KR20160114772A - 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 스키조필럼 코뮨 (Schizophyllum commune)과 아밀라리아 저미나(Armillaria gemina)의 배양물에서 얻은 섬유소 분해효소의 혼합물인 컨소시엄 효소를 목질계 바이오매스를 기질로 하여 반응시켜 당화하는 단계를 포함하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법을 제공한다.

Description

중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법{Biological Saccharification Method Using Biomass from Heavy Metal Contaminated Soil Purifying Plant}

본 발명은 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 목질계 바이오매스에 대한 당화 효율이 높아 바이오에너지의 생산에 유용하고, 특히 국내에서 자생하는 목질계 바이오매스에 대한 가수분해 과정이 복잡하지 않아 저비용에 의해 고효율의 바이오에너지를 제공할 수 있는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법에 관한 것이다.

1925년 헨리 포드는 "미래 연료는 사과, 잡초, 톱밥 같은 발효될 수 있는 모든 식물 재료에서 나올 것이다"라며, 에틸알코올이 장차 미래 원료가 될 것이라 말한 바 있다. 현재 전 세계적으로 화석연료의 과다 사용에 따른 자원 고갈 및 환경오염에 대한 관심고조로 선진국을 중심으로 환경오염 및 지구온난화를 해결하기 위해 친환경적 바이오에너지 생산 기술의 개발이 절실히 요구되나 화석연료 대비 가격 경쟁력의 문제가 대두되고 있다. 특히 전분계 및 당질계인 1세대 바이오에탄올은 미국 및 브라질에서 이미 산업화되었지만 더불어 곡물 가격의 급등에 따른 새로운 문제가 야기되고 있다.

이를 해결하기 위해서는 지구상에 가장 풍부하며 재생산이 가능한 바이오매스 중 가장 큰 비중을 차지하는 리그노셀룰로오스 바이오매스를 이용한 기술 개발이 절실히 필요하다.

과학기술부에 따르면 목질계 바이오매스는 가용 자원 에너지의 96%에 달하며, 주로 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌으로 이루어져 있어 이들을 가수분해하면 다양한 단당류가 생산된다. 리그노셀룰로오스 바이오매스로 생산할 수 있는 바이오에탄올은 연간 4,420억 리터로 추산되며, 이는 현재 전 세계 바이오에탄올 생산량의 16배에 해당한다. 따라서 리그노셀룰로오스 바이오매스(lignocellulosic biomass)는 미생물 발효를 통한 2세대 바이오에탄올의 생산 원료로 주목받고 있다.

하지만 리그노셀룰로오스 바이오매스는 원료 가치에 비해 아직까지 상용화되고 있지 못하고 있는 실정인데, 이는 원료의 대량 확보 및 안정적 공급 문제와 효율적인 생산 공정이 확립되지 않아 경제적 비용이 더 크기 때문이다.

셀룰로오스의 가수분해를 억제시키는 두 가지 물리적 장해인자들이 있는데, 하나가 셀룰로오스의 결정구조이며 다른 하나는 리그닌의 존재이다. 이들 두 장해인자들은 산 혹은 효소에 의한 가수분해를 저해한다. 따라서 전처리 공정의 목표는 가수분해효소 반응속도를 향상시키고 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스로부터 발효에 적합한 당의 생산 수율을 높이기 위해 구조 및 구성상 장해요인을 제거하는 것이다. 전처리 공정은 당의 생성율을 높이고 탄수화물의 분해 또는 손실을 피하고 후속 공정을 저해하는 부산물의 발생을 피하면서 동시에 경제적이어야 한다. 또한 전처리 공정은 바이오매스의 바이오에탄올 전환 전체 공정의 효율과 비용을 결정하는 가장 중요한 공정이다. 전처리 기술로는 증기를 이용한 자가 가수분해(autohydrolysis), 암모니아와 증기를 이용한 AFEX(ammonia fiber/freeze explosion), 산처리, 염기처리, 생물학적 전처리 등이 있다. 현재의 화학적 방법은 많은 양의 에너지를 소모할 뿐만 아니라 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 생산 장비를 필요로 하며 또한 이때 발생하는 폐기물의 처리비용 등으로 인하여 생산단가가 높아질 뿐만 아니라 열처리 과정에서 원치 않는 부산물의 생성을 초래하며 정제를 어렵게 만드는 요인으로 작용하기 때문에 비용이 적게 들고 효율적인 전처리 공정 연구가 계속되고 있다.

가수분해는 전처리 다음 공정으로 셀룰로오스를 가수분해하여 단당류를 생산하는 과정이다. 셀룰라아제(Cellulase) 효소에 의한 가수분해가 산에 의한 가수분해 보다 수율이 높고 유지관리 비용이 적다. 일반적으로 전처리 공정 없이 가수분해를 하게 되면 수율이 20% 미만이나, 전처리 공정을 거치게 되면 90%를 넘기도 한다. 하지만 목질계 바이오매스의 주성분인 리그노셀룰로오스는 순수한 셀룰로오스와는 달리 리그닌과 헤미셀룰로오스와 같은 글루칸이 아닌 성분을 가지고 있기 때문에 가수분해가 복잡하고 어렵다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 목질계 바이오매스에 대한 당화 효율이 높아 바이오에너지의 생산에 유용하고, 특히 국내에서 자생하는 목질계 바이오매스에 대한 가수분해 과정이 복잡하지 않아 저비용에 의해 고효율의 바이오에너지를 제공할 수 있는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 스키조필럼 코뮨 (Schizophyllum commune)과 아밀라리아 저미나(Armillaria gemina)의 배양물에서 얻은 섬유소 분해효소의 혼합물인 컨소시엄 효소를 목질계 바이오매스를 기질로 하여 반응시켜 당화하는 단계를 포함하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법.

(2) 상기 (1)에 있어서, 목질계 바이오매스는 해바라기, 카놀라, 백합, 측백, 포플러, 소나무, 및 개오동나무의 군에서 선택된 적어도 1종의 식물에서 유래하는 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법.

(3) 상기 (1)에 있어서, 컨소시엄균에 의해 생산되는 효소는 10~20 FPU/g-기질의 농도로 투입하는 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법.

(4) 상기 (1)에 있어서, 바이오매스를 2% NaOH를 이용하여 50℃의 온도로 전처리하고, 당화공정에서 기질의 농도는 2~10 %(w/w), 당화공정의 온도는 40~50 ℃, 당화공정의 pH는 4~5인 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법.

본 발명에 의하면 목질계 바이오매스에 대한 당화 효율이 높아 바이오에너지의 생산에 유용하고, 특히 국내에서 자생하는 목질계 바이오매스에 대한 가수분해 과정이 복잡하지 않아 저비용에 의해 고효율의 바이오에너지를 제공할 수 있다.

도 1은 식물정화 해바라기 줄기의 당화에서 변수들 간의 상호작용을 보여주는 반응표면 그래프이다.[(a) 기질과 효소 농도 간의 상호작용; (b) 온도와 효소 농도 간의 상호작용; (c) 효소 농도와 pH 간의 상호작용; (d) 다른 변수를 그들 각각의 "0"의 수준에 유지할 때 당화에 대한 각각의 변수의 영향]
도 2는 식물정화에 사용된 카놀라 바이오매스의 당화 수율을 보여주는 그래프이다. [24시간 (black colour); 48시간 (grey colour); 72시간 (dark grey colour); 96시간 (white colour) 처리한 후 얻어진 당화율. 반응 조건은 50℃, pH 4.8, RPM 150]
도 3은 다양한 농도의 기질을 사용하였을 때 시간에 따른 당화 효율 그래프이다.[실험은 50℃, pH 4.8, RPM 150에서 1% (●), 3% (○), 5% (▼), 7% (△)의 기질 존재 하에서 수행]
도 4는 식물정화 카놀라 바이오매스의 당화에서 변수들 간의 상호작용을 보여주는 반응표면 그래프이다.[(a) 기질과 효소 농도 간의 상호작용; (b) 온도와 효소 농도 간의 상호작용; (c) 효소 농도와 pH 간의 상호작용; (d) 다른 변수를 그들 각각의 "0"의 수준에 유지할 때 당화에 대한 각각의 변수의 영향]

본 발명은 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법에 관한 것으로 스키조필럼 코뮨 (Schizophyllum commune)과 아밀라리아 저미나(Armillaria gemina)의 배양물에서 얻은 섬유소 분해효소의 혼합물인 컨소시엄 효소를 목질계 바이오매스를 기질로 하여 반응시켜 당화하는 단계를 포함한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 의하면, 아밀라리아 저미나(Armillaria gemina)는 높은 EG 활성을 (146 U/ml) 가지고 있지만 낮은 BGL 활성 (15 U/mL)을 보이고 있는 반면, 스키조필럼 코뮨 (Schizophyllum commune)은 높은 BGL 활성 (27.9 U/ml)을 가지고 있지만 낮은 EG 활성 (14.1 U/mL)을 가지고 있어, 상기 두 균을 조합하여 배양할 경우 섬유소 바이오매스의 효소 당화에 시너지 효과를 제공하는 것으로 확인된다.

이에 따라, 본 발명에서는 상기 목질계 바이오매스를 기질로 하는 당화효소로 S. commune과 A. gemina를 포함하는 컨소시엄균을 배양하고, 상기 배양물로부터 얻어지는 혼합효소를 사용한다. 상기 혼합효소를 사용할 경우 두 효소의 혼합비는 중량비로 10:90~90:10, 바람직하게는 50:50으로 된다.

상기 혼합효소는 10~20 FPU/g-기질의 농도, 바람직하게는 10 FPU/g-기질의 농도로 투입하는 것이 좋다. 상기 당화공정에 투입되는 혼합효소의 함량이 10 FPU/g-기질의 농도 미만일 경우에는 효소의 농도가 너무 낮아 기질에 대한 당화공정이 원활하게 이루어지기 어렵고, 20 FPU/g-기질의 농도를 초과할 경우에는 기질 대비 효소의 과잉공급으로 지나친 효소 간 경쟁에 의해 오히려 당화효율이 떨어지게 되는 문제가 있어 바람직하지 않다.

본 발명에서 사용하는 목질계 바이오매스는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 해바라기, 카놀라, 백합, 측백, 포플러(현사시나무 포함), 소나무, 및 개오동나무의 군에서 선택되어지는 적어도 1종의 식물에서 유래하는 것으로 한다. 나아가 중금속에 오염된 토양에서 식물정화용도로 재배되어 수확되어진 식물을 포함하는 것은 물론이다.

기질이 되는 목질계 바이오매스의 농도는 특별한 한정을 요하지는 않지만, 2~10 %(w/w)로 투입하는 것이 공정을 최적화하여 환원당 생산량을 크게 증가시킬 수 있기에 바람직하다. 상기 기질로 첨가되는 목질계 바이오매스의 농도가 2 %(w/w) 미만에서는 기질의 농도가 충분하지 않아 환원당 생산량이 감소하게 되고, 10 %(w/w)를 초과할 경우에는 상기 효소의 투입농도를 고려할 때 기질이 포화상태로 되어 더 이상의 환원당 생산량의 증가를 기대할 수 없게 되어 상기 범위로 투입하는 것이 바람직하다.

당화공정의 온도는 사용되는 기질 및 효소에 따라 상이할 수 있지만, 본 발명에 의하면 당화공정의 최적화를 위해 40~50 ℃의 조건을 유지하여 주는 것이 바람직하다. 만일 40 ℃ 미만으로 유지할 경우 효소의 활성이 떨어져 당화에 어려움이 있고, 50 ℃를 초과할 경우에도 마찬가지로 효소가 활성을 잃을 우려가 있어 당화공정에는 바람직하지 않다.

또한, 당화공정의 pH는 사용되는 기질에 따라 상이할 수 있지만, 본 발명에 의하면 당화공정의 최적화를 위해 pH 4~5의 조건을 유지하여 주는 것이 바람직하다. 만일 pH가 4 미만으로 유지할 경우 효소의 활성이 떨어져 당화에 어려움이 있고, 5를 초과할 경우에도 마찬가지로 효소가 활성을 잃을 우려가 있어 당화공정에는 바람직하지 않다.

상기와 같이 본 발명에 따른 목질계 바이오매스의 당화방법에 의하면, 상기 목질계 바이오매스에 대하여 높은 환원당 생산능력을 나타내고, 당화공정을 최적화하여 당화공정을 실시할 경우 환원당 생산량은 최적화 이전 보다 현저하게 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 내용을 실시예 및 실험예를 참조하여 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예 및 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 예시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이에 의해 제한되어서는 아니된다.

[실시예] Schizophyllum commune과 Armillaria gemina 컨소시엄을 이용한 고효율 당화효소의 생산

(1) 해바라기 바이오매스 전처리

해바라기 줄기의 전처리 조건을 결정하기 하기 위해 전처리 방법을 달리하면서 회수율과 당화수율 분석실험을 수행하였다. 전처리 방법은 일정한 시간 동안 121 ~ 221 ℃ 까지의 고온을 처리하는 열수 처리; 증기 폭발; NaOH, H₂O₂, Ca(OH)₂, HCl 및 FeCl₃ 같은 화학 물질을 사용하는 열 화학적 처리; 0.3 에서 2.5% H₂SO₄의 희석된 산 농도와 130 에서 210℃의 온도를 사용하는 희석된 산 열 전처리 등을 사용하였다. 2%와 4%의 NaOH를 사용하여 얻은 당화 수율은 유사했지만 전처리 후에 얻은 바이오매스 수율은 50~60 ℃에서 4% NaOH 가 사용되었을 때 감소했다. 따라서 본 실험에서는 2% NaOH가 사용되었고, 온도 50~60 ℃는 당화 수율에 유의한 영향을 미치지 않았다. 따라서 최종적으로 50 ℃에서 2% NaOH를 전처리 방법으로 사용하였다. 전처리 전의 해바라기줄기 바이오매스의 구성은 34.4% 셀룰로오스, 20.1% 헤미셀룰로오스, 그리고 29%의 리그닌 함량으로 이루어졌다. 전처리 후의 구성은 34.4% 셀룰로오스, 19.6% 헤미셀룰로오스, 그리고 19% 리그닌으로서, 리그닌 함량은 29%에서 전처리 후에 19%로 감소했다.

(2) S, commune과 A. gemina의 컨소시엄을 사용한 섬유소 분해효소 생산

S. commune (KCCM 11186P)과 A. gemina (KACC93084P)를 공시된 배양법에 따라 배양하여 다양한 리그노셀룰라제(EG, CBH, BGL, 만나아제, 자일라나제, 라카제, 리그닌 퍼옥시다제 등)의 생산을 확인하였다 (표 1). 두 균주의 배양은 다음 조건에서 진행하였다.

종 배양: 보관된 단일 군락을 전 배양 배지 (Potato starch 4 g/L, Dextrose 20 g/L) 50 mL가 들어있는 500 mL 플라스크에 접종하여 진탕배양기에서 200rpm, 30℃로 3일간 배양하였다.

본 배양: 200 mL의 종배양액을 생산배지(볏짚 20 g/L, 효모추출액 2 g/L, 옥수수 침지액 8 g/L, 일인산칼륨 5 g/L, 이인산칼륨 5 g/L, 황산마그네슘 3 g/L) 4 L가 들어있는 7L 발효조에 접종하여 교반속도 200rpm, 배양온도 33 ℃, pH 5에서 6일간 본 배양을 수행하였다.

상기 셀룰라아제의 생산은 교반속도 250 rpm, 통기량 0.8 ~ 1.2 vvm, pH 5 및 배양온도는 30 ℃에서 수행하였다.

표 1에 나타낸 바와 같이, S. commune으로부터 70L 발효기에서 1.43 U/ml 수준의 셀룰라제의 생산을 확인하였으며, A. gemina로부터 얻은 섬유소 분해효소는 바이오매스 가수분해에 효율적인 것으로 확인되었다. 즉, 가수분해 파라미터를 최적화한 후에 A. gemina 효소를 사용하여 63%의 최대 당화를 얻은 반면에 상업적으로 구할 수 있는 효소 Celluclast는 49.2%의 당화 수율을 얻을 수 있었다. 유사하게 10 FPU/g-기질 농도의 S. commune 효소는 포플러 바이오매스의 4%를 가수분해 할 수 있었고 49.1% (398 mg/g-기질)의 전환 수율로 환원당을 생산할 수 있었는데 이것은 상업적 효소인 Celluclast 1.5L로부터 얻은 전환수율과 유사하다.

A. gemina는 높은 EG 활성을 (146 U/ml) 가지고 있지만 낮은 BGL 활성 (15 U/mL)을 보이고 있는 반면, S. commune는 높은 BGL 활성 (27.9 U/ml)을 가지고 있지만 낮은 EG 활성 (14.1 U/mL)을 가지고 있다. 그러므로 이 두 균 배양의 결합은 섬유소 바이오매스의 효소 당화에 시너지 효과를 제공할 것으로 예상되었다. 따라서 본 실험에서 선택된 균주들의 컨소시엄을 사용하여 섬유소 분해효소의 칵테일을 사용했다. 가장 높은 FPU 수준 1.84 U/mL, EG 수준 120 U/mL, CBH 수준 31 U/mL, 및 BGL 수준 23 U/mL이 관찰되었다 (표 1). 높은 섬유소 분해 효소 생산과 함께 컨소시엄의 여과액은 엔도자일라나제 (1870 U/mL) 및 라카제 (0.2 U/mL) 활성도 보여주었다.

	Units/mL
효소	컨소시엄 (A. gemina, S. commune)	A. gemina (KACC93084P)	S. commune (KCCM 11186P)
셀룰라제	1.84	1.62	1.43
베타 글루코시다제	23	15	28
엔도-베타-1,4 글루카나제/CMCase	120	146	14
엑소-베타-1,4 글루카나제/CBH	31	34	15
자일라나제	1870	1260	1510
라카제	0.20	0.16	0.24

[실험예 1] 해바라기 바이오매스에 의한 금속 이온의 식물복원 및 이에 사용된 해바라기 바이오매스의 당화

(1) 해바라기 바이오매스에 의한 금속 이온의 식물복원

고도 축적 식물은 메탈 이온을 흡수하여 격리하는 능력을 가지고 있다. 토양 kg 당 1~150 mg 내외 소량의 Ni, As 및 Cd을 가하였을 때, H. annuus의 꽃과 잎에서 161 mg의 가장 높은 Cd 흡수가 나타났다. Ni 과 As의 경우 꽃과 잎이 줄기보다 높은 식물환경복원력을 나타내었다 (표 2). Zn의 경우 토양에 공급하는 금속의 농도를 증가하였을 경우 흡수되는 금속의 농도 또한 증가하였다. 300 mg/kg-soil 농도의 Zn를 공급하였을 경우 꽃과 입에서 흡수율이 2.5배 증가하였고, 줄기에서는 1.5배 증가하였다 (표 2). 300 및 450 mg/kg-soil 농도의 Cu²⁺ 존재 하에 H. annuus를 재배하였을 경우 식물의 모든 부분에서 Cu²⁺가 흡수되었다. 꽃과 잎에는 75.3 mg, 줄기에는 10.3 mg의 Cu²⁺가 존재하였다 (표 2). 고농도 (2000 mg/kg-soil)의 Pb를 공급하였을 경우 줄기에서는 가장 많은 251.9 mg의 Pb²⁺이 존재하였고, 잎과 꽃에는 148.7 mg의 Pb²⁺이 흡수된 것을 확인하였다. 1000 mg/kg-soil 농도의 Pb²⁺를 공급하였을 경우 줄기에서는 135.8 mg의 가장 높은 흡수율을 보였다.

금속	토양속 금속 (mg/kg-soil)	바이오매스 구성	바이오매스속 금속 (mg/kg-biomass)
Ni	10	줄기	0.525
		L + F*	3.13
	50	줄기	2.54
		L + F*	13.9
	100	줄기	15.6
		L + F*	99.1
As	10	줄기	N.D.
		L + F*	N.D.
	50	줄기	N.D.
		L + F*	10.2
	100	줄기	44.1
		L + F*	43.9
Cd	50	줄기	40.3
		L + F*	98.1
	100	줄기	78.4
		L + F*	161.1
Zn	200	줄기	128.2
		L + F*	269.1
	300	줄기	443.1
		L + F*	808.1
Cu	300	줄기	14.2
		L + F*	43.4
	450	줄기	10.3
		L + F*	75.3
Pb	250	줄기	29.1
		L + F*	26.3
	1000	줄기	135.8
		L + F*	63.2
	2000	줄기	251.9
		L + F*	148.7

*잎(L)과 꽃(F)의 혼합

(2) 컨소시엄 효소를 사용한 식물복원 해바라기 줄기의 당화 최적화

S. commune와 A. gemina 컨소시엄 효소를 이용한 당화공정을 개발하기 위한 최적화 실험은 통계학적 실험 설계 프로그램인 RSM (Response Surface Methodology)을 이용하여 주요 인자에 대한 조합을 도출하고 이를 실행하여 최적의 조건을 찾는 작업을 수행하였다. 식물정화에 사용된 해바라기 바이오매스(10 mg-Ni/kg-soil 처리구에서 자란 해바라기 줄기)의 당화 조건 최적화를 위한 주요 인자를 효소첨가량, 기질 농도, 온도, pH로 놓고 통계학적 실험 설계 프로그램인 RSM에 입력하였을 때 아래 표 3과 같이 실험설계가 제시되었으며, 회귀 분석 결과는 표 4에 나타내었다.

변수	심볼	로우	하이	-알파	+알파
효소농도 (FPU/g)	A	6	14	2	18
기질농도 (%)	B	3	8	0.5	10.5
온도 (oC)	C	45	55	40	60
pH	D	3.5	5.5	2.5	6.5

소스	평균제곱	자유도	F 값	p>F*
모델	1580.91	14	15.39	< 0.0001
A-효소	915.14	1	8.91	0.0093
B-기질	7679.10	1	74.76	< 0.0001
C-온도	5082.02	1	49.48	< 0.0001
D-pH	999.23	1	9.73	0.0070
AB	100.00	1	0.97	0.3394
AC	13.21	1	0.13	0.7248
AD	0.59	1	0.01	0.9408
BC	0.25	1	0.00	0.9613
BD	29.16	1	0.28	0.6020
CD	65.37	1	0.64	0.4375
A2	458.64	1	4.47	0.0518
B2	2076.86	1	20.22	0.0004
C2	2889.69	1	28.13	< 0.0001
D2	4243.25	1	41.31	< 0.0001
Residual	102.72	15
Lack of Fit	145.94	10	8.97	0.0129
Pure Error	16.26	5
Cor Total		29

* R² 0.928, Adj R² 0.86;

효소와 기질 농도 사이의 당화율은 기질 농도가 증가함에 따라 증가했다. 8%의 기질 농도에서 높은 효소 농도 (14 FPU/g-기질)는 82.1%의 최대 수율을 얻을 수 있었다 (도 1). 온도를 45~50 ℃의 사이에서 변화시켰을 때 효소 농도의 증가 (10-14 FPU/g-기질)는 환원당 생산을 증가시켰으나, 50 ℃ 이상의 고온에서는 당화 수율이 오히려 감소하였다 (도 1b). 효소와 pH 사이의 상호작용은 중간 pH 범위가 최적의 당화 수율을 생성했다 (도 1c). 섭동 그래프는 모든 변수 자신의 코드화된 값으로부터의 편차를 표시한다 (도 1d). 실제 값들은 각각 기질 농도 5.5 %, 효소 농도 10 FPU/g-기질, 온도 50℃, 및 pH 4.5다. 이 모형은 위의 최적의 변수 조건을 사용하여 얻을 수 있는 최대 전환 효율이 86.0% 이었다.

(3) 식물복원에 사용된 모든 해바라기 바이오매스의 당화

위의 (2)에서 식물복원 해바라기 줄기를 대상으로 최적화된 당화 조건 하에서 식물정화에 사용된 모든 부위의 해바라기 바이오매스를 사용한 당화를 진행하였다. 금속 이온 Ni, As, Cd, Zn, Cu, Pb 등을 10~2000 ppm의 농도로 처리한 토양을 식물정화한 해바라기 바이오매스의 당화 수율을 확인하기 위해 담자균 컨소시엄 효소로 72시간 당화 후에 환원당 생산을 확인하였다 (표 5).

토양 kg당 10~50 mg의 금속이온 (Ni과 As)을 첨가하였을 경우 최종 당화율에 영향을 미치지 않았는데 이는 위의 표 2에 나타난 바와 같이 식물이 소량의 금속이온 (0.52-2.54 mg/kg-biomass)을 흡수하여 당화 효소의 활성이 저해되지 않았기 때문인 것으로 사료된다. 토양 kg당 10 mg의 Ni²⁺를 가한 시료에서 재배한 해바라기 바이오매스를 사용하였을 때 가장 높은 86.4%의 당화수율을 보였고, As²⁺를 식물복원한 해바라기 바이오매스를 이용하였을 경우 꽃과 잎에서 가장 높은 85.2%의 당화수율을 나타내었다. 토양 kg당 100 mg의 Ni, As, Cd을 가한 토양에서 재배한 해바라기 바이오매스를 식물복원에 사용하였을 경우 가장 높은 당화수율은 Ni²⁺ 처리구에서 재배한 바이오매스에서 83.2%, 가장 낮은 당화수율은 Cd²⁺ 처리구의 바이오매스에서 얻어진 62.3% 이었다.

Pb²⁺는 S. commune과 A. gemina의 컨소시엄 효소를 이용한 해바라기 바이오매스의 당화 활성을 가장 많이 저해하였으며, 또한 환경복원 시 낮은 흡수율을 나타내었다. 26.3 mg의 Pb²⁺를 처리한 토양을 환경복원한 해바라기 바이오매스를 담자균 컨소시엄 효소를 이용하여 당화하였을 경우 79%의 당화수율을 보였으며, Pb²⁺ 농도를 증가하였을 경우 바이오매스에 축적된 Pb²⁺에 의한 담자균 컨소시엄 효소의 저해로 인해 당화수율이 감소하였다.

S. commune과 A. gemina의 컨소시엄 섬유소 분해효소에 의한 해바라기 바이오매스의 최고 당화율은 86.4%로 10 FPU/g의 효소와 5.5%의 해바라기 줄기를 사용하였을 때의 수치이다. 이와 같은 당화수율은 식물환경복원에 사용된 바이오매스가 당화 및 그 후의 바이오 에탄올 생산을 위해서 유용하게 사용될 수 있다는 가능성을 명확히 제시한다고 할 수 있다.

금속	토양속 금속 (mg/kg-soil)	바이오매스구성	당화수율 (%)
			FCa	FC+188b	CCc	CC+188d
Ni	10	줄기	86.4	86.2	76.4	82.5
		L + F*	86	85.4	79.8	85.6
	50	줄기	85	84.2	75.9	83.5
		L + F*	83.7	81.6	78.5	82.4
	100	줄기	83.2	81.5	72.5	79.8
		L + F*	79.3	73.9	72.4	75.7
As	10	줄기	83.7	84.2	76.2	82.6
		L + F*	85.2	85.8	74.9	84.5
	50	줄기	83.7	85.4	73.5	82.1
		L + F*	83.5	82.2	72.6	79.2
	100	줄기	80.2	78.6	72.6	78.6
		L + F*	80.7	76.6	72.4	77.9
Cd	50	줄기	83.2	77.4	71.6	79.5
		L + F*	68.4	61.9	56.7	61.2
	100	줄기	62.3	75.5	61.8	68.2
		L + F*	42.6	35.4	32.5	34.6
Zn	200	줄기	81.1	77.1	69.5	72.4
		L + F*	64.1	54.3	49.7	50.6
	300	줄기	41.9	28.5	33.4	34.1
		L + F*	26.3	12.3	16.9	17.2
Cu	300	줄기	80.9	79.1	70.3	77.6
		L + F*	75.7	72.2	62.9	70.6
	450	줄기	69.9	68.8	61.3	67.5
		L + F*	65.3	59.2	55.6	62.5
Pb	250	줄기	76.7	75.8	68.4	72.6
		L + F*	79	78.2	66.5	75.8
	1000	줄기	37.7	28.6	29.4	31.2
		L + F*	54.5	46.8	43.6	48.6
	2000	줄기	28.6	17.4	17.6	18.3
		L + F*	35.8	29.5	22.5	25.1

*잎(L)과 꽃(F)의 혼합

a. 곰팡이 컨소시엄의 효소칵테일; b. 노보자임 BGL을 함유한 곰팡이 컨소시엄; c. 상업용 셀룰라제; d. 노보자임 BGL을 함유한 상업용 셀룰라제

최적화된 컨소시엄 조건에서 여러 가지 전처리 방법에 의해 해바라기 바이오매스의 효소 가수분해와 각각 얻은 당화 수율을 표 6에 나타내었다. 기존 연구에 따르면 T. reesei Rut-C 30 섬유소 분해효소를 사용하였을 경우 57.8%, 희석 황산 전처리 후에 Celluclast 1.5L & Novozyme 188 을 사용한 경우 82.1%, 열수 전처리를 사용한 경우는 67%, 220℃의 뜨거운 물에서 5분간 전처리 한 효소 (기질 g 당 23??31 U의 Celluclast, 15 U의 Novozyme BGL)에 의한 가수분해는 90%의 당화 수율을 보였다. S. commune와 A. gemina의 컨소시엄 유래 리그노셀룰라제를 이용하여 식물정화에 사용된 해바라기 바이오매스의 당화 결과 최대 86.3%의 당화수율로 일반 바이오매스와 유사한 수준의 당화를 확보하였다.

전처리조건	효소 소스 및 유닛	해바라기 줄기(%)	당화수율(%)
Steam explosion for 1.5h with 0.5% NaOH	T. reesei Rut-C 30 cellulase (25 FPU/g)	5	57.8
Steam explosion for 1.5h with 0.5% NaOH	T. reesei Rut-C 30 cellulase (25 FPU/g)	5	59.8
Liquid hot water pre-treatment 220℃, 5 min.	Celluclast 23-31 FPU/g glucan with 15U BGL (Novozyme)	5	90.2
Sulphuric acid (0.02 M) overnight steam exploded at 207 ℃ and 21 kg/㎠ for 3 min.	Celluclast 2.67% (w/w)	6	11.9
Pre-treatment at 220℃ steam explosion	Celluclast : Novozyme BGL 15 FPU:12.5U/g	10	72
200℃ and 0.5% acid concentration	Celluclast : Novozyme BGL 15 FPU:15U/g	5	82.1
Hydrothermal treatment 180℃ for 30 min.	8 FPU	5	67
Thermochemical (50℃, 24 h, 2% NaOH): 해바라기 바이오매스	Cellulase: BGL 10 FPU: 6 U/g	5	84.3
Thermochemical (50℃, 24 h, 2% NaOH): 식물정화 후 해바라기 바이오매스	컨소시엄 당화효소 FPU: 6 U/g	5	86.3

(4) 식물정화 해바라기 바이오매스로부터 생산된 환원당을 이용한 에탄올 생산.

식물정화에 사용된 해바라기 바이오매스의 가수분해를 통해 생산된 환원당을 농축한 후, 그 혼합물을 에탄올 발효에 사용하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이 사카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 단독으로 사용하였을 때 에탄올의 생산 농도는 13.5 g_p/L, 에탄올 용적생산성은 0.45 g_p/L/h, 사용된 당 대비 에탄올 수율은 0.40 g_p/g_s 이었다. 초기 당농도 50 gs/L 대비, S. cerevisiae에서는 68%의 당이 소비되었으며, 에탄올로의 당전환효율은 78%이었다. 반면 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)를 단독으로 사용하였을 때는 에탄올의 생산 농도 10.2 g_p/L, 에탄올 용적생산성 0.34 g_p/L/h, 사용된 당 대비 에탄올 수율은 0.38 g_p/g_s 이었다. 초기 당농도 50 g_s/L 대비, P. stipitis에서는 54%의 당이 소비되었으며, 에탄올로의 당전환효율은 74%이었다. S. cerevisiae와 P. stipitis를 공동 배양하여 에탄올을 생산한 연구 결과, 에탄올 생산은 19.5 g_p/L, 에탄올 용적생산성은 0.65 g_p/L/h, 소비된 당 대비 에탄올 수율은 0.47 g_p/g_s 이었다. 최종 82%의 환원당이 소비되었고, 92%의 당이 에탄올로 전환되었다. 에탄올로의 당전환효율은 에탄올의 이론적 수율(0.51 g/g)과 얻어진 실험적 수율의 비로 계산하였다.

효모	초기 당농도(g/L)	잔류 당농도 (g/L)	당소비율 (%)	에탄올 (gP/L)	QP (g/L/h)	YP/S (gP/gS)	에탄올로의 당전환효율 (%)
S. cerevisiae	50	16	68	13.5	0.45	0.40	78
P. stipitis	50	23	54	10.2	0.34	0.38	74
S. cerevisiae + P. stipitis-	50	9	82	19.5	0.65	0.47	92

* 30시간, Q_P 에탄올 용적생산성, Y_P/S 에탄올 수율

[실험예 2] 식물정화에 사용된 카놀라 바이오매스의 당화

(1) 카놀라 바이오매스 전처리

카놀라(유채)를 실험예 1에서와 같이 2% NaOH를 이용하여 50℃의 온도로 24시간 동안 전처리하였다.

(2) 금속 이온이 당화에 미치는 영향

본 실험의 목적은 Hg 등을 포함한 많은 금속 이온이 처리된 토양에서 유해 금속 이온의 식물정화 후 이에 사용된 카놀라 바이오매스를 당화에 재사용하는데 있다. 고농도의 금속이온을 식물정화한 카놀라 바이오매스가 효율적으로 당화되는지를 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 컨소시엄 효소의 농도는 10 FPU/g-substrate을 첨가하여 진행하였으며, 당화효율을 확인하기 위한 반응 조건은 7% (w/v) 기질 농도를 사용하였고, 96시간 동안 진탕 반응기를 이용하여 확인하였다. 금속이온의 식물정화에 사용된 카놀라 바이오매스에서 당화효율이 20~30% 감소하였다. 가장 높은 저해를 보이는 금속이온은 Mn²⁺이었으며, 가장 적게 저해를 초래한 금속이온은 Pb²⁺이었다.

(3) S. commune과 A. gemina 컨소시엄을 이용한 당화 시 기질 농도의 최적화

0.1 g의 전처리된 바이오매스를 당화에 사용하였고, 실험은 50℃, sodium citrate buffer (pH 4.8)에서 S. commune과 A. gemina 컨소시엄 효소를 사용하여 진행하였다. 효소의 양을 10 FPU/g-기질로 고정시키고 다양한 농도의 기질 농도에서 당화율을 측정하였다 (도 3). 가장 높은 당화 효율은 7%의 기질을 사용하여 96시간 반응하였을 때 확보되었다. 72시간 전처리한 바이오매스가 분해되어 77.6 ± 3.7%의 당화효율 (10 FPU/g-기질)을 나타내었으며, 같은 효소의 양을 사용하였을 경우 1%의 전처리한 바이오매스가 분해되어 47.1 ± 4.6%의 당화효율을 보였다.

	12시간 후		24시간 후		36시간 후		48시간 후
SCa	RSb	SYc	RSb	SYc	RSb	SYc	RSb	SYc
7	380±35	55.2±4.84	512±48	74.3±7.12	515±48	76.2±7.74	519±48	77.6±3.74
5	299±27	43.4±3.92	412±36	59.8±5.52	459±42	66.5±6.23	411±36	59.7±5.42
3	260±23	37.7±3.35	370±34	53.6±4.85	430±41	62.4±5.94	364±33	52.8±4.79

* 50 ℃, pH 4.8, 150 RPM(0.2% (v/v) Tween-20 사용). 효소용량은 10 FPU/g-기질로 유지, a:기질농도(%), b: 방출 환원당(mg/g-기질), c: 최종 당화수율(%)

(4) S. commune과 A. gemina 컨소시엄을 이용한 최적 조건에서의 당화수율

당화공정을 개발하기 위한 최적화 실험은 통계학적 실험 설계 프로그램인 RSM을 이용하여 주요 인자에 대한 조합을 도출하고 이를 실행하여 최적의 조건을 찾는 작업을 수행하였다. 식물정화에 사용된 카놀라 바이오매스의 당화 조건 최적화를 위한 주요 인자를 효소첨가량, 기질 농도, 온도, pH로 놓고 통계학적 실험 설계 프로그램인 RSM에 입력하였을 때 해바라기 바이오매스의 경우와 유사하게 아래 표 9와 같이 실험설계가 제시되었다.

RSM 프로그램을 이용한 당화공정 최적화 변수

변수	심볼	로우	하이	-알파	+알파
효소농도(FPU/g)	A	6	14	2	18
기질농도(%)	B	3	8	0.5	10.5
온도(℃)	C	45	55	40	60
pH	D	3.5	5.5	2.5	6.5

카놀라 바이오매스 기질 농도 7%, 컨소시엄 효소 농도 14 FPU/g-기질, 온도 48℃, 및 pH 4.0 등 최적화된 당화 조건하에서 77.4%의 가장 높은 당화수율을 확보하였다 (도 4, 표 10).

S. commune와 A. gemina의 컨소시엄 유래 리그노셀룰라제를 이용하여 식물정화에 사용된 카놀라 바이오매스의 당화 결과 최대 78.7%의 당화수율로 일반 바이오매스와 유사한 수준의 당화를 확보하였다 (표 10). 식물정화에 사용된 카놀라 바이오매스를 이용한 고효율 당화는 최초로 보고되는 것이다.

바이오매스	전처리방법	효소(per g-기질)	당화수율 (%)
유채짚	NaCl	Termitomyces clypeatus	16-40
유채짚	암모니아	Bjerkandera sp.	50
유채짚	0.32% 인산	30FPU Celluclast + 30CBU/gβ-글루코시다제	60
겨자짚	암모니아+곰팡이	Bjerkandera sp.	74
유채짚	NaOH	T. clypeatus	82
유채짚	19.8% 암모니아수	T. clypeatus	84
카놀라 바이오매스	2% NaOH	10 FPU S. commune + A. gemina	78.7

(5) 식물정화에 사용된 카놀라 바이오매스로부터 생산된 환원당을 이용한 에탄올 생산.

가수분해를 통해 생산된 당을 농축한 후, 그 5탄당과 6탄당의 혼합물을 에탄올 발효에 사용하였다. 표 11에 나타낸 바와 같이 카로미세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 단독으로 사용하였을 때 에탄올의 생산 농도는 12.2 g_p/L, 에탄올 용적생산성은 0.4 g_p/L/h, 사용된 당 대비 에탄올 수율은 0.39 g_p/g_s 이었다. 초기 당농도 50 gs/L 대비, S. cerevisiae에서는 62%의 당이 소비되었으며, 에탄올로의 당전환효율은 76%이었다. 반면 피키아 스티피티스(Pichia stipitis)를 단독으로 사용하였을 때는 에탄올의 생산 농도 9.5 g_p/L, 에탄올 용적생산성 0.31 g_p/L/h, 사용된 당 대비 에탄올 수율은 0.35 g_p/g_s 이었다. 초기 당농도 50 g_s/L 대비, P. stipitis에서는 54%의 당이 소비되었으며, 에탄올로의 당전환효율은 68%이었다. S. cerevisiae와 P. stipitis를 공동 배양하여 에탄올을 생산한 연구 결과, 에탄올 생산은 18.3 g_p/L, 에탄올 용적생산성은 0.61 g_p/L/h, 소비된 당 대비 에탄올 수율은 0.46 g_p/g_s 이었다. 최종 78%의 환원당이 소비되었고, 90%의 당이 에탄올로 전환되었다. 에탄올로의 당전환효율은 에탄올의 이론적 수율(0.51 g/g)과 얻어진 실험적 수율의 비로 계산하였다.

효모	초기 당농도 (g/L)	잔류 당농도 (g/L)	당소비율 (%)	에탄올 (gP/L)	QP (g/L/h)	YP/S (gP/gS)	에탄올로의 당전환효율 (%)
S. cerevisiae	50	19	62	12.2	0.40	0.39	76
P. stipitis	50	23	54	9.5	0.31	0.35	68
S. cerevisiae + P. stipitis-	50	11	78	18.3	0.61	0.46	90

* 30시간, Q_P 에탄올 용적생산성, Y_P/S 에탄올 수율

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (4)

1. 스키조필럼 코뮨 (Schizophyllum commune)과 아밀라리아 저미나(Armillaria gemina)의 배양물에서 얻은 섬유소 분해효소의 혼합물인 컨소시엄 효소를 목질계 바이오매스를 기질로 하여 반응시켜 당화하는 단계를 포함하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법.
2. 제 1항에 있어서, 목질계 바이오매스는 해바라기, 카놀라, 백합, 측백, 포플러, 소나무, 및 개오동나무의 군에서 선택된 적어도 1종의 목재에서 유래하는 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법.
3. 제 1항에 있어서, 컨소시엄균에 의해 생산되는 효소는 10~20 FPU/g-기질의 농도로 투입하는 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법.
4. 제 1항에 있어서, 바이오매스를 2% NaOH를 이용하여 50℃의 온도로 전처리하고, 당화공정에서 기질의 농도는 2~10 %(w/w), 당화공정의 온도는 40~50 ℃, 당화공정의 pH는 4~5인 것을 특징으로 하는 중금속 오염토양 정화식물의 바이오매스를 원료로 한 생물학적 당화방법.

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