CN113046408B - 一种秸秆制备黄腐酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种秸秆制备黄腐酸的方法，属于生物发酵技术领域，包括先后将发酵种子液Ⅰ和发酵种子液Ⅱ接种到发酵液罐中，且并在发酵第二阶段添加辅料Ⅱ，辅料Ⅱ包括辅酶Q、葡聚糖酶和壳聚糖；本发明的有益效果是：利用了草浆黑液的碱性环境对秸秆进行软化反应后，减少了氧化钙的使用，利用了发酵的手段，实现了秸秆和制浆黑液中纤维素和木质素分步降解，热带假丝酵母能够有效地抑制白腐真菌的生长，促进发酵前期纤维素的降解，葡聚糖酶对于热带假丝酵母细胞壁进行处理，解除了热带假丝酵母对白腐真菌的生长抑制，壳聚糖能够有效地抑制纤维素酶和半纤维素的酶活，避免了发酵后期分解木质素的同时对纤维素的过分降解，导致黄腐酸转化率较低。

Description

一种秸秆制备黄腐酸的方法

技术领域：

本发明属于生物发酵技术领域，更具体地涉及一种秸秆制备黄腐酸的方法。

背景技术：

碱法制浆是利用碱性化学药剂的水溶液处理植物纤维原料，而将原料中的木素溶出，使纤维从其中分离成为纸浆的方法。碱法制浆后，约有50％的纤维原料和绝大部分碱性物质溶解于蒸煮液中，成为黑液，黑液废水中含有聚戊糖、木素、硫酸盐皂和碱类物质，所以废水呈黑色。由于脱色困难、排入水体严重消耗溶解氧，用一般方法难以处理。

目前，制浆企业黑液转化为腐植酸，一般包括两种，一是将制浆黑液加入碱液，使黄腐酸沉淀下来再利用物理方法进行分离干燥；二是将制浆黑液利用微生物进行培养，得到含量更多的黄腐酸。

本公司申请的CN 106906260 B的国家发明专利公开了一种混合菌发酵生产黄腐酸的方法，利用了混合菌发酵法采用了多种菌体的协同作用，充分的发挥了培养液的作用，很大程度地提高了黄腐酸的转化率，但是由于本发明中采用的是：利用了草浆黑液的碱性环境对秸秆进行软化反应，其中草浆黑液中含有大量的木质素和纤维素，而秸秆中含有的是纤维素和半纤维素，该法中菌种主要处理的是纤维素，导致草浆黑液的木质素无法应用，特别是由于该法多种菌体的协同作用对于纤维素分解效率太高，导致部分纤维素过分分解，过分分解的纤维素无法通过菌种转化成黄腐酸。

发明内容：

为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种秸秆制备黄腐酸的方法，能够有效的解决第一个问题是：秸秆中含有的是纤维素和半纤维素，该法中菌种主要处理的是纤维素，导致草浆黑液的木质素无法应用的问题；

解决的第二个技术问题是：多种菌体的协同作用对于纤维素分解效率太高，导致部分纤维素过分分解，过分分解的纤维素无法通过菌种转化成黄腐酸。

本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：秸秆制备黄腐酸的方法，其特征在于包括：

(1)菌株发酵：将菌种分别接种于YPD平板培养基上30℃培养活化；

(2)一级种子培养：按照豆粕水解液(300-400)g/L、玉米粉(4-8)g/L、蔗糖(1.0-1.5)g/L、NaCl 15g/L、MgSO₄·7H₂O 8g/L、KH₂PO₄ 6g/L、(NH₄)₂HPO₄4.5g/L，配制一级种子培养基，自然pH值，将斜面菌种接种于1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h；

(3)二级种子培养：

按照豆粕水解液(300-400)g/L、玉米粉(1-5)g/L、蔗糖(0.5-1)g/L、NaCl10g/L、MgSO₄·7H₂O 4g/L、KH₂PO₄ 3g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2g/L，配制二级种子液，自然pH值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6-8h，得相应的发酵种子液Ⅰ；

按照豆粕水解液(300-400)g/L、玉米粉(1-5)g/L、蔗糖(0.5-1)g/L、NaCl10g/L、MgSO₄·7H₂O 4g/L、KH₂PO₄ 3g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2g/L，配制二级种子液，自然pH值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌和白腐真菌的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6-8h，得相应的发酵种子液Ⅱ；

(4)扩大发酵：

秸杆前处理后软化好的秸秆按照秸秆:按照秸秆:制浆黑液为1:5添加制浆黑液，并添加H₃PO₄，调PH至4-5，按照，按照豆粕水解液(300-400)g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄·7H₂O4g/L，配制成发酵液，按照2-4％的接种量将发酵种子液Ⅰ接种到100L的发酵液罐中，发酵过程中添加辅料Ⅰ，发酵6-8小时；

并再按照2-4％的接种量将发酵种子液Ⅱ接种到100L的发酵液罐中，且并在发酵过程中添加辅料Ⅱ，发酵16-24小时停止发酵；

所述秸杆前处理：机械破碎稻草至变软，浸泡于制浆黑液为1:2，将秸秆浸泡于制浆黑液中，24～48h后捞出，软化好的秸秆质地柔软；

(5)黄腐酸的提取：在步骤(4)中的发酵液，经充分发酵后的固液混合物，板框挤压过滤得到的悬浮液体，通过0.1-0.2mol/L碱液溶解抽提分离，用HCI调至pH值为1.8-2.2，静置1-3h，过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液；利用喷雾干燥机干燥后即得到黄腐酸干粉。

所述的辅料Ⅰ包括辅酶Q。

所述的辅料Ⅱ包括辅酶Q、葡聚糖酶和壳聚糖。

所述的发酵种子液Ⅰ的枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的接种量之比为4-6：6-7：5-6；

所述的发酵种子液Ⅱ的枯草芽孢杆菌和白腐真菌的接种量之比为(1-2)：(6-8)。

本发明的有益效果是：

本发明利用了草浆黑液的碱性环境对秸秆进行软化反应后，减少了氧化钙的使用，降低了成本，减少了环境的污染；利用了发酵的手段，实现了秸秆和制浆黑液中纤维素和木质素分步降解，规避了现有技术利用铵盐蒸煮进行净化分离或一步发酵法导致纤维素和半纤维素过分降解的问题；

利用枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉对秸秆和制浆黑液中的纤维素和半纤维素进行有效的处理转换成黄腐酸，热带假丝酵母能够有效地抑制白腐真菌的生长，规避了白腐真菌对纤维素酶的抑制影响作用，促进发酵前期纤维素的降解，

在此基础上通过添加葡聚糖酶对于热带假丝酵母细胞壁进行处理，实现对于热带假丝酵母灭活的效果，解除了热带假丝酵母对白腐真菌的生长抑制，促进发酵后期通过白腐真菌对制浆黑液中的木质素进行有效的定量降解和利用；

进一步地发酵后期在发酵种子液Ⅱ中添加了壳聚糖，能够有效地抑制纤维素酶和半纤维素的酶活，对纤维素的降解进行有效的控制，避免了发酵后期分解木质素的同时对纤维素的过分降解，导致黄腐酸转化率较低。

具体实施方式：

在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明的具体实施方式：

秸秆制备黄腐酸的方法，其特征在于包括：

(1)菌株发酵：将菌种枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母、黑曲霉和白腐真菌分别接种于YPD平板培养基上30℃培养活化；

(2)一级种子培养：按照豆粕水解液(300-400)g/L、玉米粉(4-8)g/L、蔗糖(1.0-1.5)g/L、NaCl 15g/L、MgSO₄·7H₂O 8g/L、KH₂PO₄ 6g/L、(NH₄)₂HPO₄4.5g/L，配制一级种子培养基，自然pH值，将斜面菌种接种于1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h；

(3)二级种子培养：

按照豆粕水解液(300-400)g/L、玉米粉(1-5)g/L、蔗糖(0.5-1)g/L、NaCl10g/L、MgSO₄·7H₂O 4g/L、KH₂PO₄ 3g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2g/L，配制二级种子液，自然pH值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6-8h，得相应的发酵种子液Ⅰ，其中，发酵种子液Ⅰ的枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的接种量之比为4-6：6-7：5-6；

按照豆粕水解液(300-400)g/L、玉米粉(1-5)g/L、蔗糖(0.5-1)g/L、NaCl10g/L、MgSO₄·7H₂O 4g/L、KH₂PO₄ 3g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2g/L，配制二级种子液，自然pH值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌和白腐真菌的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6-8h，得相应的发酵种子液Ⅱ，其中所述的发酵种子液Ⅱ的枯草芽孢杆菌和白腐真菌的接种量之比为1-2：6-8；

(4)扩大发酵：

秸杆前处理：机械破碎稻草至变软，浸泡于制浆黑液为1:2，将秸秆浸泡于制浆黑液中，24～48h后捞出，软化好的秸秆质地柔软；

秸杆前处理后软化好的秸秆，按照秸秆:按照秸秆:制浆黑液为1:5添加制浆黑液，并添加H₃PO₄，调PH至4-5，按照，按照豆粕水解液(300-400)g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄·7H₂O4g/L，配制成发酵液，按照2-4％的接种量将发酵种子液Ⅰ接种到100L的发酵液罐中，发酵过程中添加辅料Ⅰ辅酶Q，发酵6-8小时；

并再按照2-4％的接种量将发酵种子液Ⅱ接种到100L的发酵液罐中，且并在发酵过程中添加辅料Ⅱ辅酶Q、葡聚糖酶和壳聚糖，发酵16-24小时停止发酵；

(5)黄腐酸的提取：在步骤(4)中的发酵液，经充分发酵后的固液混合物，板框挤压过滤得到的悬浮液体，通过0.1-0.2mol/L碱液溶解抽提分离，用HCI调至pH值为1.8-2.2，静置1-3h，过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液；利用喷雾干燥机干燥后即得到黄腐酸干粉。

为了更加直观的展现本发明的分步协同抑制菌种降解的工艺优势，特以本发明的方法和相同工艺采用替换的方法进行对比，

对比例一：

制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，发酵种子液Ⅰ的热带假丝酵母替换成白腐真菌；

对比例二：

制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，发酵种子液Ⅰ的添加白腐真菌；

对比例三：

采用援引的方式，将CN 106906260 B的国家发明专利公开了一种混合菌发酵生产黄腐酸的方法引入；

使用时，具体操作如下：

表1：不同发酵工艺对于黄腐酸的转化效果对比

根据表1数据分析可知：

本发明和对比例三相比，黄腐酸的转化率从32.6％提升至38.4％，这可能是由于本发明采用了分步发酵的方法，在发酵后期引入了白腐真菌，白腐真菌能够分泌活性较强的木质素过氧化酶，能够有效的利用制浆黑液中的木质素，提高了黄腐酸的转化率；

对比例一和对比例三相比，其中对比例一的转化率较对比例二的32.6％还要低，这可能是由于热带假丝酵母替换成白腐真菌后，发酵前期白腐真菌对于纤维素酶产生影响，严重的时候导致纤维素酶失活，而发酵后期添加了壳聚糖致使整个发酵过程纤维素酶活性极低，导致无法利用制浆黑液和秸秆中的纤维素，最终导致黄腐酸的转换率极低；

而对比例二中虽然也加入了白腐真菌，但是由于热带假丝酵母的存在，热带假丝酵母能够抑制白腐真菌的生长，发酵前期白腐真菌也不会对纤维素酶产生影响，发酵前期其他菌株能够充分利用纤维素转化成黄腐酸；而发酵后期，添加的葡聚糖酶能够将热带假丝酵母破坏，热带假丝酵母破裂后，解除了对于白腐真菌抑制效果，发酵后期白腐真菌能够利用木质素进行转化，因此对比例二与对比例一差异性不大；

为了更加直观的展现本发明的葡聚糖酶和壳聚糖工艺优势，特以本发明和相同工艺采用替换的方法进行对比，

对比例四：

制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，辅料Ⅱ未添加葡聚糖酶；

对比例五：

制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，辅料Ⅱ未添加壳聚糖；

对比例六：

制备方法同实施例，所不同的是：本对比例的制备过程中，辅料Ⅱ未添加葡聚糖酶和壳聚糖；

使用时，具体操作如下：

表2：不同辅料对于黄腐酸的转化效果对比

	菌种	葡聚糖酶	壳聚糖	转化率
					本发明	分步	+	+	38.4％
对比例四	分步	-	+	34.4％
					对比例五	分步	+	-	34.8％
对比例六	分步	-	-	32.6％

根据表2数据分析可知：

对比例四中采用了分步发酵的方法，热带假丝酵母的细胞壁为葡聚糖，但是发酵后期由于没有添加葡聚糖酶，因此，热带假丝酵母始终保持很高的活性，且由于热带假丝酵母能够抑制白腐真菌的生长，必然导致发酵后期制浆黑液中的木质素无法利用，因此收率较低仅有34.4％，与对比例三没有添加分解木质素酶的菌体的结果是一致的；

对比例五中采用了分步发酵的方法，发酵后期也加入了葡聚糖酶，热带假丝酵母的细胞壁为葡聚糖，热带假丝酵母的细胞壁分解，热带假丝酵母破裂后，解除了对于白腐真菌抑制效果，白腐真菌的细胞壁为几丁质，不会收到葡聚糖酶的影响；

壳聚糖能够抑制纤维素酶的活性，但是由于没有添加壳聚糖，导致体系中的纤维素酶一直分解体系中的纤维素，最终导致体系中的纤维素过度分解，菌体导致无法利用并转化成黄腐酸；

对比例六中采用了分步发酵的方法，但是由于没添加葡聚糖酶和壳聚糖，导致了热带假丝酵母一直处于活性状态，分泌大量的纤维素，且热带假丝酵母抑制了白腐真菌的活性，导致了制浆黑液中的木质素无法利用；相当于没有添加白腐真菌，效果与对比例三没有添加分解木质素酶的菌体的结果是一致的。

综上所述：

本发明利用了草浆黑液的碱性环境对秸秆进行软化反应后，减少了氧化钙的使用，降低了成本，减少了环境的污染；利用了发酵的手段，实现了秸秆和制浆黑液中纤维素和木质素分步降解，规避了现有技术利用铵盐蒸煮进行净化分离或一步发酵法导致纤维素和半纤维素过分降解的问题；

利用枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉对秸秆和制浆黑液中的纤维素和半纤维素进行有效的处理转换成黄腐酸，热带假丝酵母能够有效地抑制白腐真菌的生长，规避了白腐真菌对纤维素酶的抑制影响作用，促进发酵前期纤维素的降解，

在此基础上通过添加葡聚糖酶对于热带假丝酵母细胞壁进行处理，实现对于热带假丝酵母灭活的效果，解除了热带假丝酵母对白腐真菌的生长抑制，促进发酵后期通过白腐真菌对制浆黑液中的木质素进行有效的定量降解和利用；

进一步地发酵后期在发酵种子液Ⅱ中添加了壳聚糖，能够有效地抑制纤维素酶和半纤维素的酶活，对纤维素的降解进行有效的控制，避免了发酵后期分解木质素的同时对纤维素的过分降解，导致黄腐酸转化率较低。

Claims (1)

1.一种秸秆制备黄腐酸的方法，其特征在于包括：

（1）菌种活化：将菌种分别接种于YPD平板培养基上30℃培养活化；

（2）一级种子培养：按照豆粕水解液（300-400）g/L、玉米粉（4-8）g/L、蔗糖（1.0-1.5）g/L、NaCl 15g/L、MgSO₄·7H₂O 8g/L、KH₂PO₄ 6g/L、(NH₄)₂HPO₄ 4.5g/L，配制一级种子培养基，自然pH值，将活化菌种接种于1000mL的液体培养基中在30℃，200rpm下发酵24h；

（3）二级种子培养：

按照豆粕水解液（300-400）g/L、玉米粉（1-5）g/L、蔗糖（0.5-1）g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄·7H₂O 4g/L、KH₂PO₄ 3g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2g/L，配制二级种子液，自然pH值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6-8h，得相应的发酵种子液Ⅰ；

按照豆粕水解液（300-400）g/L、玉米粉（1-5）g/L、蔗糖（0.5-1）g/L、NaCl10g/L、MgSO₄·7H₂O 4g/L、KH₂PO₄ 3g/L、(NH₄)₂HPO₄ 2g/L，配制二级种子液，自然pH值，按照2％的接种量将枯草芽孢杆菌和白腐真菌的二级种子液接种到10L的二级种子液罐中，发酵6-8h，得相应的发酵种子液Ⅱ；

（4）扩大发酵：

秸杆前处理后软化好的秸秆，按照秸秆:制浆黑液为1:5添加制浆黑液，并添加H₃PO₄，调PH至4-5，按照豆粕水解液（300-400）g/L、NaCl 10g/L、MgSO₄·7H₂O 4g/L，配制成发酵液，按照2-4％的接种量将发酵种子液Ⅰ接种到100L的发酵液罐中，发酵过程中添加辅料Ⅰ，发酵6-8小时；

并再按照2-4％的接种量将发酵种子液Ⅱ接种到100L的发酵液罐中，且并在发酵过程中添加辅料Ⅱ，发酵16-24小时停止发酵；所述秸杆前处理：机械破碎稻草至变软，按照1:2将秸秆浸泡于制浆黑液中，24～48h后捞出，软化好的秸秆质地柔软；

(5)黄腐酸的提取：在步骤(4)中的发酵液，经充分发酵后的固液混合物，板框挤压过滤得到的悬浮液体，通过0.1-0.2mol/L 碱液溶解抽提分离，用HCI调至pH值为1.8-2.2，静置1-3h，过滤，分离，上清液即为黄腐酸溶液；利用喷雾干燥机干燥后即得到黄腐酸干粉；

所述的辅料Ⅰ包括辅酶Q，所述的辅料Ⅱ包括辅酶Q、葡聚糖酶和壳聚糖，

所述的发酵种子液Ⅰ的枯草芽孢杆菌、热带假丝酵母和黑曲霉的接种量之比为4-6：6-7：5-6；

所述的发酵种子液Ⅱ的枯草芽孢杆菌和白腐真菌的接种量之比为1-2：6-8。