WO2021232124A1 - Uso de monooxigenases líticas de polissacarídeos, composição enzimática contendo-as e método de degradação de polímeros plásticos - Google Patents

Uso de monooxigenases líticas de polissacarídeos, composição enzimática contendo-as e método de degradação de polímeros plásticos Download PDF

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Definitions

  • the present invention falls within the major chemical and environmental areas, specifically in the areas of biodegradation, bioremediation and biofragmentation.
  • Plastic is found in several areas of industry, having diverse applications, such as in food packaging, pharmaceuticals, toys, general household products, in construction and decoration and numerous other industries. Each plastic material has a different chemical composition, some of them being reusable and others with a complex recycling process.
  • thermoplastics are classified into two large distinct groups according to processing and thermal behavior: thermoplastics and thermosets.
  • the former are moldable, as they soften when heated; and the latter are not easily moldable by heating (Spinacé and de Paoli, The technology of polymer recycling. Qu ⁇ mica Nova, 2005, 28 (1), 65-72).
  • plastics that are produced and used for various commercial purposes are polyethylene terephthalate (PET or PETE or polyester), high density polyethylene (HDPE or HDPE), polyvinyl chloride (PVC), low-density polyethylene density (LDPE or LDPE), polypropylene (PP), polystyrene (PS, Styrofoam), polyurethane (PU), polytetrafluoroethylene (Teflon) and other plastics that can be layered or blended with other types of polyesters.
  • PET or PETE or polyester high density polyethylene
  • PVC polyvinyl chloride
  • LDPE or LDPE low-density polyethylene density
  • PP polypropylene
  • PS polystyrene
  • PS Styrofoam
  • PU polyurethane
  • Teflon polytetrafluoroethylene
  • PET represents 5.9% of national consumption.
  • the PET recycling rate in Brazil was 58% (Abiplast 2019, available at http://www.abiplast.org.br/wp-content/uploads/2019/10/perfil2018-web_VC.pdf; https ://sidra.ibge.gov.br/tabela/1202#resultado , accessed April 2, 2020).
  • PET is a semi-aromatic thermoplastic. It is a semi-crystalline, hygroscopic and colorless polymer with excellent coating capacity, good tensile strength and impact resistance. It is one of the most abundant and manufactured polyester plastics in the world, having numerous applications: prefabricated containers, thermoformed products, textile, furniture, medical implants and the automotive, aviation and aerospace industries.
  • PET One of the main applications of PET is in the field of packaging such as bottles or films, due to its excellent water, gas and moisture dam properties, as well as low permeability (Koshti, Mehta and Samarth, Biological Recycling of Polyethylene Terephthalate: A mini-review, Journal of Polymers and the Environment 2018, 26, 3520-3529).
  • the recycling of plastics can be classified into primary, secondary, tertiary and quaternary.
  • the primary is the reintroduction of polymer scraps and fragments in the cycle to produce similar products with characteristics similar to those of the original products (Pinto, AG Municipal Garbage: Integrated Management Manual, IPT/CEMPRE 2018, 4aed, 351p).
  • the secondary deals with the mechanical reprocessing of simple polymeric materials and involves the following steps: crushing, separation, washing and extrusion (Al-Salem, Lettieri and Baeyens, The valorization of plastic solid waste (PSW) by primary to quaternary routes: From re- use to energy and Chemicals, Progress in Energy and Combustion Science 2010, 36, 103-129).
  • Another also known route of plastic degradation involves exposure to UV light, in addition to mechanical changes caused by waves and winds or crushing in rocks and marine sediments, which eventually break larger plastics into pieces smaller ones known as micro- (>5 mm) and nanoplastics (0.1 pm).
  • these smaller particles are likely to incorporate into the food chain and end up in the intestine of animals, including man, although it has not yet been determined in a case study (Danso, Chow and Streit, Plastics: Environmental and biotechnologycal pespectives on microbial degradation Applied and Environmental Microbiology 2019, 85 (19), 1095-1109).
  • PET which is a functional unit between terephthalic acid (AT) and ethylene glycol (EG) is, as a rule, recycled in the following ways: 1) the material is granulated, cleaned and extruded to become again a PET bottle; or 2) PET is broken down into its monomers that can be repolymerized. Both approaches are conducted at high temperatures.
  • the main recycling methods require conditions of high temperature and high pressure (chemical methods) or consume a large amount of energy and/or generate a large amount of toxic and harmful substances to the environment, which even results in secondary (biological) pollution.
  • the microbial degradation of polymers is a slow process. This high strength is mainly due to the high molecular weight of the fiber, the strong C-C interactions and the extremely hydrophobic surface, which is very difficult to be attacked by enzymes.
  • polymers have different molecular orderings (eg amorphous and crystalline forms), resulting in different levels of degradability (Danso, Chow and Streit, Plastics: Environmental and biotechnologycal pespectives on microbial degradation. Applied in Environmental Microbiology 2019, 85 (19) , 1095-1109).
  • the patent document JP2000143868 describes the method of degradation of aromatic polyester with the microorganisms Trichosporon FEM BP-6445 and Arthrobacter FERM BP-6444.
  • the patent document W02005019439 describes the genus Rhizobium, in particular, Rhizobium sp. OKFI-03, having the ability to degrade aromatic polyesters.
  • JP20081999957 describes the 201 -F6 gram negative bacillus isolated from soil with aromatic polyester degradation activity.
  • Thermobifida alba Cut1 ADV92525
  • Thermobifida fusca Cut2 CBY05530
  • Thermobifida fusca Cut1 AET05798
  • Thermobifida halotolerans Serine hydrolase AFA45122
  • Saccharomonospora viridis Cutinase BA042836 Cutinase
  • Thermomonospora curvata triacylglycerol lipase (WP 012851645), LCC (AEV21261), Ideonella sakaiensis PETase (GAP38373), Polyangium brachysporum triacylglycerol lipase (WP047194864), Vi brio gazogenes lipase (WP02574Acticactic) (spiral anatomical lipase (WP0257419718894), Polyangium brachysporum lipase (WP047194864), , Ideonella sakaiensis MFIETase (WP 082368715), Humicola insolens cutinase (40YY) and Fusarium oxysporum cutinase (5AJFI) degrade polyethylene substrates.
  • Arthrobacter sp NylE WP079941038
  • Arthrobacter sp NylA BAA05090
  • Arthrobacter sp NylB CAA24927
  • Arthrobacter sp NylC YP001965068
  • Pseudomonas oleovorans AHs (CAB54050), Pseudomonas fluorescens StyB (CAB06823), Pseudomonas fluorescens StyA (CAB06823) and Pseudomonas fluorescens StyC (CAB06825) degraded polystyrene (PS), whereas degradation of polyurethane (PU237emonas) can occur with Pseudomonas (PU237emonas) ), Pseudomonas fluorescens PueB (AAY92474) and Pseudomonas fluorescens PulA (AAF66684) (Danso, Chow and Streit, Plastics: Environmental and biotechnological perspectives on microbial degradation. Applied Environmental Microbiology 2019, 85 (19), 1095-1109).
  • PET polyethylene terephthalate
  • enzymatic surface modification is possible with several enzyme families, such as lipases, carboxylesterases, cutinases and proteases.
  • obtaining monomers from PET requires substantial degradation of PET components; therefore, only a limited number of cutinases, recognized as PETases, act by releasing monomers from the PET.
  • the first PET hydrolase was discovered by Muller et al. (Enzymatic degradation of poly(ethylene terephthalate): rapid hydrolyse using hydrolase from T. fusca. Macromolecular Rapid Communications 2005, 26, 1400-1405).
  • lytic polysaccharide monooxygenases constitute a recently identified group of enzymes. These enzymes were originally classified as a GH (glycosyl hydrolase) or CBM (carbohydrate binding module) family, and now belong to auxiliary activity enzymes (AAs), identified under classes AA9 - AA11 and AA13 - AA16 in the databases CAZy. It is known that the presence of LPMOs in an enzyme cocktail can increase the activity of canonical GHs by up to two orders of magnitude. In addition to cellulose, LPMOs oxidize a wide range of saccharide-based polymers, including hemicellulose, starch and chitin.
  • LPMOs exhibit substrate promiscuity.
  • LPMOs increase the performance of GHs by acting in regions where GHs do not act by increasing the repertoire of extremities to be recognized by canonical GHs (Chen et al. Enzymatic degradation of plant biomass and synthetic polymers. Nature Reviews Chemistry 2020, 4: 114 -126).
  • LPMOIOA is an LPMO obtained from Kitasatospora papulosa and cloned in Escherichia coli, having been described its use to degrade lignocellulosic biomass (Corrêa et al, An actinobacteria lytic polysaccharide Mono-oxygenase acts on both cellulose and xylan to boost biomass saccharification Biotechnology for Biofuels 2019, 12:117).
  • glycosyl hydrolase 61 formerly known as AA9, coming from different genera of bacteria (gram positive: Bacillus sp. and Streptomyces sp. or gram negative: E.coli or Pseudomonas sp.) and fungi ( Candida , Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces or Yarrowia or filamentous fungi) associated with cutinases for the treatment of polyester-based fabrics (PET). The inventors demonstrated that the association of enzymes presents greater tissue degradation than with cutinases alone.
  • the present invention describes a new use of enzymes belonging to the family of lytic polysaccharide monooxygenases (Lytic Polysaccharide Mono-oxygenases - LPMOs). More precisely, the present invention describes the use of LPMOs in the degradation of polyethylene, more specifically, in the degradation of polyethylene terephthalate (PET).
  • the LPMOs of the present invention are isolated from microorganisms, preferably isolated from bacteria of the genus Kitasatospora sp. and from fungi of the genus Aspergillus sp.
  • the present invention provides an enzyme composition for use in degrading polyester comprising at least one lytic polysaccharide monooxygenase of the present invention and an acceptable carrier.
  • the composition of the present invention further comprises a cutinase, more specifically a PETase.
  • the present invention provides the use of the enzymatic composition of the present invention in the degradation of polyethylene terephthalate (PET).
  • PET polyethylene terephthalate
  • the present invention provides a method of degradation of PET comprising the use of at least one lytic polysaccharide monooxygenase of the present invention.
  • the method of the present invention further comprises employing a cutinase, more specifically a PETase.
  • the present invention provides the use of at least one lytic polysaccharide monooxygenase in the enzymatic degradation of polyester, wherein said lytic polysaccharide monooxygenase degrades said polyester without the aid of at least one canonical enzyme.
  • the lytic polysaccharide monooxygenases of the present invention are used.
  • Figure 1 shows the expression vector for K LMOIOA (or LPMO AA10) from Kitasatospora papulosa (A) and A/LPM09A (or LPMO AA9) from Aspergillus fischeri (B).
  • Figure 2 shows the protein profile of KpLPMOIOA (A), At LPM09A (B) and /sPETase (C) obtained from two chromatographic steps.
  • Figure 3 shows images obtained by Atomic Force Microscopy of PET Mylar films treated with LPMOs.
  • A untreated control;
  • B film treated with KpLPMOIOA;
  • D film treated with A/LPMO10A.
  • Figure 4 shows the images obtained by Atomic Force Microscopy of PET bottles treated with LPMOs.
  • A untreated control;
  • B PET treated with KpLPMOIOA;
  • C PET treated with A/LPM09A.
  • Figure 5 shows the spectra obtained by the XPS technique of the control (A), PET bottle after enzymatic degradation by A/LPM09A.
  • Figure 6 shows the prediction of possible products generated by LPMOs from PET.
  • Figure 7 shows the fluorescence emission spectra of PET bottle cards treated and not treated with the enzymes of the present invention.
  • A inner face.
  • B external face. The material was excited at 340 nm.
  • Figure 8 shows the results of the synergism tests between A/LPM09A (LPMO) and /sPETase (PETase) on PET, with the release measures of mono (2-hydroxyethyl) terephthalate (MHET) and terephthalic acid (TPA).
  • A /sPETase activity in PET from crushed bottle and block.
  • B MHET Release and TPA by /sPETase from ground PET pretreated with different concentrations of A/LPM09A.
  • C Release of MHET and TPA by /sPETase in reactions with simultaneous addition of /sPETase and A/LPM09A at different concentrations.
  • D /sPETase activity on N-acetate and N-butyrate in the absence and presence of ascorbic acid.
  • Figure 9 presents topographic images of atomic force microscopy of juice bottle and plastic bag, both HDPE, treated with AscAC (E and G, control) and in the presence of At LPM09A (F and H). Arrows point to erosions on the material caused by enzymatic action.
  • the present invention describes a new use of enzymes belonging to the family of lytic polysaccharide monooxygenases (Lytic Polysaccharide Monooxygenases - LPMOs).
  • enzymes from the family of LPMOs are known only for their activity of oxidizing polysaccharides, such as cellulose, hemicellulose, starch and chitin.
  • LPMOs have polyethylene degradation activity, which is surprising in light of the activities of these enzymes described so far, demonstrating their use in the degradation of plastics, more precisely in the degradation of polyethylene terephthalate (PET ).
  • the inventors of the present invention demonstrated that the LPMOs of the present invention exhibit PET degradation activity in isolation, that is, without the need for the concomitant use of canonical enzymes such as cutinases or PETases.
  • the inventors of the present invention have demonstrated that the association of the LPMOs of the present invention with canonical enzymes has a surprising synergistic effect on the degradation of PET.
  • the inventors of the present invention also developed a method of degradation of polyethylene using the LPMOs of the present invention, which occurs at 30-37 °C, being advantageous over other methods of enzymatic degradation of polyethylene described in the state of the art.
  • the LPMOs of the present invention comprise an amino acid sequence that exhibits at least 60% identity with the sequences SEQ ID NQ 2 or SEQ ID NQ 5.
  • the LPMOs the present invention comprising at least 60% identity to SEQ ID NO : 2 sequence Q or Q SEQ ID NO: 5 can be isolated from bacteria or fungi.
  • bacterial LPMOs include those from Bacillus sp., Burkholderia sp., Caldibacillus sp., Cellvibrio sp., Enterococcus sp., Hahella sp., Jonesia sp., Listeria sp., Micromonospora sp., Nocardiopsis sp., Photorhabdus sp., Serratia sp., Teredinibacter sp., Thermobifida sp.
  • Streptomyces sp. for example, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans,
  • Fungal LPMOs include those from Gloeophyllum sp., Heterobasidium sp., Pleurotus sp., Pestalotiopsis sp., Phanerochaete sp., Podospora sp., Lentinus sp., Myceliophythora sp., Neurospora sp., Trametes sp., Thermoascus sp. , Thermothelomyces sp.
  • Penicillium for example Penicillium oxalicum, Penicillium subrubescens, Penicillium rolfsii, Penicillium brasilianum, Penicillium antarcticum, Penicillium arizonense, Penicillium steckii, Penicillium vulpinum, Penicillium expansum, Penicillium camelium PeniciHium coprophilum, PeniciHium roqueforti, PeniciHium polonicum, PeniciHium maci, Penicillium rubens, Penicillium griseofulvum, Penicillium digitatum, Penicillium italicum and PeniciHium nalgiovense more specifically, Aspergillus sp.
  • Penicillium for example Penicillium oxalicum, Penicillium subrubescens, Penicillium rolfsii, Penicillium brasilianum, Penicillium antarcticum, Penici
  • Aspergillus udagawae Aspergillus clavatus, Aspergillus homomorphus, Aspergillus aculeatinus, Aspergillus fijiensis, Aspergillus brunneoviolaceus, Aspergillus uvacrum, Aspergillus aculeatus, Aspergillus tanneri, Aspergillus brasilus, Aspergillus, Aspergillus, Aspergillus, Aspergillus, Aspergillus, Aspergillus, Aspergillus, Aspergillus, pipe japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus kawachii, Aspergillus saccharolyticus, Aspergillus neoniger, Aspergillus glaucus, Aspergillus ruber, Aspergillus tubingensis, Aspergillus le
  • the LPMOs of the present invention are preferably derived from bacteria of the genus Kitasatospora sp. and fungi of the genus Aspergillus sp.
  • the enzymes of the present invention come from the bacterium Kitasatospora papulosa, such as the enzyme KpLPMOIOA, and the filamentous fungus Aspergillus fischeri, such as the enzyme A/LPM09A.
  • the polypeptide chain of KpLPMOIOA consists of amino acids 39 to 224 of SEQ ID No. 2 covering the N-terminal histidine (H39) typical of LPMOs and H146 and Y215 related to the coordination of the metal ion, which may be a copper.
  • the polypeptide chain of At LPM09A consists of amino acids 20-247 of SEQ ID No. 5 spanning the N-terminal histidine (H20) typical of LPMOs and H105 and Y194 possibly related to metal ion coordination, which may be a copper .
  • the enzymes of the present invention can be obtained by transforming expression vectors into cells using steps known in the art.
  • the enzymes of the present invention are expressed in Escherichia coli cells containing suitable expression vectors grown in suitable media and under suitable conditions and are extracted by means of lysis using an appropriate protocol.
  • the enzymes of the present invention are then obtained using separation techniques such as, for example, affinity chromatography, and the protein profile of the fractions obtained is evaluated on an SDS-PAGE gel. Additional steps for purification of the enzymes of the present invention can be applied by employing suitable techniques such as gel filtration chromatography using a suitable column.
  • the present invention provides an enzyme composition for use in polyester degradation which comprises at least one lytic polysaccharides monooxygenase of the invention (SEQ ID NO : Q 2 or SEQ Q ID NO 5) (LPMO), and an acceptable vehicle.
  • SEQ ID NO : Q 2 or SEQ Q ID NO 5) LPMO
  • an aqueous vehicle that keeps the enzymes of the present invention in suspension or solution when in suitable concentration, which may contain, in addition to water, other additives, such as preservatives, agents or buffer systems etc.
  • the LPMOs of the present invention are present in a concentration between approximately 0.001% and approximately 0.1% by total weight of the composition of the present invention, preferably between approximately 0.002% and approximately 0.005% by total weight of the composition.
  • compositions of the present invention contain at least one LPMO of the present invention, which may contain an isolated enzyme or an association of enzymes within the context of the invention.
  • composition of the present invention additionally comprises a cutinase, more specifically a PETase.
  • Cutinases are enzymes related to the degradation of the aliphatic polyester cutin, found in the plant cuticle. All PET hydrolases (PETases) characterized so far belong to the cutinases family. PETases have a broader catalytic center when compared to cutinases, probably related to the accommodation of semi-aromatic crystalline polyesters. Polyesterases act preferentially in amorphous regions of PET, as opposed to LPMOs that act preferentially in crystalline regions in the polymeric substrates where its activity was previously reported. Therefore, the joint action of LPMO-PETase can be advantageous as reported for LPMOs-GHs.
  • polyesters and polyamides recognized by cutinases include poly(L-lactic acid) (PLA), polyethylene furanoate (PEF), polybutylene adipate-co-terephthalate (PBAT), polycaprolactone (PCL), polybutylene succinate (PBS), polyamide 6.6 and polyethylene terephthalate (PET).
  • PLA poly(L-lactic acid)
  • PEF polyethylene furanoate
  • PBAT polybutylene adipate-co-terephthalate
  • PCL polycaprolactone
  • PBS polybutylene succinate
  • PET polyamide 6.6
  • PET polyethylene terephthalate
  • Cutinases with PET hydrolase (PETase) activity to be employed in the composition of the present invention may be of fungal or bacterial origin.
  • Those of fungal origin include those from Humicola sp., Fusarium sp., Aspergillus sp. and Penicillium sp.
  • Bacterial include those from Acidovorax sp., Rhizobacter sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Thermobifida sp., Saccharomonospora sp., Clostridium and Ideonela sp., specifically, Ideonela sakaiensis.
  • the concentration of PETase in the composition of the present invention ranges between approximately 0.0005% and approximately 0.05% by total weight of the composition, preferably between approximately 0.001 and approximately 0.0025% by total weight of the composition.
  • the present invention provides the use of the enzymatic composition of the present invention in the degradation of plastic polymers, more specifically, polyethylene.
  • plastic waste used as substrate for enzymatic degradation can be selected from HDPE, PVC, LDPE, PP, PS, PC, PU, ABS, PE and PET, preferably PU, ABS, PE and PET, more preferably ABS, PE and PET, even more preferably PE and PET, and even more preferably PET.
  • the present invention provides a method of degradation of PET comprising the use of at least one lytic polysaccharide monooxygenase of the present invention.
  • the PET degradation method of the present invention comprises adding at least one LPMO of the present invention in an aqueous medium containing substrate.
  • the concentration of LPMO to be used depends on the origin and conditions of pH and temperature of the reaction, being initially standardized according to methods that are familiar to the person skilled in the art.
  • the concentration of LPMO in the reactions of the present invention is between 0.01-50 milligrams of LPMO per gram of PET, preferably 1-30 milligrams of LPMO per gram of PET, preferably 2-20 milligrams of LPMO per gram of PET.
  • the substrate concentration in the form of PET in the process of the present invention varies between 10-80% of the reaction, preferably 20-70% of the reaction, preferably 40-60% of the reaction, preferably 30-50% of the reaction.
  • the aqueous medium additionally comprises a buffer solution.
  • the concentration of the buffer solution is between 0.01 -0.5M, preferably 0.03-0.25M, preferably 0.05-0.1M.
  • the PET degradation method of the present invention comprises an additional step, where an electron donor substance is added to LPMO.
  • the electron donor molecule for LPMO can be selected from ascorbic acid and its mixtures.
  • the concentration of the electron donor molecule for LPMO varies between 0.3mM-2mM, preferably 0.8-1.5mM, preferably 0.5-1 mM.
  • the reaction time of the present invention is usually between 5 minutes-48 hours, preferably 10 minutes-48 hours, more preferably 30 minutes-48 hours, and even more preferably 60 minutes-48 hours.
  • the reaction pH is selected according to the origin of the LPMO employed and is previously standardized, and may be between pH 4.0-9.0, preferably between pH 5.0-8.0 and, more preferably, between pH 5.5-7.5.
  • the reaction temperature is selected according to the origin of the LPMO employed and is standardized in advance.
  • the reaction is conducted at temperatures between 20-60 ° C, preferably 25-55 ° C, preferably 30-50 ° C.
  • the temperature employed in the method of the present invention is below 40 ° C, preferably 37 Q C .
  • the method of the present invention further comprises employing a cutinase.
  • the concentration of PETase to be used depends on the reaction conditions, being initially standardized.
  • the concentration of PETase in the reactions of the present invention can be between 0.005-25 milligrams of PETase per gram of PET, preferably 0.5-15 milligrams of PETase per gram of PET, preferably 1-10 milligrams of PETase per gram of PET.
  • LPMO lytic polysaccharide monooxygenase
  • PETase mixture with hydrolase
  • STEP 1 The bacteria K. papulosa (DSM4643) had the genomic DNA extracted and used for amplification of the gene of interest KpLPMOIOA (SEQ ID N° 1, nucleotide 115-672), which encodes the enzyme AA10 KpLPMOIOA, with primers KpF and KpR (Table 1). The amplification product was used for a new PCR reaction with primers KpFpET22b and KpRpET22b (Table 1) to add homology tails to the pET22b vector. The gene was cloned into the pET22b(+) vector immediately after the sequence encoding the peB signal peptide.
  • STEP 2:0 AfLPM09A gene (SEQ ID No. 3, nucleotide 58-741), which encodes the enzyme AA9 At LPM09A, has been added sequence encoding pel B (SEQ ID No. 4, nucleotide 1-66) and had the codons optimized for expression in Escherichia coli.
  • peB + A ⁇ LPM09A was synthesized and cloned in the restriction sites for the enzymes Nde ⁇ and Xho ⁇ in the vector pET21a(+) by Genscript (Piscataway).
  • STEP 3 The /sPETase gene (GenBank: BBYR01000074.1), which encodes the PETase enzyme in Ideonella sakaiensis, had the codons optimized for expression in E. coli. /sPETase was synthesized and cloned into the restriction sites for the Nde ⁇ and Xho ⁇ enzymes in the pET21 b(+) vector by Genscript (Piscataway).
  • STEP 4 The vectors pET22b(+)-KpLPMO10A and pET21a(+)-AfLPM09A were (separately) transformed into Escherichia coli Shuffle ® cells. The cells were cultivated in TB medium and added with IPTG to promote the expression of KpLPMOIOA (SEQ ID No. 2, amino acid 39-224) or A/LPM09A (SEQ ID No. 2, amino acid 20-247) proteins for 16 h 18 °C/250 rpm. Cells were centrifuged and lysed by osmotic shock protocol. Supernatants obtained from lysis were loaded onto His-affinity column. Trap 5mL (GE) for chromatography.
  • KpLPMOIOA SEQ ID No. 2, amino acid 39-224
  • A/LPM09A SEQ ID No. 2, amino acid 20-247
  • STEP 1 The vector pET21 b(+)-/sPETase was transformed into Escherichia coli BL21(DE3) cells. Cells were cultivated in LB medium and added with IPTG to facilitate expression of /sPETase for 16 h at 18°C/250 rpm. Cells were centrifuged and lysed with the aid of lysozyme and sonicator. Supernatants obtained from lysis were loaded onto 5ml His-Trap affinity column (GE) for chromatography. The protein profile of the fractions obtained by affinity chromatography was evaluated on an SDS-PAGE gel.
  • GE His-Trap affinity column
  • Fractions containing proteins of the expected size were pooled, concentrated and used for gel filtration chromatography using HiLoad Superdex G-75 16/60 column. Fractions containing pure proteins of the expected size (evaluated by SDS-PAGE) were pooled, concentrated and evaluated for concentration (mg protein/mL) and used in further experiments.
  • STEP 1 PET, Mylar and bottle were cut into dimensions of 0.6 cm x 0.4 cm with the aid of scissors. Subsequently, they were washed with 1 mL of Milli-Q water with the aid of a pipette and subjected to ultrasound for 5 minutes. This procedure was performed 3 times. The plastics were dried in a stream of N 2 for 10-15 minutes and stored for later use.
  • STEP 1 Tests that help direct detection of products released by LPMOs from plastic polymers are not available.
  • the reaction conditions initially adopted are the same as those used for (hemi)cellulosic substrates. Enzyme reactions were performed in 2 ml Eppendorf tubes containing PET (Mylar or PET bottle), 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 6.0, 20 mg LPMOIOA or A/LPM09A per gram of PET. After 10 minutes at 37°C, reactions were added with 1 mM ascorbic acid and incubated at 37°C, 850 rpm for 48 hours.
  • Example 5 Characterization measurements of the polyester under study a. Atomic force microscopy
  • the genes encoding the KpLPMOIOA (AA10) protein (SEQ ID NO: Q 1) and A / LPM09A (AA9) (SEQ ID NO : Q 2) were isolated from papular Kitasatospora bacteria and filamentous fungus Aspergillus fischeri, respectively .
  • Kitasatospora and Streptomyces have similar morphologies, but differ in cell wall composition, characterizing Kitasatospora as a distinct group among Streptomyces.
  • Kitasatospora proteins can be characterized as belonging to Streptomyces sp. in view of the high amino acid sequence identity between the two genera.
  • KpLPMOIOA, LPM09A Ac (SEQ ID NO: 1 Q 5) and / sPETase were expressed by transformed E.coli cells with the vector pET22b (+) - KpLPMOIOA, pET21a (+) - A / LPM09A ( Figure 1) and pET21a(+)-/sPETase, respectively and purified by two chromatographic steps ( Figure 2).
  • LPMOs introduce an oxygen atom onto carbon 1 (C1) or carbon 4 (C4) of the glucose molecule when cellulose is used as a substrate resulting in the release of aldonic acid and ketoaldose, respectively. Furthermore, some LPMOs have been shown to be able to release a mixture of oxidized products in both C1 and C4 from the same substrate.
  • Figure 6 Based on the products released by LPMOs from cellulose, Figure 6 highlights the possible products released from the PET polymer by LPMOs.
  • Fluorescence emission spectra of PET bottle cards treated and not treated with the enzymes of the present invention were obtained at room temperature in a Hitachi F-4500 FL spectrophotometer, with excitation at 340 nm and collecting the emission between 360 -550 nm.
  • the peaks at 370 nm (excimer) and 390 nm (ground state dimer) recorded on cards treated with LPMO excited at 340 nm showed reduced emission compared to the control treated with AscAc, indicating the occurrence of scission of the PET chain.
  • No decrease in peak emissions of 370/390 was observed when exciting the outer face (exposed to air) of the LPMO-treated PET bottle, which agrees with the atomic force microscopy data discussed above.
  • A/LPM09A and /sPETase were assessed by non-concomitant or concomitant addition of enzymes to reactions containing PET as a substrate (8mg).
  • PET powder was obtained by grinding the PET bottle in a ball mill (Tecnal).
  • the substrate was pretreated with A ⁇ LPM09A (0.5, 2 or 4 mM) following the same conditions outlined in “Enzyme Assays - LPMO”.
  • the supernatant was boiled and the residual PET was washed with Milli-Q water and sonicated three times (10 min each).
  • /sPETase (0.05 mM) was added to the supernatant or to the residual PET and the reactions were performed in 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 7.2, at 30oC / 400 rpm / 120 h.
  • LPM09A and /sPETase were added simultaneously to reactions containing PET powder.
  • the concentration of Ai LPM09A varied (0.05-4 mM) while the concentration of /sPETase was kept fixed (0.05 mM) in 0.05 M sodium phosphate buffer, pH 6.0, 37oC / 850 rpm / 120 H.
  • the PET powder was pretreated with A/LPM09A + AscAc (pH 6.0 / 37 °C / 48 h), washed / sonicated three times and added with /sPETase (pH 7.2 / 30 °C / 120 h).
  • Pretreatment with 0.5, 2 and 4 mM A/LPM09A + AscAc improved MHET release by 20, 16 and 23%, respectively, and TPA by 34, 64 and 49%, respectively, by IsPETse.
  • HDPE high (HDPE) and low density (LDPE) polyethylenes were evaluated as a substrate for the activity of A/LPM09A.

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Abstract

A presente invenção trata da nova atividade da composição enzimática contendo monooxigenases líticas de polissacarídeos (Lytic Polysaccharide Mono-oxigenases – LPMOs) bacterianas (Auxiliary Activity 10, AA10) e/ou fúngicas (Auxiliary Activity 9, AA9) para a degradação de polietileno tereftalato (PET) e polímeros plásticos relacionados. Os genes que codificam KpLPMO10A (AA10) e AfLPMO9A (AA9) foram isolados a partir dos micro-organismos Kitasatospora papulosa e Aspergillus fischeri, respectivamente. Metodologias como microscopia de força atômica (MFA) e espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X (X-ray photoelectron spectroscopy ou XPS) detectaram alterações na morfologia e na composição química superficial do PET encontrado em garrafas de líquidos quando tratados com LPMOs. As condições brandas de temperatura empregadas durante a reação LPMO-PET favorecem a aplicação dessas enzimas no auxílio a enzimas canônicas (PETases) para desconstrução de plásticos favorecendo a economia circular do PET.

Description

USO DE MONOOXIGENASES LÍTICAS DE POLISSACARÍDEOS, COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA CONTENDO-AS E MÉTODO DE DEGRADAÇÃO DE POLÍMEROS
PLÁSTICOS
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] Este pedido contém uma listagem de sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada aqui por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[0002] A presente invenção se insere nas grandes áreas química e ambiental, especificamente nas áreas de biodegradação, biorremediação e biofragmentação.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0003] O plástico é encontrado em várias áreas da indústria, tendo aplicações diversas, tais como em embalagens de alimentos, produtos farmacêuticos, brinquedos, produtos de uso geral doméstico, na construção civil e decoração e inúmeras outras indústrias. Cada material plástico apresenta composição química distinta, sendo alguns deles reutilizáveis e outros com complexo processo de reciclagem.
[0004] Os polímeros plásticos são classificados em dois grandes grupos distintos de acordo com o processamento e comportamento térmico: os termoplásticos e os termofixos. Os primeiros são moldáveis, por amolecer quando aquecidos; e os segundos, não são facilmente moldáveis por aquecimento (Spinacé e de Paoli, A tecnologia da reciclagem de polímeros. Química Nova, 2005, 28 (1), 65-72).
[0005] Dentre os plásticos que são produzidos e utilizados para diversos fins comerciais, encontram-se o polietileno tereftalato (PET ou PETE ou poliéster), polietileno de alta densidade (HDPE ou PEAD), cloreto de polivinila (PVC), polietileno de baixa densidade (LDPE ou PEBD), polipropileno (PP), poliestireno (PS, isopor), poliuretano (PU), politetrafluoroetileno (Teflon) e outros plásticos que podem ser estratificados ou misturados com outros tipos de poliésteres.
[0006] Um levantamento realizado em 2018 mostrou que os principais materiais plásticos consumidos no Brasil são o PP (20,3%), PEAD (13,5%) e PEBD (11,4%). O PET representa 5,9% do consumo nacional. Em 2012, a taxa de reciclagem do PET no Brasil era de 58% (Abiplast 2019, disponível em http://www.abiplast.org.br/wp-content/uploads/2019/10/perfil2018-web_VC.pdf; https://sidra.ibge. gov.br/tabela/1202#resultado , acesso 02 de abril de 2020).
[0007] O PET é um termoplástico semi-aromático. Trata-se de um polímero semi-cristalino, higroscópico e incolor com excelente capacidade de revestimento, boa resistência à tração e resistência ao impacto. É um dos plásticos de poliéster mais abundantes e fabricados mundialmente, tendo inúmeras aplicações: contêineres pré-fabricados, produtos termo-formados, setor têxtil, mobílias, implantes médicos e indústrias de automóveis, aviação e aeroespacial.
[0008] Uma das principais aplicações do PET está no campo de embalagens como garrafas ou filmes, devido às suas excelentes propriedades de barragem de água, gás e umidade, além de baixa permeabilidade (Koshti, Mehta e Samarth, Biological Recycling of Polyethylene Terephthalate: A mini-review, Journal of Polymers and the Environment 2018, 26, 3520-3529).
[0009] Desde que o setor de plástico surgiu, a produção desse produto alcançou um total de 8,3 bilhões de toneladas no mundo e, desse montante produzido, a maioria é usada apenas uma vez e imediatamente descartada, em geral, em aterros sanitários.
[0010] Em 2018, a Organização das Nações Unidas (ONU) iniciou um movimento de conscientização global sobre o descarte de objetos plásticos no meio ambiente e seus efeitos. Um dos principais agravantes da poluição causada por materiais plásticos ocorre devido à alta meia-vida desse material que, por vezes, leva mais de 200 anos para se decompor na natureza, o que acarreta um forte impacto ambiental, principalmente quando descartado em oceanos. No ambiente marinho, o plástico afeta os seres desse ecossistema ao alterar ciclos bioquímicos inerentes à flora marinha devido ao bloqueio da penetração de oxigénio e luz no mar. Além disso, tartarugas e peixes podem vir a se alimentar de material plástico, levando-os a óbito. Cerca de 91 % do plástico utilizado mundialmente não é reciclado. [0011] Segundo dados do Banco Mundial (2018), o Brasil é o quarto maior produtor de resíduos plásticos no mundo, com 11 ,3 milhões de toneladas, ficando atrás apenas dos Estados Unidos (70 milhões de toneladas), China (54,7 milhões de toneladas) e índia (19,3 milhões de toneladas). Desse total de resíduos gerados, mais de 10,3 milhões de toneladas são coletadas (91 %), mas apenas 145 mil toneladas (1 ,28 %) são efetivamente recicladas, considerado um dos menores índices da pesquisa e bem abaixo da média global de reciclagem do plástico, que é de 9 %. Geralmente, os resíduos são destinados de forma irregular, onde as cooperativas trabalham com pouca eficiência, já que cerca de 10 % dos resíduos que recebem é rejeito não reaproveitável (Kaza et al. Word Bank Group 2018, What a waste 2.0 - A Global Snapshot of Solid Waste Management to 2050, v.1 , 275p).
[0012] Mesmo nas usinas de reciclagem, há perdas durante a categorização dos tipos de plásticos por estarem contaminados, serem multicamadas ou de baixo valor. O destino de 7,7 milhões de toneladas de plástico é o aterro sanitário; enquanto outros 2,4 milhões de toneladas são descartados de forma irregular, sem qualquer tipo de tratamento, em vazadouro a céu aberto.
[0013] A reciclagem de plásticos pode ser classificada em primária, secundária, terciária e quaternária. A primária é a reintrodução de sucatas e fragmentos de polímeros no ciclo para produção de produtos similares com características semelhantes às dos produtos originais (Pinto, A. G. Lixo Municipal: Manual de Gerenciamento Integrado, IPT/CEMPRE 2018, 4aed, 351 p). A secundária trata do reprocessamento mecânico de materiais poliméricos simples e envolve as seguintes etapas: trituração, separação, lavagem e extrusão (Al-Salem, Lettieri e Baeyens, The valorization of plastic solid waste (PSW) by primary to quaternary routes: From re-use to energy and Chemicals, Progress in Energy and Combustion Science 2010, 36, 103-129). A terciária, ou química, envolve o processo de despolimerização por processos termoquímicos (pirólise, conversão catalítica) (Pinto, A. G. Lixo Municipal: Manual de Gerenciamento Integrado, IPT/CEMPRE 2018, 4aed, 351 p; Al-Salem, Lettieri e Baeyens, The valorization of plastic solid waste (PSW) by primary to quaternary routes: From re-use to energy and Chemicals, Progress in Energy and Combustion Science 2010, 36, 103-129; Hopewell, Dvorak e Kosior, Plastics recycling: challenges and opportunites. Philosofical Transactions of the Royal Society B 2009, 364, 2115-2126). A reciclagem química é uma alternativa aos resíduos plásticos que esgotaram a capacidade de reciclagem pelo método secundário e aos filmes plásticos, laminados e multicamadas (British Plastics Federation, Plastics Recycling.
<http://www.bpf.co.uk/sustainability/plastics_recycling.aspx>, acesso 02 de abril de 2020). A quaternária, ou recuperação energética de resíduos, acontece pelo método de incineração gerando vapor ou energia, reduzindo o volume do material em 90 a 99 % em volume e diminuindo o descarte em aterro. Entretanto, esse método deve ser monitorado devido ao decorrente impacto ambiental (Al-Salem, Lettieri e Baeyens, The valorization of plastic solid waste (PSW) by primary to quaternary routes: From re-use to energy and Chemicals, Progress in Energy and Combustion Science, 2010, 36, 103-129; Flopewell, Dvorak e Kosior, Plastics recycling: challenges and opportunites. Philosofical Transactions of the Royal Society B 2009, 364, 2115-2126).
[0014] Uma outra rota também conhecida de degradação de plásticos, conhecida como intemperismo ou fotodegradação, envolve a exposição à luz UV, além de alterações mecânicas ocasionadas por ondas e ventos ou trituração em rochas e sedimentos marinhos, que eventualmente quebram plásticos maiores em pedaços menores conhecidos como micro- (> 5 mm) e nanoplásticos (0,1 pm). Entretanto, essas partículas menores são prováveis de se incorporarem na cadeia alimentar e findarem no intestino de animais, inclusive o homem, embora ainda não tenha sido determinado em estudo de caso (Danso, Chow e Streit, Plastics: Environmental and biotechnologycal pespectives on microbial degradation. Applied and Environmental Microbiology 2019, 85 (19), 1095-1109).
[0015] O PET, que constitui unidade funcional entre o ácido tereftálico (AT) e o etileno glicol (EG) é, via de regra, reciclado das seguintes maneiras: 1) o material é granulado, limpo e extrusado para tornar-se novamente uma garrafa PET; ou 2) o PET é decomposto em seus monômeros que podem ser repolimerizados. Ambas abordagens são conduzidas em altas temperaturas.
[0016] Assim, de um modo geral, os principais métodos de reciclagem requerem condições de alta temperatura e alta pressão (métodos químicos) ou consomem uma grande quantidade de energia e/ou geram uma grande quantidade de substâncias tóxicas e nocivas ao meio ambiente, o que resulta inclusive em poluição secundária (biológicos).
[0017] Para minimizar esses efeitos a partir de uma abordagem ambientalmente sustentável para a reciclagem de produtos plásticos, tem-se sido aplicado e estudado intensivamente os métodos de biodegradação (Ma et al, Enhanced Poly(ethylene terephthalate) hydrolase activity engineering. Engineering 2018, 4, 888-891 ; Yoshida et al, A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate. Science 2016, 351 (6278), 1196-1199).
[0018] Pesquisas recentes referentes à biodegradação têm abordado a capacidade de micro-organismos em degradar plástico. Com o atual conhecimento sobre a degradação de plástico por meio microbiano, sabe-se que enzimas secretadas ou obtidas a partir de micro-organismos atuam principalmente em polímeros de polietileno tereftalato (PET) e poliuretano (PU). No entanto, as melhores enzimas e micro-organismos ativos em PU e PET ainda apresentam taxas de catálise moderadas.
[0019] Em geral, a degradação microbiana de polímeros é um processo lento. Essa alta resistência se deriva principalmente do alto peso molecular da fibra, das fortes interações C-C e da superfície extremamente hidrofóbica, que é muito difícil de ser atacada por enzimas. Além disso, os polímeros apresentam diferentes ordenações moleculares (e.g. formas amorfas e cristalinas), resultando em diferentes níveis de degradabilidade (Danso, Chow e Streit, Plastics: Environmental and biotechnologycal pespectives on microbial degradation. Applied na Environmental Microbiology 2019, 85 (19), 1095-1109).
[0020] A primeira evidência de biodegradação de poliésteres aromáticos foi reportada em estudo publicado em 2005, no qual o micro-organismo Thermobifida fusca foi empregado para degradação de PET (Muller et al, Enzymatic degradation of Poly(ethylene terephthalate): rapid hydrolyse using a hydrolase form T. fusca. Macromolecular Rapid Communication 2005, 26, 1400-1405). A partir de então, outros micro-organismos foram testados na degradação desse substrato.
[0021] Por exemplo, o documento de patente de invenção JP2000143868 descreve o método de degradação de poliéster aromático com os micro-organismos Trichosporon FEM BP-6445 e Arthrobacter FERM BP-6444.
[0022] O documento de patente de invenção W02005019439 descreve o gênero Rhizobium, em particular, Rhizobium sp. OKFI-03, possuindo habilidade de degradar poliésteres aromáticos.
[0023] O documento de patente de invenção JP20081999957 descreve o bacilo 201 -F6 gram negativo isolado a partir de solo com atividade de degradação de poliéster aromático.
[0024] Uma abordagem da biodegradação consiste no uso de enzimas isoladas a partir de micro-organismos. Atualmente, existem 27 enzimas funcionais e verificadas conhecidas, das quais a maioria é discriminada bioquimicamente de acordo com os substratos de polímeros sintéticos ou oligômeros/monômeros aos quais elas se ligam. As enzimas cutinases representam a maior fração dominante dentro dos estudos realizados.
[0025] Por exemplo, tem-se sido relatadas que as enzimas Thermobifida alba Cut1 (ADV92525), Thermobifida fusca Cut2 (CBY05530), Thermobifida fusca Cut1 (AET05798), Thermobifida halotolerans Serine hydrolase (AFA45122), Saccharomonospora viridis Cutinase (BA042836), Thermomonospora curvata triacilglicerol lipase(WP 012851645), LCC (AEV21261), Ideonella sakaiensis PETase (GAP38373), Polyangium brachysporum triacilglicerol lipase (WP047194864), Vi brio gazogenes lipase (WP021018894), LiplAF5-2 (ACC95208), Oleispira antarctica LipA (CCk74972), Ideonella sakaiensis MFIETase (WP 082368715), Humicola insolens cutinase (40YY) e Fusarium oxysporum cutinase (5AJFI) degradam substratos de polietileno. Para degradação do substrato poliamida (PA) tem-se sido aplicadas as enzimas Arthrobacter sp NylE (WP079941038), Arthrobacter sp NylA (BAA05090), Arthrobacter sp NylB (CAA24927), Arthrobacter sp NylC (YP001965068). As enzimas Pseudomonas oleovorans AHs (CAB54050), Pseudomonas fluorescens StyB (CAB06823), Pseudomonas fluorescens StyA (CAB06823) e Pseudomonas fluorescens StyC (CAB06825) degradaram poliestireno (PS), enquanto a degradação do poliuretano (PU) pode ocorrer com Pseudomonas fluorescens PueA (AAC23718), Pseudomonas fluorescens PueB (AAY92474) e Pseudomonas fluorescens PulA (AAF66684)(Danso, Chow e Streit, Plastics: Environmental and biotechnological perspectives on microbial degradation. Applied Environmental Microbiology 2019, 85 (19), 1095-1109).
[0026] A desconstrução enzimática do polietileno tereftalato (PET) tem sido objeto de extensa pesquisa anterior e pode ser agrupada em duas categorias: (1) modificação enzimática da superfície do poliéster ou (2) despolimerização em seus respectivos monômeros. Diferentes enzimas com propriedades específicas são necessárias para esses dois processos. A modificação enzimática da superfície é possível com várias famílias de enzimas, como lipases, carboxilesterases, cutinases e proteases. Por outro lado, a obtenção de monômeros a partir de PET requer uma degradação substancial dos componentes do PET; portanto, apenas um número limitado de cutinases, reconhecido como PETases, atua liberando monômeros a partir do PET. A primeira hidrolase de PET foi descoberta por Muller et al. (Enzymatic degradation of poly(ethylene terephthalate): rapid hydrolyse using hydrolase from T. fusca. Macromolecular Rapid Communications 2005, 26, 1400- 1405).
[0027] Existe, portanto, uma necessidade de se obter enzimas que apresentem atividade de degradação de PET e que possam ser empregadas industrialmente na reciclagem desse material.
[0028] As mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (do inglês, lytic polysaccharide monooxygenases ), ou LPMOs, constituem um grupo de enzimas identificado recentemente. Essas enzimas foram originalmente classificadas como uma família GH (glicosil hidrolase) ou CBM (módulo de ligação ao carboidrato), sendo agora pertencentes às enzimas de atividades auxiliares (AAs), identificadas sob as classes AA9 - AA11 e AA13 - AA16 nos bancos de dados CAZy. Sabe-se que a presença de LPMOs em um coquetel enzimático pode aumentar a atividade de GHs canónicas em até duas ordens de magnitude. Além da celulose, as LPMOs oxidam uma ampla gama de polímeros à base de sacarídeos, incluindo hemicelulose, amido e quitina. Notavelmente, algumas LPMOs exibem promiscuidade de substrato. No geral, LPMOs aumentam o desempenho das GHs ao atuarem em regiões onde GHs não atuam aumentando o repertório de extremidades a serem reconhecidas pelas GHs canónicas (Chen et al. Enzymatic degradation of plant biomass and synthetic polymers. Nature Reviews Chemistry 2020, 4: 114-126).
[0029] LPMOIOA é uma LPMO obtida a partir de Kitasatospora papulosa e clonada em Escherichia coli, tendo sido descrito seu uso para degradar biomassa lignocelulósica (Corrêa et al, An actinobacteria lytic polysaccharide Mono-oxigenase acts on both cellulose and xylan to boost biomass saccharification. Biotechnology for Biofuels 2019, 12:117).
[0030] Apesar de o mecanismo catalítico e as aplicações das LPMOs terem atraído interesse da indústria nos últimos anos, o uso dessa classe de enzimas como agentes de biodegradação de plásticos quase não foi explorado.
[0031] Foi identificado apenas o documento W0201412506 abordando o uso de glicosil hidrolase 61 (GH61), antiga denominação de AA9, oriunda de diversos gêneros de bactérias (gram positivo: Bacillus sp. e Streptomyces sp. ou gram negativo: E.coli ou Pseudomonas sp.) e fungos ( Candida , Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces ou Yarrowia ou fungos filamentosos) associado a cutinases para o tratamento de tecidos à base de poliéster (PET). Os inventores demonstraram que a associação das enzimas apresenta maior degradação do tecido que apenas com cutinases. Contudo, o documento não aborda o uso isolado de LPMOs na degradação de PET, muito menos na degradação de rejeitos plásticos oriundos de garrafas ou frascos. Além disso, o processo da degradação enzimática descrito ocorreu mediante altas temperaturas (entre 65 e 90 °C), assim como comumente relatado para a reciclagem de PET.
[0032] Dessa forma, existe a necessidade de fornecimento de uma alternativa à degradação enzimática de polietileno tereftalato (PET) que seja vantajosa em relação às alternativas descritas no estado da técnica.
[0033] Além disso, não foi encontrado nenhum documento do estado da técnica que se refere ou que sugere um processo de degradação enzimática por monooxigenases líticas de polissacarídeos ( Lytic Polysaccharide Mono-oxigenases - LPMOs) isoladas a partir da bactéria Kitasatospora papulosa e do fungo filamentoso Aspergillus fischeri, onde a sua função até então conhecida apenas para hidrolisar os compostos lignocelulósicos, podem ser empregadas na degradação de materiais plásticos poliésteres sem o auxílio de enzimas canónicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0034] A presente invenção descreve um novo uso de enzimas pertencentes à família das monooxigenases líticas de polissacarídeos ( Lytic Polysaccharide Mono- oxygenases - LPMOs). Mais precisamente, a presente invenção descreve o uso de LPMOs na degradação de polietileno, mais especificamente, na degradação de polietileno tereftalato (PET).
[0035] As LPMOs da presente invenção são isoladas a partir de micro- organismos, sendo preferencialmente isoladas a partir de bactérias do gênero Kitasatospora sp. e a partir de fungos do gênero Aspergillus sp.
[0036] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição enzimática para uso na degradação de poliéster que compreende pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos da presente invenção e um veículo aceitável. Em uma modalidade específica, a composição da presente invenção compreende, adicionalmente, uma cutinase, mais especificamente uma PETase.
[0037] Em uma segunda modalidade, a presente invenção fornece o uso da composição enzimática da presente invenção na degradação de polietileno tereftalato (PET).
[0038] Em uma terceira modalidade, a presente invenção fornece um método de degradação de PET que compreende o uso de pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos da presente invenção. Em uma modalidade específica, o método da presente invenção compreende empregar, adicionalmente, uma cutinase, mais especificamente uma PETase.
[0039] Por fim, em uma quarta modalidade, a presente invenção fornece o uso de pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos na degradação enzimática de poliéster, em que a dita monooxigenase lítica de polissacarídeos degrada o dito poliéster sem o auxílio de pelo menos uma enzima canónica. Em uma modalidade preferencial, são utilizadas as monooxigenases líticas de polissacarídeos da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0040] Na figura 1 apresenta-se o vetor de expressão para K LMOIOA (ou LPMO AA10) a partir de Kitasatospora papulosa (A) e A/LPM09A (ou LPMO AA9) a partir de Aspergillus fischeri (B).
[0041] Na figura 2 apresenta-se o perfil proteico de KpLPMOIOA (A), At LPM09A (B) e /sPETase (C) obtido a partir de dois passos cromatográficos.
[0042] Na figura 3 apresenta-se imagens obtidas por Microscopia de Força Atómica de filmes de PET Mylar tratados com LPMOs. A: controle não tratado; B: filme tratado com KpLPMOIOA; D: filme tratado com A/LPMO10A.
[0043] Na Figura 4 apresenta-se as imagens obtidas por Microscopia de Força Atómica de PET de garrafas tratado com LPMOs. A, controle não tratado; B, PET tratado com KpLPMOIOA; C, PET tratado com A/LPM09A.
[0044] Na Figura 5 apresenta-se os espectros obtidos pela técnica de XPS do controle (A), PET de garrafa pós-degradação enzimática por A/LPM09A.
[0045] Na figura 6 apresenta-se a predição dos possíveis produtos gerados por LPMOs a partir de PET.
[0046] Na figura 7 apresentam-se os espectros de emissão de fluorescência de cartões de garrafa PET tratados e não tratados com as enzimas da presente invenção. (A): face interna. (B): face externa. O material foi excitado a 340 nm.
[0047] Na figura 8 apresentam-se os resultados dos ensaios de sinergismo entre A/LPM09A (LPMO) e /sPETase (PETase) sobre PET, com as medidas de liberação de mono (2-hidroxietil) tereftalato (MHET) e ácido tereftálico (TPA). (A) Atividade de /sPETase em PET de garrafa moído e bloco. (B) Liberação de MHET e TPA por /sPETase a partir de PET moído pré-tratado com diferentes concentrações de A/LPM09A. (C) Liberação de MHET e TPA por /sPETase em reações com adição simultânea de /sPETase e A/LPM09A em diferentes concentrações. (D) Atividade de /sPETase em N-acetato e N-butirato na ausência e presença de ácido ascórbico.
[0048] Na figura 9 apresentam-se imagens topográficas de microscopia de força atómica de garrafa de suco e sacola plástica, ambas de PEAD, tratadas com AscAC (E e G, controle) e na presença de At LPM09A (F e H). As setas apontam para as erosões sobre o material, causadas pela ação enzimática.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0049] A presente invenção descreve um novo uso de enzimas pertencentes à família das monooxigenases líticas de polissacarídeos ( Lytic Polysaccharide Monooxygenases - LPMOs).
[0050] Quando empregadas de maneira isolada, isto é, sem a presença de enzimas com outras funções, as enzimas da família das LPMOs são conhecidas apenas por sua atividade de oxidação de polissacarídeos, tais como celulose, hemicelulose, amido e quitina.
[0051] Os inventores da presente invenção verificaram que as LPMOs têm atividade de degradação de polietileno, o que é surpreendente à luz das atividades dessas enzimas descritas até então, demonstrando seu uso na degradação de plásticos, mais precisamente na degradação de polietileno tereftalato (PET).
[0052] Igualmente surpreendente, os inventores da presente invenção demonstraram que as LPMOs da presente invenção apresentam atividade de degradação de PET de modo isolado, isto é, sem a necessidade do uso concomitante de enzimas canónicas, como cutinases ou PETases.
[0053] Além disso, os inventores da presente invenção demonstraram que a associação das LPMOs da presente invenção com enzimas canónicas apresenta um efeito sinérgico surpreendente na degradação de PET.
[0054] Os inventores da presente invenção também desenvolveram um método de degradação de polietileno empregando as LPMOs da presente invenção, o qual ocorre à 30-37 °C, sendo vantajoso em relação aos demais métodos de degradação enzimática de polietileno descritos no estado da técnica.
[0055] As LPMOs da presente invenção compreendem uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com as sequências SEQ ID NQ 2 ou SEQ ID NQ 5.
[0056] As LPMOs da presente invenção, compreendendo pelo menos 60 % de identidade com as sequências SEQ ID NQ 2 ou SEQ ID NQ 5, podem ser isoladas a partir de bactérias ou fungos. Dentre as LPMOs bacterianas incluem-se as de Bacillus sp., Burkholderia sp., Caldibacillus sp., Cellvibrio sp., Enterococcus sp., Hahella sp., Jonesia sp., Listeria sp., Micromonospora sp., Nocardiopsis sp., Photorhabdus sp., Serratia sp., Teredinibacter sp., Thermobifida sp. e Vibrio sp.; mais especificamente, Streptomyces sp., por exemplo, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans,
Streptomyces pratensis, Streptomyces atroolivaceus, Streptomyces swartbergensis, Streptomyces azureus, Streptomyces afghaniensis, Streptomyces coeruleoribdus, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces coelicoflavus, Streptomyces pactum, Streptomyces qaidamensis, Streptomyces olivaceus, Streptomyces africanus,
Streptomyces iakyrus, Streptomyces regalis, Streptomyces luteus, Streptomyces cyaneogriseus, Streptomyces havaiiensis, Streptomyces rubrogriseus, Streptomyces marokkonensis, Streptomyces corynorhini, Streptomyces pharetrae, Streptomyces glauscescens, Streptomyces capillispiralis mais especificamente, K itasatospora sp., por exemplo, Kitasatospora cheerisanensis, Kitasatospora aureofaciens, Kitasatospora aburaviensis, Kitasatospora herbaricolor, Kitasatospora misakiensis, Kitasatospora xanthocidica e Kitasatospora papulosa. As LPMOs fúngicas incluem as oriundas de Gloeophyllum sp., Heterobasidium sp., Pleurotus sp., Pestalotiopsis sp., Phanerochaete sp., Podospora sp., Lentinus sp., Miceliophythora sp., Neurospora sp., Trametes sp., Thermoascus sp., Thermothelomyces sp. e Trichoderma sp.; mais especificamente, Penicillium, por exemplo, Penicillium oxalicum, Penicillium subrubescens, Penicillium rolfsii, Penicillium brasilianum, Penicillium antarcticum, Penicillium arizonense, Penicillium steckii, Penicillium vulpinum, Penicillium expansum, Penicillium camemberti, Penicillium solitum, PeniciHium coprophilum, PeniciHium roqueforti, PeniciHium polonicum, PeniciHium freii, Penicillium rubens, Penicillium griseofulvum, Penicillium digitatum, Penicillium italicum e PeniciHium nalgiovense mais especificamente, Aspergillus sp., por exemplo, Aspergillus lentulus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus novofumigatus, Aspergillus turcosus, Aspergillus thermomutatus, Aspergillus udagawae, Aspergillus clavatus, Aspergillus homomorphus, Aspergillus aculeatinus, Aspergillus fijiensis, Aspergillus brunneoviolaceus, Aspergillus uvacrum, Aspergillus aculeatus, Aspergillus tanneri, Aspergillus brasiliensis, Aspergillus terreus, Aspergillus tamarii, Aspergillus nidulans, Aspergillus caelatus, Aspergillus ibericus, Aspergillus piperis, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus kawachii, Aspergillus saccharolyticus, Aspergillus neoniger, Aspergillus glaucus, Aspergillus ruber, Aspergillus tubingensis, Aspergillus leporis, Aspergillus mulundensis e Aspergillus fischeri.
[0057] As LPMOs da presente invenção são preferencialmente oriundas de bactérias do gênero Kitasatospora sp. e de fungos do gênero Aspergillus sp. Preferencialmente, as enzimas da presente invenção são oriundas da bactéria Kitasatospora papulosa, como por exemplo a enzima KpLPMOIOA, e do fungo filamentoso Aspergillus fischeri, como por exemplo a enzima A/LPM09A.
[0058] A cadeia polipeptídica de KpLPMOIOA consiste dos aminoácidos 39 a 224 da SEQ ID N° 2 abrangendo a histidina N-terminal (H39) típica de LPMOs e H146 e Y215 relacionados à coordenação do íon metálico, que pode ser um cobre.
[0059] A cadeia polipeptídica de At LPM09A consiste dos aminoácidos 20-247 da SEQ ID N° 5 abrangendo a histidina N-terminal (H20) típica de LPMOs e H105 e Y194 possivelmente relacionados à coordenação do íon metálico, que pode ser um cobre.
[0060] As enzimas da presente invenção podem ser obtidas por meio da transformação de vetores de expressão em células empregando-se etapas conhecidas da técnica. Por exemplo, as enzimas da presente invenção são expressas em células de Escherichia coli contendo vetores de expressão adequados cultivadas em meios e sob condições adequados e são extraídas por meio de lise empregando-se um protocolo adequado. As enzimas da presente invenção são então obtidas empregando-se técnicas de separação como, por exemplo, cromatografia de afinidade, sendo o perfil de proteínas das frações obtidas avaliado em gel SDS-PAGE. Etapas adicionais para purificação das enzimas da presente invenção podem ser aplicadas empregando-se técnicas adequadas, como cromatografia de gel filtração utilizando coluna adequada.
[0061] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição enzimática para uso na degradação de poliéster que compreende pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos da presente invenção (SEQ ID NQ 2 ou SEQ ID NQ 5) (LPMO), e um veículo aceitável.
[0062] Entende-se por veículo aceitável, dentro do escopo da presente invenção, um veículo aquoso que mantém as enzimas da presente invenção em suspensão ou solução quando em concentração adequadas, podendo conter, além de água, outros aditivos, como conservantes, agentes ou sistemas tamponantes etc.
[0063] As LPMOs da presente invenção estão presentes em concentração entre aproximadamente 0,001 % e aproximadamente 0,1 % em peso total da composição da presente invenção, preferencialmente entre aproximadamente 0,002 % e aproximadamente 0,005 % em peso total da composição.
[0064] As composições da presente invenção contêm pelo menos uma LPMO da presente invenção, podendo conter uma enzima isolada ou uma associação de enzimas dentro do contexto da invenção.
[0065] Em uma modalidade específica, a composição da presente invenção compreende, adicionalmente, uma cutinase, mais especificamente uma PETase.
[0066] Cutinases são enzimas relacionadas à degradação do poliéster alifático cutina, encontrado na cutícula vegetal. Todas as PET hidrolases (PETases)caracterizadas até então pertencem à família das cutinases. PETases apresentam um centro catalítico mais amplo quando comparado com cutinases, provavelmente relacionado à acomodação de poliésteres cristalinos semi- aromáticos. Poliesterases atuam preferencialmente em regiões amorfas do PET, ao contrário de LPMOs que atuam preferencialmente em regiões cristalinas nos substratos poliméricos onde sua atividade foi anteriormente relatada. Por isso, a atuação conjunta LPMO-PETase pode ser vantajosa assim como relatado para LPMOs-GHs.
[0067] Dentre os poliésteres e poliamidas reconhecidos pelas cutinases, incluem-se o poli(L-ácido lático) (PLA), polietileno furanoato (PEF), polibutileno adipato-co-tereftalato (PBAT), policaprolactona (PCL), polibutileno succinato (PBS), poliamida 6,6 e polietileno tereftalato (PET).
[0068] Cutinases com atividade de PET hidrolase (PETase) a serem empregadas na composição da presente invenção podem ser de origem fúngica ou bacteriana. As de origem fúngica contemplam as oriundas de Humicola sp., Fusarium sp., Aspergillus sp. e Penicillium sp. As bacterianas contemplam as oriundas de Acidovorax sp., Rhizobacter sp., Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Thermobifida sp., Saccharomonospora sp., Clostridium e Ideonela sp., especificamente, Ideonela sakaiensis.
[0069] A concentração de PETase na composição da presente invenção varia entre aproximadamente 0,0005 % e aproximadamente 0,05 % em peso total da composição, preferencialmente entre aproximadamente 0,001 e aproximadamente 0,0025 % em peso total da composição.
[0070] Em uma segunda modalidade, a presente invenção fornece o uso da composição enzimática da presente invenção na degradação de polímeros plásticos, mais especificamente, polietileno.
[0071] De acordo com a presente invenção, os resíduos plásticos utilizados como substrato para degradação enzimática podem ser selecionados a partir de PEAD, PVC, PEBD, PP, PS, PC, PU, ABS, PE e PET, preferencialmente PU, ABS, PE e PET, mais preferencialmente ABS, PE e PET, ainda mais preferencialmente PE e PET e, ainda mais preferencialmente PET.
[0072] Dentre os resíduos que podem ser denominados PET, incluem-se garrafas de líquidos, embalagens de alimentos, filmes para janelas, filmes de Raio-X, fibras de tecidos e quaisquer outros materiais majoritariamente constituídos de PET, sem limitações. [0073] Em uma terceira modalidade, a presente invenção fornece um método de degradação de PET que compreende o uso de pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos da presente invenção.
[0074] Surpreendentemente, os inventores da presente invenção identificaram que LPMOs podem ser empregadas isoladamente para a desconstrução do PET
[0075] O método de degradação de PET da presente invenção compreende adicionar pelo menos uma LPMO da presente invenção em meio aquoso que contém substrato.
[0076] A concentração da LPMO a ser empregada depende da origem e condições de pH e temperatura da reação, sendo inicialmente padronizada de acordo com métodos que são familiares ao técnico no assunto.
[0077] A concentração de LPMO nas reações da presente invenção encontra- se entre 0,01-50 miligramas de LPMO por grama de PET, preferencialmente 1-30 miligramas de LPMO por grama de PET, preferencialmente 2-20 miligramas de LPMO por grama de PET.
[0078] A concentração de substrato na forma de PET no processo da presente invenção varia entre 10-80% da reação, preferencialmente 20-70% da reação, preferencialmente 40-60% da reação, preferencialmente 30-50% da reação.
[0079] Em uma modalidade preferencial, o meio aquoso compreende, adicionalmente, uma solução tamponante.
[0080] A concentração da solução tamponante encontra-se entre 0,01 -0,5M, preferencialmente 0,03-0,25M, preferencialmente 0,05-0,1 M.
[0081] Em uma modalidade preferencial, o método de degradação de PET da presente invenção compreende uma etapa adicional, onde é adicionada uma substância doadora de elétrons para LPMO.
[0082] De acordo com a presente invenção, a molécula doadora de elétrons para LPMO pode ser selecionada a partir de ácido ascórbico e suas misturas.
[0083] A concentração da molécula doadora de elétrons para LPMO varia entre 0,3mM-2mM, preferencialmente 0,8-1 ,5mM, preferencialmente 0,5-1 mM.
[0084] O tempo de reação da presente invenção é usualmente entre 5 minutos-48 horas, preferencialmente 10 minutos - 48 horas, mais preferencialmente 30 minutos-48 horas e, ainda mais preferencialmente, 60 minutos-48 horas.
[0085] O pH da reação é selecionado de acordo com a origem da LPMO empregada e é padronizado previamente, podendo ser entre pH 4.0-9.0, preferencialmente entre pH 5.0-8.0 e, mais preferencialmente, entre pH 5.5-7.5.
[0086] A temperatura da reação é selecionada de acordo com a origem da LPMO empregada e é padronizada previamente. A reação é conduzida em temperaturas entre 20-60°C, preferencialmente 25-55°C, preferencialmente 30-50°C Em uma modalidade específica, a temperatura empregada no método da presente invenção está abaixo de 40 °C, preferencialmente 37 QC.
[0087] Em uma modalidade específica, o método da presente invenção compreende empregar, adicionalmente, uma cutinase.
[0088] A concentração da PETase a ser empregada depende das condições da reação, sendo inicialmente padronizada. A concentração de PETase nas reações da presente invenção pode ser entre 0.005-25 miligramas de PETase por grama de PET, preferencialmente 0,5-15 miligramas de PETase por grama de PET, preferencialmente 1 -10 miligramas de PETase por grama de PET.
[0089] No contexto da invenção, trata-se de uma composição de enzimas compreendendo uma monooxigenase lítica de polissacarídeos (LPMO), com reconhecida capacidade de oxidar a porção cristalina da estrutura de glucanos favorecendo a ação de (hemi)celulases sobre os substratos de lignocelulose, e/ou mistura com a hidrolase (PETase) para a potencial degradação de polímeros plásticos no setor de despolimerização/reciclagem.
[0090] Os exemplos a seguir ilustram as formas de execução preferenciais da presente invenção. Eles não limitam, portanto, o escopo de proteção da invenção, o qual é exclusivamente definido pelas reivindicações que acompanham esta descrição.
Exemplo 1 : Preparo da construção de vetor de expressão para monooxyaenases líticas de polissacarídeos da presente invenção
[0091] ETAPA 1 : A bactéria K. papulosa (DSM4643) teve o DNA genômico extraído e utilizado para amplificação do gene de interesse KpLPMOIOA (SEQ ID N° 1, nucleotídeo 115-672), que codifica a enzima AA10 KpLPMOIOA, com os primers KpF e KpR (Tabela 1). O produto da amplificação foi empregado para nova reação de PCR com os primers KpFpET22b e KpRpET22b (Tabela 1) para a adição de caudas de homologia ao vetor pET22b. O gene foi clonado no vetor pET22b(+) imediatamente após a sequência que codifica o peptídeo sinal peB.
Tabela 1. Primers utilizados para amplificação do gene KpLPMOIOA
Nome Sequência (5’-3’)
KpF CACGGTTCCGTCGTCGAC
KpR GGT G AAGTT CACGT CACTGCAC
KpFpET22b CTGCCCAGCCGGCGATGGCCCACGGTTCCGTCGTCGAC
KpRpET22b TCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGTGAAGTTCACGTCACT
GCAC
[0092] ETAPA 2:0 gene AfLPM09A (SEQ ID N° 3, nucleotídeo 58-741), que codifica a enzima AA9 At LPM09A, foi adicionado de sequência que codifica pel B (SEQ ID N° 4, nucleotídeo 1-66) e teve os códons otimizados para expressão em Escherichia coli. peB + AÍLPM09A foi sintetizado e clonado nos sítios de restrição para as enzimas Nde\ e Xho\ no vetor pET21a(+) por Genscript (Piscataway).
[0093] ETAPA 3: O gene /sPETase (GenBank: BBYR01000074.1), que codifica a enzima PETase em Ideonella sakaiensis, teve os códons otimizados para expressão em E. coli. /sPETase foi sintetizado e clonado nos sítios de restrição para as enzimas Nde\ e Xho\ no vetor pET21 b(+) por Genscript (Piscataway).
[0094] ETAPA 4: Os vetores pET22b {+)-KpLPMO10A e pET21a(+)- AfLPM09A foram transformados (separadamente) em células de Escherichia coli Shuffle®. As células foram cultivadas em meio TB e adicionadas de IPTG para propiciar a expressão das proteínas KpLPMOIOA (SEQ ID N° 2, aminoácido 39-224) ou A/LPM09A (SEQ ID N° 2, aminoácido 20-247) durante 16 h a 18°C/250 rpm. As células foram centrifugadas e lisadas pelo protocolo de choque osmótico. Os sobrenadantes obtidos a partir da lise foram carregados em coluna de afinidade His- Trap 5mL (GE) para cromatografia. O perfil de proteínas das frações obtidas por cromatografia de afinidade foi avaliado em gel SDS-PAGE. As frações que continham proteínas com o tamanho esperado foram misturadas, concentradas e utilizadas para cromatografia de gel filtração utilizando coluna HiLoad Superdex G- 75 16/60. As frações que continham proteínas puras do tamanho esperado (avaliadas por SDS-PAGE) foram misturadas, concentradas e avaliadas quanto à concentração (mg de proteína/mL). KpLPMOIOA ou A/LPM09A foram tratadas com sulfato de cobre (CuS0 ) durante 16 horas a 4 °C. O excesso de metal foi retirado em coluna Sephadex G-25 PD-10. KpLPMOIOA ou A/LPM09A foram concentradas, quantificadas (mg de proteína/mL) e empregadas em experimentos posteriores. Exemplo 2: Preparo da construção de vetor de expressão para PET hidrolase da presente invenção
[0095] ETAPA 1 : O vetor pET21 b(+)-/sPETase foi transformado em células de Escherichia coli BL21(DE3). As células foram cultivadas em meio LB e adicionadas de IPTG para propiciar a expressão de /sPETase durante 16 h a 18 °C/250 rpm. As células foram centrifugadas e lisadas com auxílio de lisozima e sonicador. Os sobrenadantes obtidos a partir da lise foram carregados em coluna de afinidade His- Trap 5mL (GE) para cromatografia. O perfil de proteínas das frações obtidas por cromatografia de afinidade foi avaliado em gel SDS-PAGE. As frações que continham proteínas com o tamanho esperado foram misturadas, concentradas e utilizadas para cromatografia de gel filtração utilizando coluna HiLoad Superdex G- 75 16/60. As frações que continham proteínas puras do tamanho esperado (avaliadas por SDS-PAGE) foram misturadas, concentradas e avaliadas quanto à concentração (mg de proteína/mL) e empregadas em experimentos posteriores.
Exemplo 3: Preparação do filme de poliéster para as reações enzimáticas
[0096] ETAPA 1 : PET, Mylar e de garrafa, foram cortados em dimensões de 0,6 cm x 0,4 cm com o auxílio de uma tesoura. Posteriormente foram lavados com 1 mL de água Milli-Q com o auxílio de uma pipeta e submetidos a ultrassom durante 5 minutos. Esse procedimento foi realizado 3 vezes. Os plásticos foram secos em corrente de N2 durante 10-15 minutos e armazenados para posterior uso.
Exemplo 4: Degradação enzimática de resíduos de filmes de poliéster
[0097] ETAPA 1 : Ensaios que auxiliam a detecção direta de produtos liberados por LPMOs a partir de polímeros plásticos não se encontram disponíveis. As condições de reação adotadas inicialmente são as mesmas empregadas para substratos (hemi)celulósicos. As reações enzimáticas foram realizadas em tubos Eppendorf de 2 ml_ contendo PET (Mylar ou PET de garrafa), tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 6,0, 20 mg de LPMOIOA ou A/LPM09A por grama de PET. Após 10 minutos a 37 °C, as reações foram adicionadas de ácido ascórbico 1 mM e incubadas a 37 °C, 850 rpm durante 48 horas.
[0098] O PET oriundo do tratamento enzimático foi enxaguado com 0,5 ml_ de água Milli-Q com o auxílio de uma pipeta e submetidos a ultrassom durante 5 minutos. Esse procedimento foi realizado 3 vezes. A fração líquida das reações foi submetida à fervura a 99 °C durante 10 minutos e o material foi guardado para análises posteriores.
Exemplo 5: Medidas de caracterização do poliéster em estudo a. Microscopia de força atómica
[0099] O PET oriundo do tratamento enzimático foi submetido a análises por microscopia de força atómica utilizando o modelo Multimode8 e a controladora NanoScope V (Bruker, Alemanha) operando no modo PeakForce tapping com sondas modelo ScanAsyst-air (Bruker, Alemanha) de nitreto de silício com uma força nominal de 0.4 Nnr1. As imagens obtidas (3x3 pm) foram tratadas no software Gwyddion. b. Análise de espectroscopia de fotoelétrons excitados por raio-X ( X-ray photoelectron spectroscopy ou XPS)
[0100] Os espectros XPS foram obtidos com um espectrômetro VSW HA100 (Reino Unido) operado no modo energia de passagem constante, fixada em 44eV. Como excitação foi usada radiação de um anodo de Alumínio que produz fótons com 1486.6eV de energia. Os espectros de alta resolução foram coletados com passo próximo a 0.1 eV e tempo de acumulação suficiente para ter uma boa relação sinal/ruído. A pressão na câmara de análise foi mantida abaixo de 6x108 mBar durante a análise.
[0101] As amostras foram fixas a um porta amostras de aço inoxidável com fita dupla face de carbono e introduzidas na câmara de análise.
[0102] O carregamento elétrico das amostras foi corrigido utilizando o valor do anel benzênico em 284.7 eV. A deconvolução foi feita utilizando Gaussianas. As imagens foram obtidas no software Origin.
[0103] Os genes que codificam as proteínas KpLPMOIOA (AA10) (SEQ ID NQ 1) e A/LPM09A (AA9) (SEQ ID NQ 2) foram isolados a partir da bactéria Kitasatospora papulosa e do fungo filamentoso Aspergillus fischeri, respectivamente.
[0104] Kitasatospora e Streptomyces apresentam morfologias similares, mas diferem quanto à composição da parede celular, caracterizando Kitasatospora como um grupo distinto entre Streptomyces. Proteínas de Kitasatospora podem ser caracterizadas como pertencentes a Streptomyces sp. tendo em vista a alta identidade de sequências de aminoácidos entre os dois gêneros.
[0105] KpLPMOIOA, At LPM09A (SEQ ID NQ 1 A 5) e /sPETase foram expressas por células de E. coli transformadas com os vetores pET22b(+)- KpLPMOIOA, pET21a(+)-A/LPM09A (Figura 1) e pET21a(+)-/sPETase, respectivamente e purificadas por dois passos cromatográficos (Figura 2).
[0106] A atividade de KpLPMOIOA e At LPM09A sobre filme de PET (Mylar) foi avaliada por microscopia de força atómica. Por meio da técnica de microscopia de força atómica, a topografia de uma amostra é obtida após varredura da sua superfície com uma sonda, sendo qualquer alteração superficial detectada. Reações conduzidas com KpLPMOIOA (Figura 3B) e A/LPM09A (Figura 3C) levaram a alterações (erosões) na superfície do filme de PET quando comparado com a reação controle conduzida na ausência da enzima (Figura 3A). O efeito foi mais pronunciado quando A/LPM09A foi empregada na reação (Figura 3C).
[0107] Da mesma forma que para o filme de PET (Mylar), a atividade de KpLPMOIOA e A/LPM09A foi avaliada empregando-se PET de garrafas como substrato. Em comparação ao controle (Figura 4A), reação conduzida na ausência de enzimas, KpLPMOI OA (Figura 4B) e A/LPM09A (Figura 4C) alteraram a superfície do PET de garrafas, sendo também o efeito (de erosão ou “descascamento” do PET) de At LPM09A mais pronunciado quando comparado a KpLPMOIOA. A mesma concentração de enzima foi adotada para KpLPMOIOA e A/LPM09A em ambos os experimentos.
[0108] Tendo em vista as alterações notadas na superfície do PET principalmente em reações contendo A/LPM09A, a enzima foi selecionada para os experimentos posteriores. O PET de garrafa residual obtido após tratamento com A/LPM09A foi submetido à análise de espectroscopia de fotoelétrons excitados por raio-X ( X-ray photoelectron spectroscopy ou XPS). Os espectros obtidos por XPS são uma poderosa ferramenta para avaliar alterações químicas contidas na superfície de materiais, nesse caso, PET.
[0109] A intensidade dos picos relacionados a C1 para variados estados químicos encontrados na superfície do PET são mostrados na Figura 5A (Controle, PET não tratado com A/LPM09A) e Figura 5B (PET tratado com A/LPM09A) e Tabela 2. A deconvolução dos espectros da amostra controle e tratada com A/LPM09A resultou em três picos, principalmente nas regiões (eV): 284,7, ligações contidas nos anéis benzênicos (carbonos aromáticos); 286,2, carbono metilênico e 288,6, carboxila éster, consistentes com outros estudos desenvolvidos acerca da superfície do PET. O tratamento da amostra com A/LPM09A levou a uma queda da intensidade do pico correspondente a 284,7 eV e ao surgimento do pico em 287,5 eV, o que corresponde à formação de ligações duplas entre átomos de carbono e oxigénio (C=0) na superfície do PET (Tabela 2).
Tabela 2. Intensidade dos picos relacionados a C1 para variados estados químicos na superfície do PET
Tratamento Ligações
COO C=0 C-O/CN CHX,C-C,C=C Energia (288,6) (287,5) (286,2) (284,7)
Controle 16,81 X 24,2 58,9
AfL PM09A 14,96 3,27 26,3 55,4
[0110] LPMOs introduzem um átomo de oxigénio no carbono 1 (C1) ou carbono 4 (C4) da molécula de glicose quando a celulose é empregada como substrato resultando na liberação de ácido aldônico e cetoaldose, respectivamente. Ainda, algumas LPMOs demonstraram ser capazes de liberar uma mistura de produtos oxidados tanto em C1 quanto em C4 a partir do mesmo substrato.
[0111] Tendo como base os produtos liberados por LPMOs a partir de celulose, a Figura 6 ressalta os possíveis produtos liberados a partir do polímero de PET por LPMOs.
Exemplo 6: Ensaio de fluorescência
[0112] Espectros de emissão de fluorescência de cartões de garrafa PET tratados e não tratados com as enzimas da presente invenção foram obtidos à temperatura ambiente em um espectrofotômetro Hitachi F-4500 FL, com excitação a 340 nm e coletando-se a emissão entre 360-550 nm. Os picos em 370 nm (excímero) e 390 nm (dímero no estado fundamental) registrados nos cartões tratados com LPMO excitados em 340 nm apresentaram emissão reduzida em relação ao controle tratado com AscAc, indicando a ocorrência de cisão da cadeia PET. Nenhuma diminuição nas emissões de pico de 370/390 foi observada ao excitar a face externa (exposta ao ar) da garrafa PET tratada com LPMO, o que concorda com os dados de microscopia de força atómica discutidos acima.
Exemplo 7: Ensaio de sinergia com PETase
[0113] O sinergismo entre A/LPM09A e /sPETase foi avaliado pela adição não concomitante ou concomitante de enzimas a reações contendo PET como substrato (8mg). O PET em pó foi obtido pela moagem da garrafa PET em moinho de bolas (Tecnal). Para os ensaios não concomitantes, o substrato foi pré-tratado com A† LPM09A (0,5, 2 ou 4 mM) obedecendo às mesmas condições destacadas em “Ensaios enzimáticos - LPMO”. O sobrenadante foi fervido e o PET residual foi lavado com água Milli-Q e sonicado três vezes (10 min cada). Em seguida, /sPETase (0,05 mM) foi adicionado ao sobrenadante ou ao PET residual e as reações foram realiadas em tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,2, a 30oC / 400 rpm / 120 h. Nos ensaios concomitantes, A LPM09A e /sPETase foram adicionados simultaneamente às reações contendo PET em pó. A concentração de Ai LPM09A variou (0,05-4 mM) enquanto a concentração de /sPETase foi mantida fixa (0,05mM) em tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 6,0, 37oC / 850 rpm / 120 h.
[0114] Os sobrenadantes foram fervidos a 99° C, por 5 min, secos em concentradores SpeedVac (Eppendorf) e ressuspensos em uma mistura de metanol 20%: DMSO 80%. A concentração de mono (2-hidroxietil) tereftalato (MHET) e ácido tereftálico (TPA) liberado por /sPETase foi determinada por HPLC. As reações com apenas /sPETase foram adotadas como controle para os ensaios não concomitantes e concomitantes. Todas as reações foram realizadas em um volume de 600 uL, em triplicata. A concentração de /sPETase adotada em todos os ensaios de sinergia foi fixada em 0,05 mM.
[0115] Nos ensaios de sinergia não concomitantes, o pó de PET foi pré- tratado com A/LPM09A + AscAc (pH 6,0 / 37 °C / 48 h), lavado / sonicado três vezes e adicionado com /sPETase (pH 7,2 / 30 °C / 120 h). O pré-tratamento com 0,5, 2 e 4 mM A/LPM09A + AscAc melhorou a liberação de MHET em 20, 16 e 23%, respectivamente, e TPA em 34, 64 e 49%, respectivamente, por IsPETse.
[0116] A sinergia entre A LPM09A e /sPETase também foi encontrada quando o substrato foi primeiro tratado com 0,5, 2 ou 4 mM de A LPM09A na ausência de AscAc, concordando com os dados de microscopia de força atómica no que diz respeito à modificação LPMO de PET, mesmo sem a adição do doador de elétrons. No entanto, a melhora na liberação de MHET e TPA foi menor do que aquela alcançada nas reações com AscAc: 9-24% e 18-40%, respectivamente, revelando a importância dos doadores de elétrons livres na reação para promover a atividade de A/LPM09A.
[0117] Além do substrato, os sobrenadantes das reações com Ai LPM09A foram fervidos e adicionados com /sPETase, mas nem MHET, nem TPA foram detectados nesta condição.
[0118] Dada a atividade semelhante de /sPETase em pH 7,2 / 30 °C (1 ,709 + 0,06 U / mg de proteína) e pH 6,0 / 37 °C (1 ,969 + 0,02 U / mg de proteína) usando a-naftil acetato (N-ace) como substrato, a condição posterior foi adotada nos ensaios de sinergia com a adição simultânea de /sPETase e At LPM09A. As reações com /sPETase e A/LPM09A em uma proporção de 1 : 1 (sem AscAc) resultaram em uma ligeira melhora de MHET (10%) e TPA (8%). A adição sucessiva de A/LPM09A a 1 :10, 1 :15, 1 :20 e 1 :35 diminuiu a atividade da /sPETase.
[0119] A adição de AscAc à /sPETase afetou sua atividade em PET e ésteres de naftilo, o que pode ser atribuído a uma queda no pH da reação de 6,0 para 4,9. No entanto, uma melhoria de 20% na concentração de MHET e TPA foi registrada após a adição de A/LPM09A 1 :1 nesta condição.
Exemplo 8: Teste de atividade de A LPMQ9A em outros substratos
[0120] Além do PET, os polietilenos de alta (PEAD) e baixa densidade (PEBD) foram avaliados como substrato para a atividade de A/LPM09A.
[0121] A modificação de superfície causada por A/LPM09A em garrafa de suco e sacola plástica, ambas de PEAD, é evidente em comparação aos controles com AscAc. A erosão foi mais sutil do que a provocada em garrafa PET e melhor verificada em imagens topográficas de microscopia de força atómica 1x1 pm, que foi confirmada pela média do diâmetro (34 e 17 nm) e profundidade (4,8 e 4,4 nm) das áreas erodidas no suco garrafa e sacola plástica, respectivamente. Nenhuma atividade em PEBD foi detectada nas condições testadas.

Claims

REIVINDICAÇÕES
1. Composição enzimática para uso na degradação de poliéster, caraterizada por compreender pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos selecionada a partir de uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 2, uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 5, ou uma mistura dessas; e um veículo aceitável.
2. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de que a enzima que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 2 está presente em uma concentração entre aproximadamente 0,001 % e aproximadamente 0,100 % em peso total da composição, preferencialmente entre aproximadamente 0,002 % e aproximadamente 0,005 % em peso total da composição.
3. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a enzima que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 2 é a LPMOAIO (AA10) isolada de Kitasatospora papulosa.
4. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo fato de que a enzima que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NQ 5 está presente em uma concentração entre aproximadamente 0,001 % e aproximadamente 0,100 % em peso total da composição, preferencialmente entre aproximadamente 0,002 % e aproximadamente 0,005 % em peso total da composição.
5. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 5 é a A/LPMOA9 (AA9) isolada de Aspergillus fischeri.
6. Composição enzimática, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender, adicionalmente, pelo menos uma cutinase.
7. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a cutinase é uma PETase.
8. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de a PETase estar em uma concentração entre aproximadamente 0,0005 % e aproximadamente 0,0500 % em peso total da composição, preferencialmente entre aproximadamente 0,0010 % e aproximadamente 0,0025 % em peso total da composição.
9. Composição enzimática, caracterizada por compreender: aproximadamente 0,003 % de LPMOAIO; aproximadamente 0,003 % A/LPMOA9; e um veículo aceitável.
10. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por compreender, adicionalmente, 0,002 % de uma PETase.
11. Uso da composição enzimática tal qual definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ser na degradação de polietileno tereftalato (PET).
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11 , caracterizado pelo fato de que o PET é selecionado a partir de garrafas de líquidos, embalagens de alimentos, filmes para janelas, filmes de Raio-X, fibras de tecidos, uma mistura destes e quaisquer outros materiais majoritariamente constituídos de PET, sem limitações.
13. Método de degradação de PET, caracterizado por empregar pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos selecionada a partir de uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 2, uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 5, ou uma mistura dessas.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser conduzido em meio aquoso, em que o meio aquoso compreende um tampão.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender a adição de pelo menos uma substância doadora de elétrons, em que a substância doadora de elétrons é ácido ascórbico.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 2 é KpLPMOAIO (AA10) isolada de Kitasatospora papulosa.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que KpLPMOAIO (AA10) é empregada em uma quantidade variando de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50,00 miligramas de enzima por grama de PET, preferencialmente em uma quantidade variando de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 20,0 miligramas de enzima por grama de PET.
18. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 5 é A/LPMOA9 (AA9) isolada de Aspergillus fischeri.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que A/LPMOA10 (AA10) é empregada em uma quantidade variando de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50,00 miligramas de enzima por grama de PET, preferencialmente em uma quantidade variando de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 20,0 miligramas de enzima por grama de PET.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado por empregar, adicionalmente, pelo menos uma cutinase, em que a cutinase é uma PETase.
21. étodo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a PETase é empregada em uma quantidade variando de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 25,00 miligramas de PETase por grama de PET, preferencialmente aproximadamente 1 ,0 a aproximadamente 10,0 miligramas de PETase por grama de PET.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado por ser conduzido em valores de pH variando de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 9,0, preferencialmente variando de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado por ser conduzido em uma temperatura variando de aproximadamente 20 QC a aproximadamente 60 QC, preferencialmente 30 QC a aproximadamente 40 eC.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado por ser conduzido em um período variando de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 48 horas, preferencialmente em um período variando de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 48 horas.
25. Uso de pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos caracterizada por ser na degradação enzimática de poliéster, em que a dita monooxigenase lítica de polissacarídeos degrada o dito poliéster sem o auxílio de uma ou mais enzimas canónicas, em que as enzimas canónicas são uma PETase ou uma mistura de PETases.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a monooxigenase lítica de polissacarídeos compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 22.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a monooxigenase lítica de polissacarídeos que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 2 é oriunda de Kitasatospora papulosa.
28. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a monooxigenase lítica de polissacarídeos compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 5.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a monooxigenase lítica de polissacarídeos que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID NQ 5 é oriunda de Aspergillus fischeri.
30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, caracterizado pelo fato de que o poliéster compreende polietileno tereftalato (PET).
31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o PET é selecionado a partir de garrafas de líquidos, embalagens de alimentos, filmes para janelas, filmes de Raio-X, fibras de tecidos, uma mistura destes e quaisquer outros materiais majoritariamente constituídos de PET, sem limitações.
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