KR20210141464A - 비활성화된 apxia, apxiia 및 apxiiia 독소 - Google Patents

Abstract

비활성화된 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIIA 독소, 상기 비활성화된 독소를 포함하는 백신, 및 포유동물의 면역화 및 보호를 위한 이의 용도가 개시된다.

Description

비활성화된 APXIA, APXIIA 및 APXIIIA 독소

발명의 분야

본 발명은 비활성화된 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIIA 독소, 상기 비활성화된 독소를 포함하는 백신, 및 포유동물의 면역화 및 보호를 위한 이의 용도에 관한 것이다.

악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에(Actinobacillus pleuropneumoniae) (APP)는 그람-음성 박테리아이며 파스퇴렐라세아에(Pasteurellaceae) 과의 구성원이다. APP는 전 세계적으로 돼지 생산에 큰 경제적 손실을 유발하는 돼지의 중증 폐질환인 돼지 흉막폐렴의 병인체이다. 질환은 출혈성, 섬유소성 및 괴사성 폐 병변을 특징으로 한다. 질환에서 살아남은 돼지는 종종 APP의 무증상 보균자가 되며 박테리아 전파의 주요 원인이다.

현재까지, 18 개의 혈청형이 협막 다당류 (CPS)의 항원 특성에 근거하여 및 유전자형 분석의 결과에 따라 식별되었다. APP의 주요 병독성 인자는 외독소, CPS, 지질다당류 (LPS) 및 막 단백질이다. 가장 중요한 병독성 인자는 독소 (RTX) 패밀리의 기공-형성 반복부에 속하는 Apx-외독소이다. 독소는 면역원성이 높은 것으로 알려져 있으며 APP 관련된 흉막폐렴에 대한 보호적 면역을 수득하기 위해 매우 중요하다. ApxI, ApxII, ApxIII 및 ApxIV로 지정된 4 개 이상의 상이한 Apx 독소가 APP에 의해 생산된다. ApxI은 강하고 ApxII는 낮은 용혈성 활성을 나타낸다. 둘 모두는 상이한 숙주 종의 광범위한 세포에 대해 세포독성이 있으며 활성이다. ApxIII는 비용혈성이지만 돼지 폐포 대식세포 및 호중구를 주요 표적으로 하는 강력한 세포독성이 있다. ApxIV는 세포독성이 없으며 단지 1 주일 만의 용혈성 활성을 나타낸다. APP의 혈청형은 4 개의 Apx 독소를 모두 생산하지 않는다. 대부분의 혈청형은 3 가지 Apx 독소를 생산한다. Apx 독소 생산 패턴은 병독성과 연관되며, 혈청형 1, 5, 9 및 11은 ApxI을 생산하고 ApxII는 가장 병독성이 있다.

4 개 이상의 유전자가 활성 Apx 독소의 생산 및 분비를 담당한다. 유전자 A는 구조적 독소를 코딩하고 유전자 C는 독소의 번역 후 활성화에 필수적인 아실트랜스퍼라제를 코딩한다. 유전자 B 및 D는 성숙한 독소의 분비에 필요한 2 개의 막 단백질을 코딩한다. Apx 유전자는 오페론으로서 조직된다. ApxI 및 ApxIII 독소의 오페론은 유전자 CABD로 이루어지는 반면, ApxII 오페론은 유전자 CA만을 함유한다. 따라서, ApxIIA의 분비는 ApxI 오페론의 활성 유전자 B 및 D에 의존한다.

현재, 돼지의 APP 감염으로 인한 흉막폐렴은 일반적으로 항생제로 치료된다. 그러나, APP가 종종 APP 감염 치료에 흔히 사용되는 항생제 중 하나 이상에 대해 항생제 저항성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.

APP에 대한 백신접종은 흉막폐렴을 예방하는 유망한 예방적 전략이다. 여러 백신이 상용화되어 왔다. 상업적으로 이용가능한 백신은 화학적으로 비활성화된 전체 세포 백신 또는 서브유닛 백신 또는 둘 모두의 조합이다. 전체 세포 백신을 백신접종한 동물의 면역학적 반응은 주로 표면 구조, 예컨대, CPS 및 LPS에 대한 것이다. 높은 면역원성 및 보호에 필수적인 것으로 알려진 분비 단백질, 예컨대, Apx 독소의 부재는 박테린에서 관찰되는 제한된 보호를 설명한다. 더욱이, APP 전체 세포 백신은 백신 제조에 사용된 혈청형에 대해 상동 보호만을 부여한다.

상업적으로 이용가능한 서브유닛 백신 (특허 EP0453024 B1)은 화학적으로 비활성화된 ApxA 독소뿐만 아니라 외막 단백질을 함유한다. 변성 물질, 예컨대, 포름알데히드를 이용한 ApxA 독소의 비활성화는 감소된 톡소이드의 면역원성을 야기한다. 이러한 백신의 단점은 ApxA 독소의 불완전한 비활성화로 인한 아마도 잔류 독성으로 인한 수반되는 심각한 부반응뿐만 아니라 변성 독소로 인한 불충분한 보호가 있다. 차후에, 비활성화 후 감소된 면역원성으로 인해 더 많은 양의 독소가 사용될 필요가 있어 백신에서 증가된 양의 오염 LPS를 초래한다. 높은 LPS 함량은 상업적인 APP 서브유닛 백신에서 볼 수 있는 부작용을 유발할 수 있다.

현재 상업적으로 이용가능한 백신은 APP 감염에 대한 만족스러운 안전성 및/또는 효능 프로파일을 보유하지 않는다는 결론을 내릴 수 있다.

더욱이, APP 백신에 대한 일부 다른 실험적 접근법이 있다.

특허 출원 W02004045639 (A1)는 독소 ApxIA 및 ApxIIA를 코딩하는 유전자의 막관통 도메인에서 변형된 APP 균주를 함유하는 돼지 흉막폐렴에 대한 약독화된 생 백신을 개시한다. 약독화 정도를 테스트하기 위해 3 개월령 돼지에 변형된 생 APP 균주를 접종하였다. 접종 7 일 후 동물을 희생시키고 호흡기의 육안적 병변을 기록하였다. 모든 동물은 부검에서 행동의 변형 및 폐 병변을 보여주었다. 이러한 생백신의 효능은 조사되지 않았다.

특허 출원 EP0810283 (A2) 및 특허 EP0861319 (B1)는 ApxA 활성화제 유전자 apxC에서 결실을 갖는 약독화된 생 APP 균주를 기재한다. 변형된 APP 균주는 활성화제 단백질 ApxC를 기능적 형태로 생산하지 않으므로 독소 ApxIA 및 ApxIIA는 아실화에 의해 활성화되지 않았다. 마우스를 ΔapxC 균주로 백신접종하고 병독성 APP 야외 균주(field strain)로 시험감염(challenge)하였다. 백신접종된 마우스는 상동 시험감염에 대해 보호되었고 이종 시험감염에 대해 부분적으로 보호되었다. 돼지에서의 연구가 수행되었다. 백신접종된 돼지 6 마리 중 1 마리는 이종 시험감염 및 부검 후 폐 병변을 가졌다. 이러한 약독화된 생백신은 효과적인 것으로 보이지만 이 백신은 안전성 위험을 지닌다. 백신 균주는 apxC가 결여되었기 때문에 아실화에 의해 활성화되지 않는 Apx 독소를 생산한다. 그러나, 이러한 독소는 독성 ApxA의 원래 아미노산 서열을 가지고 있다. 매우 가능성이 높은 이종 아실트랜스퍼라제는 ApxA를 아실화하여 활성 독성 형태로 전환할 수 있다. 전 세계 대부분의 양돈장에는 낮은 병독성 APP 균주에 감염된 돼지뿐만 아니라 병독성 APP 균주의 점근적 보균자가 있다. 이러한 돼지가 ΔapxC 백신 균주로 백신접종되는 경우, 백신 균주의 활성화되지 않은 ApxA 독소가 야외 균주의 기능적 ApxC 단백질에 의해 활성화될 수 있다. 더욱이, 기능적 apxC 유전자의 섭취에 의해 apxC 결실을 보완할 가능성이 있다. 약독화된 균주가 병원성 균주로 되돌아가 접종된 동물의 질환을 초래할 가능성이 있다.

오늘날까지 약독화된 생백신은 상업적으로 이용가능하지 않다.

따라서, 돼지 및/또는 어린 새끼 돼지에서 모든 관련 혈청형에 대해 안전하고 교차 보호를 유도할 수 있는 APP에 대한 개선된 백신이 필요하다.

따라서, 본 발명의 목적은 비활성화된 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIIA 독소, 및 돼지 흉막폐렴에 대해 안전하고 효과적인 서브유닛 및 생백신에서의 이들 톡소이드의 용도를 제공하는 것이다.

요약

본 발명은 이들 단백질의 비활성이지만 완전한 면역원성 톡소이드 형태를 생성하기 위한 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIIA 독소의 아실화 측면의 변형을 개시한다. 2 개의 아실화 측면의 아미노산 둘 모두의 다른 아미노산으로의 대체는 이들이 아실화되는 것을 방지한다. 결과적으로, 이러한 변형된 Apx 독소는 표적 세포막에 대한 결합을 개시할 수 없으며 세포독성 또는 용혈성 활성을 갖지 않는다. 독소는 화학적으로 비활성화되어 높은 면역원성 단백질을 초래할 필요가 없다. 효과적인 서브유닛 백신의 생산에 필요한 이들 단백질의 양은 상대적으로 적다. 따라서, 오염 LPS의 함량은 또한 상대적으로 낮아 사소한 부작용, 예컨대, 적은 구토 및 무감각증을 초래한다. 화학적으로 비활성화된 Apx 서브유닛과 비교하여 더 나은 면역원성으로 인해, 본 발명에 따른 서브유닛 백신은 더 나은 안전성 프로파일을 제공한다.

더욱이, 발명은 2 개의 아미노산의 대체가 apxA 유전자의 유전적 변형에 기반하기 때문에 생백신에 사용될 수 있다. 따라서, 이는 비활성화된 및 높은 면역원성 Apx 단백질을 후속적으로 생산하는 APP 균주로 옮길 수 있다. 이들 균주는 ApxA 톡소이드뿐만 아니라 넓은 스펙트럼의 다른 APP 단백질을 생산하는 생백신으로서 사용할 수 있다. 이들 백신은 복잡한 면역 반응 및 광범위한 APP 혈청형에 대한 교차 보호를 유도한다. apxA 유전자의 유전적 변형으로 인해 생산된 Apx 톡소이드는 이종 아실트랜스퍼라제에 의해 활성화될 수 없다. 생 APP 백신 균주를 사용할 때 일부 더 많은 이점이 있다. 백신에 대한 모계 항체의 영향은 높은 면역원성 항원으로 이루어진 서브유닛 백신에 비해 생백신을 사용할 때 더 낮을 것으로 예상된다. 따라서, 6 주령 이전의 새끼 돼지에 백신을 사용할 높은 가능성이 있어, 기존의 이용가능한 백신의 면역학적 갭을 피할 수 있다. 추가적인 유전자 녹아웃을 사용하여 훨씬 더 약독화된 백신 균주를 달성하고 유전자 녹아웃을 예컨대, apxIVA 유전자의 결실에 의한 백신접종된 동물로부터 감염을 구별하기 위한 (DIVA) 마커로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 모든 알려진 백신 접근법보다 더 나은 안전성 및 효능 프로파일을 제공한다. APP가 돼지에 강력하게 적응되기 때문에, 약독화된 APP 백신 균주는 돼지와 관련된 다른 병원체의 항원에 대한 벡터로서 또한 사용될 수 있다.

발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의된다.

악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드가 개시되며, 여기서

a. 야생형 아미노산 서열이되,

i. 서열번호 1에 제시된 ApxIA의 야생형 아미노산 서열은 K560 및 K686으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되고,

ii. 서열번호 2에 제시된 ApxIIA의 야생형 아미노산 서열은 K557 및 N687로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되고,

iii. 서열번호 3에 제시된 ApxIIIA의 야생형 아미노산 서열은 K571 및 K702로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되며,

하나 이상의 아미노산은 아실화에 민감하지 않은 아미노산에 의해 교환되거나;

b. a. 하에서 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동성인, a. 하에서 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열의 유사체 또는 단편이되, 단편은 a. 하에서 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열의 연속적인 아미노산의 50% 이상을 포함하고, 유사체 또는 단편은 a 하에서 정의된 바와 같이 아실화에 민감하지 않은 아미노산을 포함하거나;

c. 야생형 아미노산 서열이되,

i. 서열번호 1에 제시된 ApxIA의 야생형 아미노산 서열은 K560 및 K686으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유하고,

ii. 서열번호 2에 제시된 ApxIIA의 야생형 아미노산 서열은 K557 및 N687로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유하고,

iii. 서열번호 3에 제시된 ApxIIIA의 야생형 아미노산 서열은 K571 및 K702로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유하며,

여기서 결실은 야생형 아미노산 서열의 50% 초과를 결실하지 않거나;

d. c. 하에서 정의된 바와 같은 결실을 포함하는 아미노산 서열의 유사체가 c 하에서 정의된 바와 같은 결실을 포함하는 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동성이다.

도 1은 APP 상층액으로부터 단리된 BL-3 세포 및 ApxA 독소를 사용한 세포독성 검정의 확립을 예시한다.
도 2는 BL-3 세포 및 유전적으로 변형된 ApxIA 및 야생형 ApxIA 독소 (A) 및 유전적으로 변형된 ApxIIIA 및 야생형 ApxIIIA 독소 (B)를 사용한 세포독성 검정을 예시한다.
도 3은 APP 상층액으로부터 단리된 양 혈액 및 ApxA 독소를 사용한 용혈성 검정의 확립을 예시한다.
도 4는 양의 혈액 및 유전적으로 변형된 ApxIA 및 야생형 ApxIA 독소를 사용한 용혈성 검정을 예시한다.
도 5: 제1 백신접종 (A) 및 제2 백신접종 (B) 6 시간 후 직장 체온. 각각의 점은 개별 동물의 직장 체온을 나타낸다. 막대는 95% 신뢰 구간의 중앙값을 나타낸다. Dunn의 다중 비교 테스트; * = p < 0.05; ** = p < 0.01.
도 6: 돼지 혈청에서 ApxIA-, ApxIIA- 및 ApxIIIA-특이적 IgG의 정량화. 상이한 항원에 대한 IgG 결합을 ELISA를 사용하여 정량화하였다. 백신접종 전 (d0), 제1 백신접종 2 주 후 (d14) 및 제2 백신접종 2 주 후 (d28)의 상이한 그룹의 돼지로부터의 혈청을 분석하였다. 각각의 시점의 정량화된 평균 그룹 IgG 값을 그룹 1의 상응하는 시점과 비교하였다. Dunn의 다중 비교 테스트; * = p < 0.05; ** = p < 0.01. 막대는 중앙값을 나타낸다. AU: 임의적인 유닛.
도 7: 제2 백신접종 2 주 후 돼지로부터의 혈청 및 6 μg의 활성 ApxIA 독소를 사용한 혈청 중화 검정. 세포의 생존력은 대사 활성 세포에 의해 대사되는 WST-1을 사용하여 사정되었다. 범례는 동물 수 및 ApxIA-특이적 IgG ELISA 데이터를 괄호 (A)로 표시한다. y최대/2의 X-값 (혈청 농도)은 비선형 회귀 곡선 (B)에 의해 계산되었다. Dunn의 다중 비교 테스트; ** = p < 0.01; n.s. = 유의하지 않음. 막대는 중앙값을 나타낸다. AU: 임의적인 유닛.
도 8: "백신 1" (그룹 1), 포실리스(Porcilis)^® APP (그룹 2) 또는 위약 (그룹 3)을 받은 3 개의 그룹 중 APP 혈청형 9로 시험감염한 후의 누적된 임상 점수. 누적된 임상 점수를 그룹 3의 상응하는 임상 점수와 비교하였다. Dunn의 다중 비교 테스트; * = p < 0.05; ** = p < 0.01. 막대는 중앙값을 나타낸다.
도 9: "백신 1" (그룹 1), 포실리스(Porcilis)^® APP (그룹 2) 또는 위약 (그룹 3)을 받은 3 개의 그룹 중 APP 혈청형 9로 시험감염한 후의 돼지의 생존. 그룹 1 및 그룹 2에서는 생존 백분율이 100%인 반면, 그룹 3에서의 동물의 37.5%는 APP에 의해 유발된 중증 증상으로 인해 동물 복지상의 이유로 사망하거나 안락사해야만 했다.
도 10: "백신 1" (그룹 1), 포실리스(Porcilis)^® APP (그룹 2) 또는 위약 (그룹 3)을 받은 3 개의 그룹 중 APP 혈청형 9로 시험감염한 후의 폐 병변 점수. 그룹 1 및 그룹 2의 폐 병변 점수를 상응하는 폐 병변 점수 대조군 (그룹 3)과 비교하였다. Dunn의 다중 비교 테스트; * = p < 0.05; ** = p < 0.01. 막대는 중앙값을 나타낸다.

다음 표제는 단지 개시내용을 조직하는 역할을 하지만, 개시내용의 한 섹션을 개시내용의 추가 섹션과 분리하는 것으로서 간주되어서는 안된다. 각각의 섹션의 특색은 임의의 추가 섹션의 특색과 조합될 수 있다.

일반 정의

본원에 사용된 바와 같은 용어 "단편 또는 유사체"는 다음과 같이 정의된다:

"유사체"는 원래 아미노산 서열에 대해 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 97% 이상의 상동성 수준을 나타내는 아미노산 서열로서 간주될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 상동성은 동일성을 의미한다. 이와 같이, 서열은 보존적 치환, 결실 또는 삽입에 기반하여 서로 상이할 수 있다.

동일성 정도는 예를 들어, 예상 역치: 10, 단어 크기: 3, 매트릭스: BLOMSUM62, 갭 비용: 존재: 11 확장: 1 및 구성적 조정: 조건부 구성적 점수 매트릭스 조정인 디폴트 매개변수가 있는 blastp 알고리즘을 사용하여 단백질 블라스트 프로그램으로 결정될 수 있다 (BLAST는 국립 의학 도서관의 등록 상표임). 프로그램은 단백질 쿼리를 사용하여 단백질 데이터베이스를 검색하는 데 사용될 수 있다. 동일성은 정렬된 쿼리 및 데이터베이스 서열 사이의 정확한 매치를 보고한다.

바람직하게는, 보존적 아미노산 "치환"은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것, 즉, 보존적 아미노산 대체의 결과이다. 아미노산 치환은 연루된 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질의 유사성의 근거로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성 (소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함하고; 극성 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고; 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 포함하며; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

"삽입" 또는 "결실"은 전형적으로 약 1, 2 또는 3 개의 아미노산 범위에 있다. 허용된 변이는 재조합 DNA 기술을 사용하여 단백질에서의 아미노산의 삽입 또는 결실을 체계적으로 도입하고 생성된 재조합 변이체의 활성을 검정함으로써 실험적으로 결정될 수 있다. 이것은 숙련된 사람에게 일상적인 실험 초과의 것을 요구하지 않는다.

폴리펩티드의 "단편"은 원래 폴리펩티드의 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 97% 이상을 포함한다. 이들 단편은 본 발명에 따른 백신의 독점적인 활성 성분으로서 사용될 수 있다.

APP "독소"는 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA의 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 1-3에 제시된 바와 같음)로 이루어지고 세포독성 및/또는 용혈성 활성을 나타내는 폴리펩티드이다. 본 개시내용에서의 "톡소이드"는 "독소"의 변형된 형태인 폴리펩티드이며, 여기서 변형은 APP에서 생체 내 아실화에 민감하고 임의의 세포독성 또는 용혈성 활성을 나타내지 않는 아미노산의 대체 또는 결실에 의해 달성된다.

백신 조성물의 맥락에서 본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 추가의 활성 또는 면역원성 구성요소가 존재할 수 있음을 의미한다. "이로 이루어진"은 추가의 구성요소가 존재하지 않는다는 것을 의미하며 "본질적으로 이로 이루어진"은 특이적인 추가의 구성요소, 즉, 백신의 본질적인 특징에 실질적으로 영향을 미치지 않는 구성요소 (즉, 비활성 또는 면역원성이 아닌 성분)가 존재할 수 있음을 의미한다.

악티노바실러스 속은 기도 및 비뇨생식기관의 점막 표면을 콜로니화하는 그람-음성, 비포자-형성 및 주로 캡슐화된 박테리아 종을 포함한다. 관련 수의학 종은 예를 들어, A. 플뢰로뉴모니아에, A. 수이스(A. suis), A. 에퀼리(A. equuli) 및 A. 리그니에레시이(A. lignieresii)가 있으며 이들은 본 개시내용의 선호되는 악티노바실러스 종이다. 악티노바실러스 종은 일반적으로 강한 숙주 특이성을 나타낸다. 선호되는 APP 혈청형은 혈청형 1, 5, 7, 8, 9 및 11이다.

폴리펩티드

개시내용은 야생형 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드가 야생형 폴리펩티드에서 아실화에 민감한 아미노산의 위치에서 아미노산 치환 또는 결실에 의해 변형된 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드 (이하, 간략화를 위해 교환가능하게 ApxA 폴리펩티드로 지정됨)에 관한 것이다. 아미노산 치환은 아실화에 민감하지 않은 아미노산을 도입한다. 상기 기재된 방식으로 변형된 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드가 더 이상 임의의 용혈성 및/또는 세포독성 활성을 나타내지 않는다는 것이 놀라운 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들은 APP에 대한 면역학적 보호를 부여하면서 포유동물을 백신접종하기 위해 사용될 때 더 적은 부작용을 나타낼 수 있다. 따라서, 이들은 비활성화된 독소, 즉, 톡소이드로서 간주될 수 있다. 따라서, 개시내용의 폴리펩티드는 APP 감염에 대해 대상체, 특히, 포유동물을 면역화하기 위한 백신에서 안전하게 사용될 수 있다.

야생형 폴리펩티드에서 아실화에 민감한 아미노산의 위치에 치환을 포함하는 폴리펩티드

특히, 개시내용은 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서

a. 야생형 아미노산 서열이되,

i. 서열번호 1에 제시된 ApxIA의 야생형 아미노산 서열은 K560 및 K686으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되고,

ii. 서열번호 2에 제시된 ApxIIA의 야생형 아미노산 서열은 K557 및 N687로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되고,

iii. 서열번호 3에 제시된 ApxIIIA의 야생형 아미노산 서열은 K571 및 K702로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되며,

하나 이상의 아미노산은 아실화에 민감하지 않은 아미노산에 의해 교환된다.

폴리펩티드는 포유동물에 투여될 때 상기 포유동물, 특히, 돼지의 APP의 하나 이상의 혈청형에 대한 체액성 또는/및 세포성 면역학적 반응을 유도할 수 있다. 폴리펩티드는 APP의 하나의 균주, 예를 들어, 포유동물에 투여될 때 상기 포유동물, 특히, 돼지의 APP의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 균주에 대한 체액성 또는/및 세포성 면역학적 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 APP, APP 균주 또는 APP 혈청형에 대한 무균 면역을 유도한다.

각각의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA는 아실화에 민감한 2 개의 아미노산을 포함한다. 변형은 하나의 또는 둘 모두의 상기 아미노산에 영향을 미칠 수 있다.

개시내용은 또한 상기 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동성인, 상기 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열의 유사체 또는/및 단편에 관한 것이며, 단편은 상기 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열의 연속적인 아미노산의 50% 이상을 포함하고, 유사체 또는 단편은 상기 정의된 바와 같이 아실화에 민감하지 않은 아미노산을 포함한다.

상기 정의된 바와 같이 유사체는 결실 또는 보존적 치환에 의해 야생형과 상이할 수 있다. 그러나, 유사체는 항상 아실화에 민감한 아미노산을 대체하는 아미노산을 포함한다.

변형된 폴리펩티드는 아실화에 민감한 아미노산을 함유하지 않기 때문에 변형된 폴리펩티드는 아실화될 수 없다. 이러한 방식으로 변형된 폴리펩티드는 임의의 내인성 또는 외인성 아실트랜스퍼라제 (예컨대, 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에의 ApxC)에 의해 아실화될 수 없다. 하기에 실험적으로 도시된 바와 같이, 변형된 폴리펩티드는 더 이상 실질적인 병리학적 효과를 나타내지 않으므로 백신 조성물에 안전하게 사용될 수 있다. 이들 변형된 폴리펩티드는 아실트랜스퍼라제가 APP의 자연 발생 균주 또는 생체 내 아실트랜스퍼라제의 임의의 다른 공급원에 의해 외인적으로 제공되더라도 병리학적으로 남아 있기 때문에 아실트랜스퍼라제 ApxC가 결실된 백신보다 백신 조성물에 사용하기에 더 안전하다. 동일한 고려사항이, 아실화에 민감한 APP의 하나의 또는 2 개의 아미노산이 결실되는 다음의 폴리펩티드에 적용된다.

야생형 폴리펩티드에서 아실화에 민감한 아미노산의 위치에 결실을 포함하는 폴리펩티드

야생형 폴리펩티드에서 아실화에 민감한 아미노산을 치환하는 대신에 아미노산은 또한 야생형 폴리펩티드의 병리학적 효과를 없애기 위해 결실될 수 있다.

따라서, 개시내용은 또한 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드에 관한 것이며, 여기서

i. 서열번호 1에 제시된 ApxIA의 야생형 아미노산 서열은 K560 및 K686으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유하고,

ii. 서열번호 2에 제시된 ApxIIA의 야생형 아미노산 서열은 K557 및 N687로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유하며,

iii. 서열번호 3에 제시된 ApxIIIA의 야생형 아미노산 서열은 K571 및 K702로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유한다.

폴리펩티드는 포유동물에 투여될 때 상기 포유동물, 특히, 돼지의 APP의 하나 이상의 혈청형에 대한 체액성 또는/및 세포성 면역학적 반응을 유도할 수 있다. 폴리펩티드는 APP의 하나의 균주, 예를 들어, 포유동물에 투여될 때 상기 포유동물, 특히, 돼지의 APP의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 균주에 대한 체액성 또는/및 세포성 면역학적 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 APP, APP 혈청형, APP 균주 또는 APP 혈청형에 대한 무균 면역을 유도한다.

상기 언급된 바와 같이, ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 각각은 아실화에 민감한 2 개의 아미노산을 포함한다. 상기 아미노산의 결실은 상기 아미노산 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.

따라서, 결실은 각각의 야생형 서열에서 아실화에 민감한 하나의 또는 2 개의 아미노산만이 결실된 점 결실을 포함할 수 있다. 결실이 또한 아실화에 민감한 하나의 또는 2 개의 아미노산에 인접한 영역에서 아미노산을 결실시킨다는 것이 또한 개시되어 있다. 따라서, 각자의 결실은 결실이 아실화에 민감한 2 개의 아미노산 중 하나를 포함하는 한, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 300, 350, 400 개의 아미노산을 포함할 수 있다. 아실화에 민감한 각각의 아미노산에 대한 결실의 크기는 동일한 크기를 가지므로 서로 독립적일 수 있다. 아실화에 민감한 2 개의 아미노산 사이의 연속적인 아미노산 스트레치를 덮는 결실이 또한 개시되어 있다.

결실은 야생형 아미노산 서열의 50% 초과를 결실하지 않는다.

개시내용은 또한 상기 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동성이고 상기 정의된 바와 같이 아실화에 민감하지 않은 아미노산을 포함하지 않는, 상기 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열의 유사체에 관한 것이다. 이러한 유사체는 일반 정의와 관련된 섹션에 정의된 바와 같은 보존적 치환 및 결실을 포함할 수 있다. 따라서, 폴리펩티드는 아실화에 민감한 하나의 또는 2 개의 아미노산을 포함하는 결실된 영역 외부에 추가의 결실을 포함할 수 있지만, 이러한 결실은 1, 2, 3 개의 아미노산만을 결실시킬 것이다.

아미노산은 아실화에 민감하지 않음

아실화에 민감한 아미노산은 자연 발생 아미노산, 예컨대, 리신 및/또는 아스파라긴이다. 아실화에 민감하지 않은 아미노산은 당업자에게 알려져 있으며, 아실화에 민감한 아미노산 중 하나 또는 둘 모두를 치환하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 아실화에 민감하지 않은 아미노산은 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 발린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 히스티딘, 아스파르트산, 시스테인, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 특히, 아실화에 민감하지 않은 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.

게다가, 아실화에 민감하지 않은 아미노산은 알라닌, 글리신 및 세린으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 아실화에 민감하지 않은 가장 바람직한 아미노산 아미노산은 알라닌이다.

2 개의 변형된 아미노산을 포함하는 APXIA, APXIIA 또는 APXIIIA 폴리펩티드

바람직하게는, 아실화에 민감한 2개의 아미노산이 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 각각에서 변형된다.

따라서, 서열번호 1에 제시된 ApxIA의 야생형 서열은 K560 및 K686에서 변형된다. 따라서, 서열번호 2에 제시된 ApxIIA의 야생형 서열은 K557 및 N687에서 변형된다. 따라서, 서열번호 3에 제시된 ApxIIIA의 야생형 서열은 K571 및 K702에서 변형된다.

ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 각각에서 아실화에 민감한 상기 2 개의 아미노산이 알라닌으로 변형된다는 것이 또한 개시되어 있다.

따라서, 개시된 변형된 폴리펩티드는 서열번호 4, 5 또는 6에 제시된 서열을 가질 수 있거나, 상기 정의된 바와 같은 이의 유사체 또는 단편일 수 있다.

핵산

상기 기재된 폴리펩티드를 코딩할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 핵산이 또한 개시되어 있다. 개시된 핵산은 cDNA, DNA, RNA, cRNA 또는 PNA (펩티드 핵산)일 수 있다. 용어 "핵산 서열"은 이들 뉴클레오티드의 서열의 뉴클레오티드의 헤테로중합체를 지칭한다. 핵산은 서열번호 10, 11 또는 12에 제시된 핵산을 포함할 수 있다.

핵산은 개시내용의 핵산을 클로닝하거나 발현하기에 적합한 벡터에 포함될 수 있다. 예시적인 벡터는 pEX-A258 (서열번호 19), pQE-80L (서열번호 20), 또는 pQE-60 (서열번호 21)이다. 핵산 또는 벡터는 유도성 또는 비-유도성 프로모터, 오퍼레이터 (예컨대, lac-오퍼레이터) 또는 다른 AP 단백질을 코딩하는 핵산과 같은 추가적인 조절 비코딩 요소를 포함할 수 있다. 추가로, 본 발명에 따른 백신 조성물은 폴리뉴클레오티드가 벡터의 발현 제어 영역에 작동가능하게 연결된 벡터에 통합된 폴리뉴클레오티드를 추가로 특징으로 하는 것이 바람직하다. 따라서, 발현 벡터가 또한 개시되며, 여기서 발현 벡터는 바람직하게는 ApxA의 변형된 형태를 코딩하는 핵산 서열에 더하여 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 용어 "발현 벡터"는 일반적으로 DNA (RNA) 서열로부터 폴리펩티드를 발현하기 위한 플라스미드 또는 파지 또는 바이러스 또는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 (1) 유전자 발현에서 조절 역할을 하는 유전적 요소 또는 요소들, 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 개시 및 종결 서열의 어셈블리를 포함하는 전사 유닛을 포함할 수 있다. 효모 또는 진핵생물 발현 시스템에 사용하기 위해 의도된 구조적 유닛은 바람직하게는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 대안적으로, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우, N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 최종 생산물을 제공하기 위해 발현된 재조합 단백질로부터 후속적으로 절단되거나 절단되지 않을 수 있다.

미생물

개시된 핵산 또는/및 상기 기재된 벡터를 포함하는 미생물이 또한 개시된다. 미생물은 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)(대장균), 대장균 균주, 예컨대, 대장균 ToplOF' 균주 또는 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에, 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에 균주, 예컨대, ST2 (예컨대, APP23), ST2 (예컨대, 07/07), ST5 (예컨대, DZY47), ST7 (예컨대, DZY33) 또는 ST8 (예컨대, DZY49)일 수 있다. 미생물은 또한 다른 유전자를 코딩하는 핵산 또는/및 벡터를 포함한다.

백신 조성물

상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 변형된 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드, 상기 정의된 바와 같은 핵산 분자, 또는 상기 정의된 바와 같은 벡터, 또는 상기 정의된 바와 같은 미생물을 포함하는 백신 조성물이 또한 개시된다. 백신 조성물은 적어도 약학적 담체, 희석제 또는/및 아쥬반트를 포함할 수 있다.

발명에 따른 백신 조성물의 제조는 당업계에 알려져 있으며, 당업자에게 알려진 핸드북에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 백신 조성물의 생산을 위해, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 아쥬반트는 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: 미네랄 염 아쥬반트 (예컨대, 명반-, 칼슘-, 철-, 지르코늄-계), 텐소액티브(tensoactive) 아쥬반트 (예컨대, Quil A, QS-21, 기타 사포닌), 박테리아-유래된 아쥬반트 (예컨대, N-아세틸 무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (MDP), 지질다당류 (LPS), 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디미콜레이트 (TDM), DNA, CpG, 박테리아 독소), 아쥬반트 에멀젼 (예컨대, FIA, 몬타나이드(Montanide), 아쥬반트 65, 리포반트(Lipovant)), 리포솜 아쥬반트, 중합체성 아쥬반트 및 담체, 사이토카인 (예컨대, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자), 탄수화물 아쥬반트, 살아있는 항원 전달 시스템 (예컨대, 박테리아 특히 변형된 APP). 더욱이, 담체는 또한 건조 제형, 예컨대, 티탄 또는 중합체로 만들어진 코팅된 패치를 포함할 수 있다. 본 출원의 백신의 제형화 및 투여를 위한 기술은 또한 "Remington, The Science and Practice of Pharmacy", 22판에서 찾을 수 있다.

유닛 조성물로서의 백신 조성물은 0.01 - 2.0 mg의 단백질, 0.01 - 2.0 mg의 핵산, 또는 0.5 - 200 mg (또는 1x1O⁴ 개의 CFU-1x10¹⁰ 개의 CFU, 콜로니 형성 유닛)의 미생물을 포함할 수 있다. 단백질, 핵산 또는 미생물의 필요한 활성량은 예컨대, 돼지 또는 새끼 돼지에서 당업자에 의한 일상적인 테스트 방법에 의해 결정될 수 있다.

상기 기재된 바와 같은 하나 이상의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물은 서브유닛 백신일 수 있다. 서브유닛 백신은 추가의 APP 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

백신은 핵산 또는 벡터만을 실질적으로 함유하며, 예를 들어, DNA 백신인 것으로 또한 고려된다. DNA 백신은 3세대 백신이다. 핵산 또는 DNA 백신은 APP로부터의 특이적 단백질 (ApxA)을 코딩하는 DNA/핵산을 함유한다. DNA/핵산은 포유동물의 신체에 주사되고 세포에 의해 흡수되며, 세포의 정상적인 대사 과정은 흡수한 핵산의 유전적 코드를 기반으로 단백질을 합성한다. 이러한 단백질이 APP의 특징인 아미노산 서열의 영역을 함유하기 때문에, 이들은 이물질로서 인식되고 숙주 세포에 의해 가공되어 표면에 표시될 때 면역계에 경보가 울려 면역 반응을 촉발한다.

대안적으로, 핵산은 세포 진입을 용이하게 하기 위해 단백질로 캡슐화될 수 있다. 이 캡시드 단백질이 핵산에 포함되어 있는 경우, 생성된 백신은 복원 위험 없이 생백신의 효력을 조합할 수 있다.

백신 조성물 중 상기 기재된 바와 같은 미생물은 악티노바실러스 종, 예를 들어, 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에, 악티노바실러스 수이스, 악티노바실러스 종 균주, 예를 들어, 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에의 균주, 악티노바실러스 수이스의 균주, 또는 악티노바실러스 종의 균주의 특정 혈청형일 수 있다. 백신 조성물은 하나 이상의, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 개의 악티노바실러스 종 균주 또는 악티노바실러스 종 균주의 혈청형을 포함할 수 있다. 악티노바실러스 종, 균주 또는 혈청형 각각은 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.

백신 조성물 중 상기 기재된 바와 같은 미생물은 개시된 변형된 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드와 상이한 APP 단백질을 코딩하는 APP 핵산을 포함하지 않을 수 있다. 예를 들어, 미생물은 apxlV 유전자 또는/및 sxy 유전자의 결실을 포함할 수 있다.

또한, 백신 조성물에서의 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에 중 하나 이상은 다음의 변형 (예컨대, 단일 또는 다중 결실) 중 하나 또는 2 개 이상을 포함할 수 있다: ΔtbpA, ΔtonB2, ΔsodC, Δ

dsbA, Δfur, ΔmlcA, ΔmglA, ΔexbB, ΔureC, 이중 돌연변이 ΔexbB ΔureC, ΔfhuA, ΔhlyX, 이중 돌연변이 ΔapxIC 및 ΔapxIIC, 삼중 돌연변이 ΔapxIC ΔapxIIC Δorf1, 헥사 돌연변이 ΔapxIIA ΔureC ΔdmsA ΔhybB ΔaspA Δfur, 이중 돌연변이 ΔapxIIIB ΔapxIIID, 이중 돌연변이 ΔcIpP 및 ΔapxIIC, ΔznuA, ΔapfA, 이중 돌연변이 ΔapxIIA 및 ΔureC, 펜타 돌연변이 ΔapxIC ΔapxIIC Δorfl ΔcpxAR ΔarcA, 이중 돌연변이 ΔapxIC ΔompP2, 이중 돌연변이 ΔapxIIC ΔapxIVA, 비활성화된 apxIIC,, 비활성화된 apxIC, Δlip40, ΔcpxA/cpxR, ΔpotD2, ΔAtolC2, ΔsapA, 또는 ΔPdxS/PdxT.

ApxIA의 톡소이드 형태뿐만 아니라 상기 개시된 바와 같은 하나 이상의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물은 현저하게 증가된 면역원성 및 보호 효능을 나타낸다. ApxIA의 톡소이드 형태뿐만 아니라 상기 개시된 바와 같은 하나 이상의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드를 포함하는 백신 조성물은 세포독성 효과 및 용혈성 효과를 나타내지 않으며, 통상적인 면역화 후 발생할 수 있는 면역화 후 체온의 유의한 증가를 유발하지 않는다.

상기 변형은 다음에 개시되어 있다:

본원에 개시된 바와 같은 변형된 폴리펩티드와 상기 열거된 추가적인 알려진 변형의 조합은 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에의 상승작용적 약독화를 초래할 것으로 예상된다.

의학적 용도 또는 방법

개시된 백신 조성물은 폐렴, 흉막염 또는 흉막폐렴, 특히, 대상체에서 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에에 의해 유발된 폐렴, 흉막염 또는 흉막폐렴의 예방적, 대량예방적(metaphylactic) 또는 치료적 치료에 사용될 수 있다. 치료될 대상체는 포유동물, 특히, 돼지일 수 있다. 백신 조성물은 근육 내, 피부 내, 정맥 내, 피하, 또는 점막 적용에 의해 (예컨대, 비강 내) 투여될 수 있다.

백신 조성물은 상기 기재된 바와 같은 유닛 조성물을 사용하여 1 회 이상, 예를 들어, 1 회 또는 2 회 투여를 통해 투여될 수 있다. 특히, 조성물은 대상체의 출생 후 3 일, 1 주, 2 주, 4 주, 6 주, 8 주, 10 주 또는 12 주 이내에 생후 처음으로 투여될 수 있다. 따라서, 백신은 포유동물의 초기 시점에 유리하게 투여될 수 있다. 그러나, 백신이 포유동물의 일생의 임의의 시점에 투여될 수 있다는 것이 또한 개시된다.

백신 조성물은 두 번째로 투여될 수 있으며, 여기서 2 회의 투여 사이의 기간은 1 내지 4 주, 1 내지 3 주, 또는 1 내지 2 주일 수 있다. 바람직하게는, 미생물을 포함하는 백신 조성물은 1 회만 투여되어야 한다.

실시예

다음의 실시예는 본 발명을 설명하는 실험 데이터를 제공하며, 발명을 예시하는 것으로만 이해되어야 한다. 특히, 실시예에 개시된 각각의 특이적 특색이 설명의 선행 부분의 특색과 조합될 수 있음을 고려하였다.

실시예 1: PEX-A258에서 야생형 및 변형된 APXIA, APXIIA 또는 APXIIIA의 클로닝

ApxIA-ApxIIIA의 야생형의 단백질 서열은 데이터 베이스 uniprot, 즉, ApxIA APP ST5b (uniprot: A3N292), ApxIIA APP ST3 (uniprot BOBPPO, 변형 S148G가 있음) 및 ApxIIIA ST8 (uniprot: P55131)로부터 수득하였다.

또한, 다음의 변형을 포함하는 단백질 서열을 제공하였다:

표 1

핵산 서열이 출발 코돈 없이 최적화되고 합성적으로 제조된 (Eurofins Genomics) 코돈인 핵산은 단백질 서열로부터 유래되었다. 각각의 핵산 서열은 5' 단부에서의 제한 부위 BamHI 및 3' 단부에서의 제한 부위 Sacl이 측면에 위치된 플라스미드 pEX-A258 (서열번호 19)에 제공되었다.

실시예 2: PQE-80L (서열번호 20)에서의 야생형 및 변형된 APXIA-APXIIIA의 클로닝 및 발현

각자의 ApxIA-ApxIIIA를 포함하는 1 μg의 pEX-A258은 제조사의 지침에 따라 BamHI FD (ThermoFisher) 및 Sacl FD (ThermoFisher)로 제한되었고, 1% 아가로스 겔 상에서 분해되었다. 적절한 크기의 핵산 단편을 아가로스 겔 (QUIAEX-II)로부터 추출하였다. pQE-80L은 제조사의 지침에 따라 BamHI FD (ThermoFisher) 및 Sacl FD (ThermoFisher)로 제한되었다. 1:5의 비율의 pQE-80L 및 각자의 핵산 단편의 결찰을 T4-DNA 리가제 (ThermoFisher)를 사용하여 실온에서 밤새 수행하였다. 결찰된 DNA를 대장균 Topf10F'에 전기천공하고, ApxIA-ApxIIIA의 야생형 및 변형된 형태의 성공적인 클로닝을 제한 분석 및 시퀀싱에 의해 확인하였다. pQE-80L은 암피실린 저항성을 포함한다.

실시예 3: PQE-60에서의 APXIC, APXIIC 및 APXIIIC 유전자의 클로닝

apxIC-IIIC 유전자는 표 2에 표시된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)을 통해 APP-DNA로부터 증폭시킨 후 정제되었다.

각자의 apxIC-IIIC 핵산 및 pQE-60을 포함하는 PCR 단편을 각자의 제조사의 지침에 따라 하기 표 2에 표시된 제한 효소로 제한하고, 1% 아가로스 겔 상에서 분해하였다.

표 2

적절한 크기의 핵산 단편을 아가로스 겔 (QUIAEX-II)로부터 추출하였다. 1:5의 비율의 pQE-60 및 각자의 핵산 단편의 결찰을 T4-DNA 리가제 (ThermoFisher)를 사용하여 실온에서 밤새 수행하였다.

결찰된 DNA를 대장균 Topf10F'에 전기천공하고, 성공적인 클로닝을 제한 분석 및 시퀀싱에 의해 확인하였다.

실시예 4: PACYC184에서의 APXIC, APXIIC 및 APXIIIC 유전자의 클로닝 및 발현

각자의 apxIC, apxIIC 및 apxIIIC 유전자는 하기 표 3에 표시된 프라이머를 사용하여 실시예 2의 각자의 pQE-60 벡터로부터 증폭되었다.

표 3

이러한 방식으로 프로모터/lac-오퍼레이터 및 리보솜 결합 부위가 또한 앰플리콘 (서열번호 16, 17 및 18)에 함유되었다.

각자의 PCR 생산물은 표 3에 표시된 제한 효소를 사용하여 제한되었고, 상기 표시된 것과 동일한 방법 및 조건을 사용하여 제한 부위 Xbal 및 Nrul (apxIC 및 apxIIIC) 또는 Clal/Bscl 및 Nrul (apxIIC)을 통해 pACYC184에 클로닝되었다. pACYC184는 클로람페니콜 저항성을 포함한다.

결찰된 DNA를 대장균 Topf10F'에 전기천공하고, 성공적인 클로닝을 제한 분석 및 시퀀싱에 의해 확인하였다.

실시예 5: APXIC, APXIIC 또는 APXIIIC 유전자를 포함하는 PACYC184 및 APXIA, APXIIA 또는 APXIIIA를 포함하는 PQE-80L의 공동-형질전환

ApxC는 ApxA 독소의 활성화에 필요하다. 따라서, 실시예 4에서 수득된 각자의 apxIC, apxIIC 또는 apxIIIC 유전자를 포함하는 pACYC184를 각자의 apxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 유전자를 포함하는 pQE-80L과 함께 대장균 TopflOF'로 공동형질전환시키고, 성공적인 공동-형질전환을 50 μg/ml의 암피실린 및 15 μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 성공적인 형질전환을 제한 분석에 의해 확인하였다.

실시예 6: APXA, 특히, APXIA, 독소 및 톡소이드의 발현 및 단리

각자의 ApxA 및 ApxC 유전자를 코딩하는 pACYC184 및 pQE-80L을 포함하는 실시예 5에서 수득된 대장균 콜로니를 사용하여, 40 ml의 LB-배지 (100 μg/ml의 암피실린 및 30 μg/ml의 클로람페니콜)를 접종하였다. 배양물을 밤새 30 ℃에서 진탕 하에서 항온처리하였다. 다음날, 밤새 배양물을 400 ml의 LB 배지 (100 μg/ml의 암피실린 및 30 μg/ml의 클로람페니콜)에 접종하여, 0.1의 광학 밀도 (600 nm에서의 광학 밀도 = OD600)를 달성하였다. 수득된 배양물을 0.5의 OD600이 수득될 때까지 진탕 하에서 항온처리하였다. 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해 1 mM의 IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드)를 첨가하였다. 배양물을 추가 4 시간 동안 30 ℃에서 진탕 하에서 항온처리하였다. 후속적으로, 배양물을 7000 g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액의 제거 후, 박테리아 펠릿을 박테리아 펠릿 1 g당 5 ml의 LEW 완충액을 포함하는 LEW 완충액 (50 mM의 NaH₂PO₄, 아쿠아 증류액 중 300 mM의 NaCl; pH 8.0)에 재현탁하고, -20 ℃에서 보관하였다.

1 ml의 10x 버그 버스터(Bug Buster) (Novagen), 5 μl의 벤조아제 (25 U/μl, Novagen) 및 10 mg의 리소자임을 재현탁된 박테리아 펠릿 10 ml에 첨가하였다. 수득된 현탁액을 실온에서 20 분 동안 천천히 회전시켰다. 4 ℃ 및 15000 g에서 60 분 동안 원심분리한 후 펠렛을 LEW 완충액 (펠렛 1 mg당 10 ml의 LEW 완충액)에서 세척하고 원심분리 (4 ℃, 15000 g, 60 분)하였다. 세척된 펠릿을 펠릿 1 g당 2 ml의 변성 가용화 완충액 (LEW 완충액 중 8 M 우레아, pH=8.0)에 재현탁하고, 후속적으로 재현탁된 펠릿 10 ml당 1 ml의 버그 버스터 (Novagen)에 재현탁하였다. 현탁액을 4 ℃에서 1 시간 동안 항온처리하고, 후속적으로 원심분리 (4 ℃, 18000 g, 15 분)하였다. 단백질 함유 상층액은 컬럼 단백질 정제를 위한 후속 단계에 활용되었다.

제조사의 지침에 따라 컬럼 (Protino Ni-IDA 2000 컬럼, Machery-Nagel)을 4 ml의 평형 완충액 (LEW 완충액 중 8 M 우레아, pH=8.0)으로 평형화하였다. 후속적으로, 컬럼에 단백질 함유 상층액의 절반을 로딩하고, 4 ml의 평형 완충액 (총 8 ml의 완충액)으로 2 회 세척하였다. 단백질을 3 ml의 용리 완충액 (250 mM의 이미다졸이 있는 평형 완충액, 총 6 ml의 완충액)으로 2 회 용리시켰다. 절차는 단백질 함유 상층액의 제2 절반으로 반복되었다. 단백질 함유 용리물을 풀링하고, 밤새 4 ℃에서 1 M 우레아를 함유하는 pH 8.0의 PBS에서 투석하였다. 투석 완충액을 PBS (pH 8.0) 중 0.5 M 우레아로 교환하고, 추가 4 시간 동안 투석을 계속하였다. 후속적으로, 완충액을 우레아가 없는 PBS (pH 8.0)로 교환하고, 추가 4 시간 동안 투석하였다. 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 Pierce BCA 단백질 검정 키트 (ThermoFisher)로 결정되었다. 단백질은 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관되었다.

실시예 7: APP로부터 APXA 독소의 단리

용액 APPVX는 1 g의 D(+)-글루코스, 일수화물, 0.1 g의 L-글루타민, 0.362 g의 L-시스테인 하이드로클로라이드 일수화물 및 10 mL의 뉴클레아제가 없는 H₂O를 함유한다. APP 단리물을 IsovitaleX를 포함하는 초콜릿 한천에 플레이팅하고, 37 ℃에서 밤새 항온처리하였다. 3 개의 APP 콜로니를 조합하여 3 ml의 컬럼비아 배지 (10 mM의 Ca²⁺, 0.2 mg/mL의 NAD, 1% APPVX)를 접종하는 데 사용하고, 수득된 배양물을 37 ℃에서 진탕 하에서 5 시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 배양물을 3200 g 및 4 ℃에서 20 분 동안 원심분리하였다. 투명한 상층액을 새로운 튜브에 옮기고, 44.05 g의 암모니아 설페이트를 점진적으로 첨가하고, 암모니아 설페이트가 완전히 용해될 때까지 혼합하였다. 후속적으로, 용액을 4 ℃에서 밤새 항온처리하였다. 침전된 단백질을 3200 g, 4 ℃에서 3 시간 동안 원심분리하고, 상층액을 제거하였다. 단백질 펠릿을 공기 건조시킨 후, 6 M 우레아를 포함하는 1 mL의 PBS에 현탁시켰다. 잔류 완충액을 제거하기 위해, 수득된 단백질 용액을 PDMidiTrap G25 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 겔 여과를 통해 정제하였다. 6 M 우레아를 포함하는 PBS로 평형화시킨 후, 1 ml의 단백질 용액을 겔 여과 컬럼 상에 로딩하고, 후속적으로 6 M 우레아를 포함하는 1.5 ml의 PBS로 용리시켰다. 후속적으로, 용리된 단백질을 -20 ℃에 보관하였다. 용리된 단백질의 동일성을 SDS-PAGE를 통해 확인하였다.

실시예 8: 세포독성 검정의 확립

재조합 ApxA 단백질 (야생형 및 톡소이드 형태)의 세포독성 활성을 분석하기 위해, 세포독성 검정은 BL3 세포 (BL3.1 CRL-2306)를 표적 세포로서 사용하였다. BL3 세포는 소의 B-세포로부터 수득되었으며, 이들은 ApxA 독소에 의해 용해될 수 있는 것으로 알려져 있다 (Tu, A. H.; Hausler, C.; Young, R.; Struck, D. K. (1994): Differential expression of the cytotoxic and hemolytic activities of the ApxllA toxin from Actinobacillus pleuropneumoniae. In Infection and immunity 62 (5), pp. 2119-2121). 실시예 7에서 수득된 ApxA 독소를 양성 대조군으로서 사용하고, 6 M 우레아를 포함하는 PBS는 음성 대조군으로서 역할을 한다.

BL3-세포는 37 ℃ 및 5% CO₂에서 배지 (100 U/mL의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신, 10% FCS 및 1x 비-필수 아미노산을 함유하는 DMEM)에서 배양되었다. 25 ml의 배지를 포함하는 T75 플라스크를 배양에 사용하였다. BL3 세포를 매주 50,000 개의 세포/cm²로 계대배양하여 새로운 플라스크를 씨딩하는 데 사용하였다.

세포독성 검정에 활용하기 위해, 배지 중 50 μl의 BL3 세포를 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 재조합 단백질 및 대조군을 DMEM에서 희석하였다. 50 μl의 희석된 재조합 단백질 및 대조군을 세포를 포함하는 각각의 웰에 첨가하였다. 후속적으로, 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO₂에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 세포 형태학을 현미경으로 사정한 후 10 μl의 WST-1 (Sigma Aldrich)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO₂에서 추가의 24 시간 동안 항온처리하였다.

후속적으로, 흡수를 450 nm에서 ELISA 판독기로 결정하였다. WST-1은 생존가능한 세포의 세포 표면 상의 복잡한 세포성 메커니즘에 의해 용해성 포르마잔으로 절단된다. 따라서, 형성된 포르마잔 염료의 양 및 ELISA 판독기에서 판독된 소멸은 배양물에서 대사적으로 활성인 세포의 수와 직접적인 상관관계가 있다.

실시예 9: 용혈성 검정의 확립

재조합 ApxA 단백질 (야생형 및 톡소이드 형태)의 용혈성 활성을 분석하기 위해, 용혈성 검정을 확립하였다. 5%의 양의 혈액을 포함하는 컬럼비아 한천 (Bection Dickinson)을 포함하는 세포 배양 플레이트를 사용하였다. 3 mm의 직경을 갖는 구멍을 세포 배양 플레이트에서 펀칭하였다. 각자의 재조합 단백질 및 대조군 샘플 10 μl를 구멍에 채우고, 플레이트를 37 ℃에서 밤새 항온처리하였다. 실시예 7에서 수득된 ApxA 독소를 양성 대조군으로서 사용하고, 6 M 우레아를 포함하는 PBS를 음성 대조군으로서 역할을 한다.

양의 혈액 한천이 탈색되어 희끄무레하게 보일 때 용혈성 활성이 존재하는 것으로 간주된다.

실시예 10: APP로부터 APXA 독소의 단리

APP 균주 ST2, ST5, ST7 및 ST8을 사용하여, 실시예 7에 기재된 발현 및 단리 방법을 사용하여 ApxA 독소를 포함하는 상층액을 단리하였다. SDS-PAGE는 상층액이 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA 및 ApxIVA에 상당하는 예상 분자량 위치에 밴드를 함유한다는 것을 보여주었다 (데이터는 도시되지 않음). 따라서, 각자의 균주 ST2, ST5, ST7 및 ST8의 수득된 각각의 상층액은 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA 및 ApxIVA의 혼합물을 포함한다.

실시예 11: BL-3 세포에서 APP로부터의 APXA의 세포독성

실시예 8의 방법을 사용하여 APP (APP 균주 ST2, ST5, ST7 및 ST8)로부터 수득된 실시예 7의 ApxA 독소 50 μl를 DMEM 중 증가하는 희석물 (1:8, 1:16, 1:32; 1:64, 1:128; 1:256, 1:512; 1:1024, 1:2048, 1:4096)에서 테스트하였다.

APP 상층액의 세포독성 효과는 희석이 증가함에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다 (도 1 참고). ST8의 단리된 독소가 가장 높은 세포독성을 보인 반면 ST7의 단리된 독소는 가장 낮은 독성을 나타냈다. ApxA 제제에서 세포독성에 대한 LPS의 상관관계는 관찰되지 않았다 (데이터는 도시되지 않음).

실시예 12: BL-3 세포에서 APXIA 및 APXIIIA의 재조합 형태의 세포독성

실시예 8의 방법을 사용하여 다음의 샘플을 테스트하였다.

표 4

각각의 샘플의 50 μl를 DMEM 중 증가하는 희석물 (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32; 1:64, 1:128; 1:256, 1:512)에서 테스트하였다.

세포가 있는 대조군은 PBS의 희석물을 사용하여, PBS의 영향을 평가하였다. 효과가 발견되지 않았다 (도 2 참고). 결과는 도 2에 예시된다.

도 2a에 예시된 바와 같이 세포독성 검정은 재조합 야생형 ApxIA가 BL3 세포를 용해시켜, 활성임을 입증하였다. 1:64의 희석물 (13.1 μg/ml의 야생형 ApxIA 독소)로 시작하여, 세포의 생존력 값은 PBS 대조군의 값과 비슷하였다. ApxIA 톡소이드 형태로 항온처리된 BL3 세포의 생존력은 PBS 대조군의 생존력과 비슷하였다. 이는 세포 형태학에 또한 적용되었다 (데이터는 도시되지 않음).

ApxIA의 톡소이드 형태가 PBS 대조군과 동일한 세포 생존력 및 형태학에 대한 효과를 갖는 반면, 야생형 ApxIA 형태는 BL3 세포에 대한 강한 세포독성 효과를 갖기 때문에, ApxIA의 톡소이드 형태가 세포독성 효과를 갖지 않는다고 결론지을 수 있다. ApxIIA (데이터는 도시되지 않음) 및 ApxIIIA (도 2b)의 톡소이드 형태와 관련하여 유사한 결과가 수득되었다.

실시예 13: APP로부터의 APXA의 용혈성 활성

실시예 9의 방법을 사용하여 APP (APP 균주 ST2, ST5 및 ST8)로부터 수득된 실시예 7의 ApxA 독소 10 μl를 테스트하였다.

결과는 도 3에 예시되어 있다. 도 3에서 왼쪽에서 오른쪽으로 희끄무레한 색이 감소하는 것으로부터 추론할 수 있는 것처럼 균주 ST8은 강한 용혈을 나타내고 ST5는 중간도 용혈을 나타내었으며 ST2는 용혈을 나타내지 않았다. ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIA 각각이 적혈구를 용해할 수 있는 것은 아닌 것으로 알려져 있다. 상이한 균주는 상이한 양의 각자의 ApxA 형태를 분비하기 때문에 상이한 ApxA 형태의 혼합물을 포함하는 각자의 균주로부터의 상층액은 상이한 용혈성 활성을 나타낼 수 있다.

요약하면, ApxA 독소의 용혈성 활성은 실시예 9에 기재된 바와 같이 5%의 양 혈액을 포함하는 컬럼비아 한천의 사용을 포함하는 방법에서 입증될 수 있음을 입증할 수 있다.

실시예 14: APXIA의 재조합 형태의 용혈성 활성

실시예 9의 방법을 사용하여 다음의 샘플을 테스트하였다.

표 5

결과는 도 4에 예시되어 있다. ApxIA 야생형 형태는 적혈구를 용해하지만 ApxIA 톡소이드 형태는 적혈구를 용해하지 않는다. ApxIIIA 야생형 형태는 문헌에 또한 기재된 바와 같이 용혈성 활성을 나타내지 않았다.

ApxIA의 톡소이드 형태는 PBS 대조군과 동일한, 즉, 부재한 용혈성 효과를 갖는 반면, 야생형 ApxIA 형태는 양의 적혈구에 대한 강한 용혈성 효과를 갖기 때문에, ApxIA의 톡소이드는 용혈성 효과를 갖지 않는다고 결론지을 수 있다. ApxIIA의 톡소이드 형태와 관련하여 유사한 결과가 수득되었다 (데이터는 도시되지 않음).

실시예 15: 돼지에서의 발명의 APXIA, APXIIA 및 APXIIIA 폴리펩티드의 면역원성

(1) 항원 및 백신 제형의 제조

대장균에서의 발현을 위해 최적화된 변형된 ApxIA (서열번호 4), ApxIIA (서열번호 5) 및 ApxIIIA (서열번호 6) 코돈을 코딩하는 핵산은 합성적으로 제조되었고 (Eurofins Genomics), 플라스미드 pEX-A258 (서열번호 19)에서의 제공된 서열은 5'에서의 제한 부위 BamHI 및 3' 단부에서의 제한 부위 Sacl이 측면에 위치한다. 각자 ApxIA 및 ApxIIIA를 포함하는 1 μg의 pEX-A258은 지침에 따라 BamHI FD (ThermoFisher) 및 Sacl FD (ThermoFisher)로 제한되었다. ApxIIA의 AA 439-801을 코딩하는 뉴클레오티드는 5'에서의 BamHI 및 3' 단부에서의 Sacl 제한 부위를 도입하여, ApxIIA에 대한 유전자를 함유하는 pEX-A258 (서열번호 19) 및 프라이머 (정방향: GCAGGATCCCAGGGGTATGATTCACGC 및 역방향 GGTGAGCTCTTAGGTGATGGAGTCGTTGCC)를 사용하여 PCR에 의해 증폭되었다. PCR 생산물은 QIAquick PCR 정제 키트 250 (Qiagen)을 사용하여 정제되었고, 제조사의 지침에 따라 BamHI FD (ThermoFisher) 및 Sacl FD (ThermoFisher)로 제한되었다. 제한된 ApxIA, ApxIIA (절삭됨) 및 ApxIIIA는 1% 아가로스 겔 상에서 분해되었다. 적절한 크기의 핵산 단편을 아가로스 겔 (QUIAEX-II)로부터 추출하였다. pQE-80L은 제조사의 지침에 따라 BamHI FD (ThermoFisher) 및 Sacl FD 10 (ThermoFisher)으로 제한되었다. 1:5의 비율의 pQE-80L 및 각자의 핵산 단편의 결찰을 T4-DNA 리가제 (ThermoFisher)를 사용하여 실온에서 밤새 수행하였다. 결찰된 DNA를 대장균 TopflOF'에 전기천공하고, ApxIA, ApxIIA (절삭됨) 또는 ApxIIIA의 변형된 형태의 성공적인 클로닝을 제한 분석 및 시퀀싱에 의해 확인하였다. pQE-80L은 암피실린 저항성을 포함한다. 변형된 ApxIA, ApxIIA (절삭됨) 또는 ApxIIIA를 코딩하는 각자의 pQE-80L은 실시예 5에 기재된 방법에 따라 실시예 4로부터 유래된 각자의 apxIC, apxIIC 및 apxIIIC를 코딩하는 pACYC184 플라스미드와 함께 대장균 TopflOF'로 공동-형질전환되었다. 공동-형질전환 후 대장균 Topf1OF'을 50 μg/ml의 암피실린 및 15 μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 플레이트 상에서 선택하였다. 다음을 포함하는 수득된 대장균 콜로니는 40 ml의 LB-배지 (100 μg/ml의 암피실린 30 μg/ml의 클로람페니콜로 보충됨)를 접종하는 데 사용되었다:

- 변형된 ApxIA를 코딩하는 pQE-80L 및 ApxIC를 코딩하는 pACYC184

- 절삭된 ApxIIA (절삭됨)를 코딩하는 pQE-80L 및 ApxIIC를 코딩하는 pACYC184

- 변형된 ApxIIIA를 코딩하는 pQE-80L 및 ApxIIIC를 코딩하는 pACYC184. 배양물을 밤새 30 ℃에서 진탕 하에서 항온처리하였다. 밤새 배양물을 400 ml의 LB 배지 (100 μg/ml의 암피실린 30 μg/ml의 클로람페니콜로 보충됨)에 접종하여, 0.1의 광학 밀도 (600 nm에서의 광학 밀도 = OD600)를 달성하였다. 수득된 배양물을 0.5의 OD600이 수득될 때까지 진탕 하에서 추가로 항온처리하였다. 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위해, 1 mM의 IPTG (이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드)를 첨가하였다. 배양물을 추가 4 시간 동안 30 ℃에서 진탕 하에서 항온처리하였다. 후속적으로, 배양물을 7,000 g에서 10 분 동안 원심분리하였다. 상층액의 제거 후, 박테리아 펠릿을 박테리아 펠릿 1 g당 5 ml의 LEW 완충액를 포함하는 LEW 완충액 (50 mM의 NaH2PO4, 아쿠아 증류액 중 300 mM의 NaCl; pH 8.0)에 재현탁하고, -20 ℃에서 보관하였다. 1 ml의 10x 버그 버스터 (Novagen), 5 μl의 벤조아제 (25 U/μl, Novagen) 및 10 mg의 리소자임을 10 ml의 재현탁된 박테리아 펠릿에 첨가하였다. 수득된 현탁액을 실온에서 20 분 동안 천천히 회전시켰다. 4 ℃ 및 15,000 g에서 60 분 동안 원심분리한 후, 펠렛을 LEW 완충액 (펠렛 1 mg당 10 ml의 LEW 완충액)에서 세척하고, 원심분리 (4 ℃, 15000 g, 60 분)하였다. 세척된 펠릿을 펠릿 1 g당 2 ml의 변성 가용화 완충액 (LEW 완충액 중 8 M 우레아; pH=8.0)에 재현탁하고, 후속적으로 재현탁된 펠릿 10 ml당 1 ml의 버그 버스터 (Novagen)에 재현탁시켰다. 현탁액을 4 ℃에서 1 시간 동안 항온처리한 후, 원심분리하였다 (4 ℃, 18,000 g, 15 분). 단백질 함유 상층액은 컬럼 단백질 정제를 위한 후속 단계에서 활용되었다. 제조사의 지침에 따라 컬럼 (Protino Ni-IDA 2000 컬럼, Machery-Nagel)을 4 ml의 평형 완충액 (LEW 완충액 중 8 M 우레아; pH=8.0)으로 평형화하였다. 후속적으로, 컬럼에 단백질 함유 상층액의 절반을 로딩하고, 4 ml의 평형 완충액으로 2 회 (총 8 ml의 완충액) 세척하였다. 단백질을 3 ml의 용리 완충액으로 2 회 (250 mM의 이미다졸이 있는 평형 완충액, 총 6 ml의 완충액) 용리시켰다. 절차는 단백질 함유 상층액의 제2 절반으로 반복되었다. 단백질 함유 용리물 분획을 풀링하고, 밤새 4 ℃에서 1 M 우레아를 함유하는 PBS, pH 8.0에서 투석하였다. 투석 완충액을 PBS (pH 8.0) 중 0.5 M 우레아로 교환하고, 추가 4 시간 동안 투석을 계속하였다. 후속적으로, 완충액을 우레아가 없는 PBS (pH 8.0)로 교환하고, 추가 4 시간 동안 투석하였다. 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 Pierce BCA 단백질 검정 키트 (ThermoFisher)로 결정되었다. 각자의 ApxA 항원을 멸균 여과하고 (0.2 μm), 제형화될 때까지 4 ℃에서 보관하였다.

몬타나이드 ISA 201 VG (롯트 36075M, Seppic)는 각자의 변형된 ApxIA, ApxIIA (절삭됨) 및 ApxIIIA로 테스트 배치를 제형화하기 위해 제조사의 지침에 따라 사용되었다 (표 6). 간략히, 아쥬반트 및 항원을 물 배쓰에서 31 ℃로 예열하였다. 항원(들)의 부피는 멸균 PBS의 첨가에 의해 아쥬반트와 동등한 양 (50:50, w/v)이 되도록 하고, 31 ℃에서 추가로 유지하였다. 몬타나이드 ISA 201 VG를 비이커에서 천천히 교반하였다. 후속적으로, 항원을 아쥬반트에 첨가하고, 31 ℃에서 5 분 동안 추가로 교반하였다. 제형을 20 ℃에서 1 시간 동안 보관하고, 유리 바이알에 채우고, 사용할 때까지 4 ℃에서 추가로 보관하였다.

표 6: 면역원성 연구를 위한 상이한 테스트 배치의 제형화

(2) 동물 연구 (면역원성)

백신 제형의 면역원성은 ELISA에서 ApxIA-, ApxIIA- 및 ApxIIIA-특이적 IgG 항체의 정량화 및 8 주령 돼지의 백신접종 후 혈청에서의 ApxIA-중화 특성의 사정에 의해 결정되었다.

동물

암수의 돼지 (수컷 [중성화] 및 암컷)는 상업적 돼지 사육자 (BHZP, 21337

, Zuchtbetrieb Garlitz (DE-LWL 1051))로부터 수득되었다. 각각의 돼지는 고유한 귀 태그 번호로 식별되었으며, 연구 프로토콜에 명시된 포함/배제 기준을 준수하는지 수의학적 검사를 받았다. 모든 동물은 APP 감염의 임상 징후를 나타내지 않았고, 동물은 연구 시작 시에 임상 징후 (호흡곤란, 기침, 설사, 파행)가 없었다. 동물은 연구에 포함되기 전에 상업적으로 이용가능한 APP-ApxIV ELISA (IDEXX)에서 혈청음성인 것으로 확인되었다. 돼지는 IDT Biologika GmbH, Am Pharmapark, D-06861 Dessau-Roßlau (Germany)의 동물 시설에서 폐쇄된 격리실에서 길러졌다. 유닛 내에는 단단한 바닥에 동등한 공간의 2 개의 별도 방/우리가 있었다. 밀짚이 침구로 사용되었으며, 매일 바꾸었다. 수동으로 채워진 건식 급이기를 사용하여 돼지에게 자유식으로 (펠릿 - 상업적 혼합물과 함께) 급이하였다. 수돗물은 수도꼭지 및 젖꼭지 급수기를 통해 공급되었다. 모든 시설은 매일 청소되었다.

연구 설계

총 25 마리의 8-주령 돼지를 그룹당 5 마리의 동물로 이루어진 5 개 그룹에 무작위로 할당하였다. 3 개의 그룹은 1.5 mL의 "백신 1", "백신 2" 또는 "백신 3"으로 14 일 간격으로 2 회 근육 내 처리되었다. 5 마리 동물의 하나의 그룹은 14 일 간격으로 2 회 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에에 대해 상업적으로 이용가능한 백신 (포실리스(Porcilis)^® APP, MSD 동물 보건, 배치: A784A01) 2 ml를 받았고, 양성 대조군으로서 역할을 한다. 다른 그룹은 위약 백신을 받았고, 음성 대조군으로서 역할을 한다. 그룹 및 치료의 개요는 표 7에 제공되어 있다.

표 7: 연구 그룹 및 치료

각각의 동물로부터 연구 0 일차 (제1 백신접종일), 14 일차 (제2 백신접종일) 및 28 일차 (연구 종료)에 혈청 표본을 수집하였다.

백신접종과 관련된 국소 및 전신 반응은 각각의 2 회의 백신접종 1 일 전부터 시작하여 3 일 후까지 연구일당 1 회 사정되었다. 국소 반응 평가를 위해 주사 부위의 발적 및 부종을 사정하였다.

직장 체온은 2 회의 백신접종의 각각의 1 일 전부터 시작하여 3 일 후까지 하루에 1 회 측정되었다. 백신접종 당일에 온도를 백신접종 전 및 백신접종 6시간 후에 측정하였다. 체온의 결과는 표 8 및 도 5에 도시된다.

결과:

표 8: 그룹당 평균 직장 체온 (증가된 온도가 마킹됨)

(3) 혈청학적 데이터 (ELISA)

돼지 혈청에서 ApxIA-, ApxIIA- 또는 ApxIIIA-특이적 IgG-항체의 정량화를 위해 ELISA를 확립하였다. 간략히, ApxIA-, ApxIIA- 또는 ApxIIIA를 실시예 5에 기재된 바와 같이 발현, 정제 및 정량화하였다. 각자의 ApxA를 1x ELISA 코팅 완충액 (120125; Candor Bioscience)에서 5 μg/mL의 최종 농도로 희석하였다. ELISA 코팅 완충액 중 각자의 ApxA 100 μl를 96-웰 플레이트 (Nunc MaxiSorb ELISA 플레이트 (44-2404-21, ThermoFisher))의 각각의 웰에 제공하고, 4 ℃에서 밤새 항온처리하였다. 후속적으로, 코팅 완충액을 제거하고, 플레이트를 세척 완충액 (PBS, 0.05% TWEEN 20 (v/v))으로 3 회 세척하였다. 플레이트를 진탕기에서 실온 (RT)에서 1 시간 동안 10% (v/v) FCS가 포함된 PBS를 함유하는 차단 용액을 사용하여 차단하였다. 후속적으로, 차단 용액을 제거하고, 모든 웰을 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 돼지 혈청을 차단 용액에 1:100으로 미리-희석하고, 차단 용액에 1:5의 희석물 시리즈 (희석물 1:100-1:312,500을 포함함)를 제조하였다. 각각의 희석물 50 μl를 ELISA 플레이트의 하나의 웰에 피펫팅하였다. A. 플뢰로뉴모니아에로 여러 번 감염된 동물로부터 수득된 과면역 혈청은 양성 대조군으로서 역할을 하며, 이전에 기재된 바와 같이 희석하였다. 진탕기에서 RT에서 1 시간의 항온처리 후, 혈청 희석물을 제거하고, 각각의 웰을 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 염소 IgG 항-돼지 IgG (H+L)-HRPO, MinX 없음 (Dianova)은 이차 항체로서 역할을 하며, 차단 완충액에 1:4,000으로 희석되고, 50 μl가 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 제공된다. 진탕기에서 RT에서 1 시간의 항온처리한 후, 이차 항체 희석물을 제거하고, 각각의 웰을 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 후속적으로, 50 μl의 TMB 기질 (555214, BD)을 ELISA-플레이트의 각각의 웰에 제공하고, 암실에서 RT에서 6 분 동안 항온처리하였다. 웰당 20 μL 2N H2SO4 (X873.1, Roth)를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450 nm 파장에서 각각의 웰의 흡수는 ELISA 판독기에서 측정된다. 흡수 데이터는 흡광도 값의 대수 변환 및 S자형 용량-반응을 사용한 비선형 회귀가 있는 GraphPad Prism 8.0을 사용하여 처리된다. ELISA의 통계적 분석 결과를 크루스칼-왈리스 테스트 및 Dunn의 다중 비교 테스트를 이용하여 분석하였다. 각각의 그룹의 데이터를 위약 그룹 (그룹 1)의 상응하는 데이터와 비교하였다. 0.05 이하의 p-값은 유의한 것으로 간주되었다. 결과는 도 6에 도시되어 있다.

(4) 혈청학적 데이터 (중화 검정)

중화 검정은 각자의 돼지 혈청의 재조합 WT ApxIA-중화 능력의 정량화를 허용한다.

BL3 세포 (BL3.1 CRL-2306)를 표적 세포로서 이용하였다. BL3 세포는 소의 B-세포로부터 수득하였고, ApxIA 독소에 의한 이러한 세포주의 용해가 설명되었다 (Tu, A. H.; Hausler, C.; Young, R.; Struck, D. K. (1994)). BL3-세포는 37 ℃ 및 5% CO2에서 배지 (100 U/mL의 페니실린, 100 μg/mL, 스트렙토마이신, 10% FCS 및 1x 비-필수 아미노산을 함유하는 DMEM)에서 배양되었다. 25 ml의 배지가 있는 T75 플라스크를 배양에 사용하였다. BL3 세포를 매주 50,000 개의 세포/cm2로 계대배양하여, 새로운 플라스크를 씨딩하기 위해 사용하였다. 중화 검정에 활용하기 위해, 배지 중 50 μl의 BL3 세포를 96-웰 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다.

돼지 혈청은 56 ℃에서 30 분 동안 열 비활성화시켰다. 후속적으로, 희석물을 포함하는, 2-배 희석 시리즈의 DMEM 중 혈청을 제조하였다. 재조합 WT ApxIA (활성 독소)는 실시예 7에 따라 제조되고, 240 μg/mL의 최종 농도로 희석되었다. 각각의 혈청 희석물 70 μl를 96-웰 플레이트에서 WT ApxIA-희석물 30 μl (웰당 최종 ApxIA 양: 6 μg)에 혼합하고 (생성물은 1:2 - 1:256의 혈청 희석물임), 37 ℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 각각의 웰의 내용물의 50 μl를 50 μL의 DMEM 중 50,000 개의 BL3 세포/cm²를 함유하는 둥근-바닥 96-웰 플레이트로 옮겨), 1:4 - 1:512의 최종 혈청 희석믈 생성하였다. 플레이트를 5% CO₂ 및 100% 습도를 함유하는 대기에서 37 ℃에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 24 시간 후 WST-1 기질 (Sigma)을 제조사의 지침에 따라 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 5% CO₂ 및 100% 습도를 함유하는 대기에서 37 ℃에서 추가로 24 시간 동안 항온처리하였다. 후속적으로, 450 nm에서 ELISA 판독기를 이용하여 흡수를 결정하였다. WST-1은 생존가능한 세포의 세포 표면 상의 복잡한 세포성 메커니즘에 의해 용해성 포르마잔으로 절단된다. 따라서, 형성된 포르마잔 염료의 양 및 ELISA 판독기에서 판독된 소멸은 배양물에서 대사적으로 활성인 세포의 수와 직접적인 상관관계가 있다. 그룹 1, 2 및 3의 동물의 혈청학적 연구의 28 일차에 수득된 혈청에 대한 중화 검정을 사용하였다. 결과는 도 7에 도시되어 있다.

실시예 16: 돼지에서의 발명의 APXIA, APXIIA 및 APXIIIA 폴리펩티드의 효능

(1) 항원 및 백신 제형의 제조

항원 및 제형의 제조를 실시예 15에 기재된 바와 같이 실시하였다. 표 9는 상이한 백신 테스트 배치의 제형을 요약한다.

표 9: 효능 연구를 위한 상이한 테스트 배치의 제형화

(2) 동물 연구 (효능)

이 연구의 목적은 돼지에서 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에 (APP) 혈청형 9 시험감염에 대해 재조합적으로 발현된 변형된 ApxIA, ApxIIA 및 ApxIIIA 백신 제형을 사용한 백신접종에 의해 수득된 보호 효능을 평가하는 것이었다.

동물

암수의 돼지 (수컷 [중성화]) 및 암컷)는 상업적 돼지 사육자 (Dalmandi

Zrt., 7211 Dalmand,

u. 42)로부터 수득되었다. 각각의 돼지는 고유한 귀 태그 번호로 식별되었으며, 연구 프로토콜에 명시된 포함/배제 기준을 준수하는지 수의학적 검사를 받았다.

공급원 (무리)에는 APP 및 마이코플라스마(Mycoplasma)가 없었다. 새끼 돼지는 모계 유래된 항체와 백신접종의 간섭을 피하기 위해 APP에 대해 백신을 접종하지 않은 암퇘지로부터 유래하였다. 동물은 임상 징후 (호흡곤란, 기침, 설사, 파행)가 없었다. 더욱이, 동물은 연구에 포함되기 전에 상업적으로 이용가능한 APP-ApxIV ELISA (IDEXX)에서 혈청음성이었다. 새끼 돼지는 완전히 발달하였으며, 임의의 기능장애 및 선천적 기형이 없이 건강하였다.

동물은 PROPHYL Ltd, Top. No.: 045/7,

H-7711, Hungary)의 동물 시설에서 폐쇄된 격리실에서 길러졌다. 수동으로 채워진 건식 급이기를 사용하여 돼지에게 자유식으로 (파쇄된 - 상업적 혼합물과 함께) 급이하였다. 수돗물은 수도꼭지 및 젖꼭지 급수기를 통해 공급되었다. 모든 시설은 매일 청소되었다.

연구 설계

비강 내 APP 혈청형 9 시험감염에 대해 몬타나이드 ISA 201 VG (롯트 36075M, Seppic)로 제형화된 각각의 변형된 ApxIA, ApxIIA (절삭됨) 및 ApxIIIA의 25 μg을 함유하는 백신에 의해 유도된 효능을, 등록된 APP 백신 (포실리스(Porcilis)^® APP, MSD 동물 보건, 롯트: A739A01) 및 PBS를 받은 위약 그룹에 의해 유도된 효능과 비교하였다. 그룹 및 치료의 개요는 표 10에 제공되어 있다.

표 10: 그룹 및 치료의 개요

42-45 일령의 모든 돼지는 처리군에 따라 2.0 ml의 각자의 백신으로 근육 내 백신접종되었다 (연구 0 일차). 28 일 후 돼지는 근육 내 경로를 사용하여 각자의 백신으로 2번째 백신접종을 받았다 (연구 28 일차). 2번째 백신접종 2 주 후에 APP 혈청형 9를 이용한 비강 내 시험감염 (5x10⁷ 개의 CFU/돼지)이 모든 동물에 투여되었다 (연구 42 일차).

시험감염 당일에 시작하여, 7 일 동안 매일 임상 검사를 실시하였다. 각각의 검사는 임상 관찰에 따라 및 표 11에 따라 점수를 초래하였다. 임상 점수는 시간이 지남에 따라 각각의 동물에 대해 누적되고, 완전한 관찰 기간에 걸쳐 그룹당 평균 점수가 계산되었다. 통계적 분석을 위해 임상 점수를 크루스칼-왈리스 테스트 및 Dunn의 다중 비교 테스트를 이용하여 분석하였다. 각각의 그룹의 데이터를 위약 그룹 (그룹 3)의 상응하는 데이터와 비교하였다. 0.05 이하의 p-값은 유의한 것으로서 간주되었다. 결과는 도 8에 도시되어 있다. 시험감염 후 동물의 생존에 대한 결과는 도 9에 도시되어 있다.

표 11: 임상 검사의 점수

시험감염 7 일 후 남아있는 모든 동물을 인간적으로 안락사시키고, 사후 검사를 하였다. 모든 동물의 폐를 부검하여, APP에 의해 유발된 병변을 관찰하였다. 폐의 평가는 표 12에 제공된 스코어링 시스템에 따라 수행되었다. 폐 병변은 통합된 폐 덩어리의 백분율에 따라 로브당 0 내지 5로 점수를 매겼다. 폐 스코어링의 결과는 각각의 돼지에 대한 누적된 폐 점수 (0 내지 35의 범위)로서 표현되었다. 누적된 폐 점수를 크루스칼-왈리스 테스트 및 Dunn의 다중 비교 테스트를 사용하여 분석하였다. 각각의 그룹의 데이터를 위약 그룹 (그룹 3)의 상응하는 데이터와 비교하였다. 0.05 이하의 p-값은 유의한 것으로서 간주되었다. 결과는 도 10에 도시되어 있다.

표 12: 폐 병변의 평가

SEQUENCE LISTING <110> IDT Biologika GmbH <120> Inactivated ApxIA, ApxIIA and ApxIIIA toxins <130> P46559-WO <150> 19154466.7 <151> 2019-01-30 <160> 34 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 1022 <212> PRT <213> Actonbacillus pleuropneumoniae <220> <223> ApxIA wild type <400> 1 Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu 1 5 10 15 Asn Gln His Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys 20 25 30 Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu Ile Leu Tyr 35 40 45 Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu 50 55 60 Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys 65 70 75 80 Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu 85 90 95 Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp 100 105 110 Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser 130 135 140 Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp 145 150 155 160 Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu 165 170 175 Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile 180 185 190 Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Gly Asn Ala Leu Ser Asn Thr Arg Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys 210 215 220 Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala 225 230 235 240 Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn 245 250 255 Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser 260 265 270 Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile 275 280 285 Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly 290 295 300 Leu Ile Gly Ser Val Val Ala Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ser Phe Leu 305 310 315 320 Asn Val Ala Asp Lys Phe Glu Arg Ala Lys Gln Leu Glu Gln Tyr Ser 325 330 335 Glu Arg Phe Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Gly Asp Ser Leu Leu Ala Ser 340 345 350 Phe Tyr Arg Glu Thr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Leu Thr Thr Ile Asn 355 360 365 Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Ala Ala Ala Thr Gly 370 375 380 Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Ala Leu Val Ser Ala Ile Thr Gly 385 390 395 400 Ile Ile Ser Gly Ile Leu Asp Ala Ser Lys Gln Ala Ile Phe Glu Arg 405 410 415 Val Ala Thr Lys Leu Ala Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys His 420 425 430 Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Ser Ala Phe 435 440 445 Leu Glu Asp Thr Phe Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Asn Lys Glu Tyr Ser 450 455 460 Val Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Val Asn Ile 465 470 475 480 Gly Glu Leu Ala Gly Ile Thr Arg Lys Gly Ala Asp Ala Lys Ser Gly 485 490 495 Lys Ala Tyr Val Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Asp 500 505 510 Pro Asp Arg Phe Asp Lys Lys Val Phe Asp Pro Leu Glu Gly Lys Ile 515 520 525 Asp Leu Ser Ser Ile Asn Lys Thr Thr Leu Leu Lys Phe Ile Thr Pro 530 535 540 Val Phe Thr Ala Gly Glu Glu Ile Arg Glu Arg Lys Gln Thr Gly Lys 545 550 555 560 Tyr Glu Tyr Met Thr Glu Leu Phe Val Lys Gly Lys Glu Lys Trp Val 565 570 575 Val Thr Gly Val Gln Ser His Asn Ala Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu 580 585 590 Ile Gln Leu Ala Ile Asp Lys Lys Gly Glu Lys Arg Gln Val Thr Ile 595 600 605 Glu Ser His Leu Gly Glu Lys Asn Asp Arg Ile Tyr Leu Ser Ser Gly 610 615 620 Ser Ser Ile Val Tyr Ala Gly Asn Gly His Asp Val Ala Tyr Tyr Asp 625 630 635 640 Lys Thr Asp Thr Gly Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Gln Ser Ala Gln Lys 645 650 655 Ala Gly Glu Tyr Ile Val Thr Lys Glu Leu Lys Ala Asp Val Lys Val 660 665 670 Leu Lys Glu Val Val Lys Thr Gln Asp Ile Ser Val Gly Lys Arg Ser 675 680 685 Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Phe Glu Leu Gly 690 695 700 Asn Gly Ile Arg Ala Lys Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile Ile 705 710 715 720 Gly Ser Asn Arg Lys Asp Lys Phe Phe Gly Ser Arg Phe Thr Asp Ile 725 730 735 Phe His Gly Ala Lys Gly Asp Asp Glu Ile Tyr Gly Asn Asp Gly His 740 745 750 Asp Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Gly Asn Asp Val Ile His Gly Gly Asp 755 760 765 Gly Asn Asp His Leu Val Gly Gly Asn Gly Asn Asp Arg Leu Ile Gly 770 775 780 Gly Lys Gly Asn Asn Phe Leu Asn Gly Gly Asp Gly Asp Asp Glu Leu 785 790 795 800 Gln Val Phe Glu Gly Gln Tyr Asn Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly Asn 805 810 815 Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Asp Gly Thr Asn Leu Phe Asp Gly Gly Val 820 825 830 Gly Asn Asp Lys Ile Tyr Gly Gly Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Arg Tyr 835 840 845 Ser Lys Glu Tyr Gly Arg His Ile Ile Ile Glu Lys Gly Gly Asp Asp 850 855 860 Asp Thr Leu Leu Leu Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asp Val Gly Phe Ile 865 870 875 880 Arg Ile Gly Asp Asp Leu Leu Val Asn Lys Arg Ile Gly Gly Thr Leu 885 890 895 Tyr Tyr His Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Ala Leu Thr Ile Lys Asp Trp 900 905 910 Phe Lys Glu Gly Lys Glu Gly Gln Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile Val 915 920 925 Asp Lys Asp Gly Ala Tyr Val Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu Leu Thr 930 935 940 Ala Pro Gly Arg Gly Ile Asn Tyr Phe Asn Gly Leu Glu Glu Lys Leu 945 950 955 960 Tyr Tyr Gly Glu Gly Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp Ile 965 970 975 Glu Gln Ile Ile Ser Ser Thr Gly Ala Leu Thr Gly Glu His Gly Gln 980 985 990 Val Leu Val Gly Ala Gly Gly Pro Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Pro Asn 995 1000 1005 Ser Ile Pro Asn Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Thr Gln Ser Ala 1010 1015 1020 <210> 2 <211> 956 <212> PRT <213> Actonbacillus pleuropneumoniae <220> <223> ApxIIA wild type <400> 2 Met Ser Lys Ile Thr Leu Ser Ser Leu Lys Ser Ser Leu Gln Gln Gly 1 5 10 15 Leu Lys Asn Gly Lys Asn Lys Leu Asn Gln Ala Gly Thr Thr Leu Lys 20 25 30 Asn Gly Leu Thr Gln Thr Gly His Ser Leu Gln Asn Gly Ala Lys Lys 35 40 45 Leu Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Gly Tyr Asp Ser Gly Gln Gly Asn Gly 50 55 60 Val Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Asn Asp Leu Gly Ile Glu Val Trp 65 70 75 80 Arg Glu Glu Arg Ser Asn Leu Asp Ile Ala Lys Thr Ser Phe Asp Thr 85 90 95 Thr Gln Lys Ile Leu Gly Phe Thr Asp Arg Gly Ile Val Leu Phe Ala 100 105 110 Pro Gln Leu Asp Asn Leu Leu Lys Lys Asn Pro Lys Ile Gly Asn Thr 115 120 125 Leu Gly Ser Ala Ser Ser Ile Ser Gln Asn Ile Gly Lys Ala Asn Thr 130 135 140 Val Leu Gly Gly Ile Gln Ser Ile Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Val 145 150 155 160 Asn Leu Asn Glu Leu Leu Gln Asn Lys Asp Pro Asn Gln Leu Glu Leu 165 170 175 Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Glu Leu Val Gly Asn Ile Ala 180 185 190 Ser Ser Val Gln Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Ile Ser Lys Leu 195 200 205 Gly Ser His Leu Gln Asn Val Lys Gly Leu Gly Gly Leu Ser Asn Lys 210 215 220 Leu Gln Asn Leu Pro Asp Leu Gly Lys Ala Ser Leu Gly Leu Asp Ile 225 230 235 240 Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Ser Ala Gly Leu Ile Leu Ala Asp 245 250 255 Lys Glu Ala Ser Thr Glu Lys Lys Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala 260 265 270 Asn Gln Ile Ile Gly Asn Val Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu 275 280 285 Ala Gln Arg Val Ala Ser Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 290 295 300 Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Leu Ser Phe Leu 305 310 315 320 Asn Val Ala Asp Lys Phe Lys Gln Ala Asp Leu Ile Lys Ser Tyr Ser 325 330 335 Glu Arg Phe Gln Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Arg Leu Leu Ala Asp 340 345 350 Phe His Arg Glu Thr Gly Thr Ile Asp Ala Ser Val Thr Thr Ile Asn 355 360 365 Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val Gly Ala Ala Ser Ala Gly 370 375 380 Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Leu Leu Val Ala Gly Val Thr Gly 385 390 395 400 Leu Ile Thr Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu His 405 410 415 Val Ala Asn Lys Val His Asp Arg Ile Val Glu Trp Glu Lys Lys His 420 425 430 Asn Lys Asn Tyr Phe Glu Gln Gly Tyr Asp Ser Arg His Leu Ala Asp 435 440 445 Leu Gln Asp Asn Met Lys Phe Leu Ile Asn Leu Asn Lys Glu Leu Gln 450 455 460 Ala Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Asn Gln Ile 465 470 475 480 Gly Asp Leu Ala Ala Ile Ser Arg Arg Thr Asp Lys Ile Ser Ser Gly 485 490 495 Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Gln His Gln Ser Tyr Asp 500 505 510 Ser Ser Val Gln Leu Asp Asn Lys Asn Gly Ile Ile Asn Ile Ser Asn 515 520 525 Thr Asn Arg Lys Thr Gln Ser Val Leu Phe Arg Thr Pro Leu Leu Thr 530 535 540 Pro Gly Glu Glu Asn Arg Glu Arg Ile Gln Glu Gly Lys Asn Ser Tyr 545 550 555 560 Ile Thr Lys Leu His Ile Gln Arg Val Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp 565 570 575 Gly Asp Ala Ser Ser Ser Val Asp Phe Thr Asn Val Val Gln Arg Ile 580 585 590 Ala Val Lys Phe Asp Asp Ala Gly Asn Ile Ile Glu Ser Lys Asp Thr 595 600 605 Lys Ile Ile Ala Asn Leu Gly Ala Gly Asn Asp Asn Val Phe Val Gly 610 615 620 Ser Ser Thr Thr Val Ile Asp Gly Gly Asp Gly His Asp Arg Val His 625 630 635 640 Tyr Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Ala Leu Val Ile Asp Ala Thr Ala Glu 645 650 655 Thr Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Val Lys Arg Tyr Val Gly Asp Ser Lys 660 665 670 Ala Leu His Glu Thr Ile Ala Thr His Gln Thr Asn Val Gly Asn Arg 675 680 685 Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg Arg Glu Asp Asp Arg Phe His Thr Gly 690 695 700 Tyr Thr Val Thr Asp Ser Leu Lys Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly Ser 705 710 715 720 Gln Phe Asn Asp Ile Phe Lys Gly Ser Gln Phe Asp Asp Val Phe His 725 730 735 Gly Gly Asn Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asp Asp His 740 745 750 Leu Phe Gly Gly Ala Gly Asp Asp Val Ile Asp Gly Gly Asn Gly Asn 755 760 765 Asn Phe Leu Val Gly Gly Thr Gly Asn Asp Ile Ile Ser Gly Gly Lys 770 775 780 Asp Asn Asp Ile Tyr Val His Lys Thr Gly Asp Gly Asn Asp Ser Ile 785 790 795 800 Thr Asp Ser Gly Gly Gln Asp Lys Leu Ala Phe Ser Asp Val Asn Leu 805 810 815 Lys Asp Leu Thr Phe Lys Lys Val Asp Ser Ser Leu Glu Ile Ile Asn 820 825 830 Gln Lys Gly Glu Lys Val Arg Ile Gly Asn Trp Phe Leu Glu Asp Asp 835 840 845 Leu Ala Ser Thr Val Ala Asn Tyr Lys Ala Thr Asn Asp Arg Lys Ile 850 855 860 Glu Glu Ile Ile Gly Lys Gly Gly Glu Arg Ile Thr Ser Glu Gln Val 865 870 875 880 Asp Lys Leu Ile Lys Glu Gly Asn Asn Gln Ile Ser Ala Glu Ala Leu 885 890 895 Ser Lys Val Val Asn Asp Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Arg Gln Asn Val 900 905 910 Ser Asn Ser Leu Ala Lys Leu Ile Ser Ser Val Gly Ser Phe Thr Ser 915 920 925 Ser Ser Asp Phe Arg Asn Asn Leu Gly Thr Tyr Val Pro Ser Ser Ile 930 935 940 Asp Val Ser Asn Asn Ile Gln Leu Ala Arg Ala Ala 945 950 955 <210> 3 <211> 1052 <212> PRT <213> Actonbacillus pleuropneumoniae <220> <223> ApxIIIA wild type <400> 3 Met Ser Thr Trp Ser Ser Met Leu Ala Asp Leu Lys Lys Arg Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Lys Arg Gln Ala Lys Lys Gly Tyr Asp Val Thr Lys Asn Gly 20 25 30 Leu Gln Tyr Gly Val Ser Gln Ala Lys Leu Gln Ala Leu Ala Ala Gly 35 40 45 Lys Ala Val Gln Lys Tyr Gly Asn Lys Leu Val Leu Val Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Tyr Asp Gly Ser Val Gly Asn Gly Phe Phe Asp Leu Val Lys Ala 65 70 75 80 Ala Glu Glu Leu Gly Ile Gln Val Lys Tyr Val Asn Arg Asn Glu Leu 85 90 95 Glu Val Ala His Lys Ser Leu Gly Thr Ala Asp Gln Phe Leu Gly Leu 100 105 110 Thr Glu Arg Gly Leu Thr Leu Phe Ala Pro Gln Leu Asp Gln Phe Leu 115 120 125 Gln Lys His Ser Lys Ile Ser Asn Val Val Gly Ser Ser Thr Gly Asp 130 135 140 Ala Val Ser Lys Leu Ala Lys Ser Gln Thr Ile Ile Ser Gly Ile Gln 145 150 155 160 Ser Val Leu Gly Thr Val Leu Ala Gly Ile Asn Leu Asn Glu Ala Ile 165 170 175 Ile Ser Gly Gly Ser Glu Leu Glu Leu Ala Glu Ala Gly Val Ser Leu 180 185 190 Ala Ser Glu Leu Val Ser Asn Ile Ala Lys Gly Thr Thr Thr Ile Asp 195 200 205 Ala Phe Thr Thr Gln Ile Gln Asn Phe Gly Lys Leu Val Glu Asn Ala 210 215 220 Lys Gly Leu Gly Gly Val Gly Arg Gln Leu Gln Asn Ile Ser Gly Ser 225 230 235 240 Ala Leu Ser Lys Thr Gly Leu Gly Leu Asp Ile Ile Ser Ser Leu Leu 245 250 255 Ser Gly Val Thr Ala Ser Phe Ala Leu Ala Asn Lys Asn Ala Ser Thr 260 265 270 Ser Thr Lys Val Ala Ala Gly Phe Glu Leu Ser Asn Gln Val Ile Gly 275 280 285 Gly Ile Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu Ala Gln Arg Leu Ala 290 295 300 Ala Gly Leu Ser Thr Thr Gly Pro Ala Ala Ala Leu Ile Ala Ser Ser 305 310 315 320 Ile Ser Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ala Phe Leu Arg Val Ala Asp Asn 325 330 335 Phe Asn Arg Ser Lys Glu Ile Gly Glu Phe Ala Glu Arg Phe Lys Lys 340 345 350 Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Lys Leu Leu Ser Glu Phe Tyr His Glu Ala 355 360 365 Gly Thr Ile Asp Ala Ser Ile Thr Thr Ile Ser Thr Ala Leu Ser Ala 370 375 380 Ile Ala Ala Gly Thr Ala Ala Ala Ser Ala Gly Ala Leu Val Gly Ala 385 390 395 400 Pro Ile Thr Leu Leu Val Thr Gly Ile Thr Gly Leu Ile Ser Gly Ile 405 410 415 Leu Glu Phe Ser Lys Gln Pro Met Leu Asp His Val Ala Ser Lys Ile 420 425 430 Gly Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys Tyr Gly Lys Asn Tyr Phe 435 440 445 Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Lys Ala Phe Leu Glu Asp Ser Phe 450 455 460 Ser Leu Leu Ser Ser Phe Asn Lys Gln Tyr Glu Thr Glu Arg Ala Val 465 470 475 480 Leu Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Glu Tyr Ile Gly Glu Leu Ala Gly 485 490 495 Ile Thr Gly Lys Gly Asp Lys Leu Ser Ser Gly Lys Ala Tyr Val Asp 500 505 510 Tyr Phe Gln Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Lys Pro Asp Asp Phe Ser 515 520 525 Lys Val Val Phe Asp Pro Thr Lys Gly Glu Ile Asp Ile Ser Asn Ser 530 535 540 Gln Thr Ser Thr Leu Leu Lys Phe Val Thr Pro Leu Leu Thr Pro Gly 545 550 555 560 Thr Glu Ser Arg Glu Arg Thr Gln Thr Gly Lys Tyr Glu Tyr Ile Thr 565 570 575 Lys Leu Val Val Lys Gly Lys Asp Lys Trp Val Val Asn Gly Val Lys 580 585 590 Asp Lys Gly Ala Val Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu Ile Gln His Ala His 595 600 605 Ile Ser Ser Ser Val Ala Arg Gly Glu Glu Tyr Arg Glu Val Arg Leu 610 615 620 Val Ser His Leu Gly Asn Gly Asn Asp Lys Val Phe Leu Ala Ala Gly 625 630 635 640 Ser 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ttcttcgggg cgaaaactct 4380 caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 4440 cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 4500 ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 4560 aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 4620 tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 4680 tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 4740 ttcgtcttca c 4751 <210> 21 <211> 3431 <212> DNA <213> Plasmid pQE-60 <220> <223> pQE-60 <400> 21 ctcgagaaat cataaaaaat ttatttgctt tgtgagcgga taacaattat aatagattca 60 attgtgagcg gataacaatt tcacacagaa ttcattaaag aggagaaatt aaccatggga 120 ggatccagat ctcatcacca tcaccatcac taagcttaat tagctgagct tggactcctg 180 ttgatagatc cagtaatgac ctcagaactc catctggatt tgttcagaac gctcggttgc 240 cgccgggcgt tttttattgg tgagaatcca agctagcttg gcgagatttt caggagctaa 300 ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat cccaatggca 360 tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata accagaccgt 420 tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca agttttatcc 480 ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaatttc gtatggcaat 540 gaaagacggt gagctggtga tatgggatag tgttcaccct tgttacaccg ttttccatga 600 gcaaactgaa acgttttcat cgctctggag tgaataccac gacgatttcc ggcagtttct 660 acacatatat tcgcaagatg tggcgtgtta cggtgaaaac ctggcctatt tccctaaagg 720 gtttattgag aatatgtttt tcgtctcagc caatccctgg gtgagtttca ccagttttga 780 tttaaacgtg gccaatatgg acaacttctt cgcccccgtt ttcaccatgc atgggcaaat 840 attatacgca aggcgacaag gtgctgatgc cgctggcgat tcaggttcat catgccgtct 900 gtgatggctt ccatgtcggc agaatgctta atgaattaca acagtactgc gatgagtggc 960 agggcggggc gtaatttttt taaggcagtt attggtgccc ttaaacgcct ggggtaatga 1020 ctctctagct tgaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt 1080 tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc gctctagagc 1140 tgcctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg 1200 gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 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tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 2100 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 2160 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 2220 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 2280 aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 2340 tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 2400 cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 2460 tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac 2520 cggctccaga tttatcagca ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc 2580 ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta 2640 gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac 2700 gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat 2760 gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa 2820 gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg 2880 tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag 2940 aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc 3000 cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct 3060 caaggatctt accgctgttg agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat 3120 cttcagcatc ttttactttc accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg 3180 ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc 3240 aatattattg aagcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 3300 tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg 3360 tctaagaaac cattattatc atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct 3420 ttcgtcttca c 3431 <210> 22 <211> 4245 <212> DNA <213> Plasmid pACYC184 <220> <223> pACYC184 <400> 22 gaattccgga tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt 60 gtgcttattt ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt 120 ataggtacat tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga 180 tatatcaacg gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga 240 aaatctcgat aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt 300 ggaacctctt acgtgccgat caacgtctca ttttcgccaa aagttggccc agggcttccc 360 ggtatcaaca gggacaccag gatttattta ttctgcgaag tgatcttccg tcacaggtat 420 ttattcggcg caaagtgcgt cgggtgatgc tgccaactta ctgatttagt gtatgatggt 480 gtttttgagg tgctccagtg gcttctgttt ctatcagctg tccctcctgt tcagctactg 540 acggggtggt gcgtaacggc aaaagcaccg ccggacatca gcgctagcgg agtgtatact 600 ggcttactat gttggcactg atgagggtgt cagtgaagtg cttcatgtgg caggagaaaa 660 aaggctgcac cggtgcgtca gcagaatatg tgatacagga tatattccgc ttcctcgctc 720 actgactcgc tacgctcggt cgttcgactg cggcgagcgg aaatggctta cgaacggggc 780 ggagatttcc tggaagatgc caggaagata cttaacaggg aagtgagagg gccgcggcaa 840 agccgttttt ccataggctc cgcccccctg acaagcatca cgaaatctga cgctcaaatc 900 agtggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggcggctccc 960 tcgtgcgctc tcctgttcct gcctttcggt ttaccggtgt cattccgctg ttatggccgc 1020 gtttgtctca ttccacgcct gacactcagt tccgggtagg cagttcgctc caagctggac 1080 tgtatgcacg aaccccccgt tcagtccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 1140 gagtccaacc cggaaagaca tgcaaaagca ccactggcag cagccactgg taattgattt 1200 agaggagtta gtcttgaagt catgcgccgg ttaaggctaa actgaaagga caagttttgg 1260 tgactgcgct cctccaagcc agttacctcg gttcaaagag ttggtagctc agagaacctt 1320 cgaaaaaccg ccctgcaagg cggttttttc gttttcagag caagagatta cgcgcagacc 1380 aaaacgatct caagaagatc atcttattaa tcagataaaa tatttctaga tttcagtgca 1440 atttatctct tcaaatgtag cacctgaagt cagccccata cgatataagt tgtaattctc 1500 atgtttgaca gcttatcatc gataagcttt aatgcggtag tttatcacag ttaaattgct 1560 aacgcagtca ggcaccgtgt atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg 1620 tcaccctgga tgctgtaggc ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg 1680 atatcgtcca ttccgacagc atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt 1740 tgatgcaatt tctatgcgca cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc 1800 cagtcctgct cgcttcgcta cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac 1860 ccgtcctgtg gatcctctac gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg 1920 cggttgctgg cgcctatatc gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg 1980 ggctcatgag cgcttgtttc ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt 2040 tgggcgccat ctccttgcat gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc 2100 tactactggg ctgcttccta atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct 2160 tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg 2220 cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg 2280 tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg 2340 tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt 2400 tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc 2460 tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg 2520 gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg 2580 gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga 2640 tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag 2700 gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca 2760 cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg 2820 agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc 2880 catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg 2940 gccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg 3000 ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg 3060 caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag 3120 tctggaaacg cggaagtccc ctacgtgctg ctgaagttgc ccgcaacaga gagtggaacc 3180 aaccggtgat accacgatac tatgactgag agtcaacgcc atgagcggcc tcatttctta 3240 ttctgagtta caacagtccg caccgctgtc cggtagctcc ttccggtggg cgcggggcat 3300 gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc 3360 ggcagcgccc aacagtcccc cggccacggg gcctgccacc atacccacgc cgaaacaagc 3420 gccctgcacc attatgttcc ggatctgcat cgcaggatgc tgctggctac cctgtggaac 3480 acctacatct gtattaacga agcgctaacc gtttttatca ggctctggga ggcagaataa 3540 atgatcatat cgtcaattat tacctccacg gggagagcct gagcaaactg gcctcaggca 3600 tttgagaagc acacggtcac 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Claims (15)

1. 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드로서,
   a. 야생형 아미노산 서열이되,
   i. 서열번호 1에 제시된 ApxIA의 야생형 아미노산 서열은 K560 및 K686으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되고,
   ii. 서열번호 2에 제시된 ApxIIA의 야생형 아미노산 서열은 K557 및 N687로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되고,
   iii. 서열번호 3에 제시된 ApxIIIA의 야생형 아미노산 서열은 K571 및 K702로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산에서 변형되며,
   상기 하나 이상의 아미노산은 아실화에 민감하지 않은 아미노산에 의해 교환되는, 야생형 아미노산 서열; 또는
   b. a. 하에서 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동성인, a. 하에서 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열의 유사체 또는 단편이되, 단편은 a. 하에서 정의된 바와 같은 변형된 아미노산 서열의 연속적인 아미노산의 50% 이상을 포함하고, 상기 유사체 또는 단편은 a 하에서 정의된 바와 같이 아실화에 민감하지 않은 아미노산을 포함하는, 변형된 아미노산 서열의 유사체 또는 단편; 또는
   c. 야생형 아미노산 서열이되,
   i. 서열번호 1에 제시된 ApxIA의 야생형 아미노산 서열은 K560 및 K686으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유하고,
   ii. 서열번호 2에 제시된 ApxIIA의 야생형 아미노산 서열은 K557 및 N687로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유하고,
   iii. 서열번호 3에 제시된 ApxIIIA의 야생형 아미노산 서열은 K571 및 K702로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 결실을 함유하며,
   여기서 상기 결실은 야생형 아미노산 서열의 50% 초과를 결실하지 않는, 야생형 아미노산 서열;
   d. c 하에서 정의된 바와 같은 결실을 포함하는 아미노산 서열에 대해 90% 이상 상동성인, c. 하에서 정의된 바와 같은 결실을 포함하는 아미노산 서열의 유사체인, ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드.
2. 제1항에 있어서,
   상기 아실화에 민감하지 않은 아미노산이 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 발린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파르트산, 히스티딘, 아스파르트산, 시스테인, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 글루탐산으로 이루어진 군으로부터 선택되며; 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린, 이소류신 및 류신으로 이루어진 군으로부터 선택되고; 가장 바람직하게는 알라닌, 글리신, 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   a. 상기 서열번호 1에 제시된 ApxIA의 야생형 아미노산 서열이 K560 및 K686에서 변형되고,
   b. 상기 서열번호 2에 제시된 ApxIIA의 야생형 아미노산 서열이 K557 및 N687에서 변형되며,
   c. 상기 서열번호 3에 제시된 ApxIIIA의 야생형 아미노산 서열이 K571 및 K702에서 변형되는, ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   a. 상기 변형된 ApxIA 야생형 아미노산 서열이 서열번호 4이고,
   b. 상기 변형된 ApxIIA 야생형 아미노산 서열이 서열번호 5이며,
   c. 상기 변형된 ApxIIIA 야생형 아미노산 서열이 서열번호 6인, ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
6. 제5항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
7. 제5항 또는 제6항에 따른 핵산 분자를 포함하는 미생물.
8. 제7항에 있어서,
   상기 미생물이 에스케리치아 콜라이 균주 또는 악티노바실러스 균주, 바람직하게는 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에 균주인 것인, 미생물.
9. 백신 조성물로서,
   a. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 ApxIA, ApxIIA 또는 ApxIIIA 폴리펩티드,
   b. 제5항에 따른 핵산 분자 또는 제6항에 따른 벡터, 또는
   c. 제7항 또는 제8항에 따른 미생물;
   및 적어도 약학적 담체, 희석제 또는/및 아쥬반트
   를 포함하는, 백신 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 제9항의 a.의 백신 조성물이 서브유닛 백신인 것인, 백신 조성물.
11. 제10항에 있어서,
    상기 서브유닛 백신이 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에의 하나 이상의 추가의 폴리펩티드를 포함하는, 백신 조성물.
12. 제9항에 있어서,
    상기 제9항의 c.의 미생물이 생백신, 바람직하게는 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에 균주인, 백신 조성물.
13. 제12항에 있어서,
    2 개 이상의 상이한 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에 균주를 포함하는, 백신 조성물.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서,
    상기 apxIV 유전자 또는/및 sxy 유전자가 결실된, 백신 조성물.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 백신 조성물이 폐렴, 흉막염 또는 흉막폐렴, 특히, 악티노바실러스 플뢰로뉴모니아에에 의해 유발된 폐렴, 흉막염 또는 흉막폐렴의 예방적, 대량예방적 또는 치료적 치료에 사용하기 위한 것이되, 여기서 임의로 상기 백신 조성물이 근육 내, 피부 내, 정맥 내, 피하 또는 점막 적용으로 투여되는 것인, 백신 조성물.

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