CN105073991B - 改变型羰基还原酶及其基因 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于，提供一种改变型羰基还原酶和/或生产该酶的转化体，所述改变型羰基还原酶改变在有机溶剂存在下反应性降低的野生型酶，与野生型酶相比，有机溶剂存在下的反应性提高。本发明人等从在野生型酶基因上随机地导入变异而制作的变异型酶库中发现与野生型酶相比存在有机溶剂下的反应性提高的改变型羰基还原酶，直至完成本发明。

Description

改变型羰基还原酶及其基因
技术领域
本发明涉及一种改变型羰基还原酶、其基因、含有该基因的载体、及利用该载体转化的转化体。
背景技术
作为医药品或农药的合成原料及中间体有用的光学活性醇的制造方法之一，已知有将羰基化合物的羰基利用微生物或酶进行不对称还原的方法。将羰基化合物还原的手性酶(以下，羰基还原酶)在各种光学活性醇的制造中是有用的。
在使用了羰基还原酶的不对称还原反应中，根据基质或生成物、pH调整时所使用的酸或碱、为了改善反应液性而添加的表面活性剂或有机溶剂等，有时酶会失活或酶反应受到抑制。因此，能够避免有机溶剂等导致的酶的失活或反应抑制的羰基还原酶有利于缩短反应时间、提高反应收率，在以工业规模生产光学活性醇方面更为有用。
例如，尝试了利用随机变异导入的有机溶剂耐性的获得，报导了对于2-丙醇或二甲基亚砜具有耐性的还原酶(专利文献1、非专利文献1)。
另一方面，现状为：对工业使用性高的有机溶剂二甲基甲酰胺具有耐性的酶少，尚无获得对二甲基甲酰胺具有实用水平耐性的还原酶的报道。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本2009-225773号公报
非专利文献
非专利文献1:ChemSusChem，1,431-436(2008)
发明内容
发明所要解决的课题
例如ezetimibe或Montelukast等许多医药品中间体与2-丙醇或二甲基亚 砜相比，对二甲基甲酰胺的溶解度高。如果可以在这种化合物的生产中使用二甲基甲酰胺耐性酶，则可以改善反应液性，可以期待获得比使用其它有机溶剂时高的生产率。
因此，本发明的课题在于，提供一种改变型羰基还原酶和/或生产该酶的转化体，所述改变型羰基还原酶改变了在二甲基甲酰胺存在下反应性低的野生型酶，使其在存在有机溶剂下的反应性高于野生型酶。
用于解决课题的技术方案
本发明人等从在野生型酶基因中随机地导入变异而制作的变异型酶库中发现了在存在有机溶剂下的反应性较野生型酶提高了的改变型羰基还原酶，直至完成本发明。
即，本发明涉及一种多肽，其显示以下(a)～(c)的性质：
(a)与序列表的序列号1中记载的氨基酸序列具有78％以上的序列同一性；
(b)还原2-戊酮而生成2-戊醇；且
(c)与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的羰基还原酶相比，在存在有机溶剂下对羰基化合物的反应性高、和/或热稳定性高。
优选所述有机溶剂为二甲基甲酰胺。
在序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中，优选选自下组中的1个以上氨基酸导入了氨基酸取代，
第2号、第22号、第25号、第39号、第42号、第45号、第51号、第56号、第71号、第87号、第90号、第102号、第109号、第124号、第135号、第138号、第155号、第159号、第175号、第177号、第183号、第190号、第195号、第212号、第220号、第226号、第228号、第236号、第238号、第250号、第254号、第257号、第259号、第265号、第267号、第270号、第279号、第298号、第300号、第301号、及第331号。
优选氨基酸取代为序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中发生选自下组的氨基酸取代中的1个以上氨基酸取代，
第2号被取代为异亮氨酸、第22号被取代为精氨酸、第25号被取代为苯基丙氨酸、第39号被取代为精氨酸、第42号被取代为精氨酸、第45号被取代为天冬氨酸、第51号被取代为丙氨酸、第56号被取代为赖氨酸、第71 号被取代为天冬酰胺或精氨酸、第87号被取代为异亮氨酸、第90号被取代为甘氨酸、第102号被取代为异亮氨酸、第109号被取代为甘氨酸、第124号被取代为亮氨酸、第135号被取代为丙氨酸、第138号被取代为天冬酰胺、第155号被取代为亮氨酸或精氨酸、第159号被取代为苯基丙氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第177号被取代为苯基丙氨酸、第183号被取代为苏氨酸、第190号被取代为丝氨酸、第195号被取代为亮氨酸、第212号被取代为苯基丙氨酸、苏氨酸或酪氨酸、第220号被取代为缬氨酸、第226号被取代为甘氨酸、第228号被取代为缬氨酸、第236号被取代为天冬酰胺、第238号被取代为异亮氨酸、第250号被取代为脯氨酸、第254号被取代为天冬酰胺、第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第265号被取代为赖氨酸、第267号被取代为脯氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第279号被取代为精氨酸、第298号被取代为脯氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、第301号被取代为半胱氨酸、及第331号被取代为苯基丙氨酸。
优选氨基酸取代为序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中发生选自下组的氨基酸取代中的1个以上氨基酸取代，
第2号被取代为异亮氨酸、第45号被取代为天冬氨酸、第71号被取代为天冬酰胺或精氨酸、第102号被取代为异亮氨酸、第124号被取代为亮氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第177号被取代为苯基丙氨酸、第183号被取代为苏氨酸、第195号被取代为亮氨酸、第220号被取代为缬氨酸、第226号被取代为甘氨酸、第236号被取代为天冬酰胺、第238号被取代为异亮氨酸、第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第265号被取代为赖氨酸、第267号被取代为脯氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、及第301号被取代为半胱氨酸，
与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的羰基还原酶相比，优选其对有机溶剂的稳定性提高。
优选氨基酸取代为序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中导入有选自下述(1)～(35)的氨基酸取代中的氨基酸取代，
(1)第71号被取代为天冬酰胺、第195号被取代为亮氨酸、
(2)第71号被取代为精氨酸、第259号被取代为谷氨酸、
(3)第71号被取代为精氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(4)第71号被取代为精氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(5)第102号被取代为异亮氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(6)第177号被取代为苯基丙氨酸、第220号被取代为缬氨酸、
(7)第226号被取代为甘氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(8)第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、
(9)第257号被取代为丝氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(10)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(11)第259号被取代为谷氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(12)第267号被取代为脯氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(13)第270号被取代为蛋氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(14)第2号被取代为异亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(15)第45号被取代为天冬氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第183号被取代为苏氨酸、
(16)第102号被取代为异亮氨酸、第226号被取代为甘氨酸、第267号被取代为脯氨酸、
(17)第124号被取代为亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(18)第177号被取代为苯基丙氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(19)第220号被取代为缬氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(20)第236号被取代为天冬酰胺、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(21)第238号被取代为异亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(22)第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(23)第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(24)第259号被取代为谷氨酸、第265号被取代为赖氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(25)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(26)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第301号被取代为半胱氨酸、
(27)第2号被取代为异亮氨酸、第238号被取代为异亮氨酸、
(28)第71号被取代为天冬酰胺、第195号被取代为亮氨酸、
(29)第109号被取代为甘氨酸、第331号被取代为苯基丙氨酸、
(30)第124号被取代为亮氨酸、第236号被取代为天冬酰胺、
(31)第159号被取代为苯基丙氨酸、第259号被取代为谷氨酸、
(32)第42号被取代为精氨酸、第155号被取代为精氨酸、第279号被取代为精氨酸、
(33)第45号被取代为天冬氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第183号被取代为苏氨酸、
(34)第155号被取代为亮氨酸、第250号被取代为脯氨酸、第298号被取代为脯氨酸、及
(35)第56号被取代为赖氨酸、第138号被取代为天冬酰胺、第190号被取代为丝氨酸、第254号被取代为天冬酰胺。
优选氨基酸取代为选自下组的氨基酸取代中的1个以上氨基酸取代，
第22号被取代为精氨酸、第39号被取代为精氨酸、第51号被取代为丙氨酸、第87号被取代为异亮氨酸、第90号被取代为甘氨酸、第259号被取代为谷氨酸、及第270号被取代为蛋氨酸，
与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的羰基还原酶相比，优选其对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高。
优选氨基酸取代为序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中发生选自下述(1)～(7)的氨基酸取代中的1个以上的氨基酸取代，
(1)第22号被取代为精氨酸、
(2)第22号被取代为精氨酸、第87号被取代为异亮氨酸、
(3)第39号被取代为精氨酸、
(4)第39号被取代为精氨酸、第51号被取代为丙氨酸、
(5)第51号被取代为丙氨酸、
(6)第87号被取代为异亮氨酸、及
(7)第90号被取代为甘氨酸。
另外，本发明涉及一种编码所述多肽的多核苷酸。
另外，本发明涉及一种含有所述多核苷酸的载体。
优选还含有编码具有还原型辅酶再生能力的多肽的多核苷酸。
优选具有还原型辅酶再生能力的多肽为葡萄糖脱氢酶。
另外，本发明涉及一种利用所述载体对宿主细胞进行转化而得到的转化体。
优选所述宿主细胞为大肠杆菌。
另外，本发明涉及一种醇化合物的制造方法，其特征在于，使所述多肽、或所述转化体和/或其处理物与羰基化合物作用。
优选所述羰基化合物为非对称酮，所述醇化合物为光学活性醇。
优选所述羰基化合物为下述式(1)表示的非对称酮，
(式中，R1及R2为氢原子、卤原子、任选被取代的烷基、任选被取代的芳烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的烷氧基、氨基或硝基，或R1和R2可以相互键合而成环。其中，R1和R2的结构不同)，
所述醇化合物为下述式(2)表示的光学活性醇，
(式中，R1、R2与上述相同，＊表示手性碳)。
发明的效果
根据本发明，可以提供一种存在有机溶剂下的反应性比野生型高的改变型羰基还原酶及其基因、含有该基因的载体、利用该载体转化的转化体、该转化体的处理物的制造方法。
具体实施方式
本发明的多肽的特征在于，显示以下(a)～(c)的性质：
(a)与序列表的序列号1中记载的氨基酸序列具有78％以上的序列同一性、(b)还原2-戊酮而生成2-戊醇、且(c)与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的羰基还原酶相比，在存在有机溶剂下对羰基化合物的反应性高、和/或热稳定性高。
[变异的记载方法]
需要说明的是，在本说明书中，氨基酸、肽、蛋白质使用下述所示的IUPAC-IUB生物化学命名委员会(CBN)所采用的简写符号表示。另外，只要没有特别明示，肽及蛋白质的氨基酸残基的序列以从左端到右端从N末端至C末端的方式表示。另外，为了易于参照，适用一般所使用的下述命名法。1个是记述为“原来的氨基酸；位置；取代的氨基酸”的方法，例如，位置64上的酪氨酸被天冬氨酸取代表示为“Y64D”。关于多重变异，通过利用连字符记号“－”分开而记载。例如，“S41A-Y64D”表示将位置41的丝氨酸取代为丙氨酸、且将位置64的酪氨酸取代为天冬氨酸。
[氨基酸的简写符号]
A＝Ala＝丙氨酸、C＝Cys＝半胱氨酸、
D＝Asp＝天冬氨酸、E＝Glu＝谷氨酸、
F＝Phe＝苯基丙氨酸、G＝Gly＝甘氨酸、
H＝His＝组氨酸、I＝Ile＝异亮氨酸、
K＝Lys＝赖氨酸、L＝Leu＝亮氨酸、
M＝Met＝蛋氨酸、N＝Asn＝天冬酰胺、
P＝Pro＝脯氨酸、Q＝Gln＝谷氨酰胺、
R＝Arg＝精氨酸、S＝Ser＝丝氨酸、
T＝Thr＝苏氨酸、V＝Val＝缬氨酸、
W＝Trp＝色氨酸、Y＝Tyr＝酪氨酸
[序列同一性]
多肽或多核苷酸的“序列同一性”用下述所得的数值表示：使要对比的2个多肽或多核苷酸适当排列，用两者序列中氨基酸或核酸碱基(例如A、T、C、G、U、或I)一致的位置个数除以比较碱基总数，并将该结果乘以100所得的数值。
序列同一性例如可以使用以下的序列分析用工具算出：GCG Wisconsin Package(Wisconsin大学)、the ExPASy World Wide Web分子生物学用服务器(瑞士生物信息学研究所)、BLAST(美国生物工程信息中心)、GENETYX(GENETYX公司)。
在本发明中，导入变异之前的野生型酶由序列表的序列号1表示的335个氨基酸残基构成，为具有将2-戊酮还原而成2-戊醇的能力的多肽。
多肽的起源没有限定，优选为属于酵母菌科(Saccharomycetaceae)、更优选Vanderwaltozyma属的微生物，进一步优选为属于Vanderwaltozyma polyspora种的微生物，特别优选为Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996株来源的羰基还原酶。该微生物可以由独立行政法人制品评价技术基础机构生物技术本部生物遗传资源部门(NBRC：〒292-0818千叶县木更津市上总镰足2-5-8)获得。
本发明的野生型酶利用序列表的序列号2所示的多核苷酸进行编码。例如，可以按照Molecular Cloning 2nd Edition(Joseph Sambrook，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))等中所记载的通常的基因工程方法从属于酵母科、优选Vanderwaltozyma属、更优选Vanderwaltozyma polyspora种的微生物、进一步优选Vanderwaltozyma polysporaNBRC0996株中取得。
即，通过从Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996株的基因组DNA中用[参考例1]中记载的方法进行PCR，可以扩增编码序列号1表示的氨基酸序列的多核苷酸、或序列号2表示的多核苷酸而制备野生型酶基因。
本发明的多肽可以为在序列号1所示的氨基酸序列中加以改变而得到的多肽。
作为加入序列号1所示的氨基酸序列中的改变，可列举取代、添加、插入或缺失，既可以包含仅1种改变(例如取代)，也可以含有2种以上的改变(例如取代和插入)。上述“多个氨基酸”是指例如40个、优选20个、更优选10个、进一步优选8个、5个、4个、3个、或2个氨基酸。
另外，加入了改变之后的氨基酸序列与序列号1所示的氨基酸序列的序列同一性为85％以上、优选90％以上、更优选92％以上、进一步优选95％以上、97％以上、98％以上、98.5％以上、99％以上。
在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中，氨基酸发生了取代、插入、缺失、添加的位置没有特别限制，优选为导入了下述氨基酸取代的多肽：序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自2、22、25、39、42、45、51、56、71、87、90、102、109、124、135、138、155、159、175、177、183、190、 195、212、220、226、228、236、238、250、254、257、259、265、267、270、279、298、300、301、及第331号中的1个或多个氨基酸发生取代。
进一步优选在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中选自下组中的1个以上的氨基酸导入了氨基酸取代的多肽：第2号被取代为异亮氨酸、第22号被取代为精氨酸、第25号被取代为苯基丙氨酸、第39号被取代为精氨酸、第42号被取代为精氨酸、第45号被取代为天冬氨酸、第51号被取代为丙氨酸、第56号被取代为赖氨酸、第71号被取代为天冬酰胺或精氨酸、第87号被取代为异亮氨酸、第90号被取代为甘氨酸、第102号被取代为异亮氨酸、第109号被取代为甘氨酸、第124号被取代为亮氨酸、第135号被取代为丙氨酸、第138号被取代为天冬酰胺、第155号被取代为亮氨酸或精氨酸、第159号被取代为苯基丙氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第177号被取代为苯基丙氨酸、第183号被取代为苏氨酸、第190号被取代为丝氨酸、第195号被取代为亮氨酸、第212号被取代为苯基丙氨酸、苏氨酸或酪氨酸、第220号被取代为缬氨酸、第226号被取代为甘氨酸、第228号被取代为缬氨酸、第236号被取代为天冬酰胺、第238号被取代为异亮氨酸、第250号被取代为脯氨酸、第254号被取代为天冬酰胺、第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第265号被取代为赖氨酸、第267号被取代为脯氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第279号被取代为精氨酸、第298号被取代为脯氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、第301号被取代为半胱氨酸、及第331号被取代为苯基丙氨酸。
另外，从对有机溶剂的稳定性提高的观点出发，本发明的多肽优选在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中导入了选自下组中的1个以上氨基酸取代：第2号被取代为异亮氨酸、第45号被取代为天冬氨酸、第71号被取代为天冬酰胺或精氨酸、第102号被取代为异亮氨酸、第124号被取代为亮氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第177号被取代为苯基丙氨酸、第183号被取代为苏氨酸、第195号被取代为亮氨酸、第220号被取代为缬氨酸、第226号被取代为甘氨酸、第236号被取代为天冬酰胺、第238号被取代为异亮氨酸、第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第265号被取代为赖氨酸、第267号被取代为脯氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、及第301号被取代为半胱氨酸。
进而，更优选为在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中导入了选自下 述(1)～(35)的氨基酸取代中的氨基酸取代的多肽：
(1)第71号被取代为天冬酰胺、第195号被取代为亮氨酸、
(2)第71号被取代为精氨酸、第259号被取代为谷氨酸、
(3)第71号被取代为精氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(4)第71号被取代为精氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(5)第102号被取代为异亮氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(6)第177号被取代为苯基丙氨酸、第220号被取代为缬氨酸、
(7)第226号被取代为甘氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(8)第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、
(9)第257号被取代为丝氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(10)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(11)第259号被取代为谷氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(12)第267号被取代为脯氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(13)第270号被取代为蛋氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(14)第2号被取代为异亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(15)第45号被取代为天冬氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第183号被取代为苏氨酸、
(16)第102号被取代为异亮氨酸、第226号被取代为甘氨酸、第267号被取代为脯氨酸、
(17)第124号被取代为亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(18)第177号被取代为苯基丙氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(19)第220号被取代为缬氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(20)第236号被取代为天冬酰胺、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(21)第238号被取代为异亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(22)第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取 代为蛋氨酸、
(23)第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(24)第259号被取代为谷氨酸、第265号被取代为赖氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、
(25)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第300号被取代为天冬氨酸、
(26)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第301号被取代为半胱氨酸、
(27)第2号被取代为异亮氨酸、第238号被取代为异亮氨酸、
(28)第71号被取代为天冬酰胺、第195号被取代为亮氨酸、
(29)第109号被取代为甘氨酸、第331号被取代为苯基丙氨酸、
(30)第124号被取代为亮氨酸、第236号被取代为天冬酰胺、
(31)第159号被取代为苯基丙氨酸、第259号被取代为谷氨酸、
(32)第42号被取代为精氨酸、第155号被取代为精氨酸、第279号被取代为精氨酸、
(33)第45号被取代为天冬氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第183号被取代为苏氨酸、
(34)第155号被取代为亮氨酸、第250号被取代为脯氨酸、第298号被取代为脯氨酸、及
(35)第56号被取代为赖氨酸、第138号被取代为天冬酰胺、第190号被取代为丝氨酸、第254号被取代为天冬酰胺。
另外，从提高对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性的观点出发，本发明的多肽优选在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中导入选自下组的氨基酸取代中的1个以上的氨基酸取代：第22号被取代为精氨酸、第39号被取代为精氨酸、第51号被取代为丙氨酸、第87号被取代为异亮氨酸、第90号被取代为甘氨酸、第259号被取代为谷氨酸、及第270号被取代为蛋氨酸。
进而，更优选在序列表的序列号1所示的氨基酸序列中导入下述(1)～(7)中任一项所示的氨基酸取代：
(1)第22号被取代为精氨酸、
(2)第22号被取代为精氨酸、第87号被取代为异亮氨酸、
(3)第39号被取代为精氨酸、
(4)第39号被取代为精氨酸、第51号被取代为丙氨酸、
(5)第51号被取代为丙氨酸、
(6)第87号被取代为异亮氨酸、及
(7)第90号被取代为甘氨酸。
作为有机溶剂，优选为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、2-丙醇、醋酸乙酯、甲苯、甲醇、乙醇、正丁醇、己烷、乙腈、醋酸丙酯、醋酸丁酯、丙酮、二甲氧基丙烷、甲基叔丁基醚、二乙基醚、二异丙基醚、二烷、四氢呋喃、二甲基乙酰胺、二甘醇二甲醚、乙二醇、二甲氧基乙烷、四氯化碳、二氯甲烷、乙基溶纤剂、醋酸溶纤剂、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮、或、六甲基磷酸三酰胺等，更优选为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、2-丙醇、醋酸乙酯、甲苯、醋酸丁酯、或1,3-二甲基-2-咪唑烷酮，进一步优选为二甲基甲酰胺、二甲基亚砜或2-丙醇。
本发明的酶在存在有机溶剂下对羰基化合物的反应性高。存在有机溶剂下可以为含有酶的液体和有机溶剂混合的状态，也可以为含有酶的液体和有机溶剂为不均匀的状态，还可以为将其进行物理性搅拌并混合的状态。
“在存在有机溶剂下反应性高的酶”与序列表的序列号1中记载的野生型酶相比，在所述存在有机溶剂下处理一定时间之后，或在所述存在有机溶剂下对2-戊酮显示酶的还原活性高。优选为对有机溶剂的酶的稳定性高，或对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性高的酶。
“对有机溶剂的稳定性提高”具体是指：在将酶与有机溶剂培养之后，在用后述实施例4或5中记载的方法测定对2-戊酮或2-己酮的残存活性时，与野生型酶相比，残存活性高1％以上，优选高5％以上，进一步优选高10％以上，最优选高20％以上。
另外，“对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高”具体是指：在用后述实施例31中记载的方法测定对有机溶剂存在条件下的2-己酮的相对活性时，与野生型酶相比，相对活性高1％以上，优选高5％以上，更优选高7％以上，进一步优选高10％以上，最优选高20％以上。
对有机溶剂的酶的稳定性例如可以用以下的方法进行评价。
[对有机溶剂的酶的稳定性的评价方法]
在含有酶的无细胞提取液中加入含有任意浓度(例如0.5％～50％)的有机溶 剂的缓冲液(优选pH5～8的0.01～1M磷酸缓冲液)，在任意温度(例如4～40℃)下进行培养。有机溶剂和缓冲液为不均匀的情况下，一边进行振荡或搅拌，一边培养。在0.1～48小时后取样未添加有机溶剂的样品和添加了有机溶剂的处理液，将其用0.1M的磷酸钾水溶液(pH7.0)稀释，使用其稀释液，用下述[对羰基化合物的还原能力的评价方法]测定酶的活性。相对活性可以用下述式算出。
相对活性(％)＝[添加溶剂条件下的酶活性]÷[未添加溶剂条件下的酶活性]×100
与序列表的序列号1中记载的羰基还原酶相比，对有机溶剂的稳定性提高的改变型羰基还原酶为进行了上述评价时的残存活性与野生型相比高1％以上的酶，优选高5％以上、进一步优选高10％以上、最优选高20％以上的酶。
[对羰基化合物的还原能力的评价方法]
使在100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中含有NADPH或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，NADH)0.25mM、想要评价还原活性的羰基化合物(例如2-戊酮、2-己酮、2,3-丁二酮)1～50mM及本发明的多肽的反应液在30℃下反应，测定伴随NADPH或NADH量的减少在波长340nm的吸光度的减少，由此可以容易地评价还原反应的进行。吸光度减少的情况下，可以判断为本发明的肽具有还原评价对象的羰基化合物的能力。需要说明的是，可以说，吸光度的减少速度越快，对评价对象羰基化合物的还原能力越高。另外，也可以将多肽的还原能力数值化，还原活性1U设为在1分钟内催化1μmol的NADPH的消耗的酶量。
另外，对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性可以例如按照以下的方法那样确定。
[对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性的评价方法1]
使在100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中含有NADPH或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(以下，NADH)3mM、想要评价还原活性的羰基化合物(例如2-戊酮、2-己酮、2,3-丁二酮)1％、有机溶剂0.01～60％(v/v)或未添加有机溶剂、及本发明的多肽的反应液在30℃下反应0.01～5小时，利用气相色谱法等进行分析，求出从羰基化合物向醇的变换率。
相对活性可以用下述式算出。
相对活性(％)＝[存在有机溶剂下的变换率]÷[不存在有机溶剂下的变换 率]×100
本说明书中，与序列表的序列号1中记载的羰基还原酶相比，对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高的改变型羰基还原酶，在进行了上述的评价时的残存活性与野生型相比高1％以上，优选5％以上、更优选高7％以上，进一步优选高10％以上，最优选高20％以上。另外，本发明的酶与序列表的序列号1中记载的羰基还原酶相比，热稳定性高。
本发明的改变型羰基还原酶可以通过下述的方法进行探索。
使用错配PCR法(Leung et al.，Technique 1,11-15(1989))、或基于同样的原理的试剂盒，可以得到在序列表的序列号2所示的碱基序列(野生型酶基因)中导入了1个以上的碱基序列的取代、插入、缺失、添加的DNA片段。例如，以野生型酶基因为模板，利用常规方法将第240号的T取代为C，可以不改变野生型酶的氨基酸序列而破坏Ndel识别位点(序列表的序列号3)。将其在模板上使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、及引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTG AACCTTCA-3’(序列表的序列号5)和随机突变PCR试剂盒(Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech公司制)，可以得到在编码野生型酶的基因的全长中随机地导入了变异、且在启始密码子上附加了Ndel识别位点、在终止密码子之后直接附加有Sall识别位点的多种双链DNA(变异型酶基因)。将该扩增片段用Ndel及Sall消化，插入在质粒pUCN18(通过PCR法将pUC18(takara-bio公司制)的第185号的T改变为A而破坏Ndel位点、进一步将第471-472号的GC改变为TG而重新导入了Ndel位点的质粒)的lac启动子的下游的Ndel识别位点和Sall识别位点之间，使用该质粒转化埃希氏菌(Escherichia coli)HB101株(以下，E.coli HB101)。将转化的大肠杆菌涂布在含有100μg/mL的氨苄西林的LB板培养基上，得到单菌落的大肠杆菌。另外，也可以使用通过所述方法得到的变异型酶基因代替野生型基因，以同样的操作进一步制作导入有变异的变异酶库。
可以从上述库中选拔本发明的改变型羰基还原酶。作为选拔方法，没有特别限定，优选为下述方法。
[对有机溶剂的稳定性提高了的酶的利用板评价的选拔法1]
将生产变异酶库的各重组菌及野生型酶的重组菌(例如参考例3所示的 E.coliHB101(pNKP))接种在适当的培养基(例如含有200μg/ml的氨苄西林的 2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0))上，在37℃下振荡培养24小时。将得到的各培养液进行菌体破碎处理，离心分离后，除去沉淀，得到无细胞提取液。在含有各酶的无细胞提取液中加入含有适当浓度的有机溶剂(优选终浓度10～30％的二甲基甲酰胺)的缓冲液(优选pH5～8的0.01～1M磷酸缓冲液)，在适当的温度(例如4～40℃)下进行培养。培养0.1～48小时左右之后，将进行了处理的各无细胞提取液分注于96孔板(AGCTECHNOGLASS公司制)，加入含有NADPH(优选1.5mM)和羰基化合物(优选10mM的2,3-丁二酮)的磷酸缓冲液(pH5～7)，在10～40℃下进行反应。经时地用UV样品摄影装置FAS-III(东洋纺织社制)观察NADPH的荧光。此时，未进行反应的酶液残存有NADPH的荧光，但进行了反应的无细胞提取液伴随NADPH的减少，荧光消失。选拔与作为对照的野生型酶相比，在短时间内使荧光消失的酶作为对氯化物的稳定性提高了的酶。从选拔的酶的培养液中提取质粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(应用生物系统日本社制)及应用生物系统3130×l基因分析仪(应用生物系统日本社制)确定改变型羰基还原酶基因的碱基序列，可以确定变异位点。
[对有机溶剂的稳定性提高了的酶的利用板评价的选拔法2]
将生产变异酶库的各重组菌及野生型酶的菌(例如，参考例3所示的E.coli HB101(pNKP))为适当的培养基)植菌于适当的琼脂培养基(例如含有100μg/mL的氨苄西林的LB板培养基)上，在30℃下培养24小时。将得到的菌落转移于尼龙膜(BiodyneA、0.45μm)之后，将该尼龙膜在含有有机溶剂(优选40％的二甲基甲酰胺)的缓冲液(优选50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液中浸渍0.1分钟～24小时。该缓冲液优选加热至40～80℃。其后，将该尼龙膜在含有NADP+(优选1mM)、硝基四氮唑蓝(优选200μM)、1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(优选10μM)、2-丙醇(例如0.1～50％)的缓冲液(优选50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液)中在适当温度(例如4～40℃)下浸渍0.1分钟～24小时。其后，将尼龙膜用蒸馏水清洗，可以选拔进行了4染色的菌落作为对有机溶剂的稳定性提高了的改变型羰基还原酶的重组菌。
将这些重组菌接种于适当的液体培养基(例如含有200μg/ml的氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0)上，在37℃下振荡培养20小时。对得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，悬浮于缓冲液(优选50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液)。将其使用 UH-50型超声波均质机(SMT公司制)破碎之后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞提取液。
将缓冲液(优选50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液)和二甲基甲酰胺的混合液以二甲基甲酰胺的终浓度为优选0.1～60％的方式加入各无细胞提取液中，进行加热(优选在40～80℃下0.1分钟～24小时)之后，进行冰冷。将其与含有NADP+(优选1mM)、硝基四氮唑蓝(优选200μM)、1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(优选10μM)、2-丙醇(例如0.1～50％)的缓冲液(优选50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液)进行混合，移至96孔板(AGCTECHNOGLASS公司制)进行观察。可以选拔被染色的物质作为对有机溶剂的稳定性进一步提高了的改变型羰基还原酶。
从选拔的重组菌的培养液中提取质粒，使用BigDye Terminator CycleSequencing Kit(应用生物系统日本社制)及应用生物系统3130×l基因分析仪(应用生物系统日本社制)确定变异型RKP基因的碱基序列，可以确定变异位点。
[对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高了的酶的利用板评价的选拔法]
将生产变异酶库的各重组菌及野生型酶的菌(例如参考例3所示的E.coli HB101(pNKP))植菌于适当的琼脂培养基(例如含有100μg/mL的氨苄西林的LB板培养基)，在30℃下培养24小时。将得到的菌落转移于尼龙膜(BiodyneA、0.45μm)之后，在含有NADP+(优选1mM)、硝基四氮唑蓝(优选200μM)、1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯(优选10μM)、2-丙醇(例如0.1～50％)和有机溶剂(优选0.1～80％的二甲基甲酰胺)的缓冲液(优选50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液)中在适当的温度(例如4～40℃)下浸渍0.1分钟～10小时。其后，将尼龙膜用蒸馏水清洗，可以选拔被染色的菌落作为对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高了的改变型羰基还原酶的重组菌的候补。
将这些重组菌接种于适当的液体培养基(例如含有200μg/ml的氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0))，在37℃下振荡培养20小时。将得到的各培养液进行菌体破碎处理，离心分离后，除去沉淀，得到无细胞提取液。将在无细胞提取液中溶解有NADPH(优选0.625M)、羰基化合物(优选10mM的2,3-丁二酮)、有机溶剂(优选0.1～80％的二甲基甲酰胺)的缓冲液(优选0.1M的磷酸缓冲液(pH6.5))进行混合。将其分 注于96孔板(旭日TECHNO GLASS公司制)，经时地用Benchmark Plus微孔板分光光度计(BIO-RAD公司制)观察NADPH的荧光。未进行反应的酶液残存NADPH的荧光，但进行了反应的无细胞提取液伴随NADPH的减少，荧光消失。通过羰基化合物的还原消耗NADPH，选拔在短时间内荧光消失的菌作为对有机溶剂的反应抑制的抵抗性进一步提高了的改变型羰基还原酶的重组菌。
从选拔的重组菌的培养液中提取质粒，使用BigDye Terminator CycleSequencing Kit(应用生物系统日本社制)及应用生物系统3130×l基因分析仪(应用生物系统日本社制)确定变异型RKP基因的碱基序列，可以确定变异位点。
通过将能够提高存在有机溶剂下对羰基化合物的反应性和/或能够提高热稳定性的多个变异利用位点特异的变异导入而组合，由此可以制作同时具有多个变异的性质的改变型羰基还原酶。
本发明的多核苷酸只要是编码本发明的多肽的多核苷酸即可，没有特别限定，可列举例如：由编码序列表的序列号2所示的野生型酶的碱基序列构成的多核苷酸、或其中加入改变而得到的多肽。
作为野生型酶基因的改变方法，可以使用Current Protocols in MolecularBiology(Frederick M.Ausubel，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989))等中记载的公知的方法。即，通过将野生型酶基因的1个或多个(例如40个、优选20个、更优选10个、进一步优选5个、4个、3个或2个碱基)碱基进行取代、添加、插入或缺失，可以制作改变了野生型酶的氨基酸序列的多核苷酸。可列举例如采用了错配PCR法(Leung et al.，Technique 1,11-15(1989))等PCR的变异导入法、或利用市售的试剂盒Diversify PCR Random Mutagenesis Kit(Clontech公司制)、Transformer MutagenesisKit(Clontech公司制)、EXOIII/Mung Bean Deletion Kit(Stratagene公司制)、QuickChange Site Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制)等。
利用位点特异的变异导入法制作多核苷酸时，作为位点特异的变异导入法，可列举例如Olfert Landt等(Gene，96，125-128(1990))、Smith等(Genetic Engineering，3,1,Setlow，J.Plenum Press)、Vlasuk等(Experimental Manipulation of Gene Expression，Inouye，M.Academic Press)、Hos.N.Hunt等(Gene，77，51(1989))的方法或利用QuikChange II Kit(Stratagene公司制) 的市售试剂盒等。需要说明的是，在2处导入变异的情况下，通过重复2次按照上述方法的方法，可以得到作为目的的本发明的多核苷酸。另外，多个其它位置用其它氨基酸取代的情况下，也可以利用该方法得到作为目的的本发明的多核苷酸。
作为编码本发明的多肽的多核苷酸，优选编码例如具有将2-戊酮还原而成2-戊醇的活性，与由序列表的序列号1所示的氨基酸序列构成的羰基还原酶相比在存在有机溶剂下对羰基化合物的反应性高的多肽，且和含有与由序列表的序列号2所示的碱基序列构成的多核苷酸互补的碱基序列的多核苷酸在严格的条件下进行杂交的多核苷酸。
在此，“和由与序列表的序列号2所示的多核苷酸互补的碱基序列构成的多核苷酸在严格的条件下杂交的多核苷酸”是指：通过将由与序列表的序列号2所示的碱基序列互补的碱基序列构成的多核苷酸作为探针、在严格的条件下使用菌落杂交法、嗜菌斑杂交法或Southern杂交法等而得到的多核苷酸。
可以按照Molecular Cloning 2nd Edition(Joseph Sambrook，Cold SpringHarbor Laboratory Press(1989))等中所记载的方法而进行杂交。在此，“在严格的条件下杂交的多核苷酸”可以列举例如能够通过如下方法而取得的DNA，即，使用固定化有菌落或者噬菌斑来源的多核苷酸的过滤器，在0.7～1.0M的氯化钠存在下、在65℃下进行杂交之后，使用3倍浓度的SSC溶液(1倍浓度的SSC溶液的组成由150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠组成)，在65℃的条件下清洗过滤器。更优选为可以通过在65℃下用1倍浓度的SSC溶液清洗、进一步优选在65℃下用0.7倍浓度的SSC溶液清洗、进一步优选在65℃下用0.5倍、0.45倍、0.25倍、0.2倍、0.15倍浓度的SSC溶液清洗而得到的多核苷酸。
如上所述记载了杂交条件，但对这些条件没有特别限制。作为影响到杂交的严格性的要素，认为是温度或盐浓度等多个要素，只要是本领域技术人员，就可以通过适当选择这些要素来实现最适的严格性。
作为可在上述条件下杂交的多核苷酸，可以列举与序列号2所示的多核苷酸的序列同一性为优选78％以上、更优选84％以上、进一步优选87％以上、进一步优选89％、90％、94％、95％、97％以上的多核苷酸，所编码的多肽只要具有本发明的多肽的性质，就包含在上述多核苷酸中。
通过将编码本发明的多肽的多核苷酸插入于表达载体，可以制作多肽表达载体。
作为上述中使用的表达载体，只要可以在适当的宿主生物内表达该多核苷酸编码的多肽即可，没有特别限定。作为这种载体，可列举例如质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体等，另外，也可以使用可与其它宿主株之间进行基因交换的穿梭载体。
关于这种载体，例如为大肠杆菌的情况下，通常可以优选用作含有lacUV5启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、pL启动子等控制因子，且含有与本发明的DNA可操作地连结的表达单元的表达载体。可列举例如pUCN18(参照参考例2)、pSTV28(takara-bio公司制)、pUCNT(国际公开第94/03613号)等。
本说明书中使用的用语“控制因子”是指具有功能性启动子及任意的关联转录要素(例如增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI位点等)的碱基序列。
本说明书中使用的用语“可操作地连结”是指：调节基因表达的启动子、增强子等各种调节元素和基因以在宿主细胞中可操作的状态被连结。控制因子的类型及种类可以根据宿主而变化，这是本领域技术人员众所周知的事项。
关于可以在各种生物中利用的载体、启动子等，详细地记述于微生物学基础讲座(8、安藤忠彦、共立出版、(1987))等。
载体可以还含有编码具有还原型辅酶再生能力的多肽的多核苷酸。作为具有还原型辅酶再生能力的多肽，可列举例如葡萄糖脱氢酶。
通过利用载体转化宿主细胞，可以得到转化体。或者，作为转化体，也可列举在染色体中导入编码本发明的多肽的多核苷酸而得到的转化体。
作为用于利用载体转化的宿主细胞，只要是能够利用含有编码各多肽的多核苷酸的多肽表达载体进行转化，且能够表达导入的多核苷酸编码的多肽的细胞即可，没有特别限制。作为可作为宿主细胞利用的微生物，可列举例如：埃希杆菌(Escherichia)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、假单胞菌(Pseudomonas)属、沙雷菌(Serratia)属、短杆菌(Brevibacterium)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、链球菌(Streptococcus)属及乳酸杆菌(Lactobacillus)属等开发了宿主载体系的细菌；红球菌(Rhodococcus)属及链霉菌(Streptomyces)属等开发了宿主载体系的放线菌；酵母菌(Saccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、接合酵母(Zygosaccharomyces)属、子囊菌酵母(Yarrowia)属、毛孢子菌(Trichosporon)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、毕赤酵母(Pichia)属及念珠菌(Candida)属等开发了宿主载体系的酵母；链孢霉 菌(Neurospora)属、曲霉菌(Aspergillus)属、头孢霉(Cephalosporium)属、及木霉(Trichoderma)属等开发了宿主载体系的霉菌等。另外，除微生物以外，在植物、动物中开发了各种各样的宿主载体系，特别开发了在使用有蚕的昆虫(Nature，315，592-594(1985))或菜籽、玉米、马铃薯等植物中使异种蛋白质大量地表达的体系，可以优选利用。其中，从导入及表达效率方面考虑，优选细菌，特别优选大肠杆菌。
本发明的载体可以利用公知的方法导入于宿主微生物。例如，使用大肠杆菌作为宿主微生物的情况下，将在作为多肽表达载体的所述表达载体pUCN18中导入了编码改变型羰基还原酶的多核苷酸的本发明的质粒(实施例2～3、6～15、17～27、30所示的pNKPm01～53)使用市售的E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)等按照其流程进行操作，由此可得到在宿主细胞中导入有该载体的转化体(例如实施例27所示的E.coli HB101(pNKPm50))。
另外，也可以育种使本发明的多肽及后述的具有还原型辅酶再生能力的多肽的两种多肽在同一菌体内表达的转化体。即，除通过将编码本发明的多肽的多核苷酸及编码具有还原型辅酶再生能力的多肽的多核苷酸插入于相同的载体，并将其导入于宿主细胞而得到之外，也可以通过将这2种DNA分别插入于不亲和性组的不同2种载体，并将它们导入于相同的宿主细胞而得到。
作为这样得到的转化体，可列举例如将编码改变型羰基还原酶的核苷酸导入于所述表达载体pUCN18而成的重组载体(例如实施例2所示的pNKPm01)和含有编码作为具有还原型辅酶再生能力的多肽的葡萄糖脱氢酶的多核苷酸的载体、导入于E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)的转化体等。
通过使本发明的多肽或转化体和/或其处理物与羰基化合物作用，可以制造醇化合物。
成为基质的羰基化合物没有特别限制。在羰基化合物中，由于非对称酮的还原产物为有用的光学活性醇，因此优选。
作为所述具有羰基的化合物，可列举例如下述式(1)：
(式中，R1及R2为氢原子、卤原子、任选被取代的烷基、任选被取代的 芳烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的烷氧基、氨基、或硝基，或R1和R2可以相互键合而成环。其中，R1和R2的结构不同)表示的非对称酮，作为其生成物，可列举例如下述式(2)：
(式中，R1、R2与上述相同，＊表示手性碳)表示的光学活性醇。
所述R1、R2，优选碳原子数1～14的烷基、碳原子数6～14的芳基、碳原子数4～14的杂芳基、碳原子数1～5的烷氧基、碳原子数2～5的烷氧基羧基、碳原子数1～5的直链或支链烷基、碳原子数2～5的链烯基、碳原子数5～10的环烷基、碳原子数4～9的杂环烷基、羧基、氢原子、卤原子、羟基、氨基、或硝基。
需要说明的是，上述中所说的任选被取代是任选具有取代基的意思，作为取代基，可列举：卤原子、羟基、羧基、氨基、氰基、硝基、烷基、芳基、芳烷基、或烷氧基等。另外，作为卤原子，可列举：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。
作为具体的羰基化合物，可列举：2-戊酮、2-己酮、2,3-丁二酮、苯乙酮、(S)-1-(4-氟苯基)-5-(2-氧代-4-苯基-唑烷-3-基)-戊烷-1,5-二酮、苯丙酮、正苯丁酮、苯戊酮、苯己酮、1-苯基-2-丁酮、苄基丙酮、2,5-己二酮、2,3-己二酮、3,4-己二酮、苯氧基-2-丙酮。
作为使用本发明的多肽而生产的醇化合物，可列举：2-戊醇、2-己醇、2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、1-苯基乙醇、[3-[(5R)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4S)-苯基-1,3-唑烷-2-酮、1-苯基-1-丙醇、1-苯基-1-丁醇、1-苯基-1-戊醇、1-苯基-1-己醇、1-苯基-2-丁醇、4-苯基-2-丁醇、2,5-己二醇、5-羟基-2-己酮、2,3-己二醇、2-羟基己烷-3-酮、3-羟基-2-己酮、3,4-己二醇、4-羟基-3-己酮、1-苯氧基-2-丙醇。
使用本发明的多肽或使本发明的多肽表达的转化体和/或其处理物将所述具有羰基的化合物还原而制造醇的情况下，可如下地实施。但并不限定于以下的方法。
加入适当的溶剂(例如100mM磷酸缓冲液(pH6.5)等)、作为羰基化合物的基质(例如2-戊酮或苯乙酮)，添加NADPH或氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷 酸(以下，NADP+)等辅酶、及该转化体的培养物和/或其处理物等，在pH调整下进行搅拌并使其反应。
在此，处理物是指例如在粗提取液、培养菌体、冷冻干燥生物体、丙酮干燥生物体、菌体破碎物或这些固定化物等中残存该多肽的酶催化剂活性的物质。
反应温度优选为5～80℃，更优选为10～60℃，进一步优选为20～40℃。反应液的pH优选为3～10，更优选为pH4～9，进一步优选为pH5～8。可以以间歇式或连续方式进行反应。间歇方式的情况下，反应基质可以以0.01～100％(w/v)、优选0.1～70％(w/v)、更优选0.5～50％(w/v)的进料浓度被添加。另外，也可以在反应的中途另外追加添加基质。
另外，在反应中，既可以使用水系溶剂，也可以将水系溶剂和有机系溶剂混合而使用。作为有机系溶剂，可列举例如：二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、2-丙醇、醋酸乙酯、甲苯、甲醇、乙醇、正丁醇、己烷、乙腈、醋酸丙酯、醋酸丁酯、丙酮、二甲氧基丙烷、甲基叔丁基醚、二乙基醚、二异丙基醚、二烷、四氢呋喃、二甲基乙酰胺、二甘醇二甲醚、乙二醇、二甲氧基乙烷、四氯化碳、二氯甲烷、乙基溶纤剂、醋酸溶纤剂、1,3-二甲基-2-咪唑烷酮、六甲基磷酸三酰胺等。反应体系中所含的有机系溶剂的浓度没有特别限定，优选为1～95％，更优选为5～90％，进一步优选为10～80％。
在此，转化体的处理物等是指例如无细胞提取液、培养菌体、冷冻干燥菌体、丙酮干燥菌体、或它们的磨碎物、它们的混合物等。进而，这些物质可以以多肽自身或直接以菌体的形态通过公知的方法固定化而使用。
另外，在进行反应时，如果使用生产本发明的多肽及具有还原型辅酶再生能力的多肽这两者的转化体，则可以大幅度地减少辅酶的使用量。关于具有还原型辅酶再生能力的多肽，下面进行详述。
使用具有本发明的多肽的生产能力的转化体将羰基化合物还原而合成醇化合物时，作为辅酶，需要NADPH或NADH。如上所述，即使在反应体系中仅添加需要量的NADPH或NADH，也可以实施还原反应。但是，通过将辅酶再生系统与本发明的多肽组合而进行反应，可以大幅度地削减高价的辅酶的使用量，所述辅酶再生系统由具有将被氧化的该辅酶(NADP+或NAD+)变换为还原型NADPH或NADH的能力(以后称为还原型辅酶再生能力)的酶和其基质构成。作为具有还原型辅酶再生能力的酶，可以使用氢化酶、甲酸 脱氢酶、羰基还原酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶及葡萄糖脱氢酶等。优选使用葡萄糖脱氢酶。
这种反应也可以通过在不对称还原反应体系内添加辅酶再生系统而进行，但将由编码本发明的酶的多核苷酸及编码具有还原型辅酶再生能力的多肽的多核苷酸这两者转化成的转化体作为催化剂时，即使另外制备具有还原型辅酶再生能力的酶而未添加于反应体系内，也可以有效地进行反应。这种转化体通过上述转化体的制作方法来得到。
来自反应后的反应液的醇的回收方法没有特别限定，可以从反应液中直接或根据需要分离菌体等之后，用醋酸乙酯、甲苯、叔丁基甲基醚、己烷、二氯甲烷等溶剂萃取，脱水后，通过蒸馏、再结晶或硅胶柱色谱法等来纯化。可以利用该方法容易地得到高纯度的醇化合物。
实施例
以下，通过实施例详细地说明本发明，但本发明并不受这些实施例限定。需要说明的是，与以下的实施例中使用的重组DNA技术有关的详细操作方法等记载于以下的出版的书中：
Molecular Cloning 2nd Edition(Joseph Sambrook，Cold Spring HarborLaboratory Press(1989))、Current Protocols in Molecular Biology(FrederickM.Ausubel，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience(1989))。
(参考例1)编码具有源自Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996株羰基化合物还原活性的多肽(野生型酶)的DNA的取得
由Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996株通过PCR取得编码对羰基化合物具有还原活性的多肽(以下，将本多肽称为RKP)的DNA。
[Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996株的染色体DNA的制备]
在容积500ml的坂口烧瓶中制备由胰化蛋白胨16g、酵母提取物10g、氯化钠5g、ADEKANOL LG-109(日油社制)0.1g(均为每1L)的组成构成的液体培养基(pH7)50ml，在120℃下进行20分钟蒸气灭菌。在该培养基上接种预先在相同培养基上进行了前培养的Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996株的培养液5ml，一边在30℃下振荡18小时，一边进行培养。从该培养液中按照Murray等方法(Nucl.Acids Res.8，4321(1980))中记载的方法提取染色体DNA。
[PCR反应]
引物1：使用5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列 表的序列号4)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTG AACCTTCA-3’(序列表的序列号5)，以Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996株的染色体DNA为模板进行PCR。
其结果，可得到在由序列表的序列号2所示的碱基序列构成的基因的启始密码子部分附加Ndel识别位点、且在终止密码子后直接附加Sall识别位点的双链DNA(RKP基因)。将其为模板进一步进行PCR反应，利用常规方法将第240号的T改变为C。由此，该基因编码的RKP酶的氨基酸序列不变化，可得到由基因中的Ndel识别位点被破坏的序列表的序列号3所示的碱基序列构成的双链DNA(破坏了Ndel位点的RKP基因)。使用Prime STAR HS DNA聚合酶(takara-bio公司制)作为DNA聚合酶而进行PCR，反应条件按照其使用说明书进行设定。
(参考例2)重组载体pNKP的构建
将破坏了参考例1中得到的Ndel位点的RKP基因用Ndel及Sall消化，插入于质粒pUCN18(通过利用PCR法将pUC18(takara-bio公司制)的第185号的T改变为A而破坏Ndel位点、进一步将第471-472号的GC改变为TG而重新导入有Ndel位点的质粒)的lac启动子下游的Ndel识别位点和Sall识别位点之间，构建重组载体pNKP。
(参考例3)表达多肽的重组生物的制作
使用参考例2中构建的重组载体pNKP将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到重组生物E.coli HB101(pNKP)。另外，使用pUCN18将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到重组生物E.coli HB101(pUCN18)。
(参考例4)重组生物中的DNA的表达
将参考例3中得到的2种重组生物(E.coli HB101(pUCN18)、E.coli HB101(pNKP))接种于含有200μg/ml的氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0)5ml上，在37℃下振荡培养24小时。对上述培养中得到的各自培养液，通过离心分离收集菌体，悬浮于5ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)。将其使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制)破碎之后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞提取液。测定这些无细胞提取液的苯乙酮还原活性。就对苯乙酮的还原活性而言，在100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中添加苯乙酮10mM、辅酶NADPH 0.25mM及无细胞提取液， 在30℃下进行1分钟反应，由波长340nm时的吸光度的减少速度算出。在该反应条件中，将在1分钟内将1μmol的NADPH氧化为NADP的酶活性定义为1U。将各自的重组生物的苯乙酮还原活性示于以下。关于E.coliHB101(pUCN18)，苯乙酮还原活性为0.1U/mg以下。另一方面，使RKP表达的E.coli HB101(pNKP)的苯乙酮还原活性为5U/mg。如上所述，参考例3中得到的重组生物具有相对于苯乙酮的还原活性，确认到RKP的表达。
(参考例5)野生型酶RKP对有机溶剂的稳定性
用与参考例4同样的方法得到野生型酶的无细胞提取液。在该无细胞提取液中添加终浓度30、40、50％的二甲基甲酰胺，用硫酸或氢氧化钠调整为pH6.5之后，在30℃下培养3小时。另外，作为对照什么也没有添加的无细胞提取液也同样地进行培养。3小时后，将各无细胞提取液稀释。用与参考例4同样的方法测定这些无细胞提取液的2-戊酮还原活性。由下述式算出溶剂添加时的相对活性，将该值作为对各种化合物的稳定性的指标。将结果示于表1。
相对活性(％)＝[第3小时的酶活性(添加溶剂)]÷[第3小时的酶活性(未添加溶剂)]×100
[表1]
添加溶剂 浓度 相对活性(％)
未添加 100
二甲基甲酰胺 30％ 64
40％ 9
50％ 0
二甲基亚砜 40％ 91
50％ 58
与二甲基亚砜相比，野生型酶对二甲基甲酰胺的稳定性低。
(参考例6)野生型酶RKP对有机溶剂的稳定性
用与参考例4同样的方法得到野生型酶的无细胞提取液。在该无细胞提取液中添加终浓度30％的二甲基甲酰胺，用硫酸或氢氧化钠调整为pH6.5之后，在30℃下培养2小时。另外，作为对照对什么也没有添加的无细胞提取液也同样地进行培养。2小时后，将各无细胞提取液稀释。测定这些无细胞提 取液的2-己酮还原活性。在100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中添加2-己酮10mM、辅酶NADPH 0.25mM及无细胞提取液，在30℃下进行1分钟反应，测定波长340nm时的吸光度的减少速度。由该减少速度算出2-己酮还原活性。由下述式算出溶剂添加时的相对活性，将该值设为对各种化合物的稳定性的指标。添加溶剂条件下的野生型酶的活性(相对活性)为未添加溶剂条件下的8％。
相对活性(％)＝[第2小时的酶活性(添加溶剂)]÷[第2小时的酶活性(未添加溶剂)]×100
(参考例7)野生型酶RKP的有机溶剂导致的反应抑制
用与参考例4同样的方法得到野生型酶的无细胞提取液。在该无细胞提取液中添加终浓度30％的二甲基甲酰胺，用硫酸或氢氧化钠调整为pH6.5之后，在30℃下培养2小时。另外，作为对照对什么也没有添加的无细胞提取液也同样地进行培养。2小时后，将各无细胞提取液稀释。测定这些无细胞提取液的2-己酮还原活性。在100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中添加30％二甲基甲酰胺、2-己酮10mM、辅酶NADPH 0.25mM及无细胞提取液而进行反应。由NADPH的荧光的减少速度求出NADPH的消耗速度，算出2-己酮还原活性。由下述式算出溶剂添加时的相对活性，将该值设为对各种化合物的稳定性的指标。添加溶剂条件下的野生型酶的活性(相对活性)为未添加溶剂条件下的24％。
相对活性(％)＝[酶活性(添加溶剂)]÷[酶活性(未添加溶剂)]×100
(实施例1)变异酶库的制作1
使含有参考例2中制作的RKP基因的质粒pNKP为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)及引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)，使用错配PCR法(Leung et al.Technique1,11-15(1989))得到在RKP基因全长上导入有随机变异的DNA扩增片段。将该扩增片段用限制酶Ndel及 Sall消化之后，插入于用相同的酶进行了处理的高表达载体pUCN18，制作多个变异酶表达质粒。使用该质粒将E.coli HB101进行转化，涂布在含有100μg/mL的氨苄西林的LB板培养基上。成长的菌落为具有进行了变异导入的RKP基因的重组大肠杆菌，将该重组菌群设为变异酶库1。
(实施例2)改变型羰基还原酶的选拔1
由变异酶库1选拔对有机溶剂的稳定性提高了的改变型羰基还原酶。将 实施例1中制作的变异酶库1的各重组菌及参考例3中制作的E.coli HB101(pNKP)(对照)分别用与参考例4同样的方法进行培养。在得到的各培养液60μl中加入含有10mM EDTA·2Na及1％Triton X-100的磷酸缓冲液(pH7.0)240μl，在37℃下培养1小时。将各处理液进行离心，将上清液设为无细胞提取液。在各无细胞提取液200μl中加入含有终浓度10～30％的二甲基甲酰胺的磷酸缓冲液(pH6.5)，在30℃下培养2小时(二甲基甲酰胺处理)。将进行了二甲基甲酰胺处理的各无细胞提取液50μl分注于96孔板(AGCTECHNO GLASS公司制)上，加入含有6mM的NADPH的磷酸缓冲液(pH6.5)50μl和含有133mM 2，3-丁二酮的磷酸缓冲液(pH6.5)100μl，在30℃下进行反应。经时地用UV样品摄影装置FAS-III(东洋纺织社制)观察NADPH的荧光。未进行反应的酶液残存NADPH的荧光，但进行了反应的无细胞提取液伴随NADPH的减少，荧光消失。与作为对照的E.coli HB101(pNKP)的无细胞提取液(野生型酶)相比，选拔使荧光较快消失的酶作为在二甲基甲酰胺存在下反应性高的酶、即对有机溶剂的稳定性提高了的改变型羰基还原酶。从选拔的酶的培养液中提取质粒，使用BigDye Terminator CycleSequencing Kit(应用生物系统日本社制)及应用生物系统3130×l基因分析仪(应用生物系统日本社制)确定变异型RKP基因的碱基序列，特定变异位点。将得到的对有机溶剂的稳定性提高了的改变型羰基还原酶示于表2。
[表2]
质粒名称 变异位点
pNKPm01 T257S
pNKPm02 K259E
pNKPm03 S267P
pNKPm04 K270M
pNKPm05 N1021-E226G-S267P
pNKPm06 H71R-G300D
取得了表2所示的6种对有机溶剂的稳定性提高了的酶。
(实施例3)改变型羰基还原酶的选拔2
由变异酶库1选拔对有机溶剂的稳定性提高了的改变型羰基还原酶。将实施例1中制作的变异酶库1的各重组菌及参考例3中制作的E.coli HB101(pNKP)(对照)植菌于含有100μg/mL的氨苄西林的LB板培养基上。将 得到的菌落转移于在40℃下进行了加热的尼龙膜(BiodyneA、0.45μm)之后，将该尼龙膜在含有30％的二甲基甲酰胺的50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液中于40℃下浸渍30分钟。其后，将该尼龙膜在含有1mM的NADP+、200μM的硝基四氮唑蓝、10μM的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯及10％(v/v)的2-丙醇的50mM的MOPS缓冲液中于室温下浸渍30分钟。其后，用蒸馏水清洗尼龙膜，选拔被染色的菌落作为对二甲基甲酰胺的稳定性提高了的改变型羰基还原酶的重组菌候补。将候补株接种于含有200μg/ml的氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0)5ml上，培养20小时。对得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，悬浮于培养液的1/6量的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。将其使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制)破碎之后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞提取液。在该无细胞提取液20μl中以总液量成为40μl的方式添加终浓度20、23、26、30％的二甲基甲酰胺和50mM MOPS缓冲液(pH7.0)，在40℃下加热30分钟。在冰上冷却1分钟之后，加入含有1mM的NADP+、200μM的硝基四氮唑蓝、10μM的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯及10％(v/v)的2-丙醇的50mM的MOPS缓冲液200μl。将反应液移至96孔板(AGCTECHNO GLASS公司制)，观察1小时。选拔被染色的物质作为对二甲基甲酰胺的稳定性进一步提高了的改变型羰基还原酶的重组菌。从选拔的重组菌的培养液中提取质粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(应用生物系统日本社制)及应用生物系统3130×l基因分析仪(应用生物系统日本社制)确定变异型RKP基因的碱基序列，特定变异位点。将得到的对有机溶剂的稳定性提高了的改变型羰基还原酶示于表3。
[表3]
质粒名称 变异位点
pNKPm01 T257S
pNKPm02 K259E
pNKPm03 S267P
pNKPm04 K270M
pNKPm05 N102I-E226G-S267P
pNKPm06 H71R-G300D
pNKPm07 H71N-F195L
pNKPm08 L177F-A220V
pNKPm09 N45D-N175D-1183T
pNKPm10 K22R
pNKPm11 Y25F
pNKPm12 T135A
pNKPm13 Q155L
pNKPm14 F195L
pNKPm15 S212F
pNKPm16 S212T
pNKPm17 S212Y
pNKPm18 E228V
pNKPm19 N265K
pNKPm20 R301C
pNKPm21 S2I-V238I
pNKPm22 E109G-K331F
pNKPm23 I124L-S236N
pNKPm24 I159F-K259E
pNKPm25 L177F-A220V
pNKPm26 K42R-Q155R-K279R
pNKPm28 Q155L-S250P-Q298P
pNKPm29 E56K-T138N-T190S-D254N
取得了表3所示的29种对有机溶剂的稳定性提高了的酶。其中6种为与实施例2中取得的酶相同的变异酶。
(实施例4)改变型羰基还原酶的评价1
将实施例2中取得的改变型羰基还原酶的各重组菌及参考例3中制作的 E.coliHB101(pNKP)(对照)分别用与参考例4同样的方法进行培养。对得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，悬浮于与培养液等量至1/5量的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。将其使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制)破碎之后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞提取液。在无细胞提取液60μl中加入含有终浓度30、40％或50％的二甲基甲酰胺的磷酸缓冲液(pH7.0)60μl，在30℃下进行培养(二甲基甲酰胺处理)。取样第3小时的二甲基甲酰胺处理液并进行稀释，用参考例4所示的方法测定对2-戊酮的还原活性。由下述式算出残存活性，将该值设为对二甲基甲酰胺的稳定性的指标。
相对活性(％)＝[第3小时的酶活性(添加溶剂)]÷[第3小时的酶活性(未添加溶剂)]×100
将在二甲基甲酰胺40％存在下进行了评价的野生型酶及改变型羰基还原酶的相对活性示于表4。
[表4]
变异位点 残存活性
(％)
野生型酶 7.9
T257S 20.2
K259E 29.4
N102I-E226G-S267P 25.6
K270M 36.2
H71R-G300D 17.8
与野生型酶相比，表4所示的改变型羰基还原酶对有机溶剂的稳定性提高。
(实施例5)改变型羰基还原酶的评价2
将实施例3中取得的改变型羰基还原酶的各重组菌及参考例3中制作的 E.coliHB101(pNKP)(对照)分别用与参考例4同样的方法进行培养。对得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，悬浮于与培养液等量至1/5量的100mM 磷酸缓冲液(pH6.5)中。将其使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制)破碎之后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞提取液。在25μl的无细胞提取液中加入等量的80％二甲基甲酰胺溶液，在30℃下静置30分钟。向其中加入100mM磷酸缓冲液(pH6.5)200μl并进行混合。在该溶液15μl中加入溶解有终浓度0.625mM的NADPH和12.5mM的2,3-丁二酮的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)250μl，并进行混合。振荡5秒，用Benchmark Plus微孔板分光光度计(BIO-RAD公司制)测定15秒NADPH的吸光(340nm)，由其减少速度求出相对于2,3-丁二酮的还原活性。由下述式算出添加二甲基甲酰胺时相对于未添加二甲基甲酰胺时的酶活性，将该值设为对二甲基甲酰胺的稳定性的指标。
相对活性(％)＝[酶活性(添加二甲基甲酰胺)]÷[酶活性(未添加二甲基甲酰胺)]×100
将野生型酶及改变型羰基还原酶的相对活性示于表5。
[表5]
变异位点 残存活性
(％)
野生型酶 8
H71N-F195L 24
L177F-A220V 47
N45D-N175D-I183T 16
N102I-E226G-S267P 26
K22R 13
Y25F 11
T135A 13
Q155L 13
F195L 29
S212F 11
S212T 10
S212Y 12
E228V 28
T257S 20
K259E 29
N265K 28
S267P 38
K270M 38
R301C 41
S2I-V238I 36
H71R-G300D 12
E109G-K331F 9
I124L-S236N 38
I159F-K259E 15
L177F-A220V 47
K42R-Q155R-K279R 14
N45D-N175D-I183T 16
Q155L-S250P-Q298P 23
E56K-T138N-T190S-D254N 14
与野生型酶相比，表5所示的改变型羰基还原酶对有机溶剂的稳定性提高。
(实施例6)多重变异改变型羰基还原酶的制作1
将实施例2中取得的质粒pNKPm02作为模板，使用引物1： 5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物3：5’-GTTAATTTCATTAGCGCGATTTTTAATTACATG-3’(序列表的序列号6)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm02作为模板，使用引物4:5’-CATGTAATTAAAAATCGCGCTAATGAA ATTAAC-3’(序列表的序列号7)、引物2:5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTT CTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有H71R、K259E的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有H71R、K259E的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm30。使用该pNKPm30将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶H71R-K259E的重组生物E.coli HB101(pNKPm30)。
(实施例7)多重变异改变型羰基还原酶的制作2
将实施例2中取得的质粒pNKPm02作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物5：5’-GATCAACCTTTCACCGCTTAACTCATCATTATG-3’(序列表的序列号8)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm02作为模板，使用引物6：5’-CATAATGATGAGTTAAGCGGTGAA AGGTTGATC-3’(序列表的序列号9)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACT ATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S、K259E的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S、K259E的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm31。使用该pNKPm31将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶T257S-K259E的重组生物E.coli HB101(pNKPm31)。
(实施例8)多重变异改变型羰基还原酶的制作3
将实施例2中取得的质粒pNKPm02作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物7：5’-CTCGTTATGGACACGATCTCCTTGAGGTAACTC-3’(序列表的序列号10)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、G300D的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm02作为模板，使用引物8:5’-GAGTTACCTCAAGGAGATCGTGTCC ATAACGAG-3’(序列表的序列号11)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACT ATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有G300D的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、G300D的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm32。使用该pNKPm32，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶K259E-G300D的重组生物E.coli HB101(pNKPm32)。
(实施例9)多重变异改变型羰基还原酶的制作4
将实施例2中取得的质粒pNKPm04作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物9：5’-GTTAATTTCATTAGCGCGATTTTTAATTACATG-3’(序列表的序列号12)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有H71R、K270M的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm02作为模板，使用引物10：5’-CATGTAATTAAAAATCGCG CTAATGAAATTAAC-3’(序列表的序列号13)、引物2：5’-ATACGCGTCGACT TACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有H71R、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有H71R、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm33。使用该pNKPm33，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶H71R-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm33)。
(实施例10)多重变异改变型羰基还原酶的制作5
将实施例2中取得的质粒pNKPm04作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物11：5’-GGATACCTTTAGTACCAATAACAGCTGGGATTAAG-3’(序列表的序列号14)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有N102I的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm04作为模板，使用引物12：5’-CTTAATCCCAGCTGTTATTGG TACTAAAGGTATCC-3’(序列表的序列号15)、引物2：5’-ATACGCGTCGACT TACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有N102I、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有N102I、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm34。使用该pNKPm34，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶N102I-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm34)。
(实施例11)多重变异改变型羰基还原酶的制作6
将实施例2中取得的质粒pNKPm04作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物13：5’-TTTATCAATTTCACTGCCTGTTGGAGCAAACATAGC-3’(序列表的序列号16)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有E226G的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm04作为模板，使用引物14：5’-GCTATGTTTGCTCCAA CAGGCAGTGAAATTGATAAA-3’(序列表的序列号17)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有NE226G的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有E226G、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm35。使用该pNKPm35，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化， 得到生产改变型羰基还原酶E226G-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm35)。
(实施例12)多重变异改变型羰基还原酶的制作7
将实施例2中取得的质粒pNKPm04作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物15：5’-GATCAACCTTTTACCGCTTAACTCATCATTATG-3’(序列表的序列号18)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm04作为模板，使用引物16：5’-CATAATGATGAGTTAAGCGG TAAAAGGTTGATC-3’(序列表的序列号19)、引物2：5’-ATACGCGTCGA CTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm36。使用该pNKPm36，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶T257S-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm36)。
(实施例13)多重变异改变型羰基还原酶的制作8
将实施例2中取得的质粒pNKPm04作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物17：5’-GACAAGATCAACCTTTCACCAGTTAACTCATC-3’(序列表的序列号20)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm04作为模板，使用引物18：5’-GATGAGTTAACTGGTGAAA GGTTGATCTTGTC-3’(序列表的序列号21)、引物2：5’-ATACGCGTCG ACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双 链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm37。使用该pNKPm37，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶K259E-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm37)。
(实施例14)多重变异改变型羰基还原酶的制作9
将实施例2中取得的质粒pNKPm04作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物19:5’-TTTGCATAGTGAACGGAGCATTTGACAAG-3’(序列表的序列号22)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S267P的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm04作为模板，使用引物20:5’-CTTGTCAAATGCTCCGTTCACTATGCAAA-3’(序列表的序列号23)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S267P、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S267P、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm38。使用该pNKPm38，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶S267P-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm38)。
(实施例15)多重变异改变型羰基还原酶的制作10
将实施例2中取得的质粒pNKPm04作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物21：5’-CTCGTTATGGACACGATCTCCTTGAGGTAACTC-3’(序列表的序列号24)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K270M、G300D的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm04作为模板，使用引物22：5’-GAGTTACCTCAAGGAGATCGTGTCCATAACGAG-3’(序列表的序列号25)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有G300D的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧 DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K270M、G300D的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm39。使用该pNKPm39，将E.coliHB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶K270M-G300D的重组生物E.coli HB101(pNKPm39)。
(实施例16)多重变异改变型羰基还原酶的评价1
将实施例6～15中取得的多重变异改变型羰基还原酶的各重组菌及参考例3中制作的E.coli HB101(pNKP)(对照)分别用与参考例4同样的方法进行培养。与实施例4同样地，评价多重变异改变型羰基还原酶对二甲基甲酰胺的稳定性。将在二甲基甲酰胺40％存在下进行了评价的野生型酶及改变型羰基还原酶的相对活性示于表6。
[表6]
变异位点 残存活性
(％)
野生型酶 8
K259E 25
K270M 31
H71R-K259E 30
T257S-K259E 38
K259E-G300D 36
H71R-K270M 29
N102I-K270M 26
E226G-K270M 31
T257S-K270M 44
K259E-K270M 64
S267P-K270M 33
K270M-G300D 44
与野生型酶相比，表6所示的改变型羰基还原酶对有机溶剂的稳定性提高。
(实施例17)多重变异改变型羰基还原酶的制作11
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物23：5’-CCAGTAGCACCTGTAACTAAAACAATCAT-3’(序列表的序列号26)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S2I的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37 作为模板，使用引物24：5’-ATGATTGTTTTAGTTACAGGTGCTACTGG-3’(序列表的序列号27)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTC TTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S2I、K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S2I、K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm40。使用该pNKPm40，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶S2I-K259E-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm40)。
(实施例18)多重变异改变型羰基还原酶的制作12
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物25：5’-GGCAGCAATTGAAGAAGTCAGAACAAATTTCTTCAC-3’(序列表的序列号28)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有I124L的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物26：5’-GTGAAGAAATTTGTTCTG ACTTCTTCAATTGCTGCC-3’(序列表的序列号29)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有I124L、K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有I124L、K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm41。使用该pNKPm41，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶I124L-K259E-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm41)。
(实施例19)多重变异改变型羰基还原酶的制作13
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物27：5’-CCTTTATTCTCTTCAAAGAAGTTCCAAGCAGC-3’(序列表的序列 号30)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有L177F的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物28：5’-GCTGCTTGGAACTTCTTTGAAGAGAATAAAGG-3’(序列表的序列号31)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有L177F、K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有L177F、K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm42。使用该pNKPm42，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶L177F-K259E-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm42)。
(实施例20)多重变异改变型羰基还原酶的制作14
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物29：5’-GGACCAAAGACCAGAACTGGGTTGATCG-3’(序列表的序列号32)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有F195L的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物30：5’-CGATCAACCCAGTTCTGGTCTTTGGTCC-3’(序列表的序列号33)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTC TTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有F195L、K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有F195L、K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm43。使用该pNKPm43，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶F195L-K259E-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm43)。
(实施例21)多重变异改变型羰基还原酶的制作15
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物31：5’-CTGTTGGAGCAAACATCACTTCCTTGATGATTTC-3’(序列表的序列号34)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有A220V的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物32：5’-GAAATCATCAAGGAAG TGATGTTTGCTCCAACAG-3’(序列表的序列号35)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有A220V、K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有A220V、K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm44。使用该pNKPm44，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶A220V-K259E-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm44)。
(实施例22)多重变异改变型羰基还原酶的制作16
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物33：5’-CGTACATCAACATAGTTACCAAAAACAGATTTATC-3’(序列表的序列号36)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S236N的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物34：5’-GATAAATCTGTTTTTG GTAACTATGTTGATGTACG-3’(序列表的序列号37)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S236N、K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有S236N、K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm45。使用该pNKPm45，将E.coli HB101感受态细胞 (takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶S236N-K259E-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm45)。
(实施例23)多重变异改变型羰基还原酶的制作17
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物35：5’-GCTACATCACGTACATCAATATAACTACCAAAAAC-3’(序列表的序列号38)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有V238I的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物36：5’-GTTTTTGGTAGTTATATT GATGTACGTGATGTAGC-3’(序列表的序列号39)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有V238I、K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有V238I、K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm46。使用该pNKPm46，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶V238I-K259E-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm46)。
(实施例24)多重变异改变型羰基还原酶的制作18
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物37：5’-GATCAACCTTTTACCGCTTAACTCATCATTATG-3’(序列表的序列号40)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物38：5’-CATAATGATGAGTTAAGCG GTAAAAGGTTGATC-3’(序列表的序列号41)、引物2：5’-ATACGCG TCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有T257S、K259E、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR， 得到编码具有序列号1所示的氨基酸序列中T257S、K259E、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm47。使用该pNKPm47，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶T257S-K259E-K270M的重组生物 E.coli HB101(pNKPm47)。
(实施例25)多重变异改变型羰基还原酶的制作19
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物39：5’-GCATAGTGAATGAAGCTTTTGACAAGATCAACCTTTCACC-3’(序列表的序列号42)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、N265K的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物40：5’-GGTGAAAGGTTGATCTTGTCAAAAGCTTCATTCACTATGC-3’(序列表的序列号43)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、N265K、K270M的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、N265K、K270M的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm48。使用该pNKPm48，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶K259E-N265K-K270M的重组生物E.coli HB101(pNKPm48)。
(实施例26)多重变异改变型羰基还原酶的制作20
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物41：5’-CTCGTTATGGACACGATCTCCTTGAGGTAACTC-3’(序列表的序列号44)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、K270M、G300D的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物42：5’-GAGTTACCTCAAGGAGATCGTGTCCATAACGAG-3’(序列表的序列号45)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAACCTTCA-3’(序列 表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、K270M、G300D的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、K270M、G300D的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm49。使用该pNKPm49，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶K259E-K270M-G300D的重组生物E.coli HB101(pNKPm49)。
(实施例27)多重变异改变型羰基还原酶的制作21
将实施例7中取得的质粒pNKPm37作为模板，使用引物1：5’-GGGAATTCCATATGAGTGTTTTAGTTACAGG-3’(序列表的序列号4)、引物43：5’-CTTCTCGTTATGGACGCAACCTCCTTGAGGTAACTCG-3’(序列表的序列号46)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、K270M、R301C的氨基酸取代的N末端侧的多肽的双链DNA(N末端侧DNA)。同样地，将质粒pNKPm37作为模板，使用引物44：5’-CGAGTTACCTCAAGGAGGTTGCGTCCATAACGAGAAG-3’(序列表的序列号47)、引物2：5’-ATACGCGTCGACTTACTATTGTTCTTGAAC CTTCA-3’(序列表的序列号5)进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、K270M、R301C的氨基酸取代的C末端侧的多肽的双链DNA(C末端侧DNA)。将N末端侧DNA和C末端侧DNA进行混合，将其作为模板，使用引物1、引物2进行PCR，得到编码在序列号1所示的氨基酸序列中具有K259E、K270M、R301C的氨基酸取代的多肽的双链DNA。用与参考例2同样的方法导入于pUCN18，制作pNKPm50。使用该pNKPm50，将E.coli HB101感受态细胞(takara-bio公司制)进行转化，得到生产改变型羰基还原酶K259E-K270M-R301C的重组生物E.coliHB101(pNKPm50)。
(实施例28)多重变异改变型羰基还原酶的评价2
将实施例17～27中取得的多重变异改变型羰基还原酶的各重组菌及参考例3中制作的E.coli HB101(pNKP)(对照)分别用与参考例4同样的方法进行培养。与实施例4同样地，评价多重变异改变型羰基还原酶对二甲基甲酰胺的稳定性。将在二甲基甲酰胺50％存在下进行了评价的野生型酶及改变型羰基还原酶的相对活性示于表7。
[表7]
变异位点 残存活性
(％)
野生型酶 0
K270M 1
K259E-K270M 5
S2I-K259E-K270M 2
I124L-K259E-K270M 25
L177F-K259E-K270M 3
F195L-K259E-K270M 21
A220V-K259E-K270M 16
S236N-K259E-K270M 24
V238I-K259E-K270M 15
T257S-K259E-K270M 33
N265K-K259E-K270M 15
G300D-K259E-K270M 20
R301C-K259E-K270M 35
表7所示的改变型羰基还原酶与野生型酶相比，对有机溶剂的稳定性提高。
(实施例29)变异酶库的制作2
使含有实施例15中取得的K259E-K270M变异酶的变异型RKP基因的质粒pNKPm37为模板，用与实施例1同样的方法制作变异酶库，将其设为变异酶库2。
(实施例30)改变型羰基还原酶的选拔3
从变异酶库2中选拔对作为有机溶剂之一的二甲基甲酰胺导致的反应抑制的抵抗性提高了的改变型羰基还原酶。将实施例29中制作的变异酶库2的各重组菌及参考例3中制作的E.coli HB101(pNKP)(对照)植菌于含有100μg/mL的氨苄西林的LB板培养基上。
将得到的菌落转移于尼龙膜(BiodyneA、0.45μm)之后，将该尼龙膜在含有40％的二甲基甲酰胺的50mM的3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)缓冲液中浸渍30～60分钟。其后，将该尼龙膜在含有1mM的NADP+、200μM的硝基四氮唑蓝、10μM的1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸甲酯及5％(v/v)的2-丙醇的50mM的MOPS缓冲液中于室温下浸渍30分钟。其后，用蒸馏水清洗尼龙膜，选拔被染色的菌落作为对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高了的改变型羰基还原酶的重组菌的候补。将这些候补株接种于含有200μg/ml的氨苄西林的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、氯化钠0.5％、pH7.0)5ml上，培养20小时。将得到的培养液进行菌体破碎处理，离心分离后，除去沉淀，得到无细胞提取液。将无细胞提取液200μl分注于96孔板(AGCTECHNO GLASS公司制)上，加入含有NADPH0.625mM和10mM的2，3-丁二酮的0.1M磷酸缓冲液(pH6.5)50μl并进行混合。经时地用Benchmark Plus微孔板分光光度计(BIO-RAD公司制)观察NADPH的荧光。通过2，3-丁二酮的还原消耗NADPH，选拔荧光消失的物质作为对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性进一步提高的改变型羰基还原酶的重组菌。从选拔的重组菌的培养液中提取质粒，使用BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(应用生物系统日本社制)及应用生物系统3130×l基因分析仪(应用生物系统日本社制)确定变异型RKP基因的碱基序列，特定变异位点。将得到的对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高的改变型羰基酶示于表8。
[表8]
质粒名称 变异位点
pNKPm51 K22R-F87I-K259E-K270M
pNKPm52 D90G-K259E-K270M
pNKPm53 K39R-T51A-K259E-K270M
取得了表8所示的3种对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高了的酶。
(实施例31)改变型羰基还原酶的评价3
将实施例30中取得的改变型羰基还原酶的各重组菌及参考例3中制作的 E.coliHB101(pNKP)(对照)分别用与参考例4同样的方法进行培养。对得到的各培养液，通过离心分离收集菌体，悬浮于培养液的1/5量的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)。将其使用UH-50型超声波均质机(SMT公司制)破碎之后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞提取液。在无细胞提取液100μl中将1M磷酸缓冲液(pH7.0)400μl、水或60％DMF溶液500μl、2-己酮1％、NADPH5％、葡萄糖3.4％进行混合，在30℃下搅拌2小时并进行反应。反应后，用醋酸乙酯提取反应液。通过将提取液在下述的[利用气相色谱法的分析条件]中记载的条件下进行分析，确认2-己醇的生成。由2-己醇和2-己酮的峰面积算出变换率。
[利用气相色谱法的分析条件]
柱：InertCapI毛细管柱(30m、内径0.25mm、GL ScienceS公司制)
检测器：氢焰离子化检测器
注入部温度：250℃
柱温度：50℃
检测器温度：250℃
载气：氦、流量150kPa
由该变换率算出各重组菌在存在二甲基甲酰胺60％条件下相对于不存在二甲基甲酰胺条件的相对活性。相对活性由下述式算出，将该值设为二甲基甲酰胺导致的反应抑制的指标。将结果示于表9。
相对活性(％)＝[存在二甲基甲酰胺条件下的变换率]÷[不存在二甲基甲酰胺条件下的变换率]×100
将得到的对有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高的改变型羰基还原酶示于表9。
[表9]
变异位点 残存活性
(％)
野生型酶 24
K22R-F87I-K259E-K270M 35
D90G-K259E-K270M 31
K39R-T51A-K259E-K270M 31
取得了对表9所示的3种有机溶剂导致的反应抑制的抵抗性提高的酶。与野生型酶相比，表中所示的改变型羰基还原酶对作为有机溶剂之一的二甲基甲酰胺导致的反应抑制的抵抗性提高。
(实施例32)3-[(5R)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4S)-苯基-1，3-唑烷-2-酮的制造
在参考例4中取得的源自Vanderwaltozyma polyspora NBRC0996株的表达羰基还原酶RKP(野生型)的重组大肠杆菌的培养液及将实施例24中取得的生产改变型羰基还原酶T257S-K259E-K270M的重组大肠杆菌用与参考例4同样的方法进行了培养的培养液700μl中，加入葡萄糖脱氢酶(商品名：GLUCDH“Amano”II、天野酶社制)12.5U、葡萄糖80mg、NADP+0.6mg、二甲基甲酰胺或0.1M磷酸缓冲液(pH7)300μl、(S)-1-(4-氟苯基)-5-(2-氧代-4- 苯基-唑烷-3-基)-戊烷-1，5-二酮10mg，在30℃下搅拌20小时。将反应液用二甲基亚砜稀释，在下述条件下进行高效液相色谱法分析，测定对3-[(5R)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4S)-苯基-1，3-唑烷-2-酮的变换率、其光学纯度。将其结果示于表10。
[表10]
酶 DMF浓度(％) 变换率(％) S体的光学纯度(％e.e)
野生型 0 54.4 89.21
野生型 30 16.6 87.89
T257S-K259E-K270M 0 47.5 80.15
T257S-K259E-K270M 30 99.0 73.91
变换为[3-[(5R)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4S)-苯基-1，3-唑烷-2-酮的变换率的算出方法和分析条件]
柱：COSMOSIL 5C8-MS(250mm、内径4.6μm、Nacalai Tesque公司制)
柱温度：40℃
检测波长：254mm
流动相：水/乙腈＝1/1
保留时间：[3-[(5)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4)-苯基-1，3-唑烷-2-酮约8.5分钟、1-(4-氟苯基)-5-(2-氧代-4-苯基-唑烷-3-基)-戊烷-1，5-二酮约12.9分钟
变换率＝[3-[(5)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4)-苯基-1，3-唑烷-2-酮的生成量/([3-[(5)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4)-苯基-1，3-唑烷-2-酮的生成量+1-(4-氟苯基)-5-(2-氧代-4-苯基-唑烷-3-基)-戊烷-1，5-二酮的残存量]×100
[3-[(5R)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4S)-苯基-1，3-唑烷-2-酮的光学纯度的算出方法和分析条件]
柱：CHIRALCEL OD-H(250mm、内径4.6μm、大赛璐化学工业社制)
柱温度：30℃
检测波长：254mm
流动相：己烷/乙醇＝8/2
保留时间：3-[(5R)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4S)-苯基-1，3-唑烷-2-酮约18.1分钟、3-[(5S)-(4-氟苯基)-5-羟基戊酰基]-(4S)-苯基-1，3-唑烷-2-酮约21.7分钟
R体的光学纯度(％e.e.)＝{(R体的峰面积)-(S体的峰面积)}÷{(R体的峰面积)+(S体的峰面积)}×100

Claims (10)

1.一种多肽，其显示以下(a)～(c)的性质：
(a)由序列表的序列号1中引入了氨基酸取代的氨基酸序列组成的多肽，其中所述氨基酸取代是序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中的下述氨基酸取代之一：
(1)第71号被取代为天冬酰胺、第195号被取代为亮氨酸；
(2)第71号被取代为精氨酸、第259号被取代为谷氨酸；
(3)第71号被取代为精氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(4)第71号被取代为精氨酸、第300号被取代为天冬氨酸；
(5)第102号被取代为异亮氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(6)第177号被取代为苯基丙氨酸、第220号被取代为缬氨酸；
(7)第226号被取代为甘氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(8)第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸；
(9)第257号被取代为丝氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(10)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(11)第259号被取代为谷氨酸、第300号被取代为天冬氨酸；
(12)第267号被取代为脯氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(13)第270号被取代为蛋氨酸、第300号被取代为天冬氨酸；
(14)第2号被取代为异亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(15)第45号被取代为天冬氨酸、第175号被取代为天冬氨酸、第183号被取代为苏氨酸；
(16)第102号被取代为异亮氨酸、第226号被取代为甘氨酸、第267号被取代为脯氨酸；
(17)第124号被取代为亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(18)第177号被取代为苯基丙氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(19)第220号被取代为缬氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(20)第236号被取代为天冬酰胺、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(21)第238号被取代为异亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(22)第257号被取代为丝氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(23)第301号被取代为半胱氨酸；
(24)第259号被取代为谷氨酸、第265号被取代为赖氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(25)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第300号被取代为天冬氨酸；
(26)第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸、第301号被取代为半胱氨酸；
(27)第2号被取代为异亮氨酸、第238号被取代为异亮氨酸；
(28)第195号被取代为亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(29)第109号被取代为甘氨酸、第331号被取代为苯基丙氨酸；
(30)第124号被取代为亮氨酸、第236号被取代为天冬酰胺；
(31)第159号被取代为苯基丙氨酸、第259号被取代为谷氨酸；
(32)第42号被取代为精氨酸、第155号被取代为精氨酸、第279号被取代为精氨酸；
(33)第22号被取代为精氨酸、第87号被取代为异亮氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(34)第155号被取代为亮氨酸、第250号被取代为脯氨酸、第298号被取代为脯氨酸；
(35)第56号被取代为赖氨酸、第138号被取代为天冬酰胺、第190号被取代为丝氨酸、第254号被取代为天冬酰胺；
(36)第90号被取代为甘氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(37)第39号被取代为精氨酸、第51号被取代为丙氨酸、第259号被取代为谷氨酸、第270号被取代为蛋氨酸；
(38)第22号被取代为精氨酸；
(39)第25号被取代为苯基丙氨酸；
(40)第135号被取代为丙氨酸；
(41)第155号被取代为亮氨酸；
(42)第195号被取代为亮氨酸；
(43)第212号被取代为苯基丙氨酸、苏氨酸或酪氨酸；
(44)第228号被取代为缬氨酸；
(45)第257号被取代为丝氨酸；
(46)第259号被取代为谷氨酸；
(47)第265号被取代为赖氨酸；
(48)第267号被取代为脯氨酸；和
(49)第270号被取代为蛋氨酸；
(b)还原2-戊酮而生成2-戊醇；和
(c)与由序列表的序列号1中记载的氨基酸序列构成的羰基还原酶相比，在存在有机溶剂下对羰基化合物的反应性高、和/或热稳定性高。
2.一种多核苷酸，其编码权利要求1所述的多肽。
3.一种载体，其包含权利要求2所述的多核苷酸。
4.如权利要求3所述的载体，其还含有：编码具有还原型辅酶再生能力的多肽的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的载体，其中，具有还原型辅酶再生能力的多肽为葡萄糖脱氢酶。
6.一种转化体，其是利用权利要求3～5中任一项所述的载体对宿主细胞进行转化而得到的。
7.如权利要求6所述的转化体，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
8.一种醇化合物的制造方法，该方法包括：使权利要求1所述的多肽、或权利要求6或权利要求7所述的转化体和/或其处理物与羰基化合物作用，所述处理物是在粗提取液、培养菌体、冷冻干燥生物体、丙酮干燥生物体、菌体破碎物或这些固定化物中残存该多肽的酶催化剂活性的物质。
9.如权利要求8所述的制造方法，其中，所述羰基化合物为非对称酮，所述醇化合物为光学活性醇。
10.如权利要求8或9所述的制造方法，其中，所述羰基化合物为下述式(1)表示的非对称酮，
式中，R1及R2为氢原子、卤原子、任选被取代的烷基、任选被取代的芳烷基、任选被取代的芳基、任选被取代的烷氧基、氨基或硝基，或者R1和R2也可以相互键合成环，其中，R1和R2的结构不同，
所述醇化合物为下述式(2)表示的光学活性醇，
式中，R1、R2与上述相同，＊表示手性碳。
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