PL213045B1 - Mutant proteinazy K, sposób jego otrzymywania oraz sekwencje i szczepy wykorzystywane w tym sposobie - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku są startery oligonukleotydowe, a także sposób modyfikacji nieciągłego genu kodującego proteinazę K Tritirachium album, sposób łączenia egzonów genu kodującego proteinazę K Tritirachium album, plazmid rekombinantowy, plazmid ekspresyjny, rekombinantowy szczep Pichia pastoris i jego sposób otrzymywania oraz sposób wytwarzania dojrzałej formy zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album z wykorzystaniem wewnątrzkomórkowych endopeptydaz w drożdżowych układach ekspresyjnych.

Proteinaza K (E.C. 3.4.21.64), proteaza serynowa, jest enzymem proteolitycznym syntetyzowanym przez komórki pleśni Tritirachium album (Engyodontium album) ATCC 22625. Jej analogi znaleźć można także w komórkach bakterii np. Serratia sp., Pseudoalteromonas sp., Alteromonas sp., Thermus sp., Vibrio sp. i in.

W zależności od źródła, z którego pochodzą, enzymy te różnią się masą cząsteczkową, długością domeny C-terminalnej. wartościami optymalnej temperatury i pH działania, a także zapotrzebowaniem na jony metali niezbędne dla aktywności enzymu lub/i stabilizowania jego struktury. Aktywność enzymów z rodziny proteinaz K zazwyczaj wzrasta, gdy w buforze reakcyjnym znajdują się czynniki denaturujące jak SDS czy mocznik. Jony wapnia zabezpieczają natomiast proteinazę K przed autoprotolizą.

Enzymy te posiadają zdolność katalizowania reakcji hydrolizy wiązań peptydowych, wykazując przy tym szerokie spektrum substratowe, dlatego wykorzystuje się je głównie w procesach izolacji DNA i innych zastosowaniach biologii molekularnej, jak również w przypadku usuwania zanieczyszczeń białkowych z materiałów niebiałkowych.

Proteinaza K jest znanym od dawna enzymem, izolowany z płynu pohodowlanego pleśni Tritirachium album. Proces produkcji jest jednak długotrwały i charakteryzuje się niską wydajnością produkcji na 1 litr płynu pohodowlanego. Podjęto również próby konstrukcji bakteryjnych układów ekspresyjnych umożliwiających produkcję proteinazy K w postaci ciał inkluzyjnych, lecz problem renaturacji białka uniemożliwił otrzymanie jego znacznych ilości (Gunkel, F. A. and Gassen, H. G. (1989) Eur. J. Biochem. Vol. 179(1). 185-194; Samal, B. B. et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. Vol. 379, 95-104). Ostatnio opracowana została metoda produkcji proteinazy K w układach drożdżowych, w postaci fuzji translacyjnej zymogenu z peptydem sygnalnym alfa faktora Saccharomyces cerevisiae. W tym przypadku autokatalityczna aktywacja zymogenu do formy aktywnej białka następuje w czasie sekrecji lub w płynie pohodowlanym, lecz może również następować przedwcześnie przez co nie jest procesem ściśle kontrolowanym (nr patentu EP1360283).

Stąd, poszukuje się nowych, wydajnych układów pozwalających na efektywną i tanią biosyntezę enzymów z rodziny proteinaz K. Od bardzo wielu lat trwają prace nad konstrukcją układu pozwalającego na wydajną biosyntezę i łatwą izolację enzymu posiadającego aktywność proteinazy K. Celem wynalazku jest dostarczenie takiego układu pozwalającego na wydajną produkcję białka o aktywności proteinazy K oraz nowych mutantów proteinazy K, które mogą być wykorzystane dla uzyskania takiego pożądanego układu.

Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest mutant zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierający sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez proteazę Kex2 umieszczoną pomiędzy propeptydem, a sekwencją białka o aktywności dojrzałej proteinazy K.

Nieoczekiwanie, zaproponowana w wynalazku modyfikacja zymogenu. (tj. nieaktywnej enzymatycznie formy białka) prowadząca do kontrolowanego odcinania pro-peptydu (tj. części białka pełniącego rolę wewnętrznego czaperonu) w komórkach drożdży i uzyskania dojrzałej formy proteinazy K lub jej mutanta (tj. białka o aktywności dojrzałej proteinazy K) umożliwia wydajną produkcję enzymu.

Korzystnie białko o aktywności dojrzałej proteinazy K posiada sekwencję aminokwasową dojrzałej proteinazy K zawierającą mutację zwiększającą efektywność odcinania pro-peptydu przez proteazę Kex2, korzystnie substytucję Ala-106 na Glu-106. Szczególnie korzystnie mutant zymogenu według wynalazku posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest mutant dojrzałej proteinazy K z Tritirachium album zawierający mutację zwiększającą efektywność odcinania pro-peptydu przez proteazę Kex2, korzystnie substytucję Ala znajdującej się w pozycji pierwszej na Glu. Korzystnie, posiada on sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:2.

PL 213 045 B1

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja DNA zawierająca sekwencję kodującą mutanta zymogenu proteinazy K według wynalazku jak zdefiniowano powyżej albo jego fragment. Korzystnie, posiada ona sekwencję SEQ ID No.:3.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sekwencja oligonukleotydu służącego do otrzymywania sekwencji DNA kodującej mutanta zymogenu proteinazy K według wynalazku zdefiniowanego powyżej albo jego fragment wybrana spośród sekwencji SEQ ID No.:5 - 23, 25 - 27, 30.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą mutanta zymogenu proteinazy K według wynalazku zdefiniowanego powyżej. Korzystnie, plazmid według wynalazku zawiera ponadto: promotor AOX1, terminator transkrypcji AOX1. gen oporności na ampicylinę (bla), gen oporności na zeocynę (Sh ble), syntetyczny prokariotyczny promotor EM7, promotor TEF1 z Saccharomyces cerevisiae, terminator transkrypcji CYC1 oraz dwa origin replikacji ColE1. Szczególnie korzystnie plazmid według wynalazku posiada sekwencję wybraną spośród sekwencji: SEQ ID No.:24. SEQ ID No.:28 oraz SEQ ID No.:29.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest plazmid rekombinantowy zawierający: sekwencję kodującą endopeptydazę Kex2 Saccharomyces cerevisiae pod kontrolą konstytutywnego promotora GAP, oraz korzystnie terminator transkrypcji AOX1, gen HIS4 S. cerevisiae szlaku syntezy histydyny wraz z własnym promotorem i terminatorem transkrypcji, gen oporności na ampicylinę (bla) oraz origin replikacji ColE1. Korzystnie plazmid według wynalazku posiada sekwencję wybraną spośród sekwencji: SEQ ID No.:32 - 34. 37.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest rekombinantowy szczep drożdżowy transformowany dowolnym plazmidem według wynalazku zdefiniowanym powyżej. Korzystnie szczep drożdży według wynalazku może być otrzymany z jednego ze znanych szczepów drożdży wybranych spośród Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyees sp., Sehizosaccharomyces sp., Yarrovia sp., lub Kluyveromyces sp., korzystnie wybranego spośród następujących szczepów Pichia pastoris: GS115, SMD1168, KM71.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania białka o aktywności proteinazy K Tritirachium album charakteryzujący się tym, że prowadzi się hodowlę komórek drożdży transformowanych plazmidem ekspresyjnym kodującym mutanta zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierającego sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez endopeptydazę występującą w komórkach drożdży transformowanych plazmidem ekspresyjnym, umieszczoną pomiędzy pro-peptydem a sekwencją białka o aktywności dojrzałej proteinazy K, a następnie uzyskiwane białko izoluje się i oczyszcza z płynu hodowlanego. Korzystnie endopeptydaza występująca w komórkach drożdży transformowanych plazmidem ekspresyjnym jest endopeptydazą występującą naturalnie w komórkach gospodarza ekspresyjnego albo endopeptydazą kodowaną przez dodatkowy plazmid rekombinantowy, korzystnie proteazą Kex2. Szczególnie korzystnie prowadzi się hodowlę komórek drożdży według wynalazku, zwłaszcza w temperaturze około 28 do 30°C, przy czym indukuje się ekspresję zmodyfikowanego genu proteinazy K metanolem. Równie korzystnie, białko o aktywności proteinazy K Tritirachium album izoluje się z płynu pohodowlanego metodą chromatografii oddziaływań hydrofobowych lub metodą chromatografii na złożu hydroksyapatytu, a następnie oczyszcza się prowadząc dializę wobec roztworu węglanu amonu, po czym suszy się ze stanu zamrożenia. Równie korzystnie, zwiększa się efektywność odcinania pro-peptydu proteinazy K przez endopeptydazę. Równie korzystnie, dodatkowy plazmid rekombinantowy zawiera promotor i terminator transkrypcji rozpoznawany przez drożdżową polimerazę RNA. Równie korzystnie, sekrecja proteinazy K inicjowana jest dzięki fuzji translacyjnej z inną niż własna sekwencją sygnalną. Równie korzystnie, sekwencja proteinazy K zawiera domeny fuzyjne ułatwiające oczyszczanie. Równie korzystnie, pro-peptyd proteinazy K zamieniono przez inny naturalnie występujący. Równie korzystnie, sekwencję genu proteinazy K zmutowano nie wpływając na zwiększenie efektywności produkcji, zwiększenie aktywności bądź stabilności enzymu.

Skonstruowano układ ekspresyjny pozwalający na wydajną biosyntezę dojrzałej formy zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album ATCC 22625 w komórkach Pichia pastoris. Nieciągły gen kodujący białko został wyizolowany i zsekwencjonowany. Na podstawie sekwencji nukleotydowej genu ustalono sekwencję egzonów i intronów, a także porównano sekwencję aminokwasową kodowanego polipeptydu ze zdeponowaną w bazie genów NCBI, co uwidoczniło jedną różnicę w sekwencji aminokwasowej w postaci zamiany reszty Ser-312 na Glu-312. Odpowiednim fragmentom sekwencji aminokwasowej przypisano funkcję: sekwencji sygnalnej umożliwiającej transport białka na zewnątrz komórki (pre-peptyd), wewnętrznego czaperonu (pro-peptyd) oraz sekwencji odpowiadającej białku dojrzałemu (mature peptide). Usunięto sekwencję nukleotydową intronu dzielącego egzony, przy czym

PL 213 045 B1 zmodyfikowano kodony tuż przed sekwencją nukleotydową odpowiadającą białku dojrzałemu, tak by kodowane przez nie reszty aminokwasowe stanowiły w syntezowanym białku niedojrzałym, miejsce rozpoznania dla proteazy wewnątrzkomórkowej gospodarza ekspresyjnego oraz zmodyfikowano kodony na N-końcu białka dojrzałego tak by zamiana reszt aminokwasowych tuż za sekwencją rozpoznania dla endopeptydazy sygnalnej Kex2 spowodowała zwiększenie efektywności odcinania propeptydu przez endopeptydazę. Zamiana reszt aminokwasowych Ile104 i Asn105 na zasadowe reszty aminokwasowe Lys104 i Arg105 spowodowała niezdolność białka do autoprotolizy, gdyż nie są one rozpoznawane przez proteinazę K Tritirachium album, co uniemożliwia przedwczesną aktywację zymogenu do formy dojrzałej (Wolfgang Ebeling, et al. Proteinase K from Tritirachium album Limber, Eur. J Biochem. 47, 91-97. 1974). Dodatkowo zmodyfikowano pierwszą resztę aminokwasową białka dojrzałego Ala-106 na Glu-106 w celu zwiększenia efektywności odcinania pro-peptydu przez endopeptydazę wewnątrzkomórkową Kex2. Taka modyfikacja genu pozwoliła na wydajną, kontrolowaną zewnątrzkomórkową produkcję proteinazy K Tritirachium album w postaci dojrzałego enzymu, który ulega aktywacji dopiero w obszarze trans-Golgie. Sposób otrzymywania funkcjonalnej zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album umożliwia otrzymanie białka w znacznych ilościach, a ponadto pozwala na produkcję zmodyfikowanego enzymu, który nie odbiega aktywnością od enzymu izolowanego ze szczepu dzikiego. Produkowane dojrzałe białko Proteinazy K nie różni się w znaczącym stopniu aktywnością od białka izolowanego z Tritirachium album mimo obecności mutacji w sekwencji aminokwasowej w postaci Ala-106->Glu-106 oraz Ser-312->Glu-312. Produkowana zmodyfikowana proteinaza K nie posiada domen fuzyjnych ułatwiających oczyszczanie, jak np. His-tag. GST-tag bądź innej fuzji translacyjnej działającej w ten sposób, aczkolwiek wprowadzenie takowych domen fuzyjnych na N-końcu lub C-końcu polipeptydu dojrzałej proteinazy K, mogłoby pozwolić na łatwiejsze oczyszczanie dojrzałego białka z płynu pohodowlanego.

Szczególną realizację wynalazku stanowią startery oligonukleotydowe do reakcji amplifikacji DNA o symbolach ProtK-N-tail, ProtK-C-tail, ProtKExon2-MutK2Z, ProtKExon1Z, FAsuIIKex2, RNotIKex2, FKex2GAP, RKex2AOX1, FMluIAmp, RSmaIAmp, FBamHIHis4, RSmaIHis4 oraz mutagenezy ukierunkowanej peptydu dojrzałego o symbolach FGlu i RGlu.

Realizację wynalazku stanowi także sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o symbolach ProtK-N-tail, ProtK-C-tail, ProtKExon2-MutK2Z, ProtKExon1Z, zawierająca fragment DNA kodujący proteinazę K, fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny AsuII, fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny EcoRI, fragment DNA, którego sekwencja aminokwasowa w biosyntezowanym białku niedojrzałym odpowiada sekwencji rozpoznawanej przez endopeptydazy wewnątrzkomórkowe np. Kex2, o symbolu ProtK-Kex2. Realizację wynalazku stanowi w szczególności sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach ProtK-N-tail, RGlu, FGlu i ProtK-C-tail, zawierająca fragment DNA jak powyżej oraz fragment DNA, którego sekwencja aminokwasowa za miejscem odcinania pro-peptydu odpowiada resztom aminokwasowym zwiększającym efektywność odcinania pro-peptydu przez endopeptydazę wewnątrzkomórkową Kex2, o symbolu ProtK-Kex2Glu. Realizację wynalazku stanowi również sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o symbolach FAsulIKex2 i RNotIKex2, zawierająca fragment DNA kodujący endopeptydazę wewnątrzkomórkową Kex2 Saccharomyces cerevisiae, fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny AsuII i fragment DNA rozpoznawany przez enzym restrykcyjny NotI. o symbolu BNKex2. Realizację wynalazku stanowi również sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach FMluIAmp i RSmaIAmp, zawierająca fragment DNA kodujący beta-laktamazę, fragment DNA o sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny MluI oraz fragment DNA o sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny Smal. Realizację wynalazku stanowi również sekwencja DNA otrzymana w wyniku amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach FBamHIHis4 i RSmaIHis4, zawierająca fragment DNA kodujący enzym HIS4, fragment DNA o sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny Smal oraz fragment DNA o sekwencji rozpoznawanej przez enzym restrykcyjny BamHI.

Realizację wynalazku stanowi również plazmid ekspresyjny zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym proteinazę K Tritirachium album, z fragmentami DNA rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne AsuII i EcoRI, z fragmentem DNA odpowiadającym w biosyntezowanym białku sekwencji aminokwasowej rozpoznawanej przez endopeptydazę wewnątrzkomórkową, z fragmentem DNA odpowiadającym w biosyntetyzowanym białku resztom aminokwasowym zwiększającym efektywność hydrolizy wiązania peptydowego w miejscu trawienia przez endopeptydazę wewnątrzkoPL 213 045 B1 mórkową oraz z promotorem AOX1, o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 oraz plazmid rekombinantowy zawierający wklonowane DNA z fragmentem kodującym endopeptydazę Kex2 S. cerevisiae, z fragmentami DNA rozpoznawanymi przez enzymy restrykcyjne AsuII i NotI. z promotorem GAP oraz genem HIS4 umożliwiającym integrację liniowej formy DNA plazmidu w obrębie locus his4, o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2.

Realizację wynalazku stanowi rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2, który stanowią komórki drożdży Pichia pastoris GS115 zawierające gen kodujący zmodyfikowaną proteinazę K Tritirachium album zintegrowany z genomem drożdżowym oraz rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Tritirachium album GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2, który stanowią komórki drożdży Tritirachium album GS115 zawierające geny kodujące zmodyfikowaną proteinazę K Tritirachium album i endopeptydazę Kex2 S. cerevisiae zintegrowane z genomem drożdżowym.

Realizacją wynalazku jest również sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Tritirachium album GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 charakteryzujący się tym, że fragment DNA kodujący zmodyfikowaną proteinazę K Tritirachium album o symbolu ProtK-Kex2Glu uzyskuje się poprzez amplifikację DNA z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach ProtK-N-tail, ProtK-C-tail, ProtKExon2-MutK2Z, ProtKExon1Z, FGlu i RGlu. W pierwszej kolejności uzyskuje się fragment DNA na drodze reakcji PCR na matrycy genomowego DNA Tritirachium album z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach ProtK-N-tail i ProtK-C-tail o symbolu ProtK-ex-in-ex, który klonuje się wstępnie w wektorze pCR-Blunt firmy Invitrogen, otrzymując DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pCR-BluntProt. Na matrycy DNA otrzymanego plazmidu o symbolu pCR-BluntProt uzyskuje się fragmenty DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach ProtK-N-tail i ProtKExon1Z oraz z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach ProtK-C-tail i ProtKExon2-MutK2Z, które łączy się w jeden fragment DNA na drodze reakcji PCR z wykorzystaniem starterów o symbolach ProtK-N-tail i ProtK-C-tail. Uzyskany w ten sposób fragment DNA o symbolu ProtK-Kex2 klonuje się wstępnie w wektorze pCR-Blunt firmy Invitrogen, otrzymując DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pCR-BluntProtKex2. Na matrycy otrzymanego DNA plazmidu o symbolu pCR-BluntProtKex2 uzyskuje się fragmenty DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach ProtK-N-tail i RGlu oraz z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach ProtK-C-tail i FGlu, które łączy się w jeden fragment DNA na drodze reakcji PCR z wykorzystaniem starterów o symbolach ProtK-N-tail i ProtK-C-tail. Uzyskany w ten sposób fragment DNA o symbolu ProtK-Kex2Glu klonuje się wstępnie w wektorze pCR-Blunt firmy Invitrogen, otrzymując DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pCR-BluntProtKKex2Glu. Fragment DNA o symbolu ProtK-Kex2Glu klonuje się również w wektorze plazmidowym o wzorze 13 i o symbolu pPICAmp. w wyniku czego uzyskuje się DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2. Otrzymanym DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris GS115, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2. Realizacją wynalazku jest również sposób otrzymywania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2 charakteryzujący się tym, że otrzymuje się fragment DNA kodujący endopeptydazę Kex2 S. cerevisiae na matrycy genomowego DNA S. cerevisiae z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o symbolach FAsuIIKex2 i RNotIKex2. W pierwszej kolejności uzyskuje się fragment DNA z wykorzystaniem starterów o symbolach FAsulIKex2 i RNotIKex2 o symbolu BNKex2. Następnie uzyskany fragment DNA klonuje się w wektorze plazmidowym o symbolu pGAPZalfaA w miejsca rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych AsuII i NotI otrzymując DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pGAPZKex2. Następnie otrzymuje się fragment DNA zawierający gen kodujący beta-laktamazę z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych FMluIAmp i RSmaIAmp na matrycy DNA wektora o symbolu pPIC9K. Następnie otrzymany fragment DNA klonuje się w wektorze plazmidowym o symbolu pGAPZKex2 w miejsca rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych MluI i Smal otrzymując DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pGAP/Amp/Kex2. W kolejnym etapie otrzymuje się fragment DNA zawierający gen HIS4 na matrycy wektora plazmidowego o symbolu pPIC9K z zastosowaniem starterów oligonukleotydowych FBamHIHis4 i RSmaIHis4, który klonuje się w plazmidzie rekombinantowym o symbolu pGAP/Amp/Kex2 w miejsca rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych Smal i BamHI i otrzymuje się w ten sposób DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2, którego DNA transformuje się komórki Pichia pastoris

PL 213 045 B1 o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2, uzyskując rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2.

W wariancie realizacji tego wynalazku, DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris GS115, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2, po czym DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2.

W wariancie realizacji tego wynalazku, DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris SMD1168, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris SMD1168 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2.

W wariancie realizacji tego wynalazku, DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris SMD1168, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris SMD1168 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2, po czym DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2 transformuje się komórki o symbolu Pichia pastoris SMD1168 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris SMD1168 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2.

W wariancie realizacji tego wynalazku, DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris SMD1168, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris SMD1168 pGAP/Amp/His4/Kex2. A następnie, DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris SMD1168 pGAP/Amp/His4/Kex2, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris SMD1168 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2.

W innym wariancie realizacji tego wynalazku, DNA plazmidu ekspresyjnego o o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris KM71. w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris KM71 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2.

W wariancie realizacji tego wynalazku, DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2 transformuje się komórki o symbolu Pichia pastoris KM71 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris KM71 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2.

W wariancie realizacji tego wynalazku, DNA plazmidu rekombinantowego o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris KM71, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris KM71 pGAP/Amp/His4/Kex2, a następnie DNA plazmidu ekspresyjnego o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 transformuje się komórki Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris KM71 pGAP/Amp/His4/Kex2, w wyniku czego uzyskuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris KM71 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2.

Realizację wynalazku stanowi również sposób wytwarzania zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album polegający na zewnątrzkomórkowej produkcji enzymu przez komórki rekombinantowego szczepu drożdży w pożywkach płynnych wzbogaconych o jony wapnia (Ca²⁺) charakteryzujący się tym, że prowadzi się hodowlę komórek szczepu drożdży o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2 w temperaturze 28-30°C, indukuje ekspresję genu kodującego zmodyfikowaną proteinazę K metanolem, a następnie izoluje się i oczyszcza białko z płynu pohodowlanego na drodze chromatografii oddziaływań hydrofobowych, po czym oczyszczony enzym suszy się ze stanu zamrożenia. Można tutaj również zastosować metodę oczyszczania chromatograficznego na złożu w postaci hydroksyapatytu.

Dzięki wykorzystaniu wynalazku uzyskuje się układ ekspresyjny umożliwiający wydajną produkcję zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album w komórkach drożdży Pichia pastoris. przy czym produkcja ta jest znacznie bardziej wydajna od biosyntezy enzymu w komórkach pleśni, czy komórkach bakteryjnych.

PL 213 045 B1

Uzyskana według wynalazku rekombinowana zmodyfikowana proteinaza K Tritirachium album zachowuje ponad 98% maksymalnej aktywności przechowywana w temperaturze -20°C przez długi okres czasu.

Wynalazek objaśniony jest bliżej w przykładach wykonania i na rysunku, na którym:

fig. 1 przedstawia fragment DNA, otrzymany na drodze amplifikacji na matrycy genomowego

DNA Tritirachium album, o wzorze 2 i symbolu ProtK-ex-in-ex, fig. 2 przedstawia schemat otrzymania fragmentu DNA o wzorze 6 i symbolu ProtK- Kex2 z fragmentów DNA o wzorach 4 i 5 i symbolach odpowiednio FragNR1 i FragNR2, z zaznaczeniem sekwencji genu proteinazy K Tritirachium album i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne AsuII i EcoRI oraz kodony odpowiadające w sekwencji białkowej sekwencji rozpoznania dla endopeptydazy wewnątrzkomórkowej Kex2, fig. 3 przedstawia sekwencję DNA fragmentu DNA o wzorze 10 i o symbolu ProtK-Kex2Glu z zaznaczeniem sekwencji genu proteinazy K Tritirachium album i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne AsuII i EcoRI oraz kodony odpowiadające w sekwencji białkowej sekwencji rozpoznania dla endopeptydazy wewnątrzkomórkowej Kex2, a także kodon odpowiadający reszcie aminokwasowej wzmagającej aktywność endopeptydazy Kex2.

P r z y k ł a d 1.

Otrzymywanie sekwencji DNA nieciągłego genu kodującego proteinazę K Tritirachium album

W celu amplifikacji DNA kodującego proteinazę K Tritirachium album syntetyzuje się startery oligonukleotydowe o wzorze 1 i o symbolach ProtK-N-tail i ProtK-C-tail. Reakcję amplifikacji DNA kodującego proteinazę K wykonuje się z użyciem starterów ProtK-N-tail (0,2 μΜ) i ProtK-C-tail (0,2 μΜ), na matrycy DNA genomowego Tritirachium album (0,2 μg), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c.. Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 60°C - 1 minuta, 72°C - 1 minuta; 30 cykli), 72°C 5 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wzorze 2 i symbolu ProtK-ex-in-ex. Fragment DNA o wzorze 2 i o symbolu ProtK-ex-in-ex klonuje się wstępnie w wektorze pCR-Blunt firmy Invitrogen, postępując zgodnie z zaleceniami producenta. Otrzymuje się DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 3 i symbolu pCR-BluntProt zawierające fragment DNA o sekwencji nieciągłego genu proteinazy K Tritirachium album, co potwierdza się przez sekwencjonowanie DNA metodą Sangera.

P r z y k ł a d 2.

Otrzymywanie sekwencji DNA kodującej proteinazę K Tritirachium album

Amplifikuje się fragment DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i symbolach ProtK-N-tail (0,2 μΜ) i ProtKExon1Z (0,2 μΜ), na matrycy DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 3 i symbolu pCR-BluntProt (0,2 μg), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c.. Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 68°C - 1 minuta, 12°C - 30 sekund; 30 cykli). 72°C - 5 minut, uzyskując fragment DNA o wzorze 4 i symbolu FragNR1 oraz amplifikuje się drugi fragment DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i symbolach ProtK-C-tail (0,2 μΜ) i ProtKExon2-MutK2Z (0,2 μΜ) na matrycy DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 3 i symbolu pCR-BluntProt (0,2 μg) w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl₂, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C 1 minuta, 65°C - 1 minuta, 72°C - 30 sekund; 30 cykli), 72°C - 5 minut, uzyskując fragment DNA o wzorze 5 i symbolu FragNR2. Otrzymane fragmenty DNA o wzorze 4 i symbolu FragNR1 (0,05 μg) i o wzorze 5 i symbolu FragNR2 (0,05 μg) łączy się stosując reakcję amplifikacji DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i symbolach ProtK-N-tail (0,2 μΜ) i ProtK-C-tail (0,2 μΜ), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się

PL 213 045 B1 w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty. (95°C - 1 minuta, 68°C - 1 minuta, 72°C - 1 minuta: 30 cykli), 72°C - 5 minut, otrzymując fragment DNA o wzorze 6 i o symbolu ProtK-Kex2. Sposób otrzymania z dokładnym zaznaczeniem sekwencji genu proteinazy K Tritirachium album i fragmentów DNA rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne AsuIl i EcoRI oraz z sekwencją kodonów fragmentu DNA, którego sekwencja aminokwasowa w biosyntezowanym białku niedojrzałym odpowiada sekwencji rozpoznawanej przez endopeptydazę wewnątrzkomórkową Kex2 ilustruje fig. 2.

P r z y k ł a d 3.

Otrzymanie zmodyfikowanego genu proteinazy K Tritirachium album

Otrzymany w przykładzie 2 fragment DNA o wzorze 6 i o symbolu ProtK-Kex2 klonuje się wstępnie w wektorze pCR-Blunt firmy Invitrogen postępując zgodnie z protokołem dostarczonym wraz z zestawem pCR-Blunt Cloning Kit tej firmy, otrzymując plazmid rekombinantowy o wzorze 7 i symbolu pCR-Blunt-ProtKex2. Na matrycy DNA plazmidu o wzorze 7 i symbolu pCR-Blunt-ProtKex2 (0,2 μg) przeprowadza się reakcję PCR stosując startery oligonukleotydowe o wzorze 1 i symbolach ProtK-N-tail (0,2 μΜ) i RGlu (0,2 μΜ) w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 68°C - 1 minuta, 72°C - 30 sekund; 30 cykli), 72°C - 5 minut, uzyskując fragment DNA o wzorze 8 i symbolu F1NR2 oraz amplifikuje się drugi fragment DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i symbolach FGlu (0,2 μΜ) i ProtK-C-tail (0.2 μΜ) na matrycy DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 7 i symbolu pCR-BluntProtKex2 (0,2 μg) w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 65°C - 1 minuta, 72°C

- 1 minuta: 30 cykli), 72°C - 5 minut, uzyskując fragment DNA o wzorze 9 i symbolu F2NR2. Otrzymane fragmenty DNA o wzorze 8 i symbolu F1NR2 (0.05 μg) oraz o wzorze 9 i symbolu F2NR2 (0,05 μg) łączy się stosując reakcję amplifikacji DNA z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i symbolach ProtK-N-tail (0,2 μΜ) i ProtK-C-tail (0,2 μΜ), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c.. Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 67°C - 1 minuta, 72°C - 1 minuta; 30 cykli). 12°C

- 5 minut, otrzymując fragment DNA o wzorze 10 i o symbolu ProtK-Kex2Glu. Otrzymany fragment DNA klonuje się wstępnie w wektorze pCR-Blunt firmy Invitrogen postępując zgodnie z instrukcją dostarczaną wraz z zestawem tej firmy, pCR-Blunt Cloning Kit, otrzymując plazmid rekombinantowy o wzorze 11 i symbolu pCR-Blunt-ProtKKex2Glu.

P r z y k ł a d 4.

Otrzymywanie plazmidu ekspresyjnego o wzorze 12 i o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2

W celu uzyskania plazmidu ekspresyjnego o wzorze 12 i o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 przeprowadza się reakcję ligacji fragmentu DNA o wzorze 10 i o symbolu ProtK-Kex2Glu, uzyskanego na drodze trawienia DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 11 i symbolu pCR-Blunt-ProtKKex2Glu enzymami restrykcyjnymi AsuII i EcoRI, z DNA wektora plazmidowego o wzorze 13 i symbolu pPICAmp trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi w temperaturze 16°C przez 1 godzinę z użyciem 2 U DNA Iigazy faga T4, stosując bufor reakcyjny: 33 mM Tris-CH3COOH pH 7,8, 10 mM (CH3COO)2Mg, 66 mM CH3COOK, 0,5 mM DTT, 2 mM ATP. Następnie mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki Escherichia coli TOP 10F' i wysiewa na podłoże LA zawierające 100 μg/ml ampicyliny. Uzyskane kolonie bakteryjne zawierające plazmidy ekspresyjne przesiewa się na pożywkę LB z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego. W wyniku izolacji uzyskuje się DNA plazmidu ekspresyjnego o wzorze 12 i o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2, który zawiera fragment DNA kodujący zmodyfikowaną proteinazę K Tritirachium album pod kontrolą silnego promotora AOX1, co potwierdza się poprzez analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie DNA metodą Sangera.

PL 213 045 B1

P r z y k ł a d 5.

Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2

W celu uzyskania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 wykonuje się transformację komórek Pichia pastoris GS115 liniową formą DNA plazmidu ekspresyjnego o wzorze 12 i o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 powstałą w wyniku trawienia DNA plazmidu o wzorze 12 i o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 enzymem restrykcyjnym MssI. Komórki drożdży wysiewa się na podłoże YPDS zawierające 100 μg/ml zeocyny, a następnie uzyskane kolonie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 przesiewa się na podłoże YPD z dodatkiem 100 μg/ml zeocyny. W celu stwierdzenia obecności zmodyfikowanego genu proteinazy K Tritirachium album w obrębie genomu drożdży Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 wykonuje się izolację genomowego DNA z komórek drożdży, a następnie reakcję amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 1 i symbolach ProtK-N-tail i ProtK-C-tail zgodnie z przykładem 1.

P r z y k ł a d 6.

Otrzymywanie sekwencji DNA kodującej endopeptydazę Kex2 Saccharomyces cerevisiae

W celu amplifikacji DNA kodującego endopeptydazę Kex2 S. cerevisiae syntetyzuje się startery oligonukleotydowe o wzorze 1 i o symbolach FAsuIIKex2 i RNotIKex2. Reakcję amplifikacji fragmentu DNA kodującego endopeptydazę Kex2 wykonuje się z użyciem starterów FAsuIIKex2 (0,2 μΜ) i RNotIKex2 (0,2 μΜ) na matrycy DNA genomowego Saccharomyces cerevisiae (0,2 μg), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 68°C - 1 minuta, 72°C

- 2,5 minuty; 30 cykli), 72°C - 1 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wzorze 14 i symbolu BNKex2.

P r z y k ł a d 7.

Otrzymywanie plazmidu rekombinantowego o wzorze 15 i symbolu pGAPZKex2

W celu uzyskania plazmidu rekombinantowego o wzorze 15 i symbolu pGAPZKex2 przeprowadza się reakcję ligacji fragmentu DNA o wzorze 14 i o symbolu BNKex2 trawionego enzymami restrykcyjnymi AsuII i NotI z DNA wektora plazmidowego o wzorze 16 i symbolu pGAPZalfaA trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi w temperaturze 16°C przez 1 godzinę z użyciem 2 U DNA ligazy faga T4, stosując bufor reakcyjny: 33 mM Tris-CH3COOH pH 7,8, 10 mM (CH3COO)2Mg, 66 mM CH3COOK, 0,5 mM DTT, 2 mM ATP. Następnie mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki Escherichia coli TOP10F' i wysiewa na niskosolne podłoże LA o pH=7,5 zawierające 25 μg/ml zeocyny. Uzyskane kolonie bakteryjne zawierające plazmidy rekombinantowe przesiewa się na niskosolną pożywkę LB o pH=7,5 z dodatkiem 25 μg/ml zeocyny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego. W wyniku izolacji uzyskuje się DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 15 i o symbolu pGAPZKex2, który zawiera fragment DNA kodujący endopeptydazę Kex2 S. cerevisiae pod kontrolą konstytutywnego promotora GAP, co potwierdza się poprzez analizę restrykcyjną i sekwenejonowanie DNA metodą Sangera.

P r z y k ł a d 8.

Otrzymywanie plazmidu rekombinantowego o wzorze 17 i o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2

W celu otrzymania DNA integracyjnego plazmidu rekombinantowego zawierającego gen HIS4 szlaku syntezy histydyny, w pierwszej kolejności otrzymuje się na drodze reakcji PCR fragment DNA o wzorze 18 i symbolu MluI-Amp-SmaI, zawierający gen oporności na ampicylinę oraz fragmenty DNA o sekwencji rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych MluI i Smal, z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i symbolach FMluIAmp (0,2 μΜ) i RSmaIAmp (0,2 μΜ) na matrycy DNA wektora o wzorze 19 i symbolu pPIC9K (0,2 μg), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 50°C - 1 minuta, 72°C - 1,2 minuty; 5 cykli), (95°C

- 1 minuta, 66°C - 1 minuta, 12°C - 1,2 minuty; 25 cykli), 72°C 5 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wzorze 18 i symbolu MluI-Amp-SmaI. Następnie przeprowadza się reakcję ligacji otrzymanego produktu PCR o wzorze 18 i symbolu MluI-Amp-SmaI trawionego enzymami restrykcyjnymi MluI i Smal z DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 15 i symbolu pGAPZKex2

PL 213 045 B1 trawionego tymi samymi enzymami restrykcyjnymi w temperaturze 16°C przez 1 godzinę z użyciem 2 U DNA ligazy faga T4, stosując bufor reakcyjny: 33 mM Tris-CH3COOH pH 7,8, 10 mM (CH3COO)2Mg, 66 mM CH3COOK, 0,5 mM DTT, 2 mM ATP. Następnie mieszaniną ligacyjną transformuje się komórki Escherichia coli TOP10F' i wysiewa na podłoże LA zawierające 100 μg/ml ampicyliny. Uzyskane kolonie bakteryjne zawierające plazmidy rekombinantowe przesiewa się na pożywkę LB z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny i hoduje się w celu izolacji DNA plazmidowego. W wyniku izolacji uzyskuje się DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 20 i symbolu pGAP/Amp/Kex2. W kolejnym etapie na drodze reakcji PCR otrzymuje się fragment DNA zawierający sekwencję genu HIS4 wraz z sekwencją własnego promotora i drożdżowego terminatora transkrypcji oraz sekwencję rozpoznania dla enzymów restrykcyjnych BamHI i Smal o wzorze 21 i symbolu BamHI -His4-Smal. W tym celu na matrycy DNA wektora o wzorze 19 i symbolu pPIC9K (0,2 μg) przeprowadza się reakcję PCR z wykorzystaniem starterów oligonukleotydowych o wzorze 1 i symbolach FBamHIHis4 (0,2 μΜ) i RSmaIHis4 (0,2 μΜ), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl2, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 55°C - 1 minuta, 11°C - 3 minuty, 5 cykli), (95°C - 1 minuta, 66°C - 1 minuta, 11°C - 3 minuty, 25 cykli), 11°C - 5 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wzorze 21 i symbolu BamHI-His4-Smal. Fragment DNA o wzorze 21 i symbolu BamHI-His4-SmaI trawi się następnie enzymami restrykcyjnymi Smal i BamHI i klonuje w DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 20 i symbolu pGAP/Amp/Kex2, postępując jak powyżej. W ten sposób otrzymuje się DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 17 i symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2 zawierającego fragment DNA kodujący endopeptydazę Kex2 pod kontrolą konstytutywnego promotora transkrypcji GAP, terminator transkrypcji AOX1TT, gen kodujący enzym HIS4 S. cerevisiae wraz z promotorem i terminatorem, gen oporności na ampicylinę i ori replikacji ColE1.

P r z y k ł a d 9.

Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2

W celu uzyskania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2 wykonuje się transformację komórek Pichia pastoris GS115 liniową formą DNA plazmidu rekombinantowego pGAP/Amp/His4/Kex2 o wzorze 17 powstałą w wyniku trawienia DNA plazmidu pGAP/Amp/His4/Kex2 enzymem restrykcyjnym SalI lub AvrII bądź BspHI. Komórki drożdży wysiewa się na podłoże RDB nie zawierające histydyny, a następnie uzyskane kolonie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2 przesiewa się na podłoże MD. W celu stwierdzenia obecności genu endopeptydazy Kex2 S. cerevisiae w obrębie genomu drożdży Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2 wykonuje się izolację genomowego DNA z komórek drożdży, a następnie reakcję amplifikacji DNA z zastosowaniem starterów o wzorze 1 i symbolach FKex2GAP i RKex2AOX1. Reakcję amplifikacji fragmentu DNA, który zawiera fragment promotora AOX1 i fragment genu kex2 S. cerevisiae wykonuje się z użyciem starterów FKex2GAP (0,2 μΜ) i RKex2AOX1 (0,2 μΜ) na matrycy DNA genomowego Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2 (0,2 μg), w buforze zawierającym: 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 3,4 mM MgCl₂, 0,15% Triton X-100, 250 μΜ każdego z trifosforanów deoksyrybonukleozydów (dNTP) i 1 U polimerazy DNA Hypernova produkowanej przez DNA-Gdańsk II s.c., Gdańsk, Polska. Reakcję przeprowadza się w termocyklerze w następujących warunkach temperaturowo-czasowych: 95°C - 3 minuty, (95°C - 1 minuta, 61°C - 1 minuta, 72°C - 1,5 minuty; 30 cykli), 72°C 5 minut. W wyniku reakcji amplifikacji uzyskuje się fragment DNA o wielkości 1169 pz.

P r z y k ł a d 10.

Otrzymywanie rekombinantowego szczepu Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2

W celu uzyskania rekombinantowego szczepu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2 wykonuje się transformację komórek Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2 uzyskanych jak w przykładzie 9 DNA plazmidu ekspresyjnego o wzorze 12 i o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 postępując jak w przykładzie 5 lub wykonuje się transformację komórek Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 17 i o symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2, uzyskanych jak w przykładzie 5 postępując jak w przykładzie 9.

PL 213 045 B1

P r z y k ł a d 11.

Otrzymywanie proteinazy K Tritirachium album

Uzyskuje się sekwencję DNA zawierającą nieciągły gen proteinazy K Tritirachium album o wzorze 2 według przykładu 1 oraz sekwencję genu kodującego endopeptydazę Kex2 S. cerevisiae o wzorze 14 według przykładu 6. Następnie otrzymuje się zmodyfikowany ciągły gen kodujący proteinazę K Tritirachium album o wzorze 6 zgodnie z przykładem 2 oraz o wzorze 10 zgodnie z przykładem 3. W kolejnym etapie otrzymuje się DNA plazmidu ekspresyjnego o wzorze 12 i o symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 zgodnie z przykładem 4. Otrzymuje się także plazmid rekombinantowy o wzorze 17 i symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2 według przykładu 8. Następnie otrzymuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 zgodnie z przykładem 5 lub otrzymuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris

GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2 zgodnie z przykładem 9, po czym otrzymuje się rekombinantowy szczep Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2-pGAP/Amp/His4/Kex2 transformując komórki Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 DNA plazmidu rekombinantowego o wzorze 17 i symbolu pGAP/Amp/His4/Kex2 lub transformując komórki Pichia pastoris o symbolu Pichia pastoris GS115 pGAP/Amp/His4/Kex2 DNA plazmidu ekspresyjnego o wzorze 12 i symbolu pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2. Szczep hoduje się w pożywce BMGY przez 18-20 godzin w temperaturze 30°C, a następnie uzyskanym inokulum zaszczepia się pożywkę zwierającą 2% peptonu K, 1% ekstraktu drożdżo-5 wego, 2% glicerolu i 4 x 10^-5% biotyny, w bioreaktorze. Hodowlę prowadzi się w 30°C przez 46-48 godzin, dodając glicerolu jako źródła węgla. Następnie indukuje się ekspresję genu zmodyfikowanej proteinazy K poprzez dodatek metanolu. Hodowlę prowadzi się przez kolejne 4 doby. dodając metanolu jako źródła węgla i induktora oraz jonów Ca²⁺. Hodowlę prowadzi się w taki sposób, aby wartość pO2 nie spadła poniżej 20%. Następnie komórki drożdży oddziela się od płynu pohodowlanego poprzez wirowanie. Proteinazę K Tritirachium album izoluje się z pożywki pohodowlanej na drodze chromatografii oddziaływań hydrofobowych. W tym celu do pożywki, po oddzieleniu biomasy, dodaje się siarczanu amonu do stężenia końcowego w pożywce równego 2 M, sączy się przez filtr o średnicy porów 0,45 μm, a następnie oczyszcza się z wykorzystaniem chromatografii oddziaływań hydrofobowych. Elucję białka wykonuje się liniowym gradientem stężenia siarczanu amonu w wodzie. W innej opcji oczyszczania proteinazy K z pożywki pohodowlanej, stosuje się złoże w postaci hydroksyapatytu, gdzie przefiltrowaną pożywkę nanosi się na złoże i wykonuje się elucję liniowym gradientem stężenia jonów fosforanowych. Frakcje zawierające oczyszczone białko łączy się i dializuje wobec 100 mM (NH4)2CO3, a następnie suszy się ze stanu zamrożenia pod zmniejszonym ciśnieniem. W ten sposób uzyskuje się oczyszczony preparat zmodyfikowanej proteinazy K stabilny podczas przechowywania w -20°C. Aktywność zmodyfikowanej proteinazy K Tritirachium album bada się w reakcji proteolizy hemoglobiny w obecności 14 M mocznika. Stężenie białka oznacza się metodą Bradford.

PL 213 045 B1

Wykaz sekwencji <110> DNA-Gdańsk II <120> mutant proteinazy K oraz otrzymywaniu <130> PK/0535/RW <160> 38 <170> Patentin version 3.3 <210> 1 <211> 388 <212> PRT <213> artificial sequence <220>

<223> zymogen ProtK-Kex2Glu <400> 1

Met 1	Arg	Leu	Ser	Val	Leu	Leu	Ser
1 Gin	Lys	Arg	Ala 20	5 ?ro	Ala	Val	Glu
Ile	Glu	Ala 35	Arg	Gly	Glu	Met	Val 40
Lys	Glu 50	Gly	Ser	Ala	Leu	Ser 55	Ala
Ser 65	Gly	Lys	Pro	Asp	His 70	Val	Tyr
Ala	Thr	Leu	Asp	Glu 85	Asn	Met	Val
Val	Glu	Tyr	Ile 100	Glu	Gin	Asp	Ala
Thr	Asn	Ala 115	Pro	Trp	Gly	Leu	Ala 120
Thr	Ser 130	Thr	Tyr	Tyr	Tyr	Asp 135	Glu
Tyr 145	Val	Ile	Asp	Thr	Gly 150	Ile	Glu
Arg	Ala	Gin	Met	Val 165	Lys	Thr	Tyr
Gly	His	Gly	Thr 130	His	Cys	Ala	Gly
Vał	Ala	Lys 195	Lys	Thr	Gin	Leu	Phe 200
Gly	Ser 210	Gly	Gin	Tyr	Ser	Thr 215	Ile
Ser 225	Asp	Lys	Asn	Asn	Arg 230	Asn	Cys
Ser	Leu	Gly	Gly	Gly 245	Tyr	Ser	Ser
Leu	Gin	Ser	Ser 260	Gly	Val	Met	Val
Ala	Asp	Ala 275	Arg	Asn	Tyr	Ser	Pro 280
Val	Gly 2S0	Ala	Ser	Asp	Arg	Tyr 295	Asp
Gly 305	Ser	Val	LiOU	Asp	Ile 310	Phe	Gly
Trp	lis	Gly	Gly	Ser 325	Thr	Arg	Ser
Pro	His	Val	Ala 340	Gly	Łeu	Ala	Ala
Thr	Ala	Ala 355	Ser	Ala	Cys	Arg	Tyr 360
Asp	Leu	Ser	Asn	Ile	Pro	Phe	Gly

sekwencje i sposób służące jego

Leu	Leu 10	Pro	Leu	Ala	Leu	Giy 15	Leu
Gin	Arg	Ser	Glu	.Ir ΐΐ	.1.	Pro	Leu
25 Ata	Asn	Lys	Tyr	Ile	30 Val	Lys	Phe
Leu	Asp	Ala	Al a	45 Met	Glu	Lys	Ile
Lys	Asn	Val	60 Phe	Ser	Gly	Phe	Ala
Arg	V a r	75 ίιθυ	Arq	Ala	His	Pro	80 Asp
Val	90 Val	Thr	Lys	Arg	ASP	95 Ala	Gin
105 Arg	Ile	Ser	Ser	Thr	110 Ser	Pro	Gly
Ser	Ala	Gly	Gin	125 Gly	Ser	Cys	Val
Ala	Ser	His	140 Pro	Glu	Phe	Glu	Gly
Tyr	Tyr	155 Ser	Ser	Arg	Asp	Gly	160 Asn
Thr	170 Val	dy	Ser	Arg	Thr	175 Tyr	Gly
185 Gly	V<3 J_	Lys	Val	Leu	190 Asp	Asp	Asn
Ile	Ala	Giy	Met	205 Asp	Phe	Val	Ala
Pro	Lys	Gly	220 Val	Val	Ala	Ser	Leu
Ser	Vai	235 Asn	Ser	Ala	Ala	Ala	240 Arg
Ala	250 Val	Ala	Ala	Gly	Asn	255 Asn	Asn
265 Ala	Ser	Glu	Pro	Ser	270 Val	Cys	Thr
Arg	Arg	Ser	Ser	285 Phe	Ser	Asn	Tyr
Pro	Gly	Thr	300 Asp	Ile	Leu	Ser	Thr
Ile	Ser	315 Gly	Thr	Ser	Met	Ala	320 Thr
Tyr	330 Leu	Met	Thr	Leu	Gly	335 Lys	Thr
34 5 Ile	Ala	Asp	Thr	Ala	350 Asn	Lys	Gly
Thr	Val	Asn	Leu	365 Leu	Ala	Tyr	Asn

PL 213 045 B1

370 375 380

Asn Tyr Gin Ala 385 <210> 2 <211> 279 <212> PRT <213> artificial seęuence <220>

<223> maturę ProtK-Kex2Glu <400> 2

Asp

Ala

Gin

Thr

Asn

Ala

Pro

Trp

Gly

Leu

Ala

Arg

Ile

Ser

Ser

Thr

1

5

10

15

Ser

Pro

Gly

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Tyr

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly

Gin

Gly

20

2 5

30

Ser

Cys

Val

Tyr

Val

Ile

Asp

Thr

Gly

Ile

Glu

Ala

Ser

His

Pro

Glu

35

40

45

Phe

Glu

Gly

Arg

Ala

Gin

Met

Val

Lys

Thr

Tyr

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Arg

5C

55

60

Asp

Gly

Asn

Gly

His

Gly

Thr

His

Cys

Ala

Gly

Thr

Val

Gly

Ser

Arg

65

70

75

80

Thr

Tyr

Gly

Val

Ala

Lys

Lys

Thr

Gin

Leu

Phe

Gly

Va.l

Lys

Val

Leu

85

90

95

Asp

Asp

Asn

Gly

Ser

Gly

Gin

Tyr

Ser

Thr

Ile

Ile

Ala

Gly

Met

Asp

100

105

110

Phe

Val

Ala

Ser

Asp

Lys

Asn

Asn

Arg

Asn

Cys

Pro

Lys

Gly

Val

Val

115

120

125

Al a

Ser

ijSU

Ser

Leu

Gly

Gly

Gly

Tyr

Ser

Ser

Ser

val

Asn

Ser

Ala

130

135

140

Ala

Ala

Arg

Leu

Gin

Ser

Ser

Gly

Val

Met

Val

Ala

Val

Ala

Ala

Gly

145

150

155

160

Asn

Asn

Asn

A.la

Asp

Ala

Arg

Asn

Tyr

Ser

Pro

Al a

Ser

Glu

Pro

Ser

165

170

175

Val

cys

Thr

Val

Gly

Ala

Ser

Asp

Arg

Tyr

Asp

Arg

Arg

Ser

Ser

Phe

180

185

190

Ser

Asn

Tyr

Gly

Ser

Val

Leu

Asp

Ile

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Asp

Ile

195

200

205

Leu

Ser

Thr

Trp

Ile

Gly

Gly

Ser

Thr

Arg

Ser

Ile

Ser

Gly

Thr

Ser

210

215

220

Met

Ala

Thr

Pro

His

Val

Ala

Gly

Leu

Ala

Al a

Tyr

Leu

Met

Thr

Leu

225

230

235

240

Gly

Lys

Thr

Thr

Ala

Ala

Ser

Ala

Cys

Arg

Tyr

Ile

Ala

Asp

Thr

Ala

245

250

255

Asn

Lys

dy

Asp

Leu

Ser

Asn

Ile

Pro

Phe

Gly

Thr

Val

Asn

Leu

Leu

260

265

270

Ala

Tyr

Asn

Asn

Tyr

Gin

Ala

275

<210>	3
<211>	1189
<212>	DNA
<213>	artificial seguence
<220>
<223>	seguence encoding zymoge of ProtK-Kex2GIu
<220>
<221>	CDS
<222>	(13).. (1179)
<400>	3
ttattcgaaa cg atg cgt ttg tet gtt ctt ctg agt ctt ctt ccc ctc gct	51

Met Arg Leu Ser Val Leu Leu Ser Leu Leu Pro Leu Ala 15 10 ctc ggc ctc gag aag aga gct cct gc.c gtt gag cag cgc tcc gag gct 99

Leu Gly Leu Glu Lys Arg Ala Pro Ala Val Glu Gin Arg Ser Glu Ala

20 25

PL 213 045 B1

get

cct

ctg

atc

gag

gcc

ege

ggc

gag

atg

gtt

gcc

aac

aag

tac

att

147

Ala

Pro

Leu

Ile

Glu

Ala

Arg

Gly

Glu

Met

Val

Ala

Asn

Lys

Tyr

Ile

30

35

40

4 5

gtc

aag

ttc

aag

gaa

ggt

age

get

ctt

tct

get

etc

gat

get

gcc

atg

195

Val

Lys

Phe

Lys

Glu

Gly

Ser

Ala

Leu

Ser

Ala

Leu

Asp

Ala

Ala

Met

50

55

60

gag

aag

att

tct

ggc

aag

ccc

gac

cac

gtc

tac

aag

aac

g

ttc

agt

243

Glu

Lys

Ile

Ser

Gly

Lys

Pro

Asp

His

Val

Tyr

Lys

Asn

Val

Phe

Ser

65

70

75

ggt

ttc

get

gcg

acc

ctt

gac

gag

aac

atg

gtt

cgg

gtt

ctc

ege

gcc

291

Gly

Phe

Ala

Ala

Thr

Leu

Asp

Glu

Asn

Met

Val

Arg

Val

Leu

Arg

Ala

80

85

90

cat

ccc

gat

gtt

gag

tac

att

gag

cag

gat

cca

ggg

age

gtt

ggt

ctg

339

His

Pro

Asp

Val

Glu

Tyr

Ile

Glu

Gin

Asp

Pro

Gly

Ser

val

Gly

Leu

95

100

105

cqc

ttc

cct

ttt

ggt

gac

aac

age

ggc

ctt

get

ege

atc

tcc

age

acc

387

Arg

Phe

Pro

Phe

Gly

Asp

Asn

Ser

Gly

Leu

Ala

Arg

Ile

Ser

Ser

Thr

110

115

120

125

age

ccc

ggt

acc

tct

act

tac

tac

tat

gac

gaa

tct

gcc

ggc

cag

ggc

435

Ser

Pro

Gly

Thr

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Tyr

Asp

G1 u

Ser

Ala

Gly

Gin

Gly

130

135

140

tcc

tgc

gtc

tac

gtg

atc

gac

acc

ggt

atc

gag

gca

teg

cac

ccc

gag

483

Ser

cys

Val

Tyr

Val

Ile

Asp

Thr

Gly

Ile

Glu

Ala

Ser

H i s

Pro

Glu

145

150

135

ttt

gag

ggt

cgt

gcc

cag

atg

gtc

aag

acc

tac

tac

tac

tcc

age

ege

531

Phe

Glu

Gly

Arg

A li

Gin

Met

Val

Lys

Thr

Tyr

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Arg

160

165

170

gac

ggt

aac

ggc

cac

ggc

act

cac

tgc

get

ggt

acc

gtt

ggc

tcc

ega

57 9

Asp

sly

Asn

Gly

His

Gly

Thr

His

Cys

Ala

Gly

Thr

vai

Gly

Ser

Arg

175

180

185

acc

tac

ggt

gtc

gcc

aag

aag

acc

cag

ctc

ttt

ggt

gtc

aag

gtc

ctc

627

Thr

Tyr

Gly

Val

Ala

Lys

Lys

Thr

Gin

Leu

Phe

Gly

Val

Lys

Val

Leu

190

195

200

205

gat

gac

aac

gac

agt

ggc

cag

tac

tcc

acc

atc

atc

gcc

ggt

atg

gac

675

Asp

Asp

Asn

Gly

Ser

Gly

Gin

Tyr

Ser

Thr

Ile

Ile

Ala

Giy

Met

Asp

210

215

220

ttt

gtt

gcc

age

gac

ii ag

aac

aac

ege

aac

tgc

ccc

aaa

ggt

gtc

gtt

723

Phe

Val

Ala

Ser

Asp

Lys

Asn

Asn

Arg

Asn

cys

Pro

Lys

Gly

Val

Val

225

230

235

gcc

tcc

ttg

tcc

ctt

ggc

ggt

ggt

tac

tcc

tcc

tcc

gtg

aac

acjc

gcc

771

Ala

Ser

Leu

Ser

Leu

G1 y

Gly

Gly

Tyr

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Ser

Ala

240

245

250

get

gcc

agg

ctc

cag

age

tct

ggt

gtc

atg

gtc

gcc

gtc

get

gcc

ggt

819

Ala

Ala

Arg

Leu

Gin

Ser

Ser

Giy

Val

Met

Val

Ala

Val

Ala

Ala

Gly

255

260

265

aac

aac

aac

get

gac

gcc

ege

aac

tac

tcc

cct

get

tct

gag

ccc

teg

867

Asn

Asn

Asn

Ala

Asp

Ala

Arg

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ala

Ser

Glu

Pro

Ser

270

275

280

285

gtc

tgc

act

gtc

ggt

get

tct

gac

ege

tac

gac

aga

ege

tcc

age

ttc

915

Val

Cys

Thr

Val

Gly

Ala

Ser

Asp

Arg

Tyr

Asp

Arg

Arg

Ser

Ser

Phe

290

295

300

tcc

aac

tac

ggc

cłCjC

gtt

ttg

gac

atc

ttt

ggc

cct

ggt

acc

gac

att

963

Ser

Asn

Tyr

Gly

Ser

Val

Leu

Asp

Ile

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Asp

11 e

305

310

315

ctc

tcc

acc

tgg

atc

ggc

ggc

age

acc

ege

tcc

atc

tct

ggt

act

tcc

1011

Leu

Ser

Thr

Trp

Ile

Gly

Giy

Ser

Thr

Arg

Ser

Ile

Ser

Gly

Thr

Ser

320

325

330

atg

get

act

ccc

cac

gtt

gcc

ggt

ctc

get

gcc

tac

ctc

atg

act

ctt

1059

Met

Ala

Thr

Pro

His

Val

Ala

Gly

Leu

Ala

Ala

Tyr

Leu

Met

Thr

Leu

335

340

34 5

gga

aag

act

acc

gcc

gcc

age

get

tgc

ega

tac

att

gcc

gac

acc

gcc

1107

Gly

Lys

Thr

Thr

A.la

Ala

Ser

Ala

Cys

Arg

Tyr

He

Ala

Asp

Thr

Ala

PL 213 045 B1

350

355

360

365

ctćłC

aag

ggc

gac

ttg

agc

aac

att

ccc ttc

ggc

act

gtc

aac

ctg

ctt

Asn

Lys

Giy

Asp

Leu

Ser

Asn

Ile

Pro Phe

Gly

Thr

vai

Asn

Leu

Leu

370

375

380

gcc

tac

aac

aac

tac

cag

gct

taa

gaattcaa

,t a

Aj. <3.

Tyr

Asn

Asn

Tyr

GTn

ti. —L. (Ξι

385 <210> 4 <211> 388 <212> PRT <213> artificiai seouence <220>

<223> Synthetic Construct <400> 4

Met 1

Arg

Leu

Ser

Vał [Z

Leu

Leu

Ser

Leu

Leu 10

Pro

Leu

Ala

Leu

Gly 15

Leu

Glu

Lys

Arg

Ala

Pro

Ala

Val

Glu

Gin

Arg

Ser

Glu

Ala

Ala

Pro

Leu

20

25

30

ile

Glu

Ala

Arg

Gly

Glu

Met

Val

Ala

Asn

Lys

Tyr

Ile

Yal

Lys

Phe

35

40

45

Lys

Glu

Gly

Ser

Ala

Leu

Ser

Ala

Leu

Asp

Ala

Ala

Met

Glu

Lys

Ile

50

55

60

Ser

Gly

Lys

Pro

Asp

His

Val

Tyr

Lys

Asn

Val

Phe

Ser

Gly

Phe

Ala

65

70

75

80

Ala

Thr

Leu

Asp

Glu

Asn

Met

Yal

Arg

Val

Leu

Arg

Ala

His

Pro

Asp

85

90

95

v a l

Glu

Tyr

Ile

Glu

Gin

Asp

Pro

Gly

Ser

Val

Gly

Leu

Arg

Phe

Pro

100

105

110

Phe

Gly

Asp

Asn

Ser

Gly

Leu

Ala

Arg

Ile

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro

Gly

115

120

125

Thr

Ser

Thr

Tyr

Tyr

Tyr

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly

Gin

Gly

Ser

Cys

Val

130

135

140

Tyr

Val

He

Asp

Thr

Gly

Ile

Giu

Ala

Ser

His

Pro

Glu

Phe

Glu

Gly

145

150

155

160

Arg

Ala

Gm

Met

Val

Lys

Thr

Tyr

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Arg

Asp

Giy

Asn

165

170

175

Gly

His

Gly

Thr

His

Cys

Ala

Gly

Thr

Val

Giy

Ser

Arg

Thr

Tyr

Gly

180

185

190

Val

Ala

Lys

Lys

Thr

Gin

Leu

Phe

Giy

Val

Lys

Val

Leu

Asp

Asp

Asn

195

200

205

Gly

Ser

Gly

Gin

Tyr

Ser

Thr

Ile

Ile

Ala

Giy

Met

Asp

Phe

Yal

Ala

210

215

220

Ser

Asp

Lys

Asn

Asn

Arg

Asn

Cys

Pro

Lys

Gly

Val

Yal

Ala

Ser

Leu

225

230

235

240

Ser

Leu

Gly

Gly

Gly

Tyr

Ser

Ser

Ser

Val

Asn

Ser

Ala

Ala

Ala

Arg

245

250

255

Leu

Gin.

Ser

Ser

Gly

Yal

Met

Yal

Ala

Val

Ala

Ala

Gly

Asn

Asn

Asn

260

265

270

Ala

Asp

Ala

Arg

Asn

Tyr

Ser

Prc

Ala

Ser

Glu

Pro

Ser

Yal

Cys

Thr

275

280

285

Yal

Gly

Ala

Ser

Asp

Arg

Tyr

Asp

Arg

Arg

Ser

Ser

Phe

Ser

Asn

Tyr

290

295

300

Gly

Ser

Val

Leu

Asp

Ile

Phe

Gly

Pro

Gly

Thr

Asp

Ile

Leu

Ser

Thr

305

310

315

320

Trp

Ile

Gly

Gly

Ser

Thr

Arg

Ser

Ile

Ser

Gly

Thr

Ser

Met

Ala

Thr

325

330

335

Pro

His

Val

Ala

Gly

Leu

Ala

Ala

Tyr

Leu

Met

Thr

Leu

Gly

Lys

Thr

340

345

350

Thr

Ala

Ala

Ser

Ala

Cys

Arg

Tyr

Ile

Al a

Asp

Thr

Ala

Asn

Lys

Gly

355

360

365

Asp

Leu

Ser

Asn

Ile

Pro

Phe

Gly

Thr

Yal

Asn

Leu

Leu

Ala

Tyr

Asn

370

375

380

PL 213 045 B1

Asn Tyr Gin Ala

385 <210 S <211> 40 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

<223> primer ProŁK-N-tail <400> 5 ttattcgaaa cgatgcgttt gtctgttctt ctgagtettc <210> 6 <211> 39 <212> DNA artificial seąuence <220 <223> primer ProtK-C-tail <400 6 atattgaatt cttaagcctg gtagttgttg taggcaagc <210 7 <211> 40 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

<223> primer ProtKExonlZ <400 7 gtactcaaca tcgggatggg cgcggagaac ccgaaccatg <210 8 <211> 7€ <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

<223> primer ProtftExon2-MutK2Z <400 8 ggttctccgc gcccatcccg atgttgagta cattgagcag gatgctgttg tcaccaaaag ggctgcgcag accaac

<210>	9
<210	54
<212>	DNA
<213>	artificial seąuence
<220>
<223>	primer FAsulIKex2
<400>	9

tcccttcgaa acgatgaaag tgaggaaata tattacttta tgcttttggt gggc <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> artificial seąuence <220 <223> primer RNotIKex2 <400 10 tgatgcggcc gctcacgatc gtccggaaga tggaggaac <210 11.

<211> 22 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

<223> primer FKex2GAP <400> 11 ccccttgcag caatgctctt cc <210> 12 <211> 34 <212> DRA

PL 213 045 B1 <213> artificial sequence <220>

<223> primer RKex2AQXl <400 12 atctcttccc tcagtaacac cttttactaa agcc <210 13 <211> 34 <212> DNA <213> artificial seguence <220>

<223> primer FMluIAmp <400 13 tattacgcgt ttaccaatgc ttaatcagtg aggc <210 14 <211> 36 <212> DNA <213> artificial seguence <220 <223> primer RSmalAmp <400 14 aattcccggg cgaataataa ctgttatttt tcagtg <210 15 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> primer FGlu <400 15 gctgttgtca ccaaaaggga agcgcagacc aacgctccct gg <210 16 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> primer RGlu <400> 16 ccagggagcg ttggtctgcg cttccctttt ggtgacaaca gc <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequence <220>

<223> primer FBamHIHis4 <400> 17 ttttggatcc tcagaattgg ttaattggtt gtaacac <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> artificial sequerice <220>

<223> primer RSmaXHis4 <400 18 aattcccggg ttaaataagt cccagtttct ccatacg <210> 19 <210 1252 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

<223> encoding fragment ProtK-ex-in--ex <400> 19 ttattcgaaa cgatgcgttt gtctgttctt ctgagtcttc ttcccctcgc tctcggcctc gagaagagag c.tcctgccgt tgagcagcgc tccgaggctg ctcctctgat cgaggcccgc

120

PL 213 045 B1 ggcgagatgg ttgccaacaa gtacattgtc ctcgatgctg ccatggagaa gatttctggc agtggtttcg ctgcgaccct tgacgagaac gtaagttttc ccatctataa tctcttcccc caggttgagt acattgagca. ggatgctgtt ccctggggcc ttgctcgcat ctccagcacc gaatctgccg gccagggctc ctgcgtctac ceegagtttg agggccgtgc ccagatggtc aacggccacg gcactcactg cgctggtacc aagacccagc tctttggtgt caaggtcctc atcatcgccg gtatggactt tgttgccagc gtcgttgcct ccttgtccct tggcggtggt aggctccaga gctctggtgt catggtcgcc cgcaactact cccctgcttc tgagccctcg gacagacgct ccagcttctc caactacggc gacattctct ccacctggat cggcggcagc actccccacg ttgccggtct cgctgcctac agcgcttgcc gatacattgc cgacaccgcc ggcactgtca acctgcttgc ctacaacaac 20

4765 DNA artificial sequence aagttcaagg aagcccgacc atggttcggg taaaaagtct gtcaccaaaa agccccggta gtgatcgaca aagacctact gttggctccc gatgacaacg gacaagaaca tactcctcct gtcgctgccg gtctgcactg agcgttttgg acccgctcca ctcatgactc aacaagggcg taccaggctt aaggtagcgc acgtctacaa ttctccgcgc ctcccttcta gggctgcgca cctctactta ccggtatcga actactccag gaacctacgg gcagtggcca accgcaa ct g ccgtgaacag gtaacaacaa tcggtgcttc acatctttgg tctctggtac ttggaaagac acttgagcaa aagaattcaa tctttctgct gaacgtcttc.

ccatcccgat atatcgccgt gaccaacgct ctactatgac ggcatcgcac ccgcgacggt tgtcgccaag gtactccacc ccccaaaggt cgccgctgcc cgctgacgcc tgaccgctac ccctggtacc ttccatggct taccgccgcc cattcccttc ta

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1252 <210> <211 > <212> <213> <220> <223> <400>

plasmid pCR-BluntProt 20 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa ttaggtgacg cgttagaata ctcaagetat ctaataacgg ccgccagtgt gctggaattc tgtaggcaag caggttgaca gtgccgaagg tgtcggcaat gtatcggcaa gcgctggcgg cagcgagacc ggcaacgtgg ggagtagcca cgccgatcca ggtggagaga atgtcggtac agttggagaa gctggagcgt ctgtcgtagc gctcagaagc aggggaqtag ttgcgggcgt ccatgacacc agagctctgg agcctggcag ;aaggaggca acgacacctt :ataccggcg atgatggtgg ccttgacacc aaagagctgg gtcttcttgg cagcgcagtg agtgccgtgg ccgttaccgt tctgggcacg gccctcaaac tcggggtgcg cgcaggagcc ctggccggca gattcgtcat tggagatgcg agcaaggccc catcctgctc aatgtactca agagattata gatgggaaaa cgtcaagggt cgcagcgaaa aaatcttctc catggcagca tcgagagcag tgtacttgtt ggcaaccatc tcgccgcggg gctcaacggc aggagctctc ttctcgaggc cagacaaacg catcgtttcg aataaccctg cgctcgagca tgcatctaga gggcccaatt ;ttacaacgt iccccctttc cttcccaaca gttgcgcagc agagccgtta tcgtctgttt gtggatgtac ggar.ggtgat ccccctagcc agtgcacgtc acccggtggt gcatatcggg gatgaaagct tgccggtctc cgttatcggg gaagaagtgg aaaacgccat taacctgatg ttctggggaa

C CJ C C o. <5. G CJ CJ 3 caacaaagtc cagggagcgt acctgacggc cttacatcgg ccactgaaga tggccgtcgt ttgcagcaca cgtgactggg gccagctggc ctatacgtac cgcgttggcc gtgagcgcaa ttatgcttcc acagctatga gcatcaagct aggtattgaa gaatgttgct cggtagtctt tggaagtacc cagggccaaa ggtcagaagc cagcgttgtt cggcgctgtt tggggcagtt agtactggcc cgacaccgta cgcggctgga atgcctcgat agtagtaagt tggtctgcgc gatattagaa gatgggcgcg cgttcttgta aaagagcgct cctcgatcag cgagagcgag aattctgcag cgccctatag aaaaccctgg gtaatagcga ggcagtttaa agagtgatat tgctgtcaga ggcgcatgat ctgatctcag tataaatgtc gattcattaa cgcaattaat ggctcgtatg ccatgattac tggtaccgag ttcttaagcc caagtcgccc tccaagagtc agagatggag gatgtccaaa accgacagtg gttaccggca cacggaggag gcggttgttc actgccgttg ggttcgggag gtagtagtag accggtgtcg agaggtaccg agcccttttg ggąagagact gagaacccga gacgtggtcg accttccttg aggagcagcc gggaagaaga atatccatca tgagtcgtat cgttacccaa agaggcccgc ggtttacacc tattgacacg taaagtctcc gaccaccgat ccaccgcgaa aggcatgaga tgcagctggc gtgagttagc ttgtgtggaa gccaagctat ctcggatcca tggtagttgt ttgttggcgg atgaggtagg cgggtgctgc acgctgccgt cagaccgagg gcgacggcga gagtaaccac ttgtcgctgg tcatcgagga ccaacggtac gtcttgacca atcacgtaga gggctggtgc Cf t CJ a C 3.0. C 3.CJ ttttagggga accatgttct ggcttgccag aacttgacaa tcggagcgct ctcagaagaa cactggcggc tacaattcac cttaatcgcc accgatcgcc tataaaagag ccggggcgac gtgaa cttt atggccagtg aatgacatca ttatcaaaaa

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

PL 213 045 B1 ggatcttcac ctagatcctt ttcacgtaga aagccagtcc gcagaaacgg tgctgacccc 2220 ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa cgcaagcgca aagagaaagc 2280 aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg ggcggtttta tggacagcaa 2340 gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt tgggaagccc tgcaaagtaa 2400 actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag gggatcaagc tctgatcaag 2460 agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg attgcacgca ggttctccgg 2520 ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca acagacaatc ggctgctctg 2580 atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt tctttttgtc aagaccgacc 2640 tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaagacg aggcagcgcg gctatcgtgg ctggccacga 2700 cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga agcgggaagg gactggctgc 2760 tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca ccttgctcct gccgagaaag 2820 tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct tgatccggct aectgeccat 2880 tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc. gagcacgtac tcggatggaa gccggtcttg 2940 tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc gccagccgaa ctgttcgcca 3000 ggctcaaggc gagcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt gacccatggc gatgcctgct 3060 tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt catcgactgt ggccggctgg 3120 gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg tgatattgct gaagagcttą 3180 gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat cgccgctccc gattcgcagc 3240 gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgaat tattaacgct tacaatttcc 3300 tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcatc aggtggcact 3360 tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 3420 tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatagcacgt gaggagggcc 3480 accatggcca agttgaccag tgccgttccg gtgctcaccg cgcgcgacgt cgccggagcg 3540 gtcgagttct ggaccgaccg gctcgggttc tcccgggact tcgtggagga cgacttcgcc 3600 ggtgtggtcc gggacgacgt gaccctgttc atcagcgcgg tccaggacca ggtggtgccg 3660 gacaacaccc tggcctgggt gtgggtgcgc ggcctggacg agctgtacgc cgagtggtcg 3720 gaggtcgtgt ccacgaactt ccgggacgcc tccgggccgg ccatgaccga gatcggcgag 3780 cagccgtggg ggcgggagtt cgccctgcgc gacccggccg gcaactgcgt gcacttcgtg 3840 gccgaggagc aggactgaca cgtgctaaaa cttcattttr aatttaaaag gatctaggtg 3900 aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga 3960 gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta 4020 atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa 4080 gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact 4140 gttcttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca 4200 tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt 4260 accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg 4320 ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgaeetaca ecgaactgag atacctacag 4380 cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta 4440 agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat 4500 ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg 4560 tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc 4620 ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac 4680 cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc 4740 gagtcagtga gcgaggaagc ggaag 4765 <210> 21 <211> 309 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

<223> encoding fragment FragNRl <400> 21 ttattcgaaa cgatgcgttt gtctgttctt ctgagtettc ttcccctcgc tctcggcctc 60 gagaagagag ctcctgccgt tgageagege tccgaggctg ctcctctgat cgaggcccgc 120 ggcgagatgg ttgccaacaa gtacattgtc aagttcaagg aaggtagcgc rctttctgct 180 etegatgetg ccatggagaa gatttctggc aagcccgacc acgtctacaa gaacgtcttc 240 agtggtttcg ctgcgaccct tgacgagaac atggttcggg ttctccgcgc ccatcccgat 300 gttgagtac 309 <210> 22 <211> 911 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

PL 213 045 B1 <223> encoding fragment FragNRŻ <400> 22 ggttctccgc gcccatcccg atgttgagta cattgagcag ggctgcgcag accaacgctc cctggggcct tgctcgcatc ctctacttac tactatgacg aatctgccgg ccagggctcc cggtatcgag gcatcgcacc ccgagtttga gggccgtgcc ctactccagc cgcgacggfca acggccacgg cactcactgc aacctacggt gtcgccaaga agacccagct ctttggtgtc cagtggccag tactccacca tcatcgccgg tatggacttt ccgcaactgc cccaaaggtg tcgttgcctc cttgtccctt cgtgaacagc gccgctgcca ggctccagag ctctggtgtc taacaacaac gctgacgccc gcaactactc ccctgcttct cggtgcttct gaccgctacg acagacgctc cagcttctec catctttggc cctggtaccg acattctctc cacctggatc ctctggtact tccatggcta ctccccacgt tgccggtctc tggaaagact accgccgcca gcgcttgccg atacattgcc cttgagcaac attcccttcg gcactgtcaa cctgcttgcc agaattcaat a <210> 23 <211> 1189 <212> DNA <213> artificial seguence <220 <220 encoding fragment ProtK-Kex2 <400 23 ttattcgaaa gagaagagag ggcgagatgg ctcgatgctg agtggtttcg gttgagtaca tggggccttg tctgccggcc gagtttgagg ggccacggca acccagctct atcgccggta gttgcctcct ctccagagct aactactccc agacgctcca attctctcca ccccacgttg gcttgccgat actgtcaace <210 24 <210 4701 <212> DNA <213> artificial seguence <220 <223> plasmid pC3-Blunt-ProtKex2 <400> 24 agcgcccaat acgacaggtt tcactcatta ttgtgagcgg ttaggtgacg ctagtaacgg cttctgagtc cgctccgagg gtcaagttca ggcaagcccg cgatgcgttt ctcctgccgt ttgccaacaa ccatggagaa ctgcgaccct Łtgagcagga ctcgcatctc agggctcctg gccgtgccca ctcactgcgc ttggtgtcaa tggactttgt tgtcccttgg etggtgtcat ctgcttctga gcttctccaa cctggatcgg ccggtctcgc acattgccga tgcttgccta acgcaaaccg tcccgactgg ggcaccccag ataacaattt cgttagaata ccgccagtgt ttcttcccct ctgctcctct aggaaggtag accacgtcta gtctgttctt tgagcagcgc gtacattgtc gatttctggc tgacgagaac tgctgttgtc cagcaccagc cgtctacgtg gatggtcaag tggtaccgtt ggtcctcgat tgccagcgac cggtggttac ggtcgccgtc gccctcggtC ctacggcagc cggcagcacc tgcctacctc caccgccaac caacaactac cctctccccg aaagcgggca gctttacact cacacaggaa ctcaagctat gctggaattc cgctctcggc gatcgaggcc cgctctttct caagaacgtc ctgagtcttc tccgaggctg aagttcaagg aagecegaec atggtteggg accaaaaągg cccggtacct atcgacaccg acctactact ggctcccgaa gacaacggca aagaacaacc tcctcctccg gctgccggta tgcactgtcg gttttggaca cgctccatct atgactcttg aagggcgact caggcttaag cgcgttggcc gtgagcgcaa ttatgcttcc acagctatga gcatcaagct aggttattcg ctcgagaaga cgcggcgaga gctctcgatg ttcagtggtt gatgctgttg tccagcacca tgcgtctacg cagatggtca gctggtaccg aaggtcctcg gttgccagcg ggcggtggtt atggtcgccg gagccctcgg aactacggca ggcggcagca gctgcctacc gacaccgcca tacaacaact t i cccctcgc ctcctctgat aaggtagcgc acgtctacaa ttctccgcgc ctgcgcagac ctacttacta gtatcgaggc actccagccg cctacggtgt gtggccagta gcaactgccc tgaacagcgc acaacaacgc gtgcttctga tctttggccc ctggtacttc gaaagactac tgagcaacat aattcaata gattcattaa cgcaattaat ggctcgtatg ccatgattac tggtaccgag aaacgatgcg gagctcctgc tggttgccaa ctgccatgga tcgctgcgac tcaccaaaag gccccggtac tgatcgacac agacctacta ttggctcccg atgacaacgg acaagaacaa actcctcctc tcgctgccgg tctgcactgt gcgttttgga cccgctccat tcatgactct acaagggcga accaggctta

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

911 tctcggcctc cgaggcccgc tctttctgct gaacgtcttc ccatcccgat caacgctccc ctatgacgaa atcgcacccc cgacggtaac cgccaagaag ctccaccatc caaaggtgtc cgctgccagg tgacgcccgc ccgctacgac tggtaccgac catggctact cgccgccagc tcccttcggc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1139 tgcagctggc gtgagttagc ttgtgtggaa gccaagctat ctcggatcca tttgtctgtt cgttgagcag caagtacatt gaagatttct ccttgacgag

120

180

240

300

360

420

480

540

600

PL 213 045 B1 aacatggttc gggttctccg cgcccatccc gatgttgagt acattgagca ggatgctgtt 660 gtcaccaaaa gggc.tgcgca gaccaacgct ccctggggcc ttgctcgcat ctccagcacc 720 agccccggta cctctactta ctactatgac gaatctgccg gccagggctc ctgcgtctac 780 gtgatcgaca ccggtatcga ggcatcgcac cccgagtttg agggccgtgc ccagatggtc 840 aagacctact actactccag ccgcgacggt aacggccacg gcactcactg cgctggtacc 900 gttggctccc gaacctacgg tgtcgccaag aagacccagc tctttggtgt caaggtcctc 960 gatgacaacg gcagtggcca gtactccacc atcatcgccg gtatggactt tgttgccagc 1020 gacaagaaca accgcaactg ccccaaaggt gtcgttgcct ccttgtccct tggcggtggt 1080 tactcctcct ccgtgaacag cgccgctgcc aggctccaga gctctggtgt catggtcgcc 1140 gtcgctgccg gtaacaacaa cgctgacgcc cgcaactact cccctgcttc tgagccctcg 1200 gtctgcactg tcggtgcttc tgaccgctac gacagacgct ccagcttctc caactacggc 1260 agcgttttgg acatctttgg ccctggtacc gacattctct ccacctggat cggcggcagc 1320 acccgctcca tctctggtac ttccatggct actccccacg ttgccggtct cgctgcctac 1380 ctcatgactc ttggaaagac taccgccgcc agcgcttgcc gatacattgc cgacaccgcc 1440 aacaagggcg acttgagcaa cattcccttc ggcactgtca acctgcttgc ctacaacaac 1300 taccaggctt aagaattcaa tacctgaatt ctgcagatat ccatcacaet ggcggccgct 1560 cgagcatgca tctagagggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca attcactggc 1620 cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 1680 agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 1740 ccaacagttg cgcagcctat acgtacggca gtttaaggtt tacacctata aaagagagag 1800 ccgttatcgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt gacacgccgg ggcgacggat 1860 ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa gtctcccgtg aactttaccc 1920 ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc accgatatgg ccagtgtgcc 1980 ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac cgcgaaaatg acatcaaaaa 2040 cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc atgagattat caaaaaggat 2100 cttcacctag atccttttca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat 2160 gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt 2220 agcttgcagt gggcttaeat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga 2280 accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg 2340 gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagctctg atcaagagac 2400 aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 2460 ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 2520 cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 2580 cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 2640 cgttcettge gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 2700 gggcgaagtg ccggggcagg atctcetgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 2760 catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcceattcga 2320 ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 2880 tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 2940 caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 3000 gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 3060 ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag agcttggcgg 3120 cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 3180 cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgaattatt aacgcttaca atttcctgat 3240 gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatcaggt ggcacttttc 3300 ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc 3360 cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata gcacgtgagg agggccacca 3420 tggccaagtt gaccagtgcc gttccggtgc tcaccgcgcg cgacgtcgcc ggagcggtcg 3480 agttctggac cgaccggctc gggttctccc gggacttcgt ggaggacgac ttcgccggtg 3540 tggtccggga cgacgtgacc ctgttcatca gcgcggtcca ggaccaggtg gtgccggaca 3600 acaccctggc ctgggtgtgg gtgcgcggcc tggacgagct gtacgccgag tggtcggagg 3660 tcgtgtccac gaacttccgg gacgcctccg ggccggccat gaccgagatc ggcgagcagc 3720 cgtgggggcg ggagttcgcc ctgcgcgacc cggccggcaa ctgcgtgcac ttcgtggccg 3780 aggagcagga ctgacacgtg ctaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 3840 tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 3900 cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 3960 gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 4020 taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcageagagc gcagatacca aatactgttc 4080 ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 4140 tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 4200 ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 4260 cgtgcacaca gcccagcttg gagc.gaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 4320

PL 213 045 B1 agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac gggggcggag cctatggaaa aacgceagca gctggccttt tgctcacatg ttctttccŁg ttaccgcctt tgagtgagct gataccgcte cagtgagcga ggaagcggaa g <210> 25

363 DMA artificial seguence <211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

fragment F1NR2 encoding ttattcgaaa cgatgcgttt gtctgttctt gagaagagag ctcctgccgt tgagcagcgc ggcgagatgg ttgccaacaa gtaeattgtc ctcgatgctg ccatggagaa gatttctggc agtggtttcg ctgcgaccct tgacgagaac gttgagtaca ttgagcagga tccagggage agc

863 DNA artificial seguence <210> <211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

encoding fragment F2NR2 26 gctgttgtca ccaaaaggga agcgcagacc agcaccagcc ccggtacctc tacttactac gtctacgtga tcgacaccgg tatcgaggca atggtcaaga cctactacta ctccagccgc ggtaccgttg gctcccgaac ctacggtgtc gtcctcgatg acaacggcag tggccagtac gccagcgaca agaacaaccg caactgcccc ggtggttact cctcctccgt gaacagcgcc gtcgccgtcg ctgccggtaa caacaacgct ccctcggtct gcactgtcgg tgcttctgac tacggcagcg tfcttggacat ctttggcc.ct ggcagcaccc gctccatctc tggtacttcc gcctacctca tgactcttgg aaagactacc accgccaaca agggcgactt gagcaacatt aacaactacc agqcttaaga attcaata <210> 27 ' <211> 1189 <212> DNA <213> artificial. seouence <220> * ggagaaaggc agcttccagg ttgagcgtcg acgcggcctt cgttatcccc gccgcagccg ggacaggtat gggaaacgcc atttttgtga tttacggttc tgattctgtg aa cgaccgag ccggtaagcg tggtatcttt tgctcgtcag ctggcctttt gataaccgta egeagegagt

4380

4440

4500

4560

4620

4630

4701 ctgagtcttc tccgaggctg aagttcaagg aagcccgacc atggttcggg gttggtctgc ttcccctcgc ctcctctgat aaggtagcgc acgtctacaa ttctccgcgc gcttcccttt tctcggcctc cgaggcccgc tctttctgct gaacgtcttc ccatcccgat tęgtgacaac

120

180

240

300

360

363 aacgctccct tatgacgaat tcgeaccccg gacggtaacg gccaagaaga tccaccatca aaaggtgtcg gctgccaggc gacgcccgca cgctacgaca ggtaccgaca atggctactc gccgccagcg ccctteggca ggggccttgc ctgccggcca agtttgaggg gccacggcac cccaget.ctt tcgccggtat ttgcctcctt tccagagctc actactcccc gacgctccag ttctctccac cccacgttgc ettgeegata ctgtcaacct gggctcctgc ccgtgcccag tcactgcgct tggtgtcaag ggactttgtt gtcccttgge tggtgtcatg tgcttctgag cttctccaac ctggatcggc cggtctcgct cattgccgac gcttgcctac

120 130 240 300 360 4 20 4 80 540 600 660 720 780 840 868 <223> encoding fragment ProŁK-Kex2Glu <400> 27 ttattcgaaa cgatgcgttt gtctgttctt ctgagtcttc gagaagagag ctcctgccgt tgagcagcgc tccgaggctg ggcgagatgg ttgccaacaa gtaeattgtc aagttcaagg ctcgatgctg ccatggagaa gatttctggc aagcccgacc agtggtttcg ctgcgaccct tgacgagaac atggttcggg gttgagtaca ttgagcagga tccagggage gttggtctgc ageggeettg ctcgcatctc cagcaccagc cccggtacct tctgccggcc agggctcctg cgtctacgtg atcgacaccg gagtttgagg gccgtgccca gatggtcaag acctactact ggccacggca ctcactgcgc tggtaccgtt ggctcccgaa acccagctct ttggtgtcaa ggtcctcgat gacaacggca atcgccggta tggactttgt tgccagc.gac aagaacaacc ttcccctcgc ctcctctgat aaggtagcgc acgtctacaa ttctccgcgc gcttcccttt ctacttacta gtatcgaggc actccagccg cctacggtgt gtggccagta gcaactgccc tctcggcctc cgaggcccgc tctttctgct gaacgtcttc ccatcccgat tggtgacaac ctatgacgaa atcgcacccc cgacggtaac cgccaagaag ctccaccatc caaaggtgtc

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

PL 213 045 B1 gttgcctcct tgtcccttgg cggtggttac tcctcctccg tgaacagcgc cgctgccagg 780 ctccagagct ctggtgtcat ggtcgccgtc gctgccggta acaacaacgc tgacgcccgc 840 aactactccc ctgcttctga gccctcggtc tgcactgtcg gtgcttctga ccgctacgac 900 agacgctcca gcttctccaa ctacggcagc gttttggaca tctttggccc tggtaccgac 960 attctctcca cctggatcgg cggcagcacc cgctccatct ctggtacttc catggctact 1020 ccccacgttg ccggtctcgc tgcctacctc atgactcttg gaaagactac cgccgccagc 1080 gcttgccgat acattgccga caccgccaac aagggcgact tgagcaacat tcccttcggc 1140 actgtcaacc tgcttgccta caacaactac caggettaag aattcaata 1189 <210> 28 <211> 4701 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

<223> plasmid pCR-Blunt-ProtKKex2Glu <400> 28 agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc gg acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat gtgagttagc 1.20 tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg ttgtgt.ggaa 180 ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac gccaagctat: 240 ttaggtgacg cgttagaata ctcaagctat gcatcaagct tggtaccgag ctcggatcca 300 ctagtaacgg ccgccagtgt gctggaattc aggttattcg aaacgatgcg tttgtctgtt 360 cttctgagtc ttcttcccct cgctctcggc ctcgagaaga gagctcctgc cgttgagcag 420 egctccgagg ctgctcctct gatcgaggec cgcggcgaga tggttgccaa caagtacatt 480 gtcaagttca aggaaggtag cgctctttct gctc.tcgatg ctgccatgga gaagatttct 540 ggcaagcccg accacgtcta caagaacgtc ttcaątggtt tcgctgcgac ccttgacgag 600 aacatggttc gggttctccg cgcccatccc gatgttgagt acattgagca ggatccaggg 660 agcgttggtc tgcgcttccc ttttggtgac aacagcggcc ttgctcgcat ctccagcacc 720 agccccggta cctctactta ctactatgac gaatctgccg gccagggctc ctgcgtctac 780 gtgatcgaca ccggtatcga ggcatcgcac cccgagtttg agggccgtgc ccagatggtc 840 aagacctact actactccag ccgcgacggt aacggccacg gcactcactg cgctggtacc 900 gttggc.tccc gaacctacgg tgtcgccaag aagacccagc tctttggtgt caaggtcctc 960 gatgac.aacg gcagtggcca gtactccacc atcatcgccg gtatggactt tgttgccagc 1020 gacaagaaca accgcaactg ccccaaaggt gtcgttgcct ccttgtccct tggcggtggt 1080 tactcctcct ccgtgaacag cgccgctgcc aggctccaga gctctggtgt catggtcgcc 1140 gtcgctgccg gtaacaacaa cgctgacgcc cgcaactact cccctgcttc tgagccctcg 1200 gtctgcactg tcggtgcttc tgaccgctac gacagacgct ccagcttctc caactacggc 1260 agcgttttgg acatctttgg ccctggtacc gacattctct ccacctggat cggcggcagc 1320 acccgctcca tctctggtac ttccatggct actccccacg ttgccggtct cgctgcctac 1380 ctcatgactc ttggaaagac taccgccgcc agcgcttgcc gatacattgc cgacaccgcc 1440 aacaagggcg acttgagcaa cattcccttc ggcactgtca acctgettac ctacaacaac 1500 taccaggctt aagaattcaa tacctgaatt ctgcagatat ccatcacact ggcggccgct 1560 cgagcatgca tctagagggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca at.tcactggc 1620 cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcąccttgc 1680 agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 1740 ccaacagttg cgcagcctat acgtacggca gtttaaggtt tacacctata aaagagagag 1800 ccgttat.cgt ctgtttgtgg atgtacagag tgatattatt gacacgccgg ggcgacggat 1860 ggtgatcccc ctggccagtg cacgtctgct gtcagataaa gtctcccgtg aactttaccc 1920 ggtggtgcat atcggggatg aaagctggcg catgatgacc accgatatgg ccagtgtgee 1980 ggtctccgtt atcggggaag aagtggctga tctcagccac cgcgaaaatg acatcaaaaa 2040 cgccattaac ctgatgttct ggggaatata aatgtcaggc atgagattat caaaaaggat 2100 cttcacctag atcctrttca cgtagaaagc cagtccgcag aaacggtgct gaccccggat 2160 gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag ggaaaacgca agcgcaaaga gaaagcaggt 2220 agcttgeagt gggcttacat ggcgatagct agactgggcg gttttatgga cagcaagcga 2280 accggaattg ccagctgggg cgccctctgg taaggttggg aagccctgca aagtaaactg 2340 gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg gcgcagggga tcaagctctg atcaagagac 2400 aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 2460 ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 2520 cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 2580 cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 2640 cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 2700 gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 2760 catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 2320

PL 213 045 B1 ccaccaagcg tcaggatgat caaggcgagc gaatatcatg ggcggaccgc cgaatgggct cgccttctat gcggtatttt ggggaaatgt cgctcatgag tggccaagtt agt tct gga c. fcggtccggga acaccctggc t cg fc g t cc sc cgtgggggcg aggagcagga tcctttttga cagaccccgt gctgcttgca taccaactct ttctagtgta tcgctctgct ggttggactc cgtgcacaca agctatgaga gcagggtcgg atagtcctgt gggggcggag gctggccttt ttaccgcctt cagtgagcga <210 29 <211> 7157 <212> DNA <213> artificiai sequenee <220>

<223> plastnid pPIC/Amp/ProtK/Glu/Kex2 <400> 29 agatccgcac aaacgaaggt ctcacttaat cttctgtact ccaagaaaaa catcaaactc gaatgatttt cccaaacccc ctgcgagata ggctgatcag gagcaagctc gtacgagaag tcctatacta tataggttac saataaaaaa gtatcaaaaa aaggtctcac ttaatcttct gtactctgaa gaggagtggg aactcgaatg attttcccaa acccctacca caagatattc atcaggagca agctcgtacg agaagaaaca aaatgacaaa gttacaaata aaaaagtatc aaaaatgaag cctgcatctc catcctcttg attagaatct agcaagaccg gtcttctcgt ggaacagtca tgtctaaggc tacaaactca atgatgatga atteagatcc tcttctgaga tgagtttttg ttctagaagc tcttcaatct ttttcgtaac accattattg gctactatct ttctccctgg gaattcttaa gcctggtagt tgttgtaggc agggaatgtt gctcaagtcg cccttgttgg cggtgtcggc cggcggtagt ctttccaaga gtcatgaggt aggcagcgag ccatggaagt accagagatg gagcgggtgc tgccgccgat taccagggcc aaagatgtcc aaaacgctgc cgtagttgga agcggtcaga agcaccgaca gtgcagaccg agggctcaga cgtcagcgtt gttgttaecg gcagc.gacgg cgaccatgac cagcggcgct gttcacggag gaggagtaac caccgccaag ctttggggca gttgcggttg ttcttgtcgc tggcaacaaa tggagtactg gccactgccg ttgtcatega ggaccttgac tggcgacacc gtaggttcgg gagccaacgg taccagcgca aaacatcgca ctggacgaag atgcccgacg gtggaaaatg tatcaggaca gaeegcttcc cgccttcttg ctccttacgc gcgcggaacc acaataaccc gaccagtgcc cgaccggctc cgacgtgacc ctgggtgtgg gaacttccgg ggagttcgcc ctgacacgtg taatctcatg agaaaagatc aacaaaaaaa ttttccgaag gccgtagtta aatcctgtta aagacgatag gcccagcttg aagcgccacg aacaggsgag cgggtttcgc cctatggaaa tgctcacatg tgagtgagct ggaagcggaa tcgagcgagc agcatcaggg gcgaggatct gecgctttte tagcgt tggc tcgtgcttta acgagttctt atctgtgcgg cctatttgtt tgataaatgc gttccggtgc gggttctccc ctgttcatca gtgcgcggcc gacgcctccg ctgcgcgacc ctaaaacttc accaaaatcc aaaggatctt ccaccgctac gtaactggct ggccaccact ccagtggctg ttaccggata gagcgaacga cttcccgaag cgcacgaggg cacctctgac aacgccagca ttctttcctg gataccgctc g acgtactcgg gctcgcgcca cgtcgtgacc tggattcatc tacccgtgat cggtatcgcc ctgaattatt tatttc.ac.ac tatttttcta ttcaataata tcaccgcgcg gggacttcgt gcgeggtcca tggacgagct ggccggccat cggccggcaa atttttaatt cttaacgtga cttgagatcc cagcggtggt tcagcagagc tcaagaactc ctgccagtgg aggcgcagcg cctacaccga ggagaaaggc agcttccagg ttgagcgtcg acgcggcctt cgttatcccc gccgcagccg atggaagccg gccgaactgt catggcgatg gactgtggcc attgctgaag gctcccgatt aacgcttaca cgcatcaggt aatacattca gcacgtgagg cgacgtcgcc ggaggacgac ggaccaggtg gtacgccgag gaccgagatc ctgcgtgcac taaaaggatc gttttcgttc tttttttctg ttgtttgccg gcagatacca tgtagcaccg cgat.aagtcg gtcgggctga actgagatac ggacaggtat gggaaacgcc atttttgtga tttacggttc tgattctgtg aacgaccgag ctgaagagga taccacaaga aaacaaaatg tgaagagatc aaataccaag atcagctgcg aaaaatcctą tcaggcaaat aagtgcccaa tgatgatggt ttcatcccct ctctgaatat aagcaggttg aatgtatcgg accggcaacg ccaggtggag gaagctggag agcaggggag accagagctc ggacaaggag gtccataccg accaaagagc gtgagtgccg gtcttgtcga tcgccaggct cctgcttgcc ggctgggtgt agcttggcgg cgcagcgcat atttcctgat ggcacttttc aatatgtatc agggccacca ggagcggtcg ttcgccggtg gtgccggaca tggtcggagg ggcgagcagc ttcgtggccg taggtgaaga cactgagcgt cgcgtaatct gatcaagagc aatactgttc cctacatacc tgtcttaccg acggggggtt ctacagcgtg ccggtaagcg tggtatcttt tgctcgtcag ctggcctttt gataaccgta cgcagcgagt

2880

2940

3000

3060

3120

3130

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4030

4140

4200

4260

4320

4330

4440

4500

4560

4620

4630

4701 gtgggaaata tattcatcag acaaaaaaaa cgcacaaacg aaaaacatca agataggctg tactatatag ggcattctga cttgaactga cgacggcgct cagcaattcc cgacacgctc acagtgccga caagcgctgg tggggagtag agaatgtcgg cgtctgtcgt tagttgcggg tggagcctgg gcaacgacac gcgatgatgg tgggtcttct tggccgttac

120

180

240

300

360

420

430

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

PL 213 045 B1 cgtcgcggct ggaytagtag taggtcttga ccatctgggc acggccctca aactcggggt 1440 gcgatgcctc gataccggtg tcgatcacgt agacgcagga. gccctggccg gcagattcgt 1500 catagtagta agtagaggta ccggggctgg tgctggagat gcgagcaagg ccgctgttgt 1500 caccaaaagg gaagcgcaga ccaacgctcc ctggatcctg ctcaatgtac tcaacatcgg 1620 gatgggcgcg gagaacccga accatgttct cgtcaagggt cgc.agcgaaa ccactgaaga 1600 cgttcttgta gacgtggtcg ggcttgccag aaatcttctc catggcagca tcgagagcag 1740 aaagagcgct accttccttg aacttgaeaa tgt.acttgtt ggcaaccatc tcgccgcggg 1800 cctcgatcag aggagcagcc tcggagcgct gctcaacgge aggagctctc ttctcgaggc 1860 cgagagcgag gggaagaaga ctcagaagaa cagacaaacg catcgtttcg aataattagt 1920 tgttttttga tcttctcaag ttgtcgttaa aagtcgttaa aatcaaaagc ttgtcaattg 1980 gaaccagtcg caattatgaa agtaagctaa taatgatgat aaaaaaaaag gtttaagaca 2040 gggcagcttc cttctgttta tatattgctg tcaagtaggg gttagaacag ttaaattttg 2100 atcatgaacg ttaggctatc agcagtattc ccaccagaat cttggaagca tacaatgtgg 2160 agacaatgca taatcatcca aaaagcgggt gtttccccat ttgcgtttcg gcacaggtgc 2220 accggggttc agaagcgata gagagactgc gctaagcatt aatgagatta tttttgagca 2280 ttcgtcaatc aataccaaac aagacaaacg gtatgccgac ttttggaagt ttctttttga 2340 ccaactggcc gttagcattt caacgaacca aacttagttc atcttggatg agatcacgct 2400 tttgtcatat taggttccaa gacagcgttt aaactgtcag ttttgggcca tttggggaac 2460 atgaaactat ttgaccccac actcagaaag ccctcatctg gagtgatgtt cgggtgtaat 2520 gcggagcttg ttgcattcgg aaataaacaa acatgaacct cgccaggggg gccaggatag 2580 acaggctaat aaagtcatgg tgttagtagc ctaatagaag gaattggaat gagogagctc 2640 caatcaagcc caataactgg gctggttttt cgatggcaaa agtgggtgtt gaggagaaga 2700 ggagtggagg tcctgcgttt gcaacggtct gctgctagtg tatcccctcc tgttgcgttt 2760 ggcacttatg tgtgagaatg gacctgtgga tgtcggatgg caaaaaggtt tcattcaacc 2820 tttcgtcttt ggatgttaga tctgatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 2880 tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 2940 tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct aocagcggtg gtttgtttgc 3000 cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 3060 caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tetgtagcac 3120 cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgeeagt ggcgataagt 3180 cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 3240 gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 3300 acctacagcg tgagcattga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 3360 atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 3420 cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acfctgagcgt cgatttttgt 3480 gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 3540 tcctggcett ttgctggoct tttgctcaca tgttggtctc cagcttgcaa attaaagcct 3600 tcgagcgtcc caaaaccttc tcaageaagg ttttcagtat aatgttacat gcgtacacgc 3660 gtctgtacag aaaaaaaaga aaaatttgaa atataaataa cgttcttaat actaacataa 3720 ctataaaaaa ataaataggg acctagactt caggttgtct aactccttcc ttttcggtta 3780 gageggatgt ggggggaggg cgtgaatgta agcgtgacat aactaatfcac atgatatega 3840 caaaggaaaa gggggacgga tctccgaggc ctgggacccg tgggccgccg tcggacgtgt 3900 cagtcctgct cctcggccac gaagtgcacg cagttgccgg ccgggtcgcg cagggcgaac 3960 tcccgccccc acggctgctc gccgatctcg gtcatggccg gcccggagge gtcccggaag 4020 ttegtggaca cgacctccga ccactcggcg tacagctcgt ccaggccgcg cacccacacc 4080 caggccaggg tgttgtccgg caccacctgg tcctggaccg cgctgatgaa cagggtcacg 4140 tcgtcccgga ccacaccggc gaagtcgtcc tccacgaagt cccgggagaa cccgagccgg 4200 tcggtccaga actcgaccgc tccggcgacg tcgcgcgcgg tgagcaccgg aacggcactg 4260 gtcaacttgg ccatggttta gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat 4320 gccgatgatt aattgtcaac accgcccctt agattagatt getatgettt ctttctaatg 4380 aacaagaagt aaaaaaagtt gtaatagaac aagaaaaatg aaactgaaac ttgagaaatt 4440 gaagaecgtt tattaactta aatatcaatg gaggtcactg aaagagaaaa aaactaaaaa 4500 aaaaaatttc aagaaaaaga aacgtgataa aaatttttat tgcctttttc gacgaagaaa 4560 aagaaacgag gcggtctctt ttttcttttc caaaccttta gtacgggtaa ttaacgacac 4620 cctagaggaa gaaagaggga aaatttagta tgctgtgctt gggtgttttg aagtggtacg 4680 gcgatgcgcg gagtccgaga aaatctggaa gagtaaaaaa ggagtagaaa cattttgaag 4740 ctatggtgtg tgggggatct ctgcctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga 4800 cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gageagacaa 4860 gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gcgcagccat gacccagtca 4920 cgtagcgata gcggagtgta tactggctta actatgcggc ateagageag attgtactga 4980 gagtgeacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa taccgeatca 5040 ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 5100

PL 213 045 B1 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 5160 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 5220 tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 5230 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 5340 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 5400 cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 5460 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 5520 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 5580 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 5640 ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcget ctgctgaagc 5700 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 5760 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 5820 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 5880 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacetagat ccttttaaat taaaaatgaa 5940 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 6000 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 6060 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 6120 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 6180 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 6240 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 6300 ctgcaggcat cgtgatgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 6360 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 6420 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 6480 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagat<1 cttttctgtg actggtgagt 6540 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgaoc gagttgctct tgcccggcgt 6600 caacacggga taatacc:gcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 6660 gttcttcggg gcgasaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 6720 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 6780 caaaaaoagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgscacgg aaatgttgaa 6840 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 6900 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 6960 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 7020 ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc aagaattaat tctcatgttt gacagcttat 7080 catcgataag ctgactcatg ttggtattgt gaaatagacg cagatcggga acactgaaaa 7140 ataacagtt.a ttattcg 7157 <210> 30 <211> 8243 <212> DNA <213> artificial seguence <220 <22 3> plasmid pPICArap <400> 30 agatccgcac aaacgaaggt ctcacttaat cttctgtact ctgaagagga gtgggaaata 60 ccaagaaaaa catcaaactc gaatgatttt cccaaacccc taccacaaga tattcatcag 120 ctgcgagata ggctgatcag gageaagetc gtacgagaag aaacaaaatg acaaaaaaaa 180 tcctatacta tataggttac aaataaaaaa gtatcaaaaa tgaagcctgc atctctcagg 240 caaatggcat tctgacatcc tcttgattag aatctagcaa gaccggtctt ctcgtaagtg 300 cccaacttga actgaggaac agtcatgtct aaggctacaa actcaatgat gatgatgatg 360 atggtcgacg gcgctattca gatcctcttc tgagatgagt ttttgttcta gaagcttcat 420 cccctcagca attcctcttc aatctttttc gtaacaccat tattggetac tatc.tctetg 480 aatatcgaca cgctcttctc cctgggaatt cttagttttg ctcagatgat gatacaaata 540 acttactgct taaattgcta ctatttataa gcttaaactg ctctgaatcc ataacgtgat 600 tagcgtttgc aaagtgtgag tcgttaacta atgctacatc taaattaagg taatattgcg 660 caccttgetc aaacgctgtt ttagttttaa tagttaacgt gtgcgtactt tgcggagcaa 720 tattaagtac atgctcgcct tgctcaacac agatgccatt ttgcattaac tgccaaataa 780 gcttttcgtt atcggtatgt ctaaatacgt aatcgctaaa tacatcaatg gtgtattggt 840 tttgattttg ctcacgcagt gtaaattgta aatgttgctg gctgtattta gcttcaaaca 900 ggctagggtg cggcgtgcgg tctgggaaca ataagccatt tatacaaaat tgacggtcat 960 ttagttcatc accaaagtcg ccgccgtaag cccaataatg cttgccgttt tcgtctgttt 1020 tagataaacc ttggtctacc caatcccaaa taaagccgcc ttgtaggcgt gggtattctc 1080 taaatgcttg ccagtaatcg tcaaagctac ctaggctgtt acccattgca tgggcgtatt 1140 cacataaaat aagcgggcga gtttcacctg gtaggcttag ccacttttta atagagtatt 1200

PL 213 045 B1 taggtaccgc atcgtcttta atatcggtat ctacacgggc gtacattggg caaataatgt 1260 cggtagccgt tgtgtttgcg ccgccgcctt cgtattgcac t.gggcgagaa gggtcaaagc 1320 tttttgacca gccgtacatc gcatcatgat ttgcgccgtg tccgcattcg ttgcccaatg 1380 accaaataat aattgaggcg tggtttttat cscgttcaac catttgtgta taacgcgaca 1440 taaatgcacc agcccactgc gggtcgcttg cgagcctgcc cataggaaac atgccatggg 1500 tttctatatt tgcttcatca actacgtata aacctagctg gtcacatagc tcgtaaaaac 1560 ggggatgatt agggtagtga gcagtacgca cggcgttaaa gttatŁLtge ttcatcagct 1620 taatatcttc aatcatatcg gcggtagtaa ctgtatggec gtt.ttctggg tggtgttcgt 1680 ggcggttaac accgcgaata agtagcggtc tgccgtttaa gcaaagctgc ccgttaagca 1740 tttctacttt tctaaagcca atgttataag cttcaacgtc gatggtattg ccttgttcat 1800 caagcagact cacaacgcag cggtat.aagt atggggtttc ggcggtccat tttttagggc 1860 tttgtatatc aattgcttga aatactacat cgctccagcc acctttttca tcaacacgtt 1920 tattgttagt gctttgaatt tgtggctcac atagcgcctg ttcgccatca aaaacttgca 1980 ctgctatttg atagttattt ggcgcattaa tcgccgtttt tatatgtagc gttgcatcgc 2040 gatagcaagc gtctaaateg ggggttataa acacatcacg tatttggttt tgtggttttg 2100 taagtaagtt aacatcgcga aaaataccgc ttagccacca catgtcctga tcttctaaat 2160 aactgccatc gctccaacga ataaccataa cggcaatacg gttagtgcct gcaactaaca 2220 gttcgcttaa atcaaactcg ctcggtaagc gyctatcttg tgaataaccc acccattgtc 2280 cgttacacca caągtgaaac gccgagttaa cgccttcaaa aataatatga ttacgctgag 2340 ttagctgact ttcgcttata ttaaattcag tgcggtaaca gcctgtaggg ttatcgcttg 2400 gtacaaaagg cgggttaact gcaaatgggt acttaacatt acagtaaata ggtttatcaa 2460 agccgtgtaa ttgccagtta gaaggcactg taatactttg ccagttgctg tttagtgttt 2520 cacttagcaa cgattcatca accgcttcgg gtttatcaaa taatttaaag tcccactgac 2580 cgtttaaact ttgtttttgc gattgcgtgt tagtacgggc atggtcaacg cttttaaatc 2640 cattgagtgg gctgtgcgct tttacttgat taacttatac tgaaattggg ttttcccaat 2700 ctcggcgatt aattatgtgc tgtaaagagg tcattctttt ctcgagagat accccttett 2760 ctttagcagc aatactggca atagtagtat ttataaacaa taacccgtta tttgtgctgt 2820 tggaaaatgg caaaacagca acatcgaaat ccccttctaa atctgagtaa ccgatgacag 2830 cttcagccgg aatttgtgec gtttcatctt ctgttgtagt gttgactgga gcagctaatg 2940 cggaggatgc tgcgaataaa acagcagtaa aaattgaagg aaatctcatc gtttcgaata 3000 attagttgtc ttttgatctt ctcaagttgt cgttaaaagt cgttaaaatc aaaagcttgt 3060 caattggaac cagtcgcaat tatgaaagta agctaataat gatgataaaa aaaaaggttt 3120 aagacagggc agcttccttc tgtttatata ttgctgtcaa gtaggggtta gaacagttaa 3180 attttgatca tgaacgttag gctatcagca gtattcccac cagaatcttg gaagcataca 3240 atgtggagac aatgcataat catccaaaaa gcgggtgttt ccccatttgc gtttcggcac 3300 aggtgcaccg gggttcagaa gcgatagaga gactgcgcta agcattaatg agattatttt 3360 tgagcattcg tcaatcaata ccaaacaaga caaacggtat gccgactttt ggaagtttct 3420 ttttgaccaa ctggccgtta gcatttcaac gaaccaaact tagttcatct tggatgagat 3480 cacgcttttg tcatattagg ttccaagaca gcgtttaaac tgtcagtttt gggccatttg 3540 gggaacatga aactatttga ccccacactc agaaagccct catctggagt gatgttcggg 3600 tgtaatgcgg agcttgttgc attcggaaat aaacaaacat gaacctcgcc aggggggcca 3660 ggatagacag gctaataaag tcatggtgtt agtagcctaa tagaaggaat tggaatgagc 3720 gagctccaat caagcccaat aactgggctg gtttttcgat ggcaaaagtg ggtgttgagg 3780 agaagaggag tggaggtcct gcgtttgcaa cggtctgctg ctagtgtatc ccct.cctgtt 3840 gcgtttggca cttatgtgtg agaatggacc tgtggatgtc ggatggcaaa aaggtttcat 3900 tcaacctttc gtctttggat gttagatctg atctcatgac caaaatccct taacgtgagt 3960 tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt 4020 tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt 4080 gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc 4140 agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg 4200 tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg 4260 ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt 4320 cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac 4380 tgagatacct acagcgtgag cattgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg 4440 acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg 4500 gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat 4560 ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt 4620 tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ggtctccagc ttgcaaatta 4680 aagccttcga gcgtcccaaa accttctcaa gcaaggtttt cagtataatg ttacatgcgt 4740 acacgcgtct gtacacaaaa aaaagaaaaa tttgaaatat aaataacgtt cttaatacta 4800 acataactat aaaaaaataa atagggacct agacttcagg ttgtctaact ccttcctttt 4860 cggttagagc ggatgtgggg ggagggcgtg aatgtaagcg tgacataact aattacatga 4920

PL 213 045 B1 tatcgacaaa ggaaaagggg gacggatctc cgaggcctgg gacccgtggg ccgccgtcgg 4930 acgtgtcagt cctgctcctc ggccacgaag tgcacgcagt tgccggccgg gtcgcgcagg 5040 gcgaactccc gcccccacgg ctgctcgccg atctcggtca tggccggccc ggaggcgtcc 5100 cggaagttcg tggacacgac ctccgaccac tcggcgtaca gctcgtccag gccgcgcacc 5160 ccagggtgtt gtccggcacc. acctggtcct ggaccgcgct gatgaacagg 5220 gtcacgtcgt cccggaccac accggcgaag tcgtcctcca cgaagtcccg ggagaacccg 5280 agccggtcgg tccagaactc gaccgctccg gcgacgtcgc gcgcggtgag caccggaacg 5340 gcactggtca acttggccat ggtttagttc ctcaccttgt cgtattatac tatgccgata 5400 tactatgccg atgattaatt gtcaacaccg ccccttagat tagattgcta tgctttcttt 5460 ctaatgaaca agaagtaaaa aaagttgtaa tagaacaaga aaaatgaaac tgaaacttga 5520 gaaat-tgaag accgtttatt aacttaaata tcaatggagg tcactgaaag agaaaaaaac 5530 taaaaaaaaa aatttcaaga aaaagaaacg tgataaaaat ttttattgcc tttttcgacg 5640 aagaaaaaga aacgaggcgg tctctttttt cttttccaaa cctttagtac gggtaattaa 5700 cgacacccta gaggaagaaa gagggaaaat ttagtatgct gtgcttgggt gttttgaagt 5760 ggtacggcga tgcgcggagt ccgagaaaat ctggaagagt aaaaaaggag Lagaaacatt 5820 ttgaagctat ggtgtgtggg ggatctctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 5880 ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 5940 agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 6000 cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 6060 tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 6120 gcatcaggcg etcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 6180 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 6240 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 6300 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 6360 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 6420 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac eggatacctg tccgcctttc 6480 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcaat gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 6540 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg €600 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 6660 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 6720 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 6780 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 6840 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 6900 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 6960 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 7020 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 7080 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 7140 gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 7200 caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 7260 ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 7320 attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 7380 ccatfcgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 7440 gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 7500 ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 7560 tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 7620 gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctottgcc 7680 cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 7740 gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 7800 tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 7860 ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 7920 gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 7980 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 8040 catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct 3100 ataaaaat.ag gcgtatcacg aggeccttte gtcttcaaga attaattctc atgtttgaca 3160 gcttatcatc gataagctga ctcatgttgg tattgtgaaa tagacgcaga tcgggaacac 3220 tgaaaaataa cagttattat tcg 3243 <210> 31 <211> 2470 <212> DNA <213> artificial seguence <220>

<223> encoding fragment BNKex2

PL 213 045 B1 <400> 31.

tcccttcgaa acgatgaaag tgaggaaata tattacttta tgcttttggt gggccttttc 60 aacatccgct cttgtatcat cacaacaaat tccattgaag gaccatacgt cacgacagta 120 ttttgctgta gaaagcaatg aaacattatc ccgcttggag gaaatgcatc caaattggaa 180 atatgaacat gatgttcgag ggctaccaaa ccattatgtt ttttcaaaag agttgctaaa 240 attgggcaaa agatcatcat tagaagagtt acagggggat aacaacgacc acatattatc 300 tgtccatgat ttattcccgc gtaacgacct atttaagaga ctaccggtgc ctgctccacc 360 aatggactca agcttgttac cggtaaaaga agctgaggat aaactcagca taaatgatcc 420 gctttttgag aggcagtggc acttggtcaa tccaagtttt cctggcagtg atataaatgt 480 tcttgatctg tggtacaata atattacagg cgcaggggtc gtggctgcca ttgttgatga 540 tggccttgac tacgaaaatg aagacttgaa ggataatttt tgcgctgaag gttcttggga 600 tttcaacgac aataccaatt tacctaaacc aagattatct gatgactacc atggtacgag 660 atgtgcaggt gaaatagctg ccaaaaaagg taacaatttt tgcggtgtcg gggtaggtta 720 caacgctaaa atctcaggca taagaatctfc atccggtgat atcactacgg aagatgaagc 780 tgcgtccttg atttatggtc tagacgtaas cgatatatat tcatgctcat ggggtcccgc 840 tgatgacgga agacatttac aaggccctag tgacctggtg aaaaaggctt tagtaaaagg 900 tgttactgag ggaagagatt ccaaaggagc gatttacgtt tttgccagtg gaaatggtgg 960 aactcgtggt gataattgca attacgacgg ctatactaat tccatatatt ctattactat 1020 tggggctatt gatcacaaag atctacatcc tccttattcc gaaggttgtt ccgccgtcat 1080 ggeagtcacg tattcttcag gttcaggcga atatattcat tcgagtgata tcaacggcag 1140 atgcagtaat agccacggtg gaacgtctgc ggctgctcca ttagctgccg gtgtttacac 1200 tttgttacta gaagccaacc caaacctaac ttggagagac gtacagtatt tatcaatctt 1260 gtctgcggta gggttagaaa agaacgctga cggagattgg agagatagcg ccatggggaa 1320 gaaatactct cat cgcta·., g gctttggtaa aatcgatgcc cataagttaa t cgaaatgtc 1380 caagacctgg gagaatgtta acgcacaaac ctggttttac ctgccaacat tgtatgtttc 1440 ccagtccaca aactccacgg aagagacatt agaatccgtc ataaccatat cagaaaaaag 1500 tcttcaagat gctaacttca agagaattga gcacgtcacg gtaactgtag atattgatac 1560 agaaattagg ggaactacga ctgtcgattt aatatcacca gcggggataa tttcaaacct 1620 tggcgttgta agaccaagag atgtttcatc agagggattc aaagactgga cattcatgtc 1680 tgtagcacat tggggtgaga acggcgtagg tgattggaaa atcaaggtta agacaacaga 1740 aaatggacac aggattgact tccacagttg gaggctgaag ctctttgggg aatccattga 1800 ttcatctaaa acagaaactt tcgtctttgg aaacgataaa gaggaggttg aaccagctgc 1860 tacagaaagt accgtatcac aatattctgc cagttcaact tctatttcca tcagcgctac 1920 ttctacatct tctatctcaa ttggtgtgga aacgtcggcc attccccaaa cgactactgc 1980 gagtaccgat cctgattctg atecaaacac tcctaaaaaa ctttcctctc ctaggcaagc 2040 catgcattat tttttaacaa tatttttgat tggcgccaca tttttggtgt tatacttcat 2100 gttttttatg aaatcaagga gaaggatcag aaggtcaaga gcggaaacgt atgaattcga 2160 tatcattgat acagactctg agtacgattc tactttggac aatggaactt ccggaattac 2220 tgagcccgaa gaggttgagg acttcgattt tgatttgtcc gatgaagacc atcttgcaag 2280 tttgtcttca tcagaaaacg gtgatgctga acatacaatt gatagtgtac taacaaacga 2340 aaatccattt agtgacccta taaagcaaaa gttcccaaat gacgccaacg cagaatctge 2400 ttccaataaa ttacaagaat tacagcctga tgttcctcca tcttccggac gatcgtgagc 2460 ggccgcatca 2470 <210> 32 <211> 5276 <212> DNA <213> artificial. seąuence <220>

<223> plasmid pGAPZKex2 <400> 32 agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60 atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120 cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180 gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240 aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300 ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360 gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420 ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480 tatttcgaaa cgatgaaagt gaggaaatat attactttat gcttttggtg ggccttttca 540 acatccgctc ttgtatcatc acaacaaatt ccattgaagg accatacgtc acgacagtat 600 tttgctgtag aaagcaatga aacattatcc cgcttggagg aaatgcatcc aaattggaaa 660 tatgaacatg atgttcgagg gctaccaaac cattatgttt tttcaaaaga gttgctaaaa 720

PL 213 045 B1 ttgggcaaaa gatcateatt agaagagtta cagggggata acaacgacca catattatct 780 gtccatgatt tattcccgcg taacgaccta tttaagagac taccggtgcc tgctccacea 840 atggactcaa gcttgttacc ggtaaaagaa gctgaggata aactcagcat aaatgatccg 900 ctttttgaga ggcagtggca cttggtcaat ccaagttttc ctggcagtga tataaatgtt 960 cttgatctgt ggtacaataa tattacagge gcaggggtcg tggctgccat tgttgatgat 1020 ggccttgact acgaaaatga agacttgaag gataattttt gcgctgaagg ttcttgggat 1080 ttcaacgaca ataccaattt acctaaacca agattatctg atgactacca tggtaegaga 1140 tgtgcaggtg aaatagctgc caaaaaaggt aacaattttt gcggtgtcgg ggtaggttac 1200 aacgctaaaa tctcaggcat aagaatctta tccggtgata tcactacgga agatgaagct 1260 gcgtccttga tttatggtct agacgtaaac gatatatatt catgctcatg gggtcccgct 1320 gatgacggaa gacatttaca aggccctagt gacctggtga aaaaggcttt agtaaaaggt 1380 gttactgagg gaagagattc caaaggagcg atttacgttt ttgccagtgg aaatggtgga 1440 actcgtggtg ataattgcaa ttacgacggc tatactaatt ccatatattc tattactatt 1500 ggggctattg atcacaaaga tctacatcct ccttattccg aaggttgttc cgccgtcatg 1560 gcagtcacgt attcttcagg ttcaggcgaa tatattcatt cgagtgatat caacggcaga 1620 tgcagtaata gccacggtgg aacgtctgcg gctgctccat tagctgccgg tgtttacact 1680 ttgttactag aagccaaccc aaacctaact tggagagacg tacagtattt atcaatcttg 1740 tctgcggtag ggttagaaaa gaacgctgac ggagattgga gagatagcgc catggggaag 1800 aaatactctc atcgctatgg ctttggtaaa atcgatgccc ataagttaat tgaaatgtcc 1860 aagacctggg agaatgttaa cgcacaaacc tggttttacc tgccaacatt gtatgtttcc 1920 cagtccacaa actccacgga agagacatta gaatccgtca taaccatatc agaaaaaagt 1980 cttcaagatg ctaacttcaa gagaattgag cacgtcacgg taactgtaga tattgataca 2040 gaaattaggg gaactacgac tgtcgattta atatcaccag cggggataat ttcaaacctt 2100 ggcgttgtaa gaccaagaga tgtttcatca gagggattca aagactggac attcatgtct 2160 gtagcacatt ggggtgagaa cggcgtaggt gattggaaaa tcaaggttaa gacaacagaa 2220 aatggacaca ggattgactt ccacagttgg aggctgaagc tctttgggga atccattgat 2280 tcatctaaaa cagaaacttt cgtctttgga aacgataaag aggaggttga accagctgct 2340 acagaaagta ccgtatcaca atattctgcc agttcaactt ctatttccat cagcgctact 2400 tctacatctt ctatctcaat tggtgtggaa acgtcggcca ttccccaaac gactactgcg 2460 agtaccgatc ctgattctga tccaaacact cctaaaaaac tttcctctcc taggcaagcc 2520 atgcattatt ttttaacaat atttttgatt ggcgccacat ttttggtgtt atacttcatg 2580 ttttttatga aatcaaggag aaggatcaga aggtcaagag cggaaacgta taaattcgat 2640 atcattgata cagactctga gtacgattct. actttggaca atggaacttc cagaattact 2700 gagcccgaag aggttgagga cttcgatttt gatttgtccg atgaagacca tcttgcaagt 2760 ttgtcttcat cagaaaacgg tgatgctgaa catacaattg atagtgtact aacaaacgaa 2820 aatccattta gtgaccctat aaagcaaaag ttcccaaatg acgccaacgc agaatctgct 2880 tccaataaat tacaagaatt acagcctgat gttcctccat cttccggacg atcgtgagcg 2940 gccgccagct ttctagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac 3000 catcatcatc afccatcattg agttttagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg 3060 ggcacttacg agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt 3120 tgcctgagag atgcaggctt catttttgat acttttttat ttgtaaccta tatagtatag 3180 gatttttttt gtcattttgt ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc 3240 agctgatgaa tatcttgtgg taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt. 3300 ggtatttccc actcctcttc agagtacaga agattaagtg agaccttcgt ttgtgcggat 3360 cccccacaca ccatagcttc aaaatgtt.tc tactcctttt ttactcttcc agattttctc 3420 ggactccgcg catcgccgta ccacttcaaa acacccaagc acagcatact aaattttccc 3480 tcttćcttcc tctagggtgt cgttaattac ccgtactaaa ggtttggaaa agaaaaaaga 3540 gaccgcctcg tttctttttc ttcgtcgaaa aaggcaataa aaatttttat cacgtttctt 3600 tttcttgaaa tttttttttt tagttttttt ctctttcagt gacctccatt gatatttaag 3660 ttaataaacg gtcttcaatt tctcaagttt cagtttcatt tttcttgttc tattacaact 3720 ttttttactt cttgttcatt agaaagaaag cataacaatc taatctaagg gcggtgttga 3780 caattaatca tcggcatagt atatcggcat agtataatac gacaaggtga ggaactaaac 3840 catggccaag ttgaccagtg ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt 3900 cgagttctgg accgaccggc tcgggtfcctc ccgggacttc gtggaggacg acttcgccgg 3960 tgtggtecgg gacgacgtga ccctgttcat cagcgcggtc caggaccagg tqgtgccqga 4020 caacaccctg gcctgggtgt gggtgcgcgg cctggacgag ctgtacgccg agtggtcgga 4080 ggtcgtgtcc acgaacttcc gggacgcctc cgggccggcc atgaccgaga tcggcgagca 4140 gccgtggggg cgggagttcg ccctgcgcga cccggccggc aactgcgtgc acttcgtggc 4200 cgaggagcag gactgacacg tccgacggcg gcccacgggt cceaggcctc ggagatccgt 4260 cccccttttc ctttgtcgat atcatgtaat tagttatgtc acgcttacat tcacgccctc 4320 cccccacatc cgctctaacc gaaaaggaag gagfctsgaca acctgsagtc taggtcccta 4380 tttatttttt tatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt 4440

PL 213 045 B1 cif33 tttttctgta ttttgggacg agcaaaaggc cccctgacga tataaagata tgccgcttac gctcacgctg acgaaccccc acccggtaag cgaggtatgt gaaggacagt gtagctcttg agcagattac ctgacgctca <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400 agatcttttt atctggctcc cttaaatgtg gttaccgtcc aatgctcttc ccagggatgg gattattgga ctcctgaccc tatttcgaaa gcattagctg gctgtcatcg aacagcacaa gaagaagggg ccgtctcgga ctcagaagag cttagacatg attetaatca tactttttta tacgagcttg gggaaaatca aagattaagt ctactccttt aacacccaag cccgtactaa aaaggcaata tctctttcag tcagtttcat gcatagcaat tagtataata tgctcaccgc cccgggactt tcagcgcggt gcctggacga ccgggccggc acccggccgg ggcccacggg ttagttatgt ggagttagac agaacgttat aacattatac aagctggaga cagacgcgtg ctcgaaggct caggaaccgt gcatcacaaa ccaggcgttt cggatacctg taggt atctc cgttcagccc acacgactta aggcggtgct atttggtatc atccggcaaa gcgcagaaaa gtggaacgaa

314 7 DNA artificial sequence ;mid pGAPZalfaA tgtagaaatg gttgcaactc gagtaatgga ctaggaaatt ccagcattac aaaagtcccg aaccaccaga aaagacttta cgatgagatt ctccagtcaa gttactcaga ataacgggtt tatctctcga tcggtacctc gatctgaata actgttcetc agaggatgtc tttgtaacct ctcctgatca ttcgagtttg gagaccttcc tttactcttc cacagcatac aggtttggaa aaa at11 tt a tgacctccat trttcttgtt ctaatctaag cgacaaggtg gcgcgacgtc cgtggaggac ccaggaccag gctgtacgcc catgaccgag caactgcgtg tcccaggcct cacgcttaca aacctgaagt + + ^+21+ + + 6^24 G* C·»-1-· Ό— t— t* — t·* *71 tgaaaacctt ccaacatgtg tacgcatgta ttaatttgca aaaaaggccg aatcgacgct ccccctggaa tccgcctttc agttcggtgt gaccgctgcg tcgccactgg acagagttct tgcgctctgc caaaccaccg aaaggatctc aactcacgtt fccttggtgtc cgaacgacct accagaaacg ttactctgct gttgcgggta gccgtcgctg atcgaatata aatttaattt tccttcaatt cactacaaca tttagaaggg attgtttata gaaaagagag gagccgcggc gcgccgtcga agttcaagtt agaatgccat at a tag t at a gcctatctcg ΐ? C| t t? T? i ΐί ¢7 ΐ? tttgtgcgga cagattttct taaattttcc aagaaaaaag tcacgtttct tgatatttaa ctattacaac ggcggtgttg aggaactaaa gccggagcgg gacttcgccg gtggtgccgg gagtggtcgg atcggcgagc cacttcgtgg cggagatccg ttcacgccct ctaggtccct aatttttctt gcttgagaag agcaaaaggc acattatact agctggagac cgttgctggc caagtcagag gctccctcgt tcccttcggg aggtcgttcg ccttatccgg cagcagccac.

tgaagtggtg tgaagccagt ctggtagcgg aagaagatcc aagggatttt ctcgtccaat gctggcaacg tctcttccct ggagagcttc aaacggaggt gcaataatag aaaggcgaac atttgtccct tttactgctg gaagatgaaa gatttcgatg aatactacta gctgaagctg ggccgccagc ccatcatcat gggcact, tac ttgcctgaga ggattttttt cagctgatga tggtatttcc tcccccacac cggactccgc ctctttcttc agaccgcctc ttttcttgaa gttaataaac tttttttact acaattaatc ccatggccaa tcgagttctg gtgtggtccg acaacaccct aggtcgtgtc agccgtgggg ccgaggagca tccccctttt ccccccacat atttattttt ttttttctgt gttttgggac cagcaaaagg gaaaaccttg caacatgtga gtttttccat gtggcgaaac gcgctctcct aagcgtggcg ctccaagctg taactatcgt tggtaacagg gcctaactac taccttcgga tggttttttt tttgatcttt ggtcatgcat caggtagcca taaaattctc tctctctcct ttctacggcc cgtgtacccg cgggcggacg acctttccca atttcaatca ttttattcgc cggcacaaat ttgctgtttt ttgccagcat aattcacgtg tttctagaac ca tcatcatt gagaagaccg gatgcaggct tgtcattttg atatcttgtg cactcctctt accatagctt gcatcgccgt ctctagggtg gtttcttttt atttttttt.t. ggtcttcaat tcttgttcat atcggcatag gttgaccagt gaccgaccgg ggacgacgtg ggcctgggtg cacgaacttc gcgggagttc ggactgacac cctttgtcga ccgctctaac ttatagttat acagacgcgt gctcgaaggc ccaggaaccg ctcgagaagg gcaaaaggcc aggctccgcc ccgacaggac gttccgaccc ctttctcaat ggctgtgtgc cttgagtcca attagcagag ggctacacta aaaagagttg gtttgcaagc tctacggggt gagatc

500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5276 tctctgaaat cggggtaaaa tccaccgccc cccttgcagc acctagcagc catgtcatga attttggttt attgaacaac agcatcctcc tccggctgaa gccattttcc tgctgctaaa gcccagccgg aaaaactcat gagttttagc gtcttgctag tcatttttga tttcttctcg gtaggggttt cagagtacag caaaatgttt accacttcaa tcgttaatta cttcgtcgaa ttagtttttt ttctcaagtt tagaaagaaa tatatcggca gccgt tccgg ctcgggttct accctgttca tgggtgcgc.g cgggacgcct gccctgcgcg gtccgacggc tatcatgtaa cgaaaaggaa g 11 a g t atta gtacgcatgt tttaatttgc taaaaaggcc

120

180

240

300

360

420

480

540

600 €60

720

790

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

2460

PL 213 045 B1 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcaa tgctcacgct taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gcagcagcca ctggtaacag gattagcages gcgaggtatg ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc taagggattt tggtcatgca tgagatc <210> 34 <211> 8310 <212> DNA <213··· artificial seguence <220>

<223> plasmid pGAP/Amp/Hi.s4/Kex2 <400> 34 agcatcacaa accaggcgtt ccggatacct gtaggtatct ccgttcagcc gacacgactt taggcggtgc tatttggtat gatccggcaa cgcgcagaaa agtggaacga aaatcgacgc tccccctgga gtccgccttt cagttcggtg cgaccgctgc atcgccactg tacagagttc ctgcgctctg acaaaccacc aaaaggatct aaactcacgt

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3147 agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60 atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120 cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tctctctcct tccaccgccc 180 gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagcttc ttctacggcc cccttgcagc 240 aatgctcttc ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300 ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360 gattattgga aaccaccaga atcgaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420 ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgt.ccct atttcaatca attgaacaac 480 tatttcgaaa cgatgaaagt gaggaaatat attactttat gcttttggtg ggccttttca 540 acatccgctc ttgtatcatc acaacaaatt ccattgaagg accatacgtc acgacagtat 600 tttgctgtag aaagcaatga aacsttatcc cgcttggagg aaatgcatcc aaattggaaa 660 tatgaacatg atgttcgagg gctaccaaac cattatgttt tttcaaaaga gttgctaaaa 720 ttgggcaaaa gatcatcatt agaagagtta cagggggata acaacgacca catat.tatct 780 gtccatgatt tattcccgcg taacgaccta tttaagagac taccggtgcc tgctccacca 840 atggactcaa gcttgttacc ggt aaa a gaa gctgaggata aactcageat aa aa tccg 900 ctttttgaga ggcagtggca cttggtcaat ccaagttttc ctggcagtga tataaatgtt 960 cttgatctgt ggtacaataa tattacaggc gcaggggtcg tggctgccat tgttgatgat 1020 ggc.cttgact acgaaaatga agacttgaag gataattttt gcgctgaagg ttcttgggat 1080 ttcaacgaca ataccaattt acctaaacca agattatctg atgactacca tggtacgaga 1140 tgtgcaggtg aaatagctgc caaaaaaggt aacaattttt gcggtgtcgg ggtaggttac 1200 aacgctaaaa tctcaggcat aagaatctta tccggtgata tcactacgga agatgaagct 1260 gcgtccttga tttatggtct agacgtaaac gatatatatt catgctcatg gggtcccgct 1320 gatgacggaa gacatttaca aggccctagt gacctggtga aaaaggcttt agtaaaaggt 1380 gttactgagg gaagagattc caaaggagcg atttaegttt ttgccagtgg aaatggtgga 1440 actcgtggtg ataattgcaa ttacgacggc tatactaatt ccatatattc tattactatt 1500 ggggctattg atcacaaaga tctacatcct ccttattccg aaggttgttc cgccgtcatg 1560 gcagtcacgt attcttcagg t: caggęgaa tatattcatt cgagtgatat caacggcaga 1620 tgcagtaata gccacggtgg aacgtctgcg gctgctccat tagctgccgg tgtttacact 1680 ttgttactag aagccaaccc aaacctaact tggagagacg tacagtattt atcaatcttg 1740 tctgcggtag ggttagaaaa gaacgctgac ggagattęga gagatagcgc catggggaag 1800 aaatactctc atcgctatgg ctttggtaaa atcgatgccc ataagttaat tg,aaatgtcc 1860 aagacctggg agaatgttaa cgcacaaacc tggttttacc tgccaacatt gtatgtttcc 1920 cagtccacaa actccacgga agagacatta gaatccgtca taaccatatc agaaaaaagt 1980 cttcaagatg ctaacttcaa gagaattgag cacgtcacgg taactgtaga tattgataca 2040 gaaattaggg gaactacgac tgtcgattta atatcaccag cggggataat ttcaaacctt 2100 ggcgttgtaa gaccaagaga tgtttcatca gagggattca aagactggac attcatgtct 2160 gtagcacatt ggggtgagaa cggcgtaggt gattggaaaa tcaaggttaa gacaacagaa 2220 aatggacaca ggattgactt ccacagttgg aggctgaagc tctttgggga atccattgat 2280 tcatctaaaa cagaaacttt cgtctttgga aacgataaag aggaggttga accagctgct 2340 acagaaagta ccgtatcaca atattctgcc agttcaactt ctatttccat cagcgctact 2400 tctacatctt ctatctcaat tggtgtggaa acgtcggcca ttccccaaac gactactgeg 2460 agtaccgatc ctgattctga tccaaacaot cctaaaaaac tttcctctcc taggcaagcc 2520 atgcattatt ttttaacaat atttttgatt ggcgccacat ttttggtgtt atacttcatg 2580

PL 213 045 B1 ttttttatga aatcaaggag aaggatcaga aggtcaagag cggaaacgta tgaattcgat 2640 atcattgata cagactctga gtacgattct actttggaca atggaacttc cggaattact 2700 gagcccgaag aggttgagga cttcgatttt gatttgtccg atgaagacca tcttgcaagt 2760 ttgtcttcat cagaaaacgg tgatgctgaa catacaattg atagtgtact aacaaacgaa 2820 aatccattta gtgaccctat aaagcaaaag ttcccaaatg acgccaacgc agaatctgct 2880 tccaataaat tacaagaatt acagcctgat gttcctccat cttccggacg atcgtgagcg 2940 gccgecaget ttctagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac 3000 catcatcatc atcatcattg agttttagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg 3060 ggcacttacg agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt 3120 tgcctgagag atgcaggctt catttttgat acttttttat ttgtaaccta tatagtatag 3180 gatttttttt gtcattttgt ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc 3240 agctgatgaa tatcttgtgg taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt 3300 ggtatttccc actcctcttc agagtacaga agattaagtg agaccttcgt ttgtgcggat 3360 cctcagaatt ggttaattgg ttgtaacact ggcagagcat tacgctgact tgacgggacg 3420 gcggctttgt tgaataaatc gaacttttgc tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc 3480 cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta 3540 caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct cactttctgg ctggatgatg gggcgattca 3600 ggcctggtat gagtcagcaa caccttcttc acgaggcaga cctcagcgcc cccccccccc 3660 ctgcaggtcg gccacgatgc gtccggcgta gaggatctcc tgatgactga ctcactgata 3720 ataaaaatac ggcttcagaa tttctcaaga ctacactcac tgtccgactt caagtatgac 3780 atttcccttg ctacctgcat acgcaagtgt tgcagagttt gataattcct tgagtttggt 3840 aggaaaagcc gtgtttccct atgctgctga ccagctgcac aacctgatca agttcactca 3900 atcgactgag cttcaagtta atgtgcaagt tgagtcatcc gttacagagg accaatttga 3960 ggagctgatc gacaacttgc tcaagttgta caataatggt atcaatgaag tgattttgga 4020 cctagatttg gcagaaagag ttgtccaaag gatgatccca ggcgctaggg ttatctatag 4080 gaccctggtt gataaagttg catccttgcc cgctaatgct agtatcgctg tgcctttttc 4140 ttctccactg ggcgatttga aaagtttcac taatggcggt agtagaactg tttatgcttt 4200 ttctgagacc gcaaagttgg tagatgtgac ttccactgtt gcttctggta taatccccat 4260 tattgatgct cggcaattga ctactgaata cgaactttct gaagatgtca aaaagttccc 4320 tgtcagtgaa attttgttgg cgtctttgac tactgaccgc cccgatggtc tattcactac 4380 tttggtggct gactcttcta attactcgtt gggcctggtg tactcgtcca aaaagtctat 4440 tccggaggct ataaggacac aaactggagt ctaccaatct cgtcgtcacg gtttgtggta 4500 taaaggtgct acatctggag caactcaaaa gttgctgggt atcgaattgg attgtgatgg 4560 agactgcttg aaatttgtgg ttgaacaaac aggtgt.tggt ttctgtcact tggaacgcac 4620 ttcctgtttt ggccaatcaa agggtcttag agccatggaa gccaccttgt gggatcgtaa 4680 gagcaatgct ccagaaggtt cttataccaa acggttattt gacgacgaag ttttgttgaa 4740 cgctaaaatt agggaggaag ctgatgaact tgcagaagct aaatccaagg aagatatagc 4800 ctgggaatgt gctgacttat tttattttgc attagttaga tgtgccaagt acggtgtgac 4860 gttggacgag gtggagagaa acctggatat gaagtcccta aaggtcacta gaaggaaagg 4920 agatgccaag ccaggataca ccaaggaaca acctaaagaa gaatccaaac ctaaagaagt 4980 cccttctgaa ggtcgtattg aattgtgcaa aattgacgtt tctaaggcct cc.tcacaaga 5040 aattgaagat gcccttcgtc gtcctatcca gaaaacggaa cagattatgg aattagtcaa 5100 accaattgtc gacaatgttc gtcaaaatgg tgacaaagcc cttttagaac taactgccaa 5160 gtttgatgga gtcgctttga agacacctgt gttagaagct cctttcccag aggaacttat 5220 gcaattgcca gataacgtta agagagccat tgatctctct atagataacg tcaggaaatt 5280 ccatgaagct caactaacgg agacgttgca agttgagact tgccctggtg tagtctgctc 5340 tcgttttgca agacctattg agaaagttgg cctctatatt cctggtggaa ccgcaattct 5400 gccttccact tccctgatgc tgggtgttcc tgccaaagtt gctggttgca aagaaattgt 5460 ttttgcatct ccacctaaga aggatggtac ccttacccca gaagtcatct acgttgccca 5520 caaggttggt gctaagtgta tcgtgctagc aggaggcgcc caggcagtag ctgctatggc 5580 ttacggaaca gaaactgttc ctaagtgtga caaaatattt ggtccaggaa accagttcgt 5640 tactgctgcc aagatgatgg ttcaaaatga cacatcagcc ctgtgtagta ttgacatgcc 5700 tgctgggcct tctgaagttc tagttattgc tgataaatac gctgatccag atttcgttgc 5760 ctcagacctt ctgtctcaag ctgaacatgg tattgattcc caggtgattc tgttggctgt 5820 cgatatgaca gacaaggagc ttgccagaat tgaagatgct gttcacaacc aagctgtgca 5880 gttgccaagg gttgaaattg tacgcaagtg tattgcacac tctacaaccc tatcggttgc 5940 aacctacgag caggctttgg aaatgtccaa tcagtacgct cctgaacact tgatcctgca 6000 aatcgagaat gcttcttctt atgttgatca agtacaacac gctggatctg tgtttgttgg 6060 tgcctactct ccagagagtt gtggagatta ctcctccggt accaaccaca ctttgccaac 6120 gtacggatat gcccgtcaat acagcggagt taacactgca accttccaga agttcatcac 6180 ttcacaagac gtaactcctg agggactgaa acatattggc caagcagtga tggatctggc 6240 tgctgttgaa ggtctagatg ctcaccgcaa tgctgttaag gttcgtatgg agaaactggg 6300

PL 213 045 B1 acttatttaa cccgggcgaa taataactgt tatttttcag tgttcccgat ctgcgtctat 6360 ttcacaatac caacatgagt cagcttatcg atgataagct gtcaaacatg agaattaatt 6420 cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa 6430 tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt 6540 tattt.ttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc 6600 ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc 6660 ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa 6720 aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg 6780 gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acctttaaag 6840 ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcgglcgcc 6900 gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta 6960 cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg 7020 eggceaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca 7080 acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac 7140 caaacgacga gcgtgacacc acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat 7200 taactggcga actacttact ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg 7260 ataaagttgc aggaccactt ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata 7320 aatctggagc cggtgagcgt gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta 7380 agccctcccg tatcgtagtt atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa 7440 atagacagat cgctgagata ggtgcctcac tgattaagca ttggtaaacg cgtgtacgca 7500 tgtaacatta tactgaaaac cttgcttgag aaggttttgg gacgctcgaa ggctttaatt 7560 tgcaagctgg agaccaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 7620 gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 7680 cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 7740 ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 7800 tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgcteae gctgtaggta tctcagttcg 7860 gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac eccccgttca gcccgac.cgc 7920 tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 7980 ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 8040 ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 8100 ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttqgtagct cttgatccgg caaacaaacc 8160 accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 8220 tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 8280 cgttaaggga ttttggtcat gcatgagatc 8310 <210> 35 <211> 1191 <212> DNA <213> artificial seąuence <220>

<223> encoding fragment MluT-Amp-Smal <400> 35 tattacgcgt ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc 60 attcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac 120 catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat 180 cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg 240 cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata 300 gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta 360 tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt 420 gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag 480 tgttatcact cat.ggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa 540 gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc 600 gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac cgcgccacat agcagaactt 660

Laaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc 720 tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta 780 ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 840 taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 900 tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac 960 aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgtctaa gaaaccatta 1020 ttatcatgac attaacctat aaaaatagge gtatcacgag gccctttcgt cttcaagaat 1080 taattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctgact catgttggta ttgtgaaata 1140 gacgcagatc gggaacactg aaaaataaca gttattattc gcccgggaat t 1191 <210> 36

PL 213 045 B1 <211> 9276 <212> DNA <213> artificiai seguence <220>

<223> plasmid pPIC9K <400> 36 agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60 gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120 tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180 agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240 acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgttt.gtt.ta 300 tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360 agtgtggggt caaatagttt catgttcccc saatggccca aaactgacag fcttaaacgct 420 gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480 ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540 cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600 ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660 ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720 gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780 atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840 actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900 caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct 960 tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact 1020 acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 1080 gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 1140 tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa 1200 agagaggctg aagcttacgt agaattccct agggcggccg cgaattaatt cgccttagac 1260 atgactgttc ctcagttcaa gttgggcact tacgagaaga ccggtcttgc tagattctaa 1320 tcaagaggat gtcagaatgc catttgcctg agagatgcag gcttcatttt tgatactttt 1380 ttatttgtaa cctatatagt ataggatttt ttt.tgtcatt ttgtttcttc tcgtacgagc 1440 ttgctcctga tcagcctatc tcgcagctga tgaatatctt gtggtagggg tttgggaaaa 1500 tcattcgagt ttgatgtttt tcttggtatt tcccactcct cttcagagta cagaagatta 1560 agtgagaagt tcgtttgtgc aagcttatcg ataagcttta atgcggtagt ttatcacagt 1620 taaattgcta acgcagtcag gcaccgtgta tgaaatctaa caatgcgctc atcgtcatcc 1680 tcggcaccgt caccctggat gctgtaggca taggcttggt tatgccggta ctgccgggcc 1740 tcttgcggga tatcgtccat tccgacagca tcgccagtca ctatggcgtg ctgctagcgc 1800 tatatgcgtt gatgcaattt ctatgcgcac ccgttctcgg agcactgtcc gaccgctttg 1860 gccgccgccc agtcctgctc gcttcgctac ttggagccac tatcgactac gcgatcatgg 1920 cgaccacacc cgtcctgtgg atctatcgaa tctaaatgta agttaaaatc tctaaataat 1980 taaataagtc ccagtttctc catacgaacc ttaacagcat tgcggtgagc atctagacct 2040 tcaacagcag ccagatccat cactgcttgg ccaatatgtt tcagtccctc aggagttacg 2100 tcttgtgaag tgatgaactt ctggaaggtt gcagtgttaa ctccgctgta ttgacgggca 2160 tatccgtacg ttggcaaagt gtggttggta ccggaggagt aatctccaca actctctgga 2220 gagtaggcac caacaaacac agatccagcg tgttgtactt gatcaacata agaagaagca 2280 ttctcgattt gcaggatcaa gtgttcagga gcgtactgat tggacatttc caaagcctgc 2340 tcgtaggttg caaccgatag ggttgtagag tgtgcaatac acttgcgtac aatttcaacc 2400 cttggcaact gcacagcttg gttgtgaaca gcatcttcaa ttctggcaag ctccttgtct 2460 gtcatatcga cagccaacag aatcacctgg gaatcaatac catgttcagc ttgagacaga 2520 aggtctgagg caacgaaatc tggatcagcg tatttatcag caataactag aacttcagaa 2580 ggcccagcag gcatgtcaat actacacagg gctgatgtgt cattttgaac catcatcttg 2640 gcagcagtaa cgaactggtt tcctggacca aatattttgt cacacttagg aacagtttct 2700 gttccgtaag ccatagcagc tactgcctgg gcgcctcctg ctagcacgat acacttagca 2760 ccaaccttgt gggcaacgta gatgacttct ggggtaaggg taccatcctt cttaggtgga 2820 gatgeaaaaa caatttcttt gcaaccagca actttggcag gaacacccag catcagggaa 2880 gtggaaggca gaattgcggt tccaccagga atatagaggc caactttctc aataggtctt 2940 gcaaaacgag agcagactac accagggcaa gtctcaactt gcaacgtctc cgttagttga 3000 gcttcatgga atttcctgac gttatctata gagagatcaa tggctctctt aacgttatct 3060 ggcaattgca taagttcctc tgggaaagga gcttctaaca caggtgtctt caaagcgact 3120 ccatcaaact tggcagttag ttctaaaagg gctttgtcac cattttgacg aacattgtcg 3180 acaattggtt Lgactaatfc cataatctgt tccgttttct ggataggacg acgaagggca 3240 tcttcaattt cttgtgagga ggccttagaa acgtcaattt tgcacaattc aatacgacct 3300 tcagaaggga cttctttagg tttggattct tctttaggtt gttccttggt gtatcctggc 3360

PL 213 045 B1 ttggcatctc tcgtccaacg cattcccagg attttagcgt gcattgctct aaacaggaag aagcagtctc gcacctttat gcctccggaa gccaccaaag tcactgacag gcatcaataa gtctcagaaa agtggagaag accagggtcc aaatctaggt atcagctcct tcagtcgatt gcttttccta aagggaaatg tatttttatt gacctgcagg taccaggcct gctttgttgt gcgttgtcgg caaagccgcc attctgatta tatcaatacc agttccatag tacaacctat tgacgactga caggccagcc gtgattgcgc gaatcgaatg caggatattc atgcatcatc gccagtttag tcagaaacaa gcccgacatt atcgoggcct tgtttatgta aacatcagag ccggcgccac gggctcgcca tggccggggg tcaacggcct gtcgagtatc ggtctcctat tctctgactt aaatgtcctt gaacaaactt tgtcgggtag gtttgtagat aatccagaga tgacaatagt tsaataatct aaaaggacaa caacttgagg ggtacgctga tgacggtgaa ggatgccggg cgcagccatg ctttccttct tcacaccgta ctatatcttc tcaacaaaac tacgatccca tgcgttccaa catcacaatc accacaaacc tagacttttt tagtgaatag ggaacttttt tggggattat aagcataaac aaaaaggcac tatagataac ccaaaatcac caaattggtc gagtgaactt ccaaactcaa tcatacttga atcagtgagt gggggggggg gaatcgcccc aggtggacca gaagatgcgt gtcccgtcaa gaaaaactca atatttttga gatggcaaga taatttcccc atccggtgag attacgctcg ctgagcgaga caaccggcgc ttctaatacc aggagtacgg tctgaccatc ctctggcgca atcgcgagcc cgagcaagac agcagacagt attttgagac aggtgcggtt cttcgggctc actgttgggc caacctacta tatgattgga cagattatgc ttggtcatca cttggagaca cttgtttcga gaatggagcg actgatgeca aatcaaagtt gtgctcgtgt tgacgagcca gtatgtctgc ggcactatct ttttaaacgt aacctctgac agcagacaag acccagtcac agtgaccttt cttggcacat cttggattta ttcgtcgtca caaggtggct gtgacagaaa caattcgata gtgacgaega ggacgagtac accatcgggg gacatcttca accagaagca agttctacta agcgatacta cctagcgcct ttcattgata etctgtaacg gatcaggttg ggaattatca agtcggacag cagtcatcag gcgctgaggt atcatccagc gttggtgatt gatctgatcc gtcagcgtaa tcgagcatca aaaagccgtt tcctggtatc tcgtcaaaaa aatggcaaaa tcatcaaaat cgaaatacgc aggaacactg tggaatgctg ataaaatgct tcatctgtaa tcgggcttcc catttatacc gtttcccgtt tttattgttc acaacgtggc gctggcgcct atgagcgctt gccatctcct ctgggctgct agtatgggaa ccaactaaag gtagactcga gtaaatgaag actttttcgg ggcaaatgct acttcagtga gtttgtctac tttgaggtca aggcgataaa ctgtattaaa tgttttagag gaaatttatc acatgcagct ccegtcaggg gtagcgatag agggacttca ctaactaatg gcttctgcaa aataaccgtt tccatggctc ccaacacctg cccagcaact gattggtaga accaggccca cggtcagtag gaaagttcgt acagtggaag ccgccattag gcattagcgg gggatcatcc eeattattgt gatgactcaa tgcagctggt aactctgcaa tgagtgtagt gagatcctct ctgcctcgtg cagaaagtga ttgaactttt ttcaactcag tgctctgcca aatgaaactg tctgtaatga ggtctgcgat taaggttatc gcttatgcat cactcgcatc gatcgctgtt ccagcgcatc ttttcccggg tgatggtcgg catcattggc catacaatcg catataaatc gaatatggct atgatgatat tttccccccc atatcgccga gtttcggcgt tgcatgcacc tcctaatgca tggtgatacc caaccggagg actgtgagac tcccaccaat tgccttgaac taccttctgg caacgttgct tattgatcca tctttgtatg tacccaaatc ccccaaatca aaatttgcgg tcaagatctc cccggagacg cgcgtcagcg cggagtgtat tatccaggtt caaaataaaa gttcatcagc tggtataaga taagaccctt tttgttcaac tttgagttgc ctccagtttg acgagtaatt tcaaagacgc attcagtagt tcacatetac tgaaactttt gcaaggatgc tttggacaac acaacttgag cttgcacatt cagcagcata cacttgcgta cttgagaaat acgccggacg aagaaggtgt gggagccacg gctttgccac caaaagttcg gtgttacaac caatttattc aggagaaaac tccgactcgt aagtgagaaa ttctttccag aaccaaaccg aaaaggacaa aacaatattt gatcgcagtg aagaggcata aacgctacct atagattgtc agcatccatg cataacaccc atttttatct ccccctgcag catcaccgat gggtatggtg attccttgcg ggagtcgcat cgcattcttc aggagatttc tatctcggtt aaagaaatcc tataaaatgt accttcaaga atttcgttca agccagtgcg aataaatcta taaaactctt gctcgtagtc agatgcgata tgcctcgcgc gtcacagctt ggtgttggcg actggcttaa tctctccacc taagtcagca ttcctcccta accttctgga tgattggcca cacaaatttc tccagatgta tgtccttata agaagagtca caacaaaatt caattgccga caactttgcg caaatcgccc aacttta tea tcttfcctgcc eaagt tgtcg aacttgaagc gggaaacacg tgcaggtagc tctgaagccg catcgtggcc tgctgactca gttgatgaga ggaacggtct atttattcaa caattaacca atateaggat tcaccgaggc ccaacatcaa tcaccatgag acttgttcaa ttatteatte ttaeaaacag teaeetgaat gtgagtaaec aattccgtca ttgceatgtt cf c. a t-. Cr. t cg cc,— fc ttggaattta cttgtattac tgtgcaatgt gtcggcatca ggggaagatc gcaggccccg gcggcggtgc aagggagagc agtgtcttga atggtaaatt atgacagcag ttgttatcag agagtggata ggtatgtagg aaccattccg gtcttgaaac gtctttgatc ttaaaacgt t tgatcctcat tcgagaaaaa gtttcggtga gtctgtaagc ggtgtcgggg etatgeggea

3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5150 5220 5280 534 0 54 00 5450 5520 5580 5640 57 00 57 60 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080

PL 213 045 B1 tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta 7140 aggagaaaat accgcatcag gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 7200 gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 7260 gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 7320 cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 7380 aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 7440 tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 7500 ctgtccgcct Łtctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 7560 ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 7620 cccgacegct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 7680 ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 7740 gctacagagt tettgaagtg gtggcctaac tacggctaca etagaaggac agtatttggt 7800 atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 7860 aaacaaacca cegctggtag eggtggtttt tttgtttgca ageageagat taegegeaga 7920 aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttetaegg ggtetgacgc tcagtggaac 7980 gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattateaa aaaggatctt cacctagatc 8040 cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 8100 gacagttacc aatgcttaat eagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 9160 tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 8220 ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttateagea 8280 ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 8340 atecagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 8400 cgcaacgttg ttgccattgc tgcaggcatc gtggtgtcac gctegtcgtt tggtatggct 8460 teatteaget ccggttccca aegatcaagg cgagttacat gatcccceat gttgtgcaaa 8520 aaagcggtta getccttcgg tectccgate gttgtcagaa gtaagttggc egcagtgtta 8580 tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg teatgeeate cgtaagatgc 8640 ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag teattetgag aatagtgtat gcggcgaccg 8700 agttgetett gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 8760 gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 8820 agatccagtt cgatgtaaec cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 8880 accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggeaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 8940 gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 9000 eagggttatt gteteatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 9060 ggggttcegc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 9120 atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattaatt 9180 ctcatgtttg acagcttatc atcgataagc tgactcatgt tggtattgtg aaatagacgc 9240 agatcgggaa cactgaaaaa taacagttat tatteg 9276 <210> 37 <211> 5929 <212> DNA <213> artificial seguence <220>

<223> plasmid pGAP/Amp/Kex2 <400> 37 agatcttttt tgtagaaatg tcttggtgtc ctcgtccaat caggtagcca tctctgaaat 60 atctggctcc gttgcaactc cgaacgacct gctggcaacg taaaattctc cggggtaaaa 120 cttaaatgtg gagtaatgga accagaaacg tctcttccct tetetet.cct tccaccgccc 180 gttaccgtcc ctaggaaatt ttactctgct ggagagette ttctacggcc cccttgcagc 240 aatgetette ccagcattac gttgcgggta aaacggaggt cgtgtacccg acctagcagc 300 ccagggatgg aaaagtcccg gccgtcgctg gcaataatag cgggcggacg catgtcatga 360 gattattgga aaccaccaga ategaatata aaaggcgaac acctttccca attttggttt 420 ctcctgaccc aaagacttta aatttaattt atttgtccct atttcaatca attgaacaac 480 tatttcgaaa cgatgaaagt gaggaaatat attactttat gcttttggtg ggccttttca 540 acatccgctc ttgtatcatc acaacaaatt ccattgaagg accatacgtc acgacagtat 600 tttgctgtag aaagcaatga aacattatcc cgcttggagg aaatgcatcc aaattggaaa 660 tatgaacatg atgttcgagg gctaccaaac cattatgttt tttcaaaaga gttgctaaaa 720 ttgggcaaaa gateateatt agaagagtta cagggggata acaacgacca catattat.et 780 gtccatgatt tattcccgcg taacgaccta tttaagagac taccggtgcc tgctccacca 840 atggaetcaa gcttgttacc ggtaaaagaa gctgaggata aactcagcat aaatgatccg 900 ctttttgaga ggcagtggca cttggtcaat ccaagttttc ctggcagtga tataaatgtt 960 cttgatctgt ggtacaataa tattacaggc gcaggggtcg tggctgccat tgttgatgat 1020 ggccttgact acgaaaatga agacttgaag gataattttt gcgctgaagg ttcttgggat 1080

PL 213 045 B1 ttcaacgaca ataccaattt acctaaacca agattatctg atgactacca tggtacgaga 1140 tgtgcaggtg aaatagctgc caaaaaaggt aacaattttt gcggtgtcgg ggtaggttac 1200 aacgctaaaa tctcaggcat aagaatctta tccggtgata tcactacgga agatgaagct 1260 gcgtcettga tttatggtct agacgtaaac gatatatatt catgctcatg gggtcccgct 1320 gatgacggaa gacatttaca aggccctagt gacctggtga aaaaggcttt agtaaaaggt 1380 gttactgagg gaagagattc caaaggagcg atttacgttt ttgccagtgg aaatggtgga 1440 actcgtggtg ataattgcaa ttacgacggc tatactaatt ccatatattc tattactatt 1.500 ggggctattg atcacaaaga tctacatcct ccttattccg aaggttgttc cgccgteatg 1560 gcagteacgt attcttcagg ttcaggcgaa tatattcatt cgagtgatat caacggcaga 1620 tgcagtaata gccacggtgg aacgtctgcg gctgctccat tagctgccgg tgtttacact 1680 ttgttactag aagccaaccc aaaectaact tggagagacg tacagtattt atcaatcttg 1740 tctgcggtag ggttagaaaa gaacgctgac ggagattgga gagatagcgc catggggaag 1800 aaatactctc atcgctatgg ctttggtaaa atcgatgccc ataagttaat tgaaatgtcc 1860 aagacctggg agaatgttaa cgcacaaacc tggttttacc tgccaacatt gtatgtttcc 1920 oagtccacaa actccacgga agagacatta gaatccgtca taaccatatc agaaaaaagt 1980 cttcaagatg ctaacttcaa gagaattgag cacgtcacgg taactgtaga tattgataca 2040 gaaattaggg gaactacgac tgtcgattta atatcaccag cggggataat ttcaaacctt 2100 ggcgttgtaa gaccaagaga tgtttcatca gagggattca aagactggac attcatgtct 2160 gtagcacatt ggggtgagaa cggcgtaggt gattggaaaa tcaaggttaa gacaacagaa 2220 aatggacaca ggattgactt ccacagttgg aggctgaagc tctttgggga atccattgat 2280 tcatctaaaa cagaaacttt cgtctttgga aacgataaag aggaggttga accagctgct 2340 acagaaagta ccgtatcaca atattctgcc agttcaactt ctatttccat cagcgctact 2400 tctacatctt ctatcteaat tggtgtggaa acgtcggcca ttccccaaac gactactgcg 2460 agtaccgatc ctgattctga tccaaacact cctaaaaaac tttcctctcc taggcaagcc 2520 atgcattatt ttttaacaat atttttgatt ggcgccacat ttttggtgtt atacttcatg 2580 ttttttatga aatcaaggag aaggatcaga aggtcaagag cggaaacgta tgaattcgat 2640 atcattgata cagactctga gtacgattct actttggaca atggaacttc cggaattact 2700 gagcccgaag aggttgagga cttcgatttt gatttgtccg atgaagacca tcttgcaagt 2?60 ttgtcttcat cagaaaacgg tgatgctgaa catacaattg atagtgtact aacaaacgaa 2820 aatccattta gtgaccctat aaagcaaaag ttcccaaatg acgccaacgc agaatctgct 2880 tccaataaat tacaagaatt acagcctgat gttcctccat cttccggacg atcgtgagcg 2940 gccgecaget ttctagaaca aaaactcatc tcagaagagg atctgaatag cgccgtcgac 3000 catcatcatc atcatcattg agttttagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg 3060 ggcacttacg agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt 3120 tgcctgagag atgcaggctt catttttgat acttttttat ttgtaaccta tatagtatag 3180 gatttttttt gtcattttgt ttcttctcgt acgagcttgc tcctgatcag cctatctcgc 3240 agctgatgaa tatcttgtgg taggggtttg ggaaaatcat tcgagtttga tgtttttctt 3300 ggtatttccc actcctcttc agagtacaga agattaagtg agaccttcgt ttgtgcggat 3360 cccccacaca ccatagcttc aaaatgtttc tactcetttt ttactcttcc agattttctc 3420 ggactccgcg catcgccgta ccacttcaaa acacccaagc acagcatact aaattttccc 3480 tctttcttcc tctagggtgt cgttaattac ccgtactaaa ggtttggaaa agaaaaaaga 3540 gaccgcctcg tttctttttc ttcgtcgaaa aaggcaataa aaatttttat cacgtttctt 3600 tttcttgaaa tttttttttt tagttttttt ctctttcagt gacctccatt gatatttaag 3660 ttaataaacg gtcttcaatt tctcaagttt cagtttcatt tttcttgttc tattacaact 3720 ttttttactt cttgttcatt agaaagaaag catagcaatc taatctaagg gcggtgttga 3780 caattaatca teggeatagt atateggeat agtataatac gacaaggtga ggaactaaac 3840 catggccaag ttgaccagtg ccgttccggt gctcaccgcg cgcgacgtcg ccggagcggt 3900 cgagttctgg accgaccggc tcgggttctc ccgggcgaat aataactgtt atttttcagt 3960 gttcccgatc tgcgtctatt. tcacaatacc aacatgagtc agettatega tgataagctg 4020 tcaaacatga gaattaattc ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag 4080 gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 4140 cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc geteatgaga 4200 caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 4260 ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 4320 gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gateagttgg gtgcacgagt gggttacatc 4380 gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 4440 atgatgagea cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg 4500 caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 4560 gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 4620 accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa egateggagg accgaaggag 4680 ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat. catgtaactc geettgateg ttgggaaccg 4740 gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgaeacca egatgcctgc agcaatggca 4800

PL 213 045 B1 acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 4860 atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcąctcggc ccttccggct 4920 ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 4930 gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 5040 gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 5100 tggtaaacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 5160 acgctcgaag gctttaattt gcaagctgga gaccaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa 5220 ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga 5230 cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag 5340 ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct 5400 taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg 5460 ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc 5520 ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt 558C aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta 5640 tgtaggcggt getacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac 5700 agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc 5760 ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca ageageagat 5620 taegegeaga aaaaaaggat ctcaagaags tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc 5860 tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg catgagatc 5929 <210> 38 <211> 2968 <212> DNA <213> artificial aeguence <220>

<223> encoding fragment BamHI-His4-SmaI <400> 38 ttttggatcc tcagaattgg ttaattggtt gtaacactgg cagagcatta cgctgacttg 60 acgggacggc ggctttgttg aataaatcga acttttgctg agttgaagga tcagatcacg 120 catcttcc.cg acaacgcaga ccgttccgtg gcaaagcaaa agttcaaaat caccaaetgg 180 tccacctaca acaaagctct catcaaccgt ggctccctca ctttctggct ggatgatggg 240 gcgattcagg cctggtatga gtcagcaaca ccttcttcac gaggcagacc tcagcgcccc 300 ecccccccct gcaggtcggc cacgatgcgt ccggc.gtaga ggatctcctg atgactgact 360 cactgataat aaaaatacgg cttcagaatt tctcaagact acactcactg tccgacttca 420 agtatgacat ttcccttgct acctgcatac gcaagtgttg cagagtttga taattccttg 480 agtttggtag gaaaagccgt gtttccctat gctgctgacc agctgcacaa cctgatcaag 540 ttcactcaat cgactgagct tcaagttaat gtgcaagttg agtcatccgt tacagaggac 600 caatttgagg agetgatega caacttgctc aagttgtaca ataatggtat caatgaagtg 660 attttggacc tagatttggc agaaagagtt gtccaaagga tgatcccagg cgctagggtt 720 atetatagga ccctggttga taaagttgca tccttgcccg ctaatgetag tatcgctgtg 780 cctttttctt ctccactggg cgatttgaaa agtttcacta atggcggtag tagaactgtt 840 tatgcttttt ctgagaccgc aaagttggta gatgtgactt ccactgttgc ttctggtata 900 atccccatta ttgatgetcg gcaattgact actgaatacg aactttctga agatgtcaaa 960 aagttccctg tcagtgaaat tttgttggcg tctttgacta ctgaccgccc cgatggtcta 1020 ttcactactt tggtggctga ctc.ttctaat tactcgttgg gcctggtgta ctcgtccaaa 1080 aagtctattc cggaggctat aaggacacaa actggagtct accaatctcg tcgtcacggt 1140 ttgtggtata aaggtgctac. atctggagca actcaaaagt tgctgggtat cgaattggat 1200 tgtgatggag actgcttgaa atttgtggtt gaacaaacag gtgttggttt ctgtcaettg 1260 gaacgcactt cctgttttgg ccaatcaaag ggtcttagag ccatggaagc caccttgtgg 1320 gatcgtaaga gcaatgctcc agaaggttct tataccaaac ggttatttga cgacgaagtt 1380 ttgttgaacg ctaaaattag ggaggaagct gatgaacttg cagaagctaa atccaaggaa 1440 gatatagcct gggaatgtgc tgacttattt tattttgcat tagttagatg tgccaagtac 1500 ggtgtgacgt tggacgaggt ggagagaaac etggatatga agtccctaaa ggtcact.aga 1560 aggaaaggag atgccaagcc aggatacacc aaggaacaac ctaaagaaga atccaaacct 1620 aaagaagtcc cttctgaagg tcgtattgaa ttgtgcaaaa ttgacgtttc taaggcctcc 1680 tcacaagaaa ttgaagatgc ccttcgtcgt cctatccaga aaacggaaca gattatggaa 1740 ttagtcaaac caattgtcga caatgttegt caaaatggtg acaaagccct tttagaacta 1800 actgccaagt ttgatggagt cgctttgaag acacctgtgt tagaagctcc tttcccagag 1860 gaacttatgc aattgccaga taacgttaag agagccattg atetetetat agataacgtc 1920 aggaaattcc atgaagctca actaacggag acgttgcaag ttgagacttg ccctggtgta 1980 gtctgctctc gttttgcaag acctattgag aaagttggcc tctatattcc tggtggaacc 2040 gcaattctgc cttccacttc cctgatgctg ggtgttcctg ccaaa.gt.tge tggttgcaaa 2100 gaaattgttt ttgcatctcc acctaagaag gatggtaccc ttaccccaga agtcatctac 2160

PL 213 045 B1 gttgcccaca gctatggctt cagttcgtta gacatgcctg ttcgttgcct ttggctgtcg gctgtgcagt tcggttgcaa atcctgcaaa tttgttggtg ttgccaacgt ttcatcactt gatctggctg aaactgggac aggttggtgc acggaacaga ctgctgccaa ctgggccttc cagaccttct atatgacaga tgccaagggt cctacgagca tcgagaatgc cctactctcc acggatatgc cacaagacgt ctgttgaagg ttatttaacc taagtgtatc aactgttcct gatgatggtt tgaagttcta gtctcaagct caaggagctt tgaaattgta ggctttggaa ttcttcttat agagagttgt ccgtcaatac aactcctgag tctagatgct cgggaatt gtgctagcag aagtgtgaca caaaatgaca gttattgctg gaacatggta gccagaattg cgcaagtgta atgtccaatc gttgatcaag ggagattact agcggagtta ggactgaaac caccgcaatg gaggcgccca aaatatttgg catcagccct ataaatacgc ttgattccca aagatgctgt ttgcacactc agtacgctcc tacaacacgc cctccggtac acactgcaac atattggcca ctgttaaggt ggcagtagct tccaggaaac gtgtagtatt tgatccagat ggtgattctg tcacaaccaa tacaacccta tgaacacttg tggatctgtg caaccacact cttccagaag agcagtgatg tcgtatggag

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

2968

Claims (25)

1. Mutant zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierający sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez proteazę Kex2 umieszczoną pomiędzy pro-peptydem, a sekwencją białka o aktywności dojrzałej proteinazy K.

2. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że białko o aktywności dojrzałej proteinazy K posiada sekwencję aminokwasową dojrzałej proteinazy K zawierającą mutację zwiększająca efektywność odcinania pro-peptydu przez proteazę Kex2, korzystnie substytucję Ala-106 na Glu-106.

3. Mutant według zastrz. 1, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:1.

4. Mutant dojrzałej proteinazy K z Tritirachium album zawierający mutację zwiększająca efektywność odcinania pro-peptydu przez proteazę Kex2, korzystnie substytucję Ala znajdującej się w pozycji pierwszej na Glu.

5. Mutant według zastrz. 4, znamienny tym, że posiada sekwencję przedstawioną jako SEQ ID No.:2.

6. Sekwencja DNA zawierająca sekwencję kodującą mutanta zymogenu proteinazy K według dowolnego z zastrz. od 1 do 3 albo jego fragment.

7. Sekwencja DNA według zastrz. 6, znamienna tym, że posiada sekwencję SEQ ID No.:3.

8. Sekwencja oligonukleotydu służącego do otrzymywania sekwencji DNA kodującej mutanta zymogenu proteinazy K według dowolnego z zastrz. od 1 do 3 albo jego fragment wybrana spośród sekwencji SEQ ID No.:5 - 23, 25 - 27, 30.

9. Plazmid ekspresyjny zawierający sekwencję DNA kodującą mutanta zymogenu proteinazy K według dowolnego z zastrz. od 1 do 3.

10. Plazmid według zastrz. 9, znamienny tym, że zawiera ponadto: promotor AOX1, terminator transkrypcji AOX1 gen oporności na ampicylinę (bla), gen oporności na zeocynę (Sh ble), syntetyczny prokariotyczny promotor EM7, promotor TEF1 z Saccharomyces cerevisiae, terminator transkrypcji CYC1 oraz dwa origin replikacji ColE1.

11. Plazmid według zastrz. 9, znamienny tym, że posiada sekwencję wybraną spośród sekwencji: SEQ ID No.:24. SEQ ID No.:28 oraz SEQ ID No.:29,

12. Plazmid rekombinantowy zawierający: sekwencję kodującą endopeptydazę Kex2 Saccharomyces cerevisiae pod kontrolą konstytutywnego promotora CAP, oraz korzystnie terminator transkrypcji AOX1, gen HIS4 S. cerevisiae szlaku syntezy histydyny wraz z własnym promotorem i terminatorem transkrypcji, gen oporności na ampicylinę (bla) oraz origin replikacji ColE1.

13. Plazmid według zastrz. 12, znamienny tym, że posiada sekwencję wybraną spośród sekwencji: SEQ ID No.:32 - 34, 37.

14. Rekombinantowy szczep drożdżowy transformowany plazmidem wybranym z grupy obejmującej plazmid według zastrz. od 9 do 11 i plazmid według zastrz. od 12 do 13.

15. Szczep drożdży według zastrz. 14, znamienny tym, że został otrzymany z jednego ze znanych szczepów drożdży wybranych spośród Pichia sp., Hansenula sp., Saccharomyces sp., SchizoPL 213 045 B1 saccharomyces sp., Yarrovia sp., lub Kluyveromyces sp.., korzystnie wybranego spośród następujących szczepów Pichia pastoris: GS115, SMD1168, KM71.

16. Sposób otrzymywania białka o aktywności proteinazy K Tritirachium album, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek drożdży transformowanych plazmidem ekspresyjnym kodującym mutanta zymogenu proteinazy K z Tritirachium album zawierającego sekwencję aminokwasową rozpoznawaną przez endopeptydazę występującą w komórkach drożdży transformowanych plazmidem ekspresyjnym, umieszczoną pomiędzy pro-peptydem a sekwencją białka o aktywności dojrzałej proteinazy K, a następnie uzyskiwane białko izoluje się i oczyszcza z płynu hodowlanego.

17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że endopeptydaza występująca w komórkach drożdży transformowanych plazmidem ekspresyjnym jest endopeptydazą występującą naturalnie w komórkach gospodarza ekspresyjnego albo endopeptydazą kodowaną przez dodatkowy plazmid rekombinantowy, korzystnie proteazą Kex2.

18. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że prowadzi się hodowlę komórek drożdży według zastrz. 14 albo 15, korzystnie w temperaturze około 28 do 30°C, przy czym indukuje się ekspresję zmodyfikowanego genu proteinazy K metanolem.

19. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że białko o aktywności proteinazy K Tritirachium album izoluje się z płynu pohodowlanego metodą chromatografii oddziaływań hydrofobowych lub metodą chromatografii na złożu hydroksyapatytu, a następnie oczyszcza się prowadząc dializę wobec roztworu węglanu amonu, po czym suszy się ze stanu zamrożenia.

20. Sposób według zastrzeżenia 16, znamienny tym, że zwiększa się efektywność odcinania pro-peptydu proteinazy K przez endopeptydazę.

21. Sposób według zastrzeżenia 17, znamienny tym, że dodatkowy plazmid rekombinantowy zawiera promotor i terminator transkrypcji rozpoznawany przez drożdżową polimerazę RNA.

22. Sposób według zastrzeżeń 16, znamienny tym, że sekrecja proteinazy K inicjowana jest dzięki fuzji translacyjnej z inną niż własna sekwencją sygnalną.

23. Sposób według zastrzeżeń 16, znamienny tym, że sekwencja proteinazy K zawiera domeny fuzyjne ułatwiające oczyszczanie.

24. Sposób według zastrzeżeń 16, znamienny tym, że pro-peptyd proteinazy K zamieniono przez inny naturalnie występujący.

25. Sposób według zastrzeżeń 16, znamienny tym, że sekwencję genu proteinazy K zmutowano nie wpływając na zwiększenie efektywności produkcji, zwiększenie aktywności bądź stabilności enzymu.