CN108118020B - 纤维素降解微生物的培养基、制备及其应用 - Google Patents

纤维素降解微生物的培养基、制备及其应用 Download PDF

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Abstract

针对现有技术中纤维素降解微生物的培养基体系所存在的问题，本发明提供了一种促进纤维素降解微生物生长，提高木质纤维素水解效率的培养基。一种纤维素降解微生物的培养基，所述培养基在1000ml水中包括磷酸盐10‑50mM，镁盐2‑20mM，尿素0‑6.0g，亚铁盐0.002‑0.4mM，钙盐0.009‑0.09mM，硫化钠0.5‑4.0g，玉米浆2.0‑12.0g，柠檬酸盐3.4‑22.1mM，纤维素碳源5‑600g；所述培养基的pH值6.0‑8.0。本发明所述的培养基利用玉米浆替代传统的酵母提取物，利用硫化钠替代半胱氨酸，费用低廉，大大降低了培养基的成本，而且也缩短了木质纤维素生物转化的周期。

Description

纤维素降解微生物的培养基、制备及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是一种纤维素降解微生物培养基，用于提高纤维素降解微生物的生长速率，以及木质纤维素到可溶性糖的水解效率；还涉及所述培养基的制备及应用。
背景技术
长期的自然进化过程使得木质纤维素资源形成了抗微生物和酶攻击的天然屏障，因此，木质纤维素利用的主要瓶颈在于如何将该成分和结构复杂的难降解固体底物高效转化为可溶性小分子糖。目前主要通过热化学裂解和生物转化两种技术体系实现木质纤维素的降解，其中生物转化技术体系具有条件温和、环境友好等优点，被普遍认为具有广阔的发展前景。然而，由于缺少清洁、高效、低成本的木质纤维素生物糖化关键技术，导致现有转化效率和成本尚不能适应大规模工业化生产要求。
木质纤维素的生物转化包括纤维素酶的生产、纤维素酶解与产品发酵等步骤，根据这些关键环节之间的关系，可以将现有的木质纤维素生物转化技术体系分为分步水解发酵工艺(SHF)、同步糖化发酵工艺(SSF)以及整合生物加工技术(CBP)三种。其中SHF和SSF都需要首先在独立的反应器中进行真菌来源的游离纤维素酶体系的生产，然后对预处理后原料进行纤维素的酶水解及发酵，CBP将纤维素酶的生产与酶解发酵等各个相对独立的技术环节整合为同一步骤，在同一反应器中进行。目前，SSF是主流的生物质生物糖化及转化工艺，但主要由于酶制剂生产的独立性以及酶解过程中酶制剂的难回收性，使生产过程中人力物力需求、设备投入和原料成本显著增加，因此效率和成本上的限制使SSF仍未实现大规模的商业化应用。CBP的“一锅法”策略具有简化流程、降低设备要求等优势。因此建立基于CBP策略的整合生物糖化工艺，可能是最适合纤维素类生物质生物转化利用的工艺路线。
木质纤维素的整合生物糖化需要有高效的纤维素降解微生物参与。目前，常规的纤维素降解微生物的培养基采用酵母提取物作为氮源，半胱胺酸盐作为硫源。张杰等(Zhang,J.,et al.(2017)."Efficient whole-cell-catalyzing cellulosesaccharification using engineered Clostridium thermocellum."BiotechnolBiofuels 10(1):124)采用的GS-2培养基使用6g/L酵母提取物以及1g/L半胱氨酸盐酸作为关键物质。然而，每吨酵母提取物为28000元，每吨半胱胺酸盐130000元，成本过高，大大限制了木质纤维素整合生物糖化的在工业化方面的进展。
玉米浆是制玉米淀粉的副产物。制造玉米淀粉须将玉米粒先用亚硫酸浸泡，浸泡液浓缩即制成黄褐色的液体，叫玉米浆。玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约40％～50％固体物质。玉米浆是微生物生长普遍应用的有机氮源，它还能促进青霉素等抗生素的生物合成。此外，硫化钠也是微生物生长普遍应用的有机硫源。目前尚没有报道将玉米浆和硫化钠应用于纤维素生物糖化以及配制纤维素降解微生物的培养基中。
发明内容
针对现有技术中纤维素降解微生物的培养基体系所存在的问题，本发明提供了一种促进纤维素降解微生物生长，提高木质纤维素水解效率的培养基。所述培养基不但成本低廉，而且效果优异。
本发明的技术方案：
一种纤维素降解微生物的培养基，所述培养基在1000ml水中包括磷酸盐10-50mM，镁盐2-20mM，尿素0-6.0g，亚铁盐0.002-0.4mM，钙盐0.009-0.09mM，硫化钠0.5-4.0g，玉米浆2.0-12.0g，柠檬酸盐3.4-22.1mM，纤维素碳源5-600g；所述培养基的pH值6.0-8.0。所述磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠；所述镁盐为氯化镁或硝酸镁；所述亚铁盐为硫酸亚铁、氯化亚铁或硝酸亚铁；所述钙盐为氯化钙或硝酸钙；所述柠檬酸盐为柠檬酸钾或柠檬酸钠。所述培养基中的纤维素碳源为纤维二糖、结晶纤维素、非结晶型纤维素或木质纤维素底物。
其中，所述的纤维素降解微生物包括梭菌类(Clostridium或Ruminoclostridium)、热解纤维素菌类(Caldicellulosiruptor)、解纤维醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)、溶纤维素拟杆菌(Bacteroides cellulosolvens)、黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)。
优选的是，纤维素降解微生物的培养基，所述培养基在1000重量份的水中，包括磷酸二氢钾0.25-4.0重量份，磷酸氢二钾0.3-6.5重量份，尿素0-6.0重量份，氯化镁0.18-1.8重量份，硫酸亚铁0.0005-0.01重量份，氯化钙0.001-0.1重量份，硫化钠0.5-4.0重量份，玉米浆2.0-12.0重量份，柠檬酸钠1.0-6.5重量份，纤维素碳源5-600重量份；所述培养基的pH值6.5-7.8。所述木质纤维素底物是指草本或木本植物来源的底物，具体为麦秆、玉米秸秆、玉米芯、木片或木粉。所述的纤维素降解微生物为热纤梭菌(Clostridium thermocellum或Ruminoclostridium thermocellum)，所述的热解纤维素菌类为热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor bescii)。
更优选的是，纤维素降解微生物的培养基，所述培养基在1000重量份的水中，包括磷酸二氢钾1.0-1.6重量份，磷酸氢二钾2.6-5.5重量份，尿素0.8-2.1重量份，氯化镁0.5-1.3重量份，硫酸亚铁0.0008-0.0012重量份，氯化钙0.009-0.015重量份，硫化钠0.5-2.0重量份，玉米浆4.0-8.0重量份，柠檬酸钠2.0-3.5重量份，纤维素碳源20-600重量份，所述培养基的pH值6.5-7.4。
纤维素降解微生物的培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取磷酸盐10-50mM，镁盐2-20mM，尿素0-6.0g，亚铁盐0.002-0.4mM，钙盐0.009-0.09mM，硫化钠0.5-4.0g，玉米浆2.0-12.0g，柠檬酸盐3.4-22.1mM，纤维素碳源5-600g；
(2)将玉米浆的pH值调成中性，离心去除沉淀；然后和其他组份一起加入到1000ml的水中，搅拌溶解，灭菌后即得到培养基；实时监测培养基的pH变化，并通过添加酸或碱，使培养基的pH值保持在6.0-8.0。
纤维素降解微生物的培养基的应用，将所述培养基应用于木质纤维素底物的生物转化。所述木质纤维素底物是指草本或木本植物来源的底物；所述木质纤维素底物具体为麦秆、玉米秸秆、玉米芯、木片或木粉。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的培养基利用玉米浆替代传统的酵母提取物，利用硫化钠替代半胱氨酸，费用低廉，因此大大降低了培养基的成本，为进一步的工业化生产提供了可能性，具备广阔的市场应用前景。
(2)此外，与传统GS-2培养基相比，本发明所述的培养基大大缩短了木质纤维素生物转化的周期，详见实施例12-16。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明。
表1.实施例1-11配制所述培养基所需各组分的重量(g)
Figure BDA0001549150370000031
实施例1：
纤维素降解微生物的培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和5g微晶纤维素(结晶纤维素)；
(2)将玉米浆的pH值调成中性，离心去除沉淀；然后和其他组份一起加入到1000ml的水中，调节pH值为6.0-8.0，搅拌溶解，115摄氏度灭菌20分钟，即得到培养基；实时监测培养基的pH变化，并通过添加酸或碱，使培养基的pH值保持在6.0-8.0。
对照组培养基的制备：根据表1称取对照组的物质和5g微晶纤维素(结晶纤维素)，加入到1000ml的水中，调节pH值为6.0-8.0，搅拌溶解，115摄氏度灭菌20分钟，即得到培养基；实时监测培养基的pH变化，并通过添加酸或碱，使培养基的pH值保持在6.0-8.0。
实施例2：
与实施例1不同的是，称取的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐的量不同。(详见表1)。对照组不变。
实施例3：
与实施例1不同的是，称取的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐的量不同。(详见表1)对照组不变。
实施例4：
与实施例1不同的是，
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和20g溶胀纤维素(非结晶纤维素)；
(2)调节pH值为6.5-74，搅拌溶解，115摄氏度灭菌20分钟，即得到培养基；实时监测培养基的pH变化，并通过添加酸或碱，使培养基的pH值保持在6.5-7.4。
对照组培养基的制备：根据表1称取对照组的物质和20g溶胀纤维素(非结晶纤维素)，加入到1000ml的水中，调节pH值为6.5-7.4，搅拌溶解，115摄氏度灭菌20分钟，即得到培养基；实时监测培养基的pH变化，并通过添加酸或碱，使培养基的pH值保持在6.5-7.4。
实施例5：
与实施例4不同的是，
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和20g微晶纤维素(结晶纤维素)。
对照组中同样采用20g微晶纤维素(结晶纤维素)。
实施例6：
与实施例4不同的是，
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和20g微晶纤维素(结晶纤维素)。
对照组中同样采用20g微晶纤维素(结晶纤维素)。
实施例7：
与实施例1不同的是，
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和20g微晶纤维素(结晶纤维素)；
(2)调节pH值为6.5-7.8，搅拌溶解，115摄氏度灭菌20分钟，即得到培养基；实时监测培养基的pH变化，并通过添加酸或碱，使培养基的pH值保持在6.5-7.8。
对照组培养基的制备：根据表1称取对照组的物质和20g微晶纤维素(结晶纤维素)，加入到1000ml的水中，调节pH值为6.5-7.4，搅拌溶解，115摄氏度灭菌20分钟，即得到培养基；实时监测培养基的pH变化，并通过添加酸或碱，使培养基的pH值保持在6.5-7.8。
实施例8：
与实施例7不同的是，
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和25g微晶纤维素(结晶纤维素)。
对照组中同样采用25g微晶纤维素(结晶纤维素)。
实施例9：
与实施例1不同的是，
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和碱法预处理的小麦秸秆底物100g(湿重)，所述底物中固含量25％(质量比)，纤维素含量72％(质量比)。
对照组中同样采用碱法预处理的小麦秸秆底物100g(湿重)。
实施例10：
与实施例9不同的是，
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和碱法预处理的玉米秸秆底物200g(湿重)，底物中固含量27％(质量比)，纤维素含量65％(质量比)。
对照组中同样采用碱法预处理的玉米秸秆底物200g(湿重)。
实施例11：
与实施例9不同的是，
(1)称取适量的磷酸盐，镁盐，尿素，亚铁盐，钙盐，硫化钠，玉米浆，柠檬酸盐(详见表1)和碱法预处理的小麦秸秆底物600g(湿重)，底物中固含量27％(质量比)，纤维素含量65％(质量比)。
对照组中同样采用碱法预处理的小麦秸秆底物600g(湿重)。
实施例12：
采用实施例1-11制备的培养基培养热纤梭菌DSM1313，分析培养基对纤维素底物水解的有益效果。将热纤梭菌DSM1313菌株预先在对照培养基中培养至对数中期，然后按照1％(体积比)的接种量接种到实施例1-11所制备的对照培养基和实验培养基中，在55摄氏度，170r/min的摇床中进行连续糖化培养。每两天取样检测发酵液中还原糖的含量，计算底物中纤维素到可溶性糖的转化率。转化率达到90％(质量比)的时间定义为木质纤维素底物的水解周期(天)。同一实施例中，实验组的周期(天)与对照组的周期(天)相比，大大缩短。(详见表2)
根据表2可知，采用对照组1制备的培养基，培养热纤梭菌DSM1313，转化周期为7.5-25.5天。而采用本发明实施例1-11制备的培养基水解周期则仅为5-10天。因此，与对照组相比，本发明实施例1-11制备的培养基转化周期缩短至原周期的33.3％-63.6％，说明所述培养基对木质纤维素生物转化具有明显的促进作用。
实施例13：
采用实施例6-9制备的培养基培养溶纤维假拟杆菌，分析培养基对纤维素底物水解的有益效果。将溶纤维假拟杆菌菌株预先在对照培养基中培养至对数中期，然后按照1％(体积比)的接种量接种到实施例6-9所制备的对照培养基和实验培养基中，在35摄氏度，200r/min的摇床中进行连续糖化培养。
根据表2可知，采用对照组1制备的培养基，培养溶纤维假拟杆菌，转化周期为20-23.5天。而采用本发明实施例1-11制备的培养基水解周期则仅为6-9天。因此，与对照组相比，本发明实施例1-11制备的培养基转化周期缩短至原周期的28.3％-41.9％，说明所述培养基对木质纤维素生物转化具有明显的促进作用。
实施例14：
采用实施例5和6制备的培养基培养解纤维醋弧菌，分析培养基对纤维素底物水解的有益效果。将解纤维醋弧菌菌株预先在对照培养基中培养至对数中期，然后按照1％(体积比)的接种量接种到实施例5和6所制备的对照培养基和实验培养基中，在35摄氏度，200r/min的摇床中进行连续糖化培养。
根据表2可知，采用对照组1制备的培养基，培养解纤维醋弧菌，转化周期为20-22.5天。而采用本发明实施例5和6制备的培养基水解周期则仅为10.5-12.5天。因此，与对照组相比，本发明实施例5和6制备的培养基转化周期缩短至原周期的52.5％-55.5％，说明所述培养基对木质纤维素生物转化具有明显的促进作用。
实施例15：
采用实施例7和8制备的培养基培养黄化瘤胃球菌，分析培养基对纤维素底物水解的有益效果。将黄化瘤胃球菌菌株预先在对照培养基中培养至对数中期，然后按照1％(体积比)的接种量接种到实施例7和8所制备的对照培养基和实验培养基中，在39摄氏度，200r/min的摇床中进行连续糖化培养。
根据表2可知，采用对照组1制备的培养基，培养黄化瘤胃球菌，转化周期为25.5-26天。而采用本发明实施例7-8制备的培养基水解周期则仅为12-12.5天。因此，与对照组相比，本发明实施例7-8制备的培养基转化周期缩短至原周期的47.1％-48％，说明所述培养基对木质纤维素生物转化具有明显的促进作用。
实施例16：
采用实施例1-4制备的培养基培养热解纤维素菌，分析培养基对纤维素底物水解的有益效果。将热解纤维素菌菌株预先在对照培养基中培养至对数中期，然后按照1％(体积比)的接种量接种到实施例1-4所制备的对照培养基和实验培养基中，在75摄氏度，200r/min的摇床中进行连续糖化培养。
根据表2可知，采用对照组1制备的培养基，培养热解纤维素菌，转化周期为13.5-15天。而采用本发明实施例1-4制备的培养基水解周期则仅为7.5-11天。因此，与对照组相比，本发明实施例1-4制备的培养基转化周期缩短至原周期的55.5％-73.3％，说明所述培养基对木质纤维素生物转化具有明显的促进作用。
表2.实施例1-11制备的培养基用于木质纤维素底物的水解周期(天)
Figure BDA0001549150370000081
由上述实施例可知，本发明提供的培养基不但原料合适，降低了成本，为进一步的工业化生产提供了可能性，具备广阔的市场应用前景。而且，与传统GS-2培养基相比，大大缩短了木质纤维素生物转化的周期，这将进一步推动木质纤维素整合生物糖化的工业化进程。

Claims (9)

1.一种纤维素降解微生物的培养基，其特征在于：所述培养基在1000ml水中包括磷酸盐10-50 mM，镁盐2-20 mM，尿素0-6.0g，亚铁盐0.002-0.4 mM，钙盐0.009-0.09 mM，硫化钠0.5-4.0g，玉米浆2.0-12.0g，柠檬酸盐3.4-22.1mM，纤维素碳源5-600g；所述培养基的pH值6.0-8.0；所述玉米浆的预处理步骤为将其pH值调成中性，离心去除沉淀。
2.根据权利要求1所述的纤维素降解微生物的培养基，其特征在于：所述磷酸盐为磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠或磷酸氢二钠；所述镁盐为氯化镁或硝酸镁；所述亚铁盐为硫酸亚铁、氯化亚铁或硝酸亚铁；所述钙盐为氯化钙或硝酸钙；所述柠檬酸盐为柠檬酸钾或柠檬酸钠。
3.根据权利要求2所述的纤维素降解微生物的培养基，其特征在于：所述培养基在1000重量份的水中，包括磷酸二氢钾0.25-3.6重量份，磷酸氢二钾0.3-6.5重量份，尿素0-6.0重量份，氯化镁0.18-1.8重量份，硫酸亚铁0.0005-0.01重量份，氯化钙0.001-0.1重量份，硫化钠0.5-4.0重量份，玉米浆2.0-12.0重量份，柠檬酸钠1.0-6.5重量份，纤维素碳源5-600重量份；所述培养基的pH值6.5-7.8。
4.根据权利要求3所述的纤维素降解微生物的培养基，其特征在于：所述培养基在1000重量份的水中，包括磷酸二氢钾1.0-1.6重量份，磷酸氢二钾2.6-5.5重量份，尿素0.8-2.1重量份，氯化镁0.5-1.3重量份，硫酸亚铁0.0008-0.0012重量份，氯化钙0.009-0.015重量份，硫化钠0.5-2.0重量份，玉米浆4.0-8.0重量份，柠檬酸钠2.0-3.5重量份，纤维素碳源20-600重量份，所述培养基的pH值6.5-7.4。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的纤维素降解微生物的培养基，其特征在于：所述的纤维素降解微生物为梭菌类、热解纤维素菌类、解纤维醋弧菌、溶纤维素拟杆菌和黄化瘤胃球菌。
6.根据权利要求5所述的纤维素降解微生物的培养基，其特征在于：所述的纤维素降解微生物中的梭菌类为热纤梭菌，所述热解纤维素菌类为热解纤维素菌。
7.根据权利要求1-4中任意一项所述的纤维素降解微生物的培养基，其特征在于：所述培养基中的纤维素碳源为纤维二糖、结晶纤维素、非结晶型纤维素或木质纤维素底物。
8.根据权利要求7所述的纤维素降解微生物的培养基，其特征在于：所述木质纤维素底物是指草本或木本植物来源的底物，所述木质纤维素底物为麦秆、玉米秸秆、玉米芯、木片或木粉。
9.纤维素降解微生物的培养基的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）称取磷酸盐10-50 mM，镁盐2-20 mM，尿素0-6.0g，亚铁盐0.002-0.4 mM，钙盐0.009-0.09 mM，硫化钠0.5-4.0g，玉米浆2.0-12.0g，柠檬酸盐3.4-22.1mM，纤维素碳源5-600g；（2）将玉米浆的pH值调成中性，离心去除沉淀；然后和其他组份一起加入到1000ml的水中，搅拌溶解，灭菌，即得到培养基；（3）实时监测培养基的pH变化，并通过添加酸或碱，使培养基的pH值保持在6.0-8.0。
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