tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca 5940

tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga 6000

atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat 6060

gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggctt 6120

tccccccccc cctgcaggtc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata 6180

tcgccgacat caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt 6240

tcggcgtggg tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc 6300

atgcaccatt ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc 6360

taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gagtatctat gattggaagt atgggaatgg 6420

tgatacccgc attcttcagt gtcttgaggt ctcctatcag attatgccca actaaagcaa 6480

ccggaggagg agatttcatg gtaaatttct ctgacttttg gtcatcagta gactcgaact 6540

gtgagactat ctcggttatg acagcagaaa tgtccttctt ggagacagta aatgaagtcc 6600

caccaataaa gaaatccttg ttatcaggaa caaacttctt gtttcgaact ttttcggtgc 6660

cttgaactat aaaatgtaga gtggatatgt cgggtaggaa tggagcgggc aaatgcttac 6720

cttctggacc ttcaagaggt atgtagggtt tgtagatact gatgccaact tcagtgacaa 6780

cgttgctatt tcgttcaaac cattccgaat ccagagaaat caaagttgtt tgtctactat 6840

tgatccaagc cagtgcggtc ttgaaactga caatagtgtg ctcgtgtttt gaggtcatct 6900

ttgtatgaat aaatctagtc tttgatctaa ataatcttga cgagccagac gataatacca 6960

atctaaactc tttaaacgtt aaaggacaag tatgtctgcc tgtattaaac cccaaatcag 7020

ctcgtagtct gatcctcatc aacttgaggg gcactatctt gttttagaga aatttgcgga 7080

gatgcgatat cgagaaaaag gtacgctgat tttaaacgtg aaatttatct caagatctgc 7140

tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 7200

gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg 7260

ggtgttggcg ggtgtcgggg cgcagccatg acccagtcac gtagcgatag cggagtgtat 7320

actggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg 7380

aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgctcaacc gcttcctcgc 7440

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 7500

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 7560

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 7620

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 7680

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 7740

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 7800

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 7860

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 7920

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 7980

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 8040

ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 8100

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 8160

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 8220

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 8280

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 8340

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 8400

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 8460

tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 8520

cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 8580

ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 8640

gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tgcaggcatc gtggtgtcac 8700

gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 8760

gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 8820

gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 8880

tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 8940

aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc 9000

cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 9060

caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 9120

cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 9180

ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 9240

aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 9300

tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 9360

tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 9420

ttcgtcttca agaattaatt ctcatgtttg acagcttatc atcgataagc tgactcatgt 9480

tggtattgtg aaata 9495

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

attggtgcca gcctgttaac a 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gcggcaaatt tttagcggcg g 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

acaggatgtt gaggcgttta tac 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

gagcgttttt ctggcgtggc gatg 24

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ctgcaggtcg actctagagg 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

aagcttaatt aattctgttt cctg 24

<210> 15

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

aggaaacaga attaattaag cttatgtcag ttgaaacaat tcc 43

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

cctctagagt cgacctgcag tcaatagttt ggagtcttac 40

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

tcaccgggct taacccgacg 20

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

atcattggta tgttagacca t 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ccccggcgaa acgccttacg c 21

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

gcgcgatgtt gctctggtgc aaaa 24

Claims (10)

1.一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述重组谷氨酸棒状杆菌是将切胶回收的indigiodine合成酶基因片段连接到DpnI消化的线性化载体穿梭质粒上，再转化导入谷氨酸棒状杆菌感受态细胞获取重组质粒pHG08，后再导入到谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中构建而成。

2.根据权利要求1所述的一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述穿梭质粒为pPIC9K、pXMJ19、pBE2的一种；

其中，所述pPIC9K的核苷酸序列为SEQIDNO.6所示，所述pXMJ19的核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，所述pBE2的核苷酸序列为SEQIDNO.8所示。

3.根据权利要求2所述的一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述穿梭质粒为pXMJ19。

4.根据权利要求1所述的一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述Indigiodine合成酶基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1~SEQIDNO.5任一序列所示。

5.根据权利要求1所述的一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌，其特征在于，所述谷氨酸棒状杆菌感受态细胞为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032感受态细胞或谷氨酸棒状杆菌ATCC9114感受细胞的一种或两种。

6.一种权利要求1所述的生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、谷氨酸棒状杆菌感受态细胞的构建

先将接种量为1%的谷氨酸棒状杆菌甘油活化接种于10ml的LBG液体培养基中，在30℃、100rpm下振荡培养10~20h，获得谷氨酸棒状杆菌LBG培养液；再取3ml谷氨酸棒状杆菌LBG培养液接种于50~150ml的Epo液体培养基中，在20~40℃、50~150rpm下振荡培养至OD600值为0.4~1.2，获得谷氨酸棒状杆菌Epo培养液，并将其置于冰浴中10~60min，后在4℃、4000rpm下进行冷冻离心，去除上清液，收集菌体，向菌体中添加10~50ml的10%甘油溶液，重悬菌体，冷冻离心，重复2~5次，再收集菌体，向收集的菌体中添加1~5ml的10%甘油溶液，重悬菌体，获得谷氨酸棒状杆菌感受态细胞；

其中，LBG液体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，其余为纯水，pH值7.0；

Epo液体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，吐温-80 1g，其余为纯水，pH值7.0，在温度121℃下灭菌20min，后加入无菌的异烟肼4 g和甘氨酸30 g；

S2、重组质粒pHG08的构建

先以穿过质粒模板，加入引物Ⅰ进行PCR扩增，再经DpnI消化，获得线性化载体穿梭质粒；再以indigiodine合成酶基因的质粒为模板，加入引物Ⅱ进行PCR扩增，再经切胶回收，获得indigiodine合成酶基因片段；接着通过In-Fusion试剂盒将线性化载体穿梭质粒和indigiodine合成酶基因片段进行连接，获得连接产物L；然后取10μl连接产物L以化学转化法导入100μl的谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中，再均匀涂布在琼脂糖平板上，并在37℃下倒置培养，长出菌落，挑取单菌落，并在质粒小提试剂盒提取质粒，获得生产蓝色天然染料的重组质粒pHG08；

S3、重组谷氨酸棒状杆菌的构建

将1~10μl重组质粒pHG08加入到50μl谷氨酸棒状杆菌感受态细胞中，轻微震动混匀，迅速转移至0.1cm电击杯中，在电压1.8kV下电击5ms，加入0.5~3ml的LBHIS液体培养基，混合转移，置于30~50℃的水浴中热激2~10min，再在20~40℃、50~500rpm下培养0.5~3h，获得谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液，并将其涂布于LBHIS固体平板上，在20~40℃下培养12~36h，挑取单菌落，在电子显微镜下检测菌株的生长状态，生长良好，获得生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌菌株，并保藏于甘油中，菌株终浓度为10~40%，获得生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌甘油种；

其中，LBHIS液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0；

LBHIS固体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，琼脂20g；脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0。

7.根据权利要求6所述的一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，以pPIC9K为穿梭质粒时，引物Ⅰ为pPIC9K-i-F/pPIC9K-i-R，pPIC9K-i-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，pPIC9K-i-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，引物Ⅱ为pPIC9K-IndC-F/pPIC9K-IndC-R，pPIC9K-IndC-F的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，pPIC9K-IndC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

8.根据权利要求6所述的一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，以pXMJ19为穿梭质粒，引物Ⅰ为pXMJ19-i-F/pXMJ19-i-R，pXMJ19-i-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，pXMJ19-i-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，引物Ⅱ为pXMJ19-IndC-F/pXMJ19-IndC-R，pXMJ19-IndC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，pPIC9K-IndC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

9.根据权利要求6所述的一种生产蓝色天然染料的重组谷氨酸棒状杆菌的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，以pBE2为穿梭质粒，引物Ⅰ为pBE2-i-F/pBE2-i-R，pBE2-i-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，pBE2-i-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，引物Ⅱ为pBE2-IndC-F/pBE2-IndC-R，pBE2-IndC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，pBE2-IndC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

10.一种权利要求1所述的重组谷氨酸棒状杆菌生产蓝色天然染料的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取重组谷氨酸棒状杆菌甘油种涂布于LBG固体平板上，进行平板划线，在30℃下培养12~36h，挑取单菌落，置于LBHIS液体培养基中，在30~50℃、50~500rpm下振荡培养至OD600值为1.0~3.5，获得重组谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液；

（2）取1~10ml重组谷氨酸棒状杆菌LBHIS培养液转接到发酵培养基中，在30~50℃、50~500rpm下发酵培养，发酵至2~15h时，添加终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，持续培养10~50h，获得蓝色发酵液，分离纯化，获得蓝色天然染料；

其中，LBG固体培养基的配方：每升培养基，葡萄糖5g，蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，琼脂20g，其余为纯水，pH值7.0；

发酵培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0；

LBHIS液体培养基的配方：每升培养基，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，NaCl 10g，脑心浸出液18.5g，山梨醇91g，其余为纯水，pH值7.0。

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