JPWO2015122190A1 - ポリヒドロキシアルカン酸の分解方法、並びに微生物製剤 - Google Patents
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Abstract
Description
非特許文献2:Schirmer等,Appl.Environ.Microbiol.,vol59,1220(1993)
非特許文献3:Klingbeil等,FEMS Microbiol.Lett.,vol142,215(1996)
非特許文献4:Takaku等,FEMS Microbiol.Lett.,vol264,152(2006)
(1)ポリヒドロキシアルカン酸を生物学的に分解する方法であって、下記(A)のメタン生成古細菌、及び、下記(B)の細菌を含んでなる微生物群集により、ポリヒドロキシアルカン酸を分解処理することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(A)Methanosarcina属のメタン生成古細菌、または、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌
(B)Acidobacteria門、Bacteroidetes門、Chloroflexi門、Firmicutes門、Nitrospirae門、Proteobacteria門、Synergistetes門、Thermotogae門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌
(2)前記(A)の古細菌が、Methanosarcina属のメタン生成古細菌を含有するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(3)前記(A)の古細菌が、Methanosarcina属のメタン生成古細菌と、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌の両方を含有するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(4)前記(B)の細菌が、Firmicutes門に分類される細菌の少なくとも1種を含有するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(5)前記Firmicutes門に分類される細菌が、16S rRNA遺伝子のクローンの割合として、前記微生物群集の全体に対し占める割合が50%以上95%以下であるポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(6)前記Firmicutes門に分類される細菌が、Peptococcaceae科またはThermoanearobacteraceae科に分類される細菌を、16S rRNA遺伝子のクローンの割合として合計で20%以上95%以下含有しているポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(7)嫌気条件下でポリヒドロキシアルカン酸を分解処理するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(8)20〜65℃の温度条件下でポリヒドロキシアルカン酸を分解処理するポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(9)前記ポリヒドロキシアルカン酸が3−ヒドロキシ酪酸および3−ヒドロキシヘキサン酸のうち少なくとも1種類を繰り返し単位構造として含む重合体であるポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(10)ポリヒドロキシアルカン酸が3−ヒドロキシ酪酸と3−ヒドロキシヘキサン酸を繰り返し単位構造として含む重合体であるポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(11)下記(A)のメタン生成古細菌、及び、下記(B)の細菌を含む、ポリヒドロキシアルカン酸分解及びメタン製造用微生物製剤。
(A)Methanosarcina属のメタン生成古細菌または単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌
(B)Acidobacteria門、Bacteroidetes門、Chloroflexi門、Firmicutes門、Nitrospirae門、Proteobacteria門、Synergistetes門、Thermotogae門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌
本発明により、PHBH等のPHAを、効率良く安価に分解し、メタンを主成分とするバイオガスを製造することが可能となる。これにより、PHBH等のPHAから形成されたゴミ袋ごと生ゴミを処理し、エネルギーとして再利用することが可能になる。
本発明において、PHAは、3HB及び3HHのうち少なくとも1種類から構成されるPHAが好ましく、より好ましくは、下記一般式:
本発明の微生物群集は、既存の嫌気性消化槽汚泥等のメタン発酵プロセスの汚泥から集積することができる。しかし、PHAを効率的に分解できる微生物群を集積できればよく、集積する方法は特に限定されない。
以下に、集積した微生物群集を用いてPHAを分解する方法を説明する。
(PHBH粉末合成法)
培養生産にはKNK−631株を用いた。
1L容ビーカーに約800mLの蒸留水をいれ、撹拌子でかき混ぜながら、酢酸、酢酸ナトリウム、リン酸二水素カリウム、炭酸水素カリウム、塩化アンモニウム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム六水和物、システイン塩酸塩一水和物、微量元素溶液、ビタミン溶液を添加し混合した。更に約100mLの蒸留水に懸濁させたPHBH粉末を超音波ホモジナイザーにて分散し、上記の水溶液に添加し、蒸留水で1LにメスアップすることでPHBHと酢酸塩の炭素濃度比(PHBH:酢酸塩)=1:9の合成廃水aを調製した。尚、合成廃水aは、総炭素濃度8,000mg/Lとなるように調製した。合成廃水aにおける各化合物の組成比を表1に示した。
合成廃水調製例1の方法に従い、表1に示したPHBHと酢酸塩の炭素濃度比、および各化合物の組成比で、合成廃水b、cを調製した。
各合成廃水およびリアクター槽内液のCODcr(化学的酸素要求量:有機物量の指標)は、試料中の有機物をニクロム酸カリウムで酸化した際に要求される酸素量として、COD試薬HR (Hach社)を用いて測定した。
リアクターから発生したバイオガスはプラスチック製のガスホルダに集気し、24時間間隔で発生バイオガス量を測定した。これを1時間当たりのバイオガス発生量に換算した数値をバイオガス発生速度とした。
(実施例1)
表2に示した微生物群を含有する嫌気性消化槽汚泥を種汚泥として、実容積1Lの完全混合型リアクターを37℃に設定した恒温水槽(実際の温度は36〜38℃)に浸漬し、嫌気的に運転した。乳化した合成廃水aを完全混合型リアクターに対して連続的に供給した。
表3に示した合成廃水、および希釈率とした以外は、実施例1と同様の方法でPHBH粉末を処理し、それぞれの定常状態でのリアクター処理性能をCODcr除去率ならびにバイオガス発生速度で評価し、その結果を表3に示した。
実施例2〜5における各リアクター槽内に集積された微生物群のシート状PHBHの分解性能を評価するために、嫌気環境におけるPHBHシートの分解試験を行った。
PHBH粉末(3HH比率11モル%)を同方向噛合型二軸押出機(東芝機械社製:TEM−26SS)を用いて、設定温度100〜140℃(出口樹脂温度160℃)、スクリュ回転数100rpmで溶融混練し、ダイスからストランド状に引き取り、ペレット状にカットした。
分解処理後の培地からPHBHシートを取り出し、PHBHシートの分解状態を、以下の基準により4段階で評価した。
−:未分解(シートの形状に変化がみられない。)
+:破損(分解により、切断や穴が開いたりしてシートの一部が破損しているが、長方形のシートの原型が保たれている。)
++:崩壊(シートの原型が認められないが、分解されたシートの残骸が観察される。)
+++:消滅(シートの原型もシートの残骸も培養液中に見られない)
(実施例6)
100ml容ガラスバイアル瓶に、表4に示した組成の無機塩培地40mlと、1cm×4cmに切断した厚み50μmのPHBHシート1枚とを入れ、N2:CO2=80:20の混合ガスで培地中の酸素を20分間置換した後、バイアル瓶をブチルゴム栓で密閉し、硫化ナトリウムおよびシステイン塩酸塩を注射器で添加することで絶対嫌気環境とした。
表5に示したリアクター槽内液を使用した以外は、実施例6と同様の方法で培養し、分解性評価を行い、その結果を表5に示した。
実施例1の種汚泥である表2に示した微生物群を含有する嫌気性消化槽の槽内液を用いた以外は、実施例6と同様の方法で分解性評価を行い、その結果を表5に示した。
実施例1〜5においてリアクターに供給している合成廃水には酢酸塩が含まれている。酢酸塩の共存によるPHBHシートの分解能を評価した。
バイアル瓶に6.8g/Lの酢酸塩をさらに添加した上で回分培養を行った以外は、実施例6と同様の方法で培養し、分解性評価を行った。その結果を表6に示した。
表6に示したリアクター槽内液を用いた以外は、実施例10と同様の方法で培養し、分解性評価を行った。その結果を表6に示した。
PHBHシートをごみ袋に使用した場合、生ごみを袋ごとメタン発酵により処理する必要があるため、有機物の共存下でPHBHシートの分解性を評価した。
タンパク質の加水分解物であるトリプトンを10g/Lの濃度となるようにバイアル瓶にさらに添加した上で回分培養を行った以外は、実施例6と同様の方法で培養し、分解性評価を行った。その結果を表7に示した。
表7に示したリアクター槽内液を用いた以外は、実施例14と同様の方法で培養し、分解性評価を行った。その結果を表7に示した。
10g/Lのトリプトンと共に、5g/Lのブドウ糖をバイアル瓶にさらに添加した上で回分培養を行った以外は、実施例16と同様の方法で回分培養を行った。その結果、回分培養開始後5日でシートが崩壊した。このことから、タンパク質由来の有機物と炭水化物由来の有機物が共存した条件でも、リアクター槽内に集積した微生物群集はPHBHシートの分解性を示すことが判った。
(実施例19)
実施例3のリアクター槽内液を採取し、落射蛍光顕微鏡(BX−41,オリンパス社)を用いて槽内液に存在する細胞を観察し、その結果を図1に示す。
実施例1、2、4、5のリアクター槽内液について実施例19と同様に顕微鏡観察した結果、供給する合成廃水のPHBH:酢酸塩の炭素濃度比および希釈率の違いに関わらず、実施例19と同様の結果が観察された。
(実施例24)
実施例3のリアクター槽内液に生息する微生物のDNAをDNA抽出キットISOIL for Beads Beating(ニッポンジーン社)を用いて抽出した。得られたDNAを鋳型として、前記微生物に含まれる細菌の16SrRNA遺伝子を、Go Taq Green Master Mix(Promega社)を用いたPCR法により増幅した。使用したPCRプライマーは、EUB338mixFと1490R(5‘-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)である。
実施例2、実施例4、実施例5のリアクター槽内液を用いた以外は、実施例24と同様の方法で各リアクターからそれぞれ約50個の16SrRNA遺伝子のクローンからなる遺伝子ライブラリを構築した。
(実施例28)
実施例24で得られた形質転換体に含まれるプラスミドに挿入された16S rRNAの塩基配列を、シーケンスプライマー907Rを用いて決定した。塩基配列の決定は、タカラバイオ社ドラゴンジェノミクスセンターにて行った。得られた塩基配列は、NCBI(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)のBLASTプログラムにより相同性検索を行った。その後、ミュンヘン工科大学のARBプログラム(http://www.arb-home.de/)を用いて16S rRNAのアライメントを行い分子系統学的な解析を行った。解読した16S rRNA遺伝子配列のV3−V4領域を含む約500bpに対して、配列の相同性がお互いに97%以上であるものを同一のOTU(Operational Taxonomy Unit)としてグループ化した。各OTU代表配列の分類は、Blastプログラムの相同性検索によって得た最も相同性の高い遺伝子配列を、マックス・プランク研究所のThe SILVA ribosomal database project (http://www.arb−silva.de) のデータベース SILVA ver. 117 に照合し、その配列の属する分類とした。実際には、リアクター由来の16S rRNA遺伝子配列から44のOTUに絞り込んだ。次に、各OTUの代表クローンの塩基配列とそれぞれに最も相同性の高い種の16S rRNA遺伝子配列を用いて近隣結合法(NJ法)ならびに最節約法(MP法)により最終的な系統樹を作成した。
実施例2、実施例4、実施例5のリアクター槽内液を使用した以外は、実施例28と同様の方法で、リアクター由来の16S rRNA遺伝子を門および綱レベルで分類し、その結果を表8に示した。
実施例3のリアクター由来の16S rRNA遺伝子の内、Firmicutes門に分類されたものをさらに詳細に分類した。系統樹を作成した結果、Firmicutes門に分類された16S rRNA遺伝子は、さらに7つのグループに分類されることが示された(図2、表9)。
実施例2、実施例4、実施例5について、実施例32と同様の方法で、各々のリアクター由来の16S rRNA遺伝子の内、Firmicutes門に分類されたものをさらに詳細に分類し、その結果を図2および表9に示した。
Claims (11)
- ポリヒドロキシアルカン酸を生物学的に分解する方法であって、下記(A)のメタン生成古細菌、及び、下記(B)の細菌を含んでなる微生物群集により、ポリヒドロキシアルカン酸を分解処理することを特徴とするポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
(A)Methanosarcina属のメタン生成古細菌、または、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌
(B)Acidobacteria門、Bacteroidetes門、Chloroflexi門、Firmicutes門、Nitrospirae門、Proteobacteria門、Synergistetes門、Thermotogae門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌 - 前記(A)の古細菌が、Methanosarcina属のメタン生成古細菌を含有することを特徴とする請求項1に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- 前記(A)の古細菌が、Methanosarcina属のメタン生成古細菌と、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌の両方を含有することを特徴とする請求項1に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- 前記(B)の細菌が、Firmicutes門に分類される細菌の少なくとも1種を含有することを特徴とする請求項1〜3のいすれか1項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- 前記Firmicutes門に分類される細菌が、16S rRNA遺伝子のクローンの割合として、前記微生物群集の全体に対し占める割合が50%以上95%以下であることを特徴とする請求項4に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- 前記Firmicutes門に分類される細菌が、Peptococcaceae科またはThermoanearobacteraceae科に分類される細菌を合計で、16S rRNA遺伝子のクローンの割合として20%以上95%以下含有していることを特徴とする請求項4または5に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- 嫌気条件下でポリヒドロキシアルカン酸を分解処理することを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- 20〜65℃の温度条件下でポリヒドロキシアルカン酸を分解処理することを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- 前記ポリヒドロキシアルカン酸が3−ヒドロキシ酪酸および3−ヒドロキシヘキサン酸のうち少なくとも1種類を繰り返し単位構造として含む重合体であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- ポリヒドロキシアルカン酸が3−ヒドロキシ酪酸と3−ヒドロキシヘキサン酸を繰り返し単位構造として含む重合体であることを特徴とする請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の分解方法。
- 下記(A)のメタン生成古細菌、及び、下記(B)の細菌を含むポリヒドロキシアルカン酸分解及びメタン製造用微生物製剤。
(A)Methanosarcina属のメタン生成古細菌、または、単桿菌状の水素資化性メタン生成古細菌
(B)Acidobacteria門、Bacteroidetes門、Chloroflexi門、Firmicutes門、Nitrospirae門、Proteobacteria門、Synergistetes門、Thermotogae門、および未分類門のいずれかの門に分類され、ポリヒドロキシアルカン酸を分解しうる細菌
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