DK164001B - Rekombinant-dna, der kan udtrykke staphylokinase og er afledt fra en temperat phag af staphylococcus aureus, fremgangsmaade til fremstilling af rekominant-dna samt fremgangsmaade til fremstilling af staphylokinase - Google Patents

Description

i

DK 164001 B

Den foreliggende opfindelse vedrører en hidtil ukendt rekombi-nant-DNA, der kan udtrykke staphylokinase og er afledt fra en temperat phag af Staphylococcus aureus, en fremgangsmåde til fremstilling af rekominant-DNA samt en fremgangsmåde til fremstilling af staphylo-5 kinase.

Staphylokinase (i det følgende omtalt som SAK) er et fibrinolytisk enzym, der produceres af Staphylococcus aureus (i det følgende omtalt som S. aureus).

Funktionen af SAK er at omdanne plasminogen i blod til pi asmin, der 10 igen virker på fibrin til lysis af samme. Som enzymer med lignende aktivitet kendes urokinase, som er til stede i human urin, og streptokinase, der produceres af streptococcer. Alle disse enzymer finder anvendelse i medicinen som fibrinolytika, f.eks. antikoagulanter (blodkoagulations-inhibitorer) og antithrombotika. På grund af denne anvendelighed har 15 mange forsøg været gjort på at forbedre fremgangsmåder til fremstilling, ekstraktion og rensning af disse enzymer.

Med hensyn til fremstillingen af SAK er det allerede kendt, at evnen til at producere SAK er en egenskab, der bibringes en S. aureus vært ved hjælp af såkaldt lysogenomdannelse, dvs. lysogeni sering i vært-20 en af en temperat phag. Hidtil kendte fremgangsmåder til fremstilling af SAK omfatter derfor udvælgelse blandt stammer af S. aureus af en stamme med SAK-produktionsevne eller lysogeni sering i en S. aureus stamme, som er ude af stand til SAK-produktion med en phag, der er i stand til at indføre genet, der koder for SAK i genomet hos S. aureus, i begge til-25 fælde dyrkning af den opnåede stamme og opnåelse af SAK fra kulturen.

S. aureus er imidlertid en bakterie med betydelig patogenicitet og håndteringen deraf kræver derfor stor forsigtighed. De hidtil kendte fremgangsmåder er derfor ikke egnede til fremstilling af SAK i industriel målestok. Endvidere er det til opnåelse af store udbytter af SAK 30 nødvendigt at foretage dyrkning i et langt tidsrum. I denne henseende mangler de hidtil kendte fremgangsmåder egnethed til SAK-fremstilling i industriel målestok.

Til grund for den foreliggende opfindelse har man indgående studeret og undersøgt fremgangsmåder, som kunne være egnede, både ud fra et 35 sikkerhedsmæssigt og effektivitetsmæssigt synspunkt, til fremstilling af SAK i industriel målestok. Det er kendt, at genet, der koder for SAK-produktion, befinder sig på phag-DNA'er, og det er nu lykkedes at transformere E. coli med en vektor indeholdende genet, der koder for SAK.

DK 164001 B

2

Den foreliggende opfindelse angår en rekombinant-DNA, der kan udtrykke staphylokinase og er afledt fra en temperat phag af Staphylococcus aureus, hvilken er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

5 Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en rekombinant DNA, der er ejendommelig ved, at man: (1) fordøjer en temperat phag-DNA, isoleret fra Staphylococcus aureus, valgt blandt 42D DNA, L42E DNA, 77 DNA, Ρφΐ DNA, P¢2 DNA, TØ-42D DNA, Pø-406 DNA, R019 DNA og SØC DNA, med ét eller flere restrik-10 tionsenzymer, der er valgt blandt Hindlll, PstI, AccI, Avail,

EcoRI, Hpal, Hpall, Hindll, SstI, Clal, BstEII, Sstll, Xhol, Bell,

Bglll, PvuII, Xorll, Kpnl, Smal og Xbal, 2) og om ønsket isolerer DNA-fragmentet, der bærer genet, som koder for staphylokinase, 15 3) spalter en vektor-DNA med ét eller flere restriktionsenzymer, og 4) indfører det i trin 1) eller 2) opnåede fragment på spaltnings-stedet for den i trin 3) opnåede vektor-DNA, idet vektor-DNA7en er udvalgt fra gruppen omfattende Col El, pMB 9, pSC 101 og pl5A og 20 derivater deraf, såsom pBR 322 og pACYC 184, samt Charon-vektorer afledt af λ-phag.

Endvidere angår den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af SAK, hvilken er ejendommelig ved det i krav 4's kendetegnende del angivne.

25 Som den temperate phag, der tjener som DNA-donor i ovenstående trin (1), kan anvendes enhver stamme, der er isoleret fra en lysogen-stamme af S. aureus, som har SAK produktionsevne, og som er i stand til lysogenomdannelse. Sådanne phag-stammer omfatter 42D, L42E og 77 (Mason, R.E. og Alien, W.E. (1975), Can. J. Microbiol., 21, 1113-1116); Pøl, 30 Pø2, TØ-42D og Pø-406 (Kondo, I. og Fujise, K. (1977), Infect. Immun., 18, 266-272); Røl9 og SøC (Kondo, I. et al. (1980), Tokyo Jikei-kai Ika-Daigaku Zasshi, 95, 1203-1206).

Fremstilling af temperate phag-DNA'er kan udføres ved hjælp af konventionelle metoder inden for denne teknik, der omfatter inficering af 35 en stamme af S. aureus som værten med en temperat phag-stamme og dyrkning af den således inficerede mikroorganisme (se f.eks. Blair, J.E. og Williams, R.E.O. (1961), Bull. W.H.O., 24, 771-784). Som følge af dyrkningen lyseres cellerne og phagen frigøres i dyrkningsmediet. Den

DK 164001 B

3 således frigjorte phag opsamles ved hjælp af en passende metode (f.eks. ved hjælp af CsCl ligevægt-densitet-gradient-centrifugering som beskrevet i Rosenbium, E.D. og Tyrone, S. (1964), J. Bacteriol., 88, 1737-1742). Isolering af phag-DNA'en fra den således opsamlede phag kan ud-5 føres ved hjælp af i og for sig kendte metoder, f.eks. ved ekstraktion med phenol.

Fordøjelse af temperate phag-DNA'er med ét eller flere restriktionsenzymer kan udføres på følgende måde.

Et passende restriktionsenzym sættes til phag-DNA'en og bringes til 10 omsætning dermed under passende betingelser, med det resultat, at phag-DNA'en fordøjes i fragmenter, der varierer med det anvendte restriktionsenzym.

Restriktionsenzymer, som er egnede til fordøjelse af phag DNA, kan spalte phag-DNA uden at spalte genet, der bærer genetisk information til 15 SAK-produkti on. Sådanne restriktionsenzymer omfatter Hind III, Pst I,

Acc I, Ava II, EcoR I, Hpa I, Hpa II, Hind II, Sst I, Cla I, BstE II,

Sst II, Xho I, Bel I, Bgl II, Pvu II, Xor II, Κρη I, Sma I og Xba I.

Efter fordøjelsen isoleres DNA-fragmentet, der bærer genetisk information til SAK-produktion, fra blandingen af phag-DNA restriktions-20 fragmenter. Isoleringen kan udføres ved hjælp af i og for sig kendte midler, for eksempel ved agarose-gel-elektroforese. Ved udførelse af isoleringen er det nødvendigt forud at bestemme, hvilket af restriktionsfragmenterne fra phag-DNA'en som bærer genetisk information til fremstilling af SAK. Fremgangsmåden til ovennævnte bestemmelse vil 25 senere blive beskrevet i detaljer. Som allerede nævnt kan dette isoleringstrin om ønsket springes over.

Spaltning af vektor-DNA'er kan udføres ved at sætte et passende restriktionsenzym til vektor-DNA'en og bringe disse til omsætning under passende betingelser.

30 I forbindelse med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse til fremstilling af en rekombinant DNA kan anvendes kendte vektor-DNA'er, hvilke omfatter Col El, pMB 9, pSC 101 og pl5A og derivater deraf, såsom pBR 322 og pACYC 184, samt Charon-vektor afledt af λ-phag.

Indføring af det ovennævnte DNA-fragment, som bærer genet for SAK i 35 vektor-DNA'en på sidstnævntes spaltningspunkt, kan udføres ved hjælp af konventionelle midler. Egnede reaktionsbetingelser vælges i afhængighed af typerne af anvendt phag-DNA, vektor-DNA og restriktionsenzym.

Som E. coli vært kan anvendes alle E. coli stammer, hvis restrik-

DK 164001 B

4 tions-modifikationssystem mangler evne til restriktion. De modificerede pi asmider, hvori der er indført DNA, som bærer genetisk information til produktion af SAK, kan også anvendes for E. coli stammer med restriktionsevne. Typen af E. coli vært, der kan anvendes, er begrænset i af-5 hængighed af den anvendte vektortype. Ved beskrivelsen af anvendte E. coli stammer anvendes "r^" som betegnelse for, at stammen mangler restriktionsevne og "ny" som betegnelse for, at stammen mangler modifikationsevne og "m^" som betegnelse for, at stammen har modifikationsevne.

10 Indføringen af rekombinant-DNA'en kan udføres ved hjælp af i og for sig kendte midler og metoder som beskrevet f.eks. i Cameron et al., (1975), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 72, 3416-3420.

Selv når trin (2) foretages, sker det undertiden, at der ikke finder nogen indføring sted af det SAK-gen-bærende DNA-fragment fra lysoge-15 ne phager. Endvidere er der, når trin (2) springes over, mulighed for, foruden at den ovennævnte mulighed for ingen indføring finder sted, at andre DNA-fragmenter, som ikke er relevante for SAK-produktion, indføres. For at undgå disse problemer er det nødvendigt at foretage selektiv adskillelse af E. coli celler, som har vundet evnen til produktion af 20 SAK. Til dette formål er det hensigtsmæssigt at anvende den for S. aureus kendte procedure som beskrevet i Kondo, I. og Fujice, K. (1977),

Infect. Immun., 18, 266-272. I overensstemmelse med denne kendte procedure fremstilles således opvarmet plasma-agarmedium, og mikroorganismen, som skal testes, udplettes derpå og dyrkes i et givet tidsrum til under-25 søgelse af den fibrinolytiske aktivitet. En mikroorganisme med evne til fibrinolyse danner transparente lytiske haloér omkring dens kolonier, hvorfra den ønskede mikroorganisme kan isoleres. På denne måde kan den ønskede SAK-producerende E. coli isoleres. Analysen af den SAK-gen-bærende DNA fra den SAK-producerende E. coli kan udføres på følgende måde.

30 Rekombinantplasmidet eller rekombinantphagen adskilles fra den SAK-producerende E. coli og fordøjes med samme restriktionsenzym eller -enzymer som anvendt til fordøjelse af phag-DNA'en og til spaltning af vektor-DNA'en. Molekylvægtene (dvs. DNA-længderne) af de resulterende DNA-frag-menter måles på kendt måde, f.eks. ved agarosegelelektroforese, hvorved 35 det er muligt at lokalisere det SAK-gen-bærende DNA-fragment.

Et eksempel på en sådan analyse er vist nedenfor.

DK 164001 B

5

Analyseeksempel: S^C DNA anvendtes som phag-DNA. Den konstateredes at besidde genetisk information til produktion af SAK: (1) ved fordøjelse med restriktionsenzym Pst I inden for segmentet 5 på 15,8 kb; (2) ved fordøjelse med restriktionsenzym Hind III inden for segmentet på 4,9 kb; (3) ved fordøjelse med restriktionsenzymer Hind III og Ava II inden for segmentet på 2,0 kb, og 10 (4) ved fordøjelse med restriktionsenzymer Ava II og Acc I inden for segmentet på 1,3 kb.

Den ved hjælp af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde opnåede SAK-producerende E. coli har samme mi krobiolog i ske egenskaber som den oprindelige E. coli, bortset fra, at førstnævnte E. coli har evne til produk-15 tion af SAK. Nogle af de almene mi krobiologi ske egenskaber bestemt med de i de følgende eksempler opnåede E. coli stammer er vist i følgende tabel.

DK 164001 B

6

TABEL

5 Hi krobi ologi ske egenskaber af E. coli stammer, som er bibragt evne _til fremstilling af SAK samt af E. coli værten_

Stamme

* ** *** ABC

10

Negativ Negativ Negativ Gram's farvning og morfologi bacillus bacillus bacillus

Katalase-produktion +++

Oxidase-produktion -

15 OF-test F F F

Syreproduktion fra glukose + + +

Gasudvikling fra glukose + + +

Nitrat reduktionsevne + + +

Phenyl alanin-deaminase-aktivitet - 20 Lysin-decarboxylase-aktivitet ...

Ornithin-decarboxylase-aktivitet -

Urease-aktivitet - - -

Hydrogensulfiddannelse ...

Indoldannelse + + + 25 ONPG-dekomponeringsevne - - - DNA-dekomponeringsaktivitet - - -

Citrat-assimi1erbarhed

Maronat-assimilerbarhed -

Syredannelse fra saccharider 30 fra lactose - fra arabinose + + + fra inositol - fra rhamnose + + + •k _ _ 35 A betegner E. coli K12 C600 r»m„

&& l\ IX

B betegner E. coli K12 C600 r^ (pSAK-HP2) (ATCC nr.

39179) *** _ _ C betegner E. coli K12 C600 r^ (pSAK 361)

DK 164001 B

7 I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse tilvejebringes en industrielt fordelagtig fremgangsmåde til fremstilling af SAK, som omfatter dyrkning af den hidtil ukendte E. coli, som er opnået på den foran beskrevne måde, og opsamling af SAK, som er akkumuleret i de 5 dyrkede celler.

Fremgangsmåden til fremstilling af SAK i overensstemmi se med den foreliggende opfindelse udføres ved på konventionel måde at dyrke den på den ovenfor beskrevne måde opnåede SAK-producerende E. coli, udvinding af de dyrkede celler og dernæst opsamling af den periplasmiske fraktion, 10 hvorfra det meste af substansen med SAK-aktivitet opnås. Opsamlingen af den periplasmiske fraktion kan udføres på i og for sig kendt måde (se f.eks. Talmadge, K. et al., (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 77, 3369-3373). Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er hidtil ukendt og effektiv og adskiller sig fra hidtil kendte fremgangsmåder med S. aureus, 15 hvor kulturens supernatant opsamles. Det er således blevet muligt at udvinde SAK som produkt fra det periplasmiske område for første gang ved hjælp af fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, hvor SAK fremstilles ved hjælp af E. coli. Dette udgør en af de karakteristiske fordele ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

20 Rensning af den således opnåede SAK kan udføres på konventionel måde for rensning af proteiner, for eksempel ved udsaltning, gel-filtrering eller adsorptionschromatografi.

I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, som har gjort det muligt for E. coli at producere SAK, frem-25 bydes således mange enestående fordele i forhold til den kendte teknik med S. aureus, i mange henseender, såsom sikkerhed, dyrkningshastighed og egnethed til massedyrkning (dvs. masseproduktion). Andre enestående fordele, der alle hidrører fra den kendsgerning, at SAK akkumulerer i det periplasmiske område, er, at SAK opnås i mere end hundrede gange 30 højere koncentrationer end i tilfælde af den kendte teknik med S. aureus, hvor SAK opnås fra en supernatantfraktion, samt ved at isoleringen og rensningen af SAK kan udføres nemmere ved fremgangsmåden, som omfatter ekstraktion fra den periplasmiske fraktion, end ved fremgangsmåden, som involverer knusning af hele celler efterfulgt af ekstraktion, 35 på grund af mindre indhold af proteinholdige forureninger.

Det ovennævnte fænomen med SAK-akkumulering i det periplasmiske område kan påvises ved hjælp af følgende eksempel. E.coli stammen, E. coli K12 C600 r^ (pSAK 361), som opnåedes i eksempel 1 nedenfor,

DK 164001 B

8 dyrkedes ved 37°C i 5 timer i 200 ml L-substrat bestående af 1% poly-pepton, 0,5% gærekstrakt og 0,5% NaCl. Fordelingen og SAK-aktivitets-forholdet er vist nedenfor.

5 Total aktivitet (u) %

Supernatantfraktion 950 23

Peripi asmisk fraktion 2400 58

Cytoplasmisk fraktion 800 19 10 Dette.resultat viser, at ca. 60% af SAK er til stede i den peri-plasmi ske fraktion.

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1 15 I dette eksempel anvendtes SØC som DNA-donor, pBR 322 som vektor-DNA, Hind III som restriktionsenzym og E. coli K12 C600 r^m^ eller C. coli K12 WA802 r^mj£ som E. coli vært-stamme.

(A) Fremstilling og fordøjelse af SøC DNA

Phag SøC dyrkedes i overensstemmelse med den fremgangmåde, 20 som er beskrevet i Blair, J.E. og Williams, R.E.O. (1961), Bull.

W.H.O., 24, 771-784. Til 1 liter af det resulterende phag-lysat sattes 100 ml 5M-NaCl og dernæst 300 ml 30% (vægt/vægt) polyethylen-glycol. Blandingen omrørtes grundigt og henstod ved 0°C i adskillige timer. Dernæst underkastedes blandingen centrifugering ved 25 10.000 opm i 15 minutter til opnåelse af et bundfald. Bundfaldet opløstes i 20 ml puffer (pH 7,4) indeholdende 10 nM Tris. HC1, 10 nM MgSO^, 5 mM CaClg og 0,01% gelatine. Til den resulterende opløsning sattes DNase og RNase på en sådan måde, at siutkoncentrationen af hvert enzym blev 1 øg/ml. Reaktionen udførtes ved 37°C i 30 20 minutter. Efter reaktionen centrifugeredes blandingen ved 10.000 opm i 10 minutter og supernatanten centrifugeredes yderligere ved 30.000 opm i 60 minutter. Det herved afsatte bundfald opløstes i 2,5 ml af den ovenfor beskrevne puffer. Ca. 1,7 g cæsiumchlorid sattes til opløsningen og blandingen underkastedes ligevægts-densitet-35 gradient-centrifugering ved 27.000 opm i 18 timer. Det således opnåede phag-bånd separeredes og dialyseredes over for 1 liter af den ovenfor beskrevne puffer. Til 0,5 ml af den dialyserede phag-suspension sattes 50 μΐ 1,5 M NaCl - 0,15 H natriumcitrat, 5 μ! 250

DK 164001 B

9 mM di natri umsalt af EDTA (pH 7,0) og 5 /il 10% SDS. Efter henstand af blandingen ved 37°C i 5 minutter tilsattes 0,6 ml phenol mættet med 0,15 M NaCl - 15 nM natriumcitratopløsning, og den resulterende blanding omrørtes forsigtigt ved stuetemperatur i ca. 10 min.

5 Dernæst underkastedes blandingen centrifugering ved 3.000 opm i 10 minutter til opsamling af den øvre fase (dvs. vandige fase). Den vandige fase underkastedes den ovenfor beskrevne phenol behandling og vaskedes dernæst tre gange med lige store voluminer ether. Den resulterende vandige fase dialyseredes tre gange over for 200 ml 10 0,15 M NaCl - 15 mM natriumcitrat - 1 mM dinatriumsalt af EDTA.

Fordøjelse af den således opnåede phag-DNA udførtes som følger. Tre enheder af Hind III sattes til 1 μg af DNA'en og reaktionen udførtes ved 37°C i 3 timer i 20 μΐ af en puffer indeholdende 10 mM Tri s.Hel - 7 mM MgClg - 7 mM Ø-mercaptoethanol - 50 mM 15 NaCl (pH 7,6). Ved reaktionens afslutning sattes 250 mM dinatriumsalt af EDTA (pH 8,0) til reaktionsblandingen.

(B) Spaltning af plasmid pBR 322

En enhed Hind III sattes til 1 /ig pBR 322 og omsætningen udførtes ved 37°C i 3 timer i 20 μΐ af samme puffer som anvendt til 20 fordøjelsen af phag-DNA'en. Ved reaktionens afslutning sattes 1 μΐ 250 mM dinatriumsalt af EDTA (pH 8,0) til reaktionsblandingen.

(C) Splejsning 5 μΐ 1,5 M natriumacetat (pH 7,0) sattes til 20 μΐ af hver af de under (A) og (B) ovenfor fremstillede restriktionsenzymbehandlede 25 DNA-opløsninger. Hver blanding tilsattes 75 μΐ 95% ethanol, henstod ved -70°C i 10 minutter og underkastedes centrifugering ved 12.000 opm i 5 minutter. Hvert bundfald opsamledes, vaskedes igen med 95% ethanol, tørredes dernæst under reduceret tryk og opløstes i 10 μΐ 10 mM tris.HCl - 1 mM dinatriumsalt af EDTA (pH 8,0; herefter 30 omtalt som TE-puffer).

Splejsning udførtes enten ved 4°C i 48 timer eller 20°C i adskillige timer i 20 μΐ af en blanding indeholdende den fordøjede pBR 322 DNA (50 ng som pBR 322 DNA), der var opnået under (B), den spaltede SØC DNA (1,5 pg som SøC DNA), der var opnået under (A), 30 mM Tris-HCl (pH 7,6), 35 10 mM MgClg» 10 mM dithiothreitol, 0,1 mM ATP og 0,1 enhed T4-ligase. En μΐ 0,25 M dinatriumsalt af EDTA (pH 8,0) sattes til reaktionsblandingen til afslutning af reaktionen. Reaktionsblandingen opvarmedes ved 65°C i 5 minutter til inaktivering af ligasen og opbevaredes ved -20°C efter

DK 164001B

10 tilsætning af 180 /il TE-puffer.

(D) Indføring af rekombinantplasmid i E. coli

Hver E. coli stamme podedes i 10 ml L-substrat (pH 7,0) bestående af 1% polypepton, 0,5% gærekstrakt og 0,5% NaCl, og dyrke- O rt 5 des til 5 x 10 celler/ml. Blandingen centrifugeredes ved 4 C til opsamling af cellerne. Cellerne suspenderedes i 5 ml afkølet 50 mM CaClg og henstod 5 minutter på is-vandbad. Suspensionen centrifugeredes dernæst igen til opsamling af cellerne. Cellerne suspenderedes i 0,67 ml afkølet 50 mM CaClg og suspensionen henstod i 5 mi- 10 nutter på is-vandbad. E. coli suspensionen blandedes med 0,33 ml af en opløsning af den under (C) ovenfor fremstillede splejsede plasmid-DNA og blandingen holdtes i 5 minutter på is-vandbad. Reaktionsblandingen holdtes ved 42°C i 2 minutter til afslutning af indføringen af rekombinantplasmidet i E. coli. Den resulterende sus- 15 pension blev enten som sådan eller efter fortynding ti eller hundrede gange udstrøget på et L-substrat agarmedium indeholdende 40 øg/ml ampicillin. Mediet inkuberedes natten over ved 37°C til vækst af E. coli transformanter, som havde opnået resistens mod ampicillin.

(E) Selektiv adskillelse af SAK-producerende E. coli 20 Portioner på 5 ml human plasma fyldtes på reagensglas og opvarmedes ved 56°C i 20 minutter. Separat fyldtes portioner på 10 ml hver af forflydiget 2% agarholdigt næringsagarmedium i reagensglas og holdtes opvarmet ved 56°C. Disse to præparater blandedes hurtigt sammen i petri-skåle og henstod indtil blandingen størknede.

25 Portioner af prøvesuspensioner af de under (D) ovenfor opnåede E. coli celler udplettedes på det således fremstillede agarmedium og inkuberedes ved 37°C. Der iagttoges kolonier, omkring hvilke der fremtrådte transparente fibrinolytiske haloér. Udseendet betyder, at koloniernes mikroorganisme har evne til SAK-produktion.

30 E. coli stammerne, der danner sådanne kolonier, er hidtil ukendte E. coli, der kan anvendes ved fremstilling af staphylokinase. En af de opnåede hidtil ukendte stammer betegnes E. coli K12 C600 r^m^(pSAK 361) og en anden E. coli K12 WA802 r^m£ (pSAK 361) (ATCC nr. 39178), svarende til den respektive E. coli værtstamme.

35 (F) Analyse af E. coli plasmid

De således opnåede E. coli celler af hver stamme dyrkedes ved 37°C i 400 ml L-substrat, som indeholdt 40 /zg/ml ampicillin, men in- o gen glucose, til ca. 4 x 10 celler/ml. På dette punkt suppleredes

DK 164001 B

11 kulturen med chloramphenicol på en sådan måde, at koncentrationen af sidstnævnte blev 150 /zg/ml, og underkastedes dernæst yderligere dyrkning ved 37°C i 15 timer efterfulgt af centrifugering til opsamling af celler. Cellerne vaskedes i 50 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) - 0,015 M 5 NaCl - 1,5 mM natriumcitrat, og suspenderedes dernæst i 3,2 ml 25% saccharose - 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Suspensionen tilsattes 1,6 ml 250 mM dinatriumsalt af EDTA (pH 8,0), 1 ml 5 mg/ml lysozym og 6 ml 2% "Brij-58" (KAO-ATLAS Co., Ltd.) - 62,5 mM dinatriumsalt af EDTA - 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), og inkuberedes ved 30°C i 15 minutter til mild lysis 10 af cellevæggene. Blandingen underkastedes "high speed" centrifugering (30.000 opm) ved 4°C i 30 minutter til fældning af cellerne. Superna-tanten underkastedes CsCl-ethidiumbromid ligevægts-densitets-gradient-centrifugering (36.000 opm) ved 10°C i 48 timer til rensning af plasmid-DNA'en. Den resulterende plasmid-DNA fordøjedes med Hind III i overens-15 stemmel se med den under (B) ovenfor beskrevne procedure. Længden af den SAK-genbærende DNA bestemtes til 4,9 kb efter måling ved hjælp af agarosegel-elektroforese under anvendelse af 1% agarose.

(G) Adskillelse af 4,9 kb fragment 100 ftg SøC fordøjedes ved omsætning af samme ved 37°C i 20 timer 20 med en blanding indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 7 mM MgC^» 7 mM Ø-mercaptoethanol, 50 mM NaCl og 100 enheder Hind III. Reaktionsblandingen underkastedes agarosegel-elektroforese under anvendelse af 1% agarose. DNA farvedes med ethidiumbromid og kun det ønskede område af gelen, dvs. området indeholdende 4,9 kb DNA-fragmentet, blev udskåret.

25 4,9 kb DNA-fragmentet elueredes elektroforetisk fra en agarosegel til et dialyse-rørsystem. DNA-eluatet behandledes med TE-puffer-mættet phenol og den vandige fase behandledes først med ether og dernæst med ethanol til fældning af DNA. Den resulterende DNA er klar til brug til splejsning med vektor-DNA'er.

30 (H) Fremstilling, ekstraktion og rensning af SAK

De ovenfor opnåede SAK-producerende E. coli celler podedes i 50 ml L-substrat indeholdende 1% polypepton, 0,5% gærekstrakt, 0,5% NaCl og 0,1% glucose (pH 7,0), og underkastedes rystedyrkning natten over ved 37°C. Den resulterende kultur podedes i 5 liter af det ovenfor anvendte 35 substrat og underkastedes rystedyrkning ved 37°C i 12 timer. Dernæst centri fugeredes kulturen til opsamling af celler. Cellerne suspenderedes i 200 ml 100 mM Tris-HCl - 20% saccharose (pH 8,0) og suspensionen centrifugeredes igen til opsamling af celler. Cellerne resuspenderedes i 45

DK 164001 B

12 ml 100 mM Tris-HCl - 20% saccharose (pH 8,0) og suspensionen tilsattes 5 ml af en lysozymopløsning (5 mg/ml lysozym i 20 mM di natriumsalt af EDTA, pH 8,0), og henstod dernæst i is-vandbad i 1 time. Blandingen centrifugeredes til opsamling af supernatanten. Til supernatanten sattes 5 ammoniumsulfat til 80% mætning. Blandingen henstod natten over ved 4°C og centrifugeredes dernæst til opsamling af bundfaldet. Bundfaldet opløstes i 10 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og dialyseredes over for samme puffer. Dialysatet underkastedes "Sephadex G-75" gel-chromatografi og elueredes med 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) til opsamling af fraktioner med 10 SAK-aktivitet. De således opsamlede fraktioner adsorberedes på en kolonne af CM-cellulose ækvilibreret med 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), og underkastedes lineær gradient-eluering med 0 - 0,5 M NaCl. Fraktioner med SAK-aktivitet opsamledes og elueredes med 0,3 - 0,32 M NaCl.

15 Eksempel 2 I dette eksempel anvendtes SøC som DNA-donor, Hind III og Pst I som restriktionsenzymer til fordøjelse af SøC, pBR 322 som vektor-DNA, EcoR I og Pst I som restriktionsenzymerne til fordøjelse af pBR 322, og E. coli K12 C600 rj^ og E. coli K12 WA802 r^m£ som E. coli 20 stammerne.

(A) Fordøjelse af phag S#C DNA

Under anvendelse af de i eksempel 1 (A) til (F) beskrevne procedurer isoleredes 4,9 kb fragment opnået ved fordøjelse af S^C DNA med Hind III. De enkeltstrengede dele, som var til stede ved begge termini af 25 fragmentet og som hver bestod af fire baser, modificeredes til dobbeltstrengede ved omsætning af fragmentet ved 18°C i 4 timer med 1 enhed T4 DNA polymerase og 4 typer dioxyribonucleosid-triphosphater (25 juM hver) i 20 /ti puffer indeholdende 67 mM Tris-HCl (pH 8,0), 6,7 mM MgClg og 6,7 mM /3-mercaptoethanol. Til reaktionsblandingen sattes 5 /ti 1,5 M natrium-30 acetat (pH 7,0) og 75 /ti ethanol. Blandingen holdtes ved -70°C i 10 minutter og underkastedes dernæst centrifugering ved 12.000 opm i 5 minutter. Bundfaldet vaskedes med ethanol og opløstes i en puffer indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,6) - 7 mM MgClg - 7 mM /J-mercaptoethanol -50 mM NaCl. Til opløsningen sattes 0,5 enhed Pst I og omsætningen udfør-35 tes ved 37°C i 3 timer til yderligere fordøjelse af fragmentet til to segmenter, der var klar til brug ved splejsning under (C) nedenfor.

(B) Spaltning af plasmid pBR 322

En enhed EcoR I sattes til 1 øg pBR 322 DNA og reaktionen udførtes 13

DK 164001 B

på samme måde som i eksempel 1 (B) til udførelse af spaltning. De enkeltstrengede dele, der var til stede ved begge termini af den spaltede DNA og som bestod af fire baser, modificeredes til dobbeltstrenge på samme måde som under (A) ovenfor under anvendelse af T4 DNA polyme-5 rase og fire typer deoxyribonucleosid-triphosphater. Den resulterende fuldt dobbeltstrengede DNA fordøjedes med PstI på samme måde som under (A) ovenfor. De fordøjede produkter var klar til anvendelse ved splejsning under (C) nedenfor.

(C) Splejsning 10 DNA-fragmenterne fra SøC DNA og plasmid pBR 322 blandedes sammen og underkastedes splejsning på samme måde som i eksempel 1 (C), bortset fra, at mængden af anvendt T4 DNA ligase var 1 enhed.

(D) Dernæst fulgtes de samme procedurer som i eksempel 1 til opnåelse af to hidtil ukendte E. coli stammer, der betegnedes E. coli K12 C600 15 r^m" (pSAK-HP2) (ATCC nr. 39179) og E. coli K12 WA802 r^m£ (pSAK-HP2). Plasmidanalyse viste, at plasmiderne i hver af E. coli stammerne indeholdt SøC-afledt genetisk information, kodende for SAK, med en længde på 2,5 kb.

20 Eksempel 3 I dette eksempel anvendtes Pøl som DNA-donor, pBR 322 som vektor,

Hind III som restriktionsenzym og E. coli K12 C600 r^ny som E. coli stamme.

(A) Fremstilling og fordøjelse med Hind III af phag Pøl DNA, samt 25 fordøjelse af vektor-DNA udførtes på samme måde som i eksempel 1.

(B) Splejsningsreaktion, indføring i E. coli og udvælgelse af rekom-binant E. coli celler udførtes på samme måde som i eksempel 1.

(C) Som følge af disse operationer blev DNA-segmentet, som bar genetisk information til SAK-produktion, afledt af Pøl, heldigt ind- 30 ført i E. coli stammen. Den resulterende hidtil ukendte E. coli stamme betegnedes E. coli K12 C600 r£m£ (pSAK 601).

35

Claims (6)

1. Rekombinant-DNA, der kan udtrykke staphylokinase og er afledt 5 fra en temperat phag af Staphylococcus aureus, KENDETEGNET ved, AT den opnås ved, at man 1. fordøjer en temperat phag-DNA, isoleret fra Staphylococcus aureus, valgt blandt 42D DNA, L42E DNA, 77 DNA, Pøl DNA, Pø2 DNA, TØ-42D DNA, Pø-406 DNA, Røl9 DNA og SøC DNA, med ét eller flere restrik- 10 tionsenzymer, der er valgt blandt Hindlll, PstI, AccI, Avail, EcoRI, Hpal, Hpall, Hindil, SstI, Cl al, BstEII, Sstll, Xhol, Bell, Bglll, PvuII, Xorll, Kpnl, Smal og Xbal, 2. og om ønsket isolerer DNA-fragmentet, der bærer genet, som koder for staphylokinase, 15 3) spalter en vektor-DNA med ét eller flere restriktionsenzymer, og 4. indfører det i trin 1) eller 2) opnåede fragment på spaltningsstedet for den i trin 3) opnåede vektor-DNA, idet vektor-DNA'en er udvalgt fra gruppen omfattende Col El, pMB 9, pSC 101 og pl5A og 20 derivater deraf, såsom pBR 322 og pACYC 184, samt Charon-vektorer afledt af λ-phag.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en rekombinant-DNA ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, AT man 1. fordøjer en temperat phag-DNA, isoleret fra Staphylococcus aureus, 25 valgt blandt 42D DNA, L42E DNA, 77 DNA, Pøl DNA, Pø2 DNA, TØ-42D DNA, PØ-406 DNA, R019 DNA og SøC DNA, med ét eller flere restriktionsenzymer, der er valgt blandt Hindlll, PstI, AccI, Avail, EcoRI, Hpal, Hpall, Hindll, SstI, Clal, BstEII, Sstll, Xhol, Bell, Bglll, PvuII, Xorll, Kpnl, Smal og Xbal, 30 2) og om ønsket isolerer DNA-fragmentet, der bærer genet, som koder for staphylokinase, 3. spalter en vektor-DNA med ét eller flere restriktionsenzymer, og 4. indfører det i trin 1) eller 2) opnåede fragment på spaltnings- 35 stedet for den i trin 3) opnåede vektor-DNA, idet vektor-DNA'en er udvalgt fra gruppen omfattende Col El, pMB 9, pSC 101 og pl5A og derivater deraf, såsom pBR 322 og pACYC 184, samt Charon-vektorer afledt af λ-phag. DK 164001B 15

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, AT vektor-DNA'en er pBR 322.

4. Fremgangmåde til fremstilling af staphylokinase, KENDETEGNET ved, AT man dyrker en coliform bacillus, hvori der er indført en 5 rekombinant-DNA ifølge krav 1, og opsamler staphylokinase akkumuleret i de dyrkede celler.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, KENDETEGNET ved, AT den coliforme bacillus er Escherichia col i.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4 eller 5, KENDETEGNET ved, AT 10 staphylokinasen opsamles fra cellernes periplasmiske område. 15