DE4003827A1 - Verfahren zur freisetzung von poly-3-hydroxycarbonsaeuren - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Freisetzung von Homo- und/oder Copolymeren von 3-Hydroxycarbonsäuren aus diese enthaltenden Zellen gram-negativer Bakterien durch induzierte Lyse mit Hilfe eines natürlichen oder chimären Lysegens.

Unter Homo- und/oder Copolymeren von 3-Hydroxycarbonsäuren sind solche zu verstehen, die von gram-negativen Bakterien, wie bei­ spielsweise Alcaligenes, Athiorhodium, Pseudomonas, Rhizobium, Spirillum gebildet und gespeichert werden können. Insbesondere sind dies Homo- und/oder Copolymere der 3-Hydroxybuttersäure (PHB) und der 3-Hydroxyvaleriansäure (PHV). Es ist aber auch möglich, daß diese Bakterien andere Poly-3-Hydroxycarbonsäuren speichern. Verfahren zur Bildung und Speicherung von PHB und PHV sind beispielsweise in EP-A-00 15 699, EP-A-00 46 344 und EP-A-00 52 459 beschrieben.

Aus Slater et al., J. Bacteriol. 170, 4431 ff. (1988) ist bekannt, daß die für die PHB-Erzeugung in der Zelle verantwortlichen En­ zyme in Bakterienzellen, die nicht PHB erzeugen, beispielsweise in Escherichia coli kloniert und mit Hilfe entsprechender Plas­ mide exprimiert werden können, wobei die klonierten Enzyme dann die Synthese von PHB in der Zelle hervorrufen.

Die Freisetzung von Poly-3-Hydroxycarbonsäuren aus den Zellen der Mikroorganismen kann durch Extrahieren des Polymeren aus den trockenen Zellen mit einem Extraktionsmittel, in dem dieses gut löslich ist, erfolgen. Ein solches Verfahren ist beispiels­ weise in EP-A 15 123 beschrieben. Dabei müssen die Zellen vor­ erst aufgebrochen und so für das entsprechende Extraktionsmit­ tel durchlässig gemacht werden. Ein Nachteil dieser Verfahren liegt darin, daß durch das Extraktionsmittel nicht nur das Polymer aus der Zelle gelöst wird, sondern auch bestimmte Zellbestandteile, im speziellen Lipide, in Lösung gehen und diese Verunreinigungen anschließend vom Polymer getrennt werden müssen.

Eine Möglichkeit der Freisetzung von Poly-3-Hydroxycarbonsäuren aus feuchten Zellen ist in der EPA 145 223 beschrieben. Dabei wird das Zellmaterial enzymatisch und/oder durch oberflächenak­ tive Substanzen in Lösung gebracht, wobei das Polymer ungelöst zurückbleibt. Die Auflösung des Zellmaterials muß dabei in meh­ reren Stufen erfolgen, wobei auch dann noch die Auflösung un­ vollständig bleibt und nicht gelöste Zellbestandteile im Poly­ mer zurückbleiben.

Es ist auch bekannt, gram-negative Bakterien durch Expression klonierter Lysegene aufzuschließen. In DE-A 37 15 840 ist bei­ spielsweise die Lyse von E.coli-Zellen mit Hilfe eines chimären Lysegens, das durch einen temperaturinduzierten Promotor ge­ steuert wird, beschrieben, wobei die Zellen innerhalb von etwa 30 bis 70 Minuten lysiert werden.

In Witte, Lubitz, Eur. J. Biochem. 180, 393 ff., (1989) wurde die Lyse von E.coli mit Hilfe des Bakteriophagen Lysegens E un­ tersucht und festgestellt, daß sich bei der Lyse ein kleiner, transmembraner Lysetunnel mit einem Durchmesser von etwa 30 bis 100 nm bildet, durch den Zellinhaltsstoffe in das umgebende Me­ dium diffundieren können. Die Zellen werden innerhalb von etwa 30 bis 60 Minuten lysiert. Da dieser Tunnel sehr klein ist, ist die Anwendung dieses Verfahrens zur Freisetzung von Polymeren, deren Größe beinahe das gesamte Zellvolumen ausfüllt, in größe­ ren Maßstab zu langwierig.

Es konnte nun ein Verfahren zur Freisetzung von Poly-3-Hydroxy­ carbonsäuregranula aus diese enthaltenden Zellen gram-negativer Bakterien durch Expression eines klonierten natürlichen oder chimären Lysegens gefunden werden, bei dem überraschenderweise nicht kleine Lysetunnel, sondern Öffnungen gebildet werden, die in ihrem Durchmesser beinahe den gesamten Querschnitt der Zelle umfassen, bei dem die Zellhüllen in ihrer ursprünglichen Ge­ stalt bestehen bleiben, und bei dem die in der Zellwand veran­ kerten Lipide in der Zelle bleiben, wobei eine vollständige Ab­ trennung der Poly-3-Hydroxycarbonsäuregranula in wäßrigem Me­ dium möglich ist.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Freiset­ zung von Poly-3-Hydroxycarbonsäuregranula aus diese enthalten­ den Zellen gram-negativer Bakterien durch Expression eines klo­ nierten natürlichen oder chimären Lysegens, das dadurch ge­ kennzeichnet ist, daß man vor der Induktion der Lysegen Ex­ pression die Ionenstärke an zweiwertigen Kationen auf 0,05 bis 0,5 mol erhöht, die Expression des Lysegens durch Tempera­ turerhöhung induziert, die Zellen erntet und die noch feuchten Zellen in Wasser oder Pufferlösungen resuspendiert, wodurch die Freisetzung der Polymergranula durch spontane Lyse erfolgt.

Zur Durchführung des Verfahrens werden die gram-negativen Bak­ terien, welche die Poly-3-Hydroxycarbonsäuren erzeugen, durch Expression eines geeigneten klonierten Lysegens zur Lyse pro­ grammiert. Das Lysegen kann ein natürliches, beispielsweise das Lysegen E der Bakteriophagen PhiX174, oder ein chimäres Lysegen sein. Vorzugsweise wird das klonierte Lysegen E der Bakte­ riophagen PhiX174, beispielsweise auf Plasmid pSH2 (Fig. 1) oder pAW13 verwendet. Zur Herstellung von Plasmid pAW13 wird das PsH/BamHI Fragment aus Plasmid pSB12 (Blasi et al., J. Gen. Microbiol. 131, (1985), 1107ff.), das das Gen E unter Kontrolle des Lambda pL-Promotors enthält, in die PsH/BamHI Schnittstel­ len des pACYC177 (Chang et al. J. Bacteriol 134 (1978), 1141ff.) eingefügt. Anschließend wird das erhaltene Plasmid mit PstI geschnitten, worauf es mit T4DNA Polymerase behandelt wird, um das bla-Gen zu zerstören. Das so erhaltene Plasmid pAW13 trägt das Lysegen E unter Kontrolle des Lambda pL Promotors. Poly-3- Hydroxycarbonsäuren erzeugende gram-negative Bakterien, die zur Lyse programmiert werden können, sind beispielsweise Alcalige­ nes, Athiorhodium, Pseudomonas, Rhizobium, Spirillium sowie Escherichia coli, in die PHB/PHV produzierende Enzyme kloniert sind.

Die Bakterienzellen werden auf übliche Weise fermentiert, d. h. auf einem für die Bildung von Poly-3-Hydroxycarbonsäuren ge­ eigneten Substrat, beispielsweise mit Kohlehydraten als Ener­ giequelle, in Abhängigkeit vom eingesetzten Bakterium bei einer Temperatur von etwa 28 bis 37°C kultiviert. Dabei ist zu be­ achten, daß die Temperatur so niedrig gehalten wird, daß der temperatursensitive Promotor des Lysegens die Lyse nicht schon während der Fermentation induziert.

Anschließend wird die Konzentration zweiwertiger Kationen, bei­ spielsweise durch Zugabe von MgSO₄, CaCO₃ u. dgl. auf etwa 0,05 bis 0,5 mol, vorzugsweise auf etwa 0,1 bis 0,3 mol erhöht. Nun wird die Lyse durch Erhöhung der Temperatur auf etwa 42°C induziert, ihr Einsetzen wird durch die hohe Ionenstärke zweiwertiger Kationen noch verhindert. Die Zellen werden durch sanftes Zentrifugieren geerntet und das feuchte Zellmaterial anschließend in Wasser oder wäßrigen Pufferlösungen resuspen­ diert, wobei es zu einem spontanen Aufplatzen der Zellen kommt und cytoplasmatische Inhaltsstoffe und darin enthaltene Poly-3- Hydroxycarbonsäuregranula innerhalb weniger Minuten freigesetzt werden. Als wäßrige Pufferlösungen können beispielsweise 0,001- 0,01 mol/l TrisHCl, 0,001-0,01 mol/l KH₂/K₂HPO₄-Puffer und dgl., eingesetzt werden.

Die freigesetzten Polymergranula, die cytoplasmatischen Inhaltsstoffe und die leeren Zellhüllen können durch übliche Trennmethoden, beispielsweise durch Dichtegradientenzentrifuga­ tion getrennt werden.

Beispiel 1 Konstruktion des Klonierungsvektors pSH2 (Fig. 1)

Das Plasmid pSH1 (S. Haist, PhiX174 Spezifische Vektorkonstruk­ tionen, Diplomarbeit München 1989) wurde mit dem Enzym Fsp I im entsprechenden Restriktionspuffer geschnitten, wobei ein 5697 bp und ein 1969 bp großes Fragment mit glatten Enden entstand. Die beiden Fragmente wurden gelelektrophoretisch getrennt und mittels "Gene Clean" (Fa. Bio 101 Inc.) gereinigt.

Das Plasmid pBluescript pSK(-) (Fa. Stratagene) wurde mit den Restriktionsenzymen SspI, das glatte Enden bildet, und Afl III, das 5′ überstehende Enden bildet, im entsprechenden Re­ striktionspuffer geschnitten, wobei drei Fragmente mit 1697 bp, 712 bp und 555 bp entstanden. Das 712 bp große Fragment wurde mit "Gene Clean" eluiert und das 5′ überstehende Ende mit Klenow Polymerase aufgefüllt. Das 5697 bp große Fragment aus pSH1 wurde mit diesem 712 bp großen Fragment mit Hilfe von T4DNA Li­ gase im entsprechenden Puffer ligiert.

Beispiel 2 Transformation von E.coli PC 1363 (Phabagen Collection, Univer­ sität Utrecht)

Die Transformation des E.coli PC 1363 erfolgt in an sich be­ kannter Weise, beispielsweise nach der in Maniatis et al., Mole­ cular Cleaning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982) beschriebenen Methode.

Dazu werden 5 ml Lurea Broth, ein Nährmedium bestehend aus 10 g Pepton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl in 1000 ml destilliertem Was­ ser (pH7) mit 1 ml Vorkultur von E.coli PC 1363 inokuliert und bei 37°C geschüttelt. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und in 25 ml Transformationspuffer bestehend aus 150 mmol/l KCl, 50 mmol/l MgCl und 1 mmol/l TrisHCl in Eis suspen­ diert. Nach erneuter Zentrifugation werden die Zellen in 2 ml Transformationspuffer resuspendiert. Von dieser Suspension wer­ den 0,1 ml mit Plasmid DNA (pSH2 (p15A) und pSB20-PHB (pHB1) (Slater et al., J.Bacteriol. 170, p 4431ff. (1988))) versetzt und nach etwa 1 Stunde 1,2 ml Lurea Broth bei 28°C zugesetzt.

Die Transformanten wurden entsprechend der Antibiotikaresi­ stenzmarker der Plasmide selektioniert.

Beispiel 3 Fermentation und Lyse von E.coli PC 1363 (pSB20, pSH2)

10 ml Lurea Broth wurden mit einer Übernachtkultur des nach Beispiel 2 hergestellten E.coli Stammes beimpft und bei 28°C bis zu einer optischen Dichte OD₆₀₀=0.2-0.9 kultiviert. Dann wurde eine 2 mol/l MgSO₄-Lösung bis zu einer Endkonzen­ tration von 0,2 mol zugesetzt und 30 min bei 28°C inkubiert. Die Temperatur wurde anschließend auf 42°C erhöht, nach 30 min wurden die Zellen durch Zentrifugation (7000 U/min, 5 min) bei 4°C geerntet und das Zellmaterial in 10 ml destilliertem Was­ ser resuspendiert. Die Lyse erfolgt während der Suspension innerhalb von 10 min.

Zum lysierten Zellgemisch wurde Saccharose bis zu einer Endkon­ zentration von 55% zugesetzt und mit 50-, 45- und 40%iger Sac­ charoselösung in 3 mmol/l EDTA überschichtet. Nach 16 Stunden Zentrifugation (4°C, 37000 U/min, SW41Ti) wurde der Gradient fraktioniert und der Proteingehalt, die Dichte sowie der Gehalt an PHB/PHV bestimmt. Es wurden drei Fraktionen mit Dichten 1,24 g/ml (nichtlysierte Zellen), 1,22 g/ml (Zellghosts) und 1,20 g/l (PHB/PHV) erhalten. Dabei wurden 60 bis 80% PHB/PHV-Granula freigesetzt.

Claims (6)

1. Verfahren zur Freisetzung von Poly-3-Hydroxycarbonsäuregra­ nula aus diese enthaltenden Zellen gram-negativer Bakterien durch Expression eines klonierten natürlichen oder chimären Lyse-Gens, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Induk­ tion der Lysegen Expression die Ionenstärke an zweiwertigen Kationen auf 0,05 bis 0,5 mol erhöht, die Expression des Lysegens durch Temperaturerhöhung induziert, die Zellen erntet und die noch feuchten Zellen in Wasser oder Pufferlösungen resuspendiert, wodurch die Freisetzung der Polymergranula durch spontane Lyse erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lysegen das klonierte Lysegen E der Bakteriophagen PhiX174 eingesetzt wird.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Konzentration an zweiwertigen Kationen auf 0,1 bis 0,3 mol erhöht wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Konzentration an zweiwertigen Kationen durch Zufügen von MgSO₄ oder CaCO₃ erhöht wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als gram-negative Bakterien Alcaligenes oder klonierte E.coli eingesetzt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als gram-negative Bakterien klonierte E.coli eingesetzt werden.