HU219772B - Vakcinakészítmény Lyme-kór megelőzésére és eljárás előállítására - Google Patents

Vakcinakészítmény Lyme-kór megelőzésére és eljárás előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU219772B
HU219772B HU9202289A HU9202289A HU219772B HU 219772 B HU219772 B HU 219772B HU 9202289 A HU9202289 A HU 9202289A HU 9202289 A HU9202289 A HU 9202289A HU 219772 B HU219772 B HU 219772B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
immunogen
polypeptide
vaccine composition
burgdorferi
protein
Prior art date
Application number
HU9202289A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9202289D0 (en
HUT66525A (en
Inventor
Friedrich Dorner
Ian Livey
Original Assignee
Baxter Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27419096&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU219772(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Baxter Ag filed Critical Baxter Ag
Publication of HU9202289D0 publication Critical patent/HU9202289D0/hu
Publication of HUT66525A publication Critical patent/HUT66525A/hu
Publication of HU219772B publication Critical patent/HU219772B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

A találmány tárgya Lyme borreliosis elleni vakcinakészítmény, amelyimmunogénként a B. burgdorferi pC-- polipeptid egy vagy többszerológiai formáját tartalmazza a Lyme borreliosisra érzékenyemlősöket immunizálni képes 1–100 ?g/immunogén/dózis hatásosmennyiségben valamely adjuvánssal elkeverve. A találmány vonatkozik afenti vegyületek előállítási eljárására is. ŕ

Description

A találmány Lyme-kór megelőzésére vonatkozik, közelebbről a találmány tárgya vakcinakészítmény, ennek előállítási eljárása, amely készítmény alkalmas a Lyme-kór kezelésére, megelőzésére.
A „Lyme-kór” és „Lyme borreliosis” általánosságban kullancs okozta fertőzést jelentenek, amelyet a spirochaéta Borrelia burgdorferi kórokozó vált ki és amely a legismertebb kullancs által közvetített betegség, mind az Amerikai Egyesült Államokban, mind Európában. A Lyme-kór hasonlatos a szifiliszhez, mivel több különböző szervet támad meg, a leggyakrabban a bőrt, az idegrendszert, a szívet, az ízületeket, továbbá mert fokozatosan fejlődik ki és krónikussá válhat.
Mivel a Lyme-kór különböző betegségek formájában jelentkezhet, meghatározásához szükség van igen pontos diagnosztikai eszközre, különösen nehéz esetekben, ahol a klinikai kórkép nem meggyőző. Szükség van továbbá olyan módszerre, amellyel ez a betegség megelőzhető vagy kezelhető. Az antibiotikumokkal való kezelés hatásos lehet, ha röviddel a fertőzés megelőzése után elkezdik, de hosszan tartó és magas dózisú kezelés szükséges, ha már egyszer a betegség kifejlődött. Az antibiotikumokkal való kezelés továbbá nem minden esetben sikeres [Preac Mursic és munkatársai, Infection 18: 332-341 (1990)]. Ennek megfelelően igen nagy szükség van a Lyme-kór megelőzésére alkalmas vakcina kifejlesztésére.
A B. burgdorferi számos antigénje ismert. A B. burgdorferi két fő külső felületi proteinjét, az ospA (31 kd) és az ospB (34 kd) proteineket a következő irodalmi helyen ismertetik: Barbour, Clin. Microbiol. Revs. 1: 399-414 (1988). Az ospA jelen van a legtöbb törzsben, de heterogén, azaz a különböző törzsekből származó ospA proteinek molekulatömegükben és szerológiai reaktivitásukban különbözhetnek egymástól.
Az ospB kisebb mértékben oszlik meg a törzsek között, mint az ospA, de hasonlóan az ospA-hoz különböző szerológiai és molekulatömegű formában van jelen. Az ospA és ospB génjeit, amelyek plazmiddal kódoltak, klónozták, szekvenálták és E. coliban expresszálták [Barbour és munkatársai, Rév. Inf. Dis. 11(6): S1470-74 (1989); Bergström és munkatársai, Mól. Microbiol. 3: 479-86 (1989)].
A B. burgdorferi pC (24 kd) proteinje hasonló az ospA és -B proteinekhez több vonatkozásban. Ez szintén lipoproptein és szerológiai és molekulatömegi heterogenitást mutat és a sejtfelületen található (a sejtfelületen az agglutináló antitest megkötésére szolgál és a sejttel kapcsolatos pC érzékeny a proteázzal végzett emésztésre). A pC-proteint kifejező törzsek ismertek Európában. Wilske és munkatársai [Wilske és munkatársai, N. Y. Acad. Sci. 539: 126-43 (1988)] által vizsgált 28 európai izolátum közül 40-50% volt pozitív pC-proteinre, bár lehet, hogy ez az érték alul van becsülve, mivel a pC-expresszió fluktuációt mutat.
Egyéb B. burgdorferi antigének közé tartozik még a 60 kd szakaszban található külső felületi protein (lásd Barbour és munkatársai szerinti előző hivatkozás), a 41 kd szakaszban található ostoros szerkezetű protein [Gassmann és munkatársai, Nucleic Acid Rés. 17:
3590 (1989)], a 30 kd szakasz proteinje [Simpson és munkatársai, J. Clin. Micro. 28: 1329-37 (1990)] és a körülbelül 94 kd nagyságú protein [Fuchs és munkatársai, Fourth International Conference on Lyme Borreliosis (1990)].
Különböző tisztítási módszereket alkalmaztak az antigének további tanulmányozására és jellemzésére. így például Wilske és munkatársai [Wilske és munkatársai, Zbl. Bakt. Hyg. 263: 92-102 (1986)] a teljes Borreliáét SDS-PAGE kezelésnek vetették alá, amelynél a proteineket melegítéssel denaturálták és detergensként nátrium-dodecil-szulfáttal (SDS) és 2-merkapto-etanollal kezelték. Hansen és munkatársai [Hansen és munkatársai, J. Clin. Microbiol. 26(2): 338-46 (1988)] a B. burgdorferi ostoros formáját tisztították. A 90/04411 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint Bergström és munkatársai egy nem denaturáló módszert ismertetnek a Borrelia burgdorferi frakciók részleges tisztítására.
Diagnosztikai vizsgálatok céljára szintén kísérleteket és tanulmányokat végeztek a különböző antigének előállítására és jellemzésére. így például a fentiekben említett Bergström-féle nemzetközi szabadalmi bejelentésben, valamint az 54707/2 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban diagnosztikai eljárást ismertetnek a B. burgdorferi közvetlen kimutatására, amelynél a fertőzésre válaszként termelődő specifikus antitestet határozzák meg.
Coleman és munkatársai [Coleman és munkatársai, J. Infect. Dis. 155: 756-65 (1987)] szintén B. burgdorferi frakciók termelését ismertetik, amely során a teljes spirochaétákat kezelik denaturáló hatású SDS-detergenssel, ily módon protoplazmás, hengeres frakciót (a proteinburkolattól megfosztott baktérium) nyernek, amelyet további kezelés után antigénként lehet alkalmazni.
Wilske és munkatársai [Wilske és munkatársai, Fourth International Conference on Lyme Borreliosis (1990)] immunodomináns Borrelia proteinek azonosításáról számolnak be, amelyeket a Lyme borreliosis diagnosztizálásában hasznosnak ítélnek meg. A vizsgálataik arra utalnak, hogy két protein, a pC és a plOO különösen fontos lehet abból a szempontból, hogy jelezhetik a betegség korai és késői stádiumait.
A DE 3942 728 számú szabadalmi leírásban B. burgdorferi pKo törzsből nyert pC-proteint, ennek részleges aminosavszekvenciáját és esetleges vakcinaként történő alkalmazását ismertetik.
Bár különböző antigének ismertek, a protektív hatásosságukat nem lehet előre megjósolni annak alapján, hogy immunválaszt képesek kiváltani a természetes vagy kísérleti úton előidézett fertőzések során. így például a 41 kd ostoros forma immunválaszt vált ki, de nincs védőhatása [lásd Simon és munkatársai, Immunology Today 12: 11-16 (1991)]. Hasonlóképpen, a 94 kd protein szintén nem rendelkezik védőhatással, mint azt a későbbiekben a 3. példában bemutatjuk. Tény, hogy kimutattuk, hogy a védőhatású antigének igen ritkák. Ebből következik, hogy az immunválaszok nagy része olyan antigének esetében van, amelyek nem alkalmasak védőhatás kialakítására. Ugyanakkor, bizonyos potenciálisan védőhatású antigének nem váltanak
HU 219 772 Β ki megfelelő immunválaszt. így egy vakcinakomponensként való alkalmazhatóság nem következik az antigén azon képességéből, hogy antitestválaszt vált ki.
Ily módon szükség van folyamatos kutatásokra az alkalmas vakcinák irányában, amelyek hatásosak Lyme borreliosisszal szemben. Például a 4 721 617 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban Lyme borreliosis elleni vakcinát ismertetnek, amely teljes B. burgdorferi sejteket tartalmaz, amelyeket liofilizálással inaktiváltak. Veséből vagy lépből kinyert patogének alapján a szerzők kimutatják az immunizált hörcsögök érzékenységét virulens B. burgdorferi törzsek által okozott fertőzésekkel szemben. A hatás rövid életű volt, azonban az állatok 90 nappal a vakcinálás után kiváltott fertőzéssel szemben teljesen védettek voltak.
418827 számú európai szabadalmi leírásban B. burgdorferi, különösen a B31 vagy ZS7 jelű törzsekkel szembeni vakcinát ismertetnek, amely a 37 kd ospA proteint felismerő monoklonális antitesteket tartalmaz. A szabadalmi bejelentés szerint ezen antitestekkel végzett SCID-egerek passzív immunizáeiója meggátolja a borreliakiváltott szimptómák kifejlődését. A védőhatást a fertőzés elleni ellenálló képességgel és az arthritis kifejlődésével szembeni ellenálló képességgel jellemzik. Az említett szabadalmi bejelentésben ismertetik továbbá a rekombináns β-galaktozidáz/ospA fúziós protein E. coliban való expresszióját is. Az ismertetett monoklonális antitesteket a teljes baktériumsejttel vagy rekombináns antigénproteinekkel végzett immunizációval termelik.
Fikrig és munkatársai [Fikrig és munkatársai, Science 250: 553-56 (1990)] egerek (C3H/HeJ) passzív védelmét ismertetik, amit elpusztított B. burgdorferi elleni vagy ospA-t expresszáló E. coli elleni poliklonális szérumokkal vagy ospA-specifikus monoklonális antitesttel végeztek. A kutatók ugyancsak kimutatták, hogy az egereket aktív módon lehet védeni tisztított rekombináns ospA/glutation S-transzferáz fúziós proteinekkel végzett immunizációval is. A védőhatást azon immunogén képességgel jellemezték, amely alkalmas a fertőzés megelőzésére vagy a betegség hisztopatológiai manifesztációjának megakadályozására. A fentiekben említett 90/04411 számú nemzetközi szabadalmi bejelentés szerint az immunogenikusan aktív B. burgdorferi frakciók alkalmazhatók vakcinákban. A leírás azonban semmiféle adatot nem tartalmaz az ismertetett frakciók immunogenitásának vagy védőhatásának demonstrálására.
A fentieknek megfelelően a találmány célja hatásos vakcina biztosítása Lyme-kór ellen emlősöknél, valamint eljárás biztosítása ezen vakcinakészítmények előállítására.
A találmány továbbá eljárást biztosít a testfolyadékokban B. burgdorferi antitestek kimutatására.
A fentieknek megfelelően tehát a találmány vakcinakészítményekre vonatkozik, amelyek a következőket tartalmazzák:
a) immunogénként a B. burgdorferi pC egy vagy több szerológiai formáját homogén formában, egy pCvariánst vagy egy pC-utánzót tartalmazó anyag, amelynek szerkezete elegendően hasonló a natív pC szerkezetéhez ahhoz, hogy protektív antitestek termelését indukálja, és
b) egy fiziológiailag elfogadható hordozóanyag, és az immunogén anyag mennyisége olyan, hogy elegendő legyen ahhoz, hogy immunválaszt váltson ki, azaz védőhatású legyen a Lyme borreliosisra érzékeny emlősöknél, ez az érték 1-100 pg dózisonként.
A találmány szerinti vakcinakészítmény egyik előnyös formája a fentiek mellett még adjuvánst is, például alumínium-hidroxidot is tartalmaz.
A találmány szerinti vakcinakészítmény alkalmas Lyme borreliosisra érzékeny emlősök immunizálására, ehhez az emlősöknek a fentiek szerinti immunogénkészítmény immunológiailag hatásos mennyiségét adagoljuk.
A találmány szerinti készítményekhez a B. burgdorferi proteinek tisztítását a következőképpen végezzük:
a) széttördeljük a B. burgdorferi sejtet és a széttört sejtet membrán- és citoplazmakomponensekre frakcionáljuk,
b) az így nyert membránkomponenst egy nem denaturáló detergensben szuszpendáljuk, ily módon egy szolubilizált proteint és egy nem szolubilizált anyagot nyerünk, ebből a szolubilizált proteint elválasztjuk,
c) az ily módon szolubilizált proteint ioncserélő kromatográfiának vetjük alá a proteinfrakció elválasztására, és
d) meghatározzuk a kapott proteinfrakcióból a kívánt protein mennyiségét.
A fentiek szerinti d) pont szerinti lépést adott esetben még hidroxil-apatit-kromatográfiával és/vagy immobilizált fémaffinitásos kromatográfiával is kiegészíthetjük, a kívánt protein betöményítésére és további tisztítására.
A fentiek szerint tisztított készítmény alkalmas B. burgdorferi antitestek diagnosztizálására, kimutatására, ennél a mintát a B. burgdorferi proteint tartalmazó készítménnyel inkubáljuk, majd detektáljuk a megkötött antitestek jelenlétét.
A mellékelt ábrákon a következőket mutatjuk be:
1. ábra: a találmány szerinti eljárással az Orth-1-ről tisztított antigének elektroforetikus analízisének eredménye. A számokhoz tartozó sávok jelentése a következő:
- nagy molekulatömegű standardok; 200, 116,
97,4, 66,2 és 45 kd,
- alacsony molekulatömegű standardok: 45,
31,21,5,14,4 kd
- B. burgdorferi Orth-1 törzs teljes sejtlizátum
- membránfrakció
- detergensszolubilizált frakció az oldhatatlan anyag kicentrifiigálása után
- 94 kd antigén (a 23 és 33 Mab frakciókkal reagál)
- körülbelül 60 kd külső felületi protein
8/9 - két másik protein a 60 kd szakaszból
- ostoros szerkezetű protein
-OspB
- OspA
-pC
- 24 kd protein
HU 219 772 Β
2. ábra: B. burgdorferi sejtek SDS-PAGE képe, tripszinnel inkubálva (2,6 és 10 sávok), proteináz K-val inkubálva (3,7 és 11 sávok) vagy proteázok nélkül (1,5 és 9 sávok), összehasonlítva a tisztított pC-proteinnel (4 és 8 sávok). Az elektroforetikusan elválasz- 5 tott proteineket aurodye-festékkel végzett aranyfestéssel (1-4 sávok), pC-specifikus monoklonális antitesttel végzett Western blotting vizsgálattal (Mab35, 5-8 sávok) és a lipoproteineket fluorografikus szerrel (3Hpalmitinsav-jelzés, 9-11 sávok) jellemeztük. 10
Bár több különböző B. burgdorferi antigént azonosítottak és jellemeztek különböző mértékben, ez ideig nem volt ismert, hogy a pC-proteinek protektív hatásúak Lyme-kórral szemben. E felismerés kulcsa az volt, hogy egy jó protektív hatásosság bizosítása érdeké- 15 ben szükséges, hogy a proteint a lehető legnagyobb mértékben az eredeti felépítésének megfelelő formában tartsuk. Ennek megfelelően az új, találmány szerinti homogén pC-proteinek előállítására vonatkozó eljárásunknál a proteinek natív konfigurációja lényegében érintet- 20 len marad, és ily módon lehetővé válik a pC felhasználása immunogén anyagként Lyme borreliosisszal szemben. Ez a nem denaturáló tisztítási módszer alkalmazható a borrelia antigének előállítására, amely felhasználható a Lyme-kór kimutatására. 25
A nem denaturált pC-protein védőhatása könnyen kimutatható a Gerbillus nemzetséghez tartozó rágcsálókon (továbbiakban versenyegereken), amelyekről eddig még nem ismerték fel, hogy alkalmas kísérleti modell egy adott antigén, így például a pC antigén hatá- 30 sósságának jelzésére, amely antigén védőhatású antitesteket termel a Lyme-kór ellen. Mindazonáltal azt tapasztaltuk, hogy a versenyegerek alkalmasak az ilyen kiértékelésekhez különösen azért, mert a versenyegerek esetében a borreliosis utánozza a humán egyedek- 35 nél végbemenő folyamatokat több szempontból is. így
Met Lys Lys Asn Thr Leu Ser Alá Ile Leu Met 1 ATG AAA AAG AAT ACA TTA AGT GCG ΑΤΑ TTA ATG 21 Asn Ser Gly Lys Gly Gly Asp Ser Alá Ser Th
AAT TCA GGG AAA GGT GGA GAT TCT GCA TCT AC
Pro Asn Leu Thr Glu Ile Ser Lys Lys Ile Th például a versenyegereknél hasonlóan, mint az embereknél
1. a fertőzés multiszisztémás, azaz több szervet érint, így például a bőrt, az ízületeket, az idegrendszert, a lépet, a szívet, a hólyagot és a vesét,
2. a betegség krónikus is lehet. B. burgdorferit a versenyegereknél több mint egy évvel a fertőzés után is kimutattak,
3. az arthritisre emlékeztető ízületek duzzadása a versenyegereknél hasonlóképpen fejlődhet ki, mint humán egyedeknél, és
4. hasonló a humorális immunválasz a válasz specificitását és átmeneti kialakulást illetően. így például felismertük, hogy a fertőzött versenyegerek és a humán egyedek immunológiailag kevésbé vagy egyáltalán nem adnak választ az ospA és ospB proteinekre. Valóban, az egerekkel ellentétben az ospA és ospB antitestek a versenyegereknél és a humán egyedeknél egyaránt ritkák.
Vakcina
A találmány egyik megvalósítási formája szerint Lyme borreliosis elleni vakcinára vonatkozik, amelynek immunogén anyaga B. burgdorferi pC-proteinjét tartalmazza. A pC-protein egy sejtfelületi antigén, mint azt a B. burgdorferi intakt sejteken végzett proteolitikus emésztéssel kimutattuk. Jellemzője továbbá, hogy a molekulatömege 24 kd, bár a különböző törzsekből származó pC-proteinek különböző molekulatömeget és szerológiai heterogenitást mutathatnak. Az ismert hibridomaeljárással 11 monoklonális antitestet (B. burgdorferi antitestek 22, 28, 29, 34-39, 42 és 45) állítottunk elő, amelyek a B. burgdorferi Orth-1 törzshöz és több más törzsekhez is kötődnek.
A protektív vizsgálatok során alkalmazott B. burgdorferi pC-proteinek teljes DNS-szekvenciája és ebből származtatott aminosavszekvencia a következő:
Thr Leu Phe Leu Phe Ile Ser Cys Asn 2 ACT TTA TTT TTA TTT ATA TCT TGT AAT 6 r Asn Pro Alá Asp Glu Ser Alá Lys Gly 4
T AAT CCT GCT GAC GAG TCT GCG AAA GGA 12 r Asp Ser Asn Alá Phe Val Leu Alá Val 6
121 CCT AAT CTT ACA GAA ATA AGC AAA AAA ATT ACA GAT TCT AAT GCA TTT GTA CTG GCT GTT 18
61 Lys Glu Val Glu Thr Leu Val Ser Ser Ile Asp Glu Leu Alá Thr Lys Alá Ile Gly Lys ! 8
181 AAA GAA GTT GAG ACT TTG GTT TCA TCT ATA GAT GAA CTT GCT ACT AAA GCT ATT GGT AAA 24
81 Lys i Ile Gin Gin Asn Asn Gly Leu Gly Alá Asn Alá Asp Lys Asn Gly Ser Leu Leu Alá 10
241 AAA ATA CAA CAA AAT AAT GGT TTA GGC GCC AAT GCG GAT AAA AAC GGA TCA TTG TTA GCA 30
101 Gly Alá Tyr Alá Ile Ser Thr Leu Ile Thr Glu Lys Leu Lys Alá Leu Lys Asn Ser Gly 12
301 GGA GCT TAT GCA ATA TCA ACC CTA ATA ACA GAA AAA TTA AAG GCA TTG AAA AAT TCA GGA 36
121 Glu Leu Lys Alá Lys Ile Glu Asp Alá Lys Lys Cys Ser Glu Asp Phe Thr Lys Lys Leu 14
361 GAA TTA AAG GCA AAA ATT GAA GAT GCT AAG AAA TGT TCT GAA GAT TTT ACT AAA AAA CTA 42
141 Al a Alá Gly His Alá Gin Leu Gly Ile Asp Gly Alá Thr Asp Asn Asp Ser Lys Glu Alá 16
421 GCT GCT GGG CAT GCA CAG CTT GGT ATA GAC GGA GCT ACT GAT AAT GAT TCA AAA GAA GCA 48
161 Ile Leu Lys Thr Asn Gly Thr Lys Thr Lys Gly Alá Glu Glu Leu Val Lys Leu Ser Glu 18
481 ATT TTG AAA ACA AAT GGG ACT AAA ACT AAG GGT GCT GAA GAA CTT GTA AAG TTA TCT GAA 54
181 Ser Val Alá Ser Leu Ser Lys Alá Alá Gin Glu Alá Ser Alá Asn Ser Val Lys Glu Leu 20
541 TCA GTA GCA AGC TTG TCA AAA GCG GCT CAA GAA GCA TCA GCT AAT TCA GTT AAA GAG CTT 60
201 Thr Ser Pro Val Val Alá Glu Thr Pro Lys Lys Pro ***
601 ACA AGT CCT GTT GTA GCA GAA ACT CCA AAA AAA CCT TAA
HU 219 772 Β
A találmány értelmében a pC-protein különböző szerológiai formájú, természetes előfordulású pC-proteinek keverékét is tartalmazhatja. Továbbá a B. burgdorferi sejtekből nyert pC-proteineken túlmenően rekombináns pC, a természetben előforduló molekulák variánsai (pC-variánsok) és utánzó molekulák - olyan vegyületek, amelyek a pC epitópokat utánzó mimotópokkal rendelkeznek - szintén alkalmazhatók.
A pC-variánsok közé tartoznak például olyan oligopeptidek és polipeptidek, amelyek a pC molekula immunogén részének, vagy bármely nem proteinszerű immunogén részének felel meg. így például a variánsok közé tartoznak az olyan polipeptidek is, amelyek homológok és rendelkeznek a természetes pC molekula immunológiai jellemzőivel, azaz immunológiai ekvivalensek. Ebben a vonatkozásban homológnak nevezünk két olyan szekvenciát is, amelynél az azonosságon kívül arra is következtetni lehet, hogy az egyik a másiknak származéka. így például egy polipeptid a pC-proteinnal homológ, ha az olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely megfelel egy, a pC-specifikus antitestek vagy T-sejtek által felismert epitópnak. Az ilyen aminosavszekvencia állhat csupán néhány aminosavból, lehet egy lineáris determináns vagy egy olyan, amely úgy képződik, hogy a lineáris szakaszból elválasztott aminosavakat térbelileg a protein csuklórészei után helyezzük vagy azokat kovalens kötéssel kötjük. Az aminosavszekvenciákat - amelyek a találmány céljára antigéndeterminánsok - például a szakterületen ismert monoklonális térképezési analízissel határozhatjuk meg [lásd például Regenmortel, Immunology Today 10: 266-72 (1989), és Berzofsky és munkatársai, Immunological Reviews 98: 9-52 (1987)]. Az ilyen típusú hasonlóságot kimutathatjuk még a kompetitív-inhibíciós vizsgálattal is, antitestek esetében vagy T-sejt-proliferációval is.
Az ezen kritériumoknak megfelelő pC-variánsokat például az ismert reverz genetikai eljárással állítjuk elő, azaz úgy, hogy egy aminosavszekvenciára alapozva megtervezünk egy genetikai szekvenciát, vagy például az ismert genetikai összevágási eljárást alkalmazzuk, így például egy pC-variánst előállíthatunk helyspecifikus mutagenezissel vagy oligonukleotid-irányított mutagenezissel [lásd például Mutagenesis of Cloned DNA, Current Protocols in Molecular Biology 8.0.3tól, Ausubel és munkatársai, 1989, („Ausubel”)].
A találmány oltalmi körébe tartozó más pC-variánsok olyan molekulák, amelyek megfelelnek a pC egy részének vagy a pC egy részét tartalmazzák, de nem azonosak a természetes molekulával és amelyek a pC immunogén aktivitását mutatják akár önmagukban, akár valamely hordozóanyaghoz kötve. Az ilyen pC-variáns lehet a természetes molekula egy adott fragmense, vagy egy de novo vagy rekombináns úton szintetizált polipeptid.
Ahhoz, hogy a pC vagy pC-variáns rekombináns expressziójához alkalmazható legyen, egy, az ezt kódoló polinukleotidmolekula előnyösen olyan nukleotidszekvenciát kell hogy tartalmazzon, amely megfelel a kívánt aminosavszekvenciának, azaz optimalizálva kell hogy legyen a kiválasztott gazdaorganizmushoz, a kodonkészlet, a transzláció kezdése és az iparilag hasznosítható pC vagy pC-variáns mennyisége szempontjából. Tehát a vektornak, amelyet a választott gazdaorganizmusnak egy ilyen polinukleotiddal való transzformáláshoz alkalmazunk, biztosítani kell a polipeptidet kódoló szekvencia fenntartását és transzkripcióját. A kódoló polinukleotidmolekula kódolhatja a kiméra proteint, azaz tartalmazhat egy, a pC-molekula immunológ részét kódoló nukleotidszekvenciát a nem pC részt kódoló szekvenciához kapcsolva, így például tartalmazhatja a gazdasejt szignálpeptidjét.
Annak érdekében, hogy a pC-molekulát kódoló DNS-szegmenst izoláljuk, ismert módszerek szerint előállíthatjuk a teljes B. burgdorferi DNS-t [Manitas és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, NY 1982); Baess, Acta Pathol. Microbiol. Scand. (Sect. B) 82: 780-84 (1974)], majd a kapott DNS-t részlegesen egy restrikciós enzimmel emésztjük a genomfragmensek többé-kevésbé random eloszlású készletének előállítása szempontjából. Erre a célra például tetranukleotidhelyet felismerő enzimet, így például Sau3A (Mbol) enzimet alkalmazhatunk. Az így végzett részleges emésztés után nyert fragmenseket ezután méret szerint frakcionáljuk, például szacharózgradiens-centrifúgálással, (lásd például a fenti Maniatis-hivatkozást) vagy pulzáló gélelektroforézissel (lásd Anad, Trends in Genetics, 1986. november, 278-83), amikor is a pC-molekulát kódoló DNS-nek megfelelő hosszúságú fragmenst nyerjük.
Ismert módszerek szerint eljárva (lásd például a fenti Ausubel-hivatkozás 5. 0.1-tői kezdődő részét) az így nyert fragmenst ezután alkalmas klónozóvektorba klónozzuk, például a kapott DNS-t a pUC18 vektor BamHl helyére inszertáljuk. A kiméra plazmidokat vagy fágot, amelyeket a méret szerint kiválasztott ffagmensnek a klónozóvektorhoz való kapcsolásával nyertünk ezután például E. coliba vagy más gazdasejtbe transzformálhatunk, amelyeket ezután a kódolt protein expressziója céljából osztályozunk. A készlet kiválasztására, amely a pC-géneket tartalmazó kiónokat tartalmazza, különböző módszereket alkalmazhatunk. Ezek közé tartozik például a pC-re specifikus hibridizációs mintával, így például egy oligonukleotid-mintával való osztályozás vagy egy pC-specifikus immunológ reagens alkalmazásával a pC-antigén-expresszióra végzett osztályozás. Ez utóbbit például úgy végezzük, hogy a készletet immunoblottingoljuk anti-pC monoklonális antitestekkel vagy tisztított pC-vel immunizált állatokból nyert specifikus poliklonális antitesttel. Ha a készletben a pC-t kódoló DNS-t tartalmazó kiónt azonosítottuk, a DNS-t izolálhatjuk, a pC-proteint kódoló szakasz jellemezve van (a szekvenálással), majd ezt követően a DNS-t alkalmazhatjuk a pC-aktív protein előállításához alkalmas pC expressziós vektor előállítására.
Mint azt már a fentiekben is említettük, a hatásos immunogén előállításához szükséges, hogy a rekombináns úton expresszált pC-protein szerkezete jelentős mértékben hasonló kell hogy legyen a natív (nem denaturált) pC szerkezetéhez, azért hogy a protein a protek5
HU 219 772 Β tív hatású antitestek képződését kiváltsa. Ezért előnyös a pC-t kódoló DNS-t úgy expresszálni, hogy az expresszált tennék intracelluláris proteolízise és aggregációja - denaturált formában - elkerülhető legyen. Az egyik lehetőség ennek megvalósítására, hogy a pC-t rekombináns úton álltjuk elő egy gazdavektorrendszerben, ami gondoskodik arról, hogy a pC a sejtből választódjon ki, előnyösen közvetlenül a tápközegbe. Egy ilyen rendszert biztosít például a Bacillus subtilis. Alkalmas szekréciós vektort szerkeszthetünk Bacillus subtilisból például úgy, hogy a B. amyloliquefaciens aamiláz szignálszekvenciáját [Young és munkatársai, Nucleic Acid. Rés. 11: 237-49 (1983)] a Bacillus pUBllO plazmidvektorhoz kapcsoljuk ismert módon [Ulmanen és munkatársai, J. Bacteriol. 162: 176-82 (1985)]. E szerint a megoldás szerint az idegen proteint kódoló szekvencia a promotertől, a riboszómakötési helytől és az α-amiláz szignálszekvenciájától lefelé helyezkedik el. A pC transzkripciója és transzlációja ebben a konstrukcióban az α-amiláz-promoter és a transzlációs mechanizmus kontrollja alatt van, és a pC-nek a gazdasejtből való szekrécióját az α-amiláz szignálszekvenciája biztosítja. Hasonló vektorokat ismertetnek élesztőben való alkalmazáshoz is, amikor a pC expressziós szekrécióját lehet biztosítani élesztőből.
Egy másik lehetőség a pC expressziójára a gazdavektorrendszerben a proteolízis, aggregáció és denaturálás kiküszöbölésével, a vacciniavírus alkalmazása vektorként, amely képes expresszióra különböző, a vakcinával való fertőzésre érzékeny emlősgazdasejtben. Ez a megoldás együtt jár azzal, hogy rekombináns vacciniavírusból származó vektort állítunk elő, amelyben a pCgént a transzlációs és szekréciós szignálokkal együtt a promoter kontrollja alá helyezzük, amely alkalmas a pC-protein expressziójára a vacciniával fertőzött gazdában. Mint azt 4 603 112 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban említik, a plazmid tartalmazhat az 5’-véggel a transzkripciós kontrollszakasz felé és a 3’-véggel a poliadenilezőszignálok 3’-vége felé elhelyezkedő határoló- (flanking) szekvenciát, amely segíti a vad típusú vacciniagenomokba való homológ rekombinációt. Ha az ilyen típusú konstrukciót a vacciniával fertőzött gazdasejtbe vezetjük, a határolószekvenciák direkt rekombinációja a plazmid és a vacciniavírus között azt eredményezi, hogy a klónozott szerkezeti szekvencia (itt a kódoló pC) annak részévé válik, a vacciniavírussal együtt szaporodik és expresszálódik. Előnyösen a határolószekvenciák közötti szakaszok szintén tartalmaznak szelektálható markert, olyat, hogy a szelekciós közeg jelenlétében csak a rekombináns vacciniavírust (és jelen esetben még a pC-aktív polipeptidet kódoló szekvenciát) tartalmazó sejtek maradnak meg.
Az ily módon nyert rekombináns vacciniatörzs alkalmazható emlőssejtek fertőzésére, így például a Vero-sejtek vagy CV1 sejtek fertőzésére alkalmasak nagy sűrűségű fermentációs szaporításra. A pC-aktív protein, amely a fermentáció alatt ezen sejtekben expresszálódik, a fermentációs közegbe válik ki, és abból ismert módszerekkel kinyerhető.
A természetes pC és pC-variánsok mellett a találmány vonatkozik azon vegyületekre is, amelyek utánozzák a pC-epitópokat („mimotópok”). Ezen vegyületek egyik típusa egy antiidiotípusú antitest, amely úgy képződik, hogy egy állatot olyan antitesttel immunizálunk, amely specifikusan kötődik egy antigénen lévő epitóphoz. Az antiidiotípusú antitest felismeri és illeszkedik az első antitest kapcsolási helyéhez. Ily módon a kapcsolási helyének formája szorosan egyezik az epitópéval, amely beleillik az első antitest kapcsolási helyébe. Miután egy antiidiotípusú antitest olyan kapcsolási hellyel rendelkezik, amelynek formája utánozza az eredeti antigént, alkalmazható vakcinaként olyan antitestek kialakítására, amelyek az eredeti antigénnel reagálni képesek [Fineberg & Érti, CRC Critical Reviewa in Immunology 7: 269-284 (1987)]. A megfelelő „utánzó” vegyületeket pC-antitestekkel végzett vizsgálattal azonosíthatjuk, amikor is kimutathatók azok az antitestek, amelyek kötődnek hozzájuk vagy amelyek molekuláris modellezéssel előállíthatok.
A találmány szerinti vakcinák alkalmasak érzékeny emlősök, beleértve a humán egyedeket is, immunizálására Lyme-kór ellen. Az „immunogén” kifejezés olyan antigént jelent, amely specifikus immunválaszt vált ki, amely Immorális vagy sejtközvetített immunitáshoz vezet, jelen esetben Borrelia-fertőzésekkel szemben. Az „immunitás” tehát azt jelenti, hogy az egyed képes ellenállni a fertőzésnek vagy képes könnyebben legyőzni azt vagy klinikai befolyásolás nélkül tolerálni, a nem immunizált egyedekhez képest.
A találmány szerinti immunogén tartalmazhat még fiziológiailag elfogadható hordozóanyagot is. Ezen hordozóanyagok ismertek és magukban foglalják például a makromolekulákat is. Példaképpen említjük például a következőket: tuberkulin PPD, szarvasmarha-szérumalbumin, tojásfehéije-albumin vagy keyhole limpet hemocianin. A hordozóanyag előnyösen nem toxikus és nem allergén.
A találmány szerinti immunogén tartalmazhat továbbá még adjuvánst is, így például valamely alumíniumvegyületet, vizet, növényi vagy ásványi eredetű olajos emulziót (például Freund-féle adjuvánst), liposzómákat, ISCOM-ot (immunstimuláló komplex), vízben oldható üvegeket, polianionokat (például poli A:U, dextrán-szulfát, lentinan), nem toxikus lipopoliszacharid-analógokat, muramil-dipeptidet, immunmoduláló anyagokat (például interleukin-1 vagy -2) vagy ezek kombinációját. Előnyös adjuváns az alumínium-hidroxid. Az immunogenitás tovább növelhető például olyan emlősök esetében, amelyek élő, gyengített bakteriális vektorokat, amelyek képesek a pC-aktív polipeptidek expresszálására, így például Salmonellea vagy Mycobacteria vektorokat vagy virális vektorokat, így például vacciniavektorokat kaptak.
A találmány szerinti immunogének kiszerelését a szakterületen ismert módszerekkel végezzük. így például az immunogéneket liofilizálhatjuk, majd ezt követően rehidratálhatjuk megfelelő hordozóanyagban, így például sóoldatban vagy más fiziológiás oldatban. Az immunogéneket úgy állítjuk elő, hogy a pC immunoló6
HU 219 772 Β giailag aktív mennyiségét elkeveijük olyan mennyiségű hordozóanyaggal, hogy a kívánt koncentrációt kapjuk. Az immunológiailag hatásos komponens mennyisége a vakcinában függ az immunizálni kívánt emlőstől, annak korától, tömegétől, valamint a vakcinában jelen lévő immunogén anyag immunogenitásától. Az immunogén anyag mennyisége a vakcinában általában 1 és 100 pg, előnyösen 10 és 50 pg közötti mennyiség dózisonként.
A találmány szerinti immunogén egy másik megvalósítási formája pC-t, egy pC-variánst vagy pC-utánzót és egy vagy több más B. burgdorferi antigént tartalmaz.
A találmány szerinti vakcinák előállítását úgy végezzük, hogy biztosítva legyen az adott molekula azonossága és hatásossága és az előállítás alatt nemkívánatos mikrobás szennyezést ne vigyünk be. A kapott terméket aszeptikus körülmények között tartjuk és forgalmazzuk.
Az emlősök immunizálását Lyme-kór ellen úgy végezzük, hogy az emlősöknek a találmány szerinti immunogén hatásos mennyiségét adagoljuk. Az adagolást bármely ismert eljárással végezhetjük. így például alkalmas módszer, ha a vakcinát az emlősöknek, amelyekről ismert, hogy B. burgdorferit hordozó kullancsok csípésének vannak kitéve, körülbelül 6 hónaptól 1 évig terjedő idővel a várt fertőzést megelőzően adagoljuk. Bármilyen immunizációs mód, amely várhatóan a kívánt immunválaszt kiváltja, alkalmazható. Bár a parenterális módszer előnyös, bármely következő adagolási mód alkalmazható még: szubkután, intrakután vagy intramuszkuláris injekciók vagy orális, nazális vagy rektális adagolás.
Kinyerési eljárás
A találmány megvalósításához egy új, nem denaturáló eljárást alkalmazunk a különböző B. burgdorferi antigének kinyerésére a különböző B. burgdorferi törzsekből. Ezen antigének például a következők: ospA, ospB, pC, az ostoros szerkezetű proteinek, valamint a körülbelül 21 kd, 56 kd, 60 kd és 63 kd molekulatömegű proteinek. Ezen új eljárás jobb mint az ismert eljárások, amelyek alkalmazásánál vagy denaturálódás lép fel, vagy csak néhány antigénre specifikusak vagy csak részleges kinyerést lehet velük elérni. Az előnyös eljárás a következő lépésekből áll:
a) a B. burgdorferi sejteket összetörjük és centrifugálással „membrán” és „citoplazma” komponensekre frakcionáljuk;
b) a membránfrakciót egy nem denaturáló detergenssel extraháljuk, majd centrifugáljuk, amikor is szolubilizált proteint nyerünk, majd az oldhatatlan anyagot pellet formájában eltávolítjuk, és
c) a szolubilizált antigéneket ioncserés kromatográfiával (dietil-amino-etil, DEAE) frakcionáljuk, és az adszorbeált antigéneket NaCl-gradienssel eluáljuk.
A találmány szerinti eljárás tartalmazhat még egy betöményítési lépést és egy további tisztítási lépést is az alábbiak szerint:
a) hidroxil-apatit-kromatográfiát végzünk, majd az adszorbeált antigéneket a pufferoldat foszfáttartalmának növelésével eluáljuk, és/vagy
b) immobilizált fémaffinitásos kromatográfiát végzünk, majd az adszorbeált antigéneket imidazollal eluáljuk.
Más ismert elúciós módszerek is alkalmazhatók, így például pH-csökkentéssel végzett eluálás vagy az ammónium-klorid, hisztidin vagy más kelátképzésbe vitt fémhez affinitással bíró anyag koncentrációjának növelése.
A sejtek összezúzását például a sejtek lizálásával végezzük, amikor is a sejteket sejtszuszpenzió formájában sejtmalomban apró üveggyöngyökkel rázzuk vagy ultrahanggal vagy franciaprésben kezeljük. Eljárhatunk úgy is, hogy az antigéneket közvetlenül a sejtfelületről extraháljuk valamely detergens alkalmazásával úgy, hogy változtatjuk a sejtkömyezet pH-jának erősségét vagy enyhén eltoljuk a hőmérsékletet. Eljárhatunk még úgy is, hogy közvetlenül a sejtektől elválasztott membrángyöngyöket alkalmazunk.
A membránfrakció extrahálását előnyösen olyan detergenssel végezzük, amely jó oldóképességű, nem denaturáló hatású és az ioncserés kromatográfiával kompatibilis. Előnyösen a Calbiochem ikerionos detergens 3-14 jelű készítményét alkalmazzuk, bár bármilyen más ismert detergens és szerves oldószer is alkalmazható, amely a fenti tulajdonságokkal rendelkezik. A detergenst általában 1 tömeg/térfogat%-ban alkalmazzuk, de hatásos 0,01-10 tömeg/térfogat%-ban is. Az extrakciót általában 0 és 60 °C közötti hőmérsékleten, előnyösen 37 °C hőmérsékleten végezzük 10 perc és 8 óra közötti ideig, előnyösen 1 órán át. A detergens mellett még valamely kaotropikus anyagot, előnyösen például karbamidot is alkalmazhatunk a szolubilizálási folyamat elősegítése érdekében.
A detergenssel szolubilizált antigéneket ezután DEAE-kromatográfiával frakcionáljuk. Előnyösen DEAE-ioncserélő gyantát alkalmazunk, de más egyéb anionos vagy kationos gyanta is felhasználható helyette vagy azzal kombináltan. A találmány értelmében az ioncserélő gyanta egy oldhatatlan mátrixot tartalmaz, amelyhez töltéssel rendelkező csoportok kapcsolódnak. Anioncserélő gyanták esetében a funkcionális csoport lehet például amino-etil-(AE), dietil-amino-etil-(DEAE) vagy kvatemer amino-etil-(QAE) csoport. Kationcserélők esetében a funkcionális csoport lehet például karboxi-metil-(CM), foszfo- vagy szulfo-propil- (SP) csoport. A mintát általában ikerionos detergens 3- 14-et tartalmazó trisz-pufferral visszük fel az oszlopra (1%) és az antigéneket NaCl-gradienssel eluáljuk, más készítmények hasonlóképpen alkalmazhatók.
Az antigének betöményítését végezhetjük például úgy, hogy ismert módon hidroxil-apatiton kötjük. Más módszer szerint vagy kiegészítésképpen eljárhatunk úgy is, hogy az antigéneket immobilizált fémaffinitásos kromatográfiával koncentráljuk/kinyerjük. Ez utóbbi módszer előnyösebb a hidroxil-apatit-módszerhez viszonyítva a pC tisztítására, mivel az ospA-tól és ospBtől jobb elválasztást eredményez.
A fentiek szerinti nem denaturáló elválasztási módszer előnye, hogy a protein 3-D-konfigurációja megmarad és így a natív protein összes antigénmegkötő helye
HU 219 772 Β
- beleértve a protektív folyamatban részt vevőket is megmarad. Ha a protein denaturálódik, a kötési helyek részben vagy teljesen szétroncsolódnak és az antigén azon képessége, hogy antitesteket indukáljon, ennek megfelelően elveszik. így, az ily módon kapott proteinek nem alkalmasak vakcinákban való felhasználásra.
A találmány szerinti kinyerési módszer előnye például az ismert Johnson-féle (1988) teljessejt-módszerrel szemben, hogy homogén, toxikus komponensektől mentes proteint lehet vele nyerni, és ily módon csökkenthető a káros reakciók valószínűsége. Ebben az értelemben a „homogén” kifejezés azt jelenti, hogy a kapott protein legalább 80 tömeg/térfogat%-a teljesen intakt pC és közel az összes fennmaradó rész ennek fragmense. Ily módon bármilyen, a közeget szennyező anyag vagy más Borrelia protein, ha egyáltalán van, csak nyomokban lehet jelen.
Ily módon a találmány szerinti eljárással lehetővé válik nemkívánatos, potenciálisan immunogén proteinek eltávolítása, amelyek autoantitesteket indukálhatnának és így káros autoimmunreakciókat válthatnának ki az emlősökben. A találmány szerinti eljárással ugyancsak lehetővé válik a reprodukálhatóság megvalósítása a vakcinák előállítása során.
Védőhatás
Felismerésünk alapján, hogy a versenyegerek igen alkalmas kísérleti állatok, vizsgálatokat végeztünk arra vonatkozóan, hogy a B. burgdorferi vei szemben immunitás biztosítható. Ezeket a kísérleteket részletesen a 3. példában ismertetjük. Bár az ospA, ospB, pC, 63 kd külső felületi proteint, a 21 kd és 94 kd proteineket (B. burgdorferi Orth-1 törzs) mind vizsgáltuk, szignifikáns védőhatást csak a pC-protein mutatott.
Kimutatási módszer
Az előzőek szerint előállított antigének alkalmasak diagnosztikai célokra is, így például arra, hogy emlősök testnedveiben a B. burgdorferi elleni antitestek jelenlétét kimutassuk. így például a fentiek szerinti eljárással nyert, homogén, nem denaturált proteint testnedvvel inkubálhatjuk és így kimutatható a megkötött antitest jelenléte. A „testnedv” lehet például agy-gerincvelő folyadék, ízületi nedv, vizelet, vér, szérum, sperma vagy nyál. Az ilyen vizsgálatok, bár a szakterületen jól ismertek, a találmány szerinti eljárással nyert antigének alkalmazásával igen nagy érzékenységgel és specifitással végezhetők.
A találmányt közelebbről a következő nem korlátozó példákkal illusztráljuk.
1. példa
Proteinkinyerés
Membránfrakció készítése
Borrelia burgdorferi sejteket (Molecular Microbiol. 1995, 18: 257-269,1. táblázat) gyűjtünk össze centrifugálással (7000 g, 20 perc, 4 °C), a sejtpelletet kétszer PBS 5 mM MgCl2-oldattal mossuk, és a sejtszáraztömeget meghatározzuk. A mosott sejteket ezután 100 mM trisz-HCl pufferban szuszpendáljuk, (pH 7,5, 1 g sejt:2 ml puffer) a szuszpenzióhoz üveggyöngyöt adagolunk (0,17-0,18 mm átmérő, 5 g gyöngy 1 g sejtpasztára) egy fémedényben, majd a sejteket a keverék Vibrogén sejtmalomban való rázással lizáljuk (Model V14, Bühler). 3 perces rázási és hűtési (4 °C) ciklusokat végzünk, amíg a lízis nagyobb mint 99%-ban végbemegy, amit sötét mezős mikroszkópiával határozunk meg. A lizátumot ezután színtereit üvegszűrőn szüljük az üveggyöngyök eltávolítására, a visszamaradó gyöngyöket mossuk, a szűrletben a baktériumok kihozatalának növelésére.
A lizátumot ezután 20 percig 7500 g mellett 4 °C-on centrifugáljuk, így nyerjük a nyerspelletet („lsp” low speed pellet). A felülúszót ezután tovább centrifugáljuk 30 percig 100 000 g mellett 4 °C-on így egy második membránfrakciót nyerünk („hsp” high speed pellet). Mindkét frakciót kétszer 100 mmol-os trisz-HCl puffénál (pH 7,5) mossuk az eredeti centrifugálási körülmények között. Bármelyik membránfrakció alkalmazható kiindulási anyagként a pC (vagy más membránantigén) kinyeréséhez, de a hsp frakció kevesebb szennyezett proteint tartalmaz.
A membránok detergenssel végzett extrakciója
A membránokat 10 mM trisz-HCl pufferban (pH 7,5) 10 mg protein/ml mennyiségben szuszpendáljuk, amely puffer még 1 tömeg/térfogat%-ban ikerionos detergens 3-14-et (Serva) is tartalmaz. 1 órás, 37 °Con végzett inkubálás után az oldhatatlan anyagot kicentrifugáljuk (100 000 g, 60 perc, 4 °C).
DEAE ioncserés kromatográfia
A detergenssel szolubilizált antigéneket az alábbiak szerint DEAE-kromatográfiával frakcionáljuk:
oszlop: Protein-PÁKDEAE 5PW szemipreparatív oszlop (21,5 mm átmérő, 150 mm hossz), Waters gyártmány;
minta: 20 ml (4 χ 5 ml) detergenssel szolubilizált készítmény (10 mg/ml); áramlási sebesség: 4 ml/perc; puffer A: 10 mM trisz-HCl, pH 7,5/1 tömeg/térfogat% ikerionos 3-14; puffer Β: A +1 M NaCl;
gradiens: 0% B 35 percig, 0-30% B 90 percig,
30-65% B 45 percig, 65-100% B 10 percig.
Az oszlopot A pufferral kiegyensúlyozzuk, és az antigéneket növekvő mennyiségű NaCl-dal eluáljuk. A kívánt antigéneket tartalmazó frakciók azonosítására 8 ml alikvot részt acetonnal kicsapunk és a pelleteket SDS-PAGE- vagy immunblotmódszerrel analizáljuk.
Hidroxil-apatit-kromatográfia
A kívánt antigénben, így például pC-ben gazdag frakciókat összegyűjtjük, C pufferral dializáljuk, majd hidroxil-apatit-oszlopra visszük. A kötött antigént növekvő mennyiségű foszfátionnal, így például D pufferral eluáljuk. Ily módon a hígított antigénoldatokat betöményíthetjük, és további tisztítást érhetünk el. A művelet paraméterei a következők:
oszlop: Bio-gel HPHT oszlop (7,8 mm átmérő,
100 mm hossz), Bio-Rad gyártmány; minta: előző lépésnél nyert pC-tartalmú frakciók egyesítve (például 20-22 frakciók C pufferral szembeni dialízis után, 4x5 ml);
HU 219 772 Β puffer C: 10 mM MOPS-NaOH (3-N-morfolino-propánszulfonsav), pH 6,8/1 mM Na(P04)3 * * *~/0,01 mmol CaCl2/l tömeg/térfogat% ikerionos 3-14; puffer D: puffer C+400 ml Na(PO4)3; gradiens: 0% D 60 percig, 0-100% D 20 percig.
A frakciók analízisét az ioncserés kromatográfiánál leírtak szerint végezzük.
Immobilizált fémaffinitásos kromatográfia
A DEAE ioncserés kromatográfiánál nyert, a kívánt antigénben, így például pC-ben gazdag frakciókat egyesítjük és a koncentrációt puffénál beállítjuk (például az ioncserés kromatográfiánál nyert, pC-tartalmú frakciókhoz 150 mmol végkoncentrációban NaCl-ot adagolunk). A szűrt antigénoldatot (0,2 pm) az oszlopra visszük, amelyet előzőleg, a gyártó cég által előírt módon Cu++val telítettünk és A pufferral kiegyensúlyoztunk, majd az oszlopot A pufferral mossuk, és a megkötött antigéneket imidazolt tartalmazó B pufferral eluáljuk. Ily módon a hígított antigénoldat betöményíthető, és további tisztítás érhető el.
A művelet paraméterei a következők oszlop: Chelating Superose HR 16/5 oszlop (16 mm átmérő, 50 mm hossz) Pharmacia/LKB gyártmány; minta: a DEAE kromatográfiás egyesített frakciók, adagolt NaCl-dal (150 mmol);
puffer A: 20 mM trisz/acetát pH 7,5/150 mM
NaCl/1 tömeg/térfogat% ikerionos detergens 3-14; puffer B 20 mM trisz/acetát, pH 7,0/150 mM NaCl/1 tömeg/térfogat% ikerionos detergens 3-14/50 mM imidazol; áramlási sebesség: 2 ml/perc;
gradiens: A 30 percig, 0-100% B 40 percig.
A pC-tartalmú frakciók azonosítását az ioncserés kromatográfiánál leírtak szerint végezzük.
2. példa
A kinyerési eljárás eredményei
A fentiekben ismertetett eljárással az alábbi antigéneket nyertük (lásd még 1. ábra) kd külső felületi protein (sáv 7), kd protein (sáv 8), kd protein (sáv 9), ostoros szerkezetű protein (sáv 10), ospB (sáv 11), ospA (sáv 12), kd protein (sáv 14) és pC (sáv 13).
A tisztítási eljárás első három lépése azonos volt függetlenül a tisztítani kívánt proteintől, bár szükség esetén módosítások végezhetők az elválasztás optimalizálása érdekében. A hidroxil-apatit-kromatográfiás tisztítási/betöményítési lépés igen jól alkalmazható a pCprotein esetében, mivel gyakorlatilag az összes kívánt protein kötődik a hidroxil-apatithoz a C pufferban.
3. példa
Védőhatás vizsgálata
Miután az aktív fertőzéssel szerzett immunitás általában felülmúlja a vakcinálással szerzett immunitást, versenyegérből álló csoportot intraperitoneálisan
2xl07 virulens B. burgdorferi Orth-1 törzzsel (Molecular Microbiol., 1995,18: 257-269,1. táblázat) megfertőzünk, annak érdekében, hogy kimutassuk, hogy a Lyme borreliosis elleni védettség elérése megvalósítható. A dózist visszamenőleg becsültük meg és körülbelül megfelel azon a mennyiség ΙΟΟΟχ-esének, amely az állatok 50%-ának fertőzéséhez szükséges. Három héttel később az állatokat antibiotikummal kezeltük egy héten át a fertőzés tisztázására. 17 nappal később, ami elegendő idő az antibiotikum kitisztulására, az állatokat ismételten megfertőztük a fentiek szerint. Két hét elteltével az állatokat leöltük, a hólyagot, a lépet, a vesét és a szívet tenyésztettük. Mindegyik állat védett volt olyan értelemben, hogy a B. burgdorferi nem mutatható ki egyik szervben sem 8 hetes folyamatos megfigyelés alatt sem. Ezzel szemben, 80%-a a kontroliegereknek, amelyek nem kapták a kezdeti „immunizálófertőzést”, megfertőződött. A teljes összehasonlíthatóság érdekében a kontrollállatokat is kezeltük antibiotikummal. Ez igazolta, hogy a védettség a vizsgálati állatoknál a szerzett immunitásnak és nem a szövetekben lévő antibiotikumnak volt köszönhető.
A következő kísérleti szériában a találmány szerinti eljárással B. burgdorferiből nyert antigének védőképességét értékeltük. A versenyegereket kétszer intraperitoneálisan immunizáltuk kéthetes időközzel, amihez 10 pg mennyiségű alumínium-hidroxiddal adjuvált antigént alkalmaztunk. Két héttel az immunizálás után az állatokat intraperitoneálisan megfertőztük a nem immunizált kontrollcsoporttal együtt, 2 χ 107 virulens B. burgdorferi Orth-1 törzzsel. Két hét elteltével az állatokat leöltük és a hólyagot, lépet, vesét, szívet spirochetára tenyésztettük. A tenyészeteket 8 héten át figyeltük.
Mind az ospA, ospB, pC és 63 kd felületproteineket (mindegyik az Orth-1 törzsből) vizsgáltuk. Csak a pCproteinnal immunizált állatoknál volt azonban kifejezett védőhatás kimutatható. Bár abszolút védettség nem volt kimutatható, komoly fertőzés egyik szervben sem keletkezett. Az immunizált állatok szív- és vesetenyészete negatív volt B. burgdorferire, míg a kontrollállatoknál 50%-os volt a fertőzöttség. Hasonlóképpen megfeleződött a fertőzöttség a lépnél, ahol a kontroll esetében ez 70% volt. Csupán a legérzékenyebb szervnél, a hólyagnál nem volt kimutatható észrevehető változás a tenyésztett kultúrák számában. Az ospA, ospB és 63 kd fehérjék, teljesen hatástalanok voltak. A kapott eredményeket a következő táblázatban foglaljuk össze.
1. táblázat
Példa Immunogén Fertőzött egerek száma/vizsgált egerek száma
Immunizált Kontroll1
25. Élő baktérium2 0/10 4/5
20. Megölt baktérium3 6/10 10/10
23. Megölt baktérium3 7/8 10/10
30. Megölt baktérium3 8/9 10/10
21/27 30/30
HU 219 772 Β
1. táblázat (folytatás)
Példa Immunogén Fertőzött egerek száma/vizsgált egerek száma
Immunizált Kontroll1
33. pC-protein 8/9 10/10
37. ospB 10/10 9/9
38. 63 kd osp 10/10 9/9
41. ospA 10/10 10/10
1 Kontroll vagy nem immunizált versenyegerek 2 Fertőzés élő B. burgdorferivel, kezelés antibiotikummal, majd ismételt fertőzés a védőhatás elérésére, azaz „természetes immunitás” 3 Formaiinnal elpusztított B. burgdorferi (25 pg dózis 2 χ, a proteinra számolva)
A következő kísérletet az előzőekben leírtak szerint végeztük, azzal az eltéréssel, hogy a fertőzést 104 * 6 dózissal végeztük. Az immunizálással a pC-protein kétségtelen védőhatást biztosított. Ugyanakkor nem volt kimutatható ez a hatás az ospA, 21 kd és 94 kd proteinekkel. Mint az a következő 2. táblázatból látható, az összes, pC-vel immunizált egér esetében kimutatható a védettség, míg az ospA, 21 kd vagy 94 kd proteinek esetében nem.
2. táblázat
Példa Immunogén Fertőzött egerek száma/vizsgált egerek száma
Immunizált Kontroll1
46. pC-protein 0/10 9/10
94 kd protein 8/9
47. ospA 10/10 10/10
21 kd protein 10/10
1 Kontroll- vagy nem immunizált állatok
4. példa pC-protein jellemzése lipoproteinként
A 3H-palmitinsav jelenlétében tenyésztett B. burgdorferi beépíti a lipoproteinjeibe ezt a jelzett zsírsavat. Az így jelzett lipoproteineket SDS-PAGE-elektroforézissel választjuk el és fluorográfíával azonosítjuk. Egy ilyen, az Orth-1 törzsből azonosított lipoprotein látszólagos molekulatömege azonos a törzs pC-proteinével (körülbelül 24 kD). Ha a radiojelzett B. burgdorferi Orth-1 teljes sejteket tripszinnel kezeljük, majd SDS-PAGE-eljárással analizáljuk, jellegzetes kettős sáv látható, a részlegesen emésztett pC-proteinnek megfelelően. Ezen anyag pC-specifikus monoklonális antitestekkel végzett Westem-blot analízise igazolta, hogy ezek a sávok valóban megfelelnek a pC-proteinnek. Ez a dublett, ami jellemző a pC-proteinra, kimutatható a tripszinnel kezelt anyag fluorografikus analízisével is.
Egy analóg kísérlet, amelynél a sejttel kapcsolatos pCproteinek mennyiségét lényegesen csökkentő proteináz K-t alkalmaztunk, a 24 kd lipoprotein közel teljes elvesztését eredményezte. Ez igazolja - mint az a 2. ábrából is látható - hogy a pC-protein lipoprotein.
Kísérleti körülmények
A B. burgdorferi sejtek radioaktív jelzése: B. burgdorferi Orth-1 sejteket (3,5 ml tenyészet, amely
I, 6xl07/ml sejtet tartalmaz) BSK közegben [összetétel: 230 ml CMRL 1066, 10x(Gibco BRL 21541),
II, 5 g neopenton (Difco 0119-17-9), 1,15 g élesztőextraktum, 13,8 g Hepes, 6,9 g D(+)-glükóz-monohidrát, 5,06 g nátrium-hidrogén-karbonát, 1,24 g trinátrium-citrát-dihidrát, 1,84 g piruvinsav, 920 mg N-acetil-D-glükóz-amin, 161 ml szarvasmarha-albumin (35%-os oldat), 184 ml nyúlszérum (3O’-ig 56 °C-on inaktiválva), 460 ml zselatin (3,5%-os oldat, pH 7,6), amely még radioaktív palmintinsavat is tartalmaz (70 μΐ 3H palmitinsav, 55 Ci/mmol; 1 mCi/ml)], tenyésztünk 48 órán át 33 °C-on, majd kétszer mossuk PBS/5 mmol MgCl2-pufferral és minden alikvot részt 190 ml PBS/MgCl2 pufferban reszuszpendáljuk.
Proteolitikus emésztés: 190 μΐ sejtszuszpenzióhoz vagy 10 μΐ PBS/MgCl2 puffért (kontroll) vagy 62,5 pg tripszint 1 mmol sósavban vagy 62,5 pg proteáz K-t vízben, adagolunk, a kapott mintákat 25 °C-on 50 percig (proteáz K) vagy 100 percig rázzuk, majd 2 pl PMSF-oldatot (50 mg fenil-metil-szulfonil-fluorid/ml etanol) adagolunk. A sejteket ezután pelletizáljuk (10 perc, 800 g), majd kétszer 500 pl PBS/5 mmol MgCl2/0,5 mg/ml PMFS-pufferral mossuk az emésztett termékek eltávolítására.
A minták analízise: SDS-PAGE és Westem-blotanalíziseket végzünk ismert módon. A fluorográfiához használt géleket 1 órán át EN3HANCE (NEN)-ben inkubáltuk, 30 percig vízzel mostuk, 65 °C-on 2 órán át szárítottuk és Hyperfilm MP (Amersham) alkalmazásával -80°-on tartottuk.
5. példa
Rekombináns pC-protein expresszálása
B. burgdorferikből DNS-t extraháltunk, részlegesen Sau 3A enzimmel emésztettük, méret szerint ffakcionáltuk és pUC18 plazmid Bam Hl helyére klónoztuk. A kimutatást oligonukleotid-hibridizációs módszerrel végeztük, a kimutatott gént szekvenáltuk.
A pC-gént PCR-rel kiegészítettük az expressziós vektorba való klónozás előtt.
A következő PCR-primereket alkalmaztuk
Primer 1, megfelel a pC nyitott leolvasási keret kezdetének (az indítókodon vastagítva van):
’ATGAAA A AGAAT AC ATT AAGTGCG ATAT TA3’
Primer 2, megfelel a pC nyitott leolvasási keret végének (a stopkodon vastagítva van):
5’ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG 3’
A PCR-reakciót a gyártó cég előírásai szerint végeztük VentR DNS-polimeráz alkalmazásával (New England Biolabs). A primerek kapcsolását a templát DNShez [rekombináns pUC18 plazmid B. burgdorferiból
HU 219 772 Β származtatott DNS-fragmenssal, amely a pC-gént tartalmazza a határoló- (flanking) DNS-sel együtt] 57 °C-on végeztük és a primereket 74 °C-on kiterjesztettük. Összesen 25,1-1 perces ciklust végeztünk, majd a mintákat 50 °C-on 5 percig melegítettük.
A pC-proteint maltózkötésű (MBP) fúziós proteinként expresszáltuk kereskedelmi forgalomban beszerezhető expressziós rendszer alkalmazásával (New England Biolabs).
Fúziós plazmidok megalkotása
A PCR-kiterjesztésű pC-gént inszertáltuk a pMAL-p2 és pMAL-c2 expressziósvektor-plazmidokba a jelen lévő malE géntől lefelé (100 ng DNS-plazmidot Xmnl restrikciós enzimmel emésztettünk és 20 ng PCRtermékhez, azaz pC-génhez ligáitok). A ligáit DNS-t akomplementáló E. coli gazdába (például TB1 vagy DH5-a) transzformáltuk és a pC-géneket tartalmazó kiónokat ampicillint és X-gal-t tartalmazó LB agaira vittük. A pC-génnek a klónozóvektorba való inszertálása, amely ampicillinrezisztenciát ad, megszakítja a malelacZa fúziót és változást eredményez a telepfenotípusban (kék vagy fehér) az alkalmazott kísérleti körülmények között. A vektor tac promoteréhez viszonyított helyes orientációjú pC-gént tartalmazó konstrukció pCMBP fúziós proteint expresszál, mint azt pC-specifikus monoklonális antitestekkel végzett Westem-blot-analízissel igazoltuk. A pC-MBP fúziós protein képződött a szignálpeptiddel (pMAL-p2) is, ami a fúziós proteint a periplazma felé irányítja, és a szignálszekvencia nélkül is, amikor is a fúziós protein a citoplazmában marad (pMAL-c2). A citoplazmás expresszió nagyobb volt mint a periplazmás expresszió, de ez utóbbinak potenciális előnye, hogy oldható terméket eredményez.
A rekombináns pC tisztítása
A periplazmás és citoplazmás úton expresszált pCMBP-t tartalmazó nyersextraktumokat a gyártó előírásai szerint nyertük. A fúziós proteint affinitásos kromatográfiával tisztítottuk, annak alapján, hogy az MBP specifikusan kötődik az amilóz affinitásos gyantához. Az MBPrészt a pc-MBP fúziós proteinről lehasítottuk, meghagyva a teljes pC-proteint, mivel a fúziós protein tartalmazza az egyetlen felismerési helyet a proteázfaktor Xa számára, a pC aminosavszekvencia kezdetével szomszédosán. A felszabadított MBP-t minden nem hasított fúziós proteinnal együtt eltávolítjuk amilózgyantával töltött oszlopon (az MBP megkötődik, míg a pC nem). Más módszer, amely alkalmas a pC tisztítására, illetve kinyerésére, szintén alkalmazható, így például ioncserés kromatográfia, immobilizált fémaffinitásos kromatográfia.
A fenti eljárás szerint nyert pC-protein komplett. Töredék pC-proteinek is előállíthatok azonban (például a feltételezett vezetőszekvencia nélkül) a megfelelő PCR-primerek alkalmazásával.

Claims (20)

1. Lyme borreliosis elleni vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy immunogénként a B. burgdorferi pCpolipeptid egy vagy több szerológiai formáját tartalmazza a Lyme borreliosisra érzékeny emlősöket immunizálni képes 1-100 pg/immunogén/dózis hatásos mennyiségben valamely adjuvánssal elkeverve.
2. Az 1. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy nem denaturált pC-polipeptid különböző szerológiai formájának keverékét tartalmazza.
3. Az 1. vagy 2. igénypontok szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy egy vagy több nem pC B. burgdorferi antigént tartalmaz.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy adjuvánsként alumínium-hidroxidot tartalmaz.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy az immunogén mennyisége 10-50 pg/immunogén dózis.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy az említett emlős ember.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy az immunogén homogén formájú, amely legalább 80 tömeg/térfogat%ban tartalmaz strukturálisan intakt pC-polipeptidet.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a pC-polipeptid transzformált gazdasejtekben termelt rekombináns polipeptid.
9. A 8. igénypont szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy a pC-polipeptid magában foglal egy aminosavszekvenciát, amelyet egy 5’ ATG AAA AAG AAT ACA TTA AGT GCG ATA 3’ és 5’ ATT AAG GTT TTT TTG GAG TTT CTG 3’ szekvenciáknak megfelelő oligonukleotid primer párral polimeráz-láncreakcióval kibővíthető DNS-szekvencia kódol.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti vakcinakészítmény, azzal jellemezve, hogy ioncserélő kromatográfiával tisztított immunogént tartalmaz.
11. Eljárás Lyme borreliosis elleni vakcinakészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy immunogénként a B. burgdorferi pC-polipeptid egy vagy több szerológiai formáját Lyme borreliosisra érzékeny emlősöket immunizálni képes 1-100 pg/immunogén/dózis hatásos mennyiségben valamely adjuvánssal elkeverünk és adagolásra alkalmas készítménnyé alakítjuk.
12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nem denaturált pC-polipeptid különböző szerológiai formájának keverékét alkalmazzuk.
13. All. vagy 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több nem pC B. burgdorferi antigént alkalmazunk.
14. A 11-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adjuvánsként alumíniumhidroxidot alkalmazunk.
15. A 11-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 10-50 pg immunogént alkalmazunk dózisonként.
16. A 11-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy emlősként embereket immunizálni képes immunogént alkalmazunk.
17. A 11-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan immunogént alkalma11
HU 219 772 Β zunk, amely homogén formájú és legalább 80 tömeg/térfogat%-ban tartalmaz strukturálisan intakt pCpolipeptidet.
18. A 11-17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy pC-polipeptidként transzfer- 5 máit gazdasejtekben termelt rekombináns polipeptidet alkalmazunk.
19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan pC-polipeptidet alkalmazunk, amely magában foglal egy aminosavszekvenciát, amelyet egy 5’ ATG AAA AAG AAT ACA TTA AGT GCG ATA 3’ és 5’ ATT AAG GTT TTT TTG GAG TTT CTG 3’ szekvenciáknak megfelelő oligonukleotid primer párral polimeráz-láncreakcióval kibővíthető DNS-szekvencia kódol.
20. A 11-19. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immunogénként ioncserélő kromatográfiával tisztított immunogént alkalmazunk.
HU9202289A 1991-07-11 1992-07-10 Vakcinakészítmény Lyme-kór megelőzésére és eljárás előállítására HU219772B (hu)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US72724591A 1991-07-11 1991-07-11
US82416192A 1992-01-22 1992-01-22
US07/903,580 US6221363B1 (en) 1991-07-11 1992-06-25 Vaccine for the prevention of lyme disease

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9202289D0 HU9202289D0 (en) 1992-10-28
HUT66525A HUT66525A (en) 1994-12-28
HU219772B true HU219772B (hu) 2001-07-30

Family

ID=27419096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202289A HU219772B (hu) 1991-07-11 1992-07-10 Vakcinakészítmény Lyme-kór megelőzésére és eljárás előállítására

Country Status (17)

Country Link
US (2) US6221363B1 (hu)
EP (1) EP0522560B2 (hu)
JP (1) JP2611095B2 (hu)
AT (1) ATE198489T1 (hu)
AU (1) AU660178B2 (hu)
CA (1) CA2073486C (hu)
CZ (1) CZ280743B6 (hu)
DE (1) DE69231619T3 (hu)
DK (1) DK0522560T4 (hu)
ES (1) ES2154633T3 (hu)
FI (1) FI107334B (hu)
HR (1) HRP950174B1 (hu)
HU (1) HU219772B (hu)
MX (1) MX9204078A (hu)
NO (1) NO304546B1 (hu)
SI (1) SI9200143B (hu)
SK (1) SK217292A3 (hu)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6872550B1 (en) * 1991-07-11 2005-03-29 Baxter Vaccine Ag Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens
US6303129B1 (en) * 1992-07-28 2001-10-16 Rx Technologies Production of borrelia burgdorferi vaccine, product produced thereby and method of use
DE69408135T2 (de) * 1993-04-29 1998-06-10 Immuno Ag Ospc-antigen-impfstoffe immunogene zusammensetzung zur vorbeugung und behandlung von lyme-krankheit und rekombinante verfahren zur herstellung von derartige antigene
US6248562B1 (en) 1993-11-01 2001-06-19 Research Foundation State University Of New York Chimeric proteins comprising borrelia polypeptides and uses therefor
US7008625B2 (en) 1993-11-01 2006-03-07 Research Foundation Of The State University Of New York Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi
ES2265643T3 (es) 1994-04-11 2007-02-16 Wyeth Holdings Corporation Bacteria de borrelia burgdorferi.
US6087097A (en) * 1994-05-12 2000-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research PCR detection of Borrelia burgdorferi
ZA964896B (en) * 1995-06-07 1997-01-08 Connaught Lab Expression of lipoproteins
AU712213B2 (en) * 1995-09-22 1999-11-04 Connaught Laboratories Limited Parainfluenza virus glycoproteins and vaccines
EP0880543A4 (en) * 1995-10-26 2000-08-02 Rhode Island Education ANTIGENS AS VACCINE CANDIDATES FROM SPIROCHETE (BORRELIA BURGDORFERI) OF LIVE DISEASE INDUCED BY A SALT OF A TICK VECTOR (IXODES SCAPULARIS)
US6045804A (en) * 1996-03-07 2000-04-04 Mayo Foundation For Medical Educational Research Method for detecting B. burgdorferi infection
US6716574B2 (en) 1996-05-02 2004-04-06 Dako A/S Osp-C derived peptide fragments
US6969520B2 (en) 1997-10-20 2005-11-29 Acambis Inc. Active immunization against clostridium difficile disease
GB9811219D0 (en) * 1998-05-26 1998-07-22 Smithkline Beecham Biolog Novel process
WO2000063386A2 (en) * 1999-04-21 2000-10-26 Boston Medical Center Corporation Prevention, diagnosis and treatment of lyme disease
ES2272296T3 (es) 1999-06-18 2007-05-01 Research Foundation Of State University Of New York Grupos de borrelia burgdorferi que producen la enfermedad de lyme en humanos.
EP1311540B1 (en) 2000-08-18 2007-12-19 Research Foundation Of State University Of New York Altered ospa of borrelia burgdorferi
US8277852B2 (en) * 2002-01-25 2012-10-02 Akzo Nobel Surface Chemistry Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
US7442391B2 (en) 2002-01-25 2008-10-28 Integrated Botanical Technologies, Llc Bioactive botanical cosmetic compositions and processes for their production
ES2652603T3 (es) 2004-01-12 2018-02-05 Isp Investments Llc Composiciones bioactivas de plantas de Theacea y procedimientos para su producción y uso
WO2007083834A1 (ja) 2006-01-19 2007-07-26 Toyo Seikan Kaisha, Ltd. カップラーおよび燃料電池用の燃料カートリッジ
BRPI0719360B1 (pt) * 2006-11-03 2016-09-06 Intervet Int Bv vacina da doença de lyme canina, e, uso de organismos de uma genoespécie de borrelia
CA2677023C (en) * 2007-02-22 2016-08-30 Baxter International Inc. Method of purification of hydrophobic proteins
WO2009131665A1 (en) * 2008-04-22 2009-10-29 Research Foundation Of State University Of New York Borrelia burgdorferi cell envelope protein array
CA2781110C (en) * 2009-11-17 2018-07-31 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies
BR112013027229B1 (pt) 2011-04-22 2020-10-27 Wyeth Llc polipeptídeo imunogênico isolado e seu uso, composição imunogênica e seu uso, célula recombinante ou progênie da mesma, e método de produção de uma toxina de clostridium difficile mutante
US8758772B2 (en) 2011-11-04 2014-06-24 Abaxis, Inc. Peptides and methods for the detection of lyme disease antibodies
BR122016023101B1 (pt) 2012-10-21 2022-03-22 Pfizer Inc Polipeptídeo, composição imunogênica que o compreende, bem como célula recombinante derivada de clostridium difficile
KR102451333B1 (ko) * 2018-10-22 2022-10-06 주식회사 엘지화학 마이크로비드 및 그 제조방법

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK590288D0 (da) 1988-10-24 1988-10-24 Symbicom Ab Kemiske forbindelser
US4603112A (en) * 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4767622A (en) * 1983-08-19 1988-08-30 University Of Illinois Method and materials for development of immunological responses protective against malarial infection
US4601903A (en) * 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
US4888276A (en) * 1986-06-26 1989-12-19 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method and composition for the diagnosis of Lyme disease
US4721617A (en) 1986-08-14 1988-01-26 Regents Of The University Of Minnesota Vaccine against lyme disease
US5192540A (en) * 1988-04-19 1993-03-09 American Cyanamid Company Haemophilus influenzae type b oxidized polysaccharide-outer membrane protein conjugate vaccine
DE3818013A1 (de) 1988-05-27 1989-11-30 Henkel Kgaa Gewebeweichmachungsmittel
IT1223777B (it) * 1988-08-18 1990-09-29 Gevipi Ag Rubinetto a due uscite con inversore a depressione
DE4015911A1 (de) * 1989-09-19 1991-03-28 Max Planck Gesellschaft Impfstoff gegen die lyme-krankheit
DE3942728C1 (en) 1989-12-22 1991-05-23 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh, 8000 Muenchen, De New immunologically active proteins derived from Borelia burgdorferiensity polyethylene vessel and a high density polyethylene sealing cap - useful as vaccine and for quick accurate diagnosis of Borelia infections
AU7058691A (en) * 1989-12-22 1991-07-24 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh Immunologically active proteines from borrelia burgdorferi, related test kits and vaccine
ATE142888T1 (de) 1990-03-05 1996-10-15 Us Health Antigen-wirkende proteine von borrelia burgdorferi
EP1016416A3 (en) * 1990-07-06 2002-10-23 Wyeth Vaccine against lyme disease and a challenge model for evaluating vaccine efficacy

Also Published As

Publication number Publication date
EP0522560B2 (en) 2006-12-20
JPH072696A (ja) 1995-01-06
EP0522560A2 (en) 1993-01-13
SI9200143B (en) 2001-06-30
CZ217292A3 (en) 1993-01-13
NO922746D0 (no) 1992-07-10
DE69231619T3 (de) 2007-07-12
JP2611095B2 (ja) 1997-05-21
ATE198489T1 (de) 2001-01-15
DE69231619T2 (de) 2001-05-31
US5530103A (en) 1996-06-25
ES2154633T3 (es) 2001-04-16
CZ280743B6 (cs) 1996-04-17
HRP950174B1 (en) 2001-08-31
CA2073486A1 (en) 1993-01-12
SI9200143A (en) 1993-03-31
HRP950174A2 (en) 1997-08-31
SK279250B6 (sk) 1998-08-05
CA2073486C (en) 2002-07-02
SK217292A3 (en) 1998-08-05
AU1934992A (en) 1993-01-14
EP0522560B1 (en) 2001-01-03
DE69231619D1 (de) 2001-02-08
EP0522560A3 (en) 1994-05-11
US6221363B1 (en) 2001-04-24
HU9202289D0 (en) 1992-10-28
DK0522560T4 (da) 2007-04-10
FI107334B (fi) 2001-07-13
NO922746L (no) 1993-01-12
AU660178B2 (en) 1995-06-15
NO304546B1 (no) 1999-01-11
FI923175A0 (fi) 1992-07-09
FI923175A (fi) 1993-01-12
HUT66525A (en) 1994-12-28
MX9204078A (es) 1993-04-01
DK0522560T3 (da) 2001-03-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU219772B (hu) Vakcinakészítmény Lyme-kór megelőzésére és eljárás előállítására
Akins et al. Lipid modification of the 17-kilodalton membrane immunogen of Treponema pallidum determines macrophage activation as well as amphiphilicity
Probert et al. Identification and characterization of a surface-exposed, 66-kilodalton protein from Borrelia burgdorferi
DK2450054T3 (en) New virulence factors of Streptococcus pneumoniae
US5807685A (en) OspE, OspF, and S1 polypeptides in Borrelia burgdorferi
JP3124753B2 (ja) インフルエンザ菌用ワクチンおよび診断法
EP0500736B1 (en) Recombinant vaccine for porcine pleuropneumonia
Cullen et al. Construction and evaluation of a plasmid vector for the expression of recombinant lipoproteins in Escherichia coli
JPH06292581A (ja) トレポネーマ・ヒオジセンテリエ ワクチン
Moses et al. A multiple site‐specific DNA‐inversion model for the control of Ompi phase and antigenic variation in Dichelobacter nodosus
Champion et al. Sequence analysis and recombinant expression of a 28-kilodalton Treponema pallidum subsp. pallidum rare outer membrane protein (Tromp2)
ES2203704T3 (es) Proteinas de membrana de leptospira.
AU750792B2 (en) 76 kDa, 32 kDa, and 50 kDa helicobacter polypeptides and corresponding polynucleotide molecules
RU2102081C1 (ru) Иммуногенная композиция против боррелиоза лайма, способ иммунизации млекопитающего против боррелиоза лайма, способ получения белка pc borrelia burgdorferi, диагностический агент для обнаружения b.burgdorferi и способ обнаружения антител к b.burgdorferi
US6296855B1 (en) 17-KDA Brucella abortus antigen, recombinant polypeptides, nucleic acids coding for the same and use thereof in diagnostic and prophylactic methods and kits
JPH10504455A (ja) ボレリア・ブルグドルフェリのＯｓｐＧを含有するワクチン
US6716591B1 (en) B. burgdorferi polypeptides
US20020026035A1 (en) Helicobacter ghpo 1360 and ghpo 750 polypeptides and corresponding polynucleotide molecules
CA2078851A1 (en) Treponema hyodysenteriae vaccine
MXPA97001224A (en) Vaccines against borrelia burgdorferi o

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee