KR20230085639A - 신규한 코리네박테리움 속 균주 유래 prai 효소 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 코리네박테리움 속 균주 유래 PRAI 효소 및 이의 용도에 관한 것으로 본 발명의 PRAI 변이체는 야생형 PRAI에 비하여 개선된 효소 활성을 나타내고, 이를 포함하는 TrpCF를 활용하여 트립토판 생산 수율을 높일 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 코리네박테리움 속 균주 유래 PRAI 효소 및 이의 용도에 관한 것이다.
L-트립토판(L-tryptophan)은 필수 아미노산의 일종으로 사료 및 식품 첨가제로 널리 사용되고 있다. L-트립토판은 주로 코리네형 세균(Corynebacterium), 바실러스형 세균(Bacillus), 에스케리키아(Escherichia) 속 미생물을 이용한 발효법으로 생산되며, 이들 균주의 야생형 균주로부터 유도된 인공변이주가 L-트립토판의 생산을 위해 사용되고 있다.
L-트립토판의 상업적 중요성으로 인해 수요가 계속 증가하고 있다. 전세계적으로, L-트립토판 시장은 2020년 8억 120만 달러로 평가되었으며, 2026년에는 3억2690만달러로 추정되며 이는 연평균 22%의 성장률이 예상되는 수치이다. 1980년대까지 화학적으로 생산되었지만, 환경 및 원료 이슈로 인해 친환경적이고 지속 가능한 방법인 미생물 발효 공정으로 점진적으로 대체되고 있고, 생산 수율을 계속 높이는 쪽으로 연구가 이루어지고 있다.
코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum)은 L-트립토판 및 기타 아미노산의 산업적 생산을 위해 활용되는 대표적인 발효 미생물이다. 미생물에서 L-트립토판 생합성은 7가지 다른 유전자의 효소에 의해 다섯 단계로 이루어진다. 상기 효소 중에서 포스포리보실-안트라닐산 이성질화효소 (phosphoribosyl-anthranilate isomerase, PRAI, TrpF)는 생합성 경로에서 세번째 단계에서 작용하는 것으로, 아마도리 재배열을 N-(5'-포스포리보실)안트라닐산(N-(5'-phosphoribosyl)anthranilate, PRA)에서 1-(2-카복시페닐아미노)-1-디옥시-D-리불로스 5-인산(1-(2-carboxyphenylamino)-1-deoxy-D-ribulose 5-phosphate, CDRP)으로 촉매하는 효소이다. 그리고, 인돌 글리세롤 포스페이트 합성 효소 (indole glycerol phosphate synthase, IGPS, TrpC)는 네번째 단계에서 작용하는 것으로, 고리 폐쇄 반응을 하고 CDRP를 인돌-3-글리세롤 포스페이트 (indole-3-glycerol phosphate, IGP)로 변환시킨다 (도 1A). 상기 두 효소는 독립적인 유전자로부터 유래되고 대부분의 미생물, 가령 Bacillus subtilis, Pseudomonas putida, Saccharomyces cerevisiae, Mycobacterium tuberculosis 및 Saccharolobus solfataricus, 에서 단일 기능 단백질로 존재한다. 이와는 대조적으로 일부 미생물, 가령 Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Enterobacter aerogenes 및 Serratia marcescens 에서는 두 효소가 하나의 유전자에 암호화되었고, 이중 기능 효소 (bi-functional enzyme)로서 발현된다. 다양한 미생물의 단일 기능 효소에 대한 광범위한 구조적, 기능적 연구에도 불구하고, 이중 기능 효소는 대장균 E. coli에서만 보고되었다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 290번째 글루타민산이 치환되거나, 294번째 프롤린이 치환된 아미노산 서열을 포함하는 PRAI 변이체를 제공하는 것을 목표로 한다.
또한, 본 발명은 상기 PRAI 변이체를 암호화하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그리고, 본 발명은 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 트립토판 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
한편, 본 발명은 상기 PRAI 변이체를 포함하는 TrpCF 변이체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 290번째 글루타민산이 치환되거나, 294번째 프롤린이 치환된 아미노산 서열을 포함하는 PRAI 변이체를 제공한다.
상기 서열번호 1은 야생형 PRAI 의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 이의 서열은 아래와 같다:
| 서열 이름 | 서열 | 서열번호 |
| PRAI | MTSNNLPTVL ESIVEGRRGH LEEIRARIAH VDVDALPKST RSLFDSLNQG RGGARFIMEC KSASPSLGMI REHYQPGEIA RVYSRYASGI SVLCEPDRFG GDYDHLATVA ATSHLPVLCK DFIIDPVQVH AARYFGADAI LLMLSVLDDE EYAALAAEAA RFDLDILTEV IDEEEVARAI KLGAKIFGVN HRNLHDLSID LDRSRRLSKL IPADAVLVSE SGVRDTETVR QLGGHSNAFL VGSQLTSQEN VDLAARELVY GPNKVCGLTS PSAAQTARAA GAVYGGLIFE EASPRNVSRE TLQKIIAAEP NLRYVAVSRR TSGYKDLLVD GIFAVQIHAP LQDSVEAEKA LIAAVREEVG PQVQVWRAIS MSSPLGAEVA AAVEGDVDKL ILDAHEGGSG EVFDWATVPA AVKAKSLLAG GISPDNAAQA LAVGCAGLDI NSGVEYPAGA GTWAGAKDAG ALLKIFATIS TFHY |
1 |
본 발명에 있어서 PRAI는 포스포리보실안트라닐레이트 이성화 효소 (phosphoribosylanthranilate isomerase)를 나타낸 것이고, IGPS (인돌-글리세롤-포스페이트 합성효소, indole-glycerol-phosphate synthase)와 함께 TrpCF 를 구성하는 효소이다.
상기 PRAI는 N-(5'-포스포리보실)안트라닐산(N-(5'-phosphoribosyl)anthranilate, PRA)에서 1-(2-카복시페닐아미노)-1-디옥시-D-리불로스 5-인산(1-(2-carboxyphenylamino)-1-deoxy-D-ribulose 5-phosphate, CDRP)으로 촉매하는 효소로서 TrpF로 표시되고, 상기 IGPS는 CDRP를 인돌-3-글리세롤 포스페이트 (indole-3-glycerol phosphate, IGP)로 변환시키는 효소로 TrpC로 표시되며 (도 1A), PRAI와 IGPS는 이합체의 형태로 TrpCF로 표현된다 (도 1B).
상기 PRAI와 IGPS는 대부분의 미생물에서는 단일 기능 단백질로 존재하는 데 비하여, 대장균 등에서는 이중 기능 효소로서 발현된다.
도 6에 따르면, 서열번호 1의 아미노산 서열, 구체적으로 CgPRAICD에서 290번째 글루타민산이 발린으로 치환되거나 (CgPRAICD/E290V), 294번째 프롤린이 류신으로 치환된 아미노산 서열 (CgPRAICD/P294K)은 야생형에 비하여 효소의 촉매 작용 증가로 인해 효소의 활성이 증가한 것을 확인하였다.
본 발명의 일 구체예로 상기 290번째 글루타민산은 발린으로 치환되는 것이고, 상기 294번째 프롤린은 라이신으로 치환되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예로 상기 PRAI 변이체는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium spp.) 균주 유래, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 균주 유래일 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 TrpCF 변이체를 암호화하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.
또한, 본 발명의 다른 일 양상은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포를 숙주 세포로 하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 당업계에서 주로 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)으로 제작될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 암호화된 단백질의 발현을 조절하는 프로모터를 더 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 예를들면 tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터, 또는 T7 프로모터일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 벡터는 발현된 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 C-말단에 다른 서열이 연결될 수도 있다. 상기 연결될 수 있는 서열은 예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들면 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 하이그로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 재조합 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 및 이와 작동가능하게 연결된 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 유전자 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 암호화하는 염기 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것으로서, 직접 연결되어 있거나 또는 일정 거리를 두고 연결되어 있을 수 있고, 목적하는 단백질의 전사, 번역, 폴딩, 분비, 또는 다른 기능적 양상을 제어할 수 있도록 연결된 것을 의미한다. 예를 들면 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열이 목적하는 단백질을 암호화하는 염기 서열과 작동가능하게 연결되면, 목적하는 단백질이 발현되어 세포 외로 분비될 수 있다.
용어 "신호 펩티드(signal peptide)"는 주로 분비 단백질의 전구체의 N-말단 상부(upstream)에 존재하며 분비된 단백질에는 제거되어 존재하지 않는 것을 의미한다. 신호 펩티드는 이를 발현하는 염기 서열과 인 프레임(in frame)으로 연결된 유전자 발현 산물을 세포 외로 분비되도록 하는 활성을 갖는다. 일반적으로 분비 단백질은 단백질 전구체에서 신호 펩티드 부분이 절단된 상태로 세포 외로 분비된다.
상기 신호 펩티드를 암호화하는 염기 서열은 상기 폴리뉴클레오티드의 5'상부에 위치할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 미생물을 제공한다.
상기 형질전환된 미생물은 PRAI 변이체를 발현할 수 있는 균주이므로, 본 명세서에서는 PRAI 변이체 생산 균주로 정의한다. 본 발명의 생산 균주를 얻기 위한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예를 들어, E. coli JM109, E.coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 이용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
형질전환을 위해 벡터 등을 숙주 세포 내로 운반하는 방법으로는, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등이 있다.
본 발명의 다른 일 양상은 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 트립토판 생산 방법을 제공한다.
상기 배양하는 단계는 공지의 배지 및 배양 조건에서 이루어질 수 있고, 전술한 바와 같이 본 발명의 PRAI 변이체는 야생형에 비하여 활성이 증가한 것이어서 공지의 배양 조건에서 배양되더라도 높은 활성을 나타낸다.
한편, 본 발명의 일 양상은 상기 PRAI 변이체를 포함하는 TrpCF 변이체를 제공하고, 본 발명의 PRAI 변이체는 활성이 증가되어 이를 포함하는 TrpCF 변이체는 높은 활성을 가지고 있고, 이를 통해 트립토판 생산 수율을 높일 수 있다.
본 발명의 PRAI 변이체는 야생형 PRAI에 비하여 개선된 효소 활성을 나타내고, 이를 포함하는 TrpCF를 활용하여 트립토판 생산 수율을 높일 수 있다.
도 1은 L-트립토판 생합성 경로 및 CgTrpCF의 전체적인 구조를 나타낸 것으로, 도 1(A)는 L-트립토판 생합성 경로, 도 1(B)는 CgTrpCF 단량체의 구조로서 IGPSND 및 PRAICD는 보라색과 오렌지색으로 각각 표현되었고, 두 도메인의 결합은 파랑색으로 표현되었다. 도 1(C)는 IGPSND 를 도 1(D)는 PRAICD를 표현하였다.
도 2는 CgTrpCF의 이량체 구조를 나타낸 것으로, 도 2(A)는 CgTrpCF의 이량체 구조를, 도 2(B)는 CgPRAICD 및 EcPRAICD의 βα 루프 16를 나타내었고, 도 2(C)는 CgTrpCF 의 Size-exclusion chromatography를 나타낸 것으로, CgTrpCF는 이량체 구조를 나타내었다.
도 3은 PRAICD 의 활성 부위를 나타낸 것으로, 도 3(A)는 rCdRP의 Electron density map을 나타낸 것이고, 도 3(B)는 PRAICD 의 rCdRP와의 결합 양상을 나타낸 것이다.
도 4는 IGPSND 의 활성을 나타낸 것으로, 도 4(A)는 IGPS의 기질 상동체인 rCdRP의 Electron density map 을 나타낸 것이고, 도 4(B)는 IGPSND 의 rCdRP의 결합 형태를 나타낸 것이며, 도 4(C)는 IGPSND 의 rCdRP 활성 부위 포켓이며 도 4(D)는 IGPSND의 활성부위를 나타낸 것이다.
도 5는 기질 결합 중의 구조적 변화를 나타낸 것으로, 도 5 (A)는 PRAICD 활성 부위의 Open/closed 때의 구조적 변화를 나타낸 것이고, 도 5 (B)는 IGPSND활성 부위의 Open/closed 때의 구조적 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 활성 부위 잔기의 변이를 분석한 결과로, 도 6 (A)는 IGPSND 및 PRAICD의 다양한 잔기의 변이를 나타낸 것으로, 도 6 (B, C) 는 CgTrpCF 의 IGPSND 및 PRAICD의 점 돌연변이를 나타낸 것이며, 도 6 (D)는 PRAICD/wild-type 및 PRAICD/P294K의 효소 활성을 나타낸 것이다.
도 2는 CgTrpCF의 이량체 구조를 나타낸 것으로, 도 2(A)는 CgTrpCF의 이량체 구조를, 도 2(B)는 CgPRAICD 및 EcPRAICD의 βα 루프 16를 나타내었고, 도 2(C)는 CgTrpCF 의 Size-exclusion chromatography를 나타낸 것으로, CgTrpCF는 이량체 구조를 나타내었다.
도 3은 PRAICD 의 활성 부위를 나타낸 것으로, 도 3(A)는 rCdRP의 Electron density map을 나타낸 것이고, 도 3(B)는 PRAICD 의 rCdRP와의 결합 양상을 나타낸 것이다.
도 4는 IGPSND 의 활성을 나타낸 것으로, 도 4(A)는 IGPS의 기질 상동체인 rCdRP의 Electron density map 을 나타낸 것이고, 도 4(B)는 IGPSND 의 rCdRP의 결합 형태를 나타낸 것이며, 도 4(C)는 IGPSND 의 rCdRP 활성 부위 포켓이며 도 4(D)는 IGPSND의 활성부위를 나타낸 것이다.
도 5는 기질 결합 중의 구조적 변화를 나타낸 것으로, 도 5 (A)는 PRAICD 활성 부위의 Open/closed 때의 구조적 변화를 나타낸 것이고, 도 5 (B)는 IGPSND활성 부위의 Open/closed 때의 구조적 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 활성 부위 잔기의 변이를 분석한 결과로, 도 6 (A)는 IGPSND 및 PRAICD의 다양한 잔기의 변이를 나타낸 것으로, 도 6 (B, C) 는 CgTrpCF 의 IGPSND 및 PRAICD의 점 돌연변이를 나타낸 것이며, 도 6 (D)는 PRAICD/wild-type 및 PRAICD/P294K의 효소 활성을 나타낸 것이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 실험 재료 및 방법
1.1. 단백질 준비(Protein preparations)
CgTrpCF의 유전자는PCR에 의해 코리네박테리움 글루타미쿰 (ATCC 13032)dml 염색체 DNA로부터 증폭되었다. PCR 산물은 Ndel 및 Chol 제한 부위 인식 효소를 사용하여 C-말단에 6xHis를 포함하는 pET30a (Novagen)에 복제되었다. 벡터 pET30a:CgTrpCF는 E. coli BL21(DE3)-T1R 균주에 형질전환되어 37℃에서 30mg/L의 카나마이신을 함유한 LB 배지에서 배양되어 OD 600으로 0.6 수치에 도달할 때까지 배양하였다. CgTrpCF 단백질 발현을 유도하기 위해 0.5mM 이소프로필- β-D-1-싸이오갈락토시란노사이드 (Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside)를 첨가하고 18℃에서 20시간 배양하였다. 세포는 20℃에서 15분간 500g로 원심분리하여 수확하였다. 세포 펠렛은 매우 차가운 버퍼 A (40 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 재현탁하였고, 초음파 처리하여 분산시켰다. 세포 잔해물은 30분간 13,000g로 원심분리하여 제거하였고, 용해물들은 Ni-NTA agarose column (Qiagen)에 적용하였다. 15mM 이미다졸을 포함하는 버퍼 A로 세척한 뒤, 결합된 단백질은 버퍼 A에서 300mM 이미다졸로 용출되었다. 마지막으로, Hi-prep 26/60 sephacryl S-300 HR column (320 mL, Cytiva)을 사용한 size exclusion chromatography에 의해 미세 오염물질들을 제거하였다. 전제된 단백질은 이후 실험을 위하여 -80℃에서 저장되었다. 점 돌연변이 실험은 Quick Change site-directed mutagenesis kit (Stratagene)을 이용하였고, CgTrpCF 돌연변이의 생산 및 정제 또한 전술한 바와 같다.
1.2. CgTrpCF의 결정화 (Crystallization of CgTrpCF)
전제된 단백질의 결정화는 먼저 시중에서 구입 가능한 sparse-matrix screens from Wizard Classic I and II (Rigaku Reagents), PEG ion I and II (Hampton Research) 등을 사용하여 20℃에서 sitting-drop vapor-diffusion method에 의해 수행되었다. 각각의 실험은 1.0μl 단백질 용액 (52 mg m/L, 40 mM Tris-HCl, pH 8.0) 과 1.0μl의 저장용액이 혼합한 뒤 50μl 저장 용액과 평형을 이루는 방식으로 이루어졌다. CgTrpCF 결정은 복수의 결정화 선별 조건에서 관찰되었다. hanging-drop vapor-diffusion method을 사용한 복수의 최적화 단계 이후, pH 7.5에서 0.8 M potassium sodium tartrate tetrahydrate 및 0.1M sodium-HEPE로 구성된 저장용액을 사용하고, 2일차에서 확인된 결정들이 가장 좋은 품질인 것을 확인하였다. rCdRP와 복합체를 이루는 CgTrpCF 결정은 3mM의 환원된 1-(2-Carboxyphenylamino)-1-deoxyribulose 5-phosphate를 첨가하여 다른 단백질 농도 (35.4 mg m/L)에서 결정화되었다. CgTrpCF의 결정체는 22% PEG3350, 0.2M magnesium chloride hexahydrate 에서 복합체로 나타났다.
1.3. CgTrpCF의 정보수집 및 구조 확인 (Data collection and structure determination of CgTrpCF)
데이터 수집 전 액체 질소 가스에 대한 초 저온에 대한 보호를 위해 30%(v/v)의 글리세롤을 저장용액으로 결정들을 옮겼다. 모든 데이터는 QUANTUM 270 CCD detector (San Diego, CA, USA)를 사용하여 포항 가속기 연구소 (PAL, Republic of Korea)의 7A 빔라인에서 수집되었다. apo-형 및 rCdRP와 복합체인 CgTrpCF 결정은 각각 2.1 및 2.2 Å의 분해능으로 회절하였다. 데이터들은 HKL2000 suite를 사용하여 정리하였다. apo-형인 CgTrpCF는 P43212 공간 그룹에 속하고, 셀 파라미터는 a=90.681 Å b=90.681 Å c=141.785 Å, α = β = γ = 90˚ 로 확인되었다. 단일 CgTrpCF 분자를 비대칭 단위로 가정하였을 때, 단백질 질량 단위당 결정의 부피는 2.89 Å3/Da이고, 이는 용매 함량 57.42%에 해당한다. rCdRP와 복합체인 CgTrpCF는 P212121 공간 그룹에 속하고, 셀 파라미터는 a=89.740 Å b=98.163 Å c=116.124 Å, α = β = γ = 90로 확인되었다. 비대칭 단위당 CgTrpCF가 2분자일 때 단백질 질량 단위당 결정 부피는 2.53 Å3/Da이고, 이는 용매함량 51.45%에 해당한다. CgTrpCF의 구조는 대장균의 TrpCF (PDB CODE 1PII)를 검색 모델로 한 CCP4 MOLREP를 사용하여 분자 치환 방법 (molecular replacement method)으로 도출하였다. 추가적인 모델 구축은 WinCoot 프로그램을 사용하였고, CCP4 REFMAC5 프로그램으로 다듬었다. rCdRP와 복합체인 CgTrpCF는 apo-형인 CgTrpCF의 구조를 사용하여 분자 치환 방법으로 결정하였다. apo-형 CgTrpCF 및 rCdRP와 복합체인 CgTrpCF의 모형은 Protein Data Bank에 각각 PDB 코드 7ETX 및 7ETY로 기탁하였다.
1.4 분자 결합 시뮬레이션 (Molecular docking simulation)
IGP와 CgTrpCF 구조의 분자 결합 시뮬레이션은 AutoDock Vina software를 통해 이루어졌다. JLigand software를 사용하여 rCdRp에 결합된 CgTrpCF 구조는 제거되었고, IGPSND, IGP는 준비되었다. 결합 시뮬레이션은 AutoDock Vina를 사용하여 생성하였다. Glu59, Leu93, Lys120, Phe122, Leu141, Gle169, Glu220, Ser221, Leu240 및 Ser243의 곁가지들은 flexible residue로 처리되었다. 도출된 최종 구조는 PyMOL software를 이용하여 검증하였다.
1.5. bi-functional TrpCF의 아미노산 서열 분석 (Amino acid sequence analysis bi-functional TrpCFs)
Position specific iterated basic local alignment search tools (PSI-BLAST)는 CgTrpCF의 아미노산 서열을 검색 서열로 사용하여 nr 데티어베이스를 기반으로 수행되었다. 30%이상의 동일성, e-value가 0.05 미만 및 70% 이상을 포함하는 서열을 가진 Bi-functional TrpCF의 상동체가 선택되었다. Clustal Omega software를 사용하여 Multiple sequence alignment를 수행하였다.
실시예 2: 실험 결과
3.1. CgTrpCF의 전체 구조(Overall Structure of CgTrpCF)
bi-functional CgTrpCF의 분자적 메커니즘을 확인하기 위하여, 2.1 Å 해상도로 결정 구조를 확인하였다 (도 1B). 확인된 구조는 결합 각도, 결합 길이 및 다른 기하학적 파라미터의 X-ray crystallographic statistics와 일치하였다. CgTrpCF의 단량체 구조는 다음의 두 도메인으로 나뉜다: N말단의 IGPS 영역 (IGPSND, Met1-Tyr260) 및 C-말단의 PRAI 영역 (PRAICD, Gly261-Tyr474) (도 1B). 두 도메인 모두 8개의 modular βα units, (βα)8으로 구성되어 있다. IGPSND의 TIM-barrel 은 중앙의 8개의 β-strands (β1-β8) 와 이를 둘러싼 8개의 α-helices (α1-α8)로 형성되어있다. 또한, IGPSND의 N말단의 53개 잔기는 barrel의 양측과 하단에 두개의 helices (α0, α00)가 형성되어 있다 (도 1C). PRAICD의 중앙 평행 (βα)8 barrel은 8개의 α-helices (α9-α16)으로 둘려싸여있다 (도 1D).
CgTrpCF 결정의 비대칭 단위에는 분자 하나가 있지만, P43212 crystallographic symmetry operation에 의해 이합체 구조가 형성될 수 있다 (도 2A). PISA 및 EPPIC software 또한 CgTrpCF가 이합체 구조로 형성하는 것으로 계산되었다. 용액 내 CgTrpCF 효소의 올리고머 상태를 조사하기 위해 analytical size-exclusion chromatography를 수행하였다. 약 110kDa의 CgTrpCF가 용출되었고, 이량체로 기능함을 확인하였다 (도 2C). 대장균의 TrpCF (EcTrpCF)가 단량체로 기능함에 기초하여, CgTrpCF가 고유한 올리고머 상태를 가지고 있음을 유추할 수 있다. CgTrpCF 효소의 이합체 형태에서 IGPSND의 분자 하나는 PRAICD의 분자 하나와 맞닿아 있다. IGPSND의 3개의 α-helices (α0, α2, 및 α3)와 하나의 loop (βα-loop 1)는 PRAICD 의 두개의 α-helices (α9 및 α16) 및 하나의 loop (βα-loop 16)와 상호작용하고, 24개의 수소 결합과 4개의 salt bridge가 이합체 결합에 관여한다. PISA software룰 통해서는 solvent-accessible interface 영역이 2070.5 Å2이 포함되어있고, 참여 잔기는 13.1%인 것으로 계산되었다. CgTrpCF와 EcTrpCF의 구조를 비교할 때, 이합체 접촉에 관여되는 잔기들은 서로 많이 상이하며, 특히 βα-loop 16의 길이에 차이가 많이 났다 (Val444-Ala459, 15 아미노산). CgTrpCF의 βα-loop 16는 대응되는 EcTrpCG 의 루프 (Val430-Ala439, 10 아미노산)보다 길고, 이웃 분자와 접촉하기 위하여 PRAICD의 중심에서 바깥쪽에 위치한다 (도 2B). βα-loop 16의 구조적 차이가 bifunctional TrpCF의 단량체 또는 이합체를 결정하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 추측되었다.
3.2.PRAI
CD
의 Active Site
CgTrpCF의 기질 결합 양상을 확인하기 위해 화학적으로 안정적인 동등체인 reduced-CdRP (rCdRP)와 공동 결정 (co-crystallization)을 수행하였다. rCdRP는 PRAICD의 TIM-barrel 중심에 결합되어 있다 (도 3A). Cys266 및 Asp393의 잔기는 PARICD의 Active Site에 위치하여 촉매 기능을 하고, 두 잔기가 PRAI에서 확인되는 바와 같이 각각 염기 및 산으로서 기능할 것으로 추측한다. Cys266는 β9의 C-말단에 위치하고, rCdRP의 C2'원자에 가깝다 (S-C 거리는 4.2 Å) (도 3B). Asp393은 β14의 C-말단에 위치하고, PRA 기질의 furanose 고리의 산소에 해당하는 rCdRP의 C4'-히드록실기의 산소와 수소결합을 형성한다. C2' 원자 및 rCdRP의 C4'-히드록실기 산소에서는 산-염기 촉매 메커니즘이 발생하는 곳이다 (도 1A). 4 개의 βα-loops (10, 14, 15, 및 16)에 의해 촉매부위가 덮여 있다. βα-loop 10 의 Arg295 및 Ser293는 RCdRPdml 안트라닐산 잔기의 카르복실 그룹과 salt bridge응 형성한다 (도 3B). Asn441는 C3'의 히드록실기 산소 및 안트라닐산 잔기의 카르복실기와 연결된다. rCdRP의 인산기는 다른 루프에 위치한 Gly398, Gly400, Gly421, 및 Ser442의 펩타이드 NH기의 수소결합으로 안정화된다. 또한, Ser442의 히드록실기 산소는 같은 인산기와 slat bridge를 형성한다. Lys264, Gln336, 및 Asp439는 묻혀있는 rCdRP를 안정화하시키 위하여 rCdRP의 C2'-히드록실기 산소와 반응한다. His338는 rCdRP와 직접 상호작용을 하지는 않지만, 기질 영역으로 확장되어 기질의 공간을 형성하는 데 도움을 준다.
3.3. IGPS
ND
의 Active Site
rCdRP와 복합체인 IGPSND의 구조와 도메인의 Active Site를 확인하였다. PRAICD에서 확인한 바와 같이, IGPSND에서 β-strands 및 βα-loops의 C말단에 Active site가 위치한다 (도 4B). 촉매 잔기는 다른 IGPS의 대응되는 위치에서 보존되었다. IGPSND에서, lys120 잔기는 β3의 C-말단에 위치하고 rCdRP의 C2'-히드록실기 산소와 작용하고, 산으로 기능할 수 있다 (도 4C). IGPS의 반응 메커니즘에 따르면, Lys120의 암모늄기와 CdRP의 C2'사이의 상호작용은 indole-ring-forming cyclization reaction에 대해 C1과 C2'의 C-C 결합을 형성한다 (도 1A). dl Eo, clu169의 카르복실기는 인돌 고리의 NH와 slat bridge를 형성한다. CdRP의 NH기와 Glu169의 카르복실기 사이의 큰 작용거리가 있지만, CdRP의 중간 응축 단계에서 Glu169와 가까운 상호작용으로 이동된다. 두 α-helices (α0 및 α8) 및 5개의 
α-loops (1, 2, 6, 7, 및 8)가 촉매 부위를 덮고 있다. βα-loop 1에서의 Ser64 및 Ser66의 히드록실기 산소와 Ser66의 펩타이드 NH기는 rCdRP의 안트라닐산의 카르복실기와 3개의 수소결합을 형성한다. β1의 C-말단에 위치하는 Glu59 및 Lys61는 C2' 및 C4'의 히드록실기의 산소와 rCdRP의 인산잔기와 수소결합을 형성한다. Glu59, Lys61, 및 Lys120는 서로를 안정하기 위하여 salt bridge 3개를 형성하였다. βα-loop 7 의 Ser221은 C4' 및 rCdRP의 인산기와 수소결합을 형성한다. Asn190는 기질 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 반응을 보조하기 위하여 Ser221 및 Glu169와 수소결합을 형성한다. βα-loop 7 및 8에 위치한 Gly222, Gly242, 및 Ser243는 rCdRP의 인산기와 수소결합을 형성한다.
rCdRP가 결합하는 기질 결합부위의 내부에 빈 공간이 확인되었다 (도 4C). Phe99, Lys120, Phe122, Leu141, Met143, 및 Lue194와 같은, 소수성 잔기에 의해 형성되는 이 공간은 반응 중간 시점의 인돌 고리를 수용하는 것으로 추측된다. IGPSND의 Active site 내 빈 공간의 역할을 확인하기 위하여 IGP의 molecular docking simulation을 CgTrpCF 구조로 수행하였다. 시뮬레이션 모델에서 IGP의 인산기는 rCdRP의 잔기와 거의 동일한 위치에 위치하고, IFP의 인돌 고리는 rCDRP의 안트라닐산 아래의 빈 공간에 위치하였다 (도 4D). 이러한 내용에 기초하여, 반응 중간에 CdRP가 중간체로 변하면서 생기는 인돌 고리가 이 부위에 위치하면서 안정화 되는 것으로 추측된다.
3.4. 기질 결합에 따른 구조적 변화 (Conformational Change upon Substrate Binding)
TIM-barrel-type 효소는 기질의 수용을 위해 βα-loops의 입체구조 변화를 겪는 것과, CgTrpCF의 apo- 및 복합적 구조는 기질 결합 과정에서 효소가 양쪽 도메인에서 큰 구조적 변화를 겪는다는 것을 보여준다는 것이 알려져 있다. apo- 및 복합체 구조를 함께 생각했을 때, rCdRP의 결합과정에서 βα-loop 14 (Glu393-Ala411)는 큰 구조적 변화를 보였다. βα-loop 14는 apo-구조의 active site로부터 먼 곳에 위치하여 rCdRP를 안정화시키기 위해 15.8 Å 거리만큼 도메인의 active site로 이동하였다 (도 5A). 특히 루프에 위치하는 Gly398 및 Gly400의 주 사슬은 rCdRP의 인산 잔기와 수소 결합을 형성한다. 실질적인 구조 변화가 IGPSND에서 기질과의 결합과정에서 확인되었다. PRAICD의 βα-loop 14에서 확인된 것과 비슷한 형태로, βα-loop 1 (Cys60-Pro76)는 rCdRP의 결합 시 가장 큰 거리의 변화 (11.1 Å)를 보여줬다. 두 세린 잔기, 특히 Ser64 및 Ser66, 는 rCdRP의 안트라닐산 잔기의 카복실기와 수소 결합을 형성한다. IGPSND에서 βα-loop 6 및 7는 rCdRP 결합시 약간의 형태 변화, rCdRP의 결합을 도와주기 위해 기질 결합으로 이러한 루프이동, 를 보여주었다. βα-loop 1 및 14 가 각각 IGPSND 및 PRAICD의 개방/폐쇄의 구조적 변화를 유도하는 것으로 추정된다.
3.5. CgTrpCF의 기질 결합 잔기의 보존적 분석 (Conservation Analysis of the Substrate-binding Residues of CgTrpCF)
TrpCF의 두 결합 부위들의 보존 정도를 확인하였다. BLAST 검색 결과, CgTrpCF의 기능동 상동체가 15,199 개로 선정되었고, 48개의 아미노산이 두 기질 결합 부위에 관련된 것으로 확인되었다. IGPSND 의 결합 부위에 27개의 아니모산이 관여하고, 24개의 아미노산이 완전히 보존되었고, 이를 통해 도메인의 기질 결합 부위는 모든 효소 계통에서 보존되는 것을 의미한다. 예외적으로 Val9, Le67 및 Ile199의 세 잔기는 가변적인 것으로 확인되었다 (도 6A). IGPSND의 최적 기질 결합부위를 확인하기 위해 CgIGPSND의 가변 잔기에 대응되는 세 잔기를 돌연변이 시켰다. 돌연변이체들의 IGPS 활성을 측정하였을 때 모든 변이체들이 동등 또는 감소된 활성을 보여주었다 (도 6B). 이러한 결과는 CgTrpCF는 IGPSND의 기질 결합 부위에 최적화 된 것으로 추측된다. PRAICD는 21개 중 17 아미노산이 완전히 보존되었고, PRAICD의 기질 결합부위가 효소 계통에서 완전히 보존되는 것을 의미한다. Glu290, Pro294, His338, 및 Ile391의 4개 잔기는 PRAICD에거 가변 부위이다 (도 6A). 도메인의 최적의 기질 결합 부위를 확인하기 위하여 CgPARICD의 상기 가변 잔기의 네 잔기를 변형시켰다. CgPRAICD/E290V 및 CgPRAICD/P294K의 두 변형은 야생형과 비교하여 PRAI 활성이 향상되었으나, 다른 변이체들은 동등 또는 감소된 활성을 보여주었다 (도 6C). 이러한 결과는 CgPRAICD의 Glu290 및 Pro294 위치의 Val과 lys의 위치가 도메인의 보다 최적화된 기질 결합 부위를 형성하는 데 도움이 된다는 것을 의미한다. rCdRP와 복합적으로 결합된 CgTrpCF의 구조는 Gly290을 Val으로 대체하면 안트라닐산 잔기의 방향성 고리와의 소수성 상호작용을 증가시킬 수 있으며, Lys으로 Pro294를 대체하면 안트라닐산 잔기의 카복실기와 salt bridge를 형성할 수 있음을 시사한다 (도 3B). CgPRAICD/P294K 변이체의 역학 파라미터를 측정하였을 때, 변이체는 다소 증가한 KM값의 증가도 확인되었지만, 야생형과 비교하여, 더 높은 kcat 값을 보여주었다 (도 6D). 이러한 결과에서 CgPRAICD/P294K 변이체의 상승된 활성은 증가된 기질 친화성 보다는 효소의 촉매 작용 증가 때문일 것으로 추측된다.
실시예 3: 결과 요약
L-트립토판 생합성에서 중요한 효소인 bifunctional CgTrpCF를 확인하였다. 두 기능적 도메인에서 rCdRP와 결합된 복합체 구조를 확인하였고, 두 active site에서 기질 결합 형태를 확인하였다. 복합체 구조는 또한, 효소의 양 도메인이 기질과의 결합에 따라 개방/폐쇄 구조적 변화가 발생하는 것을 확인하였다. 생체 기능 TrpCF 상동체의 아미노산 서열 분석에 따라 두 기질결합 자리가 몇몇 예외적 경우를 제외하고 보존적인 것을 확인하였다. 최적 기질 결합 부위를 확인하기 위한 돌연변이 시험 과정에서 두 CgTrpCF 변이체가 향상된 효소활성을 가진 것을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> A NOVEL PRAI ENZYME DERIVED FROM CORYNEBACTERIUM SPP. AND THE USE
OF THE SAME
<130> BPN211033
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 474
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PRAI (phosphoribosyl-anthranilate isomerase, TrpF)
<400> 1
Met Thr Ser Asn Asn Leu Pro Thr Val Leu Glu Ser Ile Val Glu Gly
1 5 10 15
Arg Arg Gly His Leu Glu Glu Ile Arg Ala Arg Ile Ala His Val Asp
20 25 30
Val Asp Ala Leu Pro Lys Ser Thr Arg Ser Leu Phe Asp Ser Leu Asn
35 40 45
Gln Gly Arg Gly Gly Ala Arg Phe Ile Met Glu Cys Lys Ser Ala Ser
50 55 60
Pro Ser Leu Gly Met Ile Arg Glu His Tyr Gln Pro Gly Glu Ile Ala
65 70 75 80
Arg Val Tyr Ser Arg Tyr Ala Ser Gly Ile Ser Val Leu Cys Glu Pro
85 90 95
Asp Arg Phe Gly Gly Asp Tyr Asp His Leu Ala Thr Val Ala Ala Thr
100 105 110
Ser His Leu Pro Val Leu Cys Lys Asp Phe Ile Ile Asp Pro Val Gln
115 120 125
Val His Ala Ala Arg Tyr Phe Gly Ala Asp Ala Ile Leu Leu Met Leu
130 135 140
Ser Val Leu Asp Asp Glu Glu Tyr Ala Ala Leu Ala Ala Glu Ala Ala
145 150 155 160
Arg Phe Asp Leu Asp Ile Leu Thr Glu Val Ile Asp Glu Glu Glu Val
165 170 175
Ala Arg Ala Ile Lys Leu Gly Ala Lys Ile Phe Gly Val Asn His Arg
180 185 190
Asn Leu His Asp Leu Ser Ile Asp Leu Asp Arg Ser Arg Arg Leu Ser
195 200 205
Lys Leu Ile Pro Ala Asp Ala Val Leu Val Ser Glu Ser Gly Val Arg
210 215 220
Asp Thr Glu Thr Val Arg Gln Leu Gly Gly His Ser Asn Ala Phe Leu
225 230 235 240
Val Gly Ser Gln Leu Thr Ser Gln Glu Asn Val Asp Leu Ala Ala Arg
245 250 255
Glu Leu Val Tyr Gly Pro Asn Lys Val Cys Gly Leu Thr Ser Pro Ser
260 265 270
Ala Ala Gln Thr Ala Arg Ala Ala Gly Ala Val Tyr Gly Gly Leu Ile
275 280 285
Phe Glu Glu Ala Ser Pro Arg Asn Val Ser Arg Glu Thr Leu Gln Lys
290 295 300
Ile Ile Ala Ala Glu Pro Asn Leu Arg Tyr Val Ala Val Ser Arg Arg
305 310 315 320
Thr Ser Gly Tyr Lys Asp Leu Leu Val Asp Gly Ile Phe Ala Val Gln
325 330 335
Ile His Ala Pro Leu Gln Asp Ser Val Glu Ala Glu Lys Ala Leu Ile
340 345 350
Ala Ala Val Arg Glu Glu Val Gly Pro Gln Val Gln Val Trp Arg Ala
355 360 365
Ile Ser Met Ser Ser Pro Leu Gly Ala Glu Val Ala Ala Ala Val Glu
370 375 380
Gly Asp Val Asp Lys Leu Ile Leu Asp Ala His Glu Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Glu Val Phe Asp Trp Ala Thr Val Pro Ala Ala Val Lys Ala Lys Ser
405 410 415
Leu Leu Ala Gly Gly Ile Ser Pro Asp Asn Ala Ala Gln Ala Leu Ala
420 425 430
Val Gly Cys Ala Gly Leu Asp Ile Asn Ser Gly Val Glu Tyr Pro Ala
435 440 445
Gly Ala Gly Thr Trp Ala Gly Ala Lys Asp Ala Gly Ala Leu Leu Lys
450 455 460
Ile Phe Ala Thr Ile Ser Thr Phe His Tyr
465 470
Claims (9)
- 서열번호 1의 아미노산 서열에서 290번째 글루타민산이 치환되거나, 294번째 프롤린이 치환된 아미노산 서열로 이루어진 PRAI (phosphoribosylanthranilate isomerase) 변이체.
- 제 1항에 있어서,
상기 290번째 글루타민산은 발린으로 치환되는 것이고, 상기 294번째 프롤린은 라이신으로 치환되는 것인 PRAI 변이체.
- 제1항에 있어서,
상기 PRAI 변이체는 코리네박테리움 속 (Corynebacterium spp.) 균주 유래인 것인 PRAI 변이체.
- 제1항에 있어서,
상기 PRAI 변이체는 코리네박테리움 글루타미컴 (Corynebacterium glutamicum) 균주 유래인 것인 PRAI 변이체.
- 제1항의 PRAI 변이체를 암호화하는 염기 서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드.
- 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
- 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 미생물.
- 제7항의 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 트립토판 생산 방법.
- 제1항의 PRAI 변이체를 포함하는 TrpCF 변이체.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210174003A KR20230085639A (ko) | 2021-12-07 | 2021-12-07 | 신규한 코리네박테리움 속 균주 유래 prai 효소 및 이의 용도 |
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Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR102298651B1 (ko) | 2020-05-20 | 2021-09-06 | 경북대학교 산학협력단 | 고온에서 PET 분해 활성을 갖는 PETase 변이체 |
-
2021
- 2021-12-07 KR KR1020210174003A patent/KR20230085639A/ko unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102298651B1 (ko) | 2020-05-20 | 2021-09-06 | 경북대학교 산학협력단 | 고온에서 PET 분해 활성을 갖는 PETase 변이체 |
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