NO304546B1 - Preparat omfattende et immunogen i form av B. burgdorferi-pC-polypeptider, for immunisering av et pattedyr mot Lymeborreliose, samt anvendelse av preparat for fremstilling av et farmas°ytisk preparat for behandling av Lyme-borreliose - Google Patents

Description

Oppfinnelsens bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse gjelder et preparat som omfatter et i det vesentlige rent immunogen fra gruppen av én eller flere ikke-denaturerte serologiske fomrer av B. burgdorferi- pC-polypeptid med i det vesentlige nativ konfigurasjon, i en mengde som er effektiv til å frembringe en immunrespons hos et mottagelig pattedyr og som immuniserer pattedyret mot Lyme borreliose.

Uttrykkene "Lyme-sykdom" og "Lyme-borreliose" er fellesbetegnelser på middoverførte infeksjoner forårsaket av spiroketen Borrelia burqdorferi. som representerer den vanligste middoverførte sykdom både i De forente stater og i Europa. Lyme-sykdom ligner på syfilis fordi den påvirker mange organer, vanligvis hud, nervesystem, hjerte og ledd, og fordi den utvikler seg i stadier og kan bli kronisk.

Da Lyme-sykdom kan forveksles med andre sykdommer, eksisterer et behov for nøyaktige diagnostiske hjelpemidler, særlig i vanskelige tilfeller hvor det kliniske bilde er ufullstendig. Det er også behov for fremgangsmåter for behandling eller forebyggelse av sykdommen. Antibiotikaterapi kan være effektiv dersom den startes kort etter infeksjonen, men langvarig behandling med høye doser er nødvendig dersom sykdommen først har utviklet seg. Videre er antibiotikaterapi ikke alltid effektiv, se Preac Mursic et al., Infection 18: 332-341 (1990). Følgelig er det ønskelig med en vaksine som forhindrer Lyme-sykdom.

Flere antigener fra B. burqdorferi er kjent. To hovedproteiner fra overflaten av B. bur<q>dorferi. ospA (31 kd) og ospB (34 kd), diskuteres av Barbour, Clin. Microbiol. Revs. 1: 399-414 (1988). ospA foreligger i de fleste stammer, men er heterogent, dvs. at ospA-proteiner fra forskjellige stammer kan være forskjellige med hensyn til molekylvekt og serologisk reaktivitet.

ospB er mindre vidspredt blant stammer enn ospA, men finnes i likhet med ospA i forskjellige serologiske former og molekylvekt former. Genene for ospA og ospB, som kodes av plasmid, er blitt klonet, sekvensert og uttrykt i E. coli, se Barbour et al., Rev. Inf. Dis. 11 (6): S1470-74 (1989), og BergstrOm et al., Mol. Microbiol. 3: 479-86 (1989).

pC-proteinet (24 kd) fra B. burqdorferi ligner i noen henseender på ospA og -B. Også dette er et lipoprotein som viser molekylvekt- og serologisk heterogenitet, og som er eksponert på celleoverflaten. (Det er tilgjengelig på celleoverflaten for binding av agglutinerende antistoff, og celleassosiert pC er ømfintlig for kløyving av proteaser.) Stammer som uttrykker pC-protein, er vanlige i Europa. Mellom 40 % og 50 % av de 28 europeiske isolater som ble analysert av Wilske et al., N.Y. Acad. Sei. 539: 126-43 (1988), var positive med henblikk på pC-proteinet, selv om dette kan være en under-

vurdering da pC-ekspresjon er gjenstand for fluktuasjoner.

Andre B. bur<q>dorferi-anti<q>ener omfatter overflateproteinet funnet i 60 kd-området, Barbour et al., supra; det strukturelle flagellprotein i 41 kd-området, Gassmann et al., Nucleic Acids Res. 17: 3590 (1989); proteinet i 39 kd-området, Simpson et al., J. Clin. Micro. 28: 1329-37 (1990); og et protein på tilnærmet 94 kd, Fuchs et al., Fourth International Conference on Lyme-Borreliosis (1990).

I denne sammenheng har en rekke rensemetoder blitt benyttet for fremstilling av antigener for videre undersøkelser og karakterisering. Wilske et al., Zbl. Bakt. Hyg. 263: 92-102

(1986), utsatte f.eks. intakte Borreliae for en SDS-PAGE-behandling hvor proteinene ble denaturert med varme og behandling med detergenten natriumdodecylsulfat (SDS) og 2-merkaptoetanol. Hansen et al., J. Clin. Microbiol. 26 (2): 338-46 (1988), beskrev rensing av B. burqdorferi-flaqeller. Internasjonal patentsøknad nr. 90/04411 av Bergstrom et al. beskriver en ikke-denaturerende fremgangsmåte for delvis rensing av fraksjoner fra Borrelia burqdorferi.

Undersøkelser har også konsentrert seg om fremstilling og karakterisering av forskjellige antigener med henblikk på utvikling av diagnostiske analyser. En diagnostisk fremgangsmåte for indirekte påvisning av B. bur<q>dorferi ved analyse av spesifikk antistoffproduksjon som svar på infeksjon er således beskrevet i den tidligere nevnte søknad fra Bergstrom et al. og i US patentsøknad, serienummer 07/487.716 (Simpson & Schwan)

(publisert 18. juli 1990).

Coleman et al., J. Infect. Dis. 155: 756-65 (1987), beskriver også fremstilling av B. bur<q>dorferi-fraksioner ved behandling av intakte spiroketer med denaturerende SDS-detergent for således å erholde en protoplasmisk sylinder(bakterien med fjernet proteinkappe)fraksjon som etter videre behandling kan benyttes som et antigen.

Wilske et al., Fourth International Conference on Lyme Borreliosis (1990), beskriver identifikasjonen av immunodominante Borreliae-proteiner som sies å være anvendbare for diagnose av Lyme-borreliose. Disse forskere konkluderer med at to proteiner, pC og plOO, kan være spesielt viktige ved at de tilveiebringer en indikasjon på henholdsvis de tidlige og sene stadier av sykdommen.

Selv om en rekke antigener er kjent, kan effektiv beskyttende evne ikke forutsis fra et antigens evne til å utløse en immunrespons i løpet av en naturlig eller eksperimentell j-nfeksjon. For eksempel utløser flagellproteinet på 41 kd en immunrespons som ikke er beskyttende, se Simon et al., Immunology Today 12: 11-16 (1991). Tilsvarende gir heller ikke 94 kd-proteinet beskyttelse, som beskrevet nedenfor i eksempel 3. Søkerne har faktisk funnet at antigener som beskytter, er relativt sjeldne. Følgelig vil en stor del av immunresponsen være rettet mot antigener som ikke er relevante for beskyttelse. Tilsvarende kan noen mulig beskyttende antigener unnlate å utløse en adekvat immunrespons. Følgelig kan nytteverdi som bestanddel i en vaksine ikke utledes fra et antigens evne til å utløse en antistoffrespons.

Det er følgelig et behov for fortsatt forskning ved-rørende utvikling av en egnet vaksine mot Lyme-borreliose. I denne sammenheng er US patentskrift nr. 4.721.617 (Johnson), som beskriver en vaksine mot Lyme-borreliose som består av intakte B. bur<q>dorferi-celler inaktivert ved frysetørking, av interesse. Basert på gjenvinning av patogenet fra nyre eller milt viser Johnson en doseavhengig reduksjon i immuniserte hamsteres følsomhet overfor infeksjon av en virulent B. burqdorf er i-st amme. Effekten var imidlertid kortvarig, og dyr infisert 90 dager etter vaksinasjonen var ufullstendig beskyttet.

Europeisk patentsøknad nr. 418827 (Simon et al.) beskriver en vaksine mot B. burqdorferi, særlig stamme B31 eller ZS7, som består av monoklonale antistoffer som gjenkjenner ospA-proteinet på 31 kd. Ifølge den tidligere nevnte europeiske søknad fra Simon et al. hemmer passiv immunisering av SCID-mus med disse antistoffer utvikling av Borrelia-induserte symptomer.

(Beskyttelse defineres med hensyn til motstandsdyktighet mot infeksjon og utvikling av artritt.) Den europeiske søknad beskriver også ekspresjon i E. coli av et rekombinant Ø-galak-tosidase-/ospA-fusjonsprotein. De monoklonale antistoffer som beskrives, fremskaffes ved immunisering med intakte bak-terieceller eller med de rekombinante, antigene proteiner.

Fikrig et al., Science 250: 553-56 (1990), dokumenterer passiv beskyttelse av mus (C3H/HeJ) med polyklonale sera mot døde B. burqdorferi eller mot E. coli som uttrykker ospA, eller med et ospA-spesifikt monoklonalt antistoff. Disse forskere viser også at mus ble aktivt beskyttet ved immunisering med et renset, rekombinant ospA-/glutation S-transferasefusjonsprotein. Beskyttelse ble målt med henblikk på immunogenets evne til å forhindre infeksjon eller til å motvirke sykdommens his-topatologiske uttrykk.

Bergstrom et al. (WO 90/04411) foreslår også mulig bruk av immunogenisk aktive B. bur<q>dorferi-fraksioner i vaksiner. Det gis imidlertid ingen data som viser verken immunogenisiteten eller den beskyttende evne til disse beskrevne fraksjoner.

Oppsummering av oppfinnelsen

Det er følgelig et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe et preparat som er en effektiv vaksine mot Lyme-sykdom hos pattedyr, hvor det gjøres bruk av en ikke-denaturerende fremgangsmåte for rensing av B. burgdorferi-proteiner.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en anvendelse av preparatet for fremstilling av et farmasøytisk preparat.

For å oppnå disse formål er det tilveiebragt et preparat som er kjennetegnet ved at det omfatter a) et i det vesentlige rent immunogen fra gruppen av én eller flere ikke-denaturerte serologiske forner av B. burqdorferi-pC-polypeptid med i det vesentlige nativ konfigurasjon, i en mengde som er effektiv til å frembringe en immunrespons hos et mottagelig pattedyr og som immuniserer pattedyret mot Lyme borreliose, hvori mengden er i området fra 1 til 100 ug pr. immunogen pr. dose, og b) et

hjelpestoff.

Videre er det tilveiebragt en anvendelse av et preparat ifølge ethvert av kravene 1 til 9 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av et pattedyr mot Lyme-borreliose.

Kort beskrivelse av figurene

Figur 1 er et fotografi som viser resultatene av elektroforetisk analyse av antigener renset fra Orth-1 ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet her. Figur 2 er et fotografi som viser SDS-PAGE av B. burgdorferi-celler inkubert med trypsin (sporene 2, 6 og 10), proteinase K (sporene 3, 7 og 11) eller uten proteaser (sporene 1, 5 og 9) sammenlignet med det rensede pC-protein (sporene 4 og 8). De elektroforetisk separerte proteiner blekarakterisert vedgullfarging med aurodye (sporene 1-4), ved western blotting med et pC-spesifikt monoklonalt antistoff (Mab35, sporene 5-8) og ved fluorografi for lipoproteiner (<3>H-palmitinsyremerking, sporene 9-11).

Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelser

Selv om flere forskjellige B. burgdorferi-antigener er identifisert ogkarakteriserti varierende grad, er pC-protein inntil nå ikke blitt oppfattet som et beskyttende middel mot Lyme-sykdom. En viktig side ved denne oppdagelse var erkjennelsen av at det for optimal beskyttende evne ville være nødvendig å bibeholde pC-proteinet i en konf ormas jon så nær opp til den opprinnelige som mulig. En ny fremgangsmåte for fremstilling av homogent pC-protein som lar proteinets native konfigurasjon være i det vesentlige upåvirket, er derfor blitt utviklet, noe som tillater bruk av pC som immunogen mot Lyme-borreliose. Denne ikke-denaturerende rensefremgangsmåte kan anvendes for fremstilling av Borrelia-antigener for anvendelse i påvisning av Lyme-sykdom .

Den beskyttende virkning av ikke-denaturert pC-protein kan lett demonstreres i ørkenrotten, som inntil nå ikke er blitt ansett som en overlegen dyremodell for estimering av effek-tiviteten av et gitt antigen, f.eks. pC, for fremkalling av beskyttende antistoffer mot Lyme-sykdom. Ikke desto mindre har det vist seg at ørkenrotten er spesielt velegnet for slike evalueringer, delvis fordi borreliose hos ørkenrotter i mange viktige henseender ligner sykdommen hos mennesker. Således gjelder både for ørkenrotter og mennesker: (1) infeksjonen er multisystemisk og påvirker en rekke organer, som hud, ledd, nervesystem, milt, hjerte, blære og nyre, (2) sykdommen kan være kronisk. B. burgdorferi er blitt gjenvunnet fra ørkenrotter mer enn 1 år etter infeksjonen, (3) en oppsvulming av leddene som minner om artritt kan utvikles hos ørkenrotter som hos mennesker, (4) en omtrent lik humoral immunrespons når det gjelder spesifisitet og temporær utvikling av responsen. Det er f.eks. blitt oppdaget at infiserte ørkenrotter og mennesker gir små eller ingen immunologiske responser på ospA- og ospB-proteiner. I motsetning til hos mus er faktisk ospA- og ospB-antistoffer hos ørkenrotter og mennesker sjeldne.

Vaksine

Én utførelse av foreliggende oppfinnelse gjelder en vaksine mot Lyme-borreliose hvor immunogenet omfatter pC-proteinet fra B. bur<g>dorferi. pC-proteinet er et celleoverflate-antigen, som vist ved den proteolytiske kløyving av proteinet fra intakte B. burgdorferi-celler. Det karakteriseres videre ved en molekylvekt på tilnærmet 24 kd, selv om pC fra forskjellige stammer kan vise molekylvekt- og serologisk heterogenitet. Ved bruk av konvensjonell hybridommetodologi er 11 monoklonale antistoffer ( B. burgdorferi monoklonale anti-

stoffer 22, 28, 29, 34-39, 42 og 45) som bindes til pC fra B. bur<g>dorferi-stamme Orth-1 og en rekke andre stammer, blitt fremstilt.

I tillegg er den fullstendige DNA-sekvens og avledede aminosyresekvens for pC-proteinet fra B. burgdorferi benyttet i beskyttelsesundersøkelser som følger:

pC-proteinet som anvendes i preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte en blanding av forskjellige serologiske former av det naturlig forekommende pC-protein.

For bruk til rekombinant ekspresjon av pC vil et polynukleotidmolekyl som koder for et slikt molekyl, fortrinnsvis omfatte en nukleotidsekvens som tilsvarer den ønskede aminosyresekvens, og som er optimalisert for den valgte vert når det gjelder kodonbruk, translasjonsinitiering og ekspresjon av kommersielt anvendbare mengder av pC eller en ønsket pC-variant. Videre bør vektoren valgt for transformasjon av den valgte vertsorganisme med et slikt polynukleotidmolekyl tillate effektiv bibeholdelse og transskripsjon av sekvensen som koder for polypeptidet. Det kodende polynukleotidmolekyl kan kode for et kimært protein, dvs. det kan ha en nukleotidsekvens som koder for en immunologisk del av pC-molekylet operasjonelt knyttet til en kodende sekvens for en ikke-pC-rest, f.eks. et signalpeptid hos vertscellen.

For å isolere et DNA-fragment som koder for et pC-molekyl, kan total-DNA fra B. burqdorferi fremstilles ifølge publiserte fremgangsmåter, se f.eks. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, N.Y. 1982); Baess, Acta Pathol. Microbiol. Scand. (Sect. B) 82: 780-84 (1974). DNA erholdt på denne måte kan kuttes delvis med et restriksjonsenzym, slik at et mer eller mindre tilfeldig utvalg av genomiske fragmenter erholdes; et enzym med et tetranukleotidgjenkjenningssete, f.eks. Sau3A (Mi>oI), er egnet for dette formål. Fragmentene fra en slik delvis kutting kan så størrelsesfraksjoneres, f.eks. ved sukrosegradientsentrifugering (seManiatis, supra), eller ved pulsfeltgelelektroforese (se Anad, Trends in Genetics, november 1986, s. 278-83) for å tilveiebringe fragmenter av en størrelse tilsvarende den til DNA som koder for pC-molekylet.

Ifølge velkjente fremgangsmåter beskrevet f.eks. i Ausubel ved 5.0.1 et seq., kan de utvalgte fragmenter klones i en egnet kloningsvektor. Et DNA erholdt på denne måte kan f.eks. innsettes i BamHl-setet i kloningsvektoren pUC18. Kimære plasmider eller fag fremstilt ved kobling av de stør-relsesselekterte fragmenter til kloningsvektoren, kan så transformeres inn i E. coli eller andre vertsceller som deretter screenes for ekspresjon av proteinet det kodes for. En rekke fremgangsmåter kan benyttes til screening av biblioteker for identifisering av en klon som inneholder pC-genet. Disse fremgangsmåter omfatter screening med en hybridiseringsprobe spesifikk for pC, f.eks. en oligonukleotidprobe, eller screening for pC-antigenekspresjon ved bruk av et pC-spesifikt immunologisk reagens. Dette kan f.eks. oppnås ved immunoblotting av et bibliotek med anti-pC-monoklonale antistoffer eller med et spesifikt polyklonalt antistoff fremstilt fra dyr, immunisert med renset pC. Når først en klon som inneholder pC-kodende DNA er identifisert i biblioteket, kan DNA-et isoleres, regionen som koder for pC-protein fullt ut karakteriseres (f.eks. ved sekvensering), og endelig kan DNA-et benyttes for fremstilling av pC-ekspresjonsvektorer egnet for fremstilling av aktivt pC-protein.

Som bemerket tidligere bør, for å tilveiebringe et effektivt immunogen, strukturen av det rekombinant uttrykte pC-protein være tilstrekkelig lik den til nativt (ikke-denaturert) pC til at proteinet induserer produksjon av beskyttende antistoffer. For dette formål foretrekkes det å uttrykke pC-kodende DNA på en slik måte at intracellulær proteolyse og aggregering av ekspresjonsproduktet i denaturert form unngås. En fremgangsmåte for å unngå disse problemer er å produsere pC rekombinant i et vert-vektor sy st em som gir utskilling av pC fra vertscellen, fortrinnsvis direkte i dyrkningsvæsken. Et slikt system tilveiebringes av Bacillus svbtilis. En egnet sekresjonsvektor for Bacillus subtilis kan fremstilles ved å koble signalsekvensen fra a-amylase fra B. amyloliquefaciens, se Young et al., Nucleic Acids Res. 11: 237-49 (1983), til Bacillus-plasmidvektoren pUBHO, som beskrevet av Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162: 176-82 (1985). Ifølge denne fremgangsmåten klones sekvensen som koder for fremmedproteinet nedstrøms for promoteren, ribosombin-dingssetet og signalsekvensen for a-amylase. Transskripsjon og translasjon av pC er under kontroll av a-amylasepromoteren og translasjonsmaskineriet i dette konstrukt, og sekresjon av pC fra vertscellen tilveiebringes av a-amylasesignalsekvensen. Tilsvarende vektorer for bruk i gjær er blitt beskrevet, og ekspres-jonssekresjon av pC i gjær ved bruk av disse vektorer vil kunne oppnås.

Nok en tilnærming for ekspresjon av pC i et vert-vektorsystem som unngår proteolyse, aggregering og denaturering, er bruk av kukoppevirus som en vektor i stand til ekspresjon i en rekke pattedyrvertsceller som kan infiseres med kukoppevirus. Denne tilnærming ville omfatte fremstilling av en rekombinant kukoppevirusavledet vektor, i hvilken pC-genet er plassert under kontroll av en promoter, sammen med translasjons- og sekres-jonssignaler, egnet for ekspresjon av pC-protein i en kukop-pevirusinfisert vert. Som beskrevet i US patentskrift nr. 4.603.112, ville plasmidet også omfatte 5' for transskripsjons-kontrollområdene og 3' for de 3' terminerings- og polyadenyler-ingssignaler, flankerende sekvenser som fremmer homolog rekombinasjon inn i et villtypekukoppegenom. Når en konstruksjon av denne type innføres i en kukoppeinfisert vertscelle, styrer de flankerende sekvenser rekombinasjon mellom plasmidvektoren og kukoppeviruset, med det resultat at en klonet strukturell sekvens (som her koder for pC) blir del av, formeres med og uttrykkes med kukoppeviruset. Området mellom de flankerende sekvenser inneholder også fortrinnsvis en selekterbar markør, slik at i nærvær av seleksjonsmedium vil bare de celler som inneholder rekombinert kukoppevirus (og i den foreliggende sammenheng sekvensen som koder for et pC-aktivt polypeptid), overleve.

En rekombinant kukoppestamme fremstilt på denne måten kan benyttes til infeksjon av pattedyrceller, f.eks. Vero-celler eller CVl-celler, egnet til fermentativ vekst i høy tetthet. Det pC-aktive protein som uttrykkes i disse celler under fermenteringen, ville utskilles i fermenteringsvæsken, fra hvilken det ville kunne renses ved konvensjonelle fremgangsmåter.

Preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse er beregnet for immunisering av et mottakelig pattedyr, heriblant et menneske, mot Lyme-sykdom. Begrepet "immunogen" betyr et antigen som fremkaller spesifikk immunrespons som fører til humoral eller cellemediert immunitet, i denne sammenheng mot infeksjon med Borrelia. "Immunitet" betegner følgelig individets evne til å motstå eller overkomme infeksjon lettere enn ikke-immuniserte individer, eller til å tolerere infeksjonen uten å bli klinisk påvirket.

Preparatet kan omfatter videre et hjelpestoff, som f.eks. en aluminiumforbindelse, vann og plante- eller mineral-oljeemulsjoner (f.eks. Freunds adjuvans), liposomer, ISCOM (immunostimulerende kompleks), vannløselige glass, polyanioner (f.eks. poly A:U, dekstransulfat, lentinan), ikke-giftige lipopolysakkaridanaloger, muramyldipeptid og immunoregulerende stoffer (f.eks. interleukinene 1 og 2) eller kombinasjoner av disse. Det foretrukne hjelpestoff er aluminiumhydroksid. Immunogenisiteten kan også forhøyes hos pattedyr som har mottatt levende, svekkede bakterievektorer som f.eks. Salmonella eller Mycobacterla, eller virale vektorer som Vaccinia, som uttrykker et pC-aktivt polypeptid.

Det farmasøytiske preparat som fremstilles ved anvendelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, av preparatet ifølge oppfinnelsen, kan videre omfatte et aksepterbart fysiologisk bærerstoff. Slike bærerstoffer er velkjente innen faget og omfatter makromolekylære bærerstoffer. Eksempler på egnede bærerstoffer for pattedyr omfatter tuberkulin-PPD, bovint serumalbumin, ovalbumin eller hemocyanin fra albueskjell. Bærerstoffet bør fortrinnsvis være ugiftig og ikke-allergent.

Teknikker for utforming av slike preparater er velkjente innen faget. Preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse kan f.eks. frysetørkes for påfølgende rehydratisering i en eksipiens som saltvann eller en annen fysiologisk løsning. I alle tilfeller fremstilles preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse ved å blande en immunologisk effektiv mengde av pC med eksipien-sen i en mengde som gir den ønskede konsentrasjon av preparatets immunogenisk effektive bestanddel. Mengden av immunogenisk effektiv bestanddel i preparatet vil avhenge av pattedyret som skal immuniseres, hvor alder og vekt av dette, så vel som immunogenisiteten av den immunogene bestanddel i preparatet, tas i betraktning. I de fleste tilfeller vil mengden av immunogen bestanddel i preparatet ligge i området fra 1 til 100 ug pr. dose, og vil fortrinnsvis være i området fra 10 til 50 ug pr. dose.

I nok en utførelse av foreliggende oppfinnelse omfatter preparatet pC og ett eller flere andre B. burgdorferi-antigener.

Fremstillingsfremgangsmåten for preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er utformet for å sikre bibehold av identitet og immunologisk effektivitet av de spesifikke molekyler, og at ingen uønskede mikrobielle forurensninger innføres. Sluttproduktene fordeles og lagres under aseptiske betingelser.

Fremgangsmåten for immunisering av pattedyr mot Lyme-sykdom omfatter tilførsel til pattedyret av en effektiv mengde av det foran nevnte immunogen. Tilførselen kan omfatte enhver fremgangsmåte velkjent innen faget. En egnet tilførselsstrategi kan f.eks. omfatte tilførsel av preparatet beskrevet ovenfor til pattedyr som man vet er utsatt for midd som bærer B..burgdorferi tilnærmet 6 måneder til 1 år forut for tidspunktet for kjent eller forventet eksponering. Enhver immuniseringsmåte som kan tenkes eller er blitt vist å gi en passende immunrespons, kan benyttes selv om parenteral tilførsel foretrekkes. Egnede tilførselsformer omfatter subkutane, intrakutane eller intra-muskulære injeksjoner eller preparater egnet for oral, nasal eller rektal tilførsel.

Rensefremqanqsmåte

En ny ikke-denaturerende fremgangsmåte er blitt utviklet for rensing av en rekke B. jburgrdorferi-antigener fra en rekke B. hurgdorferi-stammer. Antigenene omfatter, men er ikke begrenset til, ospA, ospB, pC, det strukturelle flagellprotein og proteiner med tilnærmede molekylvekter på 21 kd, 56 kd, 60 kd og 63 kd. Disse fremgangsmåter representerer en forbedring over tidligere kjente fremgangsmåter, som enten er denaturerende, spesifikke for bare én spesiell type antigen eller bare gir delvis rensing. Den foretrukne rensefremgangsmåte omfatter følgende trinn: (a) åpning av B. iurgdorferi-celler og fraksjonering ved sentrifugering i "membran"-fraksjon og "cytoplasma"-fraksjon; (b) ekstraksjon av membranfraksjonen med en ikke-denaturerende detergent, fulgt av sentrifugering for å erholde en supernatant som omfatter løseliggjort protein og for å fjerne uløselig materiale som et bunnfall; og (c) fraksjonering av løseliggjorte antigener ved ionebytterkromatografi (dietylaminoetyl eller "DEAE"), og eluering av adsorberte antigener med en NaCl-gradient.

Rensef remgangsmåten kan omfatte konsentrer ing og videre rensing av antigenene ved: (a) hydroksylapatittkromatografi hvor adsorberte antigener elueres ved å øke bufferens fosfatinnhold, og/eller (b) immobilisert metallaffinitetskromatografi hvor adsorberte antigener elueres med imidazol.

Andre elueringsfremgangsmåter kjent innen faget omfatter eluering ved en pH-reduksjon eller ved økende konsen-trasjoner av ammoniumklorid, histidin eller andre stoffer med affinitet for det chelatiserte metall.

Celleåpning kan oppnås ved lysering av celler ved å riste dem i suspensjon i en cellemølle med små glasskuler, ved ultralydbehandling eller i en French-presse. Alternativt kan antigenet ekstraheres direkte fra organismens celleoverflate ved å utsette cellen for en detergent, ved å endre ionestyrken i cellens omgivelser eller ved små forandringer av temperaturen. Alternativt kan et utgangsmateriale som omfatter membranblærer

avgitt fra celler benyttes.

Ekstraksjonen av membranfraksjonen kan oppnås med en detergent som fortrinnsvis har høy evne til løseliggjøring, er ikke-denaturerende og kompatibel med ionebytterkromatografi. Den foretrukne detergent er zwitteriondetergent 3-14 fra Calbiochem, selv om enhver detergent eller ethvert organisk løsemiddel med de ovenfor nevnte egenskaper kan benyttes. Detergenten benyttes typisk ved en konsentrasjon på 1 % (vekt/vol), men ville være mer eller mindre effektiv i området 0,01-10 % (vekt/vol). Detergen-tekstraksjonen utføres ved en temperatur i området fra 0 til 60 °C, fortrinnsvis ved 37 °C, og bør ta fra 10 minutter til 8 timer, fortrinnsvis 1 time. Kaotrope stoffer som urea kan benyttes sammen med detergenten for å forbedre løseliggjørings-prosessen.

Antigener løseliggjort med detergent fraksjoneres så ved DEAE-kromatografi. Fortrinnsvis benyttes en DEAE-ionebytterharpiks, men andre anion- eller kationbytterharpikser kan benyttes i stedet for eller sammen med denne. En ionebytterharpiks omfatter en uløselig matriks til hvilken ladete grupper er blitt koblet. Funksjonelle grupper benyttet i ionebyttere omfatter aminoetyl(AE)-, dietylaminoetyl(DEAE)- og kvaternære aminoetyl(QAE)-grupper. Kationbyttere kan ha karboksymetyl(CM)-, fosfo- eller sulfopropyl(SP)-grupper. Selv om prøver påsettes kolonnen i en tris-buffer som inneholder zwitteriondetergent 3-14 (3 %) og antigenene elueres med en NaCl-gradient, kan andre utforminger være like effektive.

Antigener kan konsentreres ved å binde dem til hydroksylapatitt ifølge fremgangsmåter velkjente innen faget. En alternativ eller komplementær fremgangsmåte ved hvilken antigener kan konsentreres/renses ytterligere, er ved immobilisert metallaffinitetskromatografi. Denne fremgangsmåten foretrekkes fremfor hydroksylapatittkromatografi for rensing av pC, da en bedre separasjon fra ospA og -B oppnås.

Fordelen ved den ovenfor beskrevne ikke-denaturerende rensefremgangsmåte er at 3-D-konformasjonen av proteinet bibeholdes, slik at alle antistoffbindende seter funnet på det native protein bibeholdes, heriblant dem involvert i beskyttelse. Dersom et protein denatureres, kan bindingssetene ødelegges delvis eller fullstendig, og antigenets evne til å indusere antistoffer mot de antigene seter vil reduseres tilsvarende. Proteiner endret på denne måte ville derfor være uegnede for bruk i vaksiner.

En fordel ved den ovenfor beskrevne rensefremgangsmåte fremfor helcellefremgangsmåten, som den beskrevet av Johnson

(1988), er at den fremstiller homogent protein fritt for alle toksiske bestanddeler, noe som reduserer faren for en uønsket reaksjon. "Homogen" i denne sammenheng betyr at minst 80 %

(vekt/vekt) av proteinet er fullstendig intakt pC, og hvor det meste av det gjenværende utgjøres av nedbrytningsprodukter av pC. Urenheter i form av mediumbestanddeler og andre Borrelia-proteiner foreligger følgelig bare i spor-

mengder eller ikke i det hele tatt. Homogent pC kan bestå av mer enn én serologisk form av pC.

På denne måte tillates fjerning av uønskede, potensielt immunogene proteiner som ville kunne indusere autoantistoffer og forårsake skadelige autoimmunreaksjoner i det immuniserte pattedyr. På samme måte sikrer også den ovenfor beskrevne rensefremgangsmåte reproduserbarhet mellom partier under vaksinefremstillingen.

Beskyttelse

Basert på den oppdagede validitet av ørkenrotter som dyremodell i denne sammenheng ble eksperimenter utført for å bekrefte at immunitet mot B. iurgrdorferi-infeksjon kunne over-føres. Disse eksperimenter diskuteres i eksempel 3 nedenfor. Selv om ospA, ospB, pC, 63 kd-overflateprotein, 21 kd- og 94 kd-proteiner fra B. burgdorferi-stamme Orth-1 også ble analysert, viste bare pC-protein klare tegn på en beskyttende virkning.

Påvi sninqs f remgangsmåte

Antigener fremstilt ved den ovenfor beskrevne rensefremgangsmåte er egnet til bruk i diagnostiske analyser, som f.eks. for påvisning av antistoffer mot B. burgdorferi i kroppsvæsker fra pattedyr. Et ikke-denaturert, homogent protein fremstilt ved fremgangsmåten ovenfor kan f.eks. inkuberes med en kroppsvæskeprøve, slik at nærvær av bundet antistoff som et resultat av inkubasjonen kan oppnås. Begrepet "kroppsvæske" er ment å omfatte, men er ikke begrenset til, cerebrospinalvæske, leddvæske, urin, kroppshulevæske, blod, serum, sæd og spytt. Selv om slike analyser er velkjente innen faget, ville de i stor grad forbedres ved sensitiviteten og spesifisiteten av antigenene renset ifølge foreliggende opp-finnelse.

Foreliggende oppfinnelse er beskrevet mer i detalj i de følgende eksempler som skal illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

Proteinrensing

Fremstilling av membranfraksioner

Borrelia iurgrdorferi-celler ble høstet ved sentrifugering (7000 g, 20 minutter, 4 °C), cellepelleten ble vasket to ganger med PBS-5 mM MgCl2og våtvekten av cellene bestemt. De vaskede celler ble så resuspendert i 100 mM tris-HCl-buffer, pH 7,5 (ved et forhold på 1 g celler:2 ml buffer), og suspensjonen ble tilsatt glasskuler (0,17-0,18 mm diameter, 5 g kuler til 1 g cellemasse) i et metallbeger. Cellene ble så lysert ved å riste blandingen i en "Vibrogen"-cellemølle (modell V14, Biihler). Tre minutters sykluser med risting under kjøling (4 °C) ble gjentatt inntil mer enn 99 % av cellene hadde lysert, anslått ved mørkefeltmikroskopi. Lysatet ble så filtrert gjennom et sintret glassfilter for å fjerne glasskulene, og kulene ble vasket med buffer for å forbedre utbyttet av bakterieantigener i filtratet.

Lysatet ble sentrifugert i 20 minutter ved 7.500 g og 4 °C for fremstilling av en råmembranf raks jon ("lsp" - low speed pellet). Supernatanten ble videre sentrifugert i 30 minutter ved 100.000 g og 4 °C for fremstilling av den andre membranfraksjon ("hsp" - high speed pellet). Begge membranfraksjoner ble vasket to ganger med 100 mM tris-HCl-buffer (pH 7,5) under de opprinnelige sentrifugeringsbetingelser. Begge membranf r aks joner kunne benyttes som utgangsmateriale for rensing av pC (eller de andre membranforbundne antigener), men hsp-fraksjonen inneholdt færre forurensende proteiner.

Detergentekstraksion av membraner

Membraner ble resuspendert ved tilnærmet 10 mg protein/ml i en 10 mM tris-HCl-buf fer (pH 7,5) med 1 % (vekt/vol) av zwitteriondetergenten 3-14 (Serva). Etter 1 times inkubasjon ved 37 °C ble uløselig materiale fjernet ved sentrifugering (100.000 g, 60 minutter, 4 °C).

DEAE- ionebvtterkromatoqrafi

De detergentløseliggjorte antigener ble fraksjonert ved DEAE-kromatografi som illustrert nedenfor: Kolonne: Protein-PAK DEAE 5PW semipreparativ kolonne

(diameter 21,5 mm, lengde 150 mm) fra Waters. Prøve: 20 ml (4 x 5 ml) detergentløseliggjort antigen-preparat (10 mg/ml).

Strømnings-

hastighet: 4 ml/minutt.

Buffer A: 10 mM tris-HCl, pH 7,5/1 % (vekt/vol) zwitteriondetergent 3-14.

Buffer B: A + 1 M NaCl.

Gradient: 0 % B i 35 minutter, 0-30 % B på 90 minutter, 30-65 % B på 45 minutter, 65-100 % B på 10 minutter.

Kolonnen ble ekvilibrert med buffer A og antigenene eluert med økende mengder NaCl. For å identifisere fraksjoner som inneholdt antigenet av interesse ble uttak fra 8 ml fraksjoner felt med aceton, og bunnfallene ble analysert ved SDS-PAGE og/eller immunoblotting.

Hvdroksylapatittkromatoqrafi

Fraksjoner anriket på antigenet av interesse, f.eks. pC, ble slått sammen og dialysert mot buffer C før påsetting på hydroksylapatittkolonnen. Bundet antigen ble eluert med økende mengder fosfationer, f.eks. med buffer D. På denne måte kunne fortynnede antigenløsninger konsentreres, og ytterligere separasjon av antigenet fra kontaminanter kunne oppnås. De tekniske spesifikasjoner for denne fremgangsmåten er som følger:Kolonne: Bio-Gel HPHT-kolonne (diameter 7,8 mm, lengde 100

mm) fraBio-Rad.

Prøve: Sammenslåtte pC-holdige fraksjoner fra foregående trinn (f.eks. fraksjonene 20-22) etter dialyse mot

buffer C (4 x 5 ml).

Strømnings-

hastighet: 0,5 ml/minutt.

Buffer C: 10 mMMOPS-NaOH (3-N-morfolino)-propansulfonsyre),

pH 6,8/1 mM Na(PO4)<3>V0,01 mM CaCl2/l % (vekt/vol)

zwitteriondetergent 3-14.

Buffer D: C + 400 mM Na(P04)<3>_.

Gradient: 0 % D i 60 minutter, 0-100 % D på 20 minutter.

Fraksjonene ble analysert som beskrevet i ionebytterkromatografitrinnet.

Immobilisert metallaffinitetskromatoqrafi

Fraksjoner anriket på antigenet av interesse, f.eks. pC-fraksjoner fra DEAE-ionebytterkromatografiseparasjonene, ble slått sammen og bufferen justert (f.eks. ble NaCl tilsatt ionebytterkromatograf i fraksjonene som inneholdt pC-proteinet til en sluttkonsentrasjon på 150 mM). Filtrert antigenløsning (0,2 um) ble påsatt immobilisert metallaf f initetskromatograf ikolonnen (på forhånd ladet med Cu<++>, som beskrevet av fabrikanten, og ekvilibrert med buffer A), vasket med buffer A, og det bundne antigen eluert med den imidazolholdige buffer B. På denne måten kunne fortynnede antigenløsninger konsentreres og videre separasjon av antigenet fra kontaminanter oppnås.

De tekniske spesifikasjoner for denne fremgangsmåte, illustrert ved pC-proteinet, er som følger: Kolonne: Chelaterende superose HR 16/5-kolonne (diameter 16

mm, lengde 50 mm) fra Pharmacia/LKB.

Prøve: Sammenslåtte pC-holdige fraksjoner fra DEAE-ionebytterkromatograf i med tilsatt NaCl (150 mM). Buffer A: 20 mM tris/acetat, pH 7,5/150 mM NaCl/1 %

(vekt/vol) zwitteriondetergent 3-14.

Buffer B: 20 mM tris/acetat, pH 7,0/150 mM NaCl/1 %

(vekt/vol) zwitteriondetergent 3-14/50 mM

imidazol.

Strømnings-

hastighet: 2 ml/minutt.

Gradient: A i 30 minutter, 0-100 % B på 40 minutter.

Fraksjonene som inneholdt pC, ble identifisert som i ionebytterkromatografitrinnet.

Eksempel 2

Resultater fra rensefremqanqsmåten

Følgende antigener, fremstilt ved bruk av fremgangsmåtene skissert ovenfor, karakteriseres med henvisning til figur 1:

63 kd-overflateprotein (spor 7)

60 kd-protein (spor 8)

56 kd-protein (spor 9)

Strukturelt flagellprotein (spor 10)

ospB (spor 11)

ospA (spor 12)

pC (spor 13)

21 kd-protein (spor 14)

De første tre trinn i renseprosessen var i det vesentlige identiske, uavhengig av hvilket protein som skulle renses, selv om modifikasjoner kunne innføres etter behov for å optimalisere separasjonen. Hydroksylapatittkromatografitrinnet benyttet for rensing/konsentrasjon av pC-proteinet er vidt anvendbart, da nærmest alle proteiner av interesse bindes til hydroksylapatitt i buffer C.

Eksempel 3

Beskyttelsesundersøkelser

Da immunitet erholdt i løpet av en aktiv infeksjon vanligvis er overlegen immunitet oppnådd ved vaksinering, ble en gruppe på 10 ørkenrotter infisert intraperitonealt med 2 x IO<7>virulent B. iurgdorferi-stamme Orth-1 for å vise at beskyttende immunitet mot Lyme-borreliose er et realistisk mål. Denne dosen ble i etterhånd vurdert til å tilsvare tilnærmet 1000 ganger den infeksiøse dose som kreves for å infisere 50 % av dyrene. Tre uker senere ble dyrene behandlet med antibiotika i 1 uke for å fjerne infeksjonen. Etter en hviletid på 17 dager for å la antibiotikaet fjernes ble dyrene infisert på nytt, som beskrevet ovenfor. To uker senere ble dyrene drept, og blære, milt, nyrer og hjerte ble dyrket. Alle disse dyr var beskyttet, da B. jburgdorferi ikke kunne påvises i noen av organkulturene trass i regelmessig inspeksjon av kulturene over en periode på 8 uker. I motsetning til dette var 80 % av kontrollørkenrottene, som ikke hadde fått den opprinnelige "immuniserende infeksjon", infisert. For å sikre sammenlignbarhet med analysedyrene hadde også disse kontroller blitt behandlet med antibiotika. Dette bekreftet at beskyttelsen i analysegruppen kunne tilskrives erholdt immunitet og ikke gjenværende antibiotika i vevene.

I neste serie med eksperimenter ble den beskyttende evne til antigener renset ved de beskrevne fremgangsmåter fra B. jburgdorferi evaluert. Ørkenrotter ble immunisert intraperitonealt to ganger med et 2 ukers opphold mellom immuniseringene med 10 ug antigen med aluminiumhydroksid som hjelpe-

stoff. To uker etter den siste immunisering ble dyrene infisert intraperitonealt, sammen med en ikke-immunisert kontrollgruppe, med 2 x IO<7>virulent B. iurgdorferi-stamme Orth-1. To uker senere ble dyrene drept og blære, milt, nyrer og hjerte dyrket for spiroketanalyse. Kulturene ble regelmessig inspisert i 8 uker.

ospA, ospB, pC og 63 kd-overflateproteinet, alle fra stamme Orth-1, ble analysert. Bare dyrene som ble immunisert med pC-proteinet, viste klare tegn til en beskyttende virkning. Selv om ingen absolutt beskyttelse ble vist, var infeksjonen i de pC-immuniserte dyr mindre alvorlig, og færre organer var infisert. Hjerte- og nyrekulturene fra de immuniserte dyr var negative med henblikk på B. burgdorferi, sammenlignet med en infeksjonshyp-pighet på tilnærmet 50 % i kontrollene. Tilsvarende ble in-feksjonshyppigheten i milt på tilnærmet 70 % nesten halvert. Bare når det gjaldt det mest utsatte organ, blæren, var det ingen vesentlig endring i antallet infiserte kulturer. ospA, ospB og 63 kd-proteinet var fullstendig uten virkning. Resultatene av disse eksperimenter er beskrevet i tabell 1 nedenfor.

Et påfølgende eksperiment ble utført i samsvar med samme protokoll som beskrevet ovenfor, bortsett fra at infek-sjonsdosen ble redusert til IO<6>organismer. Ved immunisering ga pC en utvilsom beskyttelse. Derimot var det ingen tegn til beskyttelse etter immunisering med ospA, 21 kd-protein eller 94 kd-protein. Som vist i tabell 2, viste alle ørkenrotter immunisert med pC beskyttende virkning, mens ingen av ørkenrottene immunisert med ospA, 21 kd-protein eller 94 kd-protein viste særlig virkning.

Eksempel 4

Karakterisering av pC- protein som et lipoprotein

B. burgdorferi dyrket i nærvær av<3>H-palmitinsyre inkorporerer denne radioaktivt merkede fettsyre i sine lipoproteiner. Disse radioaktivt merkede lipoproteiner separeres ved SDS-PAGE-elektroforese og identifiseres ved fluorografi. Et slikt lipoprotein identifisert fra stamme Orth-1 har samme tilsyne-latende molekylvekt (ca. 24 kd) som pC-proteinet fra denne stamme. Når<3>H-palmitinsyremerkede hele celler av B. jburgdorferi Orth-1 ble behandlet med trypsin og analysert ved SDS-PAGE, kunne et karakteristisk dobbeltbånd som tilsvarer delvis kløyvd pC-protein ses. Westernblotting av dette materialet med pC-spesifikke monoklonale antistoffer bekreftet at disse bånd virkelig tilsvarte pC-proteinet. Dette dobbeltbånd som er karakteristisk for pC-proteinet, kunne også påvises ved fluorografisk analyse av det trypsinbehandlede materialet. Et tilsvarende eksperiment med proteinase K som gir en vesentlig reduksjon av mengden celleassosiert pC-protein, førte til nærmest fullstendig tap av 24 kd-lipoproteinet. Disse resultater som er vist i figur 2, bekrefter av pC-proteinet er et lipoprotein.

Metodologiske detaljer

Radioaktiv merking av B. fturqrdorferi- celler: B. jburgdorferi-Orth-l-celler (3,5 ml kultur med 1,6 x IO<7>celler/ml) ble dyrket i BSK-medium med radioaktivt merket palmitinsyre (70 ul<3>H-palmitinsyre, 55 Ci/mmol, 1 mCi/ml) i 48 timer ved 33 °C), vasket to ganger med PBS/5 mM MgCl2-buffer, og hver porsjon ble resuspendert i 190 ul av PBS/MgCl2-bufferen.

Proteolytisk kløyving: Til 190 pl cellesuspensjon ble tilsatt 10 pl av enten PBS/MgCl2(kontroll), 62,5 pg trypsin i 1 mM HC1 eller 62,5 pg proteinase K i vann. Prøvene ble inkubert under risting ved 25 °C i 50 minutter (proteinase K) eller 100 minutter, hvoretter 2 pl PMSF (50 mg fenylmetylsulfonylfluorid/ml i etanol) ble tilsatt. Cellene ble nedsentrifugert (10 minutter, 8.000 g) og vasket to ganger med 500 pl PBS/5 mM MgCl2/0,5 mg/ml PMSF for å fjerne kløyvingsprodukter.

Prøveanal<y>se: SDS-PAGE og westernblotting ble utført ved bruk av gjengse fremgangsmåter. Geler benyttet til fluorografi ble inkubert i 1 time i EN<3>HANCE (NEN), vasket i 30 minutter med vann, tørket ved 65 °C i 2 timer og eksponert med hyperfilm MP (Amersham) ved -80 °C.

Eksempel 5

Ekspresjon av rekombinant pC- protein

DNA ble ekstrahert fra B. jburgdorferi Orth-1, delvis kuttet med Sau3A, størrelsesfraksjonert og klonet inn i BamHl-setet i pUC18. Screening ble utført med en oligonukleotid-hybridiseringsprobe, og det påviste gen ble sekvensert.

pC-genet ble så amplifisert med PCR og klonet inn i en ekspresjonsvektor.

De benyttede PCR-primere var:

Primer 1 tilsvarer starten av den åpne leseramme for pC

(startkodonet er uthevet)

Primer 2 tilsvarer enden av den åpne leseramme for pC

(stoppkodonet er uthevet)

PCR-reaksjonen ble utført ifølge fabrikantens in-struksjoner ved bruk av VentR-DNA-polymerase (New England Biolabs). Hybridisering av primerne mot templat-DNA (rekombinant pUC18-plasmid med et B. jburgdorferi-avledet DNA-fragment som inneholder pC-genet sammen med flankerende DNA) ble utført ved 57 °C, og primerne ble forlenget ved 74 °C. I alt 25 sykluser, hver på 1 minutt, ble utført, hvoretter prøven ble oppvarmet ved

50 °C i 5 minutter.

pC-proteinet var blitt uttrykt som et fusjonsprotein med maltosebindende protein (MBP) ved bruk av et kommersielt tilgjengelig ekspresjonssystem (New England Biolabs).

Konstruksjon av fusjonsplasmidene

Det PCR-amplifiserte pC-gen ble innsatt nedstrøms for znalE-genet, som foreligger i ekspresjonsvektorplasmidene pMAL-p2 og pMAL-c2 (100 ng plasmid-DNA ble kuttet med restriksjonsenzymet Xmnl og ligert til 20 ng PCR-produkt, dvs. pC-gen). Det ligerte DNA ble transformert inn i en a-komplementerende E. coli- vert (f.eks. TB1 eller DH5a), og kloner som inneholdt pC-genet ble selektert på LB-agar med ampicillin og X-gal. Innsetting av pC-genet i kloningsvektoren, som gir ampicillinresistens, ødelegger malE- lacZa-fusjonen og gir en endret kolonifenotype (blå til hvit) under de valgte analysebetingelser. Konstrukter med pC-genet i korrekt orientering relativt til tac-promoteren i vektoren uttrykte et pC-MBP-fusjonsprotein, som ble bekreftet ved westernblotting med pC-spesifikke monoklonale antistoffer. pC-MBP-fusjonsproteinet ble fremstilt både med et signalpeptid (pMAL-p2), som dirigerer fusjonsproteinet til periplasma, og uten signalsekvensen, hvorved fusjonsproteinet forblir i cytoplasma (pMAL-c2). Cytoplasmatisk ekspresjon var høyere enn periplas-matisk ekspresjon, men den siste har den mulige fordel å gi et løselig produkt.

Rensing av rekombinant pC

Råekstrakter som inneholdt det periplasmatiske og cytoplasmatiske uttrykte pC-MBP, ble fremstilt som beskrevet av fabrikanten. Fusjonsproteinet ble renset ved affinitets-kromatografi basert på den spesifikke binding av MBP til en amyloseaffinitetsharpiks. MBP-resten kløyves fra pC-MBP-fusjonsproteinet og etterlater et intakt pC-protein, da fusjonsproteinet inneholder ett enkelt gjenkjenningssete for proteasen faktor Xa ved siden av begynnelsen på pC-aminosyre-sekvensen. MBP frigjort i denne prosess fjernes sammen med eve-ntuelt ukløyvd fusjonsprotein ved hjelp av amyloseharpiksen (MBP bindes, mens pC ikke bindes). Andre fremgangsmåter egnet for rensing av pC kunne også blitt benyttet, f.eks. ionebytterkromatografi, hydroksylapatittkromatografi, immobilisert metallaffinitetskromatografi.

Ifølge denne fremgangsmåten er det fremstilte pC-protein intakt. Forkortede former av pC-proteinet (f.eks. uten den antatte ledersekvens) kan også fremstilles ved bruk av passende PCR-primere.

Claims (10)

1. Preparat, karakterisert vedat det omfatter a) et i det vesentlige rent immunogen fra gruppen av én eller flere ikke-denaturerte serologiske former av B. jburgrdorferi-pC-polypeptid med i det vesentlige nativ konfigurasjon, i en mengde som er effektiv til å frembringe en immunrespons hos et mottagelig pattedyr og som immuniserer pattedyret mot Lyme-borreliose, hvori mengden er i området fra 1 til 100 ug pr. immunogen pr. dose, og b) et hjelpestoff.

2. Preparat ifølge krav 1, karakterisert vedat det omfatter ett eller flere ikke-pC-antigener fra B. burgdorferi.

3. Preparat ifølge kravene 1 til 2,karakterisert vedat hjelpestoffet er aluminiumhydroksid.

4. Preparat ifølge kravene 1 til 3,karakterisert vedat mengden av immunogen er i området fra 10 til 50 pg pr. imunogen pr. dose.

5. Preparat ifølge ethvert av kravene 1 til 4,karakterisert vedat pattedyret er et menneske.

6. Preparat ifølge ethvert av kravene 1 til 5,karakterisert vedat immunogenet er i en homogen form og omfatter minst 80 % (vekt/volum) av strukturelt intakt pC-polypeptid.

7. Preparat ifølge ethvert av kravene 1 til 6,karakterisert vedat pC-polypeptidet er et rekombinant polypeptid som er produsert i transformerte vertsceller.

8. Preparat ifølge krav 7, karakterisert vedat pC-polypeptidet omfatter en aminosyresekvens som er kodet av en DNA-sekvens som kan amplifiseres ved hjelp av polymerase kjedereaksjon med oligonuk-leotidprimerpar tilsvarende 5' ATG AAA AAG AAT ACA TTA AGT GCG ATA TTA 3' og 5' ATT AAG GTT TTT TTG GAG TTT CTG 3'.

9. Preparat ifølge ethver av kravene 1 til 8,karakterisert vedat immunogenet renses ved hjelp av ionebyttekromatografi.

10. Anvendelse av et preparat ifølge ethvert av kravene 1 til 9 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av et pattedyr mot Lyme-borreliose.