CN117883560A - 猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗及应用 - Google Patents
猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117883560A CN117883560A CN202410065109.7A CN202410065109A CN117883560A CN 117883560 A CN117883560 A CN 117883560A CN 202410065109 A CN202410065109 A CN 202410065109A CN 117883560 A CN117883560 A CN 117883560A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- protein
- actinobacillus pleuropneumoniae
- vaccine
- seq
- inactivated
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000606748 Actinobacillus pleuropneumoniae Species 0.000 title claims abstract description 56
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 54
- LMDKAEWBVKHXMN-QAMPPYGQSA-N rapx Chemical compound C([C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@@]2(O)[C@H](C)CC[C@H](O2)C[C@@H](C(=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)C(C)C[C@@H](C)C(=O)C1)/C)OCC)C1=CC=C(O)C(OC)=C1 LMDKAEWBVKHXMN-QAMPPYGQSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 13
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 10
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 7
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 5
- 229940001442 combination vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 5
- 241000122975 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 1 Species 0.000 claims description 4
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 3
- 241001258963 Actinobacillus pleuropneumoniae serovar 7 Species 0.000 claims description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 2
- 241000606750 Actinobacillus Species 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 25
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 25
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 abstract description 19
- 101150053844 APP1 gene Proteins 0.000 abstract description 16
- 101100189105 Homo sapiens PABPC4 gene Proteins 0.000 abstract description 16
- 102100039424 Polyadenylate-binding protein 4 Human genes 0.000 abstract description 16
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 abstract description 15
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 abstract description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 8
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 abstract description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 3
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 16
- 230000034994 death Effects 0.000 description 15
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 15
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 13
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 13
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 11
- 101000657454 Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-I toxin determinant A from serotypes 1/9 Proteins 0.000 description 10
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 9
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 9
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 8
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 6
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 4
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 4
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 4
- BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N NAD zwitterion Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 BAWFJGJZGIEFAR-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 3
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 3
- 101100148259 Actinobacillus pleuropneumoniae apxIIA gene Proteins 0.000 description 2
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 208000020401 Depressive disease Diseases 0.000 description 2
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 2
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 201000003102 mental depression Diseases 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 238000003359 percent control normalization Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 2
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 2
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 3-[[oxo(pyridin-4-yl)methyl]hydrazo]-N-(phenylmethyl)propanamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1CNC(=O)CCNNC(=O)C1=CC=NC=C1 NOIIUHRQUVNIDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000766026 Coregonus nasus Species 0.000 description 1
- 101100136092 Drosophila melanogaster peng gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 101150051095 apxIA gene Proteins 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 244000144980 herd Species 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- CAMWVBRDIKKGII-UHFFFAOYSA-M n,n-dimethyl-4-(1-methylpyridin-1-ium-4-yl)aniline;iodide Chemical compound [I-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=[N+](C)C=C1 CAMWVBRDIKKGII-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术及兽用疫苗领域，具体涉及猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗及应用。所述的疫苗包括：SEQ ID NO.1所示的rApxⅠ蛋白、SEQ ID NO.2所示的rApxⅡ蛋白和灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌，所述的猪胸膜肺炎放线杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M20231360。本发明将可溶性表达的ApxⅠA与ApxⅡA与猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型灭活全菌进行组合，能够对不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌提供交叉保护。较之于单独使用APP2022116进行免疫，本发明的组合型疫苗提高了对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型毒株的抵抗力，针对APP1型和APP7型菌株的攻毒保护率均为100％。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及兽用疫苗领域，具体涉及猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗及应用。
背景技术
由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪传染性胸膜肺炎(pocontagious pleuropneumonia,PCP)是一种严重的猪传染性疾病，常呈急性爆发，死亡率高，给全世界的养猪业带来了极大的危害(Nahar et al.,2021)。该病具有高度传染性，临床上以失血性、纤维性和坏死性肺炎为特征。APP为革兰氏阴性短杆菌，呈显著的多形性和两极着色性。菌体有荚膜，无芽孢，不运动，为兼性厌氧菌。该菌依据生长过程中是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷可将APP分为两个生物型：生物Ⅰ型和生物Ⅱ型。依据APP荚膜抗原和脂多糖的差异，又可将生物Ⅰ型分为17个血清型，生物Ⅱ型含有两个血清型。我国已分离到的血清型有1、2、3、4、5、7、8、9、10型，血清型较多，其中血清1型、2型、3型和7型为主要的流行血清型(朱秀高and李艳青,2017)。由于该病的病程急，病原菌耐药问题严重，抗生素治疗效果不佳，同时，随着我国减抗禁抗政策的出台，因此疫苗接种是防控该病的重要手段之一。
由于APP血清型众多，各型之间无很好的交叉反应(姚建聪et al.,2003)，同时随着时间的推移，各个地区之间流行的优势血清型也会发生变化，也会增大疫苗研发的难度。全菌灭活疫苗是预防此病最有效的第一代疫苗，但是这种疫苗仅能对同种血清型产生保护，并不能提供交叉保护效果(Kim et al.,2011)。自家苗因法规和生物安全问题，仅限于感染此病的农场使用，对疾病的防控具有局限性。减毒活疫苗可对免疫后动物产生免疫保护，但是其可能会恢复毒力还原为强毒，存在一定风险，目前仍未广泛被应用(Zhou etal.,2016)。
针对猪传染性胸膜肺炎，国内现有疫苗几乎均为灭活疫苗，但灭活苗中APP分泌的外毒素成分含量少也是免疫效果不好的原因，因此有关外毒素的研究已成为该病的研究重点，灭活疫苗如科前生物的科肺宁，其抗原包括1、2、7型APP，菌体抗原浓度高，副反应大；也存在一些亚单位疫苗，如默沙东的亚单位疫苗爱普克，但其疫苗价格昂贵，提高养殖成本，同时纯亚单位疫苗由于缺少LPS等细胞壁成分而缺乏一般的保护能力。
溶血外毒素(Apx)是APP的主要毒力因子之一，Apx毒素分别为ApxI、ApxII、ApxIII及ApxIV(Frey et al.,1991；Hathroubi et al.,2018)。除了ApxⅣ毒素在所有血清型中都存在外，其他3种只被某些血清型合成并分泌，血清型1、5、9、11分泌ApxⅠ、ApxⅡ，血清型2、3、6、8分泌ApxⅡ、ApxⅢ，10型分泌ApxⅠ，7、12型分泌ApxⅡ，Apx毒素不仅是该菌致病的主要毒力因子，同时也可作为APP的主要保护性抗原(Ito and Sueyoshi,2015)。
在近30年间，国内外学者都致力于探究Apx毒素对免疫及对APP保护的影响，最早在1998年就有文献指出含有Apx毒素的亚单位疫苗可以抵抗APP9型的感染(Chiers etal.,1998)；2006年我国科学家利用原核外源表达了rApxⅠ以及rApxⅡ，并证明了其在小鼠与兔子的免疫中具有良好的免疫保护效果(王春来et al.,2006；严克霞et al.,2006)；近15年来，大量国内高校的研究生在研究Apx毒素方面取得了显著的进展，并且他们的研究结果表明，Apx毒素具有良好的免疫效果，但无一例外，他们的研究中Apx毒素无论是截短还是进行全长表达，表达出的Apx毒素均在包涵体中，需要对其变性后进行包涵体纯化(胡辉灿,2019；李鹏,2017；龙剑,2020；宋丹et al.,2019；田瑾,2019；吴东,2014；余光勇,2008；周家强,2013)，或者是通过体外大量培养APP，回收其培养上清再将其纯化回收(华方根,2012；马艳芳,2009)，这两种方法都具有很明显的弊端，其产量较低，不适合进行大规模生产。同时经过包涵体纯化后的蛋白其空间构象有可能会发生改变，导致其抗原决定簇发生改变，降低部分免疫原性。还有学者将截短Apx毒素作为表面展示抗原，表达在酿酒酵母表面，经口服给药方式，以达到猪对APP攻毒的免疫(Shin et al.,2013)。这些大量工作的目的都是为了通过获得Apx毒素，通过免疫的方式，使猪群获得较好保护效果。
在亚单位疫苗中，通常情况下，完整的蛋白会具有更好的免疫效果。这是因为完整的蛋白包含了所有的抗原决定簇，可以激发更广泛的免疫反应。相比之下，截短的蛋白只包含部分抗原决定簇，可能无法激发同样广泛的免疫反应。在上述研究中，虽然其证明了Apx毒素具有良好的免疫效果，却无法通过更好的手段将其完整表达并进行纯化回收。
针对上述问题，本发明成功对ApxI及ApxⅡ进行了全长的外源表达，该蛋白可溶性高，并且表达在上清，与筛选出的APP1型强毒力菌株进行混合，制备了猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗，该疫苗可以提供更多更丰富的细胞壁抗原，还可以通过ApxⅠ与ApxⅡ诱导强大的细胞介导的免疫反应，达到针对App多种血清型的保护能力，为猪传染性胸膜肺炎的免疫防控提供全面的解决方案。
发明内容
本发明的目的在于提供了猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗，该疫苗包括两个重组融合蛋白和灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌APP2022116，分别为rApxⅠ(氨基酸序列为SEQ ID NO.1)、rApxⅡ(氨基酸序列为SEQ ID NO.2)和保藏编号为CCTCC NO：M20231360猪胸膜肺炎放线杆菌。
本发明的另一个目的在于提供了猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗在制备猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗中的应用。
为了实现以上发明目的，本发明提供以下技术方案：
申请人通过毒力测定，从100多株菌株中筛选出一株血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌，其毒力较强，免疫原性佳，同时具有针对国内流行血清1型和7型猪胸膜肺炎放线杆菌的交叉保护效果，针对APP1型和APP7型菌株的攻毒保护率分别为80％和100％。
申请人于2023年7月21日将该菌株送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Actinobacillus pleuropneumoniae APP2022116，保藏编号：CCTCC NO：M20231360，地址：中国武汉武汉大学。
该菌株的培养和形态特征如下：
菌株APP2022116的细胞形态为球杆状，有时呈线装或多形性，无鞭毛，不具有运动性，直径约为0.5nm～2.0nm，长度约为60nm～450nm。培养时营养要求较高，需在含有10％新生牛血清、0.01％NAD的TSA平板，37℃的培养箱中生长，会形成圆形，边缘完整光滑，具有淡蓝色荧光的菌落。
本发明的保护范围包括：
猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗，所述的疫苗包括：SEQ ID NO.1所示的rApxⅠ蛋白、SEQ ID NO.2所示的rApxⅡ蛋白和灭活的1型猪胸膜肺炎放线杆菌，所述的1型猪胸膜肺炎放线杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M20231360。
以上所述的疫苗优选的：所述的rApxⅠ蛋白或rApxⅡ蛋白的制备方法包括：
将编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示蛋白的多核苷酸连接至载体pCold-TF获得重组载体，然后导入E.coli BL21(DE3)中进行诱导发酵，发酵上清中即获得对应蛋白；
以上所述的制备方法，优选的，编码SEQ ID NO.1蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.3所示；编码SEQ ID NO.2蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.4所示。
以上所述的制备方法，优选的，发酵诱导表达条件为16℃，加入终浓度为1mM的IPTG，170rpm诱导表达24h。
以上所述的制备方法，优选的，获得发酵上清后，按照下述方法分离纯化蛋白：
调整上样缓冲液的pH值为11，利用含有大孔径阴离子交换填料Rigose-DEAE的预装柱，通过AKTA pure25蛋白质层析纯化系统进行上样，上样流速为1mL/min，在上样过程中上清中的杂蛋白与阴离子交换填料结合，目的蛋白在上样流穿中留存，收集流穿后使用10000MWCO超滤管，通过超滤浓缩的方式获得ApxIA或ApxIIA蛋白。
本发明的保护范围还包括：胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗在制备猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗中的应用，所述的应用包括以胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗为唯一有效成分或有效成分之一，制备成猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗。
胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗在制备治疗或预防猪胸膜肺炎放线杆菌感染的药物中的应用。
以上所述的应用，优选的，所述的猪胸膜肺炎放线杆菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型和/或7型。
以上所述的应用，优选的，所述的疫苗剂型为现有技术中的任何剂型。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
(1)本发明使用E.coli原核表达猪胸膜肺炎放线杆菌的全长外毒素ApxⅠA与ApxⅡA，本发明这中的两种蛋白经过优化均成功实现可溶性表达，同时申请人建立了该蛋白的分离纯化方法，易于大量生产，降低生产成本。
(2)本发明中从100多株菌株中筛选出一株血清1型猪胸膜肺炎放线杆菌，其毒力较强，免疫原性佳，同时具有针对国内流行血清1型和7型猪胸膜肺炎放线杆菌的交叉保护效果，针对APP1型和APP7型菌株的攻毒保护率分别为80％和100％。
(3)本发明将可溶性表达的ApxⅠA与ApxⅡA与猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型灭活全菌进行组合，能够对不同血清型的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌提供交叉保护。较之于单独使用APP2022116进行免疫，本发明的组合型疫苗提高了对猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型毒株的抵抗力，针对APP1型和APP7型菌株的攻毒保护率均为100％。
(4)本发明为高效、低廉、广谱的猪传染性胸膜肺炎疫苗的研制奠定了基础，为猪传染性胸膜肺炎的防治提供了有效的技术手段。
附图说明
图1为APP菌株毒力筛选肺部剖检打分示意图。
图2为纯化回收后的ApxⅠ与ApxⅡ蛋白。
图3为动物免疫流程图。
图4为对照组(NC)和免疫组(APP+rApx1+rApx2)血清中特异性抗体水平检测图。
图5为攻毒后各组猪的生存曲线图。
图6为APP1型攻毒后对照组和免疫组剖检对比图。
图7为APP7型攻毒后对照组和免疫组剖检对比图。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的实施例。结合实施对本发明做进一步的描述和论证。但是本实施例不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所示试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
pCold-TF载体购自宝日医生物技术(北京)有限公司，货号为Code No.3365。
实施例1：
猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)APP2022116筛选及其免疫原性：1.猪胸膜肺炎放线杆菌APP2022116的筛选
对2021-2022年从全国规模化养猪场的发病猪收集的病料中，在无菌操作下，将病料接种于含有10％新生牛血清和0.01％NAD的TSA平板上，37℃过夜。对分离到的菌落进行PCR鉴定。对PCR鉴定证实是猪胸膜肺炎放线杆菌的菌株进行筛选，经初步筛选，选取35株血清型为1型的猪胸膜肺炎放线杆菌进行下一步动物试验，进行毒力比较。
取180只4周龄雌性KM小鼠，随机分成36组，每组5只，其中5只作为阴性对照，注射生理盐水，其他各组分别腹腔注射上述35株猪胸膜肺炎放线杆菌5×107/只，连续观察7天，观察记录小鼠发病及死亡情况，结果如表1所示，根据表1毒力情况，继续筛选毒力较强的20株菌株，降低攻毒计量进行第二次筛选。
表1第一次毒力比较结果
再次取210只4周龄雌性KM小鼠，随机分成21组，每组10只，取10只作为阴性对照，其他各组分别腹腔注射第一次筛选到的20株菌1×107/只，连续观察7天，观察记录小鼠发病及死亡情况，结果如表2所示，根据表2的毒力情况与小鼠死亡临床症状比较，选择1-9、1-16、1-20、1-26、APP-2 5株菌进行下一步毒力筛选。
表2第二次毒力比较结果
| 菌株名称 | 死亡数 | 死亡率 | 菌株名称 | 死亡数 | 死亡率 | 菌株名称 | 死亡数 | 死亡率 |
| 1-3 | 5 | 50％ | 1-20 | 7 | 70％ | APP-3 | 5 | 50％ |
| 1-5 | 6 | 60％ | 1-21 | 6 | 60％ | APP-4 | 2 | 20％ |
| 1-9 | 8 | 80％ | 1-22 | 3 | 30％ | APP-5 | 3 | 30％ |
| 1-10 | 6 | 60％ | 1-25 | 4 | 40％ | APP-6 | 2 | 20％ |
| 1-11 | 2 | 20％ | 1-26 | 5 | 50％ | APP-7 | 1 | 10％ |
| 1-12 | 3 | 30％ | 1-27 | 3 | 30％ | APP-8 | 5 | 50％ |
| 1-16 | 6 | 60％ | APP-2 | 7 | 70％ | 生理盐水 | 0 | 0％ |
取40日龄仔猪30头，随机分为6组，每组5头，其中5头作为阴性对照，注射生理盐水，其他5组分别气管注射上述筛选到的5株菌株，攻毒计量为5×107/只，连续观察7天，记录仔猪发病及其死亡情况，结果如表3所示，剖检后肺部打分如图1所示。
表3仔猪攻毒筛选结果
| 菌株名称 | 仔猪数 | 死亡数 | 死亡率 |
| 1-9 | 5 | 2 | 40％ |
| 1-16 | 5 | 5 | 100％ |
| 1-20 | 5 | 4 | 80％ |
| 1-26 | 5 | 5 | 100％ |
| APP-2 | 5 | 4 | 80％ |
| 生理盐水 | 5 | 0 | 0％ |
通过仔猪死亡情况与剖检后肺部病变打分情况，虽然菌株1-26的死亡率也达到了100％死亡率，但较之于菌株1-16，并未引起严重的肺部病变，因此最后选择1-16作为候选免疫菌株，命名为APP2022116。
申请人于2023年7月21日将该菌株送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Actinobacillus pleuropneumoniae APP2022116，保藏编号：CCTCC NO：M20231360，地址：中国武汉武汉大学。
2.猪胸膜肺炎放线杆菌APP2022116的免疫原性鉴定
1)猪胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗的制备
将猪胸膜肺炎放线杆菌APP2022116涂布至含有10％新生牛血清和0.01％NAD的TSA平板上，置于37℃恒温培养箱内过夜培养12h，使用PBS将其洗下后加入终浓度0.4％的甲醛进行灭活，放置于37℃200rpm的摇床中震荡48h后，离心清洗2遍后使用PBS进行重悬。
取灭活后的猪胸膜肺炎放线杆菌APP2022116与氢氧化铝佐剂混匀，使每剂疫苗中含有细菌1×109个。
2)猪胸膜肺炎放线杆菌灭活疫苗免疫保护效果评估
取20只35日龄仔猪，将其随机分为对照组和疫苗免疫组，每组10只。按表4的试验方案进行免疫攻毒。在第一次免疫后28d进行二免，免疫方式为颈背部肌肉注射，免疫剂量和途径与第一次免疫时相同。攻毒前将对照组和免疫组各分为2组，每组5只仔猪，并分别使用APP1型和APP7型菌株进行攻毒(免疫流程见图2)
表4免疫攻毒试验方案
在第二次免疫14d后，将各组分别用新鲜培养的APP1型及APP7型菌株进行攻毒，攻毒计量分别为3×107/只与4×109/只。观察一周内猪的临床症状及死亡情况，对死亡猪进行剖检，采集各组织部位，回收病变组织并用4％甲醛固定。观察结束时对未死亡猪进行安乐死，并观察其剖检变化。发病的判定标准：①精神沉郁；②咳嗽、呼吸困难；③死亡；④无症状者剖检可见出血性纤维素性胸膜肺炎或局灶性坏死。出现上述任何1项者判为发病。统计分析疫苗的免疫保护率。
试验结果表明，该灭活疫苗具有针对APP1型和7型的交叉保护效果。PBS+佐剂对照组在观察期内共死亡5头，其中APP1型攻毒对照组死亡3头，APP7型攻毒对照组死亡2头，免疫组死亡1头，为APP1型攻毒所致。该灭活疫苗对APP1型和APP7型菌株攻毒的猪的保护率分别为80％和100％，结果见表5。
表5猪胸膜肺炎放线杆菌(APP2022116株)灭活疫苗的免疫保护结果
| 组别 | 攻毒菌株 | 发病数 | 死亡数 | 死亡率 | 发病数 | 发病率 |
| 免疫组 | APP1型 | 1 | 1 | 20％ | 1 | 20％ |
| 对照组 | APP1型 | 5 | 3 | 60％ | 5 | 100％ |
| 免疫组 | APP7型 | 0 | 0 | 0％ | 0 | 0％ |
| 对照组 | APP7型 | 5 | 2 | 40％ | 5 | 100％ |
实施例2：
ApxⅠA和ApxⅡA蛋白表达和纯化：
1.重组质粒构建及验证：
分别将ApxⅠA(SEQ ID NO.3所示，编码SEQ ID NO.1所示蛋白)，ApxⅡA(SEQ IDNO.4所示，编码SEQ ID NO.2所示蛋白)分别构建到pET-28a(+)、pET-30a(+)、pET-32a(+)、pGEX-6P-1、pCold-Ⅰ、pCold-sumo、pCold-TF载体质粒中。
具体方式如下：
通过设计ApxⅠA和ApxⅡA基因的引物(表6)，以APP2022116的基因组DNA为模板，按表7的程序进行PCR，分别扩增目的基因片段ApxⅠA及ApxⅡA。由于PrimerSTAR Max DNAPolymerase具有特异性高、反应灵敏度高、扩增效率高的特点，其本身很高的退火效率使退火及延伸时间大幅缩短的特性，根据说明书，本次对目的基因的PCR均可使用预变性95℃3min；变性95℃10s；退火52℃10s；延伸72℃45s；最后延伸72℃2min，30个循环的反应程序。PCR完成后进行核酸电泳，结果显示扩增得到的ApxⅠA、ApxⅡA的条带大小分别位于预期位置附近。
表6引物序列
表7PCR反应体系
| 反应组分 | 体积(μL) |
| 2×PrimerSTAR Max DNA Polymerase | 25 |
| 上游引物 | 2 |
| 下游引物 | 2 |
| 基因组模板 | 1 |
| ddH2O | 20 |
| 总计 | 50 |
将pET-28a(+)、pET-30a(+)、pET-32a(+)、pGEX-6P-1、pCold-Ⅰ、pCold-sumo、pCold-TF载体与扩增到的ApxⅠA、ApxⅡA一同进行双酶切，选择EcoRI、BamHⅠ37℃酶切4h。酶切4h之后对酶切产物采用Omega公司的Gel Extraction Kit进行胶回收，之后将回收的ApxⅠA、ApxⅡA片段分别与pET-28a(+)、pET-30a(+)、pET-32a(+)、pGEX-6P-1、pCold-Ⅰ、pCold-sumo、pCold-TF载体进行连接，共获得14个重组质粒。
将产物传化E.coli DH5α感受态细胞中，再将菌液涂布于含相应抗生素的LA平板上进行抗性筛选。将获得的单克隆接种至含相应抗生素的LB培养基中，37℃摇床震荡培养12h后，提质粒进行PCR鉴定，并送至擎科生物公司进行测序鉴定。
这些重组表达质粒经PCR鉴定和测序鉴定，均与预期相符，序列无突变、证明基因被成功插入到相应载体上。
2.重组目的蛋白的表达纯化
将测序验证正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，再将菌体涂布于含相应抗生素的LA平板上进行抗性筛选，挑取重组菌株的单克隆分别接种至含相应抗生素的LB液体培养基中，待菌液OD600至0.6-0.8时，取适量的菌液做空白对照(不加IPTG)，剩余菌液中加入终浓度为1mM的IPTG，将每个重组菌16℃16h的条件下进行蛋白诱导。诱导结束后，离心收集菌体，重悬、破碎后收集上清及沉淀，进行SDS-PAGE电泳，检测目的蛋白的表达情况。
诱导表达条件确定之后，将新划线的重组菌株接种并转接扩大培养至1L LB液体培养基中，37℃200rpm摇至OD600为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，将各重组菌在其最适诱导条件下进行诱导。待诱导完成后，收集菌体，高压破碎后低温离心，并分离上清与沉淀。
经过表达载体以及表达条件优化，发现仅有pCold-TF质粒的两个重组蛋白均能以可溶的形式表达,诱导表达条件为16℃，加入终浓度为1mM的IPTG，170rpm诱导表达24h。
之后利用常规的Ni树脂亲和层析纯化重组蛋白，并将重组蛋白进行SDS-PAGE检测，发现无论通过改变上样缓冲液的类型或者相应溶剂浓度，蛋白均无法与Ni树脂亲和层结合。
申请人尝试更换纯化回收材料，采用阴阳离子交换柱进行回收，发现目的蛋白还是无法与填料结合。
最后申请人在完成蛋白诱导后，高压破碎得到蛋白表达表达上清，调整上样缓冲液(20mM Tris-Hcl)的pH值为11，利用含有大孔径阴离子交换填料Rigose-DEAE的预装柱，通过AKTA pure25蛋白质层析纯化系统进行上样，上样流速为1mL/min，在上样过程中使上清中的杂蛋白与阴离子交换填料结合，目的蛋白在上样流穿中留存，收集流穿后使用10000MWCO超滤管，通过超滤浓缩的方式得到了ApxIA与ApxIIA蛋白，将重组蛋白进行SDS-PAGE检测，结果显示纯化的ApxIA、ApxIIA大小分别为163kDa与155kDa，与预期相符(图2)。
实施例3：
猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗的制备及免疫效果的评估
1.猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗疫苗的制备
将APP2022116细菌涂布至含有10％新生牛血清和0.01％NAD的TSA平板上，置于37℃恒温培养箱内过夜培养12h，使用PBS将其洗下后加入终浓度0.4％的甲醛进行灭活，放置于37℃200rpm的摇床中震荡48h后，离心清洗2遍后使用PBS进行重悬。
取纯化好的蛋白ApxIA、ApxIIA并根据其浓度适当稀释后混匀，将稀释好的蛋白及灭活后的猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型细菌与CPC佐剂混匀，使每剂疫苗中含有各个蛋白的250μg，猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型细菌1×109个。
2.灭活亚单位联合疫苗免疫效果的评估
取20只35日龄仔猪，将其随机分为对照组和疫苗免疫组，每组10只。按表8的试验方案进行免疫攻毒。在第一次免疫后28d进行二免，免疫方式为颈背部肌肉注射，免疫剂量和途径与第一次免疫时相同，在免疫前与免疫后每7d进行前腔静脉采血并分装血清冻存备用。攻毒前将对照组和免疫组各分为2组，每组5只仔猪，并分别使用实施例1中的攻毒菌株APP1型和APP7型菌株进行攻毒(免疫流程见图2)。
表8免疫攻毒试验方案
3.血清特异性抗体水平检测
将重组蛋白ApxⅠA及ApxⅡA分别用PBS稀释至500ng/mL包被ELISA板，每孔100μL，4℃过夜包被，包被后使用5％脱脂奶作为封闭剂在37℃封闭2h。以免疫前后的血清(1：500)为一抗，山羊抗猪IgG-HRP(1：5000)作为二抗，充分孵育后，使用TMB显色液显色10min，并用显色终止液终止显色，然后用酶标仪读取OD630的数值检测并比较各组血清中ApxⅠA及ApxⅡA的特异性抗体水平差异。
结果显示在疫苗加强免疫后，各组小鼠血清中ApxⅠA及ApxⅡA的特异性抗体水平较初次免疫前均显著升高(图4)。表明，该疫苗可以刺激猪产生对上述2种抗原的高水平特异性抗体。
4.攻毒试验
在第二次免疫14d后，将各组分别用新鲜培养的实施例1中的攻毒菌株APP1型及APP7型菌株进行攻毒，攻毒计量分别为6×107/只与4×109/只。观察一周内猪的临床症状及死亡情况，对死亡猪进行剖检，采集各组织部位，回收病变组织并用4％甲醛固定。观察结束时对未死亡猪进行安乐死，并观察其剖检变化。发病的判定标准：①精神沉郁；②咳嗽、呼吸困难；③死亡；④无症状者剖检可见出血性纤维素性胸膜肺炎或局灶性坏死。出现上述任何1项者判为发病。统计分析疫苗的免疫保护率。
试验结果表明，PBS+佐剂对照组在观察期内共死亡6头，其中APP1型攻毒对照组死亡4头，APP7型攻毒对照组死亡2头，免疫组无死亡(图5)。该灭活亚单位联合组合疫苗对APP1型和APP7型菌株攻毒的猪的保护率均为100％(5/5)，结果见表9。同时通过对比对照组和疫苗组的肺部剖检显示，对照组猪的肺脏与胸腔粘连严重，肺脏出血严重，肺部肿大，部分可见干酪样坏死，气管粘膜出血，气管内具有泡沫或血红色泡沫；对比免疫组猪的肺脏大部分完好，肺脏与胸腔基本无粘连，具有肉眼可见的小肿块，气管内壁光滑，无出血(图6、7)。结果表明，该疫苗对感染APP1型和APP7型菌株的猪具有良好的免疫保护效果。
表9灭活亚单位联合疫苗对不同菌株攻毒后的免疫保护率
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1. 猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗，所述的疫苗包括：SEQ ID NO.1所示的rApxⅠ蛋白、SEQ ID NO.2所示的rApxⅡ蛋白和灭活的猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae），所述的猪胸膜肺炎放线杆菌的保藏编号为CCTCCNO：M20231360。
2.根据权利要求1所述的疫苗，所述的rApxⅠ蛋白或rApxⅡ蛋白的制备方法包括：
将编码SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示蛋白的多核苷酸连接至载体pCold-TF获得重组载体，然后导入E.coli BL21(DE3)中进行诱导发酵，发酵上清中即获得对应蛋白。
3. 根据权利要求2所述的疫苗，所述的制备方法中编码SEQ ID NO.1蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.3所示，编码SEQ ID NO.2蛋白的多核苷酸为SEQ ID NO.4所示。
4. 根据权利要求2所述的疫苗，所述的制备方法中的发酵诱导表达条件为16 ℃，加入终浓度为1 mM的IPTG, 170 rpm诱导表达24 h。
5.根据权利要求2所述的蛋白，所述的制备方法在获得发酵上清后，按照下述方法分离纯化蛋白：
调整上样缓冲液的pH值为11，利用含有大孔径阴离子交换填料Rigose-DEAE的预装柱，通过AKTA pure25蛋白质层析纯化系统进行上样，上样流速为1 mL/min，在上样过程中上清中的杂蛋白与阴离子交换填料结合，目的蛋白在上样流穿中留存，收集流穿后使用10000MWCO超滤管，通过超滤浓缩的方式获得ApxIA或ApxIIA蛋白。
6.权利要求1所述的疫苗在制备猪胸膜肺炎放线杆菌疫苗中的应用。
7.权利要求1所述的疫苗在制备治疗或预防猪胸膜肺炎放线杆菌感染的药物中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，所述的猪胸膜肺炎放线杆菌为猪胸膜肺炎放线杆菌血清1型和/或7型。
9.根据权利要求6或7所述的应用，所述的疫苗或药物的剂型为现有技术中的任何剂型。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310907533 | 2023-07-24 | ||
| CN2023109075337 | 2023-07-24 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117883560A true CN117883560A (zh) | 2024-04-16 |
Family
ID=90648572
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410065109.7A Pending CN117883560A (zh) | 2023-07-24 | 2024-01-17 | 猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117883560A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101818901B1 (ko) * | 2016-08-26 | 2018-01-16 | 우진 비앤지 주식회사 | 돼지흉막폐렴균의 재조합 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C 말단 분자 및 불활화 돼지흉막폐렴균을 이용한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물 |
| CN113350495A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-09-07 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗及其制备方法 |
| CN113490506A (zh) * | 2019-01-30 | 2021-10-08 | 法国诗华大药厂 | 灭活的apxia、apxiia和apxiiia毒素 |
| CN116323644A (zh) * | 2020-07-30 | 2023-06-23 | 帝国理工创新有限公司 | 胸膜肺炎放线杆菌疫苗 |
-
2024
- 2024-01-17 CN CN202410065109.7A patent/CN117883560A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101818901B1 (ko) * | 2016-08-26 | 2018-01-16 | 우진 비앤지 주식회사 | 돼지흉막폐렴균의 재조합 ApxIA, ApxIIA, ApxIIIA toxin의 N 또는 C 말단 분자 및 불활화 돼지흉막폐렴균을 이용한 돼지 흉막폐렴 백신 조성물 |
| CN113490506A (zh) * | 2019-01-30 | 2021-10-08 | 法国诗华大药厂 | 灭活的apxia、apxiia和apxiiia毒素 |
| CN116323644A (zh) * | 2020-07-30 | 2023-06-23 | 帝国理工创新有限公司 | 胸膜肺炎放线杆菌疫苗 |
| CN113350495A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-09-07 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ZHANG L.J.等: "A Combinatorial Vaccine Containing Inactivated Bacterin and Subunits Provides Protection Against Actinobacillus pleuropneumoniae Infection in Mice and Pigs", 《FRONTIERS IN VETERINARY SCIENCE》, vol. 9, 7 June 2022 (2022-06-07), pages 1 - 10 * |
| 万玉萌: "猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素和外膜蛋白的表达及间接ELISA检测方法的建立", <万方数据知识服务平台>, 2 September 2021 (2021-09-02), pages 1 - 81 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106928373B (zh) | 一种猪支原体肺炎多表位黏膜疫苗 | |
| US10603371B2 (en) | Attenuated Pasteurella multocida vaccines and methods of making and use thereof | |
| CN113350495B (zh) | 猪链球菌病-副猪嗜血杆菌病-猪传染性胸膜肺炎三联亚单位疫苗及其制备方法 | |
| CN113943714A (zh) | 一种猫杯状病毒毒株及其应用 | |
| US10058601B2 (en) | Attenuated Mannheimia haemolytica vaccines and methods of making and use | |
| CN115991749A (zh) | 一种猪传染性胸膜肺炎-猪多杀性巴氏杆菌病二联亚单位疫苗 | |
| CN104248753B (zh) | 一种疫苗组合物及其应用 | |
| CN117838890A (zh) | 一种c型副鸡禽杆菌亚单位疫苗及其应用 | |
| CN117427153A (zh) | 一种截短的猪丹毒丝菌SpaA蛋白制备的疫苗及应用 | |
| CN116350763A (zh) | 一种犬支气管败血波氏杆菌弱毒株疫苗组合及其制备方法 | |
| CN107868130B (zh) | 含猪肺炎支原体抗原的融合蛋白、疫苗组合物与应用 | |
| CN110974951B (zh) | 一种二联灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN117883560A (zh) | 猪胸膜肺炎放线杆菌灭活亚单位联合疫苗及应用 | |
| CN105602981B (zh) | 一种猪流行性腹泻病毒基因工程亚单位口服组合疫苗的制备方法及应用 | |
| CN116832149B (zh) | 一种绵羊肺炎支原体、丝状支原体和d型多杀性巴氏杆菌三联灭活疫苗及制备方法 | |
| CN117304338B (zh) | 一种融合蛋白抗原组合物及其制备方法和应用 | |
| CN112143666B (zh) | 一种猪肺炎支原体弱毒株及其在制备弱毒疫苗中的应用 | |
| CN112501133B (zh) | 一种伪狂犬病毒qd株三基因缺失致弱株 | |
| CN114146171B (zh) | 一种猪萎缩性鼻炎灭活疫苗及其制备方法 | |
| CN117535323A (zh) | 一种表达冠状病毒m蛋白表位肽的重组乳酸菌载体及重组植物乳杆菌和应用 | |
| CN117070567A (zh) | 一种兼用于猪呼吸道和消化道的病毒载体递送系统及其应用 | |
| CN115992099A (zh) | 一株猪细小病毒及其应用 | |
| CN116790515A (zh) | 一种猪繁殖与呼吸综合征病毒及其应用 | |
| CN104293816A (zh) | 猪肺炎支原体融合基因及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |