SK279250B6 - Vakcína s obsahom proteínu pc na prevenciu lymskej - Google Patents
Vakcína s obsahom proteínu pc na prevenciu lymskej Download PDFInfo
- Publication number
- SK279250B6 SK279250B6 SK2172-92A SK217292A SK279250B6 SK 279250 B6 SK279250 B6 SK 279250B6 SK 217292 A SK217292 A SK 217292A SK 279250 B6 SK279250 B6 SK 279250B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- protein
- burgdorferi
- vaccine
- detecting
- antigens
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 103
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 100
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 62
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 title claims abstract description 58
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 46
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title claims description 27
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 title claims description 4
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 title claims description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 title description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 16
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 10
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 10
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 5
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 claims description 5
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 claims description 5
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical group [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 108700029191 Borrelia burgdorferi pC Proteins 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 38
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 20
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 18
- 101150045801 ospA gene Proteins 0.000 description 17
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 14
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 13
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 101150107960 ospB gene Proteins 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 8
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 8
- 101150005926 Pc gene Proteins 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 6
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 6
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 6
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 5
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 5
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 5
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 3
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000712 G cell Anatomy 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 2
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- -1 aluminum compound Chemical class 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 2
- 210000001503 joint Anatomy 0.000 description 2
- 108010071185 leucyl-alanine Proteins 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N Ala-Asp Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O XAEWTDMGFGHWFK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N Ala-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WKOBSJOZRJJVRZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XYTNPQNAZREREP-XQXXSGGOSA-N Ala-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XYTNPQNAZREREP-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N Ala-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O DVJSJDDYCYSMFR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N Ala-Ser-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)N HOVPGJUNRLMIOZ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N Ala-Tyr-Ala Chemical compound [O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)CC1=CC=C(O)C=C1 AENHOIXXHKNIQL-AUTRQRHGSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N Asp-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O PDECQIHABNQRHN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N Asp-Phe Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YZQCXOFQZKCETR-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VNXQRBXEQXLERQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 101001086191 Borrelia burgdorferi Outer surface protein A Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N Glu-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JZDHUJAFXGNDSB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N Gly-Ala-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN QSDKBRMVXSWAQE-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 1
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN OLIFSFOFKGKIRH-WUJLRWPWSA-N 0.000 description 1
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 1
- JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C JWBXCSQZLLIOCI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O TWVKGYNQQAUNRN-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RQJUKVXWAKJDBW-SVSWQMSJSA-N Ile-Ser-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N RQJUKVXWAKJDBW-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 206010023232 Joint swelling Diseases 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N L-leucyl-L-phenylalanine Natural products CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KFKWRHQBZQICHA-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 description 1
- HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N Leu-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HSQGMTRYSIHDAC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- YUGVQABRIJXYNQ-CIUDSAMLSA-N Leu-Ala-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YUGVQABRIJXYNQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YUGVQABRIJXYNQ-UHFFFAOYSA-N Leu-Ala-Ala Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(O)=O YUGVQABRIJXYNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N Leu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CCQLQKZTXZBXTN-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- LIINDKYIGYTDLG-PPCPHDFISA-N Leu-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LIINDKYIGYTDLG-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N Leu-Thr-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O LFSQWRSVPNKJGP-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Glu Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O UGTZHPSKYRIGRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN FMIIKPHLJKUXGE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- QBEPTBMRQALPEV-MNXVOIDGSA-N Lys-Ile-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QBEPTBMRQALPEV-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N Lys-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NCZIQZYZPUPMKY-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WRODMZBHNNPRLN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN NVGBPTNZLWRQSY-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- YXPJCVNIDDKGOE-MELADBBJSA-N Lys-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YXPJCVNIDDKGOE-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- 241001082241 Lythrum hyssopifolia Species 0.000 description 1
- 101710164702 Major outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N Ser-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CO SSJMZMUVNKEENT-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ala-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YQHZVYJAGWMHES-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N Ser-Gly-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O MIJWOJAXARLEHA-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N Ser-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CO VMLONWHIORGALA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O GZSZPKSBVAOGIE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N Ser-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N Thr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H](C)O BQBCIBCLXBKYHW-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- PRNGXSILMXSWQQ-OEAJRASXSA-N Thr-Leu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PRNGXSILMXSWQQ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N Thr-Lys-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MGJLBZFUXUGMML-VOAKCMCISA-N 0.000 description 1
- 208000035056 Tick-Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 108010045350 alanyl-tyrosyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 108010069205 aspartyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 108010025153 lysyl-alanyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010054155 lysyllysine Proteins 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004719 natural immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- ZEDAGFBWUVYFQU-UHFFFAOYSA-M sodium;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonate;hydrate Chemical compound [OH-].[Na+].OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 ZEDAGFBWUVYFQU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 229940124856 vaccine component Drugs 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
Oblasť techniky
Vynález sa týka vakcíny na prevenciu lymskej boreliózy u cicavcov. Podrobnejšie sa tento vynález týka imunogénnych prostriedkov a spôsobov ich použitia na spomalenie alebo prevenciu rozvoj a lymskej boreliózy.
Doterajší stav techniky
Táto prihláška je čiastočne nadväzujúcou prihláškou USA prihlášky 07/824 161 z 22. januára 1992, ktorá je čiastočne nadväzujúcou prihláškou USA prihlášky 07/727 245 z 11. júla 1991.
Pojem lymská choroba alebo lymská borelióza genericky označuje kliešťové infekcie, ktoré sú spôsobované spirochétou Borrelia burgdorferi Toto ochorenie predstavuje najobvyklejšie ochorenie prenášané kliešťom tak v Spojených štátoch, ako aj v Európe. Lymská choroba je podobná syfilisu, pretože ovplyvňuje mnoho orgánov, najčastejšie kožu, nervovú sústavu, srdce a kĺby, vyvíja sa postupne a môže sa stať chronickým ochorením.
Keďže lymská choroba môže klinickým obrazom pripomínať iné choroby, existuje potreba presných diagnostických prostriedkov, najmä v ťažkých prípadoch, kedy klinický obraz nie je presvedčivý. Je tu zároveň potreba spôsobu liečby alebo prevencie tejto choroby. Liečba antibiotikami môže byť efektívna, ak sa s ňou začne skoro po infekcii. Ak je však ochorenie v pokročilom štádiu, je potrebná ďalšia liečba vysokými dávkami. Okrem toho nie je liečba antibiotikami vždy úspešná, pozri Preac Mursic a spol: Infection 18, 332-341 (1990). Jc teda žiaduce predchádzať tomuto ochoreniu očkovaním.
Sú známe niektoré antigény Borrelia burgdorferi. O dvoch hlavných proteinoch vonkajšieho povrchu membrány Borrelia burgdorferi ospA (molekulová hmotnosť 31 000) a ospB (molekulová hmotnosť 34 000) pojednáva Barbour: Clin. Microbiol. Revs.+, 399-414 (1988). Vonkajší povrchový proteín ospA (outer-surface protein, skrátene osp) je prítomný vo väčšine kmeňov, ale je heterogénny. To znamená, že ospA proteíny z rôznych kmeňov sa môžu líšiť v molekulovej hmotnosti a v sérologickej aktivite.
OspB je menej rozšírený medzi kmeňmi než ospA, ale podobne ako ospA existuje vo formách, ktoré sa môžu líšiť v molekulovej hmotnosti a v sérologickej aktivite. Gény pre ospA a ospB, ktoré sú kódované plazmidmi, boli sekvenované a boli pripravené expresiou v E. coli. Pozri: Barbour a spol.: Rev. Inf. Dis. 11/6/, 1470 -1474 /1989/, Bergstrom a spol.: Mol. Mocrobiol. 3, 479 -486 -1989/.
pC proteín (s molekulovou hmotnosťou 24 000) z Borrelia burgdorferi je v niektorých smeroch podobný ospA a ospB. Je to tiež lipoproteín, ktorý má heterogenitu tak v molekulovej hmotnosti, ako sérologickú, a vyskytuje sa na bunkovom povrchu /je dostupný na bunkovom povrchu na naviazanie aglutinačnej protilátky a pC asociovaný s bunkou je citlivý na štiepenie proteázami/. Kmene, ktoré expresiou poskytujú pC protein, sú v Európe obvyklé. Z 28 európskych izolovaných vzoriek, testovaných podľa Wilskeho a spol: N.Y. Acad.Sci. 539, 126-143 (1988), bolo 40 - 50 % pozitívnych na pC proteín, i keď toto číslo môže byť podhodnotené, pretože expresia pC môže byť premenlivá.
Medzi ďalšie B. burgdorferi antigény patrí proteín vonkajšieho povrchu v oblasti molekulovej hmotnosti 60 000 (pozri Barbour a spol.:, proteín s flagelámou (bičíkovitou) štruktúrou v oblasti molekulovej hmotnosti 41 000 (Gassman a spol: Nucleic Acids Res. 17, 3590 (1989), proteín s molekulovou hmotnosťou v oblasti 39 000 (Simpson a spol.: J.Clin.Micro. 28, 1329-1337 (1990)), a proteín s molekulovou hmotnosťou približne 94 000 (Fuchs a spol.: Fourt Intemational Conference on Lyme Borreliosis (1990)).
Na prípravu antigénov na ďalšie štúdium a na ich charakteristiku boli v tejto súvislosti použité rôzne spôsoby čistenia, napríklad Wilske a spol. (Zbl.Bakt.Hyg. 263, 92-102 (1986)) podrobili celé Borreliae režimu SDS-PAGE, pričom proteíny boli denaturované teplom a vystavené pôsobeniu činidla, zloženého z dodecylsulfátu sodného (SDS) a 2-merkaptoetanolu. Hansen a spol. (J. Clin. Microbiol 26 (2), 338-346 (1988) opísali čistenie B. burqdorferi flagellum. Vo svetovej patentovej prihláške č. 90/04411 (Bergstrom a spol.) je opísaný nedenaturačný spôsob čistenia frakcií Borrelia burqdorferi.
Pozornosť bola sústredená aj na štúdium prípravy a charakterizovania rôznych antigénov s cieľom vyvinúť diagnostické testy.Tak diagnostický postup detekcie B. burgdorferi nepriamo, analyzovaním produkcie špecifickej protilátky ako odpovede na infekciu, je opísaný v uvedenej prihláške Bergstroma a spol. v USA patentovej prihláške č. 07/487 716 (Simpson a Schvan), publikovanej 18. júla 1990.
Coleman a spol. (J.Infect.Dis. 155, 756-765 (1987)) tiež opisujú prípravu frakcií B. burgdorferi spracovaním celých spirochét s denaturujúcim SDS zmáčavým detergentom. Získa sa tak protoplazmová frakcia /baktérie zbavené proteínového poťahu/, ktorá sa po ďalšom spracovaní môže použiť ako antigén.
Wilske a spol. (Fourt Intemational Conference on Lyme Borreliosis, 1990) opisujú identifikáciu imunodominantných Borrelia proteínov, o ktorých sa uvádza, že sú užitočné pri diagnostikovaní lymskej boreliózy. Títo výskumní pracovníci prišli k záveru, že dva proteíny, pC a p 100, môžu byť obzvlášť dôležité v tom, že poskytujú indikáciu včasných a neskorých stavov ochorenia.
I keď sú známe rôzne antigény, nedá sa predpovedať obranná účinnosť zo schopnosti antigénu vyvolávať imunitnú odpoveď v priebehu prirodzenej alebo pokusnej infekcie. Napríklad bičíkovitý (flagelárny) proteín s molekulovou hmotnosťou 41 000 indukuje imunitnú odpoveď, ale nie je obranný . Pozri Šimon a spol.: Immunology Today 12, 11-16 (1991). Podobne aj proteín molekulovej hmotnosti 94 000 zlyháva pri obrane, ako je to opísané ďalej v príklade 3. V skutočnosti autori tejto prihlášky pozorovali, že antigény, ktoré sú obranné, sú relatívne vzácne. Veľká časť imunitnej odpovede sa teda týka antigénov, ktoré nie sú vhodné na obranu. A naopak, niektoré potenciálne vhodné antigény môžu zlyhať pri vyvolávaní adekvátnej odpovede. Použiteľnosť vakcinovej zložky sa nemôže odvodzovať od schopnosti antigénu vyvolávať protilátkovú odpoveď.
Existuje teda potreba pokračovania výskumu vývoja vhodnej vakcíny proti lymskej chorobe, lymskej borelióze. Z tohto pohľadu je dôležitý fakt, že v USA patente č. 4 721 617 (Johnson) je opísaná vakcína proti lymskej borelióze, pozostávajúca z celých buniek B. burgdorferi, ktoré boli dezaktivované lyofilizáciou. Na základe izolácie patogénu z obličky alebo sleziny Johnson dokázal od dávky závislé zníženie vnímavosti imunizovaných škrečkov na infekciu virulentným kmeňom B. burgdorferi. Ale účinok bol krátkodobý. Zvieratá 90 dní po očkovaní neboli úplne chránené.
Európska patentová prihláška č. 418 827 (Šimon a spol.) opisuje vakcínu proti B. burgdorferi, najmä kmeňom B31 a ZS7, ktorá pozostáva z monoklonálnych protilátok, ktoré rozoznávajú ospA proteín s molekulovou hmotnosťou 31 000. Podľa uvedenej európskej patentovej prihlášky Šimona a spol. pasívna imunizácia SCID-myší týmito protilátkami inhibuje vývoj príznakov, indukovaných Borreliou (ochrana je definovaná v pojmoch: rezistencia na infekciu a vývoj artritídy. Táto európska prihláška opisuje tiež expresiu v E. coli rekombinantného proteínu s napojením β-galaktozidáza/ospA. Opísané monoklonálne protilátky vznikajú imunizáciou celou bakteriálnou bunkou alebo rekombinantnými antigénnymi proteínmi.
Fikrig a spol. (Science 250, 553-556 (1990)) dokumentujú pasívnu obranu myší /C3H/HeJ/ polyklonálnym sérom na usmrtené B. burgdorferi alebo na E. coli expresiou poskytujúce ospA alebo ospA-špecifickou monoklonálnou protilátkou. Predpokladá sa, že myši boli aktívne chránené po imunizácii vyčisteným rekombinantným proteínom s napojením osp/glutatión S-transferáza. Obrana je meraná v termínoch schopnosti imunogénu chrániť pred infekciou alebo odstraňovať histopatologické prejavy ochorenia.
Bergstrom a spol. (svetový patent WO 90/04411) navrhujú tiež možnosť, aby sa imunologický aktívne frakcie B. burgdorferi mohli používať vo vakcínach. Neuvádzajú však žiadne údaje, ktoré by dokazovali imunogenicitu alebo obrannú účinnosť opísaných frakcií.
Podstata vynálezu
Predmetom vynálezu je vakcína s obsahom proteínu pC na prevenciu alebo liečenie lymskej boreliózy. Podstata vakcíny podľa vynálezu spočíva v tom, že obsahuje (a) materiál vybraný zo skupiny zahrnujúcej aspoň jednu sérologickú formu proteínu pC z Borrelia burgdorferi v homogénnej forme, variantu pC a imitácie pC, obe vyvolávajúce produkciu ochranných protilátok, (b) fyziologicky prijateľný excipient a (c) adjuvans, pričom uvedený materiál je obsiahnutý v množstve účinne chrániacom vnímavých cicavcov, 1 až 100 pg v jednej dávke, najmä však 10 až 50 pg v jednej dávke.
Vakcína ďalej obsahuje aspoň jeden ne-pC antigén Borrelia burgdorferi. Ako adjuvans vakcína obsahuje hydroxid hlinitý a je určená pre človeka ako cicavca.
Vynález opisuje aj spôsob čistenia proteínu B. burgdorferi. Čistenie sa uskutočňuje tak, že sa bunky B. burgdorferi rozbijú a potom frakcionujú na membránovú zložku a cytoplazmovú zložku, membránová zložka sa resuspenduje v nedenaturujúcom detergente za získania rozpustného proteínu a nerozpustného materiálu, načo sa ďalej rozpustený proteín oddelí od nerozpustného materiálu. Rozpustený proteín sa chromatografuje na ionexe, proteínové frakcie sa spoja a spojené proteínové frakcie sa podrobia antigénovej skúške.
Je možné po rozbití buniek B. burgdorferi výhodne spojené frakcie ďalej chromatografovať na hydroxyapatite za skoncentrovania a ďalšieho vyčistenia proteínových frakcií.
Ako proteín sa výhodne čistí proteín pC.
Vynález opisuje aj diagnostické činidlo na detekciu protilátok B. burgdorferi vo vzorkách, najmä v ľudskej telovej tekutine a spôsob detekcie protilátok B. burgdorferi vo vzorkách telovej tekutiny. Toto sa robí tak, že vzorka tekutiny inkubuje s diagnostickým činidlom podľa vynálezu, a stanoví sa prítomnosť väzby protilátky ako výsledku reakcie.
V nasledujúcej časti spisu budú podrobne opísané výhodné spôsoby realizácie tohto vynálezu.
I keď bolo identifikovaných a do rôznych stupňov charakterizovaných niekoľko rôznych antigénov B. burgdorferi, proteín pC až doposiaľ nebol preskúmaný ako obranný faktor proti lymskej chorobe. Kľúčovým aspektom tohto objavu bolo poznanie, že na optimálnu obrannú potenciu by bolo nutné zachovať čo možno najpôvodnejšiu konformáciu pC proteínu. Bol teda vyvinutý nový spôsob prípravy homogénneho pC proteínu, ktorý necháva prirodzenú konfiguráciu proteínu v podstate neovplyvnenú. To umožňuje použiť pC ako imunogén proti lymskej borelióze. Táto nedenaturujúca čistiaca metóda je aplikovateľná na produkciu Borrelia antigénov na použitie pri detekcii lymskej choroby.
Obranný účinok nedenaturovaného pC proteínu sa ľahko demonštruje pri gerbile (mongolská púštna myš, Gerbilles), ktorá až dodnes nebola považovaná za vhodný zvierací model na zisťovanie účinnosti daného antigénu, ako je napríklad pC, pri získavaní obranných protilátok proti lymskej chorobe. Bolo však zistené, že gerbila je vhodná na toto vyhodnocovanie, sčasti preto, že borelióza gerbil imituje niektoré dôležité aspekty tohto ochorenia u človeka. Tak pri gerbilách, rovnako ako u ľudí:
1. infekcia je multisystémová, ovplyvňuje rôzne orgánové systémy, ako je napríklad koža, kĺby, nervový systém, slezina, srdce, žlčník a obličky,
2. ochorenie môže byť chronické. B. burgdorferi boli izolované z gerbil po viac ako jednom roku,
3. u gerbil, rovnako ako u ľudí, sa môžu vyvinúť opuchy kĺbov, pripomínajúce artritídu a
4. existuje podobná humorálna imunitná odpoveď, pokiaľ ide o špecifičnosť a dočasný vývoj odpovede. Napríklad bolo objavené, že infikované gerbily a infikovaní ľudia, majú malú imunitnú odpoveď, ak vôbec nejakú majú, na ospA a ospB proteíny. V skutočnosti sú ospA a ospB protilátky u gerbil a u ľudí (na rozdiel od myši) vzácne.
Jedno využitie podľa tohto vynálezu sa týka vakcíny proti lymskej borelióze, kedy imunogén obsahuje pC proteín B. burgdorferi. pC proteín je antigén na povrchu bunky, ako bolo demonštrované jeho proteolytickým štiepením z neporušených buniek B. burgdorferi. Ďalej je charakterizovaný tým, že má molekulovú hmotnosť asi 24 000, aj keď pC z rôznych kmeňov môže mať tak rôznu molekulovú hmotnosť, ako aj sérologickú heterogenicitu. Pomocou konvenčnej metodológie hybridómu sa produkuje jedenásť monoklonálnych protilátok (B. burgdorferi monoklonálne protilátky 22, 28, 29, 34 až 39 vrátane, 42 až 45), ktoré sa viažu s pC z B. burgdorferi kmeňa Orth-1 a niekoľkých ďalších kmeňov.
Úplná DNA sekvencia a odvodené sekvencie aminokyselín pC proteínu B. burgdorferi, použitého na štúdie obrany je nasledujúca:
| mei | lys | lys | aen | chr | leu | ser | ala | ile | leu | met | thr | leu | phe | leu | phe |
| ATG | AAA | AAG | AAT | ACA | TTA | AGT | GCG | ATA | TTA | ATG | ACT | TTA | TTT | TTA | TTT |
| Íle | ser | cye | asn | asn | ser | giy | lye | gly | gly | aep | ser | ala | ser | thr | asn |
| ATA | TCT | TCT | AAT | AAT | TCA | GGG | AAA | GGT | GGA | GAT | TCT | GCA | TCT | ACT | AAT |
| pro | ala | a sp | glu | ser | ala | lys | giy | pro | asn | leu | thr | glu | ile | ser | iye |
| CCT | GCT | GAC | GAG | TCT | GCG | AAA | GGA | CCT | AAT | CTT | ACA | GAA | ATA | AGC | AAA |
| lys | ile | thr | a sp | ser | asn | ala | phe | val | leu | ala | val | lys | glu | val | glu |
| AAA | ATT | ACA | GAT | TCT | AAT | GCA | TTT | GTA | CTG | GCT | GTT | AAA | GAA | GTT | GAG |
| thr | leu | val | ser | ser | ile | asp | glu | leu | ala | thr | iye | ala | íle | giy | lye |
| ACT | TTG | GTT | TCA | TCT | ATA | GAT | GAA | CTT | GCT | ACT | AAA | GCT | ATT | GGT | AAA |
| lys | ile | gin | gin | asn | asn | giy | leu | gly | ala | asn | ala | asp | lye | asn | giy |
| AAA | ATA | CAA | CAA | AAT | AAT | GGT | TTA | GGC | GCC | AAT | GCG | GAT | AAA | AAC | GG |
| ser | leu | leu | ala | gly | ala | tyr | ala | ile | ser | thr | leu | ile | thr | glu | lys |
| TCA | TTG | TTA | GCA | GGA | GCT | TAT | GCA | ATA | TCA | ACC | CTA | ATA | ACA | GAA | AAA |
| leu | lys | ala | leu | lys | asn | ser | giy | glu | leu | lys | ala | lys | ile | glu | asp |
| TTA | AAG | GCA | TTG | AAA | AAT | TCA | GGA | GAA | TTA | AAG | GCA | AAA | ATT | GAA | GAT |
| ala | lys | iys | cya | aer | giu | asp | phe | thr | lys | lys | leu | ala | ala | gly | his |
| GCT | AAG | AAA | TGT | TCT | GAA | GAT | TTT | ACT | AAA | AAA | CTA | GCT | GCT | GGG | CAT |
| ala | gin | leu | giy | ile | aep | gly | ala | thr | asp | asn | asp | ser | lys | glu | ala |
| GCA | CAG | CTT | GGT | ATA | GAC | GGA | GCT | ACT | GAT | AAT | GAT | TCA | AAA | GAA | GCA |
| ile | leu | lye | thr | asn | giy | thr | lye | thr | lye | 9iy | ala | glu | glu | leu | val |
| ATT | TTG | AAA | ACA | AAT | GGG | ACT | AAA | ACT | AAG | GGT | GCT | GAA | GAA | CTT | GTA |
| lys | leu | ser | glu | ser | val | ala | ser | leu | ser | lys | ala | ala | gin | glu | ala |
| AAG | TTA | TCT | GAA | TCA | GTA | GCA | AGC | TTG | TCA | AAA | GCG | GCT | CAA | GAA | GCA |
| ser | ala | aen | ser | val | lys | glu | leu | thr | ser | pro | val | val | ala | glu | thr |
| TCA | GCT | AAT | TCA | GTT | AAA | GAG | CTT | ACA | AGT | CCT | GTT | GTA | GCA | GAA | ACT |
pro lys lys pro *♦+ CCT AAA AAA CCT TAA pC proteín podľa tohto vynálezu môže obsahovať zmes rôznych sérologických foriem prirodzene sa vyskytujúceho pC proteínu. Okrem pc proteínu, získaného z buniek B. burgdorferi, ako je opísané, sa môžu používať rekombinantné pC varianty prirodzene sa vyskytujúcej molekuly (pC varianty) a imitácie - zlúčeniny s mimotópmi, ktoré imitujú pC epitópy.
Medzi kategórie pC variant patria napríklad oligopeptidy a polypeptidy, zodpovedajúce imunogénnym častiam pC molekuly a akékoľvek neproteínové imunogénne časti molekuly pC molekuly.
Za varianty sú teda považované také polypeptidy, ktoré sú homológne a zachovávajú si imunologické rysy prírodnej pC molekuly. V tomto zmysle homológia medzi dvoma sekvenciami označuje podobnosť identity, označujúce odvodenie prvej sekvencie od druhej. Napríklad polypeptid je homológny s pC, ak obsahuje sekvenciu aminokyselín, ktorá zodpovedá epitópu, rozoznávanému protilátkami špecifickými pre pC alebo T-bunkami. Takáto sekvencia môže mať dĺžku niekoľkých aminokyselín a môže byť lineárnou determinantou alebo determinantou, ktorá vznikne, ak aminokyseliny z oddelených častí lineárnej sekvencie sú priestorovo umiestnené za sebou po proteínovom zložení alebo po modifikácii kovalentnej väzby. Sekvencie aminokyselín, ktoré sú antigénnymi determinantmi podľa tohto vynálezu, môžu byť detekované napríklad analytickou technikou monoklonálneho mapovania, ktorá je odborníkom známa. Pozri Regenmortel: Immunology Today 10, 266-272 (1989) a Berzofsky a spol.: Immunological Rewievs 98, 9-52 (1987). Analýza podobnosti tohto typu sa môže robiť tiež štúdiou kompetitívnej inhibície v prípade protilátok alebo proliferáciou T-buniek.
Polypeptidy, ktoré sa kvalifikujú podľa týchto kritérií ako pC varianty, sa môžu pripravovať podľa tohto vynálezu konvenčnými reverznými genetickými technikami, t.j. navrhnutím genetickej sekvencie, založenej na sekvencii aminokyselín, alebo konvenčnými genentickými strihovými technikami. Napríklad pC varianty sa môžu pripravovať technikami, medzi ktoré patria miestne riadené mutagenézy alebo oligonukleotidom riadené mutagenézy. Pozri napríklad Mutagenesis of Cloned DNA v Current Protocols in Molecular Biology 8.0.3. a nasledujúce (Ausubel a spol., red. 1989) (Ausubel).
Iné pC varianty podľa tohto vynálezu sú molekuly, ktoré zodpovedajú časti pC, alebo ktoré obsahujú časť pC, ale nie sú koincidenčné s prírodnou molekulou, a ktoré majú imunogénnu aktivitu pC, ak sú prítomné samé, alebo ak sú naviazané na nosič. pC variant tohto druhu by mohol predstavovať skutočný fragment prírodnej molekuly alebo by mohla byť polypeptidom, ktorý bol syntetizovaný de novo alebo rekombinantne.
Aby bola polynukleotidová molekula, kódujúca takúto molekulu, použiteľná pri rekombinantnej expresii pC alebo pC variantu, mala by výhodne obsahovať nukleotidovú sekvenciu, zodpovedajúcu žiadanej sekvencii aminokyselín, ktorá je optimálna pre vybraného hostiteľa v takých pojmoch, ako sú použitý kodón, počiatok translácie a expresie komerčne užitočných množstiev pC alebo žiadanej variantu pC. Aj vektor, ktorý je vybraný na trasformáciu určeného hostiteľského organizmu takouto polynukleotidovou molekulou, by mal umožniť efektívne uchovanie a transkripciu sekvencie, kódujúcej polypeptid. Kódujúca polypeptidová molekula môže kódovať chimémy proteín. To znamená, že môže mať nukleotidovú sekvenciu, kódujúcu imonologickú časť pC molekuly, odštiepiteľne napojenú na kódujúcu sekvenciu ne-pC časti, ako je napríklad signálny peptid hostiteľskej bunky.
Aby sa izoloval DNA segment, ktorý kóduje pC molekulu, môže sa celková B.burgdorferi DNA pripraviť podľa publikovaných spôsobov. Pozri napríklad Maniatis a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, N.Y.1982, Baess:Acta Pathol. Microbiol. Scand. (Sect.B) 82, 780-784 (1972). Takto získaná DNA sa môže čiastočne rozštiepiť reštrikčným enzýmom. Získa sa tak viac alebo menej náhodné zoradenie genómových fragmentov. Na tento účel je vhodný enzým s tetranukleotidovým rozoznávacím miestom, ako je napríklad Sau3A (Mbol). Fragmenty z takéhoto čiastočného štiepenia sa potom môžu rozdeliť na frakcie podľa veľkostí, napríklad odstreďovaním v sacharózovom gradiente (pozri Maniatis a spol.), alebo elektroforézou na géli v pulznom poli (Pozri Anad. Trends in Genetics 278-283, November 1986). Získajú sa tak fragmenty s dĺžkou, porovnateľnou s dĺžkou DNA, kódujúcej molekulu pC.
Podľa dobre známych opísaných spôsobov, napríklad Ausubel 5.0.1, respektivne nasledujúce, sa vybrané fragmenty môžu klonovať do vhodného klonovacieho vektora. Takto sa získaná DNA môže vložiť napríklad v mieste BamHl klonovacieho vektora pUC18. Chiméme plazmidy alebo fág, mimo iného, pripravené napojením fragmentov, vybraných podľa veľkosti na klonovací vektor sa potom môže transformovať do E. coli alebo iných hostiteľských buniek, ktoré sa potom testujú na expresiu kódovaného proteínu. Na identifikovanie klonu, obsahujúceho pC gén pri testovaní bánk sa môžu používať rôzne spôsoby. Medzi tieto spôsoby patrí testovanie hybridizačnou sondou, špecifickou pre pC, ako je napríklad oligonukleotidová sonda, alebo testovanie na expresiu pC antigénu imunologickým činidlom, špecifickým pre pC. Druhý spôsob môže byť realizovaný imunoblotovaním banky anti-pC monoklonálnych protilátok, alebo špecifickou monoklonálnou protilátkou, pripravenou zo zvierat, imunizovaných vyčisteným pC. Len čo je v banke kloň, obsahujúci DNA, ktorá kóduje pC, už raz identifikovaný, môže byť izolovaná DNA, môže byť plne charakterizovaná oblasť, kódujúca pC proteín (sekvenovanim), a následne sa DNA môže použiť na pro4
SK 279250 Β6 dukciu pC expresných vektorov, vhodných na produkciu pC-aktívneho proteínu.
Ako už bolo poznamenané, na získanie efektívneho imunogénu by mala byť Štruktúra rekombinantne expresiou získaného pC proteínu dostatočne podobná štruktúre prírodného (nedenaturovaného) pC: Tento proteín potom indukuje produkciu ochranných protilátok. Je výhodné, aby expresiou bola produkovaná DNA kódujúca pC takým spôsobom, že sa obíde intraceluláma proteolýza a agregácia expresovaného produktu v denaturovanej forme. Jedným spôsobom, ako obísť tieto problémy, je rekombinantne pripraviť pC v hostiteľskom vektorovom systéme tak, že dochádza k sekrécii pC z hostiteľskej bunky, výhodne priamo do kultivačného média. Jeden takýto systém poskytuje Bacillus subtilis. Vhodný sekrečný vektor je možné pre Bacillus subtilis skonštruovať naviazaním B. amyloliquefaciens -amylázovej signálnej sekvencie (pozri Young a spol: Nucleic Acid Res.ll, 237-249 (1983) na Bacillus plazmidový vektor pUBl 10, ako opísali Ulmanen a spol.: J. Bacteriol. 162, 176-182 (1985). Podľa tohto prístupu sa kódujúce sekvencie pre cudzí proteín klonujú v smere vlákna promótora ribozómového väzobného miesta a signálnej sekvencie pre -amylázu. Transkripcia a translácia pC je pod kontrolou -amylázového promótora a translačného aparátu v tejto konštrukcii.Sekrécia pC z hostiteľskej bunky sa dosiahne -amylázovou signálnou sekvenciou. Na použitie v kvasinkách boli použité podobné vektory. Použitím týchto vektorov je možné prísť k sekrécii expresiou získaného pC v kvasinkách.
Ďalším prístupom k expresu pC v systéme hostiteľ-vektor, ktorý sa vyhýba proteolýze, agregácii a denaturácii, je použitie vírusu vakcínie ako vektora schopného expresie v rôznych hostiteľských bunkách cicavcov, citlivých na infekciu vírusom vakcínie. Podľa tohto postupu je možné pripraviť vektor, odvodený od rekombinantného vírusu vakcínie, v ktorom je pC gén umiestnený pod kontrolou promótora, spolu s translačnými a sekrečnými signálmi, vhodne na expresiu pC proteínu v hostiteľovi, infikovanému vakcíniou. Ako je to opísané v USA patente č. 4 603 112, tento plazmid by obsahoval aj 5' pre transkripčné kontrolné oblasti a 3' pre 3' terminačné a polyadenylačné signály obklopujúce sekvencie, ktoré prispievajú k homológnej rekombinácii do prírodného genómu vakcínie. Keď je konštrukcia tohto druhu zavedená do hostiteľskej bunky, infektovanej vakcíniou, obklopujúce sekvencie riadia rekombináciu medzi plazmidovým vektorom a vírusom vakcínie. Výsledkom je, že klonovaná štrukturálna sekvencia (tu kódujúca pC) sa stáva časťou, ktorá je množená a ktorá je produkovaná expresiou vírusom vakcínie. Výhodne oblasť medzi obklopujúcimi sekvenciami obsahuje tiež selektovateľný marker, taký, aby v prítomnosti selekčného média prežili len tie bunky, ktoré obsahujú rekombinovaný vírus vakcínie (a, v našej súvislosti, sekvenciu kódujúcu pC aktívny polypeptid).
Rekombinantný vakcínia kmeň, ktorý je produkovaný týmto spôsobom, sa môže použiť na infektovanie cicavčích buniek, ako sú napríklad bunky Vero alebo bunky CV1, vhodné na fermentačný rast vo vysokej hustote. pC-aktívny proteín, ktorý sa získava expresiou v týchto bunkách v priebehu fermentácie, by sa sekretoval do fermentačného média, z ktorého by sa vyčistil konvenčnými spôsobmi.
Okrem prírodného pC a pC variantov sú v tomto vynáleze zahrnuté zlúčeniny (imitácie, mimikry), ktoré imitujú pC epitópy (mimotópy). Jedným príkladom imi tácie je antiidiotypová protilátka, t.j. protilátka, ktorá je produkovaná imunizáciou živočícha protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na epitóp na antigéne. Antiidiotypová protilátka rozoznáva a zodpovedá kombinačnému miestu na prvej protilátke. Tvar tohto kombinačného miesta úzko pripomína epitóp, ktorý sa hodí do kombinačného miesta prvej protilátky. Keďže antiidiotypová protilátka má kombinačné miesto, tvar ktorého imituje originálny antigén, môže byť použitá ako vakcína na generáciu protilátok, ktoré reagujú s pôvodným antigénom. Pozri Fineberg a Ertl: CRC Critical Reviews in Immunology 7,269-284 /1987/. Príslušné imitácie by mohli byť identifikované testovaním pC protilátkou. Tým sa detekuje, ktorá zlúčenina sa na ne viaže alebo ktorá by mohla byť produkovaná molekulárnym modelovaním. Pozri Morgan a spol: Approaches to the Discovery of Non-Peptide Ligands for Peptide Receptors and Peptidases, v Annual reports in Medicinal Chemistry (Academic Press 1989), na stranách 243 a nasledujúcich.
Vakcína podľa tohto vynálezu je určená na imunizáciu vnímavého cicavca, vrátane človeka, proti lymskej chorobe. Pojem imunogén znamená antigén, ktorý vyvoláva špecifickú imunitnú odpoveď, vedúcu k humorálnej alebo bunkami sprostredkovanej imunite, v tej to súvislosti, proti infekcii, spôsobenej Borréliou. Pojem imunita teda označuje schopnosť jednotlivca byť rezistentný proti infekcii, alebo prekonávať infekciu ľahšie v porovnaní s neimunizovanými jednotlivcami, alebo znášať infekciu bez toho, aby prišlo ku klinickému ovplyvneniu jednotlivca.
Imunogén podľa tohto vynálezu môže ďalej obsahovať prijateľný fyziologický nosič. Takéto nosiče sú odborníkom dobre známe. Patria medzi ne makromolekuláme nosiče. Medzi príklady vhodných nosičov u cicavcov patrí tuberkulín PPD, hovädzí séroalbumín, ovalbumín alebo KLH (Kezhole limpet hemocyanin). Nosič by mal byť výhodne netoxický a nealergizujúci.
Imonogén môže ďalej obsahovať adjuvans, ako je napríklad hlinitá zlúčenina, voda a emulzia rastlinného alebo minerálneho oleja (napríklad Freundovo adjuvans), lipozómy, ISCOM (imunostimulačný komplex), vo vode rozpustné sklá, polyanióny (napr. poly A: U, dextransulfát, lentinan), netoxické lipopolysacharidové analógy, muramyldipeptid a imunostimulačné zlúčeniny (napríklad interleukíny 1 a 2) alebo ich kombinácie. Výhodným adjuvansom je hydroxid hlinitý. Imunogenicita môže byť zvýšená tiež pri cicavcoch, ktoré dostali živé zoslabené bakteriálne vektory, ako je napríklad Salmonella alebo Mycobactérie, alebo vírusové vektory, ako Vaccinia, ktoré expresiou poskytujú pC aktívny polypeptid.
Spôsoby formulácie takýchto imunogénov sú dobre známe odborníkom. Napríklad imunogén podľa tohto vynálezu môže byť lyofilizovaný pre následnú rehydratáciu v excipiente, ako je napríklad soľný roztok alebo iný fyziologický roztok. Vakcína podľa tohto vynálezu sa pripravuje tak, že sa zmieša imunologický aktívne množstvo pC s excipientom v množstve, ktoré vedie k žiadanej koncentrácii imunogeneticky efektívnej zložky vakcíny. Množstvo imunogeneticky efektívnej zložky vo vakcíne závisí od cicavca, ktorý má byť imunizovaný s tým, že sa berie do úvahy vek a hmotnosť subjektu a tiež imunogenicita imunogénnej zložky, prítomnej vo vakcíne. Vo väčšine prípadov množstvo imunogénnej zložky vakcíny bude v rozmedzí 1 až 100 pg na dávku, výhodne bude v rozmedzí od 10 do 50 g na dávku.
V ešte inom usporiadaní podľa tohto vynálezu imunogén pozostáva z pC, pC variantu alebo pC imitácie a jedného alebo viac B. burgdorferi antigénov.
Spôsoby prípravy vakcín podľa tohto vynálezu sú navrhnuté tak, aby zaistili, že identita a imunologická účinnosť špecifických molekúl je zachovaná a že sa nezavádzajú žiadne ďalšie nežiaduce mikrobiálne zlúčeniny, Koncové produkty sa distribuujú a uchovávajú za aseptických podmienok.
Spôsob imunizácie cicavca proti lymskej chorobe zahŕňa podávanie efektívneho množstva predchádzajúceho imunogénu cicavcovi. Podávanie môže prebiehať akýmkoľvek spôsobom, dobre známym odborníkom. Napríklad vhodnou stratégiou je podávanie už opísanej vakcíny cicavcom, o ktorých je známe, že sú vystavené kliešťom, nesúcim B. burgdorferi, približne 6 mesiacov až 1 rok pred známym časom alebo pred predpokladaným vystavením ich pôsobeniu. V súlade s týmto vynálezom je možné použiť akúkoľvek imunizačnú cestu, o ktorej je možné predpokladať, že produkuje príslušnú imunitnú odpoveď, i keď výhodné sa javí parenterálne podávanie. Medzi vhodné formy podávania patrí subkutánne, intrakutánne alebo intramuskuláme podanie, alebo prostriedky vhodné na orálne, nosné alebo rektálne podávanie.
V inom usporiadaní podľa tohto vynálezu bol na čistenie rôznych B. burgdorferi antigénov z rozličných B. burgdorferi kmeňov vyvinutý nedenaturačný spôsob. Medzi antigény patria, ale nie sú na ne obmedzené, ospA, ospB, pC, protein s flagelámou štruktúrou a proteíny, ktoré majú približne molekulové hmotnosti 21 000, 56 000, 60 000 a 63 000. Tieto postupy znamenajú zlepšenie oproti spôsobom, známym z odbornej literatúry, ktoré sú buď dcnaturačné, sú špecifické len pre príslušný typ antigénu, alebo pri ktorých sa dosahuje len čiastočné vyčistenie. Výhodný spôsob čistenia zahŕňa nasledujúce stupne:
a) rozbitie buniek B. burgdorferi a frakcionovanie odstreďovaním na membránové a cytoplazmové zložky,
b) extrakciu membránovej frakcie nedenaturačným zmáčacím činidlom s nasledovným odstreďovaním: získa sa tak supematant, obsahujúci solubilizovaný protein, nerozpustný materiál sa odstráni ako peleta a
c) frakcionáciu solubilizovaných antigénov chromatografiou na ionexe (dietylaminoetyl alebo DEAE), pričom absorbované antigény sa eluujú gradientom chloridu sodného.
Čistenie môže zahŕňať zahustenie a ďalšie čistenie antigénov: a) chromatografiou na hydroxyapatite, adsorbované antigény sa eluujú zvyšovaním obsahu fosforečnanu v pufri a/alebo b) afmitnou chromatografiou na imobilizovanom kove, adsorbované antigény sa eluujú imidazolom.
Medzi iné elučné spôsoby, známe odborníkom, patrí elúcia znížením pH alebo zvýšením koncentrácie chloridu amónneho, histidínu alebo inej látky s afinitou ku komplexovanému kovu.
Rozbitie buniek je možné realizovať lýzou buniek, ich trepaním v suspenzii s malými perličkami v bunkovom mlyne, pôsobením ultrazvuku alebo vo francúzskom lise. Antigény sa môžu extrahovať tiež priamo z bunkovej steny organizmu tak, že sa táto bunka vystaví pôsobeniu zmáčacieho činidla, zmenou iónovej sily bunkového okolia alebo miernou zmenou teploty. Možne jc použiť aj východiskový materiál, ktorý obsahuje tiež membránové pľuzgieriky, ktoré sú z buniek vypustené.
Extrakcia membránovej frakcie sa môže realizovať zmáčacím činidlom, ktoré má výhodne dobrú rozpúšťaciu schopnosť, je nedenaturačné a je zlučiteľné s chromatografiou na ionexe. Výhodným zmáčacím činidlom je zwiteriontové činidlo 3-14 (Calbiochem), ale môže sa použiť akékoľvek zmáčacie činidlo alebo organické rozpúšťadlo, ktoré má uvedené vlastnosti. Zmáčacie činidlo sa typicky používa v koncentrácii 1 % (hmotnostné diely k objemovým dielom). Účinná je zmena tejto koncentrácie v rozmedzí od 0,01 do 10 % (hmotnostné diely k objemovým dielom). Extrakcia zmáčacím činidlom sa realizuje za teploty v rozmedzí od 0 do 60 °C, výhodne pri teplote 37 °C. Extrakcia by mala trvať desať minút až osem hodín, výhodne jednu hodinu. Na zlepšenie procesu rozpúšťania by sa mohli okrem zmáčacieho činidla používať chaotropné činidlá, ako je napríklad močovina.
Antigény, ktoré sú pomocou zmáčacieho činidla uvedené do roztoku, sa potom rozdeľujú na frakcie DEAE-chromatografiou. Výhodne sa používa DEAE ionexová živica. Je však možné používať iné anexové alebo katexové živice namiesto DEAE ionexovej živice, alebo sa používajú vo vzájomnej kombinácii. Podľa tohto vynálezu ionexová živica obsahuje nerozpustnú matricu, s ktorou boli skondenzované nabité skupiny. Medzi funkčné skupiny, používané pri anexoch, patria aminoctylová (AE), dietylaminoetylová (DEAE) a kvartéma aminoetylová skupina (QAE). Katexy môžu mať karboxymelovú (CM), fosfo- alebo sulfopropylovú (SP) skupinu. I keď sa vzorky na kolónu nanášajú v pufri Tris, obsahujúcom zwiteriónové zmáčacie činidlo 3-14 (1 %) a antigény sa eluujú gradientom chloridu sodného, môžu byť rovnako účinné i iné usporiadania.
Antigény sa môžu skoncentrovať naviazaním na hydroxyapatit podľa spôsobov, ktoré sú odborníkom dobre známe. Alternatívny alebo doplnkový postup, podľa ktorého môžu byť antigény ďalej skoncentrované/vyčistené, je afinitná chromatografia na imobilizovanom kove. Tento druhý spôsob je výhodnejší ako chromatografia na hydroxyapatite pri čistení pC, lebo sa tak dosiahne lepšie oddelenie od ospA a B.
Výhodou opísaného nedenauračného čistiaceho postupu je to, že zostáva zachovaná 3-D konfigurácia proteínu. Tým sa udržia všetky protilátkové kombinačné miesta na prírodnom proteíne, vrátane tých, ktoré sú zahrnuté v ochrane. Ak je protein denaturovaný, väzobné miesta môžu byť čiastočne alebo úplne zničené. Kapacita antigénu indukovať protilátky na antigénnych miestach bude zodpovedajúcim spôsobom znížená. Takto pozmenené proteíny by teda boli nevhodné na použitie vo vakcínach.
Výhodou uvedeného spôsobu čistenia proti spôsobu s celými bunkami, ako je napríklad spôsob podľa Johnsona (1988) je to, že sa podľa neho získava homogénny protein bez akýchkoľvek toxických zložiek. Tým sa znižuje pravdepodobnosť nepriaznivej reakcie. Pojem homogénny v tejto súvislosti znamená, že aspoň 80 % /hmotnostné diely k objemovým dielom/ proteínu je úplne neporušený pC s takmer všetkými zvyškami, reprezentovanými pC rozkladnými produktami. Takže pokiaľ vôbec sú, sú nečistoty vo forme zložiek média a iných Borrelia proteínov prítomné len v stopových množstvách. Homogénny pC môže pozostávať z viac než jednej sérologickej formy pC.
Týmto spôsobom sa podľa tohto vynálezu umožňuje odstránenie nechcených potenciálne imunogénnych proteínov, ktoré by mohli indukovať autoprotilátky a spôsobovať škodlivé autoimúnne reakcie v imunizovanom cicavcovi. Opísaný spôsob čistenia takisto zaisťuje reprodukovateľnosť všetkých zložiek v priebehu výroby vakcíny. Na základe objavu, že gerbily ako zvierací model sú na účely tohto vynálezu cenné, boli realizované pokusy, ktoré potvrdili, že by bolo možné zdieľať imunitu proti infekcii B. burgdorferi. Tieto pokusy sú diskutované ďalej v príklade
3. I keď boli testované aj ospA, ospB, pC, proteín vonkajšieho povrchu s molekulovou hmotnosťou 63 000, proteíny z kmeňa Orth-1 B. burgdorferi s molekulovou hmotnosťou 21 000 a 94 000, iba proteín pC mal zreteľné známky ochranného účinku.
Antigény, ktoré boli pripravené podľa predchádzajúceho postupu čistenia, sú vhodné na použitie v diagnostických testoch, ako je napríklad detekcia protilátok na B. burgdorferi v telesnej tekutine cicavcov. Napríklad nedenaturovaný, homogénny proteín, pripravený podľa predchádzajúceho spôsobu, môže byť inkubovaný so vzorkou telesnej tekutiny. Detekuje sa tak prítomnosť naviazanej protilátky, pochádzajúcej z takejto inkubácie. Pojem telesná tekutina zahŕňa (ale nie je obmedzený na uvedené) mozgomiešny mok, synoviálnu tekutinu, moč, tekutiny telesných dutín, krv, sérum, semeno a sliny. Také testy, i keď sú odborníkom dobre známe, by boli veľmi zlepšené citlivosťou a špecifičnosťou antigénov, vyčistených podľa tohto vynálezu.
Tento vynález je opísaný podrobnejšie nasledujúcimi príkladmi, ktoré sú uvedené na ilustráciu, a v žiadnom prípade nie sú myslené ako obmedzenie rozsahu tohto vynálezu.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obrázok 1 je fotografia, znázorňujúca výsledky elektroforetickej analýzy antigénov, ktoré boli vyčistené od Orth-1 tu opísanými spôsobmi.
Obrázok 2 je fotografia, znázorňujúca SDS-PAGE buniek B. burgdorferi, inkubovaných trypsínom (pásy 2,6 a 10),proteinázou K (pásy 3,7 a 11) alebo bez proteáz (pásy 1, 5 a 9) v porovnaní s vyčisteným pC proteínom (pásy 4 a 8). Elektroforeticky oddelené proteíny boli charakterizované vyfarbovaním zlatom aurofarbivom (pásy 1 až 4), westemovým blotovanim pC-špecifíckou monoklonálnou protilátkou (Mab35, pásy 5 až 8) a fluorografiou lipoproteinov (palmitová kyselina značená 2 H, pásy 9 až 11).
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
Čistenie proteinov
Príprava membránových frakcií
Bunky Borrelia burgdorferi sa izolujú odstreďovaním (7000 x g) (dvadsať minút, 4 °C). Bunková peleta sa premyje dvakrát PBS s 5 mM chloridom horečnatým. Stanoví sa suchá hmotnosť buniek. Premyté bunky sa resuspendujú v 100 mM pufri Tris-HCl, pH 7,5 (v pomere 1 g buniek na 2 ml pufra). Táto suspenzia sa pridá ku skleneným perličkám (priemer 0,17 až 0,18 mm, 5 g perličiek na 1 g bunkovej pasty) v kovovej kadičke. Tieto bunky sa potom lyžujú trepaním zmesi v bunkovom mlyne VibrogenR (Model VI4, Buhler). Trojminútové cykly trepania s ochladením (na 4 °C) sa opakujú, pokiaľ lýza nie je väčšia ako 99 %, čo sa testuje mikroskopom s tmavým poľom. Lyzát sa potom sfiltruje sintrovým skleneným filtrom, aby sa odstránili sklenené perličky. Zadržané perličky sa premyjú pufrom, aby sa zlepšil výťažok bakteriálnych antigénov vo filtráte.
Tento lyzát sa odstreďuje dvadsať minút pri 7 500 x g pri teplote 4 °C. Získa sa tak surová membránová frakcia (lsp, čo znamená peleta získaná pri nízkej rýchlosti (low speed pellet)).Supematant sa ďalej odstreďuje tridsať minút pri 100 000 x g pri teplote 4 °C. Získa sa tak druhá membránová frakcia (hsp, čo znamená peleta získaná pri vysokej rýchlosti (high speed peliet)). Obe membránové frakcie boli premyté dvakrát v lOOmM pufri Tris-HCl (pH 7,5) za pôvodných podmienok odstreďovania. Ako východiskový materiál na čistenie pC (alebo iných s membránou asociovaných antigénov) by sa mohla použiť ktorákoľvek z membránovývh frakcii. Ale frakcia hsp obsahovala menšie množstvo kontaminujúcich proteinov.
Extrakcia membrán zmáčavým činidlom sa realizuje tak, že sa membrány resuspendujú tak, aby bolo asi 10 mg proteínu v 1 ml pufra Tris-HCl (Ph 7,5), ktoiý obsahuje 1 % (hmotnostné diely k objemovým dielom) zwiteriónového zmáčavého činidla 3-14/Serva/. Po jednohodinovej inkubácii pri 37 °C sa nerozpustný materiál oddelí odstreďovaním (100 000 x g, šesťdesiat minút, 4 °C).
Antigény, ktoré boli rozpustené pomocou zmáčavého činidla, boli frakcionované DEAE chromatografiou za nasledujúcich podmienok: Kolóna: semi-prop kolóna Proteín_PAK DEAE 5PW s priemerom 21,5 mm a dĺžkou 150 mm od firmy Waters, vzorka: 20 ml (4 x 5 ml) antigénového prostriedku, rozpusteného v zmáčavom činidle (10 mg/ml), prietok: 4 ml/min., pufer A: 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 % (hmotnostné diely k objemovým dielom) zwiteriónového činidla 3-14, pufer B: A + IM chlorid sodný, dradient: 0 % B počas 35 minút, 0 až 30 % B počas 90 minút, 30 až 65 % počas 45 minút a 65 až 100 % B počas 10 minút.
Kolóna sa ekvilibruje pufrom A a antigény sa eluujú zvyšujúcimi množstvami chloridu sodného. Na identifikovanie frakcií, ktoré obsahujú žiadaný antigén, sa časti osemmililitrových frakcii vyzrážajú acetónom a pelety sa analyzujú SDS-PAGE a/alebo imunoblotovaním.
Pri chromatografii na hydroxyapatite sa frakcie, obohatené o žiadaný antigén, ako je napríklad pC, spoja a dialyzujú proti pufŕu C predtým, ako sa nanesú na hydroxyapatitovú kolónu. Naviazaný antigén sa eluuje zvyšujúcim sa množstvom fosforečnanových iónov, napríklad pufrom D. Týmto spôsobom sa môžu zahustiť zriedené roztoky antigénu, a následne sa antigén môže oddeliť od znečistením Technický opis tohto pristupuje nasledujúci: kolóna : kolóna Bio-Gel HPHT s priemerom 7,8 mm a dĺžkou 100 mm od firmy Bio-Rad, vzorka: spojené pC, obsahujúce frakcie z predchádzajúceho stupňa (napr. frakcie 20 až 22) po dialýze proti pufru C (4 x 5 ml), prietok: 0,5 ml/min., pufer C: 10 mM MOPS-NaOH (3-N-morfolinopropánsulfónová kyselina), pH=6,8, 1 mM fosforečnan sodný (0,01 mM chlorid vápenatý), 1 % (hmotnostné diely k objemovým dielom) zwiteriónového činidla 3-14, pufer D: pufer C + 400 mM fosforečnan sodný, gradient: 0 % D počas 60 minút, 0 až 100 % D počas 20 minút. Frakcie boli analyzované postupom, ktorý je opísaný pri chromatografii na ionexe.
Pri afinitnej chromatografii na imobilizovanom kove sa frakcie, obohatené o žiadaný antigén, ako sú napríklad pC
SK 279250 Β6 frakcie z delenia chromatografiou na DEAE ionexe, spoja a pH sa upraví pufrom (napr. pri chromatografických frakciách z ionexu, obsahujúcich pC proteín, sa pridá chlorid sodný na koncovú koncentráciu 150 mM). Sfiltrovaný roztok antigénu (0,2 m) sa nanesie na chromatografickú kolónu s imobilizovaným kovom (vopred naplnenú Cu++ podľa opisu výrobcu a ekvilibrovanú pufrom A), premyjú sa pufrom A a naviazaný antigén sa eluuje pufrom B, ktorý obsahuje imidazol. Týmto spôsobom sa môžu zahustiť zriedené roztoky antigénov, a následne sa antigén môže oddeliť od znečistenín. Technický opis tohto postupu pre proteín pC (ako príklad) je nasledujúci: Kolóna: s chelátovanou superosou HR 16/5 s priemerom 16 mm a dĺžke 50 mm od fy Pharmacia/LKB, vzorka: spojené pC, obsahujúce frakcie z chromatografie na DEAE ionomeniči s pridaným chloridom sodným (150 mM), pufer A:20 mM tris/acetát, pH 7,5 (150 mM chlorid sodný) 1 % (hmotnostné diely k objemovým dielom) obojstranne iónového detergentu 3-14, pufer B: 20 mM tris/acetát, pH 7,0 (150 mM chlorid sodný) 1 % (hmotnostne/objemovo) obojstranne iónového detergentu 3-14/50 mM imidazol, prietok: 2 ml/min., gradient: A počas 30 minút, 0 až 100 % B počas 40 minút. Frakcie, ktoré obsahujú pC, sa identifikujú postupom, opísaným pri chromatografii na ionexe.
Príklad 2
Výsledky postupu čistenia
Na obrázku 1 sú charakterizované nasledujúce antigény, ktoré boli pripravené podľa uvedených postupov: proteín s molekulovou hmotnosťou 60 000 (pás 8), proteín s molekulovou hmotnosťou 56 000 (pás 9), proteín s flagelámou štruktúrou (pás 10), ospB (pás 11), ospA (pás 12), pC (pás 13) a proteín s molekulovou hmotnosťou 21 000 (pás 14).
Prvé tri stupne čistenia boli v podstate identické bez ohľadu na to, ktorý proteín bol čistený, i keď je možné podľa potreby realizovať modifikácie, ktoré optimalizujú delenie. Stupeň chromatografie na hydroxyapatite, použitý na čistenie/koncentráciu pC proteínu, je široko aplikovateľný, lebo takmer všetky žiadané proteíny sa viažu na hydroxyapatit v pufri C.
Príklad 3
Štúdie ochrany
Keďže imunita, získaná v priebehu aktívnej infekcie, je zvyčajne vyššia ako imunita získaná očkovaním, bolo skupine desiatich gerbíl intraperitoneálne podané 2.107 virulentných B. burgdorferi, kmeň Orth-1, aby sa ukázalo, že ochranná imunita,získaná očkovaním proti lymskej borelióze, je realistickým cieľom. Táto dávka bola retrospektívne vyhodnotená ako ekvivalent približne tisícnásobku infekčnej dávky, ktorá je potrebná na infikovanie poloviny zvierat. Po troch týždňoch boli zvieratá liečené jeden týždeň antibiotikami, aby sa zbavili infekcie. Ďalších 17 dní boli zvieratá ponechané v pokoji, aby sa eliminovali antibiotiká. Zvieratá potom boli infikované znovu podaním rovnakej dávky, ako je uvedené predtým. Po ďalších dvoch týždňoch boli zvieratá usmrtené. Žlčník, slezina, obličky a srdce boli podrobené kultivácii. Všetky zvieratá boli chránené proti B. burgdorferi, ktorá nebola detekovaná ani v jednej kultúre žiadneho orgánu, hoci tieto kultúry boli pravidelne sledované počas 8 týždňov. Naproti tomu 80 % kontrolných gerbíl, ktorým bola podaná pôvodná imunizačná dávka, bolo infikovaných. Aby bola zaistená porovnateľnosť s testovanými zvieratami, tieto kontrolné skupiny boli tiež liečené antibiotikami. Tým bolo potvrdené, že ochrana študijnej skupiny sa môže pripísať získanej imunite a nie pretrvávaniu antibiotík v tkanivách.
V ďalšej sérii pokusov bola hodnotená potencia antigénov, vyčistených opísanými spôsobmi z B. burgdorferi. Gerbily sa dvakrát intraperitoneálne imunizujú s dvojtýždňovým intervalom medzi imunizáciami 10 m antigénu s hydroxitom hlinitým ako adjuvans. Dva týždne po poslednej imunizácii sa zvieratám intraperitoneálne podá (spoločne s neimunizovanou kontrolnou skupinou) 2.107 virulentnej B. burgdorferi, kmeň Orth-1. Po dvoch týždňoch sa zvieratá zabijú. Žlčník, slezina, obličky a srdce sa kultivujú na prítomnosť spirochét. Kultúry boli pravidelne sledované počas 8 týždňov.
Boli testované ospA, ospB, pC a proteín vonkajšieho povrchu s molekulovou hmotnosťou 63 000, všetky z podaného kmeňa Orth-1. Len zvieratá, imunizované pC proteínom, mali zreteľné znaky ochranného účinku. I keď nebola dokázaná úplná ochrana, infekcia zvierat, imunizovaných pC, bola menej prudká a bolo zasiahnutých menej orgánov. Kultúry srdca a obličiek z imunizovaných zvierat boli negatívne na B. burgdorferi v porovnaní s približne 50 % infekciou pri kontrolnej skupine. Podobne i infikovanosť sleziny, ktorá bola približne 70 %, bola znížená takmer na polovicu. Len pri najcitlivejšom orgáne, žlčníku, nebola pozorovateľná zmena v počte infikovaných kultúr. OspA, ospB a proteín s molekulovou hmotnosťou 63 000 boli úplne neúčinné. Výsledky týchto pokusov sú uvedené v tabuľke I.
| Tabuľka I | |||
| Pokus £. iotuaogén | počet infikovaných gerbíl k počtu testovaných gerbíl | ||
| imunizované | kontrola1 | ||
| 25 | živé baktérie^ | 0/10 | </5 |
| 20 | zabití baktérie; | 6/10 | 10/10 |
| 23 | zabití baktérie^ | 7/a | 10/10 |
| 30 | zabité baktérie3 | «/q | 10/10 |
| 21/27 | 30/30 | ||
| 33 | pC proteín | B/9 | 10/10 |
| 37 | OBpB | 10/10 | 9/9 |
| 38 | osp o mol. hmotn. 63 OOO | 10/10 | 9/9 |
| 41 | ospA | 10/10 | 10/10 |
| 1 | Kontrola alebo neintunizované gerbily | ||
| 2 | Podané živé B. burgdorferi, liečené antibiotikami a znovu | ||
| podané B. burgdorferi | na zistenie ochrany, t.j | . prirodzenej | |
| imunity, 3 Formalínon usmrtení B. <->rr>r»ín/ | burgdorferi / dve 25 ug dávky, počítané |
Nasledujúci pokus bol realizovaný podľa rovnakého, uvedeného protokolu až na to, že podávaná dávka bola znížená na 106 organizmov. Po imunizácii pC preukazuje zreteľnú ochranu. Na rozdiel od pC však neprišlo k žiadnej imunizácii pôsobením ospA, proteínom s molekulovou hmotnosťou 21 000 alebo proteínom s molekulovou hmotnosťou 94 000. Ako je uvedené v tabuľke, všetky gerbily imunizované pC mali ochranný účinok, pričom žiadna z gerbíl, imunizovaná ospA, proteínom s molekulovou hmotnosti 21 000 alebo proteínom s molekulovou hmotnosťou 94 000, nemala prílišnú účinnosť.
SK 279250 Β6
| Tabuľka II | |||
| pokus S | imunogén | počet infikovaných gerbíl k počtu testovaných gerbíl | |
| imunizcvané | kontrola1 | ||
| 46 | pC proteín proteín o nolek. lua. 94 000 | 0/10 B/9 | 9/10 |
| 47 | ospA proteín a aolek. hm. 21 000 | 10/10 10/10 | 10/10 |
| 1 Kontrola alebo neimunizované gerbily |
Príklad 4
Charakteristika pC proteínu ako lipoproteínu
B. burgdorferi, ktorá vyrástla v prítomnosti ^H-palmitovej kyseliny, inkorporuje túto rádioaktívne značenú mastnú kyselinu do svojich lipoproteínov. Tieto rádioaktívne označené lipoproteíny sa oddelia SDS-PAGE lektroforézou a identifikujú sa fluorografiou. Jeden takýto lipoproteín, identifikovaný z kmeňa Orth-1, má zdanlivo rovnakú molekulovú hmotnosť (asi 24 000) ako pC proteín z tohto kmeňa. V prípade, že sa ^H-palmitovou kyselinou rádioaktívne označené celé bunky B. burgdorferi Orth-1 nechajú zreagovať s trypsínom a potom sa anlyzujú SDS-PAGE, je vidieť charakteristický dvojitý pás, zodpovedajúci čiastočne rozštiepenému pC proteínu. Westemove blotovanie tohto materiálu potvrdilo, že tieto pásy skutočne zodpovedajú pC proteínu. Tento dublet, ktorý je diagnostický pre pC proteín, bol detekovaný tiež fluorografiou materiálu, ktorý bol ponechaný reagovať s trypsínom. Analogický pokus, používajúci proteinázu K, ktorá podstatne znižuje množstvo na bunku asociovaného pC proteínu, vedie takmer k úplnej strate lipoproteínu s molekulovou hmotnosťou 24 000. Tieto dáta, ako ukazuje obrázok 2, potvrdzujú, že pC proteín je lipoproteín.
Rádioaktívne značené B. burgdorferi bunky: B. burgdorferi Orth-l bunky (3,5 ml kultúry obsahujúcej 1,6.10^ buniek na mililiter) boli ponechané rásť v médiu BSK, doplnenom o rádioaktívnu kyselinu palmitovú (70 ul^H-palmitovej kyseliny, 55 Ci/mmol, 1 mCi/ml) 48 hodín pri 33 °C, potom boli premyté dvakrát pufrom PBS/5 mM chloridom horečnatým. Každý podiel bol suspendovaný v 190 ul pufru PBS/chlorid horečnatý.
Proteolytícké štiepenie: Do 190 ul bunkovej suspenzie sa pridá 10 ul buď PBS/chlorid horečnatý (kontrola), 62,5 ug trypsínu v 1 mM kyseline chlorovodíkovej alebo 62,5 ug proteinázy K vo vode. Tieto vzorky sa inkubujú trepaním 50 minút pri teplote 25 °C (proteináza K) alebo 100 minút, následne sa pridajú 2 mikrolitre PMSF (50 mg fenylmetylsulfonylfluoridu na 1 ml etanolu). Bunky sa peletujú (10 minút pri 8 000 x g) a dvakrát sa premyjú 500 ul PBS/5mM chlorid horečnatý/0,5 mg/ml PMSF. Odstránia sa tak rozštiepené produkty.
Analýza vzoriek: SDS-PAGE a Westemovo blotovanie sa realizujú štandardnými spôsobmi. Gély pre flurografíu sa inkubujú jednu hodinu v EN^HANCE (NEN), premývajú sa 30 minút vodou, sušia sa dve hodiny pri 65 °C, a exponujú sa pri -80 °C na Hyperfilm MP(Amersham).
Príklad 5
Expresia rekombinantného génu
DNA sa extrahuje z B. burgdorferi Orth-1, čiastočne sa rozštiepi pôsobením Sau 3A, rozdelí sa podľa veľkosti a klonuje sa do miesta Bam Hl plazmidu pUC18. Testovanie (vyhľadávanie, screening) sa realizuje oligonukleotidovou hybridizačnou sondou. Detekovaný gén sa sekvenuje.
Pred klonovaním do expresného vektora sa pC gén amplifikuje PCR. Ako PCR priméry sa uvádzajú: Primár 1, zodpovedajúci počiatku pC otvorenej čítacej fázy (počiatočný kodón je podčiarknutý): 5'ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCGATATTA 3'. Primér 2, zodpovedajúci koncu pC otvorenej čítacej fázy (stop kodón je podčiarknutý):
PCR reakcia bola realizovaná podľa inštrukcií výrobcu s použitím VentR DNA polymerázy (New England Biolabs).Priméry boli anelované s templátovou DNA (rekombinantný plazmid pUC18 s DNA fragmentom odvodeným od B. burgdorferi obsahujúcom gén spolu s obklopujúcou DNA) pri 57 DC, a predĺžené pri 74 °C. Bolo urealizovaných spolu 25 cyklov, každý 1 minútu. Potom sa vzorka zahrieva 5 minút na teplotu 50 °C.
Potom sa zrealizuje expresia pC proteínu vo forme napojenia s MBP (maltose binding protein), komerčne dostupným expresným systémom (New England Biolabs).
Skonštruovanie napojených plazmidov sa realizuje nasledujúcim spôsobom: PCR amplifikovaný gén pC sa vloží po smere vlákna mal E na expresných vektorových plazmidoch pMAL-p2 a pMAL-c2 (100 ng plazmidovej DNA sa rozštiepi reštrikčným enzýmom Xmnl a liguje sa s 20 ng PCR produktu, t.j. pC génom). Ligovaná DNA sa transformuje do alfa-komplementámeho E. coli hostiteľa (napr. TB1 alebo DH5alfa). Na LB agare, obsahujúcom ampicilín a X-gel sa vyberú klony, ktoré obsahujú pC gén. Inzercia pC génu do klonovacieho vektora, ktorý prepožičiava rezistenciu na ampicilín, preruší spojenie male-laxZalfa. Výsledkom je zmena fenotypu kolóny (modrá na bielu) za zvolených testovacích podmienok. Konštrukcia s pC génom so správnou orientáciou vzhľadom na tac promótor vektora vedie k expresii napojeného proteínu pC-MBP. To bolo potvrdené Westemovým blotovaním monoklonálnymi protilátkami, ktoré sú špecifické na pC. Napojený proteín pC-MBP bol produkovaný tak so signálnym peptidom (pMAL-p2), ktorý usmerňuje napojený proteín do periplazmy, ako bez signálnej sekvencie, kedy napojený proteín zostáva v cytoplazme (pMAL-c2). Cytoplazmová expresia bola vyššia ako periplazmová expresia, ktorá však bola potenciálne výhodná, lebo poskytovala rozpustný produkt.
Rekombinantný pC sa čistí tak, že sa podľa pokynov výrobcu pripravia surové extrakty, ktoré obsahujú pC-MBP expresiou v periplazme a cytoplazme. Napojený proteín sa vyčistí afinitnou chromatografiou vplyvom špecifického naviazania MBP na amylózovú afinitnú živicu. Z napojeného proteínu pC-MBP sa odštiepi MBP časť. Získa sa tak úplný pC proteín, pretože napojený proteín obsahuje jediné rozpoznávacie miesto pre proteázový faktor Xa, priľahlý k počiatku sekvencie aminokyselín pc. MBP časť, uvoľnená v tomto postupe spolu s akýmkoľvek neodštiepeným napojeným proteínom sa odstráni prechodom cez amylázovú živicu (MBP sa viaže, ale pC nie). Je možné použiť aj iné spôsoby, o ktorých je známe, že sú vhodné na čistenie pC, napr. chromatograflu na ionexe, chromatograflu na hydroxyapatite, afinitnú chromatograflu na imobilizovanom kove.
pC proteín, získaný podľa tohto spôsobu, je úplný. Použitím príslušných primérov sa však môžu pripravovať skrátené formy pC proteínu (napr. bez leader sekvencie).
Claims (9)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Vakcína s obsahom proteínu pC na prevenciu alebo liečenie lymskej boreliózy, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje (a) materiál vybraný zo skupiny zahrňujúcej aspoň jednu sérologickú formu proteínu pC z Borrelia burgdorferi v homogénnej forme, variantu pC a imitácie pC, obe vyvolávajúce produkciu ochranných protilátok, (b) fyziologicky prijateľný excipient a (c) adjuvans, pričom uvedený materiál je obsiahnutý v množstve účinne chrániacom vnímavých cicavcov, 1 až 100 pg v jednej dávke, najmä však 10 až 50 pg v jednej dávke .
- 2. Vakcína podľa nároku 1, vyznačujúca sa t ý m , že obsahuje aspoň jeden ne-pC antigén B. burgdorferi.
- 3. Vakcína podľa nároku 1, vyznačujúca sa t ý m , že ako adjuvans obsahuje hydroxid hlinitý.
- 4. Vakcína podľa nároku 1, vyznačujúca sa t ý m , že vnímavým cicavcom je človek.
- 5. Spôsob čistenia proteínu B. burgdorferi, vyznačujúci sa t ý m , že sa (a) bunky B. burgdorferi rozbijú a potom frakcionujú na membránovú zložku a cytoplazmovú zložku, (b) membránová zložka sa resuspenduje v nedenaturujúcom detergente za získania rozpustného proteínu a nerozpusteného materiálu, načo sa rozpustený proteín oddelí od nerozpusteného materiálu, (c) rozpustený proteín sa chromatografúje na ionexe, (d) proteínové frakcie sa spoja a (e) podrobia antigénovej skúške.
- 6. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa t ý m , že po stupni (e) sa spojené proteínové frakcie ďalej chromatografujú na hydroxyapatite za skoncentrovania a ich ďalšieho vyčistenia.
- 7. Spôsob podľa nároku 5, vyznačujúci sa tým, že ako proteín sa čistí proteín pC.
- 8. Diagnostické činidlo na detekciu protilátok B. burgdorferi vo vzorke, najmä ľudskej telovej tekutiny, vyznačujúce sa tým, že obsahuje proteín B. burgdorferi získaný podľa nároku 5.
- 9. Spôsob detekcie prítomnosti protilátok B. burgdorferi vo vzorke telovej tekutiny, vyznačujúci sa t ý m , ž e sa vzorka telovej tekutiny inkubuje s diagnostickým činidlom podľa nároku 8 a stanoví sa prítomnosť viazanej protilátky vyplavenej z inkubácie.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US72724591A | 1991-07-11 | 1991-07-11 | |
| US82416192A | 1992-01-22 | 1992-01-22 | |
| US07/903,580 US6221363B1 (en) | 1991-07-11 | 1992-06-25 | Vaccine for the prevention of lyme disease |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK279250B6 true SK279250B6 (sk) | 1998-08-05 |
| SK217292A3 SK217292A3 (en) | 1998-08-05 |
Family
ID=27419096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK2172-92A SK217292A3 (en) | 1991-07-11 | 1992-07-10 | Vaccine containing a pc protein useful in prevention of lyme disease, method of b.burgdorferi protein purification, diagnostic agent detecting b.burgdorferi antigens and method of detecting b.burgdorferi antigenes in humoralis |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6221363B1 (sk) |
| EP (1) | EP0522560B2 (sk) |
| JP (1) | JP2611095B2 (sk) |
| AT (1) | ATE198489T1 (sk) |
| AU (1) | AU660178B2 (sk) |
| CA (1) | CA2073486C (sk) |
| CZ (1) | CZ280743B6 (sk) |
| DE (1) | DE69231619T3 (sk) |
| DK (1) | DK0522560T4 (sk) |
| ES (1) | ES2154633T3 (sk) |
| FI (1) | FI107334B (sk) |
| HR (1) | HRP950174B1 (sk) |
| HU (1) | HU219772B (sk) |
| MX (1) | MX9204078A (sk) |
| NO (1) | NO304546B1 (sk) |
| SI (1) | SI9200143B (sk) |
| SK (1) | SK217292A3 (sk) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6872550B1 (en) * | 1991-07-11 | 2005-03-29 | Baxter Vaccine Ag | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens |
| US6303129B1 (en) * | 1992-07-28 | 2001-10-16 | Rx Technologies | Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use |
| CZ289212B6 (cs) * | 1993-04-29 | 2001-12-12 | Baxter Aktiengesellschaft | Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění, sekvence rekombinantní DNA, OspC antigen, pouľití kombinace antigenů a způsob rekombinantní výroby OspC antigenu |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US6248562B1 (en) | 1993-11-01 | 2001-06-19 | Research Foundation State University Of New York | Chimeric proteins comprising borrelia polypeptides and uses therefor |
| CA2187535C (en) | 1994-04-11 | 2011-09-13 | Jon B. Korshus | Borrelia burgdorferi bacterin |
| US6087097A (en) * | 1994-05-12 | 2000-07-11 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | PCR detection of Borrelia burgdorferi |
| ZA964896B (en) * | 1995-06-07 | 1997-01-08 | Connaught Lab | Expression of lipoproteins |
| EP0851873A2 (en) * | 1995-09-22 | 1998-07-08 | Aventis Pasteur Limited | Parainfluenza virus glycoproteins and vaccines |
| EP0880543A4 (en) * | 1995-10-26 | 2000-08-02 | Rhode Island Education | ANTIGENS AS VACCINE CANDIDATES FROM SPIROCHETE (BORRELIA BURGDORFERI) OF LIVE DISEASE INDUCED BY A SALT OF A TICK VECTOR (IXODES SCAPULARIS) |
| US6045804A (en) * | 1996-03-07 | 2000-04-04 | Mayo Foundation For Medical Educational Research | Method for detecting B. burgdorferi infection |
| US6716574B2 (en) | 1996-05-02 | 2004-04-06 | Dako A/S | Osp-C derived peptide fragments |
| US6969520B2 (en) * | 1997-10-20 | 2005-11-29 | Acambis Inc. | Active immunization against clostridium difficile disease |
| GB9811219D0 (en) * | 1998-05-26 | 1998-07-22 | Smithkline Beecham Biolog | Novel process |
| CA2365424A1 (en) * | 1999-04-21 | 2000-10-26 | Boston Medical Center Corporation | Prevention, diagnosis and treatment of lyme disease |
| ATE340262T1 (de) | 1999-06-18 | 2006-10-15 | Univ New York State Res Found | Gruppen von borrelia burgdorferi, die lyme krankheit verursachen |
| WO2002016421A2 (en) | 2000-08-18 | 2002-02-28 | Research Foundation Of The State University Of New York | Altered ospa of borrelia burgdorferi |
| US8277852B2 (en) * | 2002-01-25 | 2012-10-02 | Akzo Nobel Surface Chemistry Llc | Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production |
| US7442391B2 (en) | 2002-01-25 | 2008-10-28 | Integrated Botanical Technologies, Llc | Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production |
| KR101224697B1 (ko) * | 2004-01-12 | 2013-01-21 | 인테그레이티드 보태니컬 테크놀러지스, 엘엘씨 | 테아세아 식물로부터의 생물활성 조성물 및 이들의 생산방법 및 용도 |
| KR20080091233A (ko) | 2006-01-19 | 2008-10-09 | 도요 세이칸 가부시키가이샤 | 커플러 및 연료 전지용의 연료 카트리지 |
| KR101192127B1 (ko) | 2006-11-03 | 2012-10-17 | 쉐링-프라우 리미티드 | 개 라임병 백신 |
| CN101616930B (zh) * | 2007-02-22 | 2013-05-08 | 巴克斯特国际公司 | 疏水性蛋白质的纯化方法 |
| EP2274616A1 (en) * | 2008-04-22 | 2011-01-19 | The Research Foundation of State University of New York | Borrelia burgdorferi cell envelope protein array |
| JP2013511530A (ja) * | 2009-11-17 | 2013-04-04 | アバクシス， インコーポレイテッド | ライム病抗体の検出のためのペプチドおよび方法 |
| ES2742823T3 (es) | 2011-04-22 | 2020-02-17 | Wyeth Llc | Composiciones relacionadas con una toxina mutante de Clostridium difficile y sus procedimientos |
| US8758772B2 (en) | 2011-11-04 | 2014-06-24 | Abaxis, Inc. | Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies |
| BR122016023101B1 (pt) | 2012-10-21 | 2022-03-22 | Pfizer Inc | Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile |
| KR102451333B1 (ko) * | 2018-10-22 | 2022-10-06 | 주식회사 엘지화학 | 마이크로비드 및 그 제조방법 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK590288D0 (da) * | 1988-10-24 | 1988-10-24 | Symbicom Ab | Kemiske forbindelser |
| US4603112A (en) * | 1981-12-24 | 1986-07-29 | Health Research, Incorporated | Modified vaccinia virus |
| US4767622A (en) * | 1983-08-19 | 1988-08-30 | University Of Illinois | Method and materials for development of immunological responses protective against malarial infection |
| US4601903A (en) * | 1985-05-01 | 1986-07-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease |
| US4888276A (en) | 1986-06-26 | 1989-12-19 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Method and composition for the diagnosis of Lyme disease |
| US4721617A (en) | 1986-08-14 | 1988-01-26 | Regents Of The University Of Minnesota | Vaccine against lyme disease |
| US5192540A (en) * | 1988-04-19 | 1993-03-09 | American Cyanamid Company | Haemophilus influenzae type b oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine |
| DE3818013A1 (de) | 1988-05-27 | 1989-11-30 | Henkel Kgaa | Gewebeweichmachungsmittel |
| IT1223777B (it) * | 1988-08-18 | 1990-09-29 | Gevipi Ag | Rubinetto a due uscite con inversore a depressione |
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| AU7058691A (en) * | 1989-12-22 | 1991-07-24 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh | Immunologically active proteines from borrelia burgdorferi, related test kits and vaccine |
| DE3942728C1 (en) | 1989-12-22 | 1991-05-23 | Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh, 8000 Muenchen, De | New immunologically active proteins derived from Borelia burgdorferiensity polyethylene vessel and a high density polyethylene sealing cap - useful as vaccine and for quick accurate diagnosis of Borelia infections |
| DE69122240T2 (de) | 1990-03-05 | 1997-02-13 | Us Health | Antigen-wirkende proteine von borrelia burgdorferi |
| DE69132417T2 (de) * | 1990-07-06 | 2001-05-23 | American Home Prod | Impfstoff gegen die Lyme-Krankheit |
-
1992
- 1992-06-25 US US07/903,580 patent/US6221363B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-01 AU AU19349/92A patent/AU660178B2/en not_active Ceased
- 1992-07-08 CA CA002073486A patent/CA2073486C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-09 DK DK92111713T patent/DK0522560T4/da active
- 1992-07-09 AT AT92111713T patent/ATE198489T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 FI FI923175A patent/FI107334B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-07-09 EP EP92111713A patent/EP0522560B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 ES ES92111713T patent/ES2154633T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-07-09 DE DE69231619T patent/DE69231619T3/de not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-10 NO NO922746A patent/NO304546B1/no not_active IP Right Cessation
- 1992-07-10 SI SI9200143A patent/SI9200143B/sl not_active IP Right Cessation
- 1992-07-10 MX MX9204078A patent/MX9204078A/es unknown
- 1992-07-10 JP JP4207392A patent/JP2611095B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-07-10 HU HU9202289A patent/HU219772B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-07-10 CZ CS922172A patent/CZ280743B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1992-07-10 SK SK2172-92A patent/SK217292A3/sk unknown
-
1993
- 1993-03-12 US US08/031,295 patent/US5530103A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-03-30 HR HR950174A patent/HRP950174B1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SK279250B6 (sk) | Vakcína s obsahom proteínu pc na prevenciu lymskej | |
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| HU212716B (en) | Method for the preparation of vaccine against lyme disease | |
| US5656451A (en) | OspE, OspF, and S1 polypeptides in borrelia burgdorferi | |
| EP1012181B1 (en) | Surface antigens and proteins useful in compositions for the diagnosis and prevention of lyme disease | |
| CZ289212B6 (cs) | Imunogenní prostředek proti lymskému onemocnění, sekvence rekombinantní DNA, OspC antigen, pouľití kombinace antigenů a způsob rekombinantní výroby OspC antigenu | |
| AU644829B2 (en) | Recombinant vaccine for porcine pleuropneumonia | |
| US6610301B1 (en) | Immunologically active proteins from Borrelia burgdorferi, nucleic acids which encode them, and their use in test kits and as vaccines | |
| Moses et al. | A multiple site‐specific DNA‐inversion model for the control of Ompi phase and antigenic variation in Dichelobacter nodosus | |
| Champion et al. | Sequence analysis and recombinant expression of a 28-kilodalton Treponema pallidum subsp. pallidum rare outer membrane protein (Tromp2) | |
| ES2203704T3 (es) | Proteinas de membrana de leptospira. | |
| RU2102081C1 (ru) | Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi | |
| US6716591B1 (en) | B. burgdorferi polypeptides | |
| JP2000510339A (ja) | インビボで発現されるＢ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉポリペプチド | |
| US20020039586A1 (en) | Novel borrelia burgdorferi polypeptides and uses thereof | |
| against Infection | Active and Passive Immunity against |