JPS6287089A - 高温で活性なｄ―ヒダントイナーゼを含有する大腸菌の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、高温で活性なＤ−ヒダントイナーゼを含有す
る中温菌微生物を製造する方法、ならびにこの菌をヒダ
ントイナーゼの製造に又はＤ，Ｌ−ヒダントインの分割
に使用することに関する。

ジヒドロピリミジナーゼ（ＥＣ３，５，２，２）は、ラ
セミ体のヒダントインを分割して対応するＤ−Ｎ　−及
ヒＬ　−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸にする場合に
触媒作用をする。Ｄ−Ｎ−カルバモイル−α−アミノ酸
は、半合成のペニシリン及びセファロスポリンを製造す
るための重要な中間体である。

耐熱性微生物から得られるジヒドロビリミジナーゼはＤ
ＥＯ８６０３１１５１号明細書に記載されており、これ
はＤ，Ｌ−ヒダントインを立体選択的にＤ−Ｎ−カルバ
モイル−α−アミノ酸に分割し、その際酵素が活性であ
る高い転位温度（４０〜９０°Ｃ）によって、分離され
なかったＬ−ヒダントインは後から自然にラセミ化する
。

ヒダントインに対する特殊性によってＤ−ヒダ化したの
ちＤ，Ｌ−ヒダントインの分割に用いられる。しかし使
用された耐熱性微生物はわずがな細胞密度に生長するに
すぎない。またＤ−ヒダントイナーゼの含量は、微生物
の全蛋白のわずかな千分率に達するにすぎない。

発酵収率を向上するためには、原則として二つの方法が
可能である。

１、化学的又は物理的方法による変異誘発によって明ら
かに高い酵素収率を与えるように微生物を変化させるこ
とを試みることができる。

しかし著しく改良された微生物によるこの試みは、大き
い費用を要し、しかも結果が不確実である。

２、酵素生成に責任のある遺伝子を微生物がら単離し、
これを本来の供与微生物又は他の微生物（それはこの遺
伝子を吸収し、安定に遺伝し、そし−で機能を保持する
）に移植したのち、高い酵素生成に導くように変えるこ
とを試みることができる。

酵素生成活性を高めそして酵素を安定化するため、目的
とする変化を、遺伝子と結びつ（ＤＮＡ連鎖の範囲で又
は遺伝子自体の範囲で行うこともできる。

最後に細胞の酵素生成を、各細胞において酵素生成に責
任のある同一遺伝子の数を増加することにより増強する
こともできる。

多数の遺伝子移植が成果をあげているが（米国特許４２
３７２２４号、ＥＳＯ８３１３号、ＤＥＯ５３１３８０
９６号、同３２３８５５４号及びＪ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｔｏｋｙｏ　８９巻６６７頁１９８
１年参照）、特定の場合に遺伝子移植が希望する結果に
導くことを予測できない。

本発明は、Ｄ−ヒダントインを分解する高温菌微生物か
らＤＮＡを分離して断片に破断し、得られたＤＮＡ断片
をクローニングベクトルと結合し、この再結合クローニ
ングベクトルを中温菌微生物中で統合し、酵素活性ヒダ
ントイナーゼを表現するこの微生物を選別することを特
徴とする、高温で活性なＤ−ヒダントイナーゼを含有す
る中温菌微生物の製法である。

さらに本発明は、この耐熱性微生物から得られるＤ−ヒ
ダントイナーゼコード化ＤＮＡ連鎖及びこの連鎖を含有
するクローニングベクトル、ナラびにこのクローニング
ベクトルを含有する耐熱性微生物及びそれを耐熱性Ｄ−
ヒダントイナーゼの製造に又はＤ，Ｌ−ヒダントインの
分割に使用することに関する。

遺伝子移植により得られるＤ−ヒダントインを分割しう
る耐熱性微生物を製造するためには、Ｄ−ヒダントイン
を分割しうる耐熱性微生物から出発する。その微生物の
例は、テルムス・スペック及びバチルス属の耐熱性のも
のである。

これは栄養素の多い水性生物生息地域から土含有又は水
性の試料を短時間約１００℃に加熱し、培地中で約６０
°Ｃで保温し、次いでＤ−ヒダントイナーゼ活性を選別
することにより得られる（　ＤＥＯ８３０３１１５１号
参照）。その２種の菌株が寄託されている（ＣＢ５３６
３．８０及びＣＢ５３６３．８０）。

より、ＤＮＡいわゆるスペンダーＤＮＡが単離され、こ
うして得られた分解液からフェノール含有溶液を用いて
蛋白の土量を沈殿させ、次いで残りの蛋白を酵素分解及
びそれに続く透析により除去する。こうして得られた溶
液から、平衡勾配遠心分離及びそれに続（透析によりス
ペンダーＤＮＡが純粋に得られる。

Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子を単離し又は濃化するため
には、スペンダーＤＮＡを断片にせねばならない。これ
は物理的に剪断力を作用させ、あるいは化学的に酵素分
解することによって行われる。

物理的切断は、例えばＤＮＡの超音波処理、ホモジナイ
ザー中の高速攪拌、カニユーレによる圧搾又は凍結と解
凍の繰り返しにより行われる（　Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、　７７巻１頁１９７６年参照）。

スペンダーＤＮＡの酵素による切断は、例えば好ましく
は二重素片が生ずる条件下で静力学的に分解するＤＮＡ
アーゼを用いて行われる（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ　２４２巻４４０９頁１９６８年
参照）。

統合成分としてベクトルＤＮＡに吸収される形にせねば
ならない。スペンダーＤＮＡ及びベクトルＤＮＡは、両
者を相互に補充する基剤を用いて延長しそしてカップリ
ングさせることにより、相互に結合することもできる。

限定末端ヌクレアーゼによるスペンダーＤＮＡの分解は
特に好ましく、それはＤＮＡ断片の末端で特定の限定末
端ヌクレアーゼの種類にのみ左右されるヌクレオチド連
鎖を遊離化する。プラスミドｐＢＲ５２２又はｐＢＲ３
２７（Ｇｅｎｅ　２巻９５頁１９７７年及び同９巻２８
７頁１９８０年参照）又はそれから誘導されたプラスミ
ド例えばＩ）ＨＣ７９（同書１１巻２９１頁１９８０年
参照）をベクトルＤＮＡとして使用する場合は、限定末
端ヌクレアーゼとして特にＥｎｄｏＲ，ＢａｍＨ１、Ｅ
ｎｄｏＲ，Ｈｉｎｄｌｌｌ、　ＥｎｄｏＲ，ＥｃｏＲＩ
又はＥｎｄｏＲ，ＰｓｔＩがあげられる（酵素の記号は
多くは形成基を略して（ＥｎｄｏＲ）として略記される
）。これは前記のプラスミドを１回だけ切断して、その
中にスペンダーＤＮＡ断片が特に良好な進行可能に補充
される線状ベクトルＤＮＡにする。分割されたＤＮＡの
同族の末端連鎖を遊離化する特定の限定末端ヌクレアー
ゼの結合も用いられる。例えばスペンダーＤＮＡを、多
くの認められた場所で切断されたＥｎｄｏＲ，Ｓａｎ　
３　Ａを用いて断片化することができる。続いてこの断
片を、ＥｎｄｏＲ。

ＢａｍＨ１により切断されたベクトルＤＮＡ中に、ＤＮ
Ａリガーゼ（ＥＣ６，５，１，１：］の作用により統合
する。

スペンダーＤＮＡの断片化を、低濃度の多くの位置で切
断される限定末端ヌクレアーゼを用いて行うと、準静力
学的に生成したＤＮＡ断片が得られ、その場合断片の大
きさは、酵素濃度及びその作用期間に依存する。こうし
てＤＮＡ断片もクローン化することができ、これはわず
かに裂けた限定末端ヌクレアーゼのためのその特殊な基
剤連鎖によって、前記のように試用される遺伝子に存在
する識別位置に対し、全く又は不充分にしか近接を有し
ない。

スペンダーＤＮＡの断片は直線化されたベクトルＤＮＡ
　Ｋ埋め込まれる。これは場合によりＴ４を感染させた
大腸菌細胞から得られたＤＮＡ　ＩＪガーゼを用いて行
われる。埋め込みのためには共因子（ＮＡＤ　又はＡＴ
Ｐ　）が必要である。

ベクトルＤＮＡとしては、プラスミド、コスミド又はバ
クテリオファージからのＤＮＡが適する。

最初の埋め込み工程のためには線状化コスミド又はバク
テリオファージλのＤＮＡを使用することが好ましく、
それ以後の埋め込み工程のためにはプラスミドが好まし
い。なぜならばコスミド又はバクテリオファージλＤＮ
Ａは、プラスミドＤＮＡよりもはるかに大きいＤＮＡ断
片をクローン化しうるからである。コスミドー又はバク
テジオファージ−ベクトル中にクローン化されうるＤＮ
Ａ断片の最大の大きさは、約５０〜２６Ｋｔ）である（
　１Ｋｂは二重索ＤＮＡの１０００基体対に相当する）
。これによってＤ−ヒダントイナーゼの表現について試
験されねばならない独立のクローンの数が少なく保たれ
る。例えばコメミドベクトル中の統合断片の大きさが４
０　Ｋｂにおいて、微生物の全ＤＮＡは約６５０の独立
クローン中で９９％の公算が得られるのに対し、プラス
ミドクローニングのための代表的大きさの範囲において
は、試験されるクローンの数は約２３００に上昇する。

しかし求めるコード化ＤＮＡ連鎖が発見されたのちは、
まず必然的に同時にクローン化された隣接の希望しない
ＤＮＡ連鎖を、できるだけ高い安定性を得るために除去
せねばならない。このために最適には（しばしば必要な
処理でもあるが）　ＤＮＡを限定酵素消化物の形でプラ
スミドに埋め込み、そしてＤＮＡの低下した大きさによ
って結合を容易にすることが適する。

こうして得られた雑種ベクトルを適当な宿主細胞に加入
する。それは特定の遺伝学的標識を有する大腸菌細胞、
特に限定／変性系の欠損を有するもの（ｒ−ｍ″″）、
再結合欠損を有するもの（ｒｅｃＡ−）及び場合により
熱安定なλ−抑制因子（ｃ工８５７　）を有するもので
ある。特に好適な宿主細胞はＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ　１
０１、ＮＦＩ、Ｗ６　（λｒｅｘ）及びＮ４８６０であ
る。

得られた遺伝子クローニングの証明はこの段階では、遺
伝子のための特殊な証明試薬を入手しうるか否かに依存
する。一般にこれは核酸又はその断片であって、これは
供与細胞から単離されるか、あるいは先にクローン化さ
れた当該遺伝子の一部であるか又はそれと隣接する連鎖
であるか、あるいは蛋白生成物の一部アミノ酸連鎖につ
いて化学的に合成されたもの（それに遺伝子がコード化
される）である。最後にその中で別種の受入細胞が特殊
な蛋白生成物を生産する遺伝子の容積も利用でき、この
場合は生成蛋白の証明のための抗体が利用され、あるい
は生成した蛋白を場合により酵素活性により検出するこ
とができる。いずれの場合にも、求める遺伝子（Ａ）が
シグナル連鎖を持参することが必要で、これは受入細胞
中で転写の促進剤もしくは終末剤又はリポソーム結合位
置として機能しつる（これらの概念の定義についてはバ
イオテクノロジー・メイド・シムプル、エイ・グロツサ
リ−・オプ・リコムビナントＤＮＡ・アンド・ヒプリド
マ・テクノロジー、ＰＪＢパブリケーションズ１８−２
０　Ｈｉｌｌ　Ｒ１５ｅ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　５ｕ
ｒｒｅｙ。

ＴＷ１０６　ＵＡ、　ＵＫ、１９８３参照）。この見地
から酵素試験によるスクリーニングの費用により制限さ
れるが、大きいＤＮＡ断片について最初のクローニング
を行うことが有利である。そのためにはコスミドベクト
ル又はファージベクトルについてのクローニングが役立
つ。

得られた遺伝子（Ａ）の表現をさらに改善するため、前
記のシグナル連鎖を他の遺伝子（Ｂ）によって調整する
こともできる。他の遺伝子（Ｂ）は、例えばＭＳ２−レ
プリカーゼの断片のＤＮＡ当量及びバクテリオファージ
λのクロ遺伝子断片である（　Ｇｅｎｅ　１５巻８１頁
１９８１年及びＥＭＢＯＪ　、　１巻１２１７頁１９８
２年参照）。

しかし遺伝子をまずコスミドから小さいプラスミドに加
入することも好ましい。そのためには特に遺伝子（Ａ）
を含むコスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡアーゼを用いて
数回の処理に分けて切断する。この処理物を一緒にして
電気泳動法又はクロマトグラフィにより、大きさに応じ
て分画する。摂取遺伝子の大きさに相当する分子量範囲
のＤＮＡ分画を単離して精製する。こうして得られたＤ
ＮＡを、線状化された少なくとも１回耐性標識されたプ
ラスミドＤＮＡを用いて結合する。

この結合物を細菌細胞中で変形する。こうして得られた
細胞を、使用したプラスミドが宿主細胞に耐性を媒介す
る物質を含む媒体中でクローン化する。このヒダントイ
ナーゼを生成するクローンを単離する。

このクローンは次の表現最適化に用いられる。

そのためにはまずそこに得られたプラスミドを既知方法
により単離し、そして線状化する。得られた線状ＤＮＡ
を、分子の末端に直進的に作用するＤＮＡアーゼを用い
て消化し、最後にＤＮＡリンカ−の添加により再度環化
させる。この方法の最初の線状化は、限定酵素を用いて
行われ、希望しないＤＮＡ連鎖の除去が第二工程で遺伝
子に直進的に作用するＤＮＡアーゼが作用する前又は後
に行われる。

結合により再環化されたプラスミドは、続いて細菌に移
入されてクローン化される。Ｄ−ヒダントイナーゼを作
用させたクローンは、Ｄ−ヒダントイナーゼコード化連
鎖の外に最初のＤＮＡができるだけ少なく含まれるよう
に選ばれる。

このためには、なるべく少ない最初のＤＮＡを５′−末
端と酵素切断位置との間に含むクローンを、なるべく少
ないＤＮＡを６′−末端と酵素切断位置との間に含むも
のと結合することが好ましい。

結合生成物は常法により増殖され、単離され、そしてＤ
−ヒダントイナーゼ遺伝子が酵素により切り出される。

これは適当なプラスミド中に統合され、それは強い促進
剤で高活性のリポソーム結合位置を有する。その例はｐ
ＰＣＬＣ２４−誘導体、ｐＥＸ　３１又はプラスミドｐ
ＣＬ　５４７である（例えば前記両文献参照）。

得られたプラスミドを続いて細菌に移入する。

前記のプラスミドはλ−リプレッサーＣＩにより規制さ
れるので、この移入のためには、熱安定な抑制因子に導
く変異したＣＩ−遺伝子を有する大腸菌株を使用すべき
である。その細胞の中で促進剤は高められた温度で感作
される。プラスミド含有細菌は、Ｄ−ヒダントイナーゼ
酵素活性により最終的に選ばれる。

耐熱性微生物から単離されたＤ−ヒダントイナーゼ遺伝
子は、意外にもそのための異種シグナル連鎖とならずに
、中温菌大腸菌の中で受領細胞となる。ＣＢＳ　５０３
．８０株のクローン化ＤＮＡ連鎖は、−緒にクローン化
された６′−遺伝子中心部のＤＮＡ連鎖の部分削除後に
おける構成の種々の段階で不安定で詳細な限定分析及び
連鎖分析によって生成した変異株から選別されねばなら
ないことが知られた。ＣＢＳ　！１０３．８０のＤ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子の譲渡停止シグナルの後の ０２５〜１２５八ヌクレオチド及び最初のシグナル（５
′−遺伝子近位）の前の約２５０のヌクレオチドの３′
一連鎖の残留長さにおいて、遺伝子はなお安定である。

両方のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子のための表現が最終
的に最適化されると、他の遺伝子（１）ＥＸ−構成中の
ＭＳ２−複製断片、ｐＣＬ−構成中のｃｒｏ−遺伝子断
片、実施例１．８及び実施例２．６参照）との連結が望
まれるが、実際上融合蛋白が検出される場合のみが、さ
のＤ−ヒダントイナーゼが見出される。意外にもこの構
成における酵素の合成は熱により誘導できる。これは細
胞体について出発株（ＣＢ５３０３．８０）の４〜４０
倍も高い酵素活性に導く。

下記実施例では、併用されない２種のＤ−ヒダントイナ
ーゼ遺伝子の効果のあるクローニンの１９のアミノ酸に
おいてのみ制限された相似（５２％）を有する（次式参
照）。

各Ｄ−ヒダントイナーゼのアミノ酸相似実施例１ １．１　ＤＮＡの単離 カステンホルン培地２００ｍ／［：Ｉｌ中にバザチトリ
プレックス■１ｏｇ、ＣａＳＯ４”　２Ｈ２０７，５９
ｇ）、痕跡元素溶液（Ｉｌ中に濃硫酸０．５ゴ、Ｈ３Ｂ
Ｏ３０，５ｉ　、　　ＣｕＣ１７８ｍ９、Ｎａ２ＭｏＯ
，＊　２Ｈ２０２Ｂ、７５ｍ９、Ｃｏ２Ｏ３・７Ｈ２０
９，４，９４Ｔｎ９を含有）、酵母エキス２．５ｇ、バ
クトドリプトン２．５ｇ、Ｎａ、Ｐ○４１１２Ｈ２００
，２５８、！ｉ’を含有〕に、新たに一夜培養した非胞
子形成性のダラム陰性耐熱性細菌ＣＢＳ　３０３．８０
の細胞１０ｒｎｌを接種し、６０沈殿を溶液Ａ　（５０
ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８、しよ糖１０％）の２０
０ｍ１に懸濁し、再度遠心分離したのち、溶液Ａの１６
ｍ１に再度懸濁する。

１５分間保温したのち、０．５　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｐ
Ｈｓ、ｏ）４ｍｌを添加し、さらに室温で５分後によく
混和しながら、溶液Ｂ（）リス−ＨＣｌ　５０　ｍＭ、
ｐＨ８、ＥＤＴＡ　　１０　　ｍＭ、　　　０．　５　
　％　ト　リ　ト　ン　×　１００）２０ｍｌをピペッ
トで滴加する。次いで直ちに１０％ドデシル硫酸ナトリ
ウム溶液２．６　ｍｌを添加し、混合したのち粘稠な細
胞溶解物を６００Ｃで１０分間保持する。５Ｍ過塩素酸
ナトリウム溶液５　ｍｌを添加したのち、細胞溶解液を
フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール〔０
，１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７，４，０，０５Ｍ　Ｎａ
Ｃ１，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．０１％β−ヒドロキ
シキノリンにより平衡化したフェノール２５容量部、ク
ロロホルム２５容量部、イソアミルアルコール１容量部
１５０ｍＪと共に、４０℃で３０分間振と５する。乳化
液を１０分間４０００．９で遠心分離する。分離した上
層を、前記と同様にフェノール／クロロホルム／イソア
ミルアルコールを用いて２回、続いて同量のクロロホル
ムを用いて抽出する。上の水層を５０ｍＭトリス−ＨＣ
ｌ、５０　ｍＭ　ＮａＣ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ　４−ｅ
（ｐＨ８）に対して４℃で１６時間透析し、０．１５　
Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭ　）リス−ＨＣ’ｌ、ｓ　ｍＭ
　ＥＤＴＡ　（１）Ｈ８）の塩濃度となし、ＤＮＡアー
ゼ不含のＲＮＡアーゼを用いて（最終濃度０．１ダ／ｍ
１）３７°Ｃで３０分間保温する。この混合物を前記と
同様に、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ールを用いて１回、そしてクロロホルムを用いて２回抽
出する。

得られた水溶液（ＤＮＡ含量３　’０　μｉ　／　ｍｌ
　）　５ｍｌを、四硼酸ナトリウムを用いて最終濃度を
１０　ｍＭとなし、固形塩化セシウム（約１．３６　ｇ
／　ｍｌ　ＤＮＡ溶液）を用いて屈折率を１．４００に
する。１４００００．！ｉ＋で限外遠心分離したのち（
４８時間、２０℃）、遠心管内容物を管底の穿刺により
滴下させて分画する。ＤＮＡ含有分画は紫外線吸収測定
（２６０ｎｍ　）により同定され、溶液Ｃ（２ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、２　ｍＭ　ＮａＣ１，０゜１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　、　ｐＨ８）の４ノに対し４℃で１６時間透析す
る。

１．２コスミドベクトルｐＨ０７９における「ショット
ガン」クローニング １．１により得られたＤＮＡ各２０μｇを、１００　ｍ
Ｍ　トリス−ＨＣｌ　、　　ｐＨ７，５，５０ｍＭ　Ｎ
ａＣ１及び１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２０．２　ｍｌに溶解
し、２．０　Ｕ　ＢａｍＨｌを用いて各１０分、２０分
及び６０分分解する。

反応混合物を一緒にし、フェノールで処理して蛋白を除
去し、−７０℃でエタノール２．５容量部を加えて１０
分間エタノール沈殿を行うことにより（塩濃度：０．５
Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５）ＤＮＡを濃縮する。１００
　ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　、ｐＨ７゜５．５０　ｍＭ　
ＮａＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣ１□、６　ｍＭ　ＤＴＴの
中で１．５ＵのＢａｍＨｌ　／　ｔｄｉ　ＤＮＡを用い
て消化を行うことによりコスミドｐＨＣ７９（Ｇｅ：二
ｅ１１巻２９１頁１９８０年の第２図）を線状化し、脱
蛋白し、そしてエタノール沈殿により濃縮する。

ＣＢＳ　６０３．８０からのＢａｍＨｌで一部分解した
ＤＮＡ７μＩならびにコスミドｐＨＣ７９のＢａｍＨ１
で分解したＤＮＡ　０．１　ｐｇを、２０　ｍＭ　トリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１０
ｍＭ　ＤＴＴ、　０．６　ｍＭＡＴＰ、１００μ９７ｍ
１牛血清アルブミンの中で、８００　ｔｔｌ／　／ｍｌ
のＤＮＡ濃度で０．１ＵのＴ４−ＤＮＡリガーゼを用い
て１２℃で２時間給合する。結合混合物を試験管内でλ
ファツジ粒子（Ｍｅ　ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ　。

６８巻２８１．２９９頁１９７９年）中に包装し、大腸
菌ＨＢ　１０１　（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ・１．４１
巻４５９頁１９６９年）の感染に使用する。感染した細
胞をＬＢ　／　Ａｍｐ寒天（Ｌ−Ｂｒｏｔｈ　：　１％
バクトドリプトン、０．５％Ｄｉ　ｆｃｏ酵母抽出物、
０．５％ＮａＣ１，１０μｇ／ｍｌチアミン、１％Ｄｉ
ｆｃｏ寒天、１００μｊｉ／ｍｌアムピシリン）の上に
すじ状に着ける。

１．６Ｄ−ヒダントイナーゼの抗体の製造１）純粋なＤ
−ヒダントイナーゼの製造Ｄ−ヒダントイナーゼを切断
するＣＢＳ　３０３．８０株の乾燥生物体５００ｇを蒸
留水５０００　ｍｌに）′ヌ濁し、ガラス球ミル（球の
大きさ０．３５〜０、４　ｒｒａｔ　）の中で氷冷しな
がら２００ｍ１／分のポンプ速度で砕解する。次いで２
０％ポリミンＰ水溶液を最終濃度が０．４％になるまで
添加し、３０００ｇで１５分間遠心分離したのち、上澄
液を水で電気伝導度が２　ｍｓｉになるまで希釈し、ホ
ワットマンＤＥ〜５２セルロースイオン交換体２６０Ｉ
と共に２２℃で９０分間攪拌する。結合酵素を０．１　
ＭボラツクスーＨＣ”ｌ、０．２　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ
８，５を用いて溶出し、脱塩し、そしてＤＥＡＥＡ−５
０セフアデツクスカラム上で５０　ｍＭボラツクスーＨ
ＣＩ　ｐＨ８，５中の０．２　Ｍ　ＮａＣ１勾配におい
て分画する。溶出物を２０　ｍＭボラツクスーＨＣＩ、
ｐＨ８，５に対し透析したのち、酵素製品をＡＣＡ　４
４ウルトロゲルカラム（ＬＫＢ　）上で脱塩し、硫酸ア
ンモニウムで０．５Ｍにしたのち、オクチルセファロー
スＣＬ４Ｂ（ファルマシア）上の疎水性クロマトグラフ
ィにより更に分画する。

主ピークは、イソエレクトリック焦点化及び５ＤＳ−ポ
リアクリルアミド・ゲル電気泳動による分析によると純
粋である。収率は１０％である。

得られたＤ−ヒダントイナーゼ溶液を０．１Ｍボラツク
スーＨＣＩ、０゜１Ｍ＜えん酸ナトリウム、ｐＨ８，５
に対し透析し、結晶皿上に置く。溶液を密閉室中で０．
５　Ｍ　＜えん酸ナトリウム溶液、ｐＨ７，０（これは
４日後に０．８　Ｍ　＜えん酸ナトリウム溶液、ｐＨ７
，０で置き換える）の上で濃縮する。８日後にＤ−ヒダ
ントイナーゼ活性を有する大きい蛋白結晶が生ずる。

ＣＢＳ　３０３．８０株から得られたＤ−ヒダントイナ
ーゼのアミノ末端の、内部トリプトペプチドの及びカル
ボキシル末端のアミノ酸連鎖を、工結 ドマン分解による自動連、＃＃：により測定する（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ、　２７巻９４２頁１９７６年
）。

蛋白のためには次の部分連鎖が知られる（　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ。

Ｃｈ　ｅＩＩＩ、２４６巻６５５７頁１９６８年）。

ＰＬＬＩＫＮＧＥＩ　ＩＴＡＤＳＲＹＫＡＤＩＹＡＥＧ
ＸＴＩＴ（Ｒ）Ｉ　（ＧＱＮＬＥＡＰ）１寸−末端 Ｔｔ）ＰＥＷＨＥＰＳ（ＲＰＸＡＶ） ＫＧＴＩＡＶＧＳＤＡＤＬＶＶＹ ＴＱＨＶＮＮＤＹＮ（）ＦＥＧＦ ＮＦＦＬ・ ｉｉ）抗体の採取 ３匹のウサギに、１）により得られた完全に融和する補
助薬（Ｄｉｒｃｏ　）中の酵素製品の０．９％ＮａＣ１
溶液を各５００μＩ注射し、半量の酵素μｇと結合して
いる。ウサギ抗血清のＩｇ（）分画は、蛋白Ａ−セファ
ロース上のクロマトグラフィにより得られる。

１．４Ｄ−ヒダントイナーゼを生産する細胞クローンの
同定 特定の抗原を生産する大腸菌コロニー（感度約１　ｐｇ
　、　Ｇｅｎｅ　６巻２６頁１９７９年）を免疫学的に
固定する。この分析の詳細な操作は、ｐｖｃシートをＤ
−ヒダントイナーゼに対する抗体で予備含浸し、すべて
の遊離結合位置を予備免疫血清により飽和し、分解コロ
ニーとの接触によりプリントし、そしてＤ−ヒダントイ
ナーゼに対する放射性標識抗体と結合する。放射性抗体
は先にＤ−ヒダントイナーゼ又は部分連鎖がシート上に
吸着されている位置だけと結合する。

レントゲンフィルムを用いるシートの自動写真術により
、酵素のＤ−ヒダントイナーゼ又は部分連鎖を合成する
クローン（単数又は複数）が同定される。

１．２により得られたクローン（約２０００　）を歯用
ビックを用いて寒天板からミクロ滴定板の穴に移し、３
７℃で１６時間振動し、ミクロ滴定板の型内でＬＢ　／
　Ａｍｐ板上のニトロセルロースフィルター（ＢａＢ４
、シュライへル・アンド・シェル）上に移す。約２龍の
大きさのコロニーに、コロニーにつき１０　ｍＭ　Ｍｇ
ＳＯ４の中で、’２．５〜５Ｘ１０’λｖｉｒ　ｎｉｎ
　５フアージ（ザ・バクテリオファージ・ラムダ、バー
ジエイら、コールド、スプリング・ハーバ−１９７１年
２５９゜６２８．２２６以下、５６５−５８８頁参照）
を感染させ、３７℃に４時間保温する。次いで細胞分解
を完結するためｔ飽和クロロホルム雰囲気に１０分間さ
らす。次いでＣＢ５５０３．８０Ｄ−ヒダントイナーゼ
抗体のＩｇ（）分画を用いて処理されたｐｖｃシートを
、気泡が無いようにして分解コロニー上に置き、４℃に
一夜保温する。

このシートを０．２　Ｍ　ＮａＨＣＯｓ　、ｐＨ９，２
の中で６０μ９７ｍｌ　ＩｇＧで２０℃で２分間含浸し
、冷洗浄緩衝液（ＰＢＳ緩衝液、０．５％ウサギ血清、
Ｖ／ｖ、Ｑ、ｊ％牛血清アルブミン、ｗ／ｖ　）で２回
洗浄する。このシートを取り出して細胞の残りを注意し
て除去し、洗浄緩衝液１５ｍ１及び８×１０６　ｃｐｍ
　１２５　工標識抗Ｄ−ヒダントイナーゼＣＢＳ　６０
３．８０　ＩｇＧの中で４℃に４時間保温する。ＣＢ　
５５０３．８０Ｄ−ヒダントイナーゼに対する抗体のＩ
ｇＧ分画（抗り−ヒダントイナーゼＣＢＳ　３０３．８
０　ＩｇＧ）の標識は、５０　ｍＭ燐酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７，５，５ｍｌ　ＮａＩ２’　Ｉ　（アマ−シャムー
ブ７．７−１１００　ｍ　Ｃｉ　／ｎ１１１１５〜１７
　ｍＣｉ／μ、９　）の中のクロラミンＴ：２０μｍ３
　ＩｇＧによって行われ、クロラミンＴ１０μ＃（５０
ｍＭ燐酸ナトリウム中５１ｎ９／ｍ１ＳｐＨ７，５）を
用いて２０秒間保温したのち、１０　ｔｔｌＮａ２Ｓ２
０５　（５０ｍＭ燐酸ナトリウム中１２　ｒｎ９／ｍｌ
、　ｐＨ７，５）、１００μｌ　ＫＩ　（１０■／ｍｔ
）及び１％牛血清アルプミンヲ添加し、セファデックス
６５０（ファルマシア社製）上で脱塩する。Ｆ液を４℃
の洗浄緩衝液各１００ｍ１！中で５分ずつ２回保温し、
４°Ｃの水中で５分ずつ２回振動する。乾燥したシート
を強化シート及びコダックＭＡＲ５レントゲンフイルム
と共に一夜−７０℃で露光する。

１．５クローン生成Ｄ−ヒダントイナーゼの証明前記の
免疫学的検定（ブルーム−ギルバート、アフイニテイ・
りロマトグラフイ、プリンシプルズ・アンドΦメソツズ
、ファルマシア・ファイン・ケミカルス１９フ９年１２
頁以下及び９２頁以下参照）により陽性と同定された細
胞ファンピシリン１００μ９７ｍ１を含むし一プロス中
で、６７℃で１６〜２４時間振とうしたのち、４０００
〜６０００．９で１０分間遠心分離する。

沈殿を溶液Ａ　５０　ｍＡ！に再懸濁し、遠心分離し、
溶液ＡＩ３０ｍＡ’中に移し、ニワトリ卵白−リゾチー
ム溶液２０μ！（トリス−ＨＣｌ　２５　ｍＭ中１０　
ｍｙ　／ｍｌ、ｐＨ８）と共に室温で２０分間保温する
。次いで０．２５　Ｍ　ＥＤＴＡ溶液３３０μ１（ｐＨ
８）を添加し、５分後に激しく混合しながら溶液Ｂ１．
６７ｒｎｌを添加する。透明分解液を４℃で１時間高速
遠心分離し、上澄を７０℃で２分間加熱し、沈殿を４℃
及び４０００．９で１０分間分離する。上澄２ｍｌに、
０．４ＭボラツクスＨＣＩ　（ｐＨ８，５）　０．５ｍ
ｌ、　Ｉ　ＭＭｇＣ１□０．１　ｍｌ及び０．１Ｍボラ
ツクスーＨＣＩ中の５％メチルチオエチルヒダントイン
溶液ｏ、６２５１ｎｔ　（ｐＨ８゜５）を添加する。６
０℃で３０分間振とうしたのち（ＤｊＩ、−メチルチオ
エチルヒダントインをＮ−カルバモイル−Ｄ−メチオニ
ンに変換させるため）、１．５　ｍｌを取り出し、８０
００ｇで５分間遠心分離し、上澄１．２　ｍｌに１／１
０濃燐酸０１６８ｍ１を添加する。沈殿なａｏｏｏｙで
１分間遠心分離し、上澄を粒子不含にｐ過し、高速液体
クロマトグラフィによりＮ−カルバモイル−メチオニン
を分析する。この条件下で大腸菌ＨＢ　１０１　（，１
）ＨＣ７９）からの同量の蛋白抽出物の存在下に、Ｄ、
Ｌ−メチルチオエチルヒダントインのＮ−カルバモイル
−Ｄ−メチオニンへの自然転位が行われる。その溶解度
がＤ，Ｌ　−メチルチオエチルヒダントインのＮ−カル
バモイル−Ｄ−メチオニンへの少なくとも２倍の転位を
示すクローンを、陽性と評価する。

１．６Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子のサブクローニング Ｄ−ヒダントイナーゼを生産するクローンの再結合され
たプラスミド−ＤＮＡ（Ｂａｍ　７Ｂ　１０　；構造は
第１図に示される）を、既知方法（モレキュラー・クロ
ーニング、ニー・ラボラトリ−・マニュアル、コールド
・スプリングΦ）１−バー・ラボラトリ−１９８２年８
６頁以下参照）により単離する。

フラノ）’−ＤＮＡ　２　ｔｉｆ！を１２０　ｐｇ／ｒ
ｎｌの濃度で、ＤＮＡ　１　μｊｉにつき０．５Ｕの５
ａｕ３Ａを用Ｌ−て１０分、２０分ならびに３０分間分
解する。反応混合物を一緒にし、２　ｍＭのＥＤＴＡ及
び０−５１１ｆｉ／ｍｌのエチジウムプロミドを含有す
る５　０　ｍＭ　）リス−アセテート緩衝液（ｐＨ７，
８）中で、０．８％ソフトアガロースゲル上での電気泳
動により分画する。

２〜４キロベースの大きさのＤＮＡを含有するゲルセグ
メントを、紫外線ランプを用いてＤＮＡの大きさ標準と
比較することにより同定し、分離し、そして同容量の溶
液Ｄ　（０，１Ｍ　トリス−ＨＣｌ、１０　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ　、　０．２　Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７，４）と共に
６５°Ｃで５分間溶融する。同容量の６７℃に加温され
たフェノール水溶液を用いて乳化液となしく１：１の溶
液Ｄ／水により平衡化）そして遠心分離したのち、上澄
をクロロホルムを用いて２回抽出し、エタノール沈殿に
より濃縮する。プラスミドｐＢＲ３２７（Ｇｅｎｅ　９
巻２８７頁１９８０年）　１　ｔ４をｔ　５　Ｕ　／　
Ｉｌｌ　ＤＮＡ　ＢａｍＨｌを用いて９０分間線状化し
、子牛腸ホスファターゼ（ＣＩＰ　）を用いて脱ホスホ
リン化する（前記のモレキュラー〇クローニンク、ニー
〇ラホを、Ｂａｍ７Ｂ１０の２−４Ｋｂ−分画１μｇと
結合する（同省１４６頁、２４５頁以下、２８６頁以下
参照）。この結合混合物を用いてＣａＣ１□処理された
（　Ｇｅｎｅ　６巻２３頁１９７９年参照）大腸菌ＨＢ
　１０１細胞（Ｊ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　４１巻４５
９頁１９６９年参照）を変形する。抗生物質不含の培地
（Ｌ−プロス：１％バクトートリプトン、０．５％酵母
エキスディフコ、０．５％ＮａＣ１，１Ｑμ９７ｍ１チ
アミン）の中で９０分間培養したのち、細胞をＬＢ　／
　Ａｍｐ板の上に載せる。得られたクローンを、前記と
同様に（プルーム−ギルバート試験）、Ｄ−ビダントイ
ナーゼ上に生成したヒダントインの陽性を証明すること
により試験する。６クローンは酵素活性Ｄ−ヒダントイ
ナーゼを生成している。それらの一つＢ６　（第１図参
照）は、連鎖化ののち表現の最適化に用いられる。

１．７ベクトルＢ６中のＣＢ５５０３．８０Ｄ−ヒダン
トイナーゼ遺伝子の連結 ベクトルＢ６中にクローン化されているＣＢＳ　３０３
．８０　ＤＮＡ断片は、限定末端ヌクレアーゼＢａｍＨ
ＩＣ１ａＩ、ＥＣ０ＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｐｓ　ｔＩ
、ｐｖｕＩＩ、５ａＬＩ　、　ＫｐｎＩ、ＨｐａＩ、５
ａＬＩ及びＸｂａＩのための切断位置を有しない。クロ
ン化ＤＮＡ　断片中の特殊なＨｉｎｄＩＩ位置は、Ｂａ
ｍＨ，１連鎖の統合（ｓ’ｐｃ’ｃＧ（）ＡＴＣＣＧＧ
　−３’　）によって部分的にＨｉｎｄＩＩで切断され
たプラスミドＢ６（第２図参照）に変えられる。得られ
たプラスミド（ｐＢＧＡ、第３図参照）の１種はもはや
Ｄ−ヒダントイナーゼを表現しない。したがってＢａｍ
Ｈ１連鎖の統合は遺伝子の範囲で起こっている。それゆ
え５／　　３２ｐ標識によれば、連結はＢａｍＨｌ−切
断位置から両側へ起こっている（　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅ
ｎｚｙｍ、６８巻２８１．２９９頁１９７９年参照）。

キナーゼ処理ののちＥｃｏＲＩによる第二の切断が行わ
れ、２個の連結されるべき断片は低温溶融アガロース上
で精製される。得られた連鎖データから、Ｄ−ヒダント
イナーゼ遺伝子の位置及び方向が生ずる。

ＢａｍＨｌの下方に２２５ヌクレオチドの後にストップ
コードンが存在する。解読機構を正確に指定することは
可能である。なぜならば連結した断片は１０個のアミノ
酸残基な介して連結したトリプト断片と正確に相関する
からである（ＮＮＤＹＮＧＦＥＧＦ　；実施例１．６１
参照）。重複削除変異体（ＮｕＣｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、　１１巻４０７７頁１９８３年）によって、Ｄ−
ヒダントイナーゼ遺伝子の連結が行われる。

１）結合体のキナーゼ処理 ＢａｍＨ１連結体（５’ＣＣＧＧＡＴＣＣＧ（）　−３
’　）及びＨｉｎｄｌｌｌ連結体（５’−ＧＣＡＡＧＣ
ＴＴＣ）Ｃ−，３’　）を、２５０　ｐＭｏｌの量の反
応混合物２０μ！中で６７℃で３０分間に、６０　ｍＭ
　トリス−ＨＣｌ、ｐ）（７，５，１０ｍＭ　、ＭｇＣ
ｌ２．１５ｍＭＤＴＴ１１ｍＭスペルミン、１００　Ａ
　ＭＡＴＰ。

８ＵＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＬビオケミカル
ズ中で、３７℃で３０分間に５′−ホスホリル化型に変
えられる。混合物を続いて凍結し、そしてアリフォート
を直接に結合に使用する（下記参照）。

ｉｉ）部分的にＨｉｎｄ［により切断されたプラスミド
Ｂ６−１のＢａｍＨ１連結体の統合既知方法により単離
されたプラスミドＢ６の４μＩを、１ＵのＨｉｎｄ［（
ペーリンガー社製）を用いて６７℃で１０分間消化する
。フェノール抽出及びエタノール沈殿による濃縮ののち
、混合物５０μ影中でプラスミドの遊離末端に対し約５
０倍過剰の連結体へのＢａｍＨ１連結体の統合が行われ
る（１００ｐＭｏｌ連結体、２ｐＭｏｌ末端Ｑ４ｔｔｇ
Ｂ６、ＨｉｎｄＩＩにより部分切断、６６ｍＭ　）リス
−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，６，６ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１評
モ４キ苧５ＵＴ４ＤＮＡ−リガーゼ；１４時間、１５°
Ｃ）。フェノール抽出及びエタノール沈殿ののち、結合
ＤＮＡの４０μ！中でのＩＯＵＢａｍＨ１による完全な
消化が行われる。反応混合物を１％アガロースゲル（低
溶融アガロース、ビオラッド）の上で分画する。線状プ
ラスミドを溶融ゲルセグメントのフェノール抽出により
溶出し、ＤＥ　５２　（ホヮットマン；０．１５　Ｍ　
ＮａＣ１，１０ｍＭ　　ｌ−リ　ス　−　ＨＣＩ　　、
　　ｐＨ７，５、Ｉ　　ｍＭ　　ＥＤＴＡ　　中で結合
、１Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ　、　ｐ
Ｈ１５，１ｍＭ　ｇＤＴＡで溶出）により精製したのち
、エタノール沈殿により濃縮する。収量は約１μｇであ
る。１００　ｎＨのＤＮＡを２０μｌの結合混合物（６
６ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，６，６ｍＭＭｇ
Ｃ１□、１０　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．４　ｍＭ　ＡＴＰ
　；　１４時間、１５℃の中で、０．５ＵのＴ４ＤＮＡ
−リガーゼを用いて環化し、ＣａＣｌ２処理された大腸
菌ＨＢ　１０１−細胞中に移す。再結合されたクローン
を既知方法により選別する。できるだけ再結合されたプ
ラスミドｐＢ　６　Ａ＋Ｃ（第６図参照）を、ＥｃｏＲ
Ｉ　／　ＢａｍＨに重消化にかける。プラスミドｐＢ６
Ａを連結に使用しく　Ｍｅｔｈｏｄ　Ｅｎｚｙｍ、　６
５巻４９９頁１９８０年参照）、その際ＢａｍＨ１位置
から両側に連結が起こる（第３図参照）。プラスミドｐ
Ｂ６Ｂは、δ５′及びδ６′−変異体を生産するための
出発プラスミドとして役立つ（下記参照）。

１ｉｉ）　Ｂ６δ５′−変異体 ＢａｍＨ１により線状化されたｐＢ６Ｂ（第６図）の７
．５ｔｔｊ；／を、１２　ｍＭ　ＣａＣ１□、１２　ｍ
Ｍ　ＭｇＣｌ□、６００　ｍＭＮａｃｌ、　　２０　ｍ
Ｍ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８゜０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
の１００　ｐｌｉ中で２．４ＵのＢａ１５１　（ＢＲＬ
　）を用いて２５℃で保温する。４分及び５分後に各１
６　Ａｌｌを取り出す。試料を直ちにフェノール処理し
、そして−緒にする。対応して２試料を９分及び１１分
後、ならびに１４分及び１６分後に処理する。クロロホ
ルム抽出及びエタノール沈殿による濃縮ののち、ＤＮＡ
二＝＃ヲコルンベルクーポリメラーゼ（Ｐｏ１Ｉ　）を
用いて、続いて連結体と接合するため適切な末端が生ず
るように切断する。Ｐｏ１Ｉ処理は、１、５　μｌｌα
３２ＰｄＡＴＰ　、　４００　Ｃｉ　／　ｍｍｏｌ、１
゜ｍ　Ｃｉ　／ｍｌ、　１０　Ｕ　ＤＮＡ−ポリメラー
ゼエ（ペーリンガー社製）の１００ｍＡ’の中で、２μ
ｌのＢａ　１５’　１処理したＤＮＡを用いて１５°Ｃ
で２時間かけて行われる。次いで反応混合物を、１゜Ｏ
ｍＭ　　ＮａＣ１、５０ｍＭ　　ト　リ　ス　−　ＨＣ
Ｉ　　、　　ｐＨ７，５，５ｍＭ　ＥＤＴＡの中で、セ
ファデックス６５０（ファルマシア社製）により分画す
る。排出量のＤＮＡ　　を　０．　１　５　　Ｍ　　Ｎ
ａＣ１、１０ｍＭ　　ト　リ　ス　−　ＨＣＩ　　、ｐ
Ｈ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡの中で、ＤＥ　５２　（ホ
ヮットマン）と結合し、ｊ　Ｍ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　
）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡを用（
・て溶出し、エタノールで沈殿させる。続（ＢａｍＨ１
連結体の統合を前記のように６０μｌ中で行う。フェノ
ール抽出及びクロロホルム抽出ならびにエタン−ル沈殿
による濃縮ののち、試料なりａｍＨｌを用いて消化し、
既知方法により０．８％低溶融アガロース（ゲル濃度０
．８％）により分画して精製する。こうして精製された
ＤＮＡを２０μｇの混合物中で０．５ＵのＴ　４　ＤＮ
Ａ　−１，１ガーゼを用いて再結合する（１２時間、１
２℃）。各１０μｌの結合混合物をＣａＣｌ２処理した
大腸菌ＨＢ１０１細胞のトランスフェクトに使用し、得
られた再結合物を既知方法により選別する。４〜６すな
らびに９〜１１分のＢａ　１６１−処理から、各１５の
プラスミドを単離し、同定する。プラスミドδＢ６　５
’Ａ、−Ｂ、−Ｅ、−Ｉ及び−Ｋを、ＢａｍＨ１−切断
位置から既知方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ６５巻
４９９頁１９８０年）により前記のように連結する（　
ＥｃｏＲＩによる二次切断、第４図参照）。

１ｖ）Ｂ６δ６′−変異体 ５′−変異体の場合と同様にして６′−変異体を生成す
る。

出発ＤＮＡとしては、Ｓｍａ工（第４図）により線状化
されたｐＢ６Ｂ（第６図）が用いられる。

その１０μｇを３３μｌの反応容積中で、１．４ＵのＢ
ａ１５１と共に前記の緩衝液温度で保温する。

それぞれ２ないし４分、乙ないし８分、１０ないし１２
分、１４ないし１６分及び１８ないし２０分の後に、６
μｌをフェノール処理し、組にして仕上げ処理する。Ｐ
ｏ１Ｉ−リペイヤーの後にＨｉｎｄ　１１一連結体をプ
ラスミド−ＤＮＡ　中に統合し、これをＨｉｎｄ　ｍで
消化し再結合したのち、辱知の条件下でＨＢ　１０１細
胞中に移入する。

４８の再結合プラスミドのプラスミド特性評価ののち（
Ｂａｔ３１処理２〜１２分）、３′−削除、変異体０、
Ｐ、Ｒ及びＳが得られる。Ｈｉｎｄ　ｌｌｌ−切断部の
位置は、限定及び連結により定められる。連結はｌｉ：
ｃｏＲＩを用いる二次切断と共にＨｉｎｄ　（［１の位
置から起こる（　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ、　６５
巻４９９頁１９８０年参照）。

１゜７０１１〜ＩＶに記載の工程により得られた連鎖デ
ータをまとめて下記に示す。Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝
子のコード化範囲は、ヌクレオチド３２７からヌクレオ
チド１４３５に広がっている。移動の開始を合図しそし
て移動停止の信号である６種のヌクレオチドは、枠によ
り示される。連鎖内で範囲１は２５０±５０ヌクレオチ
ドの長さに相当し、範囲６は９０±１のヌクレオチドに
相当する。範囲２は連鎖ＮＮ又はＮＮＮ　（Ｎ＝Ａ、Ｇ
、Ｃ又はＴ）に相当する。その範囲は枠に囲まれている
。

１〜５０　　　ＣＧＴＴＧＧＡＧＡＡ　　ＡＡＴＡＴＡ
ＴＧＧＣＧＣＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＧｒ）ＧＡＡＡＣ
Ｇ（）ＣＴＴＴＧＣＡＡ５１〜１００　　　（ｌ）ＴＣ
ＣＣＮＮＡＧＣＧＴＧＣＡＡＴＣＧＡ　　ＣＴＴＣＧＣ
ＴＴＴＧＴ’ｌ’ＧＣＧＡＡＧＧＣＣＧＡＡＧＴＴＴＧ
Ｃ１０１〜１５０　　　ＣＴ’ｒＣ）ＧＧＴＣＡＣ）　
　ＧＣＴＡＴＣＧＧＴＡ　　ＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣ）
ＣＡＧＡＧＴＣＴＧ　　ＴＴＡＡＴＧＣ）ＡＡＧＴＧＧ
ＡＣＡＡＣＣＡ　　ＡＣＡＧＧＡＴＡＣＧヒーーー−ｍ
−→１１Ｄ２ ２５１〜３００　　　ＣＴＧＴＴＧＴＧＴＡ　　ＴＧＡ
ＴＧＣＣＡＧＡ　　ＴＴＣＧＴＴ（）ＣＴＧＡＴＴＣＣ
ＡＴＡＡＧ　　ＡＡＧＡＡＡ、ＧＴＡＣ６０１〜５５０
　　ＧＧＣＴＴＧＴＡＡＡ　ＣＡＴＡＡＧＧＧＡＧ　Ａ
ＡＡＣＧＴ］ＣＴＴＴＡＣＴＧＡＴ　　ＣＡＡＧＡＡＣ
（）ＧＣ６５１ヘイ００　　　ＧＡＡＡＴＣＡＴＣＡ　
　ＣＣＧＣＧＧＡＣＡＧ　　ＣＣＧＧＴＡＣＡＡＧＧＣ
Ｃ（）ＡＣＡＴＣＴ　　ＡＮＧＣＮＧＡＧＧＧ４０１〜
４５０　　　ＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＧＣＡＴＣ
Ｇ　　ＧＧＣＡＧＡＡＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＣＣＧ　　
ＣＣＣＧＧＣＡＣＣＧ４５１へろＤｏ　　　ＡＧＧＴＧ
ＡＴＡＧＣＣＣＡＣＣＧＧＣＡＡ　　（）ＴＡＣ（）Ｔ
ＧＴＴＴＣＣＣＧＧＣＴＴＣＡ　　ＴＡＧＡＣＣＣＣＣ
Ａ５０１へろ５０　　　ＣＧＴＧＣＡＣＡＴＣＴＡＣＣ
Ｔ（）ＣＣＣＴ　　ＴＣＡＴＣ）ＧＣＣＡＣＣＴＴＣＧ
ＣＣＡＡＧ　　ＧＡＣＡＣＣＣＡＣＧ５５１〜６００　
　ＡＧＡＣＣＧＧＣＴＣｃＡＡ６ＧｃｏＧｃｃ　ＴＴＧ
ＡＴ（）ＧＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣ
ＧＡＧ６０１へ−６５０ＡＴＧＴＧＣＴ（）ＣＣＣＣＡ
ＧＣＣＧＣＡＡ　　ＣＣ）ＡＣＣ）ＡＧＣＣＣＴＣＣ）
ＡＧＧ（）ＣＴＡ　　ＣＣＡＧＣＴＣＴＧＧ６５１〜７
００　　　ＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＣＧＡＧＧＧＣＡＡＣ
ＡＣ）ＣＴＡＣＴＧＣＧＡＴＴＡＣＡＣＣＴＴ　　Ｃ’
ＣＡＣＡＴＧＧＣＣ７０１〜７５０　　　ＧＴＣＣＣＣ
ＡＡＧＴ　　ＴＣＧＡＣＧＡＡＡＡ　　ＡＡＣＣＣ）Ａ
ＧＧＧＯＣＡ（）ＣＴＧＣＧＧＧ　　ＡＧＡＴＴＧＴＧ
ＣＣ’７５１へ七ＤＯＧＡＣＧＧＣＡＴＴＡ　　ＧＣＴ
ＣＣＴＴＣＡＡ　　ＡＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＴＡＣ
ＡＡＡＡ　　ＡＣＴＴＣＴＴＴＣ）Ｇ８０１〜８５０　
　　ＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣ（）ＧＧ（）ＡＧＡＴＧＴ　
　ＡＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＣＧＣＣＴＡＣ）ＣＣＡＡＧ
ＴＧＡＧＣＴＧ９５１へそＤＯＡＡＧＣＧＣＡＡＣＣＡ
ＧＡＡＡＧＴＣＣＴ　　ＧＴＧＧ（）ＧＣＣＣＴＧＣＣ
ＣＡＧ（）ＧＣＴ　　ＴＣＡＴＣＧＡＣＡＣｌｏｏｌへ
そ５０　　　Ｃ０ＴＯ（：）ＯＣＡＣＣＧＡＣＣＡＣＴ
ＧＣＣＣＣＴＴＣ（）ＡＣＣＣＣＧＧＣＡＧＡＡ（）Ｃ
ＴＧＣＴＧＧ（）ＣＡＡ１０５１〜１００　　　　ＧＧ
ＡＧＧＣＣＴＴＣＡＣＣ（）ＣＴＡＴＴＣＣＣＡ八Ｃへ
）ＧＣＡＣＣＣＯＧＣＣＡＴＣＧ　　ＡＡＧＡＣＣＧＧ
ＯＴ１１０１〜１５０．　　　ＣＡＡＣＣＴＧＣＴＣＴ
ＡＣＡＣＣＴＡＣＧ　　（）ＧＧＴＧＧＡＣＣＧＣＧＧ
ＣＣＧＣＣＴＣＧＡＴＡＴＴＣＡＣＣ１１５１ヘク００
　　　ＧＣＴＴ’１．’（）ＴＧＧＮ　　ＧＧＣＴＣＡ
ＧＣＡＣＣＡＡＧ（）ＣＣＧＣＣＡＡ（）ＴＴＧＴＴＴ
Ｇ　　ＧＡＣＴＧＴＴＣＣＣ’■ １２０１−４５０　　ＣＣＧ学＝匹＄ＡＣＡＡＣＧ　Ａ
ＣＴＡＣＡＡＣＯＧＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＴＴＴＧＡＧ
ＡＴＴＧ１２５１〜！１００　　　ＡＣＧＧＣＣＧＣ）
ＣＣＣＡＧＣＧＴＧＯＴＯＡＣＧＧＴＯＣＧＯ（）ＧＴ
ＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＣＧＣ）ＧＡＣ１６０１〜３
５０　　０ＧＧＣＡＧＴＴＴＧ　　ＴＧＧＧＣＧＡＧＡ
Ａ　　ＧＧＣ）ＧＴＧＧ′；ＧＴＡＡＧＣ’ＴＣ’ＣＴ
ＧＣＧＣ）ＣＧＣＧＡＧＣ’Ａ１３５１〜４００　　　
ＴＧＴＡＣＴＴＣＴＡ　　ＡＡＴＧＡＡＧＣＣＧ　ＡＧ
ＡＴＯＧＧＴ’ｒＴＴＧＮＡＴＴＴＧＣＴ　　ＧＧＧＴ
ＧＧＧＡＴＣ１４０１〜４５０　　　ＴＧＣＣＴＧＴＧ
ＧＡ　　ＴＡＧＣＧ（）ＴＧＧＴ　　ＧＣＴＧＧＴＧＣ
Ｔ（）ＧＧＧＣ）Ｇｌ’ｌ”　Ｃ’（）ＧＣＣＴＧＧｆ
’、Ｃ１４５１へ石Ｄｏ　　　ＧＣＴＴＴＴＴＧＣＧ　
　ＧＴＡＧＴＣＧＧＣＧ　　ＡＡＣＴＣＣＴＧＴＴＧＧ
ＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＡＡＣ）ＡＧＧＣＴ１５０１へろ
５０　　　ＴＣＡＡＧＣＧＧＡＧ　　ＡＴＡＧＡＴ（）
（）ＴＡ　　Ｇ（）ＴＧＡＡＴＡＡＴＣＣＴＧＡＣＧＧ
ＧＣＡＧＣＣＧＣＣＡＴＡ１５５１へる００　　　ＡＡ
ＴＡＧＧＧＡＡＧ　　ＡＣＣＡＴＧＡＴ（）ＣＡＡＧＣ
ＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＣＡＧＡＧ　　ＣＴＧＴＣＣＧ
ＣＣＡ１６０１〜６５０　　　ＡＡＧＧＴＴＣＧＡＡ　
　ＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＴＴＴＣＧＣ）ＴＴＣＡＧＧ
Ｏ，ＴＧＴＴＴＣＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴ１６５１〜７０
０　　　ＣＣＣＡＡＣＧＧＡＡ　　ＣＣＧＴＧＧＣＣＣ
Ｔ　　ＣＡＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＣＣＴＣＧＡＧＡ　　
ＴＣＧＣＣＮＡＧＧＧ１７０１〜７０１　　Ｇ １．８表現の最適化 再結合プラスミドδＢ６−５’Ｅは、なおり−ヒダント
イナーゼ遺伝子の移動出発コードンの前約２５０のヌク
レオチドＣＢＳ　３０３．８０　ＤＮＡを１、先にプラ
スミドｐＢ６ｂ中に存在したＳａＬ　Ｉ認識位置の前に
含有し、それに隣接する２００〜３００のヌクレオチド
の削除と共にＢａｍＨｌ−切断位置に置き換えられてい
る（１．７の１ｕ参照）。

このプラスミドを用いて変形された大腸菌ＨＢ１０１細
胞は、酵素活性Ｄ−ヒダントイナーゼとして作用する。

同様にして６′−側面保護ＤＮＡ、　一連鎖中に存在し
たＳｍａｌ−切断位置から出発して、Ｓｍａｒ切断位置
なＨｉｎｄ［Ｉ−切断位置に置き換えることができる（
第４図及び１．７のｉｖ参照）。その際随伴するＣＢＳ
　３０３．８０　ＤＮＡ連鎖は、Ｄ−ヒダントイナーゼ
遺伝子の移動停止コードンの後方の２５のヌクレオチド
まで除去される（クローンδＢ６−３’Ｏ）。Ｈｉｎｄ
　ＩＩ断片のプラスミドδＢ　６−３’Ｏからプラスミ
ドδ８６５’Ｅへの移動によって、新しいプラスミドが
構成され、これはヒダントイナーゼ遺伝子の前になお約
２５０のヌクレオチドを有し、その遺伝子の停止コード
ンの後になお２５のヌクレオチド外来ＤＮＡを有する（
δ８６ＥＯ，第５図）。別にヒダントイナーゼ遺伝子の
前の約２５０のヌクレオチド外来ＤＮＡを削除すること
は、構成されたプラスミドδＢ６ＥＯの中では不可能で
あることが知られた。これは多分ベクトル（１）ＢＲ３
２７）の応答の超厚における他のＢａ１−削除が影響す
るためと考えられる。

他の削除を行うため、δＢ６Ｅ○からのＤ−ヒダントイ
ナーゼ遺伝子を、ＢａｍＨ１／　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片
としてのｐＢＲ３２２へ常法により再クローン化する。

得られたプラスミド１）ＢＲＥＯ（第５図）を続いて前
記のように、ＢａｍＨ１により線状化したのちＢａ１３
１により短縮する。Ｂａｌ　３１−消化の終了、末端の
Ｔ４−ＤＮＡ−ポリメラーゼによる修復及びＢａｍ　Ｈ
１〜連結体の加入ののち、大腸菌ＨＢ１０１を変形した
のちに８個のクローンが選択され、そのプラスミド−Ｄ
ＮＡ　＆ｔ　ＢａｍＨｌ　／Ｈｉｎｄ　ＩＩ−消化のの
ちに、１，５〜１．３　ｋｂの適当な範囲の大きさを有
するＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子断片を有する。Ｄ−ヒ
ダントイナーゼ遺伝子はこのプラスミドから、常法によ
りＢａｍＨ１／Ｈｉｎｄ　ｍ−消化によりＤＮＡを単離
したのち切り出され、そしてプラスミドｐＥＸ３１ａ、
　ｂ及びＣに統合される。その際受容体プラスミドは、
あらかじめ同様にＢａｍＨ１及びＨｉｎｄｌＩ［を用い
て消化される。

プラスミドｐＥＸ３１ａＣはプラスミドｐＰＬＣ２４（
Ｇｅｎｅ　１５巻８１頁１９８１年）から導かれ、そし
て熱誘導可能なγ促進体ｐ１を含有し、そしてＭＳ２レ
プリカーゼの９７アミノ酸コードンの後に、ａ　−Ｃの
構成において外来遺伝子とＭＳ２レプリカーゼの結合を
すべての６種の解読機構の中で可能にするポリ連結体領
域を有する（第６図参照）。結合生成物は大腸函株Ｎ４
８６０（に ＰＬバイオケミカルズ）、、奉ニ変形され、これは熱不
安定なλ抑制体ｃＩ　８５７のための遺伝子を含有する
。抗アンピシリン性変形体は２８°Ｃで保温することに
より得られる。熱誘導によりＤ−ヒダントイナーゼを生
成するクローンは、第一に免疫学的に検出される。

このためには単独コロニーをＵ形底のミクロ滴定板のく
ぼみの中の１５０１Ｌｅ３ＬＢ　／　Ａｍｐ培地に接種
し、−夜２８℃で振動し、新しい培地（１２０μりに１
：乙の希釈で移し、ミクロ滴定板中で振動しながら４２
℃で６時間保温する。

１０％ＳＤＳ溶液２０μ！を添加したのち、ミクロ滴定
板を被覆シートで包み、５０°Ｃの水浴上で細菌の分解
が完了するまで１時間保温する。

次いで分解液を適当な装置（ＢＲＬ社のハイプリドツト
・マニホールド１０５０ＭＭによりニトロセルロース板
（シュライヘル・アンド・ジュール社のＢＡ８５）上で
吸引ｒ過し、ＰＢＳ緩衝液で洗浄したのち、既知方法（
Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１巻４０７７頁１
９８３年）によりＤ−ヒダントイナーゼ抗体（ウサギ抗
血清のＩｇＧ分画）の１：１５０希釈を用いて、続いて
最初の抗体を洗浄除去したのち、西洋わさびパーオキシ
ダーゼと結合した抗つサギＩｇＯ抗体を用℃・て処理し
、結合した西洋ワサビパーオキシダーゼを０−ジアニシ
ジン／Ｈ２Ｏ２で着色証明する。この８個のクローンは
、メチルチオエチルヒダントインとの反応において酵素
活性を示し、それと無関係にＤ−ヒダントイナーゼ遺伝
子断片がそのプラスミドｐＥＸ５１ａ−ｃの解読機構の
中にクローン化して含まれる。酵素活性の表現は熱誘導
可能である。クローンエＦ　１０．３Ａ８及び［［Ｄ２
は、最高の酵素活性を示す。それは出発株の値と比較し
て湿った微生物塊について４０倍も高い。

その培養は次の組成の培地におし・て行われる。

５ｇ酵母エキス、２．５　ｊｊ　）リプトン、１［］、
ｐ栄養液、０．２５８　ｊｉ　Ｎａ３ＰＯ４・１２Ｈ２
０，１２につき１０　ｒｎｌのカステンホルツーバルサ
ム培地。細胞を３０℃でＡ６００　＝　０．　！ｌまで
保温し、４５℃に１５分間加熱し、そして３７°Ｃで５
時間培養する。

°この細胞は溶′ｒＬＡ＋１ｍＭ１ＶｄｎＣ１゜中で遠
心分離したのち洗浄され、そしてこの緩衝液のままでヒ
ダントインの転位に用いられる。

プラスミドｐＥχ３１ａ、ｂ及びＣから誘導されたＣＢ
Ｓ　３０３．８０　Ｄ−ヒダントイナーゼとして作用す
る表現ベクトルエＦ　１０、′５Ａ８及び［ｌＤｌにお
いて、Ｄ−ヒダントイナーゼ遺伝子へのベクトル連鎖の
移行を、連結により同定する。この移行は下記式におい
て矢印及び対応する構造の名称により示される。移行は
ＢａｍＨ１連結体を介して矢印の基部で起こり、連結体
の連結は式中に示されない。

１−（１５０ＣＧＧＴＴＡＴＧＧＡ　　ＴＡＴＴＧＴＴ
ＧＧＧ　　ＡＡＧＴＣＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＴＴＣ
ＣＡＡＴＴＧＧＯＧＧ５１〜１００　　　ＧＡＣＣＴＣ
ＧＡＣＣＴＴＣＡＴＴＡＴＡＡ　　ＡＧＴＧＧＴＴＧＴ
ＴＣＧＣＡＴＴＡＡＣＡ　　ＡＡＧＡＴＧＴＴ１’Ｇ１
０１〜１５０　　　ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＡＡＴＡＡＡ
Ｔ’ＧＴＴ　　ＡＴＡＴＣＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＡＴＧ
ＣＴ　　ＴＣＴＣＡＴＣＡＡＴ１５１ヘクＤＯ（）ＣＡ
ＴＴＧＡＴＣＧ　　ＴＴＴＡＡＣＧ（）ＡＴ　　ＧＡＡ
ＡＡＴＧ（）ＡＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴ’ｒ　　ＡＡＡＡ
ＧＴＧＣＧＣ２０１へ−２５００ＡＡＧＡＡ（）ＡＴＴ
　　ＧＣ（）ＴＡＧＧ（）ＴＣ）　　ＴＡＡＴＴ’ｒＡ
ＴＧＴＴＣ＋）ＡＴＣＧＴＣＴ　　ＧＴＣＣＧＯＴＧＧ
Ａ２５１〜６００　　　ＴＧＧＴＯＣＧＡＴＴ　　（）
ＡＣＡＴＧＧＴＣＧ　ＡＡＡＴＧＣＣＡＡＧＣ（）ＡＣ
ＡＡＴＣＴＧ　　ＣＣ（）ＡＴＣ）ＡＣＡＴ６０１へ名
５０　　　Ｇ（）ＡＡＴＣ）ＡＡＣＧ　　ＣＣＡＡＧＣ
ＧＧＣＣＡＴＴＡＧＣＧＧＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧ　
　ＴＡＧＣＧＴＴＧＡＴ３５１〜４００　　　（）ＴＧ
ＡＡＡＴＡＡＡ　　ＡＣＧＡＡＡＴＴＴＣＣＡＧＣＧＧ
ＡＧＧＡＣＣＧＡＴＡＣＧＴＡ　　Ｔ（）ＡＡＣ）Ｃ（
）ＧＡＣ４５１へろＤＯＴＴ（）ＣＴＣＡＴＴＡ　　Ａ
ＡＧＡＣＧＧＡＡＡ　　ＡＡＴＴＧＣＣＡＴＧＡＴＡ（
）ＧＣＣＡＡＣＡＴ’Ｔ”ＴＡＧＡＡＧＡ５０１へろ５
０　　　　ＡＡＡＡＧＧＣＧＣＴ　　ＧＡＡＧＴＧＡＴ
ＴＧ　　ＡＴＯＣＣＡＡＡＧＧＣＴＯＴＴＡＣＧＴＡ　
　ＴＴ’ｒＣＣＡＧ（）ＣＧ５５１へる００　　　　Ｇ
ＴＡＴＴＧＡＴＴＣＧＣＡＣＡＣＯＣＡＴ　　ＴＴＡＯ
ＡＴＡＴＯＣＣ（）ＴＴＴＧＧＣＧＧ　　ＣＡＣＧＣ）
ＴＧＡＣＡ６０１へ−６５０ＡＡＧＧＡＴＧＡＴＴ　　
ＴＣＣ）ＡＡＴＣＴＧＧ　　ＡＡＣ（：）ＡＴＴＧＣＯ
ＧＣＧＯＣＡＴＴＴＧ　　（）ＣＧＧＡＡＣＡＡＣ６５
１〜７００　　　０ＡＣＣＡＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴ’
］’［：）ＴＴ　　ＴＡＡＣＧＡＡＴＡＡＡ（）ＧＧＧ
ＡＧＣＣＡ　　ＴＴＡＡＡＡＡＡＡＧ７０１〜７５０　
　　　ＣＧＡＴＴＧＡＡＡＣＴＴＧＧＣＡＣＡＡＣＡＡ
ＡＧＣ（）ＡＡＧＧＧＡＡＡＡ（）ＣＧＧＴ　　ＴＡＴ
ＴＧＡＴＴＡＴ７５１へ七００　　　　ＧＯＣＴＴＣＣ
ＡＴＴ　　ＴＡＡＴ（）ＡＴＴＡＧ　　ＣＧＡＡＡＴＴ
ＡＣ（）（）ＡＴＧＡＣＧＴＡＴ　　ＴＡＧＡＡＧＡＣ
）ＣＴ８０１へ七５０　　　　Ｃ）ＣＣＡＡＡＡＧＴＣ
ＡＴＴＧＣＣＧＡＡＧ　　ＡＡＧＧ（）ＡＴＡＡＣＡＴ
ＣＣＴＴＴＡＡＡ　　ＧＴＯＴＴ’Ｔ’ＡＴＧＧ８５１
−９００　　　　ＣＧＴＡＴＡＡＡＡＡ　　ＣＧＴＡＴ
’Ｉ”Ｌｌ’ＣＡＧ　　ＧＣＡＧＡＴＧＡＴ（）（）Ａ
ＡＣＧＴＴＡＴＡ　　ＣＣＧＣＡＣＧＣＴＡ９０１ヘタ
５０　　　　ＧＴＣ）ＧＣＴＧＣＣＡ　　ＡＡＧＡＡＣ
ＴＴＧＧ　　ＣＧＣ（）ＣＴ’Ｔ’（）ＴＣＡＴＧＧＴ
ＴＣＡＴＧ　　ＣＧＧＡＡＡＡＴＧＧ９５１補Ｄｏ　　
　　ＧＧＡＴＧＴＧＡＴＴ　　ＧＡＴＴＡＣＴＴＡＡ　
　ＣＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＣＴＴＧＣ（）（）ＡＡ　　
ＧＧＧＡＡＴＡＣ（）Ｇ１００１−０５０　　　　ＡＧ
ＣＣＧＡＴＴ”ｌｒＡ　　ＣＣＡＴＧＣＴＴ’ＴＡ　　
ＡＣＧＣ’ＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣ）ＴＡ、（）Ａ　
　ＡＧＧＡＣ）ＡＡＧ（：’Ｇ１０５１〜１００　　　
　ＡＣＣ（）ＧＧＣｆ）ＣＧ　　ＣＣＴ（）ＴＣＡＡＴ
Ｔ　　ＧＡＣＡＧＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＡ
ＣＴＴＴＡＣＧＴ１１０１〜１５０　　　ＴＧＴＴＣＡ
ＣＧＴＧ　　ＡＣＡＴＣ）ＴＧＣＧＣＡＡＧＣＧ（）Ｔ
ＧＧＡＡＡＡΔＡＴＴＧＣＡ　　ＣＡＡＧＣＧＣＧＣＡ
１１５１ヘクＤＯＡＴＡＡΔＧＧＧＴＴ　　ＧＧＡＴＧ
Ｔ（）ＴＧＧ　　ＧＧＡＧＡＡＡＣＧＴＧＴＣＣＧＣＡ
ＡＴＡ　　ＴＣＴＴＧＴＴＣＴＣ１２０１〜２５０　　
　　ＧＡＣＣＡＡＴＣＧＴ　　ＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡ　
　ＧＣＣＴＧＡＴＴ’［ｌ”Ｉ’ＧＡＡＧＧＣ（）ＣＧ
Ａ　　ＡＡＴＡＴＧＴＴＴＧ１２５１〜５００　　　Ｇ
ＴｃｃｃｃＴｃｃＧ　ＣＴＴＣＯＴ（）ＡＡＡ　　ＡＡ
Ｔ（）（）ＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣ）ＴＡＴＴＧ　　ＴＧ
ＯＡＡＴＧＣＧＣ１６０１へろ５０　　　Ｔ（）ＡＡＡ
ＡΔＣＧＧ　　ＣＣＡＧＣＴＧＣ’ＡＡ　　ＡＣＧＣＴ
ＴＧＧＡＴＣＣ）ＧＡＣＣＡＡＴＣ）　　ＴＴＣＡＴＴ
ＴＧＡＣ１３５１〜４００　　　　　　Ｔ’ｌ”ｒ’Ａ
ＡＡＧＧＣＣＡＡＡ、へ、へ（）ＡＡＣＴ　　ＴＣ）Ｇ
ＣＡＧＡＧＧＡＧＡＴＴ’ｌ叩ＡＣＴＡ　　ＡＡＡＴＴ
ＣＣＡＡＡ１４０１〜４５０　　　ＣＧＧＣＧＧＧＣＣ
Ｇ　　ＡＴＧＯＴＣＧＡＧＧ　　ＡＴＣＧＧ（）ＴＣＡ
ＧＣＡＴＴＣＴＴ’ｒＴＣＡＧＴＣ）ＡＡＧＧＣ＋０１
４５１へろ００　　　ＴＴＡＡＡΔＡＡＧＧ　　ＡＡＧ
ＡＡＴＣＡＣ（）　　ＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴＧＴＣ
ＧＡＴＡＴ　　ＴＡＴＧＴＣＧＡＣＡ１５０１へ６５［
］　　　　ＡＧＡＡＴ’Ｉ’ＧＣＣＡ　　ＡＡＴＴＧＴ
ＴＣＣ）Ｇ　　（）Ｔ’ｒＡＴＴ’ＣＣＣＧＡＧＡＡＡ
ΔＧＧＡＡ　　ＣＧＡＴＣＧＣＧＧＴ１５５１〜６００
　　　ＡＧＯＴＴＣＡ（）ＡＣＧＣＡＧＡＣＴＴＡＧ　
　ＴＣＡＴ’Ｌ”Ｉ”ｌ’ｒＧＡＣＣＣＧＧＡＴＡＴＣ
Ｃ）ＡＡＣＧＧＧＴＣ）Ａ１６０１〜６５０　　　ＴＴ
’ｌ’ＣＧＧＣＧＧＡ　　ＡＡＣＡＣＡＣＣＡＴ　　Ａ
ＴＧ（）ＣＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＡＡＴＧＣＡＴＴ’ｌ
’ＧＡＡｆｌＧＡ１６５１〜７００　　　ＡＴＧＡＡΔ
Ｃ）ＴＡＡ　　ＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＧＴＡＴＣＯ（
）ＴＴＣＧＴＧＣＡＧＡＧＧ　　ＣＧＡ、ＡＴＴＴＧＴ
Ｔ１７０１へ−７５００ＴＣＣＧＴＧＡＴＡ　　ＡＡＣ
ＡＡＴ’Ｔ’ＴＧＴ　　ＣＧ（）ＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧ
ＴＡＣＧＧＣＣＡＡＴＡＴＴロＡ１７５１へ七〇ＯＡＣ
ＧＧＣＣＡＡＡＡ　　ＴＡＣＧＧＡＡＣＣＴ　　ＣＡＡ
ＡＯＡＴ’Ｉ”：、’ＣＣＡＡ（）ＣＡＧＡＡＣＧＡＧ
ＡＡＡＴＴＡＡ１８０１へ七５０　　　ＣＣＡＴＴ’ｌ
’ＡＡＡＡ　　ＧＡＡＴＡＡＣＡＡＣＣＴＡＣＴＣＴＴ
ＧＣＣＣ（”ＴＴＡＡＡＡＴ　　Ｃ）ＣＣＡＡＴＡＡＡ
Ａ１８５１ヘタ００　　　ＴＧＣＡＡＣＡＣＴＴ　　Ａ
Ｃ）ＣＴＴ’Ｔ’ＡＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＡＡＧＡＧ １．９再結合大腸菌クローンからのＤ−ヒダントイナー
ゼＣＢＳ　３０３．８０の特性記述遺伝子工学的に変性
された大腸菌からのＤ−ヒダントイナーゼの分子特性記
述のため、ＨＢｌｏｌの培養物５００ｍ１を、プラスミ
ドＢ６と共にＬＢ　／　Ａｍｐ中で６７℃で１６時間振
動しながら保温し、酵素活性Ｄ−ヒダントイナーゼを採
取するため１．５の記載と同様に仕上げ処理する。その
際使用する緩衝液の量を１０倍に増加する。

分解液を４°Ｃで１時間高速回転遠心分離したのち、上
澄をポリプミンＰＯ６１％となし、７０℃に２分間加熱
し、低回転で１５分間遠心分離する。上澄をアミコン圧
力セル中で５分の１に濃縮する。濃厚物の６０μｌを等
電焦点集中ゲル（ｐＨ３，５〜９５；アムホラインＰＡ
（）Ｅ板ＬＫＢ　）の上に載せる。ＣＢＳ　３０５．８
０からの純粋なり　−ヒダントイナーゼを、対照として
併行して載せる。等電焦点集中の終了後、両方のはがし
たテープを３羽の断片に切断する。このゲルセグメント
を直接に、メチルチオエチルヒダントインのＮ−カルバ
モイルメチオニンへの転位による酵素活性Ｄ−ヒダント
イナーゼの試験に前記のように使用する。大腸菌ＨＢ１
０１（Ｂ６）及びＣＢＳ　３０３．８０からのそれぞれ
のＤ−ヒダントイナーゼは同じ等電点を有する。

大腸菌ＨＢＩＤ１（Ｂ６）の培養物４１を、前記と同様
に仕上げ処理して透明分解液にする。

４°Ｃで６０分の高速回転遠心分離ののち、上澄を０４
４％ポリミンＰ＃＃に調整し、７０°Ｃに２分速 間加熱したのち１５分間中β転で遠心分離する。

上澄１６５ｍ１を、１ｒｎｌのウサギ−〇−ヒダントイ
ナーゼー抗血清を１ｇのシアン化ブロム活性化されたセ
ファロースに結合させることにより製造された親和性コ
ラムによりクロマトグラフィにかける。溶出したＤ−ヒ
ダントイナーゼ５μＩを、トリス−グリシン緩衝液（ネ
イチャー２２７巻６８０頁１９７０年）中の５ＤＳ−ゲ
ル（５％集中ゲル、ｐＨ６，８，１０％分離ゲル、ｐＨ
８，８）により分画する。対照としてＣＢＳ　６０３．
８０からの真正のＤ−ヒダントイナーゼを分画する。蛋
白バンドはクーマシー・ブリリアント・ブルーによる着
色によって検知できるようにする。犬腸直及びＣＢＳ　
３０３．８０からのＤ−ヒダントイナーゼは等速度で移
行する。

実施例２ Ｌｕ１２２０からのヒダントイナーゼ遺伝子のショット
ガン−クローニング ２．０耐熱性細菌の単離 ヒダントイナーゼ活性を有する耐熱性好気性で胞子形成
性の細菌を、下記の方法により土壌試料、植物材料（特
に混合肥料）及び水試料（好ましくは栄養物質含有水）
から単離する（ＤＥＯ３３０３１１５１参照）。

１スパーチルの試料を栄養溶液又は塩水（０，８５％Ｎ
ａＣ１）に懸濁する。水試料は直接に実験に使用し、試
料の容量は約１０ｍ１とする。試料を８０℃で１０分間
加熱することにより滅菌する。

この試料のある量を１ａ倍に希釈し、栄養寒天上にすし
状に塗布する。栄養寒天を入れたシャーレをプラスチッ
クシートで包み、６０℃で１〜４日間保温する。生成し
たコロニーを取り出し、寒天培地に接種を操り返して精
製する。得られた純粋培養物を、ヒダントイナーゼ活性
のため試験する。

得られた菌株（国際記号ＬＵ１２２０）を実施例に使用
する。

２．１　ＤＮＡの調製 カスプ：ｙ　ホ／ｌ／　ツ培地２００ｍ／！ＶＣ，ＬＵ
１２２０のコロニーを接種し、振と５しながら（１６０
ｒｐｍ　）　６０℃で１９０クレット単位まで培養する
。４０００ｒｐｍ、２０分、４℃（ミニフーゲ・ヘレウ
ス）で遠心分離したのち、湿った菌体重量はｉ、　１６
　ｇである。遠心分離残有を’１５ｍ１１５０　ｍＭ　
ＮａＣ１，１００ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０で洗浄
し、再度粒状化する。この細胞をｔ　ｓ　ｍｉ　ｉ５０
　ｍＭ　ＮａＣ１，１［１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８
，０の中に移し、リゾチーム０．５　ｍｌ（ングマ；　
１５　Ｄ　ｍＭＮａＣｌ、１００　ｍＭ　ＥＤＴＡ中１
０　ｍｅ）　／ｍｌ、　ｐＨ８，０）を添加したのち、
細胞を３７°Ｃで６０分間保温する。次いで２５％ＳＤ
Ｓ水溶ｐ２Ｌ１ｍｌを添加し、６０°Ｃで１０分間保温
する（細胞の分解）。２０℃で５　Ｍ　ＮａＣｌ０４Ｇ
、　２５容入を添加し、以下に 実施例１．１ないし１．２と同様、仕上げ処理する。

次いでＤＮＡを２０　ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，
０の１５０μｌ中に移し、ＣｓＣ１−勾配遠心分離によ
り最終的に精製する。ＣｓＣ１溶液（７ｍｌ水、０゜１
１　ｍｅ　１００　ｍＭ　Ｎａ２Ｂ４Ｏ７，１，３６ｇ
ＣｓＣｌ、ｎ＝１．４００）’を、ＤＮＡ溶′ｇ！ｉ、
７５μｌと積層し、ＴＳＴ４１０−ター（コントロン超
遠心分離機）により２０℃で３０時間高速で遠心分離し
、２〜１５番のＱ、　５　ｍ１分画からのＤＮＡを集め
る。このＤＮＡを水６ｒｎｌ及びエタノール１２１ｎｌ
を添加して０℃で沈殿させ、８０％エタノールで２回洗
浄し、１　（］　Ｃ１μｌｌ　２０　ｍＭ　トリス−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ８，［ｌに溶解する。収量はＤＮＡ　１２０
μｇである。

２．２コスミドーシヨツトガンークローニングＬｕ　１
２２０　ＤＮＡを、Ｓａｕ　３Ａを用いて部分切断する
（２０μｊｊ　ＤＮＡ、　１〜３　Ｕ　５ａｕ５　Ａを
使用、３７℃で１時間）。０．８％アガロースゲル中の
電気泳動により、平均断片大きさ＞　２０　ｋｂにする
。この断片を実施例１と同様に、ｐＨｃ　７９のＢａｍ
Ｈ１認識位置に結合し、試験管内に封入し、大腸菌ＨＢ
　１０１を介してコスミドー遺伝子貯蔵所にする。１６
００の単独コロニーをＬＢ／Ａｍｐ１００μｌ（ミクロ
滴定板上の培養物）に二重体で移入する。各板をグリセ
リン培養物（グリセリン２０％）として−７０℃で貯蔵
する。

２．６Ｌｕｌ　２２０　Ｄ−ヒダントイナーゼのため陽
性コスミドクローンの免疫学的試験による同定 Ｌｕ１２２０からのＤ−ヒダントイナーゼのため、ポリ
クローン化抗体を製造する（操作は実施例１のＣＢＳ　
５０５．８０に対するポリクローン化抗体に関する記載
と同じ）。これを用いて実施例１と同様に適当な促進体
活性において、実施例１と同様に大腸菌中で生産される
Ｄ−ヒダントイナーゼのコロニー特性を検出することが
できる。そのためには１５００クローンを実施例１と同
様に（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７５
巻２７４６頁１９７８年参照）、Ｌｕ１２２ＤＤ−ヒダ
ントイナーゼ連鎖の表現のため試験する。８（［Ｗのコ
ロニーは抗り−ヒダントイナーゼＬｕ１２２０Ｉｇ（）
として抗原場性である。すべてのクローンを酵素活性に
ついて試験する（　ＬＢ　／　Ａｍｐ、１　ｍＭ　Ｍｎ
Ｃｌ２中の１５０ｍ１培養物）。培養を６７℃で約６０
０のクレット単位まで行い、細胞を４℃で２０分間中速
で遠心分離しくミニフーゲ・ヘレウス）、粒状物を溶液
Ａ　（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１０％
しよ糖）、１１ｎＭＭｎＣ１２で洗浄し、溶液Ａ　１．
３　ｍｌ、　１ｍＭ　ＭｎＣｌ２に再懸濁し、溶液Ａ中
のりゾチーム２７０μｌ（１０ｍ９７ｍ１　）を添加し
、２０℃で２０分間保温する。さらに３６０μｌ　Ｏ，
２５Ｍ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０を添加し、２０°Ｃで
５分間保温したのち、直ちに１．６７　ｍｌの溶液Ｂを
混合し、４°Ｃで１時間高速で遠心分離する。上澄各２
ｍｌにＱ、　５　ｍｌボラツクス緩衝液、ｐＨ８，１５
，０，１３Ｉｌｌ　１Ｍ　ＭｇＣｌ２及び０．５　ｍ１
５％メチルチオエチルヒダントインを添加し、６０℃で
４時間振とうする。この混合物１．５　ｍｌヲエツペン
ドルフーベンチ遠心分離機により５分間遠心分離する。

その上澄１．２　ａｔに１：１０希燐酸０．１６８　ｍ
ｌを添加し、無菌濾過し、高速液体クロマトグラフィに
より分析する。培養物（Ｃ５、第７図参照）は酵素活性
Ｄ−ヒダ／トイナーゼの生産体である。

２．４　ｐＢＲ３２７のプラスミドサブクローニングＬ
Ｂ　／　Ａｍｐ中の０５の培養物１００ｍ１から、プラ
スミド−ＤＮＡを製造する（実施例１参照）。

このＣ５−ＤＮＡ１０μＩを１００μｇ中で１．５Ｕの
Ｓａｕ　３　Ａを用いて、６７℃で１時間切断し、混合
物をそのまま０．８％低溶融アガロース（ビオラード）
の上に載せる。１５００〜６０００ヌクレオチドの大き
さを有するＤＮＡをゲルから溶出し、沈殿させ、そして
２０μ６２０　ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，０
，１ｍＭ　ＥＤＴＡに溶解する。

８μｌ（２００ｎｇ　）のＳａｕ　３　Ａにより部分的
に切断されたＣ５−ＤＮＡを、２５μｌ中で当モル量の
ｐＢＲ３２７と結合する（　Ｉ　ＵＴ４ＤＮＡ−リガー
ゼ、ＮＥＮ、１５°Ｃで一夜）。ｐＢＲ３２７−ベクト
ルをＢａｍＨ１で切断し、そして牛腸ホスファターゼ（
ペーリンガー社製）を用いてベクトルの自己結合を抑制
するため５′−説ホスホリル化する。

結合混合物１０μｌを大腸菌ＨＢ１０１に変形し、変形
混合物をＬＢ／Ａｍｐ板の上に広げる。得られた５００
のコロニーをコスミドークローンについて記載したと同
様にミクロ滴定板に移し、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　７５巻２７４６頁１９７８年の方法
によりＤ−ヒダントイナーゼ抗原を試験する。４個のク
ローンが抗原の生産を示す。

この４者のＬＢ／Ａｍｐ培養物１００　ｍｌからプラス
ミド−ＤＮＡを製造し、各５０ｒｎｌの試料について前
記のようにＤ−ヒダントイナーゼの酵素試験をする。２
種のクローンが酵素活性を示す。これらクローン（Ｆ２
及びＢ４）のプラスミドは明らかに同一で、予期しない
大きいＤＮＡ−断片（約８ｋｂ）を統合して含有するが
、他の２種は１．９ｋｂの長さの断片を統合して含有す
る。

クローンＦ２のプラスミド−ＤＮＡを、なるべく小さい
挿入長さを有するが、酵素活性Ｄ−ヒダントイナーゼを
生産しうるクローンを得るために、さらにサブクローニ
ングに使用する。

Ｆ２−ＤＮＡ　１０３ｇを１００　μｌｌ中で６Ｕの５
ａｕ３Ａを用いて１時間消化し、０，８％の低温溶融ア
ガロース上で前記と同様に、大きさにより分画する（１
５００〜３０００　ｂｐ　）。断片を前記と同様にｐＢ
Ｒ５２７のＢａｍＨ１位置に統合し、ＨＢｌｏｌに変形
する。６５０のコロニーが得られ、その２６個はブルー
ム−ギルバート試験において抗原陽性に作用し、その４
個は強いシグナルを示し、８個は活性Ｄ−ヒグントイナ
ーゼの生産体である（例えばＡ５９及びＦ６４）。１７
６４　ｂｐの挿入長さを有するＡ５９は最高の生産性を
有するクローンである（第７図）。

Ａ５９が表現最適化のため、Ａ５９及びＦ６４（第８図
）がＤ−ヒダントイナーゼの連結分析のため用いられる
。

２．５連結 連結は第９図に示す様式により行われる。それは天然の
連結のための限定位置のみならず、フリシャウ７らの方
法（ＮｕＣｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８巻５５４１
頁１９８０年参照）によりグラスミドＡ５９及びＦ６４
に加入された人工的限定位置も用いられる。その目的は
、片側において連結体切断部によって制限された（δ５
′）削除変異体を得ることにあり、したがって断片の連
結は挿入物に完全に重なる連結となる（第９図、ヒダン
トイナーゼ上の矢印は解読方向を示し、挿入物の黒色部
はコード化区域を示す）。連結はＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎ
ｚｙｍ、　６５巻４９９頁１９８０年の方法により行わ
れる。

ＤＮＡアーゼｌ緩衝液（２００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ７，５，１，５ｍＭ　ＭｎＣ１□、１００　μｇ／ｍ
ｌゼラチン）２５０ｍｌ中でプラスミド−ＤＮＡ　Ａ　
５９４０μＩを、２００　Ｉ）ｇのＤＮＡアーゼ（ワー
シントン母液：５０ｇグリセリン１ｍ中の１■ＤＮＡア
ーゼ、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０，１ＭＮ
ａＣ１、ｏ、　５　ｍｙ　／　ｍｌゼラチン）を用いて
、２４°Ｇで６分間消化し、５μｍ１０．５　Ｍ　ＥＤ
ＴＡ、　ｐＨ８，０を用いて反応を停止し、フェノール
（緩衝剤により平衡化）２５０μｌを用いて振出し、ク
ロロホルム処理し、エーテルで抽出し、０．８％低温溶
融アガロースゲル上で電気泳動法により分画する（１０
０Ｖ／２０ＣｒＩＬ、２時間）。線状プラスミドの区域
を切り出し、ＤＮＡを溶出し、ＤＥ５２−セルロース（
ホワットマン）上で精製したのち、２０　μｍ１２０　
ｍＭ　）リス−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，０、１ｍＭ　ＥＤ
ＴＡに溶解する（　ＤＮＡ約５μｇ）。ＤＮＡの末端は
、２０℃で６０分の保温により５Ｕのゼ処理したＨｉｎ
ｄ　ＩＩＩ結合体（５’　−０ＣＡＡＧＣＴＴＯＣ−３
’；Ｐ＆Ｌ）を、１０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＮ
　）の存在下に２５μｌの結合混合物中で１゜５μｇの
線状化Ａ３９ＤＮＡ（約０．８　ｐ　Ｍｏｌ末端）と結
合する。１５℃で一夜保温したのち、リガーゼを６５℃
で１０分間不活性化する。２５μｌのＹ１００緩衝液（
１００ｍＭ　ＮａＣ１、ｉ　［１ｍＭトリス−ＨＣｌ、
ｐＨ７，５，６ｍＭ　ＭＥＣ１２，１ｍ９／ｍｌゼラチ
ン、６　ｍＭβ−ＭＳＨ）を添加し、ＤＮＡを５ＵのＨ
ｉｎｄ　ｍ　（ベーリンガー社製）を用いて３７℃で１
時間消化する。生成したＤＮＡ−断片をＱ、　８％低温
溶融アガロースゲル上で分画したのち、上限がプラスミ
ドＡ５９の長さと一致するＤＮＡ断片の汚れた路が生ず
る。ｐＢＲ３２７のＨｉｎｄＩＩｌ切断位置の外側のす
べてのＤＮＡアーゼＩ−切断位置が、対の小さいプラス
ミド断片となる。ゲル上の路をかみそり刃で切断して小
さい断片となし、長さによって選別された多数の断片分
画を別個に再結合できるようにする。

分画を既知方法（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　
８巻５５４１頁１９８０年）により低温溶融アガロース
の存在下に再結合し、大腸菌ＨＢ１０１に変形する（１
６混合物）。１分画につき平均５０の変形体が得られ、
それぞれ２個がそのプラスミドを介して分析される。重
なった削除プラスミドから得られたＤＮＡ一連結から、
実施例１の１，８に示すＬｕ１２２０−　Ｄ−ヒダント
イナーゼのための全連鎖及び−緒に連結された周縁連鎖
が得られる。

Ｌｕ１２２０からの６−ヒダントイナーゼ遺伝子のコー
ド化範囲は、ヌクレオチド６９１からヌクレオチド１７
４６まで広がっている。トランスレーションの出発を標
識する６個のヌクレオチド及びトランスレーション停止
標識は、描影法によって示される。

２．６高められた生産性を有するＬｕ１２２０Ｄ−ヒダ
ントイナーゼを表現する大腸菌株の製造 連結のため製造されたＡ３９−δ５′−削除変異体を、
限界がＡＴＧ−出発コードンの近くにある多数の他の削
除変異体を製造するために使用する。その場合はＨｉｎ
ｄ　ｌ１ｌ一連結体が、出発コードンの上方で、５２ヌ
クレオチドのＰｖｕ　ＩＩ−切断位置近くに位置する削
除変異体の分画から出発する（切断位置の存在の試、験
）。この分画に属するコロニーを集め、−緒にプラスミ
ドを製造する。ＤＮＡ　（１０μｇ）をＨｉｎｄ　ｍで
線状化し、１００　μｌｌ中で２．４ＵのＢａｌ　！＋
　１を用いて２５℃で６０秒間処理する。反応をフェノ
ールの添加によって停止し、このＤＮＡを加工する。１
゜Ｏμｌの反応混合物中で、ＤＮＡ末端を拘束するため
、ＤＮＡをＤＮＡ−ポリメラーゼＩを用いて１５°Ｃで
２時間保温する（以上の操作については「モレキュラー
・クローニング、エイ−ラボラトリ−・マニュアル、コ
ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１９８２
年１０８頁、１１６頁以下、１６５頁以下、６９４頁等
参照）。

次いでＢａｍＨ１一連結体（５’　−ＣＣＧＧＡＴＣＣ
Ｇ（）　−５’、Ｐ＆；Ｌ　）の付加を、２５μβ中１
５°Ｃで一夜行う（１，５μｇＤＮＡ、約１ｐＭｏｌ末
端、８４　ｐ　Ｍｏｌ連結体、２０Ｕ　Ｔ４ＤＮＡ−リ
ガーゼ、ＮＥＮ　）。次いでリガーゼの不活性化を６５
℃で１０分間行い、そしてＤＮＡをＢａｍＨ１を用いて
消化する。

ＤＮＡを拡散帯としての０．８％低温溶融アガロース中
で精製し、単離し、１００μｌ中で結合し、大腸菌ＨＢ
１０１に移入する。全部で１８２２のコロニーが得らｈ
る。９６のコロニーについてＤ　Ｎ　Ａを統計的に調べ
、ＢａｍＨ１Ｘ　Ｐｖｕ　■−限定により図示する。１
４のプラスミドがＰｖｕ　ＩＩ／　ＢａｍＨ１−断片（
約９２　ｓ　ｂｐ　）を含有し、ＢａｍＨ１一連結体を
ＡＴＧ出発コードンの直接隣りに有し、そしてＢａｍＨ
１一連結体から連結される。

Ａ＋ＧとＣ＋Ｔの反応だけが行われる。なぜならばその
区域の正確な連結が可能だがらである。

プラスミドｐ７０．ｐ６２及びｐ５１は、前記式に示さ
れる位置でＢａｌ　３１により消化される。ベクトル連
鎖とＬｕ１２２０遺伝子断片遺伝子績合は、前記式中で
矢印及び対応する構造の名称により示される。結合は矢
印の基部でＢａｍＨ１一連結体を介して起こる。連結体
の連結は図示されない。最初の２個のヌクレオチドの連
結については不明瞭なので、これらプラス／ミドの表現
ベクトルへの変形に関して６つの可能な解読枠が示され
る。

表現ベクトルとしては、ｐＥＸ　３１　ａ　−ＣとｐＣ
Ｌ５４７の２種の系が可能である（　ＥｌｖｉＢＯＪ、
　１巻１２１７頁１９８２年参照）。ベクトルのｐＥＸ
　５１　ａ　Ｃはハイデルベルク大学のシャラー教授に
より利用可能にされ、そしてプラスミドｐＣＬ５４７は
ハイデルベルクのスタンレイ博士により利用可能にされ
ている。

プラスミドｐＥＸ　３１　ａ−ＣはｐＢＲ３２２がら誘
導され、ＭＳ２ポリメラーゼ区域と結合するλファージ
のｐＬ−促進体区域を含有する。ポリメラーゼ遺伝子の
９７アミノ酸コードンの後のＤＮＡ−Ｊ鎖は、ＥｃｏＲ
４−切断位置を介して６個の連続解読枠中でポリ連結体
区域に連結する。プラスミドｐ５１、ｐ６２及びｐ７０
のＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子連鎖は、ＢａｍＨ１切断
位置に結合する。そのためにｐＥＸ３１ａ、　ｂ及びＣ
（第６図）の促進体含有Ｐｓ　ｔ　Ｉ　−ＢａｍＨ１断
片を対応するｐ５１、ｐ６２及びｐ７０の断片でそして
７％ポリエチレングリコールの存在下に連結しく　Ｎｕ
ｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１１巻７８５３頁１９
８３年参照）、大腸菌Ｎ４８３０に移入する。

得られた各クローン（ｐＥＸ５１ａ、　ｂ、　ｃ、ｐＥ
Ｘ　６２　ａ　、　ｂ　、　ｃ及びｐＥＸ７０ａ、　ｂ
ｌｃ　ｐ約１５０のクローン／混合物）の各解読枠につ
き６２個を、ミクロ滴定板に載せる。培養物（ＬＢ／Ａ
ｍｐ培地１００μｌ中）を２８℃で一夜振とうする。こ
の温度で熱に敏感なλ表現体ｃＩ　８５７（大腸菌Ｎ４
８３０のクロモシーム中にコード化される）は、ヒダン
トイナーゼの表現を可能にする。次いで酵素生産を誘導
するため、それぞれの１０μｌを新しいミクロ滴定板に
移し、ＬＢ／　Ａｍｐ培地１００　μｌ中で２８°Ｃで
５時間振とうする。培養物を水浴上で４２°Ｃに１５分
間加熱したのち、保温型中４２°Ｃでさらに３時間振と
うする。これら大腸菌を各２０　／７１Ｊの２ｏ％ＳＤ
Ｓを用いて分解し、実施例１と同様にＬｕ　１２２０Ｄ
−ヒダントイナーゼ抗原の存在を調べる。

Ｌｕ１２２０Ｄ−ヒダントイナーゼ抗原の表現の免疫学
的試験によると、プラスミドｐＥＸ５１及びｐＥＸ　６
２の場合は、解読枠すでは陽性、ａ及びＣでは陰性であ
る。プラスミドｐＥＸ　７０の場合は、すべての解読枠
が陽性である。抗原陽性のミクロ滴定培養物ｐ■６２ｂ
、ｐ■５１ｂ及びｐＥＸ７０ａ、ｂ及びＣのそれぞれの
４個の代表について、Ｄ−ヒダントイナーゼ酵素活性を
試験する。ｐＥＸ　６２　ｂ　、　ｐＥＸ　７０　ａ　
、　ｐＥＸ　７０　ｂ及びｐＥＸ　７０　ｃだけが活性
である。ｐＥＸ　７０の構成を第１０図に示す。

表現ベクトルｐｃＬ５４７（囮ＢＯＪ、１巻１２１７頁
１９８２年）の場合は、１個の解読枠のみがＤ−ヒダン
トイナーゼ遺伝子の結合に有効である。ｐ７０、ｐ６２
及びｐ５１からのＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子を含有す
るＢａｍＨ１／　Ｐｓ　ｔ■−断片は、前記のようにＣ
ｒＯ及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の間の単位Ｂａｍ
Ｈ１切断位置と、ｐＢＲ位置のＰｓｔｌ切断位置との間
で結合する（第１１図参照）。大腸菌Ｎ４８３０への変
形ののち、各場合の４コロニーについて、酵素活性Ｄ−
ヒダントイナーゼの表現を試験する。これらの構成にお
けるＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子はλ促進体／ｃ１８５
７表現体の制約下にあるの＋■ヲダントイナーゼの合成
は熱誘導の後で前記のように測定される。構成ｐＣＬ　
７０だけが酵素活性であることが認められる。それは熱
誘導後の培養混合物において（実施例１．５参照）、湿
った微生物塊について出発法Ｌｕ　１２２０に対し４倍
高い酵素活性である。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤ−ヒダントイナーゼ遺伝子のサブクローニン
グの説明図、第２図は部分的にＨｉｎｄｌ１６図は実施
例１−７−ｉｉにおいてプラスミドｐＢ６Ａを連結に使
用する場合の説明図、第４図はプラスミドδＢ６をＢａ
ｍＨ１切断位置から連結する態様を示す説明図、第５図
は実施例１−８のプラスミドδＢ６０表現最適化の態様
を示す説明図、第６図はプラスミドｐＥＸ３１ａ−ｃが
外来遺伝子とＭＳ２レプリカーゼの結合を可能にする結
合領域を有することを示す説明図、第７図は実施例２−
６におけるＣ５の生成及びそれからＡ５９の生成を示す
説明図、第８図はＡ５９及びＥ６４の構成を示す説明図
、第９図は実施例２−５の連結を示す説明図、第１０図
はｐＥＸ７０の構成を示す説明図、第１１図はｐＣｔ、
５４７の場合の結合を示す説明図である。 出願人　パス７・アクチェンゲゼルシャフト代理人　弁
理士　小　林　　正　雄 ＦＩＧ、　１ ［Ｂａ１）Ｉｆ］５ａｕ３Ａ ｒ８ａａｌｌｌｌ＜コ＋＋ｌムｈｘｌ１Ｍｉｎ／ｆｆ１
ＬＳＪ１．ＴＩ　Ｂａ＋ａＨＩ Ｆｌｏ、１０ Ｑ！ｉｍＨ＋］５ａｕ３＾ 手続補正書（自発　） 昭和６２年１　月　９日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、Ｄ−ヒダントインを分解する高温菌微生物からＤＮ
   Ａを分離して断片に破断し、得られたＤＮＡ断片をクロ
   ーニングベクトルと結合し、この再結合クローニングベ
   クトルを中温菌微生物中で統合し、酵素活性ヒダントイ
   ナーゼを表現するこの微生物を選別することを特徴とす
   る、高温で活性なＤ−ヒダントイナーゼを含有する中温
   菌微生物の製法。 ２、微生物がＤ−ヒダントイナーゼコード化ＤＮＡ連鎖
   を有するクローニングベクトルを含有する特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 ３、微生物が大腸菌である特許請求の範囲第１項に記載
   の方法。 ４、Ｄ−ヒダントインを分解する高温菌微生物からＤＮ
   Ａを分離して断片に破断し、得られたＤＮＡ断片をクロ
   ーニングベクトルと結合し、この再結合クローニングベ
   クトルを中温菌微生物中で統合し、酵素活性ヒダントイ
   ナーゼを表現するこの微生物を選別することにより高温
   で活性なＤ−ヒダントイナーゼを含有する中温菌微生物
   を製造し、これを使用して耐熱性ヒダントイナーゼを製
   造する方法。 ５、微生物が大腸菌である特許請求の範囲第４項に記載
   の方法。 ６、Ｄ−ヒダントインを分解する高温菌微生物からＤＮ
   Ａを分離して断片に破断し、得られたＤＮＡ断片をクロ
   ーニングベクトルと結合し、この再結合クローニングベ
   クトルを中温菌微生物中で統合し、酵素活性ヒダントイ
   ナーゼを表現するこの微生物を選別することにより高温
   で活性な微生物を製造し、この菌又はこれから製造され
   た蛋白抽出物を使用してＤ，Ｌ−ヒダントインを分割す
   る方法。