BR102021009404A2 - Uso de monooxigenases líticas de polissacarídeos, composição enzimática contendo-as e método de degradação de polímeros plásticos - Google Patents

Abstract

A presente invenção trata da nova atividade da composição enzimática contendo monooxigenases líticas de polissacarídeos ( Lytic Polysaccharide Mono-oxigenases – LPMOs) bacterianas ( Auxiliary Activity 10, AA10) e/ou fúngicas ( Auxiliary Activity 9, AA9) para a degradação de polietileno tereftalato (PET) e polímeros plásticos relacionados. Os genes que codificam Kp LPMO10A (AA10) e Af LPMO9A (AA9) foram isolados a partir dos micro-organismos Kitasatospora papulosa e Aspergillus fischeri , respectivamente. Metodologias como microscopia de força atômica (MFA) e espectroscopia de fotoelétrons excitados por raios X ( X-ray photoelectron spectroscopy ou XPS) detectaram alterações na morfologia e na composição química superficial do PET encontrado em garrafas de líquidos quando tratados com LPMOs. As condições brandas de temperatura empregadas durante a reação LPMO-PET favorecem a aplicação dessas enzimas no auxílio a enzimas canônicas (PETases) para desconstrução de plásticos favorecendo a economia circular do PET.

Description

USO DE MONOOXIGENASES LÍTICAS DE POLISSACARÍDEOS, COMPOSIÇÃO ENZIMÁTICA CONTENDO-AS E MÉTODO DE DEGRADAÇÃO DE POLÍMEROS PLÁSTICOS REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Este pedido contém uma listagem de sequências em forma legível por computador. A forma legível por computador é incorporada aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção se insere nas grandes áreas química e ambiental, especificamente nas áreas de biodegradação, biorremediação e biofragmentação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] O plástico é encontrado em várias áreas da indústria, tendo aplicações diversas, tais como em embalagens de alimentos, produtos farmacêuticos, brinquedos, produtos de uso geral doméstico, na construção civil e decoração e inúmeras outras indústrias. Cada material plástico apresenta composição química distinta, sendo alguns deles reutilizáveis e outros com complexo processo de reciclagem.

[0004] Os polímeros plásticos são classificados em dois grandes grupos distintos de acordo com o processamento e comportamento térmico: os termoplásticos e os termofixos. Os primeiros são moldáveis, por amolecer quando aquecidos; e os segundos, não são facilmente moldáveis por aquecimento (Spinacé e de Paoli, A tecnologia da reciclagem de polímeros. Química Nova , 2005, 28 (1), 65-72).

[0005] Dentre os plásticos que são produzidos e utilizados para diversos fins comerciais, encontram-se o polietileno tereftalato (PET ou PETE ou poliéster), polietileno de alta densidade (HDPE ou PEAD), cloreto de polivinila (PVC), polietileno de baixa densidade (LDPE ou PEBD), polipropileno (PP), poliestireno (PS, isopor), poliuretano (PU), politetrafluoroetileno (Teflon) e outros plásticos que podem ser estratificados ou misturados com outros tipos de poliésteres.

[0006] Um levantamento realizado em 2018 mostrou que os principais materiais plásticos consumidos no Brasil são o PP (20,3%), PEAD (13,5%) e PEBD (11,4%). O PET representa 5,9% do consumo nacional. Em 2012, a taxa de reciclagem do PET no Brasil era de 58% (Abiplast 2019, disponível em http://www.abiplast.org.br/wp-content/uploads/2019/10/perfil2018-web_VC.pdf; https://sidra.ibge.gov.br/tabela/1202#resultado , acesso 02 de abril de 2020).

[0007] O PET é um termoplástico semi-aromático. Trata-se de um polímero semi-cristalino, higroscópico e incolor com excelente capacidade de revestimento, boa resistência à tração e resistência ao impacto. É um dos plásticos de poliéster mais abundantes e fabricados mundialmente, tendo inúmeras aplicações: contêineres pré-fabricados, produtos termo-formados, setor têxtil, mobílias, implantes médicos e indústrias de automóveis, aviação e aeroespacial.

[0008] Uma das principais aplicações do PET está no campo de embalagens como garrafas ou filmes, devido às suas excelentes propriedades de barragem de água, gás e umidade, além de baixa permeabilidade (Koshti, Mehta e Samarth, Biological Recycling of Polyethylene Terephthalate: A mini-review, Journal of Polymers and the Environment 2018, 26, 3520-3529).

[0009] Desde que o setor de plástico surgiu, a produção desse produto alcançou um total de 8,3 bilhões de toneladas no mundo e, desse montante produzido, a maioria é usada apenas uma vez e imediatamente descartada, em geral, em aterros sanitários.

[0010] Em 2018, a Organização das Nações Unidas (ONU) iniciou um movimento de conscientização global sobre o descarte de objetos plásticos no meio ambiente e seus efeitos. Um dos principais agravantes da poluição causada por materiais plásticos ocorre devido à alta meia-vida desse material que, por vezes, leva mais de 200 anos para se decompor na natureza, o que acarreta um forte impacto ambiental, principalmente quando descartado em oceanos. No ambiente marinho, o plástico afeta os seres desse ecossistema ao alterar ciclos bioquímicos inerentes à flora marinha devido ao bloqueio da penetração de oxigênio e luz no mar. Além disso, tartarugas e peixes podem vir a se alimentar de material plástico, levando-os a óbito. Cerca de 91 % do plástico utilizado mundialmente não é reciclado.

[0011] Segundo dados do Banco Mundial (2018), o Brasil é o quarto maior produtor de resíduos plásticos no mundo, com 11,3 milhões de toneladas, ficando atrás apenas dos Estados Unidos (70 milhões de toneladas), China (54,7 milhões de toneladas) e Índia (19,3 milhões de toneladas). Desse total de resíduos gerados, mais de 10,3 milhões de toneladas são coletadas (91 %), mas apenas 145 mil toneladas (1,28 %) são efetivamente recicladas, considerado um dos menores índices da pesquisa e bem abaixo da média global de reciclagem do plástico, que é de 9 %. Geralmente, os resíduos são destinados de forma irregular, onde as cooperativas trabalham com pouca eficiência, já que cerca de 10 % dos resíduos que recebem é rejeito não reaproveitável (Kaza et al. Word Bank Group 2018, What a waste 2.0 – A Global Snapshot of Solid Waste Management to 2050, v.1, 275p).

[0012] Mesmo nas usinas de reciclagem, há perdas durante a categorização dos tipos de plásticos por estarem contaminados, serem multicamadas ou de baixo valor. O destino de 7,7 milhões de toneladas de plástico é o aterro sanitário; enquanto outros 2,4 milhões de toneladas são descartados de forma irregular, sem qualquer tipo de tratamento, em vazadouro a céu aberto.

[0013] A reciclagem de plásticos pode ser classificada em primária, secundária, terciária e quaternária. A primária é a reintrodução de sucatas e fragmentos de polímeros no ciclo para produção de produtos similares com características semelhantes às dos produtos originais (Pinto, A. G. Lixo Municipal: Manual de Gerenciamento Integrado, IPT/CEMPRE 2018, 4aed, 351p). A secundária trata do reprocessamento mecânico de materiais poliméricos simples e envolve as seguintes etapas: trituração, separação, lavagem e extrusão (Al-Salem, Lettieri e Baeyens, The valorization of plastic solid waste (PSW) by primary to quaternary routes: From re-use to energy and chemicals, Progress in Energy and Combustion Science 2010, 36, 103-129). A terciária, ou química, envolve o processo de despolimerização por processos termoquímicos (pirólise, conversão catalítica) (Pinto, A. G. Lixo Municipal: Manual de Gerenciamento Integrado, IPT/CEMPRE 2018, 4aed, 351p; Al-Salem, Lettieri e Baeyens, The valorization of plastic solid waste (PSW) by primary to quaternary routes: From re-use to energy and chemicals, Progress in Energy and Combustion Science 2010, 36, 103-129; Hopewell, Dvorak e Kosior, Plastics recycling: challenges and opportunites. Philosofical Transactions of the Royal Society B 2009, 364, 2115-2126). A reciclagem química é uma alternativa aos resíduos plásticos que esgotaram a capacidade de reciclagem pelo método secundário e aos filmes plásticos, laminados e multicamadas (British Plastics Federation, Plastics Recycling. <http://www.bpf.co.uk/sustainability/plastics_recycling.aspx>, acesso 02 de abril de 2020). A quaternária, ou recuperação energética de resíduos, acontece pelo método de incineração gerando vapor ou energia, reduzindo o volume do material em 90 a 99 % em volume e diminuindo o descarte em aterro. Entretanto, esse método deve ser monitorado devido ao decorrente impacto ambiental (Al-Salem, Lettieri e Baeyens, The valorization of plastic solid waste (PSW) by primary to quaternary routes: From re-use to energy and chemicals, Progress in Energy and Combustion Science , 2010, 36, 103-129; Hopewell, Dvorak e Kosior, Plastics recycling: challenges and opportunites. Philosofical Transactions of the Royal Society B 2009, 364, 2115-2126).

[0014] Uma outra rota também conhecida de degradação de plásticos, conhecida como intemperismo ou fotodegradação, envolve a exposição à luz UV, além de alterações mecânicas ocasionadas por ondas e ventos ou trituração em rochas e sedimentos marinhos, que eventualmente quebram plásticos maiores em pedaços menores conhecidos como micro- (> 5 mm) e nanoplásticos (0,1 µm). Entretanto, essas partículas menores são prováveis de se incorporarem na cadeia alimentar e findarem no intestino de animais, inclusive o homem, embora ainda não tenha sido determinado em estudo de caso (Danso, Chow e Streit, Plastics: Environmental and biotechnologycal pespectives on microbial degradation. Applied and Environmental Microbiology 2019, 85 (19), 1095-1109).

[0015] O PET, que constitui unidade funcional entre o ácido tereftálico (AT) e o etileno glicol (EG) é, via de regra, reciclado das seguintes maneiras: 1) o material é granulado, limpo e extrusado para tornar-se novamente uma garrafa PET; ou 2) o PET é decomposto em seus monômeros que podem ser repolimerizados. Ambas abordagens são conduzidas em altas temperaturas.

[0016] Assim, de um modo geral, os principais métodos de reciclagem requerem condições de alta temperatura e alta pressão (métodos químicos) ou consomem uma grande quantidade de energia e/ou geram uma grande quantidade de substâncias tóxicas e nocivas ao meio ambiente, o que resulta inclusive em poluição secundária (biológicos).

[0017] Para minimizar esses efeitos a partir de uma abordagem ambientalmente sustentável para a reciclagem de produtos plásticos, tem-se sido aplicado e estudado intensivamente os métodos de biodegradação (Ma et al, Enhanced Poly(ethylene terephthalate) hydrolase activity engineering. Engineering 2018, 4, 888-891; Yoshida et al, A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate. Science 2016, 351 (6278), 1196-1199).

[0018] Pesquisas recentes referentes à biodegradação têm abordado a capacidade de micro-organismos em degradar plástico. Com o atual conhecimento sobre a degradação de plástico por meio microbiano, sabe-se que enzimas secretadas ou obtidas a partir de micro-organismos atuam principalmente em polímeros de polietileno tereftalato (PET) e poliuretano (PU). No entanto, as melhores enzimas e micro-organismos ativos em PU e PET ainda apresentam taxas de catálise moderadas.

[0019] Em geral, a degradação microbiana de polímeros é um processo lento. Essa alta resistência se deriva principalmente do alto peso molecular da fibra, das fortes interações C-C e da superfície extremamente hidrofóbica, que é muito difícil de ser atacada por enzimas. Além disso, os polímeros apresentam diferentes ordenações moleculares (e.g. formas amorfas e cristalinas), resultando em diferentes níveis de degradabilidade (Danso, Chow e Streit, Plastics: Environmental and biotechnologycal pespectives on microbial degradation. Applied na Environmental Microbiology 2019, 85 (19), 1095-1109).

[0020] A primeira evidência de biodegradação de poliésteres aromáticos foi reportada em estudo publicado em 2005, no qual o micro-organismo Thermobifida fusca foi empregado para degradação de PET (Müller et al, Enzymatic degradation of Poly(ethylene terephthalate): rapid hydrolyse using a hydrolase form T. fusca. Macromolecular Rapid Communication 2005, 26, 1400-1405). A partir de então, outros micro-organismos foram testados na degradação desse substrato.

[0021] Por exemplo, o documento de patente de invenção JP2000143868 descreve o método de degradação de poliéster aromático com os micro-organismos Trichosporon FEM BP-6445 e Arthrobacter FERM BP-6444.

[0022] O documento de patente de invenção WO2005019439 descreve o gênero Rhizobium, em particular, Rhizobium sp. OKH-03, possuindo habilidade de degradar poliésteres aromáticos.

[0023] O documento de patente de invenção JP20081999957 descreve o bacilo 201-F6 gram negativo isolado a partir de solo com atividade de degradação de poliéster aromático.

[0024] Uma abordagem da biodegradação consiste no uso de enzimas isoladas a partir de micro-organismos. Atualmente, existem 27 enzimas funcionais e verificadas conhecidas, das quais a maioria é discriminada bioquimicamente de acordo com os substratos de polímeros sintéticos ou oligômeros/monômeros aos quais elas se ligam. As enzimas cutinases representam a maior fração dominante dentro dos estudos realizados.

[0025] Por exemplo, tem-se sido relatadas que as enzimas Thermobifida alba Cut1 (ADV92525), Thermobifida fusca Cut2 (CBY05530), Thermobifida fusca Cut1 (AET05798), Thermobifida halotolerans Serine hydrolase (AFA45122), Saccharomonospora viridis Cutinase (BAO42836), Thermomonospora curvata triacilglicerol lipase(WP 012851645), LCC (AEV21261), Ideonella sakaiensis PETase (GAP38373), Polyangium brachysporum triacilglicerol lipase (WP047194864), Vibrio gazogenes lipase (WP021018894), LiplAF5-2 (ACC95208), Oleispira antarctica LipA (CCk74972), Ideonella sakaiensis MHETase (WP 082368715), Humicola insolens cutinase (4OYY) e Fusarium oxysporum cutinase (5AJH) degradam substratos de polietileno. Para degradação do substrato poliamida (PA) tem-se sido aplicadas as enzimas Arthrobacter sp NylE (WP079941038), Arthrobacter sp NylA (BAA05090), Arthrobacter sp NylB (CAA24927), Arthrobacter sp NylC (YP001965068). As enzimas Pseudomonas oleovorans AHs (CAB54050), Pseudomonas fluorescens StyB (CAB06823), Pseudomonas fluorescens StyA (CAB06823) e Pseudomonas fluorescens StyC (CAB06825) degradaram poliestireno (PS), enquanto a degradação do poliuretano (PU) pode ocorrer com Pseudomonas fluorescens PueA (AAC23718), Pseudomonas fluorescens PueB (AAY92474) e Pseudomonas fluorescens PulA (AAF66684)(Danso, Chow e Streit, Plastics: Environmental and biotechnological perspectives on microbial degradation. Applied Environmental Microbiology 2019, 85 (19), 1095-1109).

[0026] A desconstrução enzimática do polietileno tereftalato (PET) tem sido objeto de extensa pesquisa anterior e pode ser agrupada em duas categorias: (1) modificação enzimática da superfície do poliéster ou (2) despolimerização em seus respectivos monômeros. Diferentes enzimas com propriedades específicas são necessárias para esses dois processos. A modificação enzimática da superfície é possível com várias famílias de enzimas, como lipases, carboxilesterases, cutinases e proteases. Por outro lado, a obtenção de monômeros a partir de PET requer uma degradação substancial dos componentes do PET; portanto, apenas um número limitado de cutinases, reconhecido como PETases, atua liberando monômeros a partir do PET. A primeira hidrolase de PET foi descoberta por Müller et al. (Enzymatic degradation of poly(ethylene terephthalate): rapid hydrolyse using hydrolase from T. fusca . Macromolecular Rapid Communications 2005, 26, 1400-1405).

[0027] Existe, portanto, uma necessidade de se obter enzimas que apresentem atividade de degradação de PET e que possam ser empregadas industrialmente na reciclagem desse material.

[0028] As mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (do inglês, lytic polysaccharide monooxygenases ), ou LPMOs, constituem um grupo de enzimas identificado recentemente. Essas enzimas foram originalmente classificadas como uma família GH (glicosil hidrolase) ou CBM (módulo de ligação ao carboidrato), sendo agora pertencentes às enzimas de atividades auxiliares (AAs), identificadas sob as classes AA9 – AA11 e AA13 – AA16 nos bancos de dados CAZy. Sabe-se que a presença de LPMOs em um coquetel enzimático pode aumentar a atividade de GHs canônicas em até duas ordens de magnitude. Além da celulose, as LPMOs oxidam uma ampla gama de polímeros à base de sacarídeos, incluindo hemicelulose, amido e quitina. Notavelmente, algumas LPMOs exibem promiscuidade de substrato. No geral, LPMOs aumentam o desempenho das GHs ao atuarem em regiões onde GHs não atuam aumentando o repertório de extremidades a serem reconhecidas pelas GHs canônicas (Chen et al. Enzymatic degradation of plant biomass and synthetic polymers. Nature Reviews Chemistry 2020, 4: 114–126).

[0029] Kp LPMO10A é uma LPMO obtida a partir de Kitasatospora papulosa e clonada em Escherichia coli , tendo sido descrito seu uso para degradar biomassa lignocelulósica (Corrêa et al, An actinobacteria lytic polysaccharide Mono-oxigenase acts on both cellulose and xylan to boost biomass saccharification. Biotechnology for Biofuels 2019, 12:117).

[0030] Apesar de o mecanismo catalítico e as aplicações das LPMOs terem atraído interesse da indústria nos últimos anos, o uso dessa classe de enzimas como agentes de biodegradação de plásticos quase não foi explorado.

[0031] Foi identificado apenas o documento WO201412506 abordando o uso de glicosil hidrolase 61 (GH61), antiga denominação de AA9, oriunda de diversos gêneros de bactérias (gram positivo: Bacillus sp. e Streptomyces sp. ou gram negativo: E.coli ou Pseudomonas sp.) e fungos ( Candida , Kluyveromyces , Pichia , Saccharomyces , Schizosaccharomyces ou Yarrowia ou fungos filamentosos) associado a cutinases para o tratamento de tecidos à base de poliéster (PET). Os inventores demonstraram que a associação das enzimas apresenta maior degradação do tecido que apenas com cutinases. Contudo, o documento não aborda o uso isolado de LPMOs na degradação de PET, muito menos na degradação de rejeitos plásticos oriundos de garrafas ou frascos. Além disso, o processo da degradação enzimática descrito ocorreu mediante altas temperaturas (entre 65 e 90 °C), assim como comumente relatado para a reciclagem de PET.

[0032] Dessa forma, existe a necessidade de fornecimento de uma alternativa à degradação enzimática de polietileno tereftalato (PET) que seja vantajosa em relação às alternativas descritas no estado da técnica.

[0033] Além disso, não foi encontrado nenhum documento do estado da técnica que se refere ou que sugere um processo de degradação enzimática por monooxigenases líticas de polissacarídeos ( Lytic Polysaccharide Mono-oxigenases – LPMOs) isoladas a partir da bactéria Kitasatospora papulosa e do fungo filamentoso Aspergillus fischeri , onde a sua função até então conhecida apenas para hidrolisar os compostos lignocelulósicos, podem ser empregadas na degradação de materiais plásticos poliésteres sem o auxílio de enzimas canônicas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0034] A presente invenção descreve um novo uso de enzimas pertencentes à família das monooxigenases líticas de polissacarídeos ( Lytic Polysaccharide Mono-oxygenases – LPMOs). Mais precisamente, a presente invenção descreve o uso de LPMOs na degradação de polietileno, mais especificamente, na degradação de polietileno tereftalato (PET).

[0035] As LPMOs da presente invenção são isoladas a partir de micro-organismos, sendo preferencialmente isoladas a partir de bactérias do gênero Kitasatospora sp. e a partir de fungos do gênero Aspergillus sp.

[0036] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição enzimática para uso na degradação de poliéster que compreende pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos da presente invenção e um veículo aceitável. Em uma modalidade específica, a composição da presente invenção compreende, adicionalmente, uma cutinase, mais especificamente uma PETase

[0037] Em uma segunda modalidade, a presente invenção fornece o uso da composição enzimática da presente invenção na degradação de polietileno tereftalato (PET).

[0038] Em uma terceira modalidade, a presente invenção fornece um método de degradação de PET que compreende o uso de pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos da presente invenção. Em uma modalidade específica, o método da presente invenção compreende empregar, adicionalmente, uma cutinase, mais especificamente uma PETase.

[0039] Por fim, em uma quarta modalidade, a presente invenção fornece o uso de pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos na degradação enzimática de poliéster, em que a dita monooxigenase lítica de polissacarídeos degrada o dito poliéster sem o auxílio de pelo menos uma enzima canônica. Em uma modalidade preferencial, são utilizadas as monooxigenases líticas de polissacarídeos da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0040] Na figura 1 apresenta-se o vetor de expressão para Kp LMO10A (ou LPMO AA10) a partir de Kitasatospora papulosa (A) e Af LPMO9A (ou LPMO AA9) a partir de Aspergillus fischeri (B).

[0041] Na figura 2 apresenta-se o perfil proteico de Kp LPMO10A (A), Af LPMO9A (B) e Is PETase (C) obtido a partir de dois passos cromatográficos.

[0042] Na figura 3 apresenta-se imagens obtidas por Microscopia de Força Atômica de filmes de PET Mylar tratados com LPMOs. A: controle não tratado; B: filme tratado com Kp LPMO10A; D: filme tratado com Af LPMO10A.

[0043] Na Figura 4 apresenta-se as imagens obtidas por Microscopia de Força Atômica de PET de garrafas tratado com LPMOs. A, controle não tratado; B, PET tratado com Kp LPMO10A; C, PET tratado com Af LPMO9A.

[0044] Na Figura 5 apresenta-se os espectros obtidos pela técnica de XPS do controle (A), PET de garrafa pós-degradação enzimática por Af LPMO9A.

[0045] Na figura 6 apresenta-se a predição dos possíveis produtos gerados por LPMOs a partir de PET.

[0046] Na figura 7 apresentam-se os espectros de emissão de fluorescência de cartões de garrafa PET tratados e não tratados com as enzimas da presente invenção. (A): face interna. (B): face externa. O material foi excitado a 340 nm.

[0047] Na figura 8 apresentam-se os resultados dos ensaios de sinergismo entre Af LPMO9A (LPMO) e Is PETase (PETase) sobre PET, com as medidas de liberação de mono (2-hidroxietil) tereftalato (MHET) e ácido tereftálico (TPA). (A) Atividade de Is PETase em PET de garrafa moído e bloco. (B) Liberação de MHET e TPA por Is PETase a partir de PET moído pré-tratado com diferentes concentrações de Af LPMO9A. (C) Liberação de MHET e TPA por Is PETase em reações com adição simultânea de Is PETase e Af LPMO9A em diferentes concentrações. (D) Atividade de Is PETase em N-acetato e N-butirato na ausência e presença de ácido ascórbico.

[0048] Na figura 9 apresentam-se imagens topográficas de microscopia de força atômica de garrafa de suco e sacola plástica, ambas de PEAD, tratadas com AscAC (E e G, controle) e na presença de Af LPMO9A (F e H). As setas apontam para as erosões sobre o material, causadas pela ação enzimática.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0049] A presente invenção descreve um novo uso de enzimas pertencentes à família das monooxigenases líticas de polissacarídeos ( Lytic Polysaccharide Monooxygenases – LPMOs).

[0050] Quando empregadas de maneira isolada, isto é, sem a presença de enzimas com outras funções, as enzimas da família das LPMOs são conhecidas apenas por sua atividade de oxidação de polissacarídeos, tais como celulose, hemicelulose, amido e quitina.

[0051] Os inventores da presente invenção verificaram que as LPMOs têm atividade de degradação de polietileno, o que é surpreendente à luz das atividades dessas enzimas descritas até então, demonstrando seu uso na degradação de plásticos, mais precisamente na degradação de polietileno tereftalato (PET).

[0052] Igualmente surpreendente, os inventores da presente invenção demonstraram que as LPMOs da presente invenção apresentam atividade de degradação de PET de modo isolado, isto é, sem a necessidade do uso concomitante de enzimas canônicas, como cutinases ou PETases.

[0053] Além disso, os inventores da presente invenção demonstraram que a associação das LPMOs da presente invenção com enzimas canônicas apresenta um efeito sinérgico surpreendente na degradação de PET

[0054] Os inventores da presente invenção também desenvolveram um método de degradação de polietileno empregando as LPMOs da presente invenção, o qual ocorre à 30-37°C, sendo vantajoso em relação aos demais métodos de degradação enzimática de polietileno descritos no estado da técnica.

[0055] As LPMOs da presente invenção compreendem uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com as sequências SEQ ID Nº 2 ou SEQ ID Nº 5.

[0056] As LPMOs da presente invenção, compreendendo pelo menos 60 % de identidade com as sequências SEQ ID Nº 2 ou SEQ ID Nº 5, podem ser isoladas a partir de bactérias ou fungos. Dentre as LPMOs bacterianas incluem-se as de Bacillus sp., Burkholderia sp., Caldibacillus sp. , Cellvibrio sp. , Enterococcus sp. , Hahella sp. , Jonesia sp. , Listeria sp. , Micromonospora sp. , Nocardiopsis sp. , Photorhabdus sp. , Serratia sp. , Teredinibacter sp. , Thermobifida sp. e Vibrio sp.; mais especificamente, Streptomyces sp., por exemplo, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces pratensis, Streptomyces atroolivaceus, Streptomyces swartbergensis, Streptomyces azureus, Streptomyces afghaniensis, Streptomyces coeruleoribdus, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces coelicoflavus, Streptomyces pactum, Streptomyces qaidamensis, Streptomyces olivaceus, Streptomyces africanus, Streptomyces iakyrus, Streptomyces regalis, Streptomyces luteus, Streptomyces cyaneogriseus, Streptomyces havaiiensis, Streptomyces rubrogriseus, Streptomyces marokkonensis, Streptomyces corynorhini, Streptomyces pharetrae, Streptomyces glauscescens, Streptomyces capillispiralis ; mais especificamente, K itasatospora sp., por exemplo, Kitasatospora cheerisanensis, Kitasatospora aureofaciens, Kitasatospora aburaviensis, Kitasatospora herbaricolor, Kitasatospora misakiensis, Kitasatospora xanthocidica e Kitasatospora papulosa . As LPMOs fúngicas incluem as oriundas de Gloeophyllum sp. , Heterobasidium sp. , Pleurotus sp. , Pestalotiopsis sp. , Phanerochaete sp. , Podospora sp. , Lentinus sp. , Miceliophythora sp. , Neurospora sp. , Trametes sp. , Thermoascus sp. , Thermothelomyces sp. e Trichoderma sp.; mais especificamente, Penicillium , por exemplo, Penicillium oxalicum, Penicillium subrubescens, Penicillium rolfsii, Penicillium brasilianum, Penicillium antarcticum, Penicillium arizonense, Penicillium steckii, Penicillium vulpinum, Penicillium expansum, Penicillium camemberti, Penicillium solitum, Penicillium coprophilum, Penicillium roqueforti, Penicillium polonicum, Penicillium freii, Penicillium rubens, Penicillium griseofulvum, Penicillium digitatum, Penicillium italicum e Penicillium nalgiovense ; mais especificamente, Aspergillus sp., por exemplo, Aspergillus lentulus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus novofumigatus, Aspergillus turcosus, Aspergillus thermomutatus, Aspergillus udagawae, Aspergillus clavatus, Aspergillus homomorphus, Aspergillus aculeatinus, Aspergillus fijiensis, Aspergillus brunneoviolaceus, Aspergillus uvacrum, Aspergillus aculeatus, Aspergillus tanneri, Aspergillus brasiliensis, Aspergillus terreus, Aspergillus tamarii, Aspergillus nidulans, Aspergillus caelatus, Aspergillus ibericus, Aspergillus piperis, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus flavus, Aspergillus kawachii, Aspergillus saccharolyticus, Aspergillus neoniger, Aspergillus glaucus, Aspergillus ruber, Aspergillus tubingensis, Aspergillus leporis, Aspergillus mulundensis e Aspergillus fischeri .

[0057] As LPMOs da presente invenção são preferencialmente oriundas de bactérias do gênero Kitasatospora sp. e de fungos do gênero Aspergillus sp. Preferencialmente, as enzimas da presente invenção são oriundas da bactéria Kitasatospora papulosa , como por exemplo a enzima Kp LPMO10A, e do fungo filamentoso Aspergillus fischeri , como por exemplo a enzima Af LPMO9A.

[0058] A cadeia polipeptídica de Kp LPMO10A consiste dos aminoácidos 39 a 224 da SEQ ID N O 2 abrangendo a histidina N-terminal (H39) típica de LPMOs e H146 e Y215 relacionados à coordenação do íon metálico, que pode ser um cobre.

[0059] A cadeia polipeptídica de Af LPMO9A consiste dos aminoácidos 20-247 da SEQ ID N O 5 abrangendo a histidina N-terminal (H20) típica de LPMOs e H105 e Y194 possivelmente relacionados à coordenação do íon metálico, que pode ser um cobre.

[0060] As enzimas da presente invenção podem ser obtidas por meio da transformação de vetores de expressão em células empregando-se etapas conhecidas da técnica. Por exemplo, as enzimas da presente invenção são expressas em células de Escherichia coli contendo vetores de expressão adequados cultivadas em meios e sob condições adequados e são extraídas por meio de lise empregando-se um protocolo adequado. As enzimas da presente invenção são então obtidas empregando-se técnicas de separação como, por exemplo, cromatografia de afinidade, sendo o perfil de proteínas das frações obtidas avaliado em gel SDS-PAGE. Etapas adicionais para purificação das enzimas da presente invenção podem ser aplicadas empregando-se técnicas adequadas, como cromatografia de gel filtração utilizando coluna adequada.

[0061] Em uma modalidade, a presente invenção fornece uma composição enzimática para uso na degradação de poliéster que compreende pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos da presente invenção (SEQ ID Nº 2 ou SEQ ID Nº 5) (LPMO), e um veículo aceitável.

[0062] Entende-se por veículo aceitável, dentro do escopo da presente invenção, um veículo aquoso que mantém as enzimas da presente invenção em suspensão ou solução quando em concentração adequadas, podendo conter, além de água, outros aditivos, como conservantes, agentes ou sistemas tamponantes etc.

[0063] As LPMOs da presente invenção estão presentes em concentração entre aproximadamente 0,001 % e aproximadamente 0,1 % em peso total da composição da presente invenção, preferencialmente entre aproximadamente 0,002 % e aproximadamente 0,005 % em peso total da composição.

[0064] As composições da presente invenção contêm pelo menos uma LPMO da presente invenção, podendo conter uma enzima isolada ou uma associação de enzimas dentro do contexto da invenção.

[0065] Em uma modalidade específica, a composição da presente invenção compreende, adicionalmente, uma cutinase, mais especificamente uma PETase.

[0066] Cutinases são enzimas relacionadas à degradação do poliéster alifático cutina, encontrado na cutícula vegetal. Todas as PET hidrolases (PETases)caracterizadas até então pertencem à família das cutinases. PETases apresentam um centro catalítico mais amplo quando comparado com cutinases, provavelmente relacionado à acomodação de poliésteres cristalinos semi-aromáticos. Poliesterases atuam preferencialmente em regiões amorfas do PET, ao contrário de LPMOs que atuam preferencialmente em regiões cristalinas nos substratos poliméricos onde sua atividade foi anteriormente relatada. Por isso, a atuação conjunta LPMO-PETase pode ser vantajosa assim como relatado para LPMOs-GHs.

[0067] Dentre os poliésteres e poliamidas reconhecidos pelas cutinases, incluem-se o poli(L-ácido lático) (PLA), polietileno furanoato (PEF), polibutileno adipato-co-tereftalato (PBAT), policaprolactona (PCL), polibutileno succinato (PBS), poliamida 6,6 e polietileno tereftalato (PET).

[0068] Cutinases com atividade de PET hidrolase (PETase) a serem empregadas na composição da presente invenção podem ser de origem fúngica ou bacteriana. As de origem fúngica contemplam as oriundas de Humicola sp. , Fusarium sp. , Aspergillus sp. e Penicillium sp. As bacterianas contemplam as oriundas de Acidovorax sp. , Rhizobacter sp. , Pseudomonas sp. , Streptomyces sp. , Thermobifida sp. , Saccharomonospora sp. , Clostridium e Ideonela sp., especificamente, Ideonela sakaiensis .

[0069] A concentração de PETase na composição da presente invenção varia entre aproximadamente 0,0005 % e aproximadamente 0,05 % em peso total da composição, preferencialmente entre aproximadamente 0,001 e aproximadamente 0,0025 % em peso total da composição.

[0070] Em uma segunda modalidade, a presente invenção fornece o uso da composição enzimática da presente invenção na degradação de polímeros plásticos, mais especificamente, polietileno.

[0071] De acordo com a presente invenção, os resíduos plásticos utilizados como substrato para degradação enzimática podem ser selecionados a partir de PEAD, PVC, PEBD, PP, PS, PC, PU, ABS, PE e PET, preferencialmente PU, ABS, PE e PET, mais preferencialmente ABS, PE e PET, ainda mais preferencialmente PE e PET e, ainda mais preferencialmente PET.

[0072] Dentre os resíduos que podem ser denominados PET, incluem-se garrafas de líquidos, embalagens de alimentos, filmes para janelas, filmes de Raio-X, fibras de tecidos e quaisquer outros materiais majoritariamente constituídos de PET, sem limitações.

[0073] Em uma terceira modalidade, a presente invenção fornece um método de degradação de PET que compreende o uso de pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos da presente invenção.

[0074] Surpreendentemente, os inventores da presente invenção identificaram que LPMOs podem ser empregadas isoladamente para a desconstrução do PET

[0075] O método de degradação de PET da presente invenção compreende adicionar pelo menos uma LPMO da presente invenção em meio aquoso que contém substrato.

[0076] A concentração da LPMO a ser empregada depende da origem e condições de pH e temperatura da reação, sendo inicialmente padronizada de acordo com métodos que são familiares ao técnico no assunto.

[0077] A concentração de LPMO nas reações da presente invenção encontra-se entre 0,01-50 miligramas de LPMO por grama de PET, preferencialmente 1-30 miligramas de LPMO por grama de PET, preferencialmente 2-20 miligramas de LPMO por grama de PET.

[0078] A concentração de substrato na forma de PET no processo da presente invenção varia entre 10-80% da reação, preferencialmente 20-70% da reação, preferencialmente 40-60% da reação, preferencialmente 30-50% da reação.

[0079] Em uma modalidade preferencial, o meio aquoso compreende, adicionalmente, uma solução tamponante.

[0080] A concentração da solução tamponante encontra-se entre 0,01-0,5M, preferencialmente 0,03-0,25M, preferencialmente 0,05-0,1M.

[0081] Em uma modalidade preferencial, o método de degradação de PET da presente invenção compreende uma etapa adicional, onde é adicionada uma substância doadora de elétrons para LPMO.

[0082] De acordo com a presente invenção, a molécula doadora de elétrons para LPMO pode ser selecionada a partir de ácido ascórbico e suas misturas.

[0083] A concentração da molécula doadora de elétrons para LPMO varia entre 0,3mM-2mM, preferencialmente 0,8-1,5mM, preferencialmente 0,5-1mM.

[0084] O tempo de reação da presente invenção é usualmente entre 5 minutos-48 horas, preferencialmente 10 minutos – 48 horas, mais preferencialmente 30 minutos-48 horas e, ainda mais preferencialmente, 60 minutos-48 horas.

[0085] O pH da reação é selecionado de acordo com a origem da LPMO empregada e é padronizado previamente, podendo ser entre pH 4.0-9.0, preferencialmente entre pH 5.0-8.0 e, mais preferencialmente, entre pH 5.5-7.5.

[0086] A temperatura da reação é selecionada de acordo com a origem da LPMO empregada e é padronizada previamente. A reação é conduzida em temperaturas entre 20-60°C, preferencialmente 25-55°C, preferencialmente 30-50°C Em uma modalidade específica, a temperatura empregada no método da presente invenção está abaixo de 40°C, preferencialmente 37 ºC.

[0087] Em uma modalidade específica, o método da presente invenção compreende empregar, adicionalmente, uma cutinase.

[0088] A concentração da PETase a ser empregada depende das condições da reação, sendo inicialmente padronizada. A concentração de PETase nas reações da presente invenção pode ser entre 0.005-25 miligramas de PETase por grama de PET, preferencialmente 0,5-15 miligramas de PETase por grama de PET, preferencialmente 1-10 miligramas de PETase por grama de PET.

[0089] No contexto da invenção, trata-se de uma composição de enzimas compreendendo uma monooxigenase lítica de polissacarídeos (LPMO), com reconhecida capacidade de oxidar a porção cristalina da estrutura de glucanos favorecendo a ação de (hemi)celulases sobre os substratos de lignocelulose, e/ou mistura com a hidrolase (PETase) para a potencial degradação de polímeros plásticos no setor de despolimerização/reciclagem.

[0090] Os exemplos a seguir ilustram as formas de execução preferenciais da presente invenção. Eles não limitam, portanto, o escopo de proteção da invenção, o qual é exclusivamente definido pelas reivindicações que acompanham esta descrição.

Exemplo 1: Preparo da construção de vetor de expressão para monooxygenases líticas de polissacarídeos da presente invenção

[0091] ETAPA 1: A bactéria K. papulosa (DSM4643) teve o DNA genômico extraído e utilizado para amplificação do gene de interesse KpLPMO10A (SEQ ID N° 1, nucleotídeo 115-672), que codifica a enzima AA10 Kp LPMO10A, com os primers KpF e KpR (Tabela 1). O produto da amplificação foi empregado para nova reação de PCR com os primers KpFpET22b e KpRpET22b (Tabela 1) para a adição de caudas de homologia ao vetor pET22b. O gene foi clonado no vetor pET22b(+) imediatamente após a sequência que codifica o peptídeo sinal pel B.

[0092] ETAPA 2:O gene AfLPMO9A (SEQ ID N° 3, nucleotídeo 58-741), que codifica a enzima AA9 Af LPMO9A, foi adicionado de sequência que codifica pel B (SEQ ID N° 4, nucleotídeo 1-66) e teve os códons otimizados para expressão em Escherichia coli . pel B + AfLPMO9A foi sintetizado e clonado nos sítios de restrição para as enzimas Nde I e Xho I no vetor pET21a(+) por Genscript (Piscataway).

[0093] ETAPA 3: O gene Is PETase (GenBank: BBYR01000074.1), que codifica a enzima PETase em Ideonella sakaiensis , teve os códons otimizados para expressão em E. coli. Is PETase foi sintetizado e clonado nos sítios de restrição para as enzimas Nde I e Xho I no vetor pET21b(+) por Genscript (Piscataway).

[0094] ETAPA 4: Os vetores pET22b(+)- KpLPMO10A e pET21a(+)- AfLPMO9A foram transformados (separadamente) em células de Escherichia coli Shuffle ® . As células foram cultivadas em meio TB e adicionadas de IPTG para propiciar a expressão das proteínas Kp LPMO10A (SEQ ID N° 2, aminoácido 39-224) ou Af LPMO9A (SEQ ID N° 2, aminoácido 20-247) durante 16 h a 18°C/250 rpm. As células foram centrifugadas e lisadas pelo protocolo de choque osmótico. Os sobrenadantes obtidos a partir da lise foram carregados em coluna de afinidade His-Trap 5mL (GE) para cromatografia. O perfil de proteínas das frações obtidas por cromatografia de afinidade foi avaliado em gel SDS-PAGE. As frações que continham proteínas com o tamanho esperado foram misturadas, concentradas e utilizadas para cromatografia de gel filtração utilizando coluna HiLoad Superdex G-75 16/60. As frações que continham proteínas puras do tamanho esperado (avaliadas por SDS-PAGE) foram misturadas, concentradas e avaliadas quanto à concentração (mg de proteína/mL). Kp LPMO10A ou Af LPMO9A foram tratadas com sulfato de cobre (CuSO 4 ) durante 16 horas a 4°C. O excesso de metal foi retirado em coluna Sephadex G-25 PD-10. Kp LPMO10A ou Af LPMO9A foram concentradas, quantificadas (mg de proteína/mL) e empregadas em experimentos posteriores.

Exemplo 2: Preparo da construção de vetor de expressão para PET hidrolase da presente invenção

[0095] ETAPA 1: O vetor pET21b(+)- Is PETase foi transformado em células de Escherichia coli BL21(DE3). As células foram cultivadas em meio LB e adicionadas de IPTG para propiciar a expressão de Is PETase durante 16 h a 18°C/250 rpm. As células foram centrifugadas e lisadas com auxílio de lisozima e sonicador. Os sobrenadantes obtidos a partir da lise foram carregados em coluna de afinidade His-Trap 5mL (GE) para cromatografia. O perfil de proteínas das frações obtidas por cromatografia de afinidade foi avaliado em gel SDS-PAGE. As frações que continham proteínas com o tamanho esperado foram misturadas, concentradas e utilizadas para cromatografia de gel filtração utilizando coluna HiLoad Superdex G-75 16/60. As frações que continham proteínas puras do tamanho esperado (avaliadas por SDS-PAGE) foram misturadas, concentradas e avaliadas quanto à concentração (mg de proteína/mL) e empregadas em experimentos posteriores.

Exemplo 3: Preparação do filme de poliéster para as reações enzimáticas

[0096] ETAPA 1: PET, Mylar e de garrafa, foram cortados em dimensões de 0,6 cm x 0,4 cm com o auxílio de uma tesoura. Posteriormente foram lavados com 1 mL de água Milli-Q com o auxílio de uma pipeta e submetidos a ultrassom durante 5 minutos. Esse procedimento foi realizado 3 vezes. Os plásticos foram secos em corrente de N 2 durante 10-15 minutos e armazenados para posterior uso.

Exemplo 4: Degradação enzimática de resíduos de filmes de poliéster

[0097] ETAPA 1: Ensaios que auxiliam a detecção direta de produtos liberados por LPMOs a partir de polímeros plásticos não se encontram disponíveis. As condições de reação adotadas inicialmente são as mesmas empregadas para substratos (hemi)celulósicos. As reações enzimáticas foram realizadas em tubos Eppendorf de 2 mL contendo PET (Mylar ou PET de garrafa), tampão fosfato de sódio 0,05 M, pH 6,0, 20 mg de Kp LPMO10A ou Af LPMO9A por grama de PET. Após 10 minutos a 37°C, as reações foram adicionadas de ácido ascórbico 1 mM e incubadas a 37°C, 850 rpm durante 48 horas.

[0098] O PET oriundo do tratamento enzimático foi enxaguado com 0,5 mL de água Milli-Q com o auxílio de uma pipeta e submetidos a ultrassom durante 5 minutos. Esse procedimento foi realizado 3 vezes. A fração líquida das reações foi submetida à fervura a 99°C durante 10 minutos e o material foi guardado para análises posteriores.

Exemplo 5: Medidas de caracterização do poliéster em estudo a. Microscopia de força atômica

[0099] O PET oriundo do tratamento enzimático foi submetido a análises por microscopia de força atômica utilizando o modelo Multimode8 e a controladora NanoScope V (Bruker, Alemanha) operando no modo PeakForce tapping com sondas modelo ScanAsyst-air (Bruker, Alemanha) de nitreto de silício com uma força nominal de 0.4 Nm -1 . As imagens obtidas (3x3 μm) foram tratadas no software Gwyddion.

b. Análise de espectroscopia de fotoelétrons excitados por raio-X ( X-ray photoelectron spectroscopy ou XPS)

[0100] Os espectros XPS foram obtidos com um espectrômetro VSW HA100 (Reino Unido) operado no modo energia de passagem constante, fixada em 44eV. Como excitação foi usada radiação de um anodo de Alumínio que produz fótons com 1486.6eV de energia. Os espectros de alta resolução foram coletados com passo próximo a 0.1 eV e tempo de acumulação suficiente para ter uma boa relação sinal/ruído. A pressão na câmara de análise foi mantida abaixo de 6x10 -8 mBar durante a análise.

[0101] As amostras foram fixas a um porta amostras de aço inoxidável com fita dupla face de carbono e introduzidas na câmara de análise.

[0102] O carregamento elétrico das amostras foi corrigido utilizando o valor do anel benzênico em 284.7 eV. A deconvolução foi feita utilizando Gaussianas. As imagens foram obtidas no software Origin.

[0103] Os genes que codificam as proteínas Kp LPMO10A (AA10) (SEQ ID Nº 1) e Af LPMO9A (AA9) (SEQ ID Nº 2) foram isolados a partir da bactéria Kitasatospora papulosa e do fungo filamentoso Aspergillus fischeri , respectivamente.

[0104] Kitasatospora e Streptomyces apresentam morfologias similares, mas diferem quanto à composição da parede celular, caracterizando Kitasatospora como um grupo distinto entre Streptomyces . Proteínas de Kitasatospora podem ser caracterizadas como pertencentes a Streptomyces sp. tendo em vista a alta identidade de sequências de aminoácidos entre os dois gêneros.

[0105] Kp LPMO10A, Af LPMO9A (SEQ ID Nº 1 A 5) e Is PETase foram expressas por células de E. coli transformadas com os vetores pET22b(+)- Kp LPMO10A, pET21a(+)- Af LPMO9A (Figura 1) e pET21a(+)- Is PETase, respectivamente e purificadas por dois passos cromatográficos (Figura 2).

[0106] A atividade de Kp LPMO10A e Af LPMO9A sobre filme de PET (Mylar) foi avaliada por microscopia de força atômica. Por meio da técnica de microscopia de força atômica, a topografia de uma amostra é obtida após varredura da sua superfície com uma sonda, sendo qualquer alteração superficial detectada. Reações conduzidas com Kp LPMO10A (Figura 3B) e Af LPMO9A (Figura 3C) levaram a alterações (erosões) na superfície do filme de PET quando comparado com a reação controle conduzida na ausência da enzima (Figura 3A). O efeito foi mais pronunciado quando Af LPMO9A foi empregada na reação (Figura 3C).

[0107] Da mesma forma que para o filme de PET (Mylar), a atividade de Kp LPMO10A e Af LPMO9A foi avaliada empregando-se PET de garrafas como substrato. Em comparação ao controle (Figura 4A), reação conduzida na ausência de enzimas, Kp LPMO10A (Figura 4B) e Af LPMO9A (Figura 4C) alteraram a superfície do PET de garrafas, sendo também o efeito (de erosão ou “descascamento” do PET) de Af LPMO9A mais pronunciado quando comparado a Kp LPMO10A. A mesma concentração de enzima foi adotada para Kp LPMO10A e Af LPMO9A em ambos os experimentos.

[0108] Tendo em vista as alterações notadas na superfície do PET principalmente em reações contendo Af LPMO9A, a enzima foi selecionada para os experimentos posteriores. O PET de garrafa residual obtido após tratamento com Af LPMO9A foi submetido à análise de espectroscopia de fotoelétrons excitados por raio-X ( X-ray photoelectron spectroscopy ou XPS). Os espectros obtidos por XPS são uma poderosa ferramenta para avaliar alterações químicas contidas na superfície de materiais, nesse caso, PET.

[0109] A intensidade dos picos relacionados a C1 para variados estados químicos encontrados na superfície do PET são mostrados na Figura 5A (Controle, PET não tratado com Af LPMO9A) e Figura 5B (PET tratado com Af LPMO9A) e Tabela 2. A deconvolução dos espectros da amostra controle e tratada com Af LPMO9A resultou em três picos, principalmente nas regiões (eV): 284,7, ligações contidas nos anéis benzênicos (carbonos aromáticos); 286,2, carbono metilênico e 288,6, carboxila éster, consistentes com outros estudos desenvolvidos acerca da superfície do PET. O tratamento da amostra com Af LPMO9A levou a uma queda da intensidade do pico correspondente a 284,7 eV e ao surgimento do pico em 287,5 eV, o que corresponde à formação de ligações duplas entre átomos de carbono e oxigênio (C=O) na superfície do PET (Tabela 2).
Tabela 2. Intensidade dos picos relacionados a C1 para variados estados químicos na superfície do PET

[0110] LPMOs introduzem um átomo de oxigênio no carbono 1 (C1) ou carbono 4 (C4) da molécula de glicose quando a celulose é empregada como substrato resultando na liberação de ácido aldônico e cetoaldose, respectivamente. Ainda, algumas LPMOs demonstraram ser capazes de liberar uma mistura de produtos oxidados tanto em C1 quanto em C4 a partir do mesmo substrato.

[0111] Tendo como base os produtos liberados por LPMOs a partir de celulose, a Figura 6 ressalta os possíveis produtos liberados a partir do polímero de PET por LPMOs.

Exemplo 6: Ensaio de fluorescência

[0112] Espectros de emissão de fluorescência de cartões de garrafa PET tratados e não tratados com as enzimas da presente invenção foram obtidos à temperatura ambiente em um espectrofotômetro Hitachi F-4500 FL, com excitação a 340 nm e coletando-se a emissão entre 360-550 nm. Os picos em 370 nm (excímero) e 390 nm (dímero no estado fundamental) registrados nos cartões tratados com LPMO excitados em 340 nm apresentaram emissão reduzida em relação ao controle tratado com AscAc, indicando a ocorrência de cisão da cadeia PET. Nenhuma diminuição nas emissões de pico de 370/390 foi observada ao excitar a face externa (exposta ao ar) da garrafa PET tratada com LPMO, o que concorda com os dados de microscopia de força atômica discutidos acima.

Exemplo 7: Ensaio de sinergia com PETase

[0113] O sinergismo entre Af LPMO9A e Is PETase foi avaliado pela adição não concomitante ou concomitante de enzimas a reações contendo PET como substrato (8mg). O PET em pó foi obtido pela moagem da garrafa PET em moinho de bolas (Tecnal). Para os ensaios não concomitantes, o substrato foi pré-tratado com Af LPMO9A (0,5, 2 ou 4 μM) obedecendo às mesmas condições destacadas em “Ensaios enzimáticos - LPMO”. O sobrenadante foi fervido e o PET residual foi lavado com água Milli-Q e sonicado três vezes (10 min cada). Em seguida, Is PETase (0,05 μM) foi adicionado ao sobrenadante ou ao PET residual e as reações foram realiadas em tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 7,2, a 30°C / 400 rpm / 120 h. Nos ensaios concomitantes, Af LPMO9A e Is PETase foram adicionados simultaneamente às reações contendo PET em pó. A concentração de Af LPMO9A variou (0,05-4 μM) enquanto a concentração de Is PETase foi mantida fixa (0,05μM) em tampão de fosfato de sódio 0,05 M, pH 6,0, 37°C / 850 rpm / 120 h.

[0114] Os sobrenadantes foram fervidos a 99° C, por 5 min, secos em concentradores SpeedVac (Eppendorf) e ressuspensos em uma mistura de metanol 20%: DMSO 80%. A concentração de mono (2-hidroxietil) tereftalato (MHET) e ácido tereftálico (TPA) liberado por Is PETase foi determinada por HPLC. As reações com apenas Is PETase foram adotadas como controle para os ensaios não concomitantes e concomitantes. Todas as reações foram realizadas em um volume de 600 uL, em triplicata. A concentração de Is PETase adotada em todos os ensaios de sinergia foi fixada em 0,05 μM.

[0115] Nos ensaios de sinergia não concomitantes, o pó de PET foi pré-tratado com Af LPMO9A + AscAc (pH 6,0 / 37 °C / 48 h), lavado / sonicado três vezes e adicionado com Is PETase (pH 7,2 / 30 °C / 120 h). O pré-tratamento com 0,5, 2 e 4 μM Af LPMO9A + AscAc melhorou a liberação de MHET em 20, 16 e 23%, respectivamente, e TPA em 34, 64 e 49%, respectivamente, por IsPETse.

[0116] A sinergia entre Af LPMO9A e Is PETase também foi encontrada quando o substrato foi primeiro tratado com 0,5, 2 ou 4 μM de Af LPMO9A na ausência de AscAc, concordando com os dados de microscopia de força atômica no que diz respeito à modificação LPMO de PET, mesmo sem a adição do doador de elétrons. No entanto, a melhora na liberação de MHET e TPA foi menor do que aquela alcançada nas reações com AscAc: 9-24% e 18-40%, respectivamente, revelando a importância dos doadores de elétrons livres na reação para promover a atividade de Af LPMO9A.

[0117] Além do substrato, os sobrenadantes das reações com Af LPMO9A foram fervidos e adicionados com Is PETase, mas nem MHET, nem TPA foram detectados nesta condição.

[0118] Dada a atividade semelhante de Is PETase em pH 7,2 / 30 °C (1,709 + 0,06 U / mg de proteína) e pH 6,0 / 37 °C (1,969 + 0,02 U / mg de proteína) usando α-naftil acetato (N-ace) como substrato, a condição posterior foi adotada nos ensaios de sinergia com a adição simultânea de Is PETase e Af LPMO9A. As reações com Is PETase e Af LPMO9A em uma proporção de 1: 1 (sem AscAc) resultaram em uma ligeira melhora de MHET (10%) e TPA (8%). A adição sucessiva de Af LPMO9A a 1:10, 1:15, 1:20 e 1:35 diminuiu a atividade da Is PETase.

[0119] A adição de AscAc à Is PETase afetou sua atividade em PET e ésteres de naftilo, o que pode ser atribuído a uma queda no pH da reação de 6,0 para 4,9. No entanto, uma melhoria de 20% na concentração de MHET e TPA foi registrada após a adição de Af LPMO9A 1:1 nesta condição.

Exemplo 8: Teste de atividade de Af LPMO9A em outros substratos

[0120] Além do PET, os polietilenos de alta (PEAD) e baixa densidade (PEBD) foram avaliados como substrato para a atividade de Af LPMO9A.

[0121] A modificação de superfície causada por Af LPMO9A em garrafa de suco e sacola plástica, ambas de PEAD, é evidente em comparação aos controles com AscAc. A erosão foi mais sutil do que a provocada em garrafa PET e melhor verificada em imagens topográficas de microscopia de força atômica 1x1 μm, que foi confirmada pela média do diâmetro (34 e 17 nm) e profundidade (4,8 e 4,4 nm) das áreas erodidas no suco garrafa e sacola plástica, respectivamente. Nenhuma atividade em PEBD foi detectada nas condições testadas.

Claims (31)

1. Composição enzimática para uso na degradação de poliéster, caraterizada por compreender pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos selecionada a partir de uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 2, uma enzima que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 5, ou uma mistura dessas; e um veículo aceitável.
2. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 2 está presente em uma concentração entre aproximadamente 0,001 % e aproximadamente 0,100 % em peso total da composição, preferencialmente entre aproximadamente 0,002 % e aproximadamente 0,005 % em peso total da composição.
3. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a enzima que compreende a sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 2 é a Kp LPMOA10 (AA10) isolada de Kitasatospora papulosa .
4. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a enzima que compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID Nº 5 está presente em uma concentração entre aproximadamente 0,001 % e aproximadamente 0,100 % em peso total da composição, preferencialmente entre aproximadamente 0,002 % e aproximadamente 0,005 % em peso total da composição.
5. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 5 é a Af LPMOA9 (AA9) isolada de Aspergillus fischeri .
6. Composição enzimática, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por compreender, adicionalmente, pelo menos uma cutinase.
7. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a cutinase é uma PETase.
8. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de a PETase estar em uma concentração entre aproximadamente 0,0005 % e aproximadamente 0,0500 % em peso total da composição, preferencialmente entre aproximadamente 0,0010 % e aproximadamente 0,0025 % em peso total da composição.
9. Composição enzimática, caracterizada por compreender: aproximadamente 0,003 % de Kp LPMOA10; aproximadamente 0,003 % Af LPMOA9; e um veículo aceitável.
10. Composição enzimática, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por compreender, adicionalmente, 0,002 % de uma PETase.
11. Uso da composição enzimática tal qual definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por ser na degradação de polietileno tereftalato (PET).
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o PET é selecionado a partir de garrafas de líquidos, embalagens de alimentos, filmes para janelas, filmes de Raio-X, fibras de tecidos, uma mistura destes e quaisquer outros materiais majoritariamente constituídos de PET, sem limitações.
13. Método de degradação de PET, caracterizado por empregar pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos selecionada a partir de uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 2, uma enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 5, ou uma mistura dessas.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por ser conduzido em meio aquoso, em que o meio aquoso compreende um tampão.
15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender a adição de pelo menos uma substância doadora de elétrons, em que a substância doadora de elétrons é ácido ascórbico.
16. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 2 é Kp LPMOA10 (AA10) isolada de Kitasatospora papulosa .
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que Kp LPMOA10 (AA10) é empregada em uma quantidade variando de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50,00 miligramas de enzima por grama de PET, preferencialmente em uma quantidade variando de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 20,0 miligramas de enzima por grama de PET.
18. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a enzima que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 5 é Af LPMOA9 (AA9) isolada de Aspergillus fischeri.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que Af LPMOA10 (AA10) é empregada em uma quantidade variando de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 50,00 miligramas de enzima por grama de PET, preferencialmente em uma quantidade variando de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 20,0 miligramas de enzima por grama de PET.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado por empregar, adicionalmente, pelo menos uma cutinase, em que a cutinase é uma PETase.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a PETase é empregada em uma quantidade variando de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 25,00 miligramas de PETase por grama de PET, preferencialmente aproximadamente 1,0 a aproximadamente 10,0 miligramas de PETase por grama de PET.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado por ser conduzido em valores de pH variando de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 9,0, preferencialmente variando de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 7,5.
23. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado por ser conduzido em uma temperatura variando de aproximadamente 20 ºC a aproximadamente 60 ºC, preferencialmente 30 ºC a aproximadamente 40 ºC
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 21, caracterizado por ser conduzido em um período variando de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 48 horas, preferencialmente em um período variando de aproximadamente 60 minutos a aproximadamente 48 horas.
25. Uso de pelo menos uma monooxigenase lítica de polissacarídeos caracterizada por ser na degradação enzimática de poliéster, em que a dita monooxigenase lítica de polissacarídeos degrada o dito poliéster sem o auxílio de uma ou mais enzimas canônicas, em que as enzimas canônicas são uma PETase ou uma mistura de PETases.
26. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a monooxigenase lítica de polissacarídeos compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 22.
27. Uso, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a monooxigenase lítica de polissacarídeos que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 2 é oriunda de Kitasatospora papulosa .
28. Uso, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a monooxigenase lítica de polissacarídeos compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 5.
29. Uso, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a monooxigenase lítica de polissacarídeos que compreende uma sequência de aminoácidos que apresenta pelo menos 60 % de identidade com a SEQ ID Nº 5 é oriunda de Aspergillus fischeri .
30. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, caracterizado pelo fato de que o poliéster compreende polietileno tereftalato (PET).
31. Uso, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o PET é selecionado a partir de garrafas de líquidos, embalagens de alimentos, filmes para janelas, filmes de Raio-X, fibras de tecidos, uma mistura destes e quaisquer outros materiais majoritariamente constituídos de PET, sem limitações.

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