CN117882801B - 一种复合发酵剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种复合发酵剂及其应用，涉及微生物发酵工程技术领域。复合发酵剂由N‑乙酰氨基葡萄糖、植物提取物、蛋白酶和复合菌液组成；所述植物提取物由迷迭香提取物和紫苏籽提取物复配而成，复合菌液由地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌复配而成。使用本发明的复合发酵剂发酵制备青贮饲料，可以减少青贮饲料受到霉菌的污染程度，提高其发酵品质。

Description

一种复合发酵剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程技术领域，具体涉及一种复合发酵剂及其应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）是一种被广泛应用的重要多功能单糖，N-乙酰氨基葡萄糖作为自然界第二大天然多糖几丁质的基本组成单位，具有较强的还原性，其不仅是合成双歧因子的重要前提，还在生物体内作为多糖透明质酸、肝素和硫酸角质素的重要组成部分之一，维持着生物体正常的生理功能，在生物体正常生长代谢中起着重要作用。现有技术中，N-乙酰氨基葡萄糖在医药保健、饲料、食品和化妆品领域中都具有广阔的前景。

植物提取物，主要为单萜、倍单萜类化合物和多种含生物活性的苯丙类化合物组成，通常由植物的根、皮、枝、叶、种子或果实提炼而得，具有可挥发性和抗水解性的特点。植物提取物的种类和成分含量较为复杂，具有多样性，这是因为，自然界中不同植物的不同部位所含有的植物精油成分，在种类、数量或提取方法上均有差异。目前已知的植物提取物已超三千多种，且数量还在增加。现有技术中，植物提取物已经广泛运用于食用香料、日用化工、化医药产品和饲料添加剂等领域。在饲料添加剂方面，植物提取物与其他饲料添加剂相比，具有以下优点：第一，植物提取物不仅能够调节机体的生理机能，促进新陈代谢，而且具有清热解毒、抗菌、消炎、驱虫等作用，从而达到促进生长，防病治病的目的；第二，能够改善动物机体的免疫体状态，憎强免疫力；第三，天然草本植物还具有低毒性。无抗药性。无残留等特点，能够改善禽畜肉、蛋、奶的质量，且禽畜长期食用也不会致癌、畸变或性早熟；最后，草本植物资源丰富，取材方便，易于推广。

青贮饲料由含水分多的植物性饲料经过密封、发酵后而成，主要用于喂养反刍动物。青贮饲料比新鲜饲料耐储存，营养成分强于干饲料。此外，青贮饲料储存占地少，节省空间。因此，青贮饲料已得到广泛运用。

青贮饲料的原理，即是在密封状态下，利用乳酸菌的发酵作用，产生大量乳酸，使饲料呈酸性，从而抑制有害菌生长，达到长期保存青贮饲料营养特性。因此，拥有较高乳酸含量，且pH相对较低的青贮饲料具有较高的发酵品质。此外，乙酸、丙酸、丁酸和氨态氮的含量也是评价青贮饲料发酵品质的重要标准。乙酸与丙酸能够抑制青贮饲料中好氧菌、酵母菌以及其它致病微生物的增殖，因此，适量的乙酸和丙酸能够保饲料的品质；品质良好的青贮饲料中不应检测出丁酸，因为丁酸的出现意味着梭菌的代谢，会导致严重的干物质和能量损失；氨态氮是蛋白质降解的副产物，氨态氮的含量越高，说明较多的蛋白质和氨基酸被分解，引起梭菌发酵，意味着青贮饲料品质不佳。现有技术中，青贮饲料在制作、储存和使用过程中容易受到霉菌毒素的污染，对动物和人类健康带来危害，因此，为避免霉菌污染，人们会向饲料中添加防霉剂，但是防霉剂需大量使用，增加了成本，且防霉剂对禽畜肠胃的刺激性也较大，适口性差。因此，如何避免青贮饲料的污染，提高其发酵品质已经成为行业研究的一个热点。发明专利CN111903844B公开了一种提高青贮饲料发酵品质的方法及其制得的饲料，该发明提高青贮饲料发酵品质的方法为：在青贮原料中添加褪黑素进行发酵，可以显著降低青贮饲料pH值、丙酸和丁酸含量，显著提高乳酸、总酸含量。目前，尚未有使用N-乙酰氨基葡萄糖、迷迭香提取物和紫苏籽提取物复配制得发酵剂，从而提高青贮饲料发酵品质的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种复合发酵剂及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种复合发酵剂，所述复合发酵剂由N-乙酰氨基葡萄糖、植物提取物、蛋白酶和复合菌液按照重量比（0.5-2）：（18-22）：（2-5）：（9-15）的比例组成；

所述植物提取物由迷迭香提取物和紫苏籽提取物按照重量比为（1-2）：（1.5-3）的比例复配而成，复合菌液由地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌按照重量比为1:（1-1.2）的比例复配而成。

优选的，所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种。

优选的，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC AB 2010437，所述乳酸片球菌的保藏编号为CCTCC AB 204055。

优选的，所述迷迭香提取物由如下方法制备：

取新鲜的迷迭香叶于-10℃冷冻6h，冷冻结束后粉碎过筛，得到迷迭香叶粉末，向迷迭香叶粉末中加入10重量倍的超纯水，在110℃条件下煎煮1h，冷却后过滤、收集滤液，即得到迷迭香提取物。

优选的，所述紫苏籽提取物由如下方法制备：

向紫苏籽中加入10-12重量倍、体积分数60%的乙醇，加热至80-100℃回流提取40-60min，冷却后过滤，收集滤液，即得紫苏籽提取物。

优选的，所述复合发酵剂中，地衣芽孢杆菌的活菌数为（1-1.5）×10⁹CFU/g，乳酸片球菌的活菌数为（0.5-2）×10⁹CFU/g。

本发明的第二方面，提供上述复合发酵剂在提高饲料发酵品质中的应用。

优选的，所述饲料为青贮饲料。

本发明的有益效果：

（1）本发明选用N-乙酰氨基葡萄糖、植物提取物、蛋白酶和复合菌液复配得到复合发酵剂，其中N-乙酰氨基葡萄和植物提取物能够为复合菌液提供充足的营养物质，提高发酵剂的生物活性，同时，植物提取物所选用的紫苏籽提取物和迷迭香提取物均具有较高的抗氧化性，能够减少饲料有氧暴露后的腐烂、发霉程度，抑制霉菌的增殖；复合菌液中的地衣芽孢杆菌具有较高的酶活性，能够与蛋白酶相配合，充分分解饲料中的营养物质，减少有害菌种对蛋白质、氨基酸的利用，从而降低青贮饲料中氨态氮的含量，同时，地衣芽孢杆菌自身也具有抑制微生物腐败和霉菌毒素产生的功能，进一步减少了青贮饲料中霉菌污染的程度。

（2）使用本发明所提供的复合发酵剂发酵制备青贮饲料，各组分之间相互配合，协同作用，可以减少青贮饲料受到霉菌的污染程度，提高其发酵品质。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

如前所述，现有技术中，青贮饲料具有防止营养价值损失的优点，且能够保存一年甚至更长时间，可确保反刍家畜的持续饲料供应，是较为理想的饲料种类之一。但是，青贮饲料在制备、使用过程中均容易受到霉菌毒素的污染，特别是在制备完成后，暴露在空气中，更加容易导致饲料的腐败变质，这不仅造成了营养物质的严重损失，而且降低了青贮饲料的适口性，更甚者会导致家畜的疾病或死亡。

针对上述问题，本发明的目的是提供一种复合发酵剂及其应用。该复合发酵剂由N-乙酰氨基葡萄糖、植物提取物、蛋白酶和复合菌液复配而得。本发明选用地衣芽孢杆菌与乳酸片球菌组成复合菌液，其中，地衣芽孢杆菌具有较强的酶活性，能够促进饲料中营养成分的降解，增强饲料的发酵品质，同时，地衣芽孢杆菌能够产生3-甲基-1-丁醇等挥发有机化合物，从而对曲霉和青霉等产毒菌株起到拮抗作用，抑制饲料中的霉菌污染；N-乙酰氨基葡萄糖作为一种营养物质，能够为菌液的发酵提供碳源、氮源以及能量，从而提高发酵的质量和效率；紫苏籽提取物与迷迭香提取物作为植物提取，均有较强的抗氧化性，能够在提高菌株生物活性的同时，也能抑制饲料在使用时发霉、腐烂等现象的出现；木瓜蛋白酶则能够与复合菌液相配合，充分分解饲料中的营养成分，在提高饲料中营养物质和发酵品质的同时，抑制其他有害菌如种对蛋白质、氨基酸等物质的分解，从而减少青贮饲料中氨态氮的含量。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

以下各实施例和对比例中，所用地衣芽孢杆菌购自中国典型培养物保藏中心，菌株编号为CCTCC AB 2010437；乳酸片球菌购自中国典型培养物保藏中心，菌株编号为CCTCCAB 204055;木瓜蛋白酶购自上海源叶生物科技公司，货号为S10011-25g；菠萝蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，货号为S10009-25g；胰蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，货号为S10032-25g。

实施例1：复合发酵剂的制备。

（1）植物提取物的制备：

取新鲜的迷迭香叶于-10℃冷冻6h，冷冻结束后粉碎过筛，得到迷迭香叶粉末，向迷迭香叶粉末中加入10重量倍的超纯水，在100℃条件下煎煮1h，最后过滤、收集滤液，即得到迷迭香提取物；

向紫苏籽中加入10重量倍、体积分数60%的乙醇，加热至80℃回流提取40min，冷却后过滤，收集滤液，即得紫苏籽提取物；

将迷迭香提取物与紫苏籽提取物按照重量比1：1.5的比例混合即得植物提取物。

（2）将地衣芽孢杆菌菌液和乳酸片球菌菌液按照重量比1：1的比例混合得到复合菌液，然后将N-乙酰氨基葡萄糖、植物提取物、木瓜蛋白酶和复合菌液按照0.5：18：2：9的比例混合得到复合发酵剂。

经测定，本实施例中，复合发酵剂的地衣芽孢杆菌的活菌数为1×10⁹CFU/g，乳酸片球菌的活菌数为0.5×10⁹CFU/g。

实施例2：复合发酵剂的制备。

（1）植物提取物的制备：

取新鲜的迷迭香叶于-10℃冷冻6h，冷冻结束后粉碎过筛，得到迷迭香叶粉末，向迷迭香叶粉末中加入12重量倍的超纯水，在105℃条件下煎煮1.5h，最后过滤、收集滤液，即得到迷迭香提取物；

向紫苏籽中加入11重量倍、体积分数60%的乙醇，加热至90℃回流提取50min，冷却后过滤，收集滤液，即得紫苏籽提取物；

将迷迭香提取物与紫苏籽提取物按照重量比1.5：2的比例混合即得植物提取物。

（2）将地衣芽孢杆菌菌液和乳酸片球菌菌液按照重量比1：1.1的比例混合得到复合菌液，然后将N-乙酰氨基葡萄糖、植物提取物、菠萝蛋白和复合菌液按照1：20：3：10的比例混合得到复合发酵剂。

经测定，本实施例中，复合发酵剂的复合菌液中地衣芽孢杆菌的活菌数为1.3×10⁹CFU/g，乳酸片球菌的活菌数为1×10⁹CFU/g。

实施例3：复合发酵剂的制备。

（1）植物提取物的制备：

取新鲜的迷迭香叶于-10℃冷冻6h，冷冻结束后粉碎过筛，得到迷迭香叶粉末，向迷迭香叶粉末中加入15重量倍的超纯水，在110℃条件下煎煮2h，最后过滤、收集滤液，即得到迷迭香提取物；

向紫苏籽中加入12重量倍、体积分数60%的乙醇，加热至100℃回流提取60min，冷却后过滤，收集滤液，即得紫苏籽提取物；

将迷迭香提取物与紫苏籽提取物按照重量比2： 3的比例混合即得植物提取物。

（2）将地衣芽孢杆菌菌液和乳酸片球菌菌液按照重量比1： 1.2的比例混合得到复合菌液，然后将N-乙酰氨基葡萄糖、植物提取物、酶胰蛋白酶和复合菌液按照2： 22： 5： 15的比例混合得到复合发酵剂。

经测定，本实施例中，复合发酵剂的复合菌液中地衣芽孢杆菌的活菌数为1.5×10⁹CFU/g，乳酸片球菌的活菌数为2×10⁹CFU/g。

对比例1：

按照实施例1的步骤制备复合发酵剂，区别在于，本对比例中仅包含复合菌液和植物提取物，并使本对比例中复合发酵剂的活菌数与实施例1中复合发酵剂的活菌数保持一致。

对比例2：

按照实施例1的步骤制备复合发酵剂，区别在于，本对比例中仅包含N-乙酰氨基葡萄糖和复合菌液，并使本对比例中复合发酵剂的活菌数与实施例1中复合发酵剂的活菌数保持一致。

对比例3：

按照实施例1的步骤制备复合发酵剂，区别在于，本对比例中仅包含复合菌液和木瓜蛋白酶，并使本对比例中复合发酵剂的活菌数与实施例1中复合发酵剂的活菌数保持一致。

对比例4：

本对比例中仅含有复合菌液，并使本对比例中复合菌液的活菌数与实施例1中复合发酵剂的活菌数保持一致。

试验例：

（1）试验方法：

刈割蜡熟期的全株玉米作为青贮原料，将全株玉米粉碎至2-3cm的小段，然后分为7个试验组，分别做如下处理：

试验组1：喷洒实施例1制备的复合发酵剂；

试验组2：喷洒实施例2制备的复合发酵剂；

试验组3：喷洒实施例3制备的复合发酵剂；

试验组4：喷洒对比例1制备的复合发酵剂；

试验组5：喷洒对比例2制备的复合发酵剂；

试验组6：喷洒对比例3制备的复合发酵剂；

试验组7：喷洒度比例4制备的复合发酵剂。

上述试验组中的全株玉米重量相同，复合发酵剂的喷洒量均为2ml/1kg。喷洒完毕后，将7个试验组分别贮藏于抽真空密封的黑色塑料袋中，外层再套一层编织袋，密度为650kg/m³，在35℃条件下发酵90d。

发酵结束后，将各试验组开袋，各取样15g，分别加入180ml蒸馏水，搅拌均匀，在4℃条件下浸提24h，再用4层纱布和定性滤纸过滤，滤除草渣制得样品浸提液。将各组浸提液立即进行pH值测定后，在-20℃条件下保存备用，用于氨态氮、乳酸和乙酸的测定。其中，pH值采用上海力辰仪器科技有限公司PH-100酸度计测量，氨态氮采用苯酚-次氯酸钠法测定，乳酸和乙酸采用高效液相色谱法测定。

（2）试验结果：

表1：青贮饲料发酵品质

由上表数据可知，试验组1-3的青贮饲料在发酵结束时，pH值、乙酸和氨态氮的含量均小于试验组4-6，乳酸和总酸的含量均高于试验组4-6，同时，试验例1-3中的丙酸含量小于0.1%，且未检测出丁酸，这说明本发明的复合发酵剂能够有效提高青贮饲料的发酵品质。同时，将试验组1与试验组4-7的数据相对比，可知本发明所采用的N-乙酰氨基葡萄糖、植物提取物和蛋白酶的组合物在提高青贮饲料发酵品质方面起到了协同作用。

试验例2：

（1）试验方法：

取试验例1中各试验组样品20g，在有氧暴露3d时，使用新加坡PriboFast霉菌毒素酶联免疫试剂盒对各样品中的黄曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEA）进行测定。

（2）试验结果：

表2：各试验组中霉菌毒素的含量（ug/kg）

由表2数据可知，试验组1-3中的玉米全株青贮饲料在有氧暴露3d时，饲料内的黄曲霉毒素B1与玉米赤霉烯酮的含量均小于试验组4-7，这说明使用本发明提供的复合发酵剂发酵而得的玉米全株青贮饲料，能够避免其制备及使用时受到霉菌毒素的污染。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种复合发酵剂，其特征在于，所述复合发酵剂由N-乙酰氨基葡萄糖、植物提取物、蛋白酶和复合菌液按照重量比（0.5-2）：（18-22）：（2-5）：（9-15）的比例组成；所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种；

所述植物提取物由迷迭香提取物和紫苏籽提取物按照重量比为（1-2）：（1.5-3）的比例复配而成，复合菌液由地衣芽孢杆菌和乳酸片球菌按照重量比为1:（1-1.2）的比例复配而成；

所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC AB 2010437，所述乳酸片球菌的保藏编号为CCTCC AB 204055；

所述迷迭香提取物由如下方法制备：取新鲜的迷迭香叶于-10℃冷冻6h，冷冻结束后粉碎过筛，得到迷迭香叶粉末，向迷迭香叶粉末中加入10-15重量倍的超纯水，在100-110℃条件下煎煮1-2h，冷却后过滤、收集滤液，即得到迷迭香提取物；

所述紫苏籽提取物由如下方法制备：向紫苏籽中加入10-12重量倍、体积分数60%的乙醇，加热至80-100℃回流提取40-60min，冷却后过滤，收集滤液，即得紫苏籽提取物。

2.根据权利要求1所述的复合发酵剂，其特征在于，所述复合发酵剂中，地衣芽孢杆菌的活菌数为（1-1.5）×10⁹CFU/g，乳酸片球菌的活菌数为（0.5-2）×10⁹CFU/g。

3.权利要求1所述的复合发酵剂在提高饲料发酵品质中的应用，所述发酵品质的指标包括：降低pH值、提高乳酸和乙酸含量、降低丙酸和丁酸以及氨态氮含量、降低黄曲霉毒素B1含量和玉米赤霉烯酮含量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述饲料为青贮饲料。