JPH10191980A - ポリヒドロキシアルカノエイト分解酵素及びその製造方法 - Google Patents
ポリヒドロキシアルカノエイト分解酵素及びその製造方法Info
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- JPH10191980A JPH10191980A JP9001198A JP119897A JPH10191980A JP H10191980 A JPH10191980 A JP H10191980A JP 9001198 A JP9001198 A JP 9001198A JP 119897 A JP119897 A JP 119897A JP H10191980 A JPH10191980 A JP H10191980A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ
末端フラグメントを有し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法で測定した分子量が約33,000である、ポリ
ヒドロキシアルカノエイト分解酵素。コリネバクテリウ
ム属に属し、前記酵素生産能を有する微生物を培地に培
養し、得られる培養物から前記酵素を採取することを特
徴とする、前記酵素の製造方法。前記酵素の遺伝子を含
む組換えベクターによって形質転換された形質転換体を
培地に培養し、得られる培養物から前記酵素を採取する
ことを特徴とする、前記酵素の製造方法。 【効果】 ω−ヒドロキシアルカノエイト、特に４ＨＢ
のホモポリエステル又はそれらを含む共重合ポリエステ
ルの分解活性を有する新規なＰＨＡ分解酵素及びその効
率的な製造方法を提供することができる。
末端フラグメントを有し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法で測定した分子量が約33,000である、ポリ
ヒドロキシアルカノエイト分解酵素。コリネバクテリウ
ム属に属し、前記酵素生産能を有する微生物を培地に培
養し、得られる培養物から前記酵素を採取することを特
徴とする、前記酵素の製造方法。前記酵素の遺伝子を含
む組換えベクターによって形質転換された形質転換体を
培地に培養し、得られる培養物から前記酵素を採取する
ことを特徴とする、前記酵素の製造方法。 【効果】 ω−ヒドロキシアルカノエイト、特に４ＨＢ
のホモポリエステル又はそれらを含む共重合ポリエステ
ルの分解活性を有する新規なＰＨＡ分解酵素及びその効
率的な製造方法を提供することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規ポリヒドロキ
シアルカノエイト分解酵素及びその製造方法に関する。
シアルカノエイト分解酵素及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】微生物がエネルギー貯蔵物質として細胞
内に蓄積するポリヒドロキシアルカノエイト（ＰＨＡ）
は、生分解性を持つ熱可塑性ポリエステルであり、生分
解性プラスチック素材として注目されている。最も代表
的なＰＨＡは、Ｒ体の3-ヒドロキシブチレイト（３Ｈ
Ｂ）のホモポリエステル、Ｐ([Ｒ]-３ＨＢ）であり、ポ
リプロピレンと同程度の強度を有するとともに優れた生
分解性を兼ね備えている。しかしながら、極めて脆性な
性質のために生分解性プラスチックとしては実用化され
なかった。
内に蓄積するポリヒドロキシアルカノエイト（ＰＨＡ）
は、生分解性を持つ熱可塑性ポリエステルであり、生分
解性プラスチック素材として注目されている。最も代表
的なＰＨＡは、Ｒ体の3-ヒドロキシブチレイト（３Ｈ
Ｂ）のホモポリエステル、Ｐ([Ｒ]-３ＨＢ）であり、ポ
リプロピレンと同程度の強度を有するとともに優れた生
分解性を兼ね備えている。しかしながら、極めて脆性な
性質のために生分解性プラスチックとしては実用化され
なかった。
【０００３】一方、近年では、用いる微生物や炭素源の
種類に応じて、 [Ｒ]-３ＨＢと４−ヒドロキシブチレイ
ト（４ＨＢ）との共重合体などの共重合ポリエステルの
生合成が確認されている。これらの共重合ポリエステル
は構成するモノマーユニットの種類や共重合組成比に応
じて結晶性のプラスチックから弾性に富むゴムまで幅広
い物性を示すことから、生分解性プラスチックとして期
待されている。
種類に応じて、 [Ｒ]-３ＨＢと４−ヒドロキシブチレイ
ト（４ＨＢ）との共重合体などの共重合ポリエステルの
生合成が確認されている。これらの共重合ポリエステル
は構成するモノマーユニットの種類や共重合組成比に応
じて結晶性のプラスチックから弾性に富むゴムまで幅広
い物性を示すことから、生分解性プラスチックとして期
待されている。
【０００４】ＰＨＡを分解する代表的な酵素としては、
アルカリゲネス フェカーリス(Alcaligenes faecali
s)、コマモナス アシドボランス(Comamonas acidovora
ns) 、シュードモナス ピケッティイ(Pseudomonas pic
ketii)、シュードモナス レモイグネイ(Pseudomonas l
emoignei) 、シュードモナス テストステロニ(Pseudom
onas testosteroni)、ペニシリウム ピノフィラム(Pen
icillium pinophilum)などの微生物が細胞外に分泌する
ＰＨＡデポリメラーゼが確認されている。これらの酵素
の活性部位はセリン残基であり、ポリエステルの結晶化
度によってその分解活性が大きく影響されることが明ら
かとなっている。また、リゾプス デレマー(Rizopus d
elemer) などの真菌が生成するリパーゼもＰＨＡの分解
酵素として確認されており、ポリプロピルラクトンやポ
リカプロラクトンなどの側鎖を持たないＰＨＡを分解す
ることが知られている。このように、現在まで確認され
ているＰＨＡの分解酵素は、ＰＨＡデポリメラーゼとリ
パーゼのみである。
アルカリゲネス フェカーリス(Alcaligenes faecali
s)、コマモナス アシドボランス(Comamonas acidovora
ns) 、シュードモナス ピケッティイ(Pseudomonas pic
ketii)、シュードモナス レモイグネイ(Pseudomonas l
emoignei) 、シュードモナス テストステロニ(Pseudom
onas testosteroni)、ペニシリウム ピノフィラム(Pen
icillium pinophilum)などの微生物が細胞外に分泌する
ＰＨＡデポリメラーゼが確認されている。これらの酵素
の活性部位はセリン残基であり、ポリエステルの結晶化
度によってその分解活性が大きく影響されることが明ら
かとなっている。また、リゾプス デレマー(Rizopus d
elemer) などの真菌が生成するリパーゼもＰＨＡの分解
酵素として確認されており、ポリプロピルラクトンやポ
リカプロラクトンなどの側鎖を持たないＰＨＡを分解す
ることが知られている。このように、現在まで確認され
ているＰＨＡの分解酵素は、ＰＨＡデポリメラーゼとリ
パーゼのみである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、新規
なＰＨＡ分解酵素及び該酵素を効率よく生産する方法を
提供することにある。
なＰＨＡ分解酵素及び該酵素を効率よく生産する方法を
提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく、活性汚泥よりＰＨＡ分解酵素の探索を行
った結果、コリネバクテリウム属に属する菌株ＩＭ−１
株が菌体外に新規のＰＨＡ分解酵素を生産することを見
出し、本発明を完成するに至った。
を解決すべく、活性汚泥よりＰＨＡ分解酵素の探索を行
った結果、コリネバクテリウム属に属する菌株ＩＭ−１
株が菌体外に新規のＰＨＡ分解酵素を生産することを見
出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】本発明は、配列番号１で表されるアミノ酸
配列のＮ末端フラグメントを有し、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動法で測定した分子量が約33,000であ
る、ＰＨＡ分解酵素である。
配列のＮ末端フラグメントを有し、ＳＤＳポリアクリル
アミドゲル電気泳動法で測定した分子量が約33,000であ
る、ＰＨＡ分解酵素である。
【０００８】また、本発明は、コリネバクテリウム属に
属し、上記ＰＨＡ分解酵素生産能を有する微生物を培地
に培養し、得られる培養物からＰＨＡ分解酵素を採取す
ることを特徴とする、前記ＰＨＡ分解酵素の製造方法で
ある。
属し、上記ＰＨＡ分解酵素生産能を有する微生物を培地
に培養し、得られる培養物からＰＨＡ分解酵素を採取す
ることを特徴とする、前記ＰＨＡ分解酵素の製造方法で
ある。
【０００９】さらに、本発明は、上記ＰＨＡ分解酵素の
遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された形
質転換体を培地に培養し、得られる培養物からＰＨＡ分
解酵素を採取することを特徴とする、前記ＰＨＡ分解酵
素の製造方法である。
遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された形
質転換体を培地に培養し、得られる培養物からＰＨＡ分
解酵素を採取することを特徴とする、前記ＰＨＡ分解酵
素の製造方法である。
【００１０】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＰＨＡ分解酵素は、下記の理化学的性質を有す
る。
本発明のＰＨＡ分解酵素は、下記の理化学的性質を有す
る。
【００１１】１．作用及び基質特異性 ３−ヒドロキシプロピオネイト、４−ヒドロキシブチレ
イト（４ＨＢ）、５−ヒドロキシバリレイト、６−ヒド
ロキシカプロネイト等のω−ヒドロキシアルカノエイト
のホモポリエステル又はそれらを含む共重合ポリエステ
ルを分解する。その中でも、特に４ＨＢのホモポリエス
テル又は４ＨＢを含む共重合ポリエステルの分解活性が
高い。
イト（４ＨＢ）、５−ヒドロキシバリレイト、６−ヒド
ロキシカプロネイト等のω−ヒドロキシアルカノエイト
のホモポリエステル又はそれらを含む共重合ポリエステ
ルを分解する。その中でも、特に４ＨＢのホモポリエス
テル又は４ＨＢを含む共重合ポリエステルの分解活性が
高い。
【００１２】本酵素の活性は以下のようにして調べた。 (1) アルカリゲネス ユウトロファス(Alcaligenes eut
rophus) 又はコマモナスアシドボランスにより生合成さ
れた５種類の３ＨＢ−４ＨＢランダム共重合体を用いて
本発明の酵素の活性を調べた。各共重合体の数平均分子
量及び４ＨＢを表１に示す。
rophus) 又はコマモナスアシドボランスにより生合成さ
れた５種類の３ＨＢ−４ＨＢランダム共重合体を用いて
本発明の酵素の活性を調べた。各共重合体の数平均分子
量及び４ＨＢを表１に示す。
【００１３】
【表１】
【００１４】共重合体１〜５をそれぞれソルベントキャ
スト法にてフィルム化し、１cm角に切ったもの（約８m
g）を試験片とした。各試験片をpH6.5 のリン酸緩衝液
６mlに入れ、酵素を1500μg 添加した。37℃、 120rpm
の条件で振盪しながら反応させた。経時的に反応液を採
取して0.45μｍのメンブランフィルターで濾過し、得ら
れた濾過液中の水溶性有機化合物の炭素（水溶性炭素）
を定量して、反応液１ml中の１時間当たりの水溶性炭素
の溶出速度（μg-C/ml/h) を求めた。
スト法にてフィルム化し、１cm角に切ったもの（約８m
g）を試験片とした。各試験片をpH6.5 のリン酸緩衝液
６mlに入れ、酵素を1500μg 添加した。37℃、 120rpm
の条件で振盪しながら反応させた。経時的に反応液を採
取して0.45μｍのメンブランフィルターで濾過し、得ら
れた濾過液中の水溶性有機化合物の炭素（水溶性炭素）
を定量して、反応液１ml中の１時間当たりの水溶性炭素
の溶出速度（μg-C/ml/h) を求めた。
【００１５】図１に３ＨＢ−４ＨＢランダム共重合体中
の４ＨＢ分率と水溶性炭素の溶出速度の関係を示す。な
お、既知の分解酵素であるアルカリゲネス フェカーリ
ス由来のＰＨＡデポリメラーゼ、及びリゾプス デレマ
ー由来のリパーゼによる分解活性を併せて示す。その結
果、本発明のＰＨＡ分解酵素は、共重合体の４ＨＢ分率
が０モル％の場合には分解活性を示さないが、４ＨＢ分
率の増大に伴って指数関数的に分解活性が上昇するとい
う特徴が見られた。なお、４ＨＢ分率97モル％の共重合
フィルムの分解生成物をＨＰＬＣで分析し、FAB-Mass及
びLC-Mass で同定したところ主な分解生成物は４ＨＢ−
４ＨＢのダイマー（分子量 191）であることがわかっ
た。
の４ＨＢ分率と水溶性炭素の溶出速度の関係を示す。な
お、既知の分解酵素であるアルカリゲネス フェカーリ
ス由来のＰＨＡデポリメラーゼ、及びリゾプス デレマ
ー由来のリパーゼによる分解活性を併せて示す。その結
果、本発明のＰＨＡ分解酵素は、共重合体の４ＨＢ分率
が０モル％の場合には分解活性を示さないが、４ＨＢ分
率の増大に伴って指数関数的に分解活性が上昇するとい
う特徴が見られた。なお、４ＨＢ分率97モル％の共重合
フィルムの分解生成物をＨＰＬＣで分析し、FAB-Mass及
びLC-Mass で同定したところ主な分解生成物は４ＨＢ−
４ＨＢのダイマー（分子量 191）であることがわかっ
た。
【００１６】(2) 炭素原子数３〜６の直鎖のω−ヒドロ
キシアルカノエイトの重合体についての本発明の酵素の
活性を調べた。用いた重合体を表２に示す。
キシアルカノエイトの重合体についての本発明の酵素の
活性を調べた。用いた重合体を表２に示す。
【００１７】
【表２】
【００１８】各重合体を、それぞれソルベントキャスト
法にてフィルム化したものを試験片とした。各試験片に
ついて以下のようにして試験を行った。試験片９mgをpH
6.5のリン酸緩衝液６mlに入れた。次に、酵素1500μｇ
を添加した。37℃、 120rpmの条件で振盪しながら反応
させた。経時的に反応液を採取して0.45μｍのメンブラ
ンフィルターで濾過し、得られた濾過液中の水溶性炭素
量を測定して、反応液１ml中の１時間当たりの水溶性炭
素の溶出速度（μg-C/ml/h) を求めた。
法にてフィルム化したものを試験片とした。各試験片に
ついて以下のようにして試験を行った。試験片９mgをpH
6.5のリン酸緩衝液６mlに入れた。次に、酵素1500μｇ
を添加した。37℃、 120rpmの条件で振盪しながら反応
させた。経時的に反応液を採取して0.45μｍのメンブラ
ンフィルターで濾過し、得られた濾過液中の水溶性炭素
量を測定して、反応液１ml中の１時間当たりの水溶性炭
素の溶出速度（μg-C/ml/h) を求めた。
【００１９】図２に各重合体についての水溶性炭素の溶
出速度を示す。この結果から、本発明の酵素は、ω−ヒ
ドロキシアルカノエイト重合体の中でも、Ｐ（４ＨＢ）
に対して高い分解活性を示すことがわかる。
出速度を示す。この結果から、本発明の酵素は、ω−ヒ
ドロキシアルカノエイト重合体の中でも、Ｐ（４ＨＢ）
に対して高い分解活性を示すことがわかる。
【００２０】２．Ｎ末端配列 純化したＰＨＡ分解酵素のＮ末端フラグメント22残基の
アミノ酸配列をプロテインシーケンサー(PerkinElmer:M
odel 492) にて解析した。その結果、Ｎ末端フラグメン
トは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有してい
た。この配列と、各種既知酵素のＮ末端配列とのホモロ
ジー検索を行ったところ、合致する酵素はなく、新規酵
素であることが判明した。
アミノ酸配列をプロテインシーケンサー(PerkinElmer:M
odel 492) にて解析した。その結果、Ｎ末端フラグメン
トは、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有してい
た。この配列と、各種既知酵素のＮ末端配列とのホモロ
ジー検索を行ったところ、合致する酵素はなく、新規酵
素であることが判明した。
【００２１】３．分子量 分子量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測
定したところ、約33,000であった。
定したところ、約33,000であった。
【００２２】４．至適pH 本発明のＰＨＡ分解酵素の反応至適pHを酢酸緩衝液（pH
4.0〜5.5 ）、リン酸緩衝液（pH 4.5〜8.9 ）、トリス
緩衝液（pH 7.5〜9.5 ）、グリシン緩衝液（pH9.0〜10.
5）を用いて測定した。なお、基質としては、４ＨＢ分
率97モル％の３ＨＢ−４ＨＢ共重合体フィルムを用い
た。各緩衝液にソルベントキャスト法で作製した１cm角
の３ＨＢ−４ＨＢ共重合体フィルム（約６mg）を一枚入
れ、酵素を250μg/mlの濃度で添加した後、30℃で穏や
かに振盪しながら７時間反応させた。反応終了後に各フ
ィルムを取り出し乾燥重量を秤量してフィルム分解量を
求めた。図３に、pHとフィルム分解量の関係を示す。図
３に示されるように、pH４〜９の範囲で分解が確認さ
れ、最も分解量が多かった条件はpH 6.5であった。この
結果から、至適pHは５〜８であった。
4.0〜5.5 ）、リン酸緩衝液（pH 4.5〜8.9 ）、トリス
緩衝液（pH 7.5〜9.5 ）、グリシン緩衝液（pH9.0〜10.
5）を用いて測定した。なお、基質としては、４ＨＢ分
率97モル％の３ＨＢ−４ＨＢ共重合体フィルムを用い
た。各緩衝液にソルベントキャスト法で作製した１cm角
の３ＨＢ−４ＨＢ共重合体フィルム（約６mg）を一枚入
れ、酵素を250μg/mlの濃度で添加した後、30℃で穏や
かに振盪しながら７時間反応させた。反応終了後に各フ
ィルムを取り出し乾燥重量を秤量してフィルム分解量を
求めた。図３に、pHとフィルム分解量の関係を示す。図
３に示されるように、pH４〜９の範囲で分解が確認さ
れ、最も分解量が多かった条件はpH 6.5であった。この
結果から、至適pHは５〜８であった。
【００２３】５．至適温度 pH6.5 のリン酸緩衝液１mlに酵素を 250μg 入れ、４Ｈ
Ｂ分率97モル％の３ＨＢ−４ＨＢ共重合体フィルム（１
cm角、約６mg）を１枚入れて、各種温度で穏やかに振盪
しながら７時間反応を行った。反応終了後に各フィルム
を取り出して乾燥重量を秤量してフィルム分解量を求め
た。図４に温度とフィルム分解量の関係を示す。図４に
示されるように20〜60℃の範囲で分解が確認され、至適
温度は37〜42℃であった。
Ｂ分率97モル％の３ＨＢ−４ＨＢ共重合体フィルム（１
cm角、約６mg）を１枚入れて、各種温度で穏やかに振盪
しながら７時間反応を行った。反応終了後に各フィルム
を取り出して乾燥重量を秤量してフィルム分解量を求め
た。図４に温度とフィルム分解量の関係を示す。図４に
示されるように20〜60℃の範囲で分解が確認され、至適
温度は37〜42℃であった。
【００２４】６．安定温度 pH6.5 のリン酸緩衝液６mlに酵素を1500μg 入れ、各種
温度で30分間穏やかに振盪処理した。その後、４ＨＢ分
率97モル％の３ＨＢ−４ＨＢ共重合体フィルム（１cm
角、約６mg）を１枚ずつ入れ、37℃で振盪培養を行っ
た。経時的に各培養液を採取し、0.45μｍのメンブラン
フィルターで濾過し、濾過液中の水溶性炭素量を測定し
て反応液１ml中の１時間当たりの水溶性炭素の溶出速度
（μg-C/ml/h) を求めた。処理前の溶出速度を 100％活
性とした場合の各種温度での処理後の活性を図５に示
す。図５に示したとおり、42℃より高温になると活性が
急激に低下した。したがって本酵素は42℃まで安定であ
る。
温度で30分間穏やかに振盪処理した。その後、４ＨＢ分
率97モル％の３ＨＢ−４ＨＢ共重合体フィルム（１cm
角、約６mg）を１枚ずつ入れ、37℃で振盪培養を行っ
た。経時的に各培養液を採取し、0.45μｍのメンブラン
フィルターで濾過し、濾過液中の水溶性炭素量を測定し
て反応液１ml中の１時間当たりの水溶性炭素の溶出速度
（μg-C/ml/h) を求めた。処理前の溶出速度を 100％活
性とした場合の各種温度での処理後の活性を図５に示
す。図５に示したとおり、42℃より高温になると活性が
急激に低下した。したがって本酵素は42℃まで安定であ
る。
【００２５】７．等電点 等電点をアクリルアミドゲル焦点電気泳動法で測定した
ところ、約 8.6であった。
ところ、約 8.6であった。
【００２６】８．各種物質の影響 酵素1500μｇを配合したpH6.5 のリン酸緩衝液６mlに、
阻害物質としてフェニルメチルスルフォニルフルオリド
（ＰＭＳＦ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジイソ
プロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）を各々所定濃度配合
した。さらに、４ＨＢ分率97モル％の共重合フィルム
（１cm角、約６mg）を各濃度の阻害物質を含む酵素液に
一枚入れ、37℃で穏やかに振盪培養した。経時的に培養
液を採取し、0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過
し、水溶性炭素量を測定した。反応液１ml中の１時間当
たりの水溶性炭素の溶出速度を 100％として各濃度での
活性を求めた。表３に、50％活性となる各阻害物質の濃
度を示す。特に、ＤＦＰでは0.15μＭで活性が50％とな
り、顕著な阻害効果があった。
阻害物質としてフェニルメチルスルフォニルフルオリド
（ＰＭＳＦ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、ジイソ
プロピルフルオロリン酸（ＤＦＰ）を各々所定濃度配合
した。さらに、４ＨＢ分率97モル％の共重合フィルム
（１cm角、約６mg）を各濃度の阻害物質を含む酵素液に
一枚入れ、37℃で穏やかに振盪培養した。経時的に培養
液を採取し、0.45μｍのメンブレンフィルターで濾過
し、水溶性炭素量を測定した。反応液１ml中の１時間当
たりの水溶性炭素の溶出速度を 100％として各濃度での
活性を求めた。表３に、50％活性となる各阻害物質の濃
度を示す。特に、ＤＦＰでは0.15μＭで活性が50％とな
り、顕著な阻害効果があった。
【００２７】
【表３】
【００２８】本発明のＰＨＡ分解酵素の製造において使
用する微生物は、コリネバクテリウム属に属し、該ＰＨ
Ａ分解酵素生産能を有する菌株であればいずれのもので
もよく、微生物を用いて製造することができる。その具
体例としては、コリネバクテリウム アクアティカム(C
orynebacterium aquaticum) ＩＭ−１株を挙げることが
できる。また、このＩＭ−１株は、他の細菌と同様にそ
の性状が変化しやすく、例えば、紫外線、Ｘ線、薬品な
どを用いる人工的変異手段で変異しうるものであり、こ
のような変異株や変種も同様の活性を有する限り用いる
ことができる。ＩＭ−１株の菌学的性質は下記のとおり
である。
用する微生物は、コリネバクテリウム属に属し、該ＰＨ
Ａ分解酵素生産能を有する菌株であればいずれのもので
もよく、微生物を用いて製造することができる。その具
体例としては、コリネバクテリウム アクアティカム(C
orynebacterium aquaticum) ＩＭ−１株を挙げることが
できる。また、このＩＭ−１株は、他の細菌と同様にそ
の性状が変化しやすく、例えば、紫外線、Ｘ線、薬品な
どを用いる人工的変異手段で変異しうるものであり、こ
のような変異株や変種も同様の活性を有する限り用いる
ことができる。ＩＭ−１株の菌学的性質は下記のとおり
である。
【００２９】１．形態的性質 ＣＧＹ培地（カシトン５ｇ／Ｌ、グリセロール５ｇ／
Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ）で生育したＩＭ−１株の栄養
細胞は、 0.5〜0.7 × 1.5〜3.0 ミクロンの桿菌であ
る。また、30℃、２日の培養で胞子を形成せず、球状に
細胞形態が変化する多形性を示すグラム陽性桿菌であっ
た。
Ｌ、酵母エキス１ｇ／Ｌ）で生育したＩＭ−１株の栄養
細胞は、 0.5〜0.7 × 1.5〜3.0 ミクロンの桿菌であ
る。また、30℃、２日の培養で胞子を形成せず、球状に
細胞形態が変化する多形性を示すグラム陽性桿菌であっ
た。
【００３０】２．培養的性質 ＩＭ−１株は、通常の細菌用培地に25〜40℃、１〜３日
の培養で増殖する。
の培養で増殖する。
【００３１】３．生理学的性質 (1) 酸素に対する態度：好気性 (2) acid-fast ：陰性 (3) 抗酸性：陰性 (4) rod-coccus cycle：陽性 (5) 集落の色調：黄色系 (6) 硝酸塩の還元：陰性 (7) オキシダーゼ：陰性 (8) ガラクターゼ：陽性 (9) β−グルクロニダーゼ：陰性 (10)β−グルコシダーゼ：陽性 (11)Ｎ−アセチル−β−グルコシダーゼ：陽性 (12)ウレアーゼ：陰性 (13)デンプンの加水分解：陽性 (14)グルコースからの発酵：陰性 (15)糖の利用性：リボース、キシロース、マンニトー
ル、マルトース、ラクトース、シュクロース、グリコー
ゲンからの生育はなし
ル、マルトース、ラクトース、シュクロース、グリコー
ゲンからの生育はなし
【００３２】以上の菌学的性質を有するＩＭ−１株をＡ
ＰＩコリネシリーズによる同定及びBergey's Manual of
Determinative Bacteriology に記載された既知菌種と
比較した結果、ＩＭ−１株はコリネバクテリウム アク
アティカムであることが判明した。尚、コリネバクテリ
ウム アクアティカムＩＭ−１株は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成８年11月13日付けで寄託し、受
託番号FERM P-15949を得ている。
ＰＩコリネシリーズによる同定及びBergey's Manual of
Determinative Bacteriology に記載された既知菌種と
比較した結果、ＩＭ−１株はコリネバクテリウム アク
アティカムであることが判明した。尚、コリネバクテリ
ウム アクアティカムＩＭ−１株は、工業技術院生命工
学工業技術研究所に平成８年11月13日付けで寄託し、受
託番号FERM P-15949を得ている。
【００３３】コリネバクテリウム属に属する微生物を用
いてＰＨＡ分解酵素を生産させるには、ＣＧＹ培地又は
ニュートリエントブロス等の天然培地で好気的に培養す
ることによって細胞を増やし、次に回収した細胞をＰＨ
Ａ分解酵素の誘導培地に移し、さらに好気的に培養する
方法により行われる。
いてＰＨＡ分解酵素を生産させるには、ＣＧＹ培地又は
ニュートリエントブロス等の天然培地で好気的に培養す
ることによって細胞を増やし、次に回収した細胞をＰＨ
Ａ分解酵素の誘導培地に移し、さらに好気的に培養する
方法により行われる。
【００３４】ＰＨＡ分解酵素の誘導に使用される培地と
しては、唯一の炭素源として酢酸、プロピオン酸、酪
酸、フマル酸、ブタノール、メタノール、トリオレイ
ン、パラフィン、４−ヒドロキシ酪酸又はポリ−４−ヒ
ドロキシ酪酸を含み、窒素源として塩化アンモニウム又
は硫酸アンモニウムを含み、さらに硫酸マグネシウムを
配合したものが例示される。
しては、唯一の炭素源として酢酸、プロピオン酸、酪
酸、フマル酸、ブタノール、メタノール、トリオレイ
ン、パラフィン、４−ヒドロキシ酪酸又はポリ−４−ヒ
ドロキシ酪酸を含み、窒素源として塩化アンモニウム又
は硫酸アンモニウムを含み、さらに硫酸マグネシウムを
配合したものが例示される。
【００３５】培養は、通気攪拌などにより好気的に行
う。培養温度は、通常25〜37℃、好ましくは27〜32℃で
ある。また、誘導培地による培養開始時のpHは通常 6.0
〜8.0、好ましくは 7.0程度である。培養時間は、通常2
0〜96時間、好ましくは40〜96時間である。
う。培養温度は、通常25〜37℃、好ましくは27〜32℃で
ある。また、誘導培地による培養開始時のpHは通常 6.0
〜8.0、好ましくは 7.0程度である。培養時間は、通常2
0〜96時間、好ましくは40〜96時間である。
【００３６】培養物からのＰＨＡ分解酵素の分離・精製
は、培養物を遠心分離にかけて菌体を除去し、得られた
上澄液を、カラムクロマトグラフィー、硫酸アンモニウ
ムによる分画沈澱、ゲル濾過などの、従来から通常用い
られている酵素精製方法で精製することにより行うこと
ができる。このようにして純化されたＰＨＡ分解酵素が
得られる。
は、培養物を遠心分離にかけて菌体を除去し、得られた
上澄液を、カラムクロマトグラフィー、硫酸アンモニウ
ムによる分画沈澱、ゲル濾過などの、従来から通常用い
られている酵素精製方法で精製することにより行うこと
ができる。このようにして純化されたＰＨＡ分解酵素が
得られる。
【００３７】また、本発明のＰＨＡ分解酵素は、該酵素
の遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された
形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から該酵素
を採取することによっても製造することができる。本発
明のＰＨＡ分解酵素の遺伝子は、例えば、コリネバクテ
リウム アクアティカムＩＭ−１株から分離することが
でき、該遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換
された形質転換体は以下のようにして得られる。先ず、
ＰＨＡ分解酵素のＮ末端のアミノ酸配列、即ち配列番号
１のアミノ酸配列に基づいて、その全配列又は部分配列
をコードする塩基配列を有するＤＮＡプローブを化学合
成する。一方、コリネバクテリウム アクアティカムＩ
Ｍ−１株をＣＧＹ培地又はニュートリエントブロス等の
天然培地で好気的に培養して菌体を集め、常法により染
色体ＤＮＡを抽出精製する。精製染色体ＤＮＡを適当な
制限酵素により切断してＤＮＡ断片混合物を得る。上記
合成ＤＮＡプローブを用いたサザンハイブリダイゼーシ
ョン法により、このＤＮＡ断片混合物からＤＮＡプロー
ブとハイブリッド形成するＤＮＡ断片を取得する。同じ
接着末端を生じさせる制限酵素で処理したクローニング
ベクターに、取得されたＤＮＡ断片を挿入ないし連結す
る。クローニングベクターは、通常のクローニングに用
いるプラスミドベクター、ファージベクターのいずれで
もよい。このようにして得られた組換えベクターを用い
て宿主の形質転換を行い、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法により目的とする形質転換体を得ることができ
る。宿主としては、例えば、大腸菌等を用いることがで
きる。
の遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換された
形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から該酵素
を採取することによっても製造することができる。本発
明のＰＨＡ分解酵素の遺伝子は、例えば、コリネバクテ
リウム アクアティカムＩＭ−１株から分離することが
でき、該遺伝子を含む組換えベクターによって形質転換
された形質転換体は以下のようにして得られる。先ず、
ＰＨＡ分解酵素のＮ末端のアミノ酸配列、即ち配列番号
１のアミノ酸配列に基づいて、その全配列又は部分配列
をコードする塩基配列を有するＤＮＡプローブを化学合
成する。一方、コリネバクテリウム アクアティカムＩ
Ｍ−１株をＣＧＹ培地又はニュートリエントブロス等の
天然培地で好気的に培養して菌体を集め、常法により染
色体ＤＮＡを抽出精製する。精製染色体ＤＮＡを適当な
制限酵素により切断してＤＮＡ断片混合物を得る。上記
合成ＤＮＡプローブを用いたサザンハイブリダイゼーシ
ョン法により、このＤＮＡ断片混合物からＤＮＡプロー
ブとハイブリッド形成するＤＮＡ断片を取得する。同じ
接着末端を生じさせる制限酵素で処理したクローニング
ベクターに、取得されたＤＮＡ断片を挿入ないし連結す
る。クローニングベクターは、通常のクローニングに用
いるプラスミドベクター、ファージベクターのいずれで
もよい。このようにして得られた組換えベクターを用い
て宿主の形質転換を行い、コロニーハイブリダイゼーシ
ョン法により目的とする形質転換体を得ることができ
る。宿主としては、例えば、大腸菌等を用いることがで
きる。
【００３８】
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定され
るものではない。
るが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定され
るものではない。
【００３９】〔実施例１〕３Ｌのジャーファーメンター
３基に、各々4-ヒドロキシ酪酸ナトリウム５g/l、NH4Cl
１g/l 、および MgSO4・7H2O 0.5g/l を含む誘導培地
２Ｌを入れ、 121℃で15分間滅菌した。これに、ＣＧＹ
液体培地 100mlを含む 500ml三角フラスコで種培養した
コリネバクテリウム アクアティカムＩＭ−１株を各々
のジャーに無菌的に植菌し、30℃で24時間通気攪拌培養
を行った。尚、pHは１Ｎ−H2SO4 で常時 7.0に調節し
た。
３基に、各々4-ヒドロキシ酪酸ナトリウム５g/l、NH4Cl
１g/l 、および MgSO4・7H2O 0.5g/l を含む誘導培地
２Ｌを入れ、 121℃で15分間滅菌した。これに、ＣＧＹ
液体培地 100mlを含む 500ml三角フラスコで種培養した
コリネバクテリウム アクアティカムＩＭ−１株を各々
のジャーに無菌的に植菌し、30℃で24時間通気攪拌培養
を行った。尚、pHは１Ｎ−H2SO4 で常時 7.0に調節し
た。
【００４０】培養終了後、6000rpmで30分間遠心分離を
行い培養上澄液を得た。次に、分画分子量30,000の限外
濾過膜（ダイセル：FB02-CC-FUYO3AI)で処理し、分子量
30,000以上の分画を回収した。回収した分子量30,000以
上の分画はエバポレーターで35mlまで濃縮を行い粗酵素
液とした。セファデックスＧ−50を 450ml充填したカラ
ム（長さ 900mm、径30mm）に粗酵素液を添加し蒸留水で
展開した。溶離液は10mlづつのフラクションとして採取
し、各フラクションの 0.1mlを４ＨＢ分率97モル％の３
ＨＢ−４ＨＢ共重合体粉末を懸濁させたＰＨＡ寒天プレ
ートに滴下し、スポット周辺に形成されたクリアゾーン
の直径で酵素活性を判断した。
行い培養上澄液を得た。次に、分画分子量30,000の限外
濾過膜（ダイセル：FB02-CC-FUYO3AI)で処理し、分子量
30,000以上の分画を回収した。回収した分子量30,000以
上の分画はエバポレーターで35mlまで濃縮を行い粗酵素
液とした。セファデックスＧ−50を 450ml充填したカラ
ム（長さ 900mm、径30mm）に粗酵素液を添加し蒸留水で
展開した。溶離液は10mlづつのフラクションとして採取
し、各フラクションの 0.1mlを４ＨＢ分率97モル％の３
ＨＢ−４ＨＢ共重合体粉末を懸濁させたＰＨＡ寒天プレ
ートに滴下し、スポット周辺に形成されたクリアゾーン
の直径で酵素活性を判断した。
【００４１】ＰＨＡ分解活性の確認されたフラクション
を集め濃縮後凍結乾燥して 360mgの粗酵素粉末を得た。
次に蒸留水15mlに粗酵素粉末 360mgを溶解し、トヨパー
ルＨＷ40（Fine) 450mlを充填した（長さ 900mm、径30
mm）カラムに添加し蒸留水にて展開した。ＰＨＡ分解活
性を示したフラクションを集め最終的に 230mgの酵素を
得た。尚、各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
にかけたところ全て単一バンドであった。図６にＳＤＳ
−ＰＡＧＥ電気泳動写真を示す。図６において、一番左
側のバンドは分子量マーカーであり、左から２番目のバ
ンドはセファデックスＧ−50カラム処理後のＰＨＡ分解
活性の確認されたフラクションのものであり、左から３
番目以降はトヨパールＨＷ40カラム処理後のＰＨＡ分解
活性を示したフラクションのものである。
を集め濃縮後凍結乾燥して 360mgの粗酵素粉末を得た。
次に蒸留水15mlに粗酵素粉末 360mgを溶解し、トヨパー
ルＨＷ40（Fine) 450mlを充填した（長さ 900mm、径30
mm）カラムに添加し蒸留水にて展開した。ＰＨＡ分解活
性を示したフラクションを集め最終的に 230mgの酵素を
得た。尚、各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動
にかけたところ全て単一バンドであった。図６にＳＤＳ
−ＰＡＧＥ電気泳動写真を示す。図６において、一番左
側のバンドは分子量マーカーであり、左から２番目のバ
ンドはセファデックスＧ−50カラム処理後のＰＨＡ分解
活性の確認されたフラクションのものであり、左から３
番目以降はトヨパールＨＷ40カラム処理後のＰＨＡ分解
活性を示したフラクションのものである。
【００４２】
【発明の効果】本発明により、ω−ヒドロキシアルカノ
エイト、特に４ＨＢのホモポリエステル又はそれらを含
む共重合ポリエステルの分解活性を有する新規なＰＨＡ
分解酵素及びその効率的な製造方法を提供することがで
きる。
エイト、特に４ＨＢのホモポリエステル又はそれらを含
む共重合ポリエステルの分解活性を有する新規なＰＨＡ
分解酵素及びその効率的な製造方法を提供することがで
きる。
【００４３】
配列番号：１ 配列の長さ：22 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 Ala Gly Pro Val Thr Leu Glu Ala Thr Phe Thr Ser Ser Cys Cys Gly 1 5 10 15 Trp Glu Lys Val Glu Arg 20
【図１】３ＨＢ−４ＨＢランダム共重合体中の４ＨＢ分
率と本発明の酵素による水溶性炭素の溶出速度の関係を
示すグラフである。
率と本発明の酵素による水溶性炭素の溶出速度の関係を
示すグラフである。
【図２】各種ω−ヒドロキシアルカノエイト重合体の本
発明の酵素による水溶性炭素の溶出速度を示すグラフで
ある。
発明の酵素による水溶性炭素の溶出速度を示すグラフで
ある。
【図３】本発明の酵素の至適pHを示すグラフである。
【図４】本発明の酵素の至適温度を示すグラフである。
【図５】本発明の酵素の安定温度を示すグラフである。
【図６】本発明の酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動写真
である。
である。
【手続補正書】
【提出日】平成９年１月１０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 武部 英日 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式 会社薬品技術研究所内 (72)発明者 松信 俊男 神奈川県小田原市栢山788 明治製菓株式 会社薬品技術研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ
末端フラグメントを有し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法で測定した分子量が約33,000である、ポリ
ヒドロキシアルカノエイト分解酵素。 - 【請求項２】 コリネバクテリウム属に属し、請求項１
に記載のポリヒドロキシアルカノエイト分解酵素生産能
を有する微生物を培地に培養し、得られる培養物からポ
リヒドロキシアルカノエイト分解酵素を採取することを
特徴とする、前記ポリヒドロキシアルカノエイト分解酵
素の製造方法。 - 【請求項３】 請求項１に記載のポリヒドロキシアルカ
ノエイト分解酵素の遺伝子を含む組換えベクターによっ
て形質転換された形質転換体を培地に培養し、得られる
培養物からポリヒドロキシアルカノエイト分解酵素を採
取することを特徴とする、前記ポリヒドロキシアルカノ
エイト分解酵素の製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9001198A JPH10191980A (ja) | 1997-01-08 | 1997-01-08 | ポリヒドロキシアルカノエイト分解酵素及びその製造方法 |
| KR1019970082143A KR19980070317A (ko) | 1997-01-08 | 1997-12-31 | 폴리하이드록시알카노에이트 분해효소 및 그 제조방법 |
| US09/003,086 US5968801A (en) | 1997-01-08 | 1998-01-05 | Polyhydroxyalkanoate depolymerase and process for producing the same |
| CA002219959A CA2219959A1 (en) | 1997-01-08 | 1998-01-07 | Polyhydroxyalkanoate depolymerase and process for producing the same |
| EP98300131A EP0863209A3 (en) | 1997-01-08 | 1998-01-08 | Polyhydroxyalkanoate depolymerase and process for producing the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9001198A JPH10191980A (ja) | 1997-01-08 | 1997-01-08 | ポリヒドロキシアルカノエイト分解酵素及びその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10191980A true JPH10191980A (ja) | 1998-07-28 |
Family
ID=11494773
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9001198A Pending JPH10191980A (ja) | 1997-01-08 | 1997-01-08 | ポリヒドロキシアルカノエイト分解酵素及びその製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5968801A (ja) |
| EP (1) | EP0863209A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10191980A (ja) |
| KR (1) | KR19980070317A (ja) |
| CA (1) | CA2219959A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005045017A1 (ja) * | 2003-11-05 | 2005-05-19 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6737263B2 (en) * | 2000-09-08 | 2004-05-18 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Polyhydroxyalkanoate levels as an indicator of bioreactor health |
| KR101397853B1 (ko) * | 2012-03-09 | 2014-05-20 | 경상대학교산학협력단 | 생분해성 폴리에스터의 분해조절 방법 및 분해제어된 생분해성 폴리에스터 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0686681A (ja) * | 1992-09-07 | 1994-03-29 | Chikyu Kankyo Sangyo Gijutsu Kenkyu Kiko | Ｐｈａ菌体内分解酵素 |
-
1997
- 1997-01-08 JP JP9001198A patent/JPH10191980A/ja active Pending
- 1997-12-31 KR KR1019970082143A patent/KR19980070317A/ko not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-01-05 US US09/003,086 patent/US5968801A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-01-07 CA CA002219959A patent/CA2219959A1/en not_active Abandoned
- 1998-01-08 EP EP98300131A patent/EP0863209A3/en not_active Withdrawn
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005045017A1 (ja) * | 2003-11-05 | 2005-05-19 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法 |
| JPWO2005045017A1 (ja) * | 2003-11-05 | 2007-05-24 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法 |
| JP4649593B2 (ja) * | 2003-11-05 | 2011-03-09 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ポリヒドロキシアルカノエート系樹脂の分解方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5968801A (en) | 1999-10-19 |
| CA2219959A1 (en) | 1998-07-08 |
| EP0863209A2 (en) | 1998-09-09 |
| KR19980070317A (ko) | 1998-10-26 |
| EP0863209A3 (en) | 1999-12-01 |
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