CN106367408A - Pet分解酶突变体、编码基因及其应用 - Google Patents

Pet分解酶突变体、编码基因及其应用 Download PDF

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杨海涛
段胤凯
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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Abstract

本发明公开了PET分解酶突变体、编码基因及其应用，PET分解酶突变体由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经点突变获得SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的氨基酸序列所示。本发明运用Overlap PCR方法对大肠杆菌分解酶基因进行定向进化，通过定点突变，获得PET分解酶突变体。以相同时间内分解产物的量表示，PET分解酶的突变体的酶活得到了提高。

Description

PET分解酶突变体、编码基因及其应用
技术领域
本发明属于酶的基因工程，具体地说涉及PET分解酶突变体、编码基因及其应用。
背景技术
PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)由于具有可塑性、透明性和持久性长期以来被大批量工业生产，仅2013年一年，全世界就生产出了约5600万吨PET塑料。由于自然界中缺乏可以降解PET的酶或者活性极低，PET塑料在自然界中难以被自然降解，成为了一种污染物，对环境产生了极大的影响。
PET分解酶ISF6_4831是角质酶的一种。角质酶是一种可以催化角质中酯基分解并产生大量脂肪酸单体的分解酶，是α/β分解酶家族中分子量较小的成员。角质酶分解酯基的催化活性类似于脂肪酶，但脂肪酶必须在油水界面上才有催化活性，而角质酶在均相中可以；此外，角质酶对以聚合形式存在的底物具有较高的活性。而PET正好是由对苯二甲酸和乙二醇通过脱水缩合反应产生的聚合物，正好适合作为角质酶的底物。
日本的科学家最近发现Ideonella sakaiensis 201-F6这种细菌中可以在PET塑料上生长并可以以PET塑料为唯一碳源。并且研究发现，这种细菌可以产生一种能分别PET的酶类，这也是目前世界上唯一在细菌中发现的能降解PET的酶类。相对于其它可以降解PET的角质酶，PETase还具有下列的优势：第一，PETase是第一个在原核生物中发现的可以降解PET的蛋白质。相较于原核细胞，真核生物中发现的蛋白大多需要内质网和高尔基体的折叠和许多修饰，这样的蛋白就很难将这种蛋白在原核生物中进行生产，在加上真核细胞的繁衍周期长，生长条件较为苛刻，故用原核细胞进行蛋白质的生产成本较低，较简便。所以在原核生物中发现PET分解酶(下面简称为PETase)无疑是对工厂化酶解塑料的一个推动。第二，PETase对于高结晶的PET塑料(hcPET)具有较好的降解效果，其它的可降解PET的酶如TfH、LCC、FsC都不能较快降解hcPET。故此，PETase在处理高结晶度的PET塑料片上具有明显的优势，而高结晶度的PET正好是饮料瓶、某些塑料袋等的主要成分。第三，PETase具有较低的最适温度，不需要加热至较高温度就能达到最佳酶活性，而其它的酶的最适温度普遍偏高。
虽然该PETase具有以上特点，但是该酶的对PET的绝对降解速率还是较低。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供PET分解酶突变体。
本发明的第二个目的是提供PET分解酶突变体的编码基因。
本发明的第三个目的是提供PET分解酶突变体的应用。
本发明的技术方案概述如下：
PET分解酶突变体，由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经点突变获得SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的氨基酸序列所示。
编码权利要求1的SEQ ID NO.8所示PET分解酶突变体的基因，是SEQ ID NO.10所述的核苷酸序列。
编码权利要求1的SEQ ID NO.9所示PET分解酶突变体的基因，是SEQ ID NO.11所述的核苷酸序列。
SEQ ID NO.8所示PET分解酶突变体或SEQ ID NO.9所示PET分解酶突变体在催化PET降解反应中的应用。
本发明的有益效果：本发明运用Overlap PCR方法对大肠杆菌分解酶基因进行定向进化，通过定点突变，获得PET分解酶突变体。以相同时间内分解产物的量表示，PET分解酶的突变体的酶活得到了提高。
附图说明
图1为PETase突变体J的相对酶活。
图2为PETase突变体M的相对酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
pET-21b为市售。
实施例1 pET-21b-PET分解酶突变体J的构建及应用：
化学合成如SEQ ID NO.1所示的pET-21bP核苷酸序列；
从pET-21bP核苷酸序列上剪下如SEQ ID NO.2所示的PETase基因并连接到pET-21b质粒中。
a)酶切体系
b)条件
i.目的基因酶切1h，37℃。
ii.质粒酶切了2h，37℃。
iii.酶切后80℃灭活5min。
将如SEQ ID NO.2所示的PETase基因连接在pET-21b中,得到pET-21b-PETase的核苷酸序列；
a)连接体系
b)条件：22℃，2h。
利用OverlapPCR技术对pET-21b-PETase的核苷酸序列进行突变；
配制Overlap PCR反应体系
a)质粒 10ng
b)Primer+ 1μL
c)Primer- 1μL
d)2xTransStart FastPfu PCR SuperMix 25μL
e)ddH2O定容至50μL
*引物设计：
SEQ NO.3F1:5’-AACGGTGGTAGCCATTTTTGTGCCAACAGC-3’
SEQ NO.4R1:5’-AAAATGGCTACCACCGTTGATTTCTAAG-3’
PCR扩增条件
得到PET分解酶突变体J的表达载体。经测序，验证结果表明突变成功，PET分解酶突变体J基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
将PET分解酶突变体J的表达载体转入表达宿主BL21(DE3)codon plus中。
向Overlap PCR产物中加入1μL DMT酶，37℃加热1h以消化不含有突变的模板链，然后转化至DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μL/mL的Amp)平板。生长12h后，从平板上挑出单个菌落放在LB液体培养基中培养8h，运用DNA纯化试剂盒获得突变质粒。
将质粒转入感受态大肠杆菌BL21(DE3)codon plus中并涂布于LB(含100μL/mL的Amp)平板。37℃培养8h后，挑单菌落放入含有1μL/mL Amp的LB培养液中培养4h，取出600μL菌液加入400μL 50％甘油中，放入-80℃冰箱中保存。
得到PET分解酶突变体J的表达菌株。
将PET分解酶突变体J的表达菌株进行传代培养，诱导其产生如SEQ ID NO.8所示目的蛋白(PET分解酶突变体J,简称PETase突变体J)，并分离提纯目的蛋白。
取5μL pET-21b-PETase突变体J于含有5mL LB培养液的试管中，加入5μL Amp。摇床中37℃，220rpm培养10h。将试管中的菌液倒入含有1L LB培养液的2L锥形瓶中，加入700μL Amp。37℃，220rpm在摇床中培养4h，待菌液变浑浊后16℃，220rpm降温1h，然后加入500μLIPTG诱导大肠杆菌产生目的蛋白。16℃，220rpm过夜培养12h。将菌液4000rpm，16℃离心20min，弃上清，将沉淀的大肠杆菌用药匙转移到烧杯中。
将大肠杆菌用高压破菌机破碎，再用超声破菌机破碎15min。
用高速离心机4℃，18000rpm离心30min，取上清倒入镍柱，孵育1h后加入200mL咪唑20洗去杂蛋白，用20mL咪唑250洗脱目的蛋白。
用10kDa的浓缩管盛装洗脱下来的蛋白质溶液，在离心机中4℃，3500rpm离心，并用pH9.0的缓冲液进行换液，即可制得溶解在pH9.0溶液中的PET分解酶突变体J的蛋白溶液。
对PET分解酶突变体J的蛋白进行酶活检测。
用PET分解酶突变体J的蛋白溶液配制出几种不同浓度的pH9.0的蛋白质溶液。
在EP管中每管分装一片处理好的PET塑料片，分别加入100μL上一步配好的不同浓度的蛋白质溶液，在220rpm，40℃摇床中反应一天。
反应后加入等量且适量终止液，并加热15min，15000xg离心15min，取上清液用高效液相色谱进行检测。如图1所示，PET分解酶突变体J酶活较野生型PET分解酶有显著提高。
实施例2 pET-21b-PET分解酶突变体M的构建及应用：
化学合成如SEQ ID NO.1所示的pET-21bP核苷酸序列；
从pET-21bP核苷酸序列上剪下如SEQ ID NO.2所示的PETase基因并连接到pET-21b质粒中。
a)酶切体系
b)条件
i.目的基因酶切1h，37℃。
ii.质粒酶切了2h，37℃。
iii.酶切后80℃灭活5min。
将如SEQ ID NO.2所示的PETase基因连接在pET-21b中,得到pET-21b-PETase的核苷酸序列；
c)连接体系
d)条件：22℃，2h。
利用OverlapPCR技术对pET-21b-PETase的核苷酸序列进行突变；
配制Overlap PCR反应体系
f)质粒 10ng
g)Primer+ 1μL
h)Primer- 1μL
i)2xTransStart FastPfu PCR SuperMix 25μL
j)ddH2O定容至50μL
*引物设计：
SEQ NO.5 F2:5’-CCTGTGAGAACGATACCATTGCCCCAGTTAAC-3’
SEQ NO.6 R2:5’-GTATCGTTCTCACAGGCAAAAATCAAGGTAGG-3’
PCR扩增条件
得到PET分解酶突变体M的表达载体。经测序，验证结果表明突变成功，PET分解酶突变体J基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
将PET分解酶突变体M的表达载体转入表达宿主BL21(DE3)codon plus中。
向Overlap PCR产物中加入1μL DMT酶，37℃加热1h以消化不含有突变的模板链，然后转化至DH5α感受态细胞。涂布于LB(含100μL/mL的Amp)平板。生长12h后，从平板上挑出单个菌落放在LB液体培养基中培养8h，运用DNA纯化试剂盒获得突变质粒。
将质粒转入感受态大肠杆菌BL21(DE3)codon plus中并涂布于LB(含100μL/mL的Amp)平板。37℃培养8h后，挑单菌落放入含有1μL/mL Amp的LB培养液中培养4h，取出600μL菌液加入400μL 50％甘油中，放入-80℃冰箱中保存。
得到PET分解酶突变体M的表达菌株。
将PET分解酶突变体M的表达菌株进行传代培养，诱导其产生如SEQ ID NO.9所示目的蛋白(PET分解酶突变体M,简称PETase突变体M)，并分离提纯目的蛋白。
取5μL pET-21b-PETase突变体M于含有5mL LB培养液的试管中，加入5μL Amp。摇床中37℃，220rpm培养10h。将试管中的菌液倒入含有1L LB培养液的2L锥形瓶中，加入700μL Amp。37℃，220rpm在摇床中培养4h，待菌液变浑浊后16℃，220rpm降温1h，然后加入500μLIPTG诱导大肠杆菌产生目的蛋白。16℃，220rpm过夜培养12h。将菌液4000rpm，16℃离心20min，弃上清，将沉淀的大肠杆菌用药匙转移到烧杯中。
将大肠杆菌用高压破菌机破碎，再用超声破菌机破碎15min。
用高速离心机4℃，18000rpm离心30min，取上清倒入镍柱，孵育1h后加入200mL咪唑20洗去杂蛋白，用20mL咪唑250洗脱目的蛋白。
用10kDa的浓缩管盛装洗脱下来的蛋白质溶液，在离心机中4℃，3500rpm离心，并用pH9.0的缓冲液进行换液，即可制得溶解在pH9.0溶液中的PET分解酶突变体M的蛋白溶液。
对PET分解酶突变体M的蛋白进行酶活检测。
用PET分解酶突变体M的蛋白溶液配制出几种不同浓度的pH9.0的蛋白质溶液。
在EP管中每管分装一片处理好的PET塑料片，分别加入100μL上一步配好的不同浓度的蛋白质溶液，在220rpm，40℃摇床中反应一天。
反应后加入等量且适量终止液，并加热15min，15000xg离心15min，取上清液用高效液相色谱进行检测。如图2所示，PET分解酶突变体M酶活较野生型PET分解酶有显著提高。

Claims (4)

1.PET分解酶突变体，其特征是由SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列经点突变获得SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9的氨基酸序列所示。
2.编码权利要求1的SEQ ID NO.8所示PET分解酶突变体的基因，其特征是SEQ IDNO.10所述的核苷酸序列。
3.编码权利要求1的SEQ ID NO.9所示PET分解酶突变体的基因，其特征是SEQ IDNO.11所述的核苷酸序列。
4.权利要求1的SEQ ID NO.8所示PET分解酶突变体或SEQ ID NO.9所示PET分解酶突变体在催化PET降解反应中的应用。
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