JP2011518572A - ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
ホスホリパーゼ活性:本明細書において「ホスホリパーゼ活性」なる用語は、リン脂質を、脂肪酸及び他のリン脂質物質へ変換する、リン脂質分解(EC番号3.1.1.4)活性と定義される。本発明の目的として、ホスホリパーゼ活性は、PHLUとして記載される手法、及び以下の「原料と方法」の段落で記載されるプレートアッセイにより決定される。
本発明者等は、フサリウム・オキシスポラム又はフサリウム・グラミネアリウム(ジベレラ・ゼアエ(Gibberella zeae))のC末端から単離され得るペプチドは、リパーゼと結合できることを見出した。彼等はさらに、フサリウム・オキシスポラムのペプチドは、ホスホリパーゼ阻害活性を有することを示した。すなわち、例えば、ネクトリアリパーゼ;ネクトリア・ヘマトコッカ(Nectria haematococca)(フサリウム・エウマルチイ(Fusarium eumartii));フサリウム・ソラニ;フサリウム・クルモルム;フサリウム・セミテクタム;及びフサリウム・ヘテロスポラム等の任意の好適なホスホリパーゼから単離される類似のC末端ペプチドは、ホスホリパーゼ活性を阻害するために使用できることを示す。
別の態様によれば、本発明は、発現宿主においてペプチドの産生を方向付ける少なくとも1つの制御配列に作動的に結合するポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物に関する。
別の態様によれば、本発明は、当該核酸構築物を含んでなる組換え発現ベクターに関する。
別の態様によれば、本発明は、核酸構築物又は組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞に関する。
を含んでなる単離ペプチドの調製方法に関する。
ホスホリパーゼ活性(PHLU)
ホスホリパーゼ活性(PHLU)を、レシチンからの遊離脂肪酸の放出として測定する。50mM HEPES,pH7中の、50μlの4% L−アルファ−ホスファチジルコリン(Avantiからの植物レシチン)、5mM CaCl2を、50mM HEPES,pH7中で適切な濃度に希釈した50μl酵素溶液に添加する。サンプルを、10分間30℃でインキュベートし、95℃、5分間で反応を停止させた後、遠心分離した(7000rpmで5分間)。遊離脂肪酸を、NEFA Cキット(Wako Chemicals GmbH製)を用いて決定する;25μl反応混合物を、250μlの試薬Aに添加し、10分間37℃でインキュベーションする。その後、500μlの試薬Bを添加し、当該サンプルを再び10分間37℃でインキュベートする。550nmでの吸収を、HP8452Aダイオードアレイ分光光度器を用いて測定する。サンプルは、少なくとも2重に試験する。基質及び酵素ブラインド(blinds)(予備加熱した(95℃で10分)酵素サンプル+基質)を含有させる。オレイン酸を脂肪酸標準として使用する。1PHTUは、これらの条件で、1μmolの遊離脂肪酸/分を放出できる酵素量と等しい。特定のホスホリパーゼ活性(PHLU/mg)を、タンパク質量(mg)当たりのホスホリパーゼ活性(PHLU)で計算する。
タンパク質発現及び精製:ジベレラ・ゼアエ/フサリウム・グラミネアリウムリパーゼ(GZEL)遺伝子を、PCRで増幅し、さらに配列決定により確認した。その後、CZEL遺伝子を酵母において発現し、これはクマシー染色後にSDS−PAGEで顕著なタンパク質バンドを示した。そして、活性は、pH7で、オリーブ油/ブライトグリーンプレートで検出した。ポジティブ候補クローンは、穴の周辺に暗緑色ゾーンを示した。
結晶構造の非対称ユニットにおいて、4つのGZLE−ペプチド複合体が存在する。当該4つの複合体は、互いに独立に精製された。これらは、4つの異なる物体を構成する。この4つの異なる複合体において、ペプチドは、リパーゼコアドメインに対して正確に同じように置かれた。以下の表5を参照されたい。これは、リパーゼコアに対するペプチドの特異的結合についての別の証拠セットを提供する。
FoLを、PilotファーメンテーションLVF57UF濃縮PPW6523から精製した。PPW6523を、0.22μmで濾過し、且つブチルセファロースファストフローカラムにロードし、1.8M 酢酸NH4で洗浄し、且つMilliQ H2Oで溶出した。精製FoL:2003−04317−01でのデータシート。ゲル等電点電気泳動IEFpH3〜10(Novexプレキャスト)20070628において、サンプルは単一バンドを呈した。当該バンドのN−末端配列は、1つの配列、期待されるFoL N−末端のみを示し、C−末端ペプチドが結合していないことを示す。
これらの実験で使用される基質は、Sigma Aldrich製のブチル酸パラ−ニトロフェニル(p−NP)であった。基質ストック溶液を、18μLのブチル酸p−NPを、1mlの2−プロパノールに添加して調製し、100mMのストック溶液を提供する。ワーキング溶液を、10μLのストック溶液を、最終容量1mlの50mM Tris pH7バッファで希釈することにより調製した。50mM TrisバッファpH7中の45μLのFoL 1mg/mLを、2つの濃度のペプチドで予備インキュベートし、コントロールは同じバッファを用いてペプチドの不存在下で行われた。室温で5分の予備インキュベーション後、酵素溶液を、50mM Tris pH7バッファで希釈し、100μLの希釈酵素溶液を、100μLの基質溶液と混合し、そしてその後、室温で一定に振とうしながら、マイクロタイタープレート分光光度計において反応を行った。以下の表6は、2つの異なる濃度でペプチドと共に予備インキュベートされた酵素、及びペプチド不存在下、正確に同じ方法で処理されたコントロールにより遊離された、ブチル酸p−NPの分解産物の1つであるp−ニトロフェノールを、A405で観察した経時での(10分間で30秒毎)色発現を示す。
実施例4で調製したサンプルを、NowexゲルIEF3−10にロードした。レーン1:マーカー、レーン2:サンプル1(10μl)、レーン3:サンプル1(20μl)、レーン4:サンプル2(10μl)、レーン5:サンプル2(20μl)、レーン6:サンプル3(10μl)、レーン7:サンプル3(20μl)。ゲルの写真を図6に示す。当該ゲルから、ペプチドの添加により、pIに変化が引き起こされることが、ペプチド存在下のサンプル(レーン2〜5)より低いpIを有するバンド(レーン6及び7)により明らかになった。これは、酵素へのペプチドの結合の明確な指標である。
Triton−X100不存在のレシチンプレートを、原料と方法に記載した通りに調製した。精製TLL及びFoLのOD280に基づき同じ量を、2つの頂部の穴にTLLを、2つの底部の穴にFoLを;左の穴(低濃度、OD280が0.2に等しい);右の穴(高濃度、OD280が0.5に等しい)として添加した。20時間インキュベーション後、FoLは、低/高濃度で、7/10mmクリーニングゾーンを呈した。TLLは、クリーニングゾーンを示さなかった。
最近解析された、フサリウム・グラミネアリウム、別名ジベレラ・ゼアエの構造は、酵素の成熟のために通常切断されるC末端ペプチドが、当該構造に存在することを示している。当該ペプチドは、アルファヘリックス構造を採用し、且つホスホリパーゼの触媒ドメインに対して密集する。当該ペプチドは、小エステル対するホスホリパーゼ活性を阻害することが示されている。
酵素アッセイ:これらの実験で使用される基質は、ブチル酸パラ−ニトロフェニル(p−NP)(N9876 Sigma Aldrich)であった。基質ストック溶液を、18μLのブチル酸p−NPを、1mlの2−プロパノールに添加して調製し、100mMのストック溶液を提供する。ワーキング溶液を、500μLのストック溶液を、最終容量50mlの500mM リン酸 pH7.0、0.4%triton X−100で希釈することにより調製した。500mM リン酸 pH7.0、0.4%triton X−100中の40μLの酵素 38ng/mLを、2から12ステップの因子で増加する、ペプチド/リパーゼ比率が0.5〜1000となる様々な濃度を有する20μLのペプチドと予備インキュベートした。酵素基質ブランク含有の60μlをインキュベートした。最低でも15分間予備加熱後、100μLの基質を添加し、室温で初期振とう(5秒)後、マイクロタイタープレート分光光度計(Molecular Devices製のSPECTRAmax PLUS 3)で反応を続けた。加水分解により遊離したブチル酸p−NPの分解産物の1つであるp−ニトロフェノールを測定し、A405で経時での色発現を観察した(30分間で10秒毎)。
酵素アッセイ:上記のとおり、ペプチドP11及びP13を、2から10ステップの因子で増加する、ペプチド/リパーゼ比率が5〜5000となる濃度で試験した。ペプチドP12を、2から10ステップの因子で増加する、ペプチド/リパーゼ比率が6〜6000となる濃度で試験した。
配列番号2:フサリウム・グラミネアリウム(graminearium)
配列番号3:ネクトリアリパーゼ1
配列番号4:ネクトリアリパーゼ2
配列番号5:フサリウム・ヘテロスポラム
配列番号6:フサリウム・セミテクタム(semitectum)
配列番号7:フサリウム・ソラニ LipC
配列番号8:フサリウム・ソラニ LipD
配列番号9:サーモマイセス・ラヌギノーサス,TLL
配列番号10:フサリウム・ベネナタム(venenatum)PLA2、FVPLA2
配列番号11:プレクタシン
配列番号12:モネリン
配列番号13:プロテグリン
配列番号14:バルナーゼ
配列番号15:シスタチン
配列番号16:アポリポタンパク質E
Claims (29)
- a)配列番号1の残基289〜310又は配列番号10の残基154〜175と、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含んでなる、単離ペプチド;
b)配列番号1のペプチドコード配列、又は当該配列番号1のペプチドコード配列の相補鎖と、中ストリンジェンシー条件又は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、単離ペプチド;
c)配列番号1の残基289〜310と、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は100%同一であるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドによりコードされる単離ペプチド;又は
d)以下のアミノ酸配列:
M1T2D3X4X5L6E7X8K9L10N11X12Y13V14X15X16D17X18E19Y20X21K22
(式中、X4,、X5、X8、X12、X15、X16、X18,、及びX21は、独立に任意のアミノ酸であってよい)を有するモチーフを含んでなる単離ペプチド、
から選択され、サイズが60アミノ酸(aa)未満である、ホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド。 - 長さが、55アミノ酸未満、50アミノ酸未満、45アミノ酸未満、40アミノ酸未満、35アミノ酸未満、又は30アミノ酸未満である、請求項1に記載のペプチド。
- 長さが、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、又は少なくとも25アミノ酸である、請求項1又は2に記載のペプチド。
- アルファヘリックスの二次構造を有する、請求項1に記載のペプチド。
- 前記モチーフ中に存在する、位置X4,、X5、X8、X12、X15、X16、X18,、及びX21の各々のアミノ酸が、X4がA又はE、X5がE又はQ、X8がK又はA、X12がS又はN、X15がE、Q又はA、X16がL又はM、X18がK又はQ、及びX21がI又はV、から独立に選択される、請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号1と比較して、FoL残基D291、L294、E295、K297、L298、N299、Y301、D305、K306、Y308、又はV309に対応する位置で少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項1〜4のいずれか1項に記載のペプチド。
- 配列番号1と比較して、FoL残基D291E;L294A;E295T,S;K297R;L298A;N299D,E;Y301W;D305A;K306R;Y308E,D;又はV309I,N,Qに対応する少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでなる、請求項5に記載のペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド。
- 発現宿主においてペプチドの産生を方向付ける少なくとも1つの制御配列に作動的に結合する請求項8に記載のポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物。
- 請求項9に記載の核酸構築物を含んでなる、組換え発現ベクター。
- 請求項9に記載の核酸構築物又は請求項10に記載の組換え発現ベクターを含んでなる組換え宿主細胞。
- a)前記ペプチドの産生を行うための条件下、前記ペプチドの少なくとも1つの複製物をコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物を含んでなる、宿主細胞を培養するステップ、及び
b)前記ペプチドを回収するステップ、
を含んでなる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の単離ペプチドの調製方法。 - リパーゼに前記ペプチドが結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドの使用。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチド及びリパーゼを含んでなり、前記リパーゼが、50PHLU/mg未満、4/mg未満、40PHLU/mg未満、35PHLU/mg未満、30PHLU/mg未満、25PHLU/mg未満、20PHLU/mg未満、15PHLU/mg未満、10PHLU/mg未満、5PHLU/mg未満、又は1PHLU/mg未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び/又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない、ポリペプチド。
- サーモマイセス・ラヌギノーサス(Thermomyces lanuginosus)(配列番号9)と、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は100%同一であるリパーゼを含んでなる、請求項14に記載のポリペプチド。
- 前記リパーゼが、独立に、挿入、欠失、又は置換である少なくとも1つの変更を含んでなる、請求項14又は15に記載のポリペプチド。
- 前記リパーゼの少なくとも1つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス(配列番号9)の残基E87R、I90L、G91T、I202P、R209L、E210I、又はT244Lに対応する1又は複数のアミノ酸置換を含んでなる、請求項16に記載のポリペプチド。
- 前記リパーゼが、サーモマイセス・ラヌギノーサス(配列番号9)の248〜255に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム(Fusarium oxysporum)(配列番号1)の残基246〜254での置換か、又はサーモマイセス・ラヌギノーサス(配列番号9)の248〜253に対応する残基の、フザリウム・オキシスポラム(配列番号1)の残基247〜252での置換を含んでなる、請求項15に記載のポリペプチド。
- タンパク質の表面に局在するアルファヘリックスの少なくとも3つの溶媒接近可能な残基を有するタンパク質が、請求項1に記載のモチーフの位置D3、L6、L10、Y13、V14、D17、及びX21に対応する溶媒近接可能な残基、及び/又は位置E7、K9、N11、X18、及びY20に対応する末端残基の少なくとも1つで、アルファヘリックスにおいて修正されている、ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチド。
- 前記親タンパク質が、プレタシン(Plectasin)(配列番号11);モネリン(Monellin)(配列番号12);プロテグリン(Protegrin)(配列番号13);バルナーゼ(Barnase)(配列番号14);シトスタチン(Cytostatins)(配列番号15);又はアポリポタンパク質E(配列番号16)と、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有する、請求項19に記載のポリペプチド。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドがリパーゼに付加するステップを含んでなり、前記リパーゼが、50PHLU/mg未満、45PHLU/mg未満、40PHLU/mg未満、35PHLU/mg未満、30PHLU/mg未満、25PHLU/mg未満、20PHLU/mg未満、15PHLU/mg未満、10PHLU/mg未満、5PHLU/mg未満、又は1PHLU/mg未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び/又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さない、請求項14〜18のいずれか1項に記載のポリペプチドの調製方法。
- a)タンパク質の表面に局在化するアルファヘリックスを有するタンパク質を選択するステップであって、前記アルファヘリックスの少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、又は少なくとも6つの残基は、溶媒接近可能である;
b)請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドを、前記タンパク質のアルファヘリックスと整列させるステップ;
c)請求項1に記載のモチーフの位置D3、L6、L10、Y13、V14、D17、及びX21に対応する溶媒接近可能であるタンパク質のアルファヘリックスにおける残基を同定するステップ;
d)ステップ(c)において同定されたタンパク質における、少なくとも1つ、少なくとも2つ、少なくとも3つ、少なくとも4つ、少なくとも5つ、少なくとも6つ、又は少なくとも7つのアミノ酸を変更するステップ;
e)前記ポリペプチドを、ホスホリパーゼ阻害活性について試験するステップ;
f)ホスホリパーゼ阻害活性を有するポリペプチドを選択するステップ;及び
g)(f)において選択されたポリペプチドを作製するステップ、
を含んでなるポリペプチドの調製方法。 - ステップ(c)において、請求項1に記載のモチーフの位置E7、K9、N11、X18、及びY20に対応する潜在的に溶媒接近可能なタンパク質のアルファヘリックスにおける残基をさらに同定する、請求項22に記載の方法。
- 前記タンパク質における1又は複数の位置で、少なくとも1つの変更がなされるステップをさらに含んでなる、請求項23に記載の方法。
- 前記ポリペプチドに含まれるペプチドがリパーゼへ結合する際に、リパーゼの酵素活性を阻害するための、請求項14〜20のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
- 請求項1〜7のいずれか1項に記載のペプチドにより阻害され得る、50PHLU/mg未満、45PHLU/mg未満、40PHLU/mg未満、35PHLU/mg未満、30PHLU/mg未満、25PHLU/mg未満、20PHLU/mg未満、15PHLU/mg未満、10PHLU/mg未満、5PHLU/mg未満、又は1PHLU/mg未満のホスホリパーゼ活性を有する、及び/又はプレートアッセイにおいてホスホリパーゼ活性を示さないリパーゼであって、ここで前記リパーゼは、独立に挿入、欠失、又は置換である、少なくとも1つの変更を含んでなり、それにより、(a)請求項1〜8のいずれか1項に記載のホスホリパーゼ阻害活性を有する単離ペプチド;又は(b)請求項15〜21のいずれか1項に記載のポリペプチドに含まれるホスホリパーゼ阻害活性を有するペプチド、の少なくとも1つが結合する際に、前記リパーゼの活性が阻害される、リパーゼ。
- サーモマイセス・ラヌギノーサス(配列番号9)と、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は100%同一である、請求項26に記載のリパーゼ。
- 前記少なくとも1つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサス(配列番号9)の残基L92;R96;L203;I207;R211;L243;L250;又はL252に対応する置換である、請求項27に記載のリパーゼ。
- 前記少なくとも1つの変更が、サーモマイセス・ラヌギノーサ(配列番号9)の残基L92D,E,W;R96E,D,A;L203W,K,M;I207D,E;R211H;L243W,K;L250D,E,R;及びL252S,Tに対応する置換である、請求項28に記載のリパーゼ。
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