MX2014006155A - Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotdos que los codifican. - Google Patents

Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotdos que los codifican.

Info

Publication number
MX2014006155A
MX2014006155A MX2014006155A MX2014006155A MX2014006155A MX 2014006155 A MX2014006155 A MX 2014006155A MX 2014006155 A MX2014006155 A MX 2014006155A MX 2014006155 A MX2014006155 A MX 2014006155A MX 2014006155 A MX2014006155 A MX 2014006155A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
polypeptide
lysozyme
sec
activity
mature
Prior art date
Application number
MX2014006155A
Other languages
English (en)
Other versions
MX351916B (es
Inventor
Kirk Matthew Schnorr
Jens Erik Nielsen
Mikkel Klausen
Original Assignee
Novozymes As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes As filed Critical Novozymes As
Publication of MX2014006155A publication Critical patent/MX2014006155A/es
Publication of MX351916B publication Critical patent/MX351916B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/174—Vitamins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/184—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
    • A23K20/30—Oligoelements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K40/00—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs
    • A23K40/20—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs by moulding, e.g. making cakes or briquettes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K40/00—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs
    • A23K40/25—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs by extrusion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C11B1/102—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting in counter-current; utilisation of an equipment wherein the material is conveyed by a screw
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
    • Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de lisozima, y a polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La invención además se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos, al igual que a métodos para la producción y el uso de los polipéptidos.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE LISOZIMA Y POLINÜCLEOTIDOS QUE LOS CODIFICAN CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de lisozima, a dominios catalíticos y polinucleótidos que codifican los polipéptidos y los dominios catalíticos. La invención además se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos, al igual que a métodos para la producción y el uso de los polipéptidos y los dominios catalíticos .
ANTECEDENTES DE LA INVENCION La lisozima es una O-glicosil hidrolasa producida como un mecanismo de defensa contra bacterias, por muchos organismos. La enzima causa la hidrólisis de las paredes celulares bacterianas mediante la disociación de los enlaces glucosídicos del peptidoglucano, una molécula estructural importante en bacterias. Luego del debilitamiento de las paredes celulares por la acción de la lisozima, las células bacterianas se lisan, como consecuencia de la presión osmótica .
La lisozima se produce en muchos organismos, tales como virus, plantas, insectos, aves, reptiles y mamíferos. En mamíferos, la lisozima ha sido aislada de secreciones Ref. 248418 nasales, saliva, lágrimas, intestinos, orina y leche. La enzima disocia el enlace glucosídico entre el número carbónico 1 de ácido N-acetilmurámico y el número carbónico 4 de N-acetil-D-glucosamina . In vivo, estos dos carbohidratos son polimerizados para formar el polisacárido de la pared celular.
Existe un creciente interés en el potencial de las enzimas lisozimas como agentes antimicrobianos. Por ejemplo, la actividad de la lisozima se ha demostrado contra patógenos tales como Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Enterococcus faecium, Bacillus stearothermophilus, Clostridiu botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricu y Listeria monocytogenes.
Las lisozimas se han clasificado en cinco diferentes familias de glucósido hidrolasas (GH) (CAZy, www.cazy.org): la lisozima de clara de huevo de gallina (GH22) , la lisozima de clara de huevo de ganso (GH23) , la lisozima de bacteriófago T4 (GH24) , proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) y lisozimas de Chalaropsis (GH25) . Las lisozimas de las familias GH23 y GH24 se conocen, principalmente, de bacteriófagos, y no se han identificado en hongos. Se ha hallado que la familia de lisozimas GH25 no está estructuralmente relacionada con las otras familias de lisozimas.
Se ha sugerido el uso de las lisozimas en alimentaciones animal (ver, por ejemplo, las Solicitudes Internacionales WO 00/21381 y WO 04/026334), en la producción de quesos (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 05/080559), en la conservación de alimentos (Hughey y Johnson (1987), Appl . Environ. Microbiol . , 53: 2165), en detergentes (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 5.041.236 y Patente Europea EP 0425016), en el cuidado oral (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 4.355.022, Solicitud Internacional WO 04/017988 y Solicitud Internacional WO 08/124764) , en cosmetología y dermatología, en anticoncepción, urología y ginecología (ver, por ejemplo, Solicitud Internacional WO 08/124764).
Se ha informado una lisozima GH25 de Chalaropsis (Felsch, J. W. , Ingagami , T., y Hash, J. H. (1975), "The N,0-Diacetylmuramidase of Chalaropsis species; V The complete aminoácido sequence, J. Biol . Chem. , 250 (10): 3713-3720).
La lisozima de clara de huevo de gallina, que es el producto primario que puede obtenerse en el mercado comercial, no disocia N, 6 -O-diacetilmuramidasa en, por ejemplo, las paredes celulares de Staphylococcus aureus, y por lo tanto, no puede lisar este importante patógeno humano, entre otros (Masschalck, B., Deckers, D., Michiels, C. W. (2002) , "Lytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lisozima under atmospheric and high hydrostatic pressure" , J. Food Prot . , 65 (12): 1916-23).
Se ha observado que diferentes lisozimas tienen diferentes especificidades hacia distintos microorganismos. Por lo tanto, es conveniente poder obtener varias lisozimas a fin de poder seleccionar las enzimas adecuadas para cada aplicación particular. Por consiguiente, se desean nuevos polipéptidos que tengan actividad de lisozima.
SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polipéptidos fúngicos aislados que pertenecen a la familia GH25 y que tienen actividad de lisozima.
La presente invención además se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de lisozima, seleccionados del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 o al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 ; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 3 o a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC . ID . NRO . : 7 ; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de media-alta rigurosidad, con la secuencia codificadora de polipéptido maduro de SEC. ID.
NRO . : 3 o SEC. ID. NRO. : 7, o su complemento de longitud completa ; (d) una variante del polipéptido maduro SEC. ID. NRO.: 4 o SEC. ID. NRO.: 8, que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) , o (d) que tiene actividad de lisozima.
La presente invención además se refiere a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención; construcciones de ácido nucleico; vectores de expresión recombinados; células hospederas recombinadas que comprenden los polinucleótidos; y métodos para la producción de los polipéptidos.
Adicionalmente , la presente invención se refiere a composiciones que comprenden el polipéptido de la presente invención, tales como composiciones detergentes, composiciones de alimentación animal y una composición de extracción de ADN genómico bacteriano.
La presente invención además se refiere a los polipéptidos de la invención que tienen actividad antimicrobiana, y métodos de uso de los polipéptidos de la invención como inhibidores de la formación de biopelícula, en detergentes, en el cuidado dental, en alimentaciones animales y para la descomposición de las paredes celulares de bacterias .
La presente invención además se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido de señal que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO. : 4, o los aminoácidos -23 a -1 de SEC. ID. NRO. : 8, que está funcionalmente ligado a un gen que codifica una proteína; a construcciones de ácido nucleico, vectores de expresión y células hospederas recombinadas que comprenden los polinucleótidos ; y a métodos para la producción de una proteína.
BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC. ID. NRO. : 1 es la secuencia de ADN del gen P244A7 GH24 aislada de Acremonium alkalophilum CBS114.92.
SEC. ID. NRO.: 2 es la secuencia de aminoácidos deducida de SEC. ID. NRO. : 1.
SEC. ID. NRO. : 3 es la secuencia de ADN del gen P242M9 GH25 aislada de Acremonium alkalophilum CBS114.92.
SEC. ID. NRO.: 4 es la secuencia de aminoácidos deducida de SEC . ID . NRO . : 3.
SEC. ID. NRO.: 5 es el cebador delantero F-P242M9.
SEC. ID. NRO.: 6 es el cebador inverso R-P242M9.
SEC. ID. NRO.: 7 es la secuencia de ADN del gen sintéticamente optimizado GH25.
SEC. ID. NRO.: 8 es la secuencia de aminoácidos deducida de SEC. ID. NRO. : 7.
SEC. ID. NRO. : 9 es el cebador delantero BamHI .
SEC. ID. NRO.: 10 es el cebador inverso EcoRI .
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra ensayos de difusión radial de la lisozima de Acremonium alcalophilum GH24 (EXP03890, SEC. ID. NRO. : 2) , la lisozima de Acremonium alcalophilum GH25 (EXP03864, SEC. ID. NRO. : 4) y una lisozima de referencia de Aspergillus fumigatus GH25 en S. carnosus y E. colí.
La Figura 2 muestra la estabilidad de temperatura de la lisozima de Acremonium alcalophilum GH25 P242M9 (SEC. ID. NRO.: 4) a 60, 76, 70, 75, 80 y 85°C luego de 30 o 60 segundos, según lo determinado por la caída de la densidad óptica de una solución de Micrococcus luteus resuspendida, ATTC Nro. 4698, medida en un espectrofotómetro a 540 nm.
La Figura 3 muestra la termoestabilidad de la lisozima GH25 P242M9 (SEC. ID. NRO. : 4) determinada usando la Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC) en Na-acetato, 50 mM, pH 4.5; Na-acetato, 50 mM, pH 5.5; y MES, 50 mM, (ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico) , pH 6.5.
La Figura 4 muestra la actividad de lisozima de 4 concentraciones de la lisozima GH25 P242M9 (SEC. ID. NRO.: 4), la lisozima sintética GH25 (SEC. ID. NRO.: 8) y 11 variantes de SEC. ID. NRO. : 8, según lo determinado por medio de la caída de la densidad óptica de una solución de Clostridium perfringens resuspendida NN01260.
La Figura 5 muestra la actividad de lisozima de 4 concentraciones de la lisozima GH25 P242M9 (SEC. ID. NRO. : 4), la lisozima sintética GH25 (SEC. ID. NRO.: 8) y 11 variantes de SEC. ID. NRO.: 8, según lo determinado por medio de la caída de la densidad óptica de una solución de Clostridium perfringens resuspendida, aislado clínico.
La Figura 6 expone las coordenadas atómicas de la estructura tridimensional de la lisozima de Acremonium alkalophilum CBS114.92 GH25. Estas coordenadas atómicas pueden ayudar en la generación de un modelo tridimensional que representa la estructura de la lisozima de Acremonium alkalophilum CBS114.92 GH25 y un modelo tridimensional de estructuras homologas, tales como variantes de la lisozima mencionada .
DEFINICIONES Lisozima: El término actividad de "lisozima" se define en esta solicitud como una O-glicosil hidrolasa, que cataliza la hidrólisis del enlace glucosídico entre dos o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y un resto no carbohidrato. Las lisozimas disocian el enlace glucosídico entre ciertos residuos en mucopolisacáridos y mucopéptidos de las paredes celulares bacterianas, tales como las uniones 1,4-beta entre residuos ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglucano, y entre residuos iV-acetil-D-glucosamina, en quitodextrinas , de modo de lograr la bacteriólisis . La lisozima pertenece a la clase de enzimas EC 3.2.1.17. Para los propósitos de la presente invención, la actividad de la lisozima se determina de acuerdo con el ensayo de turbiedad descripto en el Ejemplo 4. En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención tienen por lo menos 20%, por ejemplo, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 100% de la actividad de la lisozima del polipéptido maduro de una de SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO. : 8.
Variante alélica: El término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede producir polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser imperceptibles (sin cambio en el polipéptido codificado) , o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
Actividad antimicrobiana: El término "actividad antimicrobiana" se define en esta solicitud como una actividad que mata o inhibe el crecimiento de microorganismos, tales como algas, arqueobacterias , bacterias, hongos y protozoos. La actividad antimicrobiana puede ser, por ejemplo, bactericida, con el significado de la muerte de bacterias; o puede ser bacterioestática, con el significado de la prevención del crecimiento bacteriano. La actividad antimicrobiana puede incluir la catálisis de la hidrólisis de uniones 1,4-beta entre residuos ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglucano, y entre residuos N-acetil-D-glucosamina, en quitodextrinas . La actividad antimicrobiana además puede incluir la unión de la lisozima a la superficie del microorganismo, y la inhibición de su crecimiento. El efecto antimicrobiano también puede incluir el uso de las lisozimas de la presente invención para la activación de autolisinas bacterianas, como un inmunoestimulante , mediante la inhibición o reducción de toxinas bacterianas y por un efecto de opsonina . Para los propósitos de la presente invención, la actividad antimicrobiana se determina de acuerdo con el ensayo antimicrobiano que se describe en el Ejemplo 10.
Propiedad alterada/modificada: El término "propiedad alterada/modificada" se define en esta solicitud como una característica asociada con una variante que está alterada o modificada, en comparación con la lisozima progenitora o con una secuencia de referencia identificada. La propiedad alterada o modificada puede ser una característica asociada con una variante que está mejorada, a menos que se establezca lo contrario, en relación con otra lisozima de referencia, o con la lisozima progenitora. Ejemplos de propiedades que pueden ser alteradas/modificadas, o mejoradas, se proporcionan a continuación.
Termoestabilidad : El término "termoestabilidad" se refiere a la actividad de la lisozima después de un período de incubación a elevada temperatura, en relación con la progenitora o con una secuencia de referencia identificada, o bien en un regulador, o en condiciones tales como aquellas que se presentan durante el almacenamiento o el transporte del producto, o en condiciones similares a aquellas que se presentan durante el uso industrial de una variante. Una variante puede exhibir o no exhibir un perfil de actividad térmica alterado en relación con la progenitora. En un aspecto, la termoestabilidad de una variante que tiene actividad de lisozima es por lo menos 1.0 vez, por ejemplo, por lo menos 1.1 veces, por lo menos 1.5 veces, por lo menos, 1.8 veces, por lo menos 2 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 15 veces, por lo menos 20 veces, y por lo menos 25 veces más termoestable que la progenitora o que una secuencia de referencia a la temperatura seleccionada. Preferentemente, la actividad se evalúa empleando el ensayo de actividad de turbiedad de lisozima que se describe en la sección titulada "Materiales y métodos" .
Perfil de temperatura/estabilidad térmica: El término "perfil de temperatura/estabilidad térmica" se refiere a la enzima variante que muestra un perfil modificado de temperatura en comparación con la progenitora o con una secuencia de referencia identificada, donde el perfil de temperatura se determina como la actividad de lisozima como una función de la temperatura. La actividad a cada temperatura, preferentemente, se indica como actividad relativa (en %) normalizada al valor a temperatura óptima. La temperatura óptima es aquella temperatura dentro de las temperaturas evaluadas (es decir, aquellas con saltos de 5-10°C) donde la actividad es más alta.
Estabilidad de pH: El término "estabilidad de pH" se refiere a la enzima variante que exhibe estabilidad estructural en relación con la lisozima progenitora o con una secuencia de referencia identificada, luego de un período de incubación a un pH que se encuentra fuera del intervalo de pH donde la enzima es activa (intervalo de actividad de pH) . La variante puede exhibir o no exhibir un alterado perfil de actividad de pH en relación con la progenitora. Por ejemplo, una variante puede no ser activa al pH mayor o menor, si bien puede mantener su estructura tridimensional y luego recobrar la actividad, una vez que retorna al intervalo de actividad de pH. Alternativamente, una variante puede tener mejorada capacidad para el replegado, en relación con la progenitora, luego de la incubación a mayor o menor pH.
En un aspecto, el perfil de estabilidad de pH es alterado, de manera que una variante de lisozima tiene mejorada estabilidad a pH ácido. De acuerdo con esta solicitud, el pH ácido significa de pH 2 a 5.5, preferentemente, de 2.5 a 5.25, más preferentemente, de 3 a 5, aun más preferentemente, de 3.5 a 4. Preferentemente, la variante de lisozima mantiene por lo menos 40%, preferentemente, por lo menos 50%, 60%, 70% u 80%, más preferentemente, por lo menos 90%, aun más preferentemente, por lo menos 95% de actividad residual luego de la incubación a un pH determinado durante 1 hora, cuando se compara con una variante que se ha mantenido a pH 6.5 durante el mismo tiempo. Preferentemente, la actividad residual de una variante de lisozima es por lo menos 1.1 vez, por lo menos 1.3 veces, por lo menos 1.5 veces, preferentemente por lo menos 2 veces, más preferentemente, por lo menos 5 veces, con mayor preferencia, por lo menos 7 veces, y aun con mayor preferencia, por lo menos 10 veces más alta que la actividad residual de la lisozima progenitora, o de una secuencia de referencia identificada, que se ha tratado en las mismas condiciones. Preferentemente, la actividad es evaluada utilizando el ensayo de actividad de turbiedad de lisozima que se describe en la sección de "Materiales y métodos" .
Actividad de pH: El término "actividad de pH" se define en esta solicitud como una variante de lisozima que exhibe una alteración del perfil de actividad dependiente del pH cuando se compara con el perfil de actividad de pH de la lisozima progenitora o de una secuencia de referencia identificada. El perfil de actividad de pH proporciona una medida de la eficiencia de la enzima en la prevención del crecimiento microbiano, la eliminación de células microbianas, o la realización de la catálisis de una reacción de hidrólisis sobre un intervalo de pH en condiciones determinadas, tales como la temperatura y la composición de solvente. Una lisozima tiene un intervalo de pH específico donde el polipéptido es estable y retiene su actividad enzimática; fuera de este intervalo, la lisozima se torna menos activa y potencialmente , además, menos estable. Dentro del intervalo de pH, en general, hay un pH óptimo, donde la lisozima muestra la actividad más alta.
Una variante de lisozima con mejorada actividad a pH alcalino (por ejemplo, de pH 7.5 a 12, preferentemente, de 8 a 11, más preferentemente, de 8.5 a 10, aun más preferentemente, de 9 a 9.5) podrá funcionar en entornos más alcalinos, tales como detergentes.
Una variante con mejorada actividad a pH ácido (por ejemplo, de pH 2 a 6.5; preferentemente, de 2.5 a 6, más preferentemente, de 3 a 5.5, aun más preferentemente, de 3.5 a 5) podrá funcionar en condiciones más ácidas, como conservante en ciertos alimentos.
Una variante con mejorada actividad a pH neutro a débilmente ácido (por ejemplo, de pH 4 a 7.0, preferentemente, de 4.5 a 6.5, más preferentemente, de 5 a 6.5) podrá funcionar en condiciones débilmente ácidas a neutras, por ejemplo, para el uso de una molécula eubiótica en alimentaciones, para estabilizar la microflora saludable de animales, o mediante la supresión de la colonización intestinal o el crecimiento de patógenos virales, parasitarios o bacterianos en el aparato GI de animales.
En un aspecto, el perfil de actividad de pH es alterado de modo tal que una variante de lisozima tiene mejorada actividad a un pH más alcalino. Preferentemente, la actividad de una variante de lisozima a un pH de por lo menos 0.5 unidades más alto, preferentemente, por lo menos 1.0 unidades de pH más alto, más preferentemente, por lo menos 1.5 unidades de pH más alto, aun más preferentemente, por lo menos 2.0 unidades de pH más alto, es por lo menos 1.1 veces, preferentemente, por lo menos 1.5 veces, más preferentemente, por lo menos 2 veces, aun más preferentemente, por lo menos 5 veces, y con mayor preferencia, por lo menos 10 veces más alta que aquella de la enzima progenitora o de una secuencia de referencia identificada. Preferentemente, una variante de lisozima, al mismo tiempo, mantiene por lo menos 40%, preferentemente, por lo menos 50%, 60%, 70% u 80%, o 90%, más preferentemente, por lo menos 95%, aun más preferentemente. por lo menos 100% de la actividad que la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada exhibe a su pH óptimo. Preferentemente, la actividad es evaluada usando el ensayo de actividad de turbiedad de lisozima que se describe en la sección de "Materiales y métodos" .
En otro aspecto, el perfil de actividad de pH es alterado de modo tal que una variante de lisozima tiene mejorada actividad a un pH más ácido. Preferentemente, la actividad de una variante de lisozima a un pH por lo menos 0.5 unidades inferior, preferentemente, por lo menos 1.0 unidades de pH inferior, más preferentemente, por lo menos 1.5 unidades de pH inferior, aun más preferentemente, por lo menos 2.0 unidades de pH inferior, es por lo menos 1.1 veces, preferentemente, por lo menos 1.5 veces, más preferentemente, por lo menos 2 veces, aun más preferentemente, por lo menos 5 veces, y con mayor preferencia, por lo menos 10 veces más alta que aquella de la enzima progenitora o de una secuencia de referencia identificada. Preferentemente, una variante de lisozima, al mismo tiempo, mantiene por lo menos 40%, preferentemente, por lo menos 50%, 60%, 70% u 80%, o 90%, más preferentemente, por lo menos 95%, aun más preferentemente, por lo menos 100% de la actividad que la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada exhibe a un pH óptimo. Preferentemente, la actividad es evaluada usando el ensayo de actividad de turbiedad de lisozima que se describe en la sección titulada "Materiales y métodos" .
Especificidad de sustrato: El término "especificidad de sustrato" se refiere a la especificidad de la lisozima con respecto al tipo de bacterias que puede matar o inhibir, y en relación a sustratos de lisozimas modelos (por ejemplo, p-NP- (NAG-NAM) n o p-NP-(NAG)m oligómeros) . Por medio de la modificación de la especificidad de sustrato de la lisozima, el tipo de bacterias que la lisozima puede matar o inhibir puede alterarse. En un aspecto, la especificidad de sustrato de la lisozima se amplía, de modo de permitir que otros tipos de bacterias sean matadas o inhibidas, además de las bacterias que puede matar o inhibir la lisozima de tipo silvestre .
Sensibilidad a la glicación: La glicación no enzimática es un proceso postraducción espontáneo donde los azúcares reductores se unen covalentemente a grupos amino libres en proteínas, principalmente, en residuos lisina (K) . La glicación puede afectar la actividad de la lisozima. De acuerdo con la presente invención, la sensibilidad de la lisozima a la glicación no enzimática puede reducirse por medio de cambios de aminoácidos especificados.
Las propiedades mejoradas además pueden abarcar propiedades térmicas, tales como la estabilidad a la miniesferización, la estabilidad al vapor de agua y un perfil más amplio de actividad térmica. Otras propiedades mejoradas pueden comprender la sensibilidad a la proteasa, o el patrón de glicosilación. Preferentemente, los mejoramientos son evaluados en relación con las condiciones de aplicación deseadas .
Dominio catalítico: El término "dominio catalítico" significa la región de una enzima que contiene la maquinaria catalítica de la enzima.
ADNc: El término "ADNc" significa una molécula de ADN que puede prepararse mediante la transcripción inversa a partir de una molécula madura, empalmada, de ARNm, obtenida a partir de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de secuencias intrónicas que pueden presentarse en el correspondiente ADN genómico. La transcripción de ARN primaria inicial es un precursor para el ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, que incluyen el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.
Secuencia codificadora: El término "secuencia codificadora" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Las limitaciones de la secuencia codificadora, en general, son determinadas por un marco de lectura abierta, que comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG, o TTG, y termina con un codón de detención, tal como TAA, TAG, o TGA. La secuencia codificadora puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una de sus combinaciones.
Secuencias de control: El término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o extraña (es decir, de un gen diferente) con respecto al polinucleótido que codifica el polipéptido, o puede ser nativa o extraña con respecto a las demás. Dichas secuencias de control incluyen, sin limitación, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido de señal y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de detención de transcripción y de traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores, con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región codificadora del polinucleótido que codifica un polipéptido.
Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa involucrada en la producción de un polipéptido, que abarca, sin limitación, la transcripción, la modificación postranscripción, la traducción, la modificación postraducción y la secreción.
Vector de expresión: El término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y que está f ncionalmente ligada a secuencias de control que proporcionan su expresión.
Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido o un dominio catalítico que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del término amino y/o carboxilo de un dominio o polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de lisozima. En un aspecto, un fragmento contiene por lo menos 184 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 25 a 208 de SEC. ID. NRO. : 4) , o por lo menos 195 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 22 a 216 de SEC. ID. NRO. : 4) . En un aspecto adicional, un fragmento contiene por lo menos 184 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 10 a 193 de SEC. ID. NRO.: 8), o por lo menos 195 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 5 a 199 de SEC. ID. NRO. : 8) .
Célula hospedera: El término "célula hospedera" significa cualquier tipo de célula que es sensible a la transformación, transíección, traducción o proceso similar, con una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedera" contempla cualquier descendiente de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación.
Aislado/a: El término "aislado/a" significa una sustancia en una forma o en un entorno que no se produce en la naturaleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia no natural, (2) cualquier sustancia que incluye, sin limitación, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que está por lo menos parcialmente desprovista de uno o más o de la totalidad de los constituyentes naturales con los cuales se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre, en relación con la sustancia hallada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia, en relación con otros componentes con los cuales se asocia naturalmente (por ejemplo, múltiples copias de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado con el gen que codifica la sustancia) . Una sustancia aislada puede presentarse en una muestra de caldo de cultivo de fermentación.
Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final luego de la traducción y de cualquier modificación posterior a la traducción, tal como el procesamiento N-terminal, la truncación C-terminal, la glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro tiene los aminoácidos 20 a 227 de SEC. ID. NRO . : 4, o los aminoácidos 1 a 208 de SEC.
ID. NRO. : 8, sobre la base del programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), que predice que los aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO. : 4 y los aminoácidos -40 a -18 de SEC. ID. NRO.: 8 son péptidos de señal. Se sabe en la técnica que una célula hospedera puede producir una mezcla de dos o más diferentes polipéptidos maduros (es decir, con un aminoácido diferente C-terminal y/o N-terminal) expresados por el mismo polinucleótido .
Secuencia codificadora de polipeptido maduro: El término "secuencia codificadora de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de lisozima. En un aspecto, la secuencia codificadora de polipéptido maduro es la secuencia unida de los nucleótidos 58 a 147 y los nucleótidos 302 a 835 de SEC. ID. NRO.: 3, y los nucleótidos 121 a 744 de SEC. ID. NRO. : 7, sobre la base del programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra)] que predice que los nucleótidos 1 a 57 de SEC. ID. NRO. : 3 y los nucleótidos 1 a 69 de SEC. ID. NRO.: 7 codifican péptidos de señal.
Construcción de ácido nucleico: El término "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra simple, ya sea de hebra doble, que es aislada de un gen natural o que es modificada de manera de contener segmentos de ácidos nucleicos de un modo que no se presenta en la naturaleza, o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.
Funcianalmente ligada/o: El término "funcionalmente ligada/o" significa una configuración en la cual se coloca una secuencia de control en una posición apropiada en relación con la secuencia codificadora de un polinucleótido, de modo que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificadora.
Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por medio del parámetro "identidad de secuencia" .
Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman- unsch (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Bíol. 48: 443-453), implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente, la versión 5.0.0 o versión posterior. Los parámetros utilizados son: penalidad de abertura de espacio de 10; penalidad de extensión de espacio de 0.5; y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BL0SUM62) . La salida de Needle rotulada "identidad más larga" (obtenida usando la opción no breve) se usa como el porcentaje de identidad, y se calcula de la siguiente manera: (Residuos idénticos x 100 )/ (Longitud de alineación -Número total de espacios en la alineación) .
Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótido se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferentemente, la versión 5.0.0 o versión posterior. Los parámetros utilizados son: penalidad de abertura de espacio de 10; penalidad de extensión de espacio de 0.5; y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4) . La salida de Needle rotulada "identidad más larga" (obtenida usando la opción no breve) se usa como el porcentaje de identidad, y se calcula de la siguiente manera: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100) / (longitud de alineación - Número total de espacios en la alineación) .
Condiciones de rigurosidad: Las diferentes condiciones de rigurosidad se definen de la siguiente manera.
El término "condiciones de rigurosidad muy baja" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 25% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS, a 45°C.
El término "condiciones de baja rigurosidad" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 25% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern hlotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2 X SSC, 0.2% de SDS, a 50 °C.
El término "condiciones de rigurosidad media" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 35% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern hlotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS, a 55 °C.
El término "condiciones de rigurosidad media-alta" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 35% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern hlotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% de SDS, a 60°C.
El término "condiciones de alta rigurosidad" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42 °C, en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 50% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS, a 65 °C.
El término "condiciones de rigurosidad muy alta" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C, en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 50% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS a 70°C.
Subsecuencia : El término "subsecuencia" significa un polinucleótido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificadora de polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad de lisozima. En un aspecto, una subsecuencia contiene por lo menos 552 nucleótidos (por ejemplo, la secuencia unida de nucleótidos 73 a 147 y los nucleótidos 302 a 778 de SEC. ID. NRO. : 3) , o por lo menos 585 nucleótidos (por ejemplo, la secuencia unida de nucleótidos 64 a 147 y los nucleótidos 302 a 802 de SEC. ID. NRO. : 3). En un aspecto adicional, una subsecuencia contiene por lo menos 552 nucleótidos (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos 148 a 699 de SEC. ID. NRO. : 7) , o por lo menos 585 nucleótidos (por ejemplo, la secuencia de nucleótidos 133 a 717 de SEC. ID. NRO.: 7).
Polinucleótido sustancialmente puro: El término "polinucleótido sustancialmente puro" significa una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o indeseados, y en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de producción de polipéptidos genéticamente diseñados. En consecuencia, un polinucleótido sustancialmente puro contiene, como máximo, 10%, como máximo, 8%, como máximo, 6%, como máximo, 5%, como máximo, 4%, como máximo, 3%, como máximo, 2%, como máximo, 1%, y como máximo, 0.5% en peso, de otro material de polinucleótido con el cual se encuentra nativa o recombinantemente asociado. Un polinucleótido sustancialmente puro, sin embargo, puede incluir regiones naturales 5' y 3' no traducidas, tales como promotores y terminadores . Preferentemente, el polinucleótido es por lo menos 90% puro, por ejemplo, por lo menos 92% puro, por lo menos 94% puro, por lo menos 95% puro, por lo menos 96% puro, por lo menos 97% puro, por lo menos 98% puro, por lo menos 99% puro, y por lo menos 99.5% puro, en peso. Los polinucleótidos de la presente invención, preferentemente, se presentan en una forma sustancialmente pura.
Polipéptido sustancialmente puro: El término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación que contiene, como máximo, 10%, como máximo, 8%, como máximo, 6%, como máximo, 5%, como máximo, 4%, como máximo, 3%, como máximo, 2%, como máximo, 1%, y, como máximo, 0.5% en peso, de otro material de polipéptido con el cual se encuentra nativa o recombinant emente asociado. Preferentemente, el polipéptido es por lo menos 92% puro, por ejemplo, por lo menos 94% puro, por lo menos 95% puro, por lo menos 96% puro, por lo menos 97% puro, por lo menos 98% puro, por lo menos 99%, por lo menos 99.5% puro, y 100% puro, en peso, del material de polipéptido total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención, preferentemente, se presentan en una forma sustancialmente pura. Esto puede lograrse, por ejemplo, por medio de la preparación del polipéptido por métodos de biotecnología bien conocidos, o por métodos de purificación clásicos.
Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad de lisozima que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción, o supresión, de uno o más (varios) residuos de aminoácidos, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa el reemplazo del aminoácido que ocupa una posición, con un aminoácido diferente; una supresión significa la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa la adición de 1, 2, o 3 aminoácidos adyacentes al aminoácido que ocupa la posición, y siguiendo inmediatamente a este. Una variante de acuerdo con la invención puede comprender de 1 a 5; de 1 a 10; de 1 a 15; de 1 a 20; de 1 a 25; de 1 a 30; de 1 a 35; de 1 a 40; de 1 a 45; es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 alteraciones .
Las variantes de la presente invención tienen por lo menos una alteración o modificación seleccionada del grupo que consiste en los números de posición 6, 10, 11, 28, 30, 33, 37, 39, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y/o 190, donde la posición corresponde a la posición en la secuencia madura de SEC. ID. NRO. : 8. La secuencia de polipéptido variante, preferentemente, es aquella que no se encuentra en la naturaleza.
Lisozima de tipo silvestre: El término "lisozima de tipo silvestre" significa una lisozima expresada por un microorganismo natural, como una bacteria, levadura o un hongo filamentoso, hallado en la naturaleza.
Convenciones para la designación de variantes.
Para las propósitos de la presente invención, el polipéptido maduro revelado en SEC. ID. NRO.: 8 se usa para determinar el correspondiente residuo de aminoácido en otra lisozima. La secuencia de aminoácidos de otra lisozima es alineada con el polipéptido maduro revelado en SEC. ID. NRO. : 8, y, sobre la base de la alineación, se determina el número de posición de aminoácido correspondiente a cualquier residuo de aminoácido en el polipéptido maduro revelado en SEC. ID. NRO.: 8, usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J". Mol. Biol . 48: 443-453), implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferentemente, la versión 5.0.0 o versión posterior. Los parámetros utilizados son: penalidad de abertura de espacio de 10; penalidad de extensión de espacio de 0.5; y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BL0SUM62 ) . La salida de Needle rotulada "identidad más larga" (obtenida usando la opción no breve) se usa como el porcentaje de identidad, y se calcula de la siguiente manera: (Residuos idénticos x 100 )/ (Longitud de alineación -Número total de espacios en la alineación) . Se utiliza el algoritmo de Needleman-Wunsch para las comparaciones de secuencias y para el cálculo de las identidades de secuencia.
La identificación del correspondiente residuo de aminoácido en otra lisozima puede determinarse mediante una alineación de múltiples secuencias de polipéptido empleando varios programas de computadora, que incluyen, sin limitación, MUSCLE (comparación de múltiples secuencias por expectativa logarítmica; versión 3.5 o versión posterior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797); MAFFT (versión 6.857 o versión posterior; Katoh and Kuma , 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh and Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh and Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900); y EMBOSS EMMA que emplea ClustalW (versión 1.83 o versión posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando sus respectivos parámetros por defecto.
Cuando la otra enzima se ha desviado del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO . : 8, de modo tal que la comparación tradicional sobre la base de las secuencias no detecta su relación (Lindahl and Elofsson, 2000, J". Mol. Biol . 295: 613-615), pueden usarse otros algoritmos de comparación de secuencias en pares. Puede lograrse mayor sensibilidad en la búsqueda sobre la base de secuencias usando programas de búsqueda que utilizan representaciones probabilísticas de familias de polipéptidos (perfiles) para la búsqueda en bases de datos. A modo de ejemplo, el programa PSI-BLAST genera perfiles a través de un proceso de búsqueda de bases de datos reiterativo, y es capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Puede lograrse una sensibilidad aun mayor, si la familia o superfamilia para el polipéptido tiene uno o más representantes en las bases de datos de estructuras de proteínas. Los programas tales como GenTHREADER (Jones, 1999, J". Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin and Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizan información de una diversidad de fuentes (PSI-BLAST, predicción de estructura secundaria, perfiles de alineación estructural y potenciales de solución) como entrada a una red neuronal que predice el pliegue estructural para una secuencia de interrogación. De manera similar, el método de Gough et al., 2000, J". Mol. Biol. 313: 903-919, puede usarse para alinear una secuencia de estructura desconocida, con los modelos de la superfamilia presentes en la base de datos SCOP. Estas alineaciones, a su vez, pueden utilizarse para la generación de modelos de homología para el polipéptido, y los modelos pueden evaluarse a exactitud usando una diversidad de herramientas desarrolladas para tal propósito.
Para proteínas de estructura conocida, pueden obtenerse varias herramientas y recursos para la recuperación y generación de alineaciones estructurales. Por ejemplo, las superfamilias SCOP de proteínas se han alineado estructuralmente , y dichas alineaciones son accesibles y descargables . Pueden alinearse dos o más estructuras de proteínas, usando una diversidad de algoritmos tales como la matriz de alineación de distancia (Holm and Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) o la extensión de combinación (Shindyalov and Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), y la implementación de estos algoritmos puede usarse adicionalmente para interrogar bases de datos estructurales con una estructura de interés, a fin de descubrir posibles homólogos estructurales (por ejemplo, Holm and Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).
En la descripción de las variantes de la presente invención, se adapta la nomenclatura descripta a continuación, con propósitos de facilidad de referencia. Se emplea la abreviatura de aminoácidos aceptada IUPAC de una sola letra, o de tres letras.
Sustituciones : Para una sustitución de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido sustituido. Por consiguiente, la sustitución de treonina en la posición 226 con alanina se designa "Thr226Ala" o "T226A" . Las múltiples mutaciones se separan por medio de signos de suma ("+"), por ejemplo, "Gly205Arg + Ser411Phe" o "G205R + S411F", que representan sustituciones en las posiciones 205 y 411 de glicina (G) con arginina (R) , y serina (S) con fenilalanina (F) , respectivamente.
Deleciones : Para una supresión de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, *. En consecuencia, la supresión de glicina en la posición 195 se designa como "Glyl95*" o "G195*" . Las múltiples deleciones se separan por medio de signos de suma ("+"), por ejemplo, "Glyl95* + Ser411*" o "G195* + S411*" .
Inserciones : Para una inserción de aminoácido, se usa la siguiente nomenclatura: Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado. En consecuencia, la inserción de lisina después de glicina en la posición 195 se designa "Glyl95GlyLys" o "G195GK" . Una inserción de múltiples aminoácidos se designa [Aminoácido original, posición, aminoácido original, aminoácido insertado #1, aminoácido insertado #2; etc.]. Por ejemplo, la inserción de lisina y alanina después de glicina en la posición 195 es indica como "Glyl95GlyLysAla" o "G195GKA" .
En tales casos, el residuo o los residuos de aminoácido (s) insertados son numerados mediante la adición de letras en minúscula, al número de posición del residuo de aminoácido que precede el residuo o los residuos de aminoácidos insertados. En el ejemplo anterior, la secuencia, por lo tanto, será: Múltiples alteraciones: Las variantes que comprenden múltiples alteraciones son separadas por medio de signos de suma ("+"), por ejemplo, "Argl70Tyr+Glyl95Glu" o "R170Y+G195E" , que representan una sustitución de arginina y glicina en las posiciones 170 y 195, con tirosina y ácido glutámico, respectivamente.
Diferentes alteraciones: Cuando pueden introducirse diferentes alteraciones en una posición, las diferentes alteraciones se separan por medio de una coma; por ejemplo, "Argl70Tyr , Glu" representa una sustitución de arginina en la posición 170, con tirosina o ácido glutámico. Por lo tanto, "Tyrl67Gly, Ala + Argl70Gly, Ala" designa las siguientes variantes: "Tyrl67Gly+Argl70Gly" , "Tyrl67Gly+Argl70Ala" , "Tyrl67Ala+Argl70Gly" y wTyrl67Ala+Argl70Ala" .
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Polipéptidos que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 80%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 85%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 90%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 91%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 92%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 93%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 94%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4 de por lo menos 95%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4 de por lo menos 96%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 97%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 98%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 99%, que tienen actividad de lisozima.
En un aspecto, los polipéptidos difieren por no más de 45 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, o 44, del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4.
Un polipéptido de la presente invención, preferentemente, comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. NRO. : 4 o una de sus variantes alélicas; o es uno de sus fragmentos que tiene actividad de lisozima. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 20 a 227 de SEC. ID. NRO.: 4.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 80%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 85%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 90%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 91%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 92%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 93%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 94%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 95%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 96%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 97%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 98%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 de por lo menos 99%, que tienen actividad de lisozima.
En un aspecto, los polipéptidos difieren por no más de 45 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, o 44, del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 8.
Un polipéptido de la presente invención, preferentemente, comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. NRO. : 8 o una de sus variantes alélicas,- o es uno de sus fragmentos, que tiene actividad de lisozima. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 20 a 227 de SEC. ID. NRO.: 8.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima codificado por un polinucleótido que híbrida, en condiciones de media rigurosidad, en condiciones de rigurosidad media-alta, en condiciones de alta rigurosidad, o en condiciones de muy alta rigurosidad, con la secuencia codificadora de polipéptido maduro de (i) SEC. ID. NRO.: 3 o SEC. ID. NRO.: 7, (ii) su secuencia de ADNc, o (iii) su complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) .
El polinucleótido de SEC. ID. NRO. : 3 o SEC . ID. NRO. : 7 o una de sus subsecuencias, al igual que el polipéptido de SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO. : 8 o uno de sus fragmentos, pueden usarse para diseñar sondas de ácido nucleico para la identificación y clonación de ADN codificador de polipéptidos que tienen actividad de lisozima de cepas de diferentes textiles o especies, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, dichas sondas pueden usarse para la hibridación con el ADN genómico o ADN c de una célula de interés, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting, a fin de identificar y aislar allí el correspondiente gen. Dichas sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, si bien deben ser de por lo menos 15, por ejemplo, por lo menos 25, por lo menos 35, o por lo menos 70 nucleótidos de longitud. Preferentemente, la sonda de ácido nucleico es de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, por ejemplo, por lo menos 200 nucleótidos, por lo menos 300 nucleótidos, por lo menos 400 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos, por lo menos 600 nucleótidos, por lo menos 700 nucleótidos, por lo menos 800 nucleótidos, o por lo menos 900 nucleótidos de longitud.
Pueden usarse tanto sondas de ADN como de ARN. Las sondas habitualmente son marcadas para la detección del correspondiente gen (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina) . Dichas sondas están contempladas por la presente invención.
Una genoteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de dichas otras cepas puede someterse a la detección sistemática para detectar ADN que híbrida con las sondas descriptas con anterioridad y que codifica un polipéptido que tiene actividad de lisozima. Puede separarse ADN genómico u otro ADN de dichas otras cepas, por medio de la electroforesis de gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado puede transferirse a nitrocelulosa u otro material portador adecuado, e inmovilizarse sobre este. A fin de identificar un clon o ADN que híbrida con SEC. ID. NRO. : 3 o SEC. ID. NRO.: 7 o una de sus subsecuencias , el material portador se usa en un Southern jblot.
Para los propósitos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido híbrida a una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a (i) SEC. ID. NRO. : 3 o SEC. ID. NRO. : 7; (ii) la secuencia codificadora de polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 3 o SEC. ID. NRO. : 7; (iii) su secuencia de ADNc; (iv) su complemento de longitud completa; o (v) una de sus subsecuencias; en condiciones de media a muy alta rigurosidad. Las moléculas a las cuales la sonda de ácido nucleico híbrida en estas condiciones pueden detectarse usando, por ejemplo, película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica.
En un aspecto, la sonda de ácido nucleico comprende los nucleótidos 58 a 147, o los nucleótidos 302 a 835 de SEC. ID. NRO. : 3, o los nucleótidos 121 a 744 de SEC. ID. NRO. : 7. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO.: 8; su polipéptido maduro; o uno de sus fragmentos. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es SEC. ID. NRO.: 3 o SEC. ID. NRO.: 7 o su secuencia de ADNc .
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima codificado por un polinucleótido que tienen una identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 3 o su secuencia de ADNc de por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100%.
En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima codificado por un polinucleótido que tienen una identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 7 o su secuencia de ADNc de por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100%.
En una modalidad preferida, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una modalidad, el número de sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos introducidos en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4 no es superior a 45, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 O 45.
En una modalidad preferida, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 8 que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una modalidad, el número de sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos introducidos en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 8 no es superior a 45, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45.
Los cambios de aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, esto es, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan de manera significativa el plegado o la actividad de la proteína; deleciones pequeñas, habitualmente , de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas amino- o carboxilo-terminales , como un residuo metionina amino-terminal ; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación mediante el cambio de la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidin , un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica son conocidas en la técnica, y son descriptas, por ejemplo, por H. Neurath y R. L. Hill, 1979, en: The Proteins, Academic Press, New York. Las sustituciones comunes son: Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.
Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.
Los aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a sitio, o la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas a fin de establecer la actividad de lisozima de modo de identificar residuos de aminoácidos que son decisivos para la actividad de la molécula. Ver, además, la referencia de Hilton et al., 1996, J. Biol . Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede determinarse por medio del análisis físico de la estructura, según lo determinado por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el marcado de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de aminoácidos de sitios de contacto putativos. Ver, por ejemplo, las referencias de: de Vos et al., 1992, Science, 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol.
Biol., 224: 899-904; Wlodaver et al . , 1992, FEBS Lett . , 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también puede ser inferida a partir de una alineación con un polipéptido relacionado.
Las sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos individuales o múltiples pueden efectuarse y evaluarse usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y mezcla (shuffling) , seguidos de un procedimiento de detección sistemática pertinente, por ejemplo, aquellos descriptos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science, 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden emplearse incluyen la PCR propensa al error, la exhibición de fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.223.409; WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., 1986, Gene, 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
Los métodos de mutagénesis/mezcla (shuffling) pueden combinarse con métodos de detección sistemática automatizados, de alto rendimiento, a fin de detectar la actividad de polipéptidos clonados mutagenizados expresados por células hospederas. (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células hospederas y pueden ser rápidamente secuenciadas usando métodos convencionales en la técnica. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido, en el cual una región de un polipéptido se fusiona en el N-terminal o en el C-terminal de una región de otro polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión disociable en el cual se fusiona otro polipéptido en el N-terminal o en el C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce mediante la fusión de un polinucleótido que codifica otro polipéptido, a un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para la producción de polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen la ligación de las secuencias codificadoras que codifican los polipéptidos, de manera de encontrarse en marco, y que la expresión del polipéptido de fusión se encuentra bajo el control de los mismos promotores y terminadores . Los polipéptidos de fusión pueden construirse además usando tecnología de inteínas, en la cual los polipéptidos de fusión son creados de manera posterior a la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
Un polipéptido de fusión, asimismo, puede comprender un sitio de disociación entre los dos polipéptidos . Con la secreción de la proteína de fusión, el sitio es disociado, de modo de liberar los dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de disociación incluyen, sin limitación, los sitios revelados en las referencias de Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol . Biotechnol., 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol . 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl . Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins : Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
La estructura cristalina de la lisozima de Acremonium alkalophilum CBS114.92 fue resuelta a una resolución de 1.3 Á. Las coordenadas atómicas de esta estructura se muestran en la figura 6. Estas coordenadas atómicas pueden usarse para la generación de un modelo tridimensional que representa la estructura de la lisozima de Acremonium alkalophilum CBS114.92 o estructuras homologas (tales como las variantes de la presente invención) .
La lisozima de Acremonium alkalophilum CBS114.92 pertenece a la familia de hidrolasas GH25 asignada con el número E.C: 3.2.1.17. Se cree que el mecanismo catalítico es el mecanismo clásico de retención de Koshland, con la configuración de retención de red de la confirmación alrededor del carbono anomérico. Esto se logra a menudo por medio de un mecanismo de desplazamiento doble de dos etapas, que involucra un intermediario enzimático de glicosilo covalente . La reacción se produce con ácido/base, y la asistencia nucleófila es proporcionada por dos cadenas laterales de aminoácidos. En la primera etapa (con frecuencia, denominada la etapa de glicosilación) , un residuo de aminoácido (D95) cumple el role de un nucleófilo que ataca el centro anomérico para desplazar el aglicón y formar un intermediario enzimático de glicosilo. Al mismo tiempo, el segundo residuo de aminoácido (E97) funciona como un catalizador ácido y protona el oxígeno glicosídico a medida que se disocia el enlace. En la segunda etapa (con frecuencia, denominada la etapa de desglicosilación) , el intermediario enzimático de glicosilo es hidrolizado por agua, donde el segundo residuo de aminoácido (E97) ahora actúa como un catalizador de base que desprotona la molécula entrante de agua. Se cree que el valor pKa del grupo ácido/base cicla entre valores altos y bajos durante la catálisis, de manera de optimizar su rol en cada etapa de la catálisis.
Con el uso de la estructura de rayos x, se han identificado los residuos de aminoácidos D95 y E97 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) como residuos catalíticos. En ciertas modalidades de la invención (además de una o más de las alteraciones citadas en esta solicitud) , no se efectúa alteración al aminoácido correspondiente a E97 y D95, usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración, de las variantes de lisozimas de la presente invención. De varias moléculas de lisozimas, se sabe que la mutación del nucleófilo puede conducir a una enzima que retiene cierta actividad catalítica, supuestamente, debido a que el agua (tal vez, en forma de OH") puede funcionar como un nucleófilo en la primera etapa del mecanismo catalítico. (Malcolm, B. A. et al, (1989), "Site-directed mutagenesis of the catalytic residues Asp-52 and Glu-35 of chicken egg white lysozyme" , Proc. Nati. Acad. Sci . 86 (1), 133-137).
Variantes que tienen actividad de lisozima.
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en una alteración en una o más (por ejemplo, varias) posiciones correspondientes a las posiciones 6, 10, 11, 28, 30, 33, 37, 39, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y/o 190 del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8, donde cada alteración es, de manera independiente, una sustitución, inserción o supresión, y una variante tiene actividad antimicrobiana y/o actividad de lisozima.
En una modalidad, la alteración es una sustitución. En otra modalidad, la alteración es una inserción. En una modalidad adicional, la alteración es una supresión.
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 93%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC . ID . NRO . : 4.
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 93%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC . ID . NRO . : 8.
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8.
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 8.
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 93% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC . ID . NRO . : 8 .
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 95% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8.
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 96% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC . ID . NRO . : 8 .
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 97% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8.
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 98% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC . ID . NRO . : 8 .
Las variantes de lisozimas de la presente invención comprenden o consisten en un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 99% de identidad con respecto al polipéptido maduro de SEC . ID . NRO . : 8 .
En un aspecto, el número de alteraciones en las variantes de la presente invención es 1-45 , por ej emplo 1-40 , 1-35 , 1-30 , 1-25 , 1-20 , 1-15 , 1-10 y 1-5 , tal como 1 , 2 , 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 o 45 alteraciones.
En otro aspecto, una variante comprende una alteración, tal como una sustitución, inserción o supresión, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones correspondientes a las posiciones 6, 10, 11, 28, 30, 33, 37, 39, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y 190 del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8. En otro aspecto, una variante comprende una alteración en dos posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 6, 10, 11, 28, 30, 33, 37, 39, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y 190 del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8. En otro aspecto, una variante comprende una alteración en tres posiciones correspondientes a cualquiera de las posiciones 6, 10, 11, 28, 30, 33, 37, 39, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y 190 del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8. En otro aspecto, una variante comprende una alteración en cada posición correspondiente a las posiciones 6, 10, 11, 28, 30, 33, 37, 39, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y 190 del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8.
Una modalidad de la invención comprende la alteración del perfil de actividad de pH de la lisozima, mientras se retiene la actividad de lisozima y/o la actividad antimicrobiana. Una modalidad preferida de la invención consiste en que la lisozima tiene mejorada actividad a un pH más alcalino; es decir, el pH de la actividad pico antimicrobiana o de lisozima aumenta o se torna más alcalino.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 10 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración). En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 10 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) que altera el perfil de actividad de pH de la lisozima. En otra modalidad, la alteración comprende o consiste en la sustitución W10H, que aumenta el pH de la actividad antimicrobiana pico.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 39 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración) . En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 39 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera el perfil de actividad de pH de la lisozima. En otra modalidad, la alteración comprende o consiste en la sustitución S39D, que aumenta el pH de la actividad antimicrobiana pico.
En otra modalidad, la variante aislada de la presente invención consiste en una alteración en la posición 10 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración) junto con una alteración en una o más de las siguientes posiciones: 6, 11, 28, 30, 33, 37, 39, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y/o 190. Una modalidad preferida es la sustitución W10H junto con una alteración en una o más de las siguientes posiciones: 6, 11, 28, 30, 33, 37, 39, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y/o 190.
En otra modalidad, la variante aislada de la presente invención consiste en una alteración en la posición 39 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) junto con una alteración en una o más de las siguientes posiciones: 6, 10, 11, 28, 30, 33, 37, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y/o 190. Una modalidad preferida es la sustitución S39D junto con una alteración en una o más de las siguientes posiciones: 6, 10, 11, 28, 30, 33, 37, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y/o 190.
En una modalidad adicional, la variante aislada de la presente invención consiste en una alteración en las posiciones 10 y 39 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) . Una modalidad preferida consiste en las sustituciones W10H y S39D.
En una modalidad adicional, la variante aislada de la presente invención consiste en una alteración en las posiciones 10 y 39 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) junto con una alteración en una o más de las siguientes posiciones: 6, 11, 28, 30, 33, 37, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y/o 190. Una modalidad preferida son las sustituciones 10H y S39D junto con una alteración en una o más de las siguientes posiciones: 6, 11, 28, 30, 33, 37, 59, 60, 61, 62, 63, 92, 93, 94, 96, 98, 99, 100, 101, 106, 133, 134, 135, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 158, 161, 162, 178, 183 y/o 190.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 6 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) . En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 6 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 11 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración). En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 11 (usando SEC.
ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 30 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración). En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 30 (usando SEC.
ID. NRO.: 8 para la numeración), que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 33 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración). En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 33 (usando SEC.
ID. NRO.: 8 para la numeración), que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 37 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) . En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 37 (usando SEC.
ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 101 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) . En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 101 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 139 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración). En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 139 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 161 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración) . En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 161 (usando SEC. ID. NRO.: 8 para la numeración), que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 162 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) . En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 162 (usando SEC.
ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 183 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) . En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 183 (usando SEC.
ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
En una modalidad, la variante aislada de la presente invención comprende o consiste en una alteración en la posición 190 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) . En una modalidad, la alteración comprende o consiste en una sustitución de un aminoácido en la posición 190 (usando SEC. ID. NRO. : 8 para la numeración) , que altera la especificidad de sustrato de la lisozima.
Fuentes de polipéptidos que tienen actividad de lisozima .
Un polipéptido que tiene actividad de lisozima de la presente invención puede obtenerse a partir de microorganismos de cualquier género. Para los propósitos de la presente invención, el término "obtenerse/obtenido de", de acuerdo con la presente solicitud, en relación con una fuente determinada, significará que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa donde el polinucleótido de la fuente se ha insertado. En un aspecto, el polipéptido obtenido de una fuente determinada es secretado de manera extracelular.
El polipéptido puede ser un polipéptido fúngico. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido fúngico filamentoso, tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Chrysosporiu , Fusarium, Humicola, Penicillium, Thíelavia o Trichodermun .
En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium samhucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grísea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albo yces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Acremonium alcalophilum, por ejemplo, un polipéptido obtenido de Acremonium alcalophilum CBS 114.92.
Se entenderá que para las especies mencionadas con anterioridad, la invención contempla tanto los estados perfectos como imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, sin consideración de la denominación de la especie por la cual se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán sin dificultad la identidad de los equivalentes apropiados .
Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles para el público en una cantidad de colecciones de cultivos, tales como las American Type Culture Collection (ATCC) [Colección de Cultivos Tipificados Americanos] , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .
El polipéptido puede identificarse y obtenerse de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, el suelo, abono orgánico, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelo, abono orgánico, agua, etc.) usando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para el aislamiento de microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidos en la técnica. Un polinucleótido que codifica el polipéptido entonces puede obtenerse por medio de la detección sistemática similar de una genoteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o de una muestra mixta de ADN. Una vez que se ha detectado con las sondas un polinucleótido que codifica un polipéptido, el polinucleótido puede aislarse o clonarse mediante la utilización de técnicas conocidas por los expertos en la materia (ver, por ejemplo, la referencia de Sambrook et al., 1989, supra) .
Polinucleótido .
La presente invención además se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención, como se describe en la solicitud.
Las técnicas empleadas para el aislamiento o la clonación de un polinucleótido son conocidas en la técnica, e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico o ADNc, o una de sus combinaciones. La clonación de los polinucleótidos a partir de ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo, mediante la utilización de la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR, según su sigla en inglés) o la detección sistemática de anticuerpos de genotecas de expresión para la detección de fragmentos de ADN clonados con rasgos estructurales compartidos. Ver, por ejemplo, la referencia de Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Pueden emplearse otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico, tales como la reacción de cadena de ligasa (LCR, según su sigla en inglés) , la transcripción activada por la ligación (LAT, según su sigla en inglés) y la amplificación sobre la base de polinucleótidos (NASBA, según su sigla en inglés) . Los polinucleótidos pueden clonarse a partir de una cepa de Aspergillus o Acremonium, o de un microorganismo relacionado, y en consecuencia, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie de la región codificadora del polipéptido, del polinucleótido .
La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas no naturales del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir, en alguna forma de diseño, del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en la actividad específica, la termoestabilidad, el pH óptimo y factores similares. Las variantes pueden construirse sobre la base del polinucleótido presentado como la secuencia codificadora de polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 3, SEC. ID. NRO . : 7 o sus secuencias de ADNc, por ejemplo, por ejemplo, una de sus subsecuencias , y/o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que no producen un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso de codón del organismo hospedero propuesto para la producción de la enzima; o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar origen a una secuencia diferente de aminoácido. Para una descripción general de sustitución de nucleótido ver, por ejemplo, la referencia de Ford et al., 1991, Protein Expresión and Purification 2: 95-107.
Construcciones de ácido nucleico.
La presente invención además se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido de la presente invención funcionalmente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificadora en una célula hospedera adecuada, en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un polinucleótido puede ser manipulado de una diversidad de maneras, a fin de proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser conveniente o necesaria de acuerdo con el vector de expresión. Las técnicas para la modificación de los polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinado son bien conocidas en la técnica.
La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedera para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control de transcripción que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestra actividad de transcripción en la célula hospedera que incluye promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares , ya sea homólogos o heterólogos con respecto a la célula hospedera.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (amyQ) , el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , el gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , el gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus (amyM) , el gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB) , los genes de Bacillus subtilis xylA y xylB, el gen de Bacillus thuringiensis cryIIIA (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), el operón de E. coli lac, el promotor de E. coli trc (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de agarasa de Streptomyces coelicolor {dagA) y el gen de beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en la referencia de Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en la referencia de Sambrook et al., 1989, supra. Ejemplos promotores en tándem se revelan en la Solicitud Internacional WO 99/43835.
Ejemplos de promotores adecuados para la dirección de la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable al ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA) , TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787) , amiloglucosidasa de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Daría de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Quinn de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el cual el líder no traducido se ha reemplazado por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos, sin limitación, incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el cual el líder no traducido se ha reemplazado por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae) ; y sus promotores mutantes, truncados e híbridos.
En un hospedero de levadura, los promotores útiles se obtienen a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactoquinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI) , metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros promotores útiles para células hospederas de levaduras se describen en la referencia de Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control además puede ser un terminador de transcripción, que es reconocido por una célula hospedera para terminar la transcripción. El terminador está funcionalmente ligado al término 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Puede usarse cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedera, en la presente invención.
Los terminadores preferidos para células hospederas bacterianas se obtienen de los genes para proteasa alcalina de Bacillus clausii {aprH) , alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) y AR ribosómico de Escherichia coli [rrnB) .
Los terminadores preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para células hospederas de levaduras se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células hospederas de levaduras son descriptos por Romanos et al . , 1992 , supra .
La secuencia de control además puede ser una región estabilizadora de ARNm corriente descendente de un promotor y corriente ascendente de la secuencia codificadora de un gen que aumenta la expresión del gen.
Ejemplos adecuados de regiones estabilizadoras de ARNm se obtienen de un gen de Bacillus thuringiensis cryIIIA ( O 94/25612) y de un gen de Bacillus subtilis SP82 (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177 : 3465-3471).
La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula hospedera. El líder está funcionalmente ligado al término 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier líder que sea funcional en la célula hospedera puede usarse .
Los líderes preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans .
Los líderes adecuados para células hospederas de levaduras se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3-fosfoglicerato quinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae .
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia funcionalmente ligada al término 3' del polinucleótido y, que cuando es transcripta, es reconocida por la célula hospedera como una señal para agregar residuos de poliadenosina a ARNm transcripto. Puede usarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedera.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospederas de levaduras son descriptas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.
La secuencia de control además puede ser una región codificadora de péptido de señal que codifica un péptido de señal ligado al N-terminal de un polipéptido, y que dirige el polipéptido hacia la vía secretoria de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificadora del polinucleótido puede contener, inherentemente, una secuencia codificadora de péptido de señal naturalmente ligada en marco de lectura de traducción, con el segmento de la secuencia codificadora que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificadora puede contener una secuencia codificadora de péptido de señal que es extraña con respecto a la secuencia codificadora. Una secuencia codificadora de péptido de señal extraña puede requerirse cuando la secuencia codificadora no contiene naturalmente una secuencia codificadora de péptido de señal. Alternativamente, una secuencia codificadora de péptido de señal extraña, simplemente, puede reemplazar la secuencia codificadora de péptido de señal natural a fin de mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia codificadora de péptido de señal que dirija el polipéptido expresado hacia la vía secretoria de una célula hospedera.
Las secuencias codificadoras de péptido de señal eficaces para células hospederas bacterianas son las secuencias codificadoras de péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y Bacillus subtilis prsA. Otros péptidos de señal son descriptos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Las secuencias codificadoras de péptido de señal eficaces para células hospederas fúngicas filamentosas son las secuencias codificadoras de péptido de señal obtenidas de los genes para la amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.
Los péptidos de señal útiles para células hospederas de levaduras se obtienen de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisíae. Otras secuencias codificadoras de péptido de señal útiles son descriptas por Romanos et al., 1992, supra.
La secuencia de control además puede ser una secuencia codificadora de propéptido que codifica un propéptido posicionado en el N-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno, en algunos casos) . Un propolipéptido es generalmente inactivo, y puede ser convertido en un polipéptido activo por medio de la disociación catalítica o autocatalítica del propéptido, a partir del propolipéptido. La secuencia codificadora de propéptido puede obtenerse de los genes para la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE) , proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT) , lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae .
Cuando se presentan tanto secuencias de péptido de señal como de propéptido, la secuencia de propéptido se posiciona junto al N-terminal de un polipéptido, y la secuencia de péptido de señal se posiciona junto al N-terminal de la secuencia de propéptido.
Puede ser conveniente, además, agregar secuencias reguladoras que regulan la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula hospedera. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan el encendido o apagado de la expresión del gen, en respuesta a un estímulo químico o físico, que incluye la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotos incluyen los sistemas lac, tac y trp. En levaduras, pueden usarse el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En sistemas eucariontes, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa, que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína, que son amplificados con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estará funcionalmente ligado con la secuencia reguladora.
Vectores de expresión.
La presente invención además se refiere a vectores de expresión recombinados que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de detención de transcripción y traducción. Las diversas secuencias de control y de nucleótidos pueden unirse para producir un vector de expresión recombinado, que puede comprender uno o más sitios de restricción convenientes a fin de permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido, en los sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede ser expresado mediante la inserción del polinucleótido o de una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido, en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificadora se ubica en el vector de manera tal que la secuencia codificadora es funcionalmente ligada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinado puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinado y que puede producir la expresión del polinucleótido. La elección del vector, habitualmente , dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual debe introducirse el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracroraosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicación . Alternativamente, el vector puede ser un vector que, cuando es introducido en la célula hospedera, es integrado en el genoma y replicado junto con los cromosomas dentro de los cuales se ha integrado. Asimismo, pueden usarse un solo vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos, que, en conjunto, contienen el ADN total por ser introducido en el genoma de la célula hospedera, o un transposón.
El vector, preferentemente, contiene uno o más marcadores de selección que permiten la fácil selección de células transformadas, transíectadas, transducidas , o similares. Un marcador de selección es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxotrofos, y similares.
Ejemplos de marcadores de selección bacterianos son genes de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis dal , o marcadores que confieren resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a ampicilina, cloranfenicol , kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina . Los marcadores adecuados para células hospederas de levaduras incluyen, sin limitación,, ADE2 , HIS3, LEU2 , LYS2, MET3 , TRP1 y URA3. Los marcadores de selección para el uso en una célula hospedera fúngica filamentosa incluyen, sin limitación, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , bar (fosfinotricina acetiltransferasa) , hph (higromicina fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina-5 '-fosfato decarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa) , al igual que sus equivalentes. Se prefieren para el uso en una célula de Aspergillus los genes de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae amdS y pyrG y un gen de Streptomyces hygroscopicus bar.
El vector, preferentemente, contiene uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedera, o la replicación autónoma del vector en la célula, independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula hospedera, el vector puede sustentarse en la secuencia del polinucleótido que codifica el polipéptido, o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante la recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por medio de la recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en una ubicación precisa en los cromosomas. Con el objetivo de aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener una cantidad suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10.000 pares de bases, 400 a 10.000 pares de bases y 800 a 10.000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con respecto a la correspondiente secuencia blanco a fin de aumentar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con respecto a la secuencia blanco en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificadores o codificadores. Por otra parte, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula hospedera por medio de la recombinación no homologa.
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector la replicación autónoma en la célula hospedera en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plásmido que media la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador plásmido" significa un polinucleótido que permite la replicación de un plásmido o vector in vivo.
Ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicación en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060 y ???ß? , que permiten la replicación en Bacillus .
Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula hospedera de levadura son el origen de replicación de 2 micrones, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.
Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene, 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden llevarse a cabo de acuerdo con los métodos que se describen en la Solicitud Internacional WO 00/24883.
Puede insertarse más de una copia de un polinucleótido de la presente invención, en una célula hospedera, de manera de aumentar la producción de un polipéptido. Un aumento en el número de copias del polinucleótido puede obtenerse mediante la integración de por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera, o mediante la inclusión de un gen marcador de selección amplificable, con el polinucleótido, donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador de selección, y por lo tanto, copias adicionales del polinucleótido, pueden seleccionarse mediante el cultivo de las células en presencia del agente de selección apropiado.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descriptos anteriormente para la construcción de los vectores de expresión recombinados de la presente invención son bien conocidos por el experto en la técnica (ver, por ejemplo, la referencia de Sambrook et al., 1989, supra) .
Péptido de señal .
La presente invención además se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un péptido de señal que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO. : 4, o los aminoácidos -40 a -18 de SEC. ID. NRO. : 4. Los polinucleótidos además pueden comprender un gen que codifica una proteína, que está funcionalmente ligado al péptido de señal. La proteína, preferentemente, es extraña con respecto al péptido de señal. En un aspecto, el polinucleótido que codifica el péptido de señal tiene los nucleótidos 1 a 57 de SEC. ID. NRO.: 3 o los nucleótidos 1 a 69 de SEC. ID. NRO.: 7.
La presente invención además se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores de expresión y células hospederas recombinadas que comprenden los polinucleótidos.
La presente invención además se refiere a métodos para la producción de una proteína, que comprenden (a) el cultivo de una célula hospedera recombinada que comprende el polinucleótido; y (b) la recuperación de la proteína.
La proteína puede ser nativa o heteróloga con respecto a una célula hospedera. El término "proteína" en esta solicitud, no tiene la intención de hacer referencia a una longitud específica del producto codificado, y por lo tanto, abarca péptidos, oligopéptidos y polipéptidos . El término "proteína" además contempla dos o más polipéptidos combinados para formar el producto codificado. Las proteínas además incluyen polipéptidos híbridos y polipéptidos fusionados.
Preferentemente, la proteína es una hormona, enzima, un receptor o una de sus porciones, un anticuerpo o una de sus porciones, o un reportero. Por ejemplo, la proteína puede ser una hidrolasa, isomerasa, ligasa, liasa, oxidorreductasa o transferasa, por ejemplo, una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, xilanasa o beta-xilosidasa .
El gen puede obtenerse de cualquier fuente procariota, eucariota, u otra fuente.
Células hospederas.
La presente invención además se refiere a células hospederas recombinadas , que comprenden un polinucleótido de la presente invención funcionalmente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido de la presente invención. Una construcción o un vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedera, de modo que la construcción o el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico de autorreplicación, como se describe con anterioridad. El término "célula hospedera" abarca cualquier descendiente de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula hospedera dependerá, en gran medida, del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
La célula hospedera puede ser cualquier célula útil en la producción recombinada de un polipéptido de la presente invención, por ejemplo, un procarioto o un eucarionte.
La célula hospedera procariota puede ser cualquier bacteria Gram-positiva o Gram-negativa . Las bacterias gram-positivas incluyen, sin limitación, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias Gram-negativas incluyen, sin limitación, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacteriu , Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma.
La célula hospedera bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, que incluye, sin limitación, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis.
La célula hospedera bacteriana además puede ser cualquier célula de Streptococcus que incluye, sin limitación, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus .
La célula hospedera bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces que incluye, sin limitación, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans .
La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede efectuarse por medio de la transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, la referencia de Chang and Cohén, 1979, Mol. Gen. Genet . 168: 111-115), la transformación de células competentes (ver, por ejemplo, la referencia de Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, o aquella de Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol . 56: 209- 221) , la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Shigeka a and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o la conjugación (ver, por ejemplo, la referencia de Koehler and Thorne, 1987, J". Bacteriol . 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede efectuarse por medio de la transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, la referencia de Hanahan, 1983, J. Mol. Biol . , 166: 557-580) o la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede efectuarse por medio de la transformación de protoplasto, la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Gong et al., 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49: 399-405), la conjugación (ver, por ejemplo, la referencia de Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o la transducción (ver, por ejemplo, la referencia de Burke et al., 2001, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas puede efectuarse por medio de la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o la conjugación (ver, por ejemplo, la referencia de Pinedo and Smets, 2005, Appl . Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede efectuarse por medio de la competencia natural (ver, por ejemplo, la referencia de Perry and Kuramitsu, 1981, Infect.
Immun. 32: 1295-1297), la transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, la referencia de Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Buckley et al., 1999, Appl . Environ. Microbiol . 65: 3800-3804), o la conjugación (ver, por ejemplo, la referencia de Cle ell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436) . Sin embargo, puede usarse cualquier método conocido en la técnica, para la introducción de ADN en una célula hospedera .
La célula hospedera puede ser, asimismo, un eucarionte, tal como una célula de mamífero, insecto, planta, o fúngica.
La célula hospedera puede ser una célula fúngica. El término "hongos", tal como se usa en esta solicitud, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota y Zygomycota, al igual que los hongos Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como lo definen Hawksworth et al., en Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi , 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) .
La célula hospedera fúngica puede ser una célula de levadura. El término "levadura", como se usa en esta solicitud, incluye levaduras ascosporógenas (Endomicetales) , levaduras basidiosporógenas y levaduras que pertenecen a la familia de Fungi Imperfecti (hongos imperfectos) (Blastomicetos) . Debido a que la clasificación de levaduras puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, las levaduras se definirán tal como se describe en Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App . Bacteriol . Symposium Series No. 9, 1980) .
La célula hospedera de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica .
La célula hospedera fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de las subdivisiones Eumycota y Oomycota (como se define en la referencia de Ha ksworth et al., 1995, supra) . Los hongos filamentosos se caracterizan, generalmente, por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetal es por elongación de las hifas, y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aerobio. En contraste, el crecimiento vegetal por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es mediante el brote de un talo unicelular, y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
La célula hospedera fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidiu , Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora , Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, P1eurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma .
Por ejemplo, la célula hospedera fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamorí, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatu , Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viridel.
Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que involucra la formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular, de manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células hospederas de Aspergillus y Trichoderma se describen en la Patente Europea EP 238023, y en las referencias de Yelton et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/'Technology 6: 1419-1422. Los métodos adecuados para la transformación de especies de Fusarium son descriptas por Malardier et al., 1989, Gene, 78: 147-156, y en el documento O 96/00787. La levadura puede ser transformada empleando los procedimientos descriptos por Becker y Guarente, en la referencia de Abelson, J. N. y Simón, . I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; la referencia de Ito et al., 1983, J. Bacteriol . 153: 163; y la referencia de Hinnen et al., 1978, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de producción.
La presente invención además se refiere a métodos para la producción de un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) el cultivo de una célula, que, en su forma de tipo silvestre, produce el polipéptido, en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. En un aspecto preferido, la célula es una célula de Acremonium. En un aspecto más preferido, la célula es una célula de Acremonium alcalophilu . En un aspecto de mayor preferencia, la célula es una célula de Acremonium alcalophilum CBS114.92.
La presente invención además se refiere a métodos para la producción de un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) el cultivo de una célula hospedera recombinada de la presente invención en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
La células hospederas se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido, usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse por medio del cultivo en matraces de agitación, o la fermentación de pequeña escala o de gran escala (que incluye las fermentaciones continua, en lotes, de alimentación de lotes, o de estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales, realizada en un medio adecuado y en condiciones que permiten la expresión y/o el aislamiento del polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados pueden obtenerse de proveedores comerciales, o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection) . Si el polipéptido es secretado en el medio nutriente, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, puede ser recuperado de los lisados celulares.
El polipéptido puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica, que son específicos para los polipéptidos , por ejemplo, el ensayo de mancha de lisozima que se describe a continuación. Estos métodos de detección incluyen, sin limitación, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.
El polipéptido puede recuperarse empleando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente por medio de procedimientos convencionales que incluyen, sin limitación, la recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
El polipéptido puede purificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, la cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, de cromatofocalización y de exclusión por tamaño) , los procedimientos de electroforesis (por ejemplo, la focalización isoeléctrica preparatoria) , la solubilidad diferencial (por ejemplo, la precipitación de sulfato de amonio) , SDS-PAGE [electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, según su sigla en inglés] , o la extracción (ver, por ejemplo, la referencia Protein Purification, Janson and Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) , a fin de obtener polipéptidos sustancialmente puros.
En un aspecto alternativo, el polipéptido no es recuperado; en cambio, se usa una célula hospedera de la presente invención que expresa el polipéptido, como fuente del polipéptido.
Plantas .
La presente invención además se refiere a plantas aisladas, por ejemplo, una planta transgénica, parte de planta o célula de planta, que comprende un polinucleótido de la presente invención, de manera de expresar y producir un polipéptido o dominio en cantidades recuperables. El polipéptido o dominio puede ser recuperado de la planta o parte de planta. Alternativamente, la planta o parte de planta que contiene el polipéptido o dominio puede usarse como tal, para mejorar la calidad de un alimento o de una alimentación, por ejemplo, para mejorar el valor nutricional, la aceptabilidad y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot.) o monocotiledónea (una monocot . ) . Ejemplos de plantas monocot . son pasturas, tales como prados (césped, Poa) , pastura de forraje, tal como Festuca, Lolium, pasturas templadas, tales como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz (choclo) .
Ejemplos de plantas dicot. son tabaco, legumbres tales como lupinos, papa, remolacha azucarera, arvejas, habas y soja, y plantas cruciferas (familia de las Brasicáceas) , tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana.
Ejemplos de partes de plantas son tallo, callo, hojas, raíces, frutos, semillas y tubérculos, al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Los compartimientos celulares de plantas específicos, tales como cloroplastos, apoplastos, mitocondrias, vacuolas, peroxisomas y citoplasma, también se consideran partes de plantas. Asimismo, cualquier célula de planta, cualquiera sea el origen de tejido, se considera una parte de planta. Además, las partes de plantas tales como células y tejidos específicos aislados para facilitar la utilización de la invención, también se consideran partes de plantas, por ejemplo, embriones, endospermos, aleuronas y coberturas de semillas.
Se incluyen además dentro del alcance de la presente invención la descendencia de dichas plantas, partes de plantas y células de plantas.
La célula de planta o planta transgénica que expresa el polipéptido o dominio puede construirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En síntesis, la planta o célula de planta se construye mediante la incorporación de una o más construcciones de expresión que codifican el polipéptido o dominio, en el genoma hospedero de la planta o genoma del cloroplasto, y la propagación de la planta o célula de planta resultante modificada en una célula de planta o planta transgénica.
La construcción de expresión es, convenientemente, una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido o dominio funcionalmente ligado con secuencias reguladoras apropiadas necesarias para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador de selección útil para la identificación de células de plantas en las cuales se ha integrado la construcción de expresión, y secuencias de ADN necesarias para la introducción de la construcción en la planta en cuestión (estas últimas dependen del método de introducción de ADN por utilizar) .
La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias de promotor y terminador, y opcionalmente , secuencias de señal o tránsito, es determinada, por ejemplo, sobre la base de cuándo, dónde y cómo se desea expresar el polipéptido o dominio. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido o dominio puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica de tejido, etapa o desarrollo, y el producto génico puede ser dirigido a una parte de planta o un tejido específico tal como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras son descriptas, por ejemplo, por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
Para la expresión constitutiva, puede usarse el promotor 35S-CaMV, el promotor ubiquitina 1 de maíz, o el promotor actina 1 de arroz (Franck efe al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol . 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos de órganos pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos de almacenamiento enterrado, tales como semillas, tubérculos de papa y frutos (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet . 24: 275-303), o de tejidos enterrados metabólicos, tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol . 24: 863-878); un promotor específico de semilla, tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o albúmina del arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol . 39: 885-889) , un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711); un promotor de una proteína de cuerpo oleaginoso de semilla (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor de proteína de almacenamiento napA de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Solicitud Internacional WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja, tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000) , el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus de Chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), o un promotor inducible por herida tal como el promotor pin2 de la papa (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducido por tratamientos abióticos tales como la temperatura, la sequía, o alteraciones en la salinidad, o inducido por sustancias exógenamente aplicadas que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas de plantas, como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico, y metales pesados.
Además, puede usarse un elemento mej orador de promotor a fin de lograr la mayor expresión de un polipéptido o dominio en la planta. Por ejemplo, el elemento mejorador de promotor puede ser un intrón, que se coloca entre el promotor y el polinucleótido que codifica un polipéptido o dominio. A modo de ejemplo, Xu et al., 1993, supra, revelan el uso del primer intrón del gen de actina 1 del arroz para mejorar la expresión.
El gen marcador de selección y cualquier otra parte de la construcción de expresión pueden seleccionarse de aquellas que pueden obtenerse en la técnica.
La construcción de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la materia, que incluyen la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación mediada por virus, la microinyección, el bombardeo de partículas, la transformación biolística y la electroporación (Gasser efc al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
La transferencia de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens es un método para la generación de dicotiledóneas transgénicas (para una reseña, ver la referencia de Hooykas and Schilperoort , 1992, Plant Mol. Biol . 19: 15-38) y para la transformación de monocotiledóneas , si bien, para estas plantas, pueden usarse otros métodos de transformación. Un método para la generación de monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno revestidas con el ADN de transformación) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol . 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplasto, como lo describen Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Otros métodos de transformación incluyen aquellos descriptos en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros . 6.395.966 y 7.151.204 (ambas, incorporadas a modo de referencia en su totalidad) .
Luego de la transformación, los transformantes que tienen incorporada la construcción de expresión se seleccionan y se regeneran en plantas enteras, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Con frecuencia, el procedimiento de transformación es diseñado para la eliminación selectiva de genes de selección, ya sea durante la regeneración, ya sea en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, la cotransformación con dos construcciones separadas de ADN-T o la escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.
Además de la transformación directa de un genotipo de planta particular con una construcción de la presente invención, las plantas transgénicas pueden prepararse mediante el cruce de una planta que tiene la construcción, con una segunda planta que carece de la construcción. Por ejemplo, una construcción que codifica un polipéptido o dominio puede introducirse en una variedad de planta particular mediante el cruce, sin la necesidad de la transformación directa de una planta de la variedad determinada. Por lo tanto, la presente invención contempla no solo una planta directamente regenerada a partir de células que se han transformado de acuerdo con la presente invención, sino, además, la descendencia de dichas plantas. De acuerdo con la presente invención, la descendencia puede referirse a la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de acuerdo con la presente invención. La descendencia puede incluir una construcción de ADN preparada de acuerdo con la presente invención. El cruce logra la introducción de un transgén en una línea de planta mediante la polinización cruzada de una línea inicial con una línea de planta donante. Ejemplos, sin limitación, de dichas etapas se describen en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 7.151.204.
Las plantas pueden ser generadas a través de un proceso de conversión por retrocruce. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas denominadas de tipo genotipo convertido por retrocruce, de líneas, endogámicas o híbridas.
Pueden usarse marcadores genéticos para asistir en la introgresión de uno o más transgenes de la invención, desde un fondo genético hacia otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas en relación con el cultivo convencional, ya que puede usarse para evitar errores causados por variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar información relacionada con el grado relativo de plasma germinal de élite en la descendencia individual de un cruce particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado, que, de otro modo, tiene un fondo genético no agroquímicamente deseado, se cruza con una progenitora de élite, los marcadores genéticos pueden usarse para seleccionar la descendencia que no solo posee el rasgo de interés, sino, además, que tiene una proporción relativamente grande del plasma germinal deseado. De esta manera, la cantidad de generaciones necesarias para la introgresión de uno o más rasgos en un fondo genético particular se minimiza.
La presente invención además se refiere a métodos para la producción de un polipéptido o dominio de la presente invención, que comprenden (a) el cultivo de una planta transgénica o una célula de planta que comprende un polinucleotido que codifica el polipéptido o dominio, en condiciones que conducen a la producción del polipéptido o dominio; y (b) la recuperación del polipéptido o dominio.
Usos .
A continuación, se proporcionan ejemplos de usos preferidos de la lisozima o de sus composiciones de la presente invención. La dosificación de la lisozima y otras condiciones en las cuales se usa la lisozima pueden determinarse sobre la base de métodos conocidos en la técnica .
Los polipéptidos de la invención habitualmente son útiles en cualquier sitio sometido a la contaminación por bacterias, hongos, levaduras o algas. Habitualmente, los loci (lugares) son en sistemas acuosos tales como sistemas de agua refrigerante, agua de enjuague de lavado de ropa, sistemas de aceites tales como aceites de corte, lubricantes, yacimientos petrolíferos y similares, donde se desea matar los microorganismos o por lo menos controlar su crecimiento. Sin embargo, la presente invención puede usarse además en todas las aplicaciones para las cuales son útiles las lisozimas conocidas, tales como la protección de madera, látex, adhesivos, cola, papel, cartón, productos textiles, cuero, plásticos, calafateo y alimentaciones.
Una lisozima, o una composición de lisozima, de la presente invención puede usarse en varias aplicaciones para degradar un material que comprende un peptidoglucano o una quitodextrina, mediante el tratamiento del material con la lisozima o su composición (ver, por ejemplo, las referencias de Proctor and Cunningham, (1988) Critical Reviews in Food Science and Nutrition 26: 359-395; Carini et al. (1985), Microbiol . Alimen. Nutr. 3: 299-320; Hughey and Johnson (1987) Appl . Environ. Microbiol. 53:2165-2170; Cunningham et al. (1991) World's Poultry Science Journal 47:141-163).
Usos de las lisozimas de la invención para limpieza y/o detergentes .
Una lisozima de la presente invención, preferentemente, se incorpora o se usa con composiciones detergentes como se describe a continuación. Cuando el lavado se realiza repetidamente a temperaturas inferiores a 60°C, hay mayor riesgo de malos olores en la máquina de lavado (lavarropas, al igual que lavavaj illas) y en los productos textiles o artículos lavados en la máquina. Estos malos olores, probablemente, son causados por microorganismos microbianos tales como bacterias, hongos, algas u otros organismos unicelulares que crecen en la máquina de lavado.
Además, la invención se refiere a un proceso para el lavado de géneros, que comprende el tratamiento de los textiles con una solución de lavado que contiene una composición detergente y una lisozima o una composición de lisozima de la invención. El tratamiento de lavado de géneros, por ejemplo, puede llevarse a cabo en un proceso de lavado a máquina, o en un proceso de lavado manual. La solución de lavado, por ejemplo, puede ser una solución de lavado acuosa que contiene la composición detergente y que tiene un pH entre 3 y 12.
Los textiles sometidos a los métodos de la presente invención pueden ser prendas para lavado convencional, por ejemplo, ropa de lavado hogareño. Preferentemente, la mayor parte de la ropa de lavado comprende prendas de vestir y géneros, que incluyen productos tejidos, tramados, denim, hilados y toallas, hechos de algodón, combinaciones de algodón o productos celulósicos naturales o fabricados por el hombre (por ejemplo, que se originan de la pulpa de la madera) o sus combinaciones. Ejemplos de combinaciones son combinaciones de algodón o rayón/viscosa con uno o más materiales compañeros tales como lana, fibras sintéticas (por ejemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol polivinílico, fibras de cloruro de polivinilo, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida) y fibras que contienen celulosa (por ejemplo, rayón/viscosa, ramio, lino, yute, fibras de acetato de celulosa, Lyocell) .
La presente invención proporciona un método para la reducción de la contaminación microbiana sobre una superficie, tal como una prenda textil o una superficie dura tal como metal, plástico o partes de caucho en una máquina de lavado o lavavaj illas , azulejos de baños, pisos, mesas, drenajes, sumideros y lavatorios, mediante el tratamiento de la superficie microbianamente contaminada con una lisozima o composición de lisozima de la presente invención. Se espera además que el tratamiento reduzca los malos olores sobre los productos textiles y las superficies duras que contienen la contaminación microbiana.
La reducción de la contaminación microbiana puede ser evaluada de varias maneras, por ejemplo, por un panel que evalúa si el olor ha disminuido; alternativamente, puede tomarse una muestra de la superficie, y cultivarse a fin de evaluar si el recuento microbiano se ha reducido como consecuencia del tratamiento, en comparación con un tratamiento sin lisozima.
Usos de las lisozimas de la invención en alimentaciones animales .
Una lisozima de la invención puede usarse también en alimentaciones animales. En una modalidad, la presente invención provee un método para la preparación de una composición de alimentación animal que comprende la adición de una lisozima de la presente invención, a uno o más ingredientes de alimentación animal.
Una lisozima de la presente invención, por ejemplo, puede utilizarse para estabilizar la microflora saludable de los animales, en particular, en ganado, tal como, sin limitación, ovejas, cabras, vacas (incluyendo, sin limitación, ganado de carne de res, vacas y terneros), ciervos, cerdos o chanchos (que incluyen, sin limitación, cochinos, cerdos de crecimiento y puercas) , aves (que incluyen, sin limitación, gansos, pavos, patos y pollos, tales como pollos parrilleros, polluelos y gallinas); caballos, alces y conejos, y además, peces (que incluyen, sin limitación, salmón, trucha, tilapia, pez gato y carpas; y crustáceos (que incluyen, sin limitación, camarones y langostinos) ) , mediante la supresión del crecimiento o la colonización intestinal de patógenos virales (como Coronaviridae, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) , Persivirus causante de diarrea del virus bovino y similares) , patógenos parasitarios (protozoos coccidios, Eimeria máxima, Eimeria mitis) o bacterianos tales como Clostridium perfringens, Escherichia coli, Campylobacter coli, C. hyointestinalis y C. jejuni; textil Yersinia, Treponema suis, Brachyspira hyodysenteriae, Lawsonia intracellularis y Salmonella, tal como Salmonella entérica, Salmonella Typhimurium y Salmonella Mbandaka. En una modalidad preferida, la lisozima reemplaza antibióticos en dietas animales. En una modalidad preferida, se aplica una lisozima al pollo, que tiene actividad antimicrobiana contra Clostridium perfringerís . En una modalidad adicional, se usa una lisozima de la presente invención como un aditivo de alimentación, donde puede proporcionar un efecto positivo sobre el balance microbiano del aparato digestivo del pollo, y de este modo, puede mejorar el comportamiento animal.
Una lisozima de la presente invención además puede usarse en alimentaciones animales como enzima mejoradora de la alimentación, que mejora la digeribilidad de la alimentación a fin de aumentar la eficiencia de su utilización de acuerdo con las Solicitudes Internacionales WO 00/21381 y WO 04/026334.
En una modalidad adicional, una lisozima de la presente invención puede usarse como un aditivo de alimentación, donde puede proporcionar un efecto positivo sobre el aparato digestivo de los animales y, de este modo, mejorar el comportamiento animal de acuerdo con el aumento de peso, la relación de conversión de alimentación (FCR, según su sigla en inglés), o la mejorada salud animal, tal como menor tasa de mortalidad. La FCR se calcula como la ingesta de alimentación en g/animal en relación con el aumento de peso en g/animal .
Usos de las lisozimas de la invención como agentes antimicrobianos .
Una lisozima de la presente invención puede utilizarse como agente antimicrobiano. Un aspecto de la presente invención comprende un método para la reducción de la contaminación microbiana, que comprende el tratamiento de una superficie con contaminación microbiana, con una lisozima de la presente invención.
A fin de evaluar si una lisozima de la presente invención es capaz de actuar como un agente antimicrobiano, puede evaluarse en un ensayo de turbiedad. En este ensayo, se evalúa si la lisozima es capaz de degradar células microbianas, por ejemplo, un sustrato desecado de células de Exiguobacterium undae (aisladas de una media con olor) o células de Micrococcus luteus disueltas en regulador o detergente, y de ese modo, reducir la densidad óptica (DO) a, por ejemplo, 540 nm, cuando se compara con una suspensión microbiana tratada solo con regulador.
Usos de las lisozimas de la invención para la desinfección o como un desinfectante.
Una lisozima de la presente invención puede ser de utilidad como un desinfectante, o puede usarse para la desinfección, por ejemplo, para el tratamiento de infecciones en los ojos o la boca, o para la limpieza y desinfección de lentes de contacto, y para la prevención o eliminación de biopelícula sobre una superficie, de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6,777,223.
Una lisozima de la presente invención, además, puede usarse en el cuidado oral. Por ejemplo, la lisozima puede utilizarse sola o en combinación con otras enzimas, o incluso, con péptidos antimicrobianos, en pasta dental y otros productos para el cuidado oral. Los polipéptidos pueden introducirse en la cavidad oral o aplicarse a un artículo que debe ser introducido en la cavidad oral. Ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 08/124764.
En general, se contempla que los polipéptidos de la presente invención son útiles para la limpieza, desinfección o inhibición del crecimiento microbiano sobre cualquier superficie. Ejemplos de superficies que pueden ponerse en contacto, convenientemente, con los polipéptidos de la invención son superficies de equipamiento de procesamiento utilizado, por ejemplo, en plantas de procesamiento de lácteos, productos químicos o farmacéuticos, sistemas de saneamiento de agua, plantas de procesamiento de aceites, plantas de procesamiento de pulpa de papel, plantas de tratamiento de agua y torres de enfriamiento. Los polipéptidos de la invención deben ser usados en una cantidad eficaz para la limpieza, desinfección o inhibición del crecimiento microbiano sobre la superficie en cuestión.
Los polipéptidos de la invención, adicionalmente , pueden usarse para la limpieza de superficies y utensilios de cocina en plantas de procesamiento de alimentos, y en cualquier área en la cual se prepara o sirve la comida, tal como hospitales, geriátricos y restaurantes.
Usos de las lisozimas de la invención en aplicaciones de alimentos .
Una lisozima de la presente invención puede usarse, asimismo, para la inhibición selectiva del crecimiento descontrolado de Clostridium tyrobutyricum durante la maduración de quesos, en particular, aquellos elaborados a partir de cuajadas prensadas y cocidas, por ejemplo, queso suizo, parmesano, Edam, Gouda, Cheddar y muchos otros.
Una lisozima de la presente invención se puede utilizar también en la elaboración de vinos, a fin de controlar o inhibir la contaminación microbiana.
Usos de las lisozimas de la invención como tratamientos. Una lisozima de la presente invención puede usarse además en el tratamiento tópico de lesiones distróficas e inflamatorias de la piel y los tejidos blandos. Ver, por ejemplo, la referencia de Palmieri y Boraldi (1977) , Arch. Sci. Med. (Torino) 134: 481-485.
Una lisozima de la presente invención puede utilizarse en el cuidado de la piel. Por ejemplo, el polipéptido se aplica a la piel de un paciente que sufre de una infección cutánea, tal como acné. La lisozima puede usarse también en un vendaje para heridas, que se aplica a la piel herida, por ejemplo, a fin de auxiliar en la curación de la herida. Ver, por ejemplo, la referencia de la Solicitud de los Estados Unidos Nro. 20080254079.
Una lisozima de la presente invención, asimismo, puede usarse en lápices labiales, bálsamos labiales, geles labiales, o brillos labiales. Por ejemplo, los productos pueden usarse para el tratamiento de una infección localizada labial, por ejemplo, una llaga. Ver, por ejemplo, la referencia de la Solicitud de los Estados Unidos Nro. 20080254079.
Una lisozima de la presente invención también puede usarse en el tratamiento de enfermedades broncopulmonares.
Una lisozima de la presente invención puede usarse, asimismo, como enzima digestiva o auxiliar digestivo. Una lisozima de la presente invención puede usarse para mejorar el uso de bacterias muertas o vivas como fuente de alimento, por ejemplo, mediante el control de contaminantes microbianos indeseados.
Una lisozima de la presente invención puede utilizarse, además, como agente terapéutico en un humano u otro animal, por ejemplo, para el control o la inhibición del crecimiento bacteriano excesivo en los intestinos de un humano que sufre una enfermedad, por ejemplo, enfermedad pancreática, o en un paciente inmunocomprometido .
Usos de las lisozimas de la invención para la extracción de ADN genómico bacteriano.
Una lisozima de la presente invención puede usarse además a fin de auxiliar en la extracción de ADN genómico bacteriano tanto de cultivos puros como de muestras ambientales que contienen múltiples especies bacterianas. A fin de poder secuencias ADN bacteriano, la pared celular bacteriana debe descomponerse, de manera de aislar el ADN que se halla en su interior. La lisozima de clara de huevo de gallina es la enzima convencional utilizada para el aislamiento de ADN de bacterias Gram positivas, y funciona mediante la hidrolización de las cadenas de peptidoglucano presentes en la pared de la célula, de modo de auxiliar en la degradación de las paredes celulares. Sin embargo, algunas paredes celulares Gram positivas no son degradadas por las lisozimas de clara de huevo de gallina. Por ejemplo, se recomienda que las células de, por ejemplo, Staphylococcus aureus sean Usadas con lisostafina, como lo describen Pitcher y Saunders (1989) , App. Environ. Microbiol. 56(3) : 782-787. No obstante, estos métodos no funcionan para todos los tipos de bacterias Gram positivas, y por lo tanto, las nuevas lisozimas ofrecen potencialmente el acceso a nuevos genomas que no pueden ser aislados con soluciones comerciales de lisozimas.
La adición de una o más lisozimas de la presente invención, opcionalmente , en conjunto con lisostafina o lisozima de clara de huevo de gallina, logra la descomposición de las paredes celulares de bacterias, preferentemente, bacterias Gram positivas, lo que no es posible usando las soluciones comerciales actuales. En una modalidad, la lisozima es una lisozima GH25 que tiene SEC. ID. NRO. : 4, SEC. ID. NRO . : 8 o una de sus variantes. En una modalidad adicional, la lisozima es eficaz en la descomposición de las paredes celulares de bacterias tales como Bacillus, Micrococcus, Zobellia, Cellulophaga y Streptomyces. Una modalidad adicional comprende bacterias tales como Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Zobellia uliginosa, Cellulophaga lytica y Streptomyces mobaraensis . En otra modalidad, la lisozima es eficaz en combinación con lisozima de clara de huevo de gallina, en la descomposición de las paredes celulares de bacterias tales como Bacillus, Micrococcus, Zobellia, Cellulophaga y Streptomyces, por ejemplo, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Zobellia uliginosa, Cellulophaga lytica y Streptomyces mobaraensis . Una modalidad particular comprende la descomposición de las paredes celulares de la bacteria Streptomyces mobaraensis .
La lisozima de la presente invención puede usarse en una composición o en un equipo para la descomposición de las paredes celulares de bacterias, opcionalmente , en conjunto con lisostafina o lisozima de clara de huevo de gallina. El componente de lisozima puede ser una lisozima GH25 de la presente invención, o una lisozima GH25 que tiene SEC. ID. NRO.: 4, SEC. ID. NRO . : 8 o una de sus variantes.
Otros usos de las lisozimas de la invención.
Una lisozima de la presente invención además se puede usar en el control del crecimiento microbiano en un proceso de fermentación, tal como en la elaboración de etanol u otros productos a partir de biomasa. Ver, por ejemplo, la referencia de la Solicitud Internacional WO 2007/109750. Por consiguiente, la lisozima puede utilizarse, por ejemplo, en un proceso para la elaboración de un producto de fermentación, que comprende: (a) la licuación y/o sacarificación de un material de carbohidrato; y (b) la fermentación usando un organismo de fermentación, donde se aplica una lisozima de la presente invención al proceso de fermentación, antes o después de la fermentación, o durante la fermentación, en concentraciones suficientes para matar o inhibir el crecimiento de células bacterianas.
Una lisozima de la presente invención también se puede usar en el control del crecimiento microbiano en un criadero de peces o langostinos.
Otros usos comprenden la preservación de alimentos, bebidas, cosméticos, tales como lociones, cremas, geles, pomadas, jabones, champús, acondicionadores, antitranspirantes , desodorantes, formulaciones enzimáticas o ingredientes de alimentos.
Composiciones .
En aun otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención, que tienen actividad antimicrobiana y/o actividad de lisozima.
La composición puede comprender un polipéptido de la invención como el principal componente enzimático, por ejemplo, una composición de monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, deoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa .
Las composiciones pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, y pueden presentarse en forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede presentarse en forma de un granulado o microgranulado . El polipéptido por incluir en la composición puede estabilizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
A continuación, se proporcionan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones en las cuales se usa la composición pueden determinarse sobre la base de métodos conocidos en la técnica.
Composición de extracción de ADN genómico bacteriano.
La lisozima de la invención puede agregarse a una composición, y en consecuencia, tornarse un componente de ella, para la extracción de ADN genómico de bacterias. La lisozima puede usarse, adicionalmente , en combinación con una o más lisozimas adicionales, como, sin limitación, lisostafina, mutanolisina o lisozima de clara de huevo de gallina. La composición puede formar parte de un equipo que puede mezclarse de acuerdo con un grupo de instrucciones para la extracción de ADN genómico de bacterias. El equipo puede contener un regulador, uno o más aglutinantes iónicos metálicos, tales como EDTA [ácido etilendiamina tetraacético, según su sigla en inglés] , una proteasa, tal como proteinasas K, un detergente, tal como SDS (dodecil sulfato de sodio) o Tritón X, y una o más lisozimas, tales como la lisozima GH25 de la invención, lisostafina, mutanolisina o lisozima de clara de huevo de gallina. El ADN genómico bacteriano puede extraerse tanto de cultivos puros como de muestras ambientales que contienen múltiples especies bacterianas. Una modalidad preferida es una lisozima GH25 que tiene SEC. ID. NRO. : 4, SEC. ID. NRO. : 8 o una de sus variantes.
Composiciones de alimentación animal.
La presente invención se dirige además a métodos para el uso de los polipéptidos de la presente invención que tienen actividad de lisozima, en alimentación animal, al igual que a composiciones de alimentaciones y aditivos de alimentaciones que comprenden las lisozimas de la invención.
El término "animal" incluye todos los animales, incluso, seres humanos. Ejemplos de animales son aquellos rumiantes y no rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras y vacas, por ejemplo, ganado de carne de res y vacas. En una modalidad particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos , por ejemplo, cerdos o chanchos (que incluyen, sin limitación, cochinos, cerdos de crecimiento y puercas); aves, tales como gansos, pavos, patos y pollos (que incluyen, sin limitación, pollos parrilleros y gallinas) ; caballos (que incluyen, sin limitación, pura sangre, de sangre fría y de sangre caliente) ; terneros jóvenes; y peces (que incluyen, sin limitación, salmón, trucha, tilapia, pez gato y carpas) ; y crustáceos (que incluyen, sin limitación, camarones y langostinos) .
El término "alimentación" o "composición de alimentación" significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición, adecuada o propuesta para la ingesta por un animal. En el uso de acuerdo con la invención, la lisozima puede ser suministrada al animal antes o después de la dieta, o, preferentemente, en forma simultánea con la dieta. Dichas composiciones de lisozima, naturalmente, pueden mezclarse con otras enzimas.
La lisozima puede agregarse a la alimentación en cualquier forma, por ejemplo, como una lisozima relativamente pura, o en mezcla con otros componentes propuestos para la adición a la alimentación animal, es decir, en forma de aditivos de alimentación animal, como las así denominadas premezclas para alimentación animal. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a composiciones para el uso en alimentación animal, tal como alimentación animal y aditivos de alimentación animal, por ejemplo, premezclas.
Aparte de la lisozima de la invención, los aditivos de alimentación animal de la invención contienen por lo menos una vitamina soluble en grasa, y/o por lo menos una vitamina soluble en agua, y/o por lo menos un oligoelemento, y/o por lo menos un macroelemento .
Asimismo, ingredientes opcionales, aditivos de alimentación, son agentes colorantes, por ejemplo, carotenoides tales como beta-caroteno, astaxantina y luteína; estabilizadores; aditivos mej oradores del crecimiento y compuestos aromáticos o saborizantes , por ejemplo, creosol, anetol , deca-, undeca- y/o dodeca-lactonas , iononas, irona, gingerol, piperidina, propilideno ftalida, butilideno ftalida, capsaicina y/o tanino; ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, según su sigla en inglés) ; especies generadores de oxígeno reactivo; además, puede usarse un soporte que contiene, por ejemplo, 40-50% en peso de fibras de madera, 8- 10% en peso de estearina, 4-5% en peso de polvo de Cúrcuma, 4-58% en peso de polvo de romero, 22-28% en peso de caliza, 1-3% en peso de una goma, tal como goma arábiga, 5-50% en peso de azúcar y/o almidón, y 5-15% en peso de agua.
Una alimentación o un aditivo de alimentación de la invención además puede comprender por lo menos una enzima adicional seleccionada de fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4), fosfolipasa Al (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa, tal como alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).
Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como ácido araquidónico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentaenoico y ácido gamma-linoleico .
Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son agentes químicos tales como perborato, persulfato o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.
Habitualmente , las vitaminas solubles en agua y en grasa, al igual que los oligoelementos , forman parte de una así denominada premezcla propuesta para la adición a la alimentación, mientras que los macroelementos habitualmente se agregan en forma separada a la alimentación. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con una proteasa de la invención, es un aditivo de alimentación animal de la invención.
En una modalidad particular, el aditivo de alimentación animal de la invención se propone para la inclusión (o se prescribe para la inclusión) en dietas animales o en alimentación animal en concentraciones de 0.1 p. p. m. a 1000 p. p. m. , preferentemente, 0.5 p. p. m. a 200 p. p. m., y más preferentemente, 1 p. p. m. a 100 p. p. m. Los niveles de dosificación recién mencionados también pueden usarse para premezclas .
La composición de alimentación animal de la invención puede contener por lo menos una proteína vegetal, como aquella derivada o que se origina de un vegetal, que incluye proteínas modificadas y derivados de proteínas. Las proteínas vegetales pueden derivar de fuentes de proteínas vegetales, como legumbres y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias Fabaceae (Leguminosae) , Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupinos y harina de semilla de colza. Alternativamente, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quínoa . Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón y repollo, y cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (choclo), arroz, triticale y sorgo.
La composición de alimentación animal de la invención además puede contener proteína animal, como harina de carne y huesos, harina de plumaje y/o harina de pescado, habitualmente, en una cantidad de 0-25%. La composición de alimentación animal de la invención también puede comprender granos desecados de la destilación con solubles (DDGS, según su sigla en inglés), habitualmente, en cantidades de 0-30%.
Aun en otras modalidades particulares, la composición de alimentación animal de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-25% de harina de pescado; y/o 0-25% de harina de carne y huesos; y/o 0-20% de suero.
Las dietas animales, por ejemplo, pueden fabricarse como alimentación en puré (no miniesferizada) o alimentación miniesferizada . Habitualmente, las alimentaciones molidas se mezclan, y se agregan cantidades suficientes de minerales y vitaminas esenciales de acuerdo con las especificaciones para la especies en cuestión. Pueden agregarse las enzimas como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, para alimentaciones en puré, puede agregarse una formulación enzimática sólida o líquida antes de la etapa de mezcla de ingredientes, o durante la etapa. Para alimentaciones miniesferizadas , la preparación (líquida o sólida) de lisozima/enzima también puede agregarse antes de la etapa de mezcla de ingredientes de la alimentación, o durante la etapa. Habitualmente , se agrega una preparación líquida de lisozima/enzima después de la etapa de miniesferización. La enzima también puede ser incorporada en una premezcla o un aditivo de alimentación.
La concentración de enzima final en la dieta se encuentra dentro del intervalo de 0.01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo, en el intervalo de 0.5-25 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal.
Composiciones detergentes o de limpieza.
La lisozima de la invención puede agregarse a una composición detergente, y en consecuencia, tornarse un componente de la composición, en particular, un detergente líquido que tiene un pH de 7 o inferior.
La composición detergente de la invención, por ejemplo, puede ser formulada como una composición detergente para el lavado de ropa manual o en lavarropas, que incluye una composición aditiva para el lavado de ropa adecuada para el pretratamiento de textiles manchados, y una composición suavizante de textiles agregada como enjuague; o puede ser formulada como una composición detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras hogareñas generales; o puede ser formulada para operaciones de lavado de vajilla manual o en lavavaj illas .
En un aspecto específico, la invención provee un aditivo de detergente que comprende la lisozima de la invención. El aditivo de detergente, al igual que la composición detergente, pueden comprender una o más enzimas adicionales, como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o una peroxidasa.
En general, las propiedades de las enzimas seleccionadas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y las enzimas deben presentarse en cantidades eficaces.
En una modalidad, la invención se dirige a composiciones detergentes o de limpieza que comprenden una enzima de la presente invención en combinación con uno o más componentes de limpieza adicionales. La elección de componentes de limpieza adicionales se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica, e incluye ingredientes convencionales, que abarcan los componentes no limitativos ejemplares que se exponen a continuación.
La elección de componentes puede incluir, para el cuidado de productos textiles, la consideración del tipo de producto textil por limpiar, el tipo y el grado de suciedad, la temperatura a la cual debe tener lugar la limpieza, y la formulación del producto detergente. Si bien los componentes mencionados a continuación se categorizan conforme a una función particular, esta categorización no debe interpretarse como una limitación, ya que el componente puede tener una o más funcionalidades adicionales, que apreciará el experto en la técnica.
La composición detergente o de limpieza puede ser adecuada para el lavado de productos textiles tales como géneros, lienzos o blanquería; para la limpieza de superficies duras, tales como pisos y mesas; o para el lavado de vajilla.
La invención además se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos; a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos; al igual que a métodos para la producción y el uso de los polipéptidos.
Tensioactivos .
La composición detergente puede comprender uno o más tensioactivos , que pueden ser aniónicos, catiónicos, no iónicos, semipolares, zwiteriónicos , o una mezcla de los anteriores. En una modalidad particular, la composición detergente incluye una mezcla de uno o más tensioactivos no iónicos y uno o más tensioactivos aniónicos. Los tensioactivos habitualmente se presentan en concentraciones de alrededor de 0.1% a 60% en peso, tal como alrededor de 1% a alrededor de 40%, o alrededor de 3% a alrededor de 20%, o alrededor de 3% a alrededor de 10%. Los tensioactivos se seleccionan sobre la base de la aplicación de limpieza deseada, e incluyen cualquier tensioactivo convencional conocido en la técnica. Puede utilizarse cualquier tensioactivo conocido en la técnica para el uso en detergentes .
Cuando se incluye, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% en peso, tal como de aproximadamente 5% a aproximadamente 30%, lo que incluye de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, o de aproximadamente 20% a aproximadamente 25%, de un tensioactivo aniónico. Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos aniónicos incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS, según su sigla en inglés) , isómeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS, según su sigla en inglés) , fenilalcanesulfonatos , alfa-olefinasulfonatos (AOS) , olefinasulfonatos , alqueno sulfonatos, alcano-2 , 3-diilbis (sulfatos) , hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos , alquilsulfatos (AS) tales como dodecil sulfato de sodio (SDS) , sulfatos de alcoholes grasos (FAS, según su sigla en inglés) , sulfatos de alcoholes primarios (PAS, según su sigla en inglés) , alcohol etersulfatos (AES o AEOS o FES, también conocidos como alcohol etoxisulfatos o éter sulfatos de alcohol graso) , alcanosulfonatos secundarios (SAS) , sulfonatos de parafina (PS) , éster sulfonatos, glicerol esteres de ácidos grasos sulfonados, esteres metílicos de alfa-sulfo ácidos grasos (alfa-SFMe o SES) que incluyen metil éster sulfonato (MES) , ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido dodecenil/tetradecenil succínico (DTSA, según su sigla en inglés) , derivados de ácidos grasos de aminoácidos, diésteres y monoésteres de jabón o ácido sulfosuccínico y sus combinaciones .
Cuando se incluyen, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo catiónico. Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos catiónicos incluyen aquilidimetiletanolamina quat (ADMEAQ) , bromuro de cet ltrimetilamonio (CTAB) , cloruro de dimetildiestearilamonio (DSDMAC) y alquilbencildimetilamonio, compuestos de alquilo amonio cuaternario, compuestos de amonio cuaternario alcoxilados (AQA) y sus combinaciones.
Cuando se incluye, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 40% en peso de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 30%, en particular, de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 10%, tal como de aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, o de aproximadamente 8% a aproximadamente 12%. Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos no iónicos incluyen alcohol etoxilados (AE o AEO) , alcohol propoxilados, alcoholes grasos propoxilados (PFA) , ésteres de alquilo de ácidos grasos alcoxilados, tales como ésteres de alquilo de ácidos grasos etoxilados y/o propoxilados, alquilfenol etoxilados (APE) , nonilfenol etoxilados (NPE) , alquilpoliglicósidos (APG) , aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácidos grasos (FAM) , dietanolamidas de ácidos grasos (FADA) , monoetanolamidas de ácidos grasos etoxilados (EFAM) , monoetanolamidas de ácidos grasos propoxilados (PFAM) , amidas de ácidos grasos de polihidroxi alquilo, o N-acil iV-alquil derivados de glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de ácidos grasos, FAGA) , al igual que productos que pueden obtenerse con las denominaciones comerciales SPAN y TWEEN, y sus combinaciones.
Cuando se incluye, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo semipolar. Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos semipolares incluyen óxidos de amina (AO) tales como óxido de alquildimetilamina , óxido de N- (coco alquil) -N, W-dimetilamina y óxido de N- (sebo-alquil) -N, N-bis (2-hidroxietil) amina, alcanolamidas de ácidos grasos y alcanolamidas de ácidos grasos etoxilados, y sus combinaciones.
Cuando se incluye, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo zwiteriónico . Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos zwiteriónicos incluyen betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína y sus combinaciones.
Hidrótropos .
Un hidrótropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrófobos en soluciones acuosas (u, opuestamente, sustancias polares en un entorno no polar) . Habitualmente, los hidrótropos tienen tanto carácter hidrófilo como hidrófobo (así denominadas propiedades anfifílicas como se conocen de los tensioactivos) ; sin embargo, la estructura molecular de los hidrótropos generalmente no favorece la autoagregación espontánea; ver, por ejemplo, la reseña de Hodgdon y Kaler (2007), Current Opinión in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Los hidrótropos no exhiben una concentración crítica sobre la cual se produce la autoagregación, como se halla para tensioactivos y lípidos que forman fases micelares, lamelares u otras mesofases bien definidas. En cambio, muchos hidrótropos muestran un proceso continuo de agregación, donde los tamaños de los agregados crecen a medida que aumenta la concentración. Sin embargo, muchos hidrótropos alteran el comportamiento de fases, la estabilidad y las propiedades coloidales de sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, que incluyen mezclas de agua, aceite, tensioactivos y polímeros. Los hidrótropos se usan clásicamente a través de todas las industrias, desde la farmacia, el cuidado personal, los alimentos, hasta aplicaciones técnicas. El uso de hidrótropos en composiciones detergentes permite, por ejemplo, formulaciones de tensioactivos más concentradas (como en el proceso de la compactacion de detergentes líquidos mediante la eliminación de agua) , sin inducir fenómenos indeseados tales como la separación de fases, o la alta viscosidad.
El detergente puede contener 0-5% en peso, tal como alrededor de 0.5 a aproximadamente 5%, o aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, de un hidrótropo. Puede utilizarse cualquier hidrótropo conocido en la técnica para el uso en detergentes. Ejemplos no limitativos de hidrótropos incluyen benceno sulfonato de sodio, p-tolueno sulfonato de sodio (STS) , xileno sulfonato de sodio (SXS) , eumeno sulfonato de sodio (SCS) , cimeno sulfonato de sodio, óxidos de amina, alcoholes y poliglicol éteres, hidroxinaftoato de sodio, hidroxinaftaleno sulfonato de sodio, etil hexil sulfato de sodio y sus combinaciones.
Reforzadores y correforzadores.
La composición detergente puede contener aproximadamente 0-65% en peso, tal como aproximadamente 5% a aproximadamente 45% de un reforzador o correforzador de detergente, o una de sus mezclas. En un detergente de lavado de vajilla, el nivel de reforzador habitualmente es de 40-65%, en particular, 50-65%. El reforzador y/o correforzador, en particular, pueden ser un agente quelante que forma complejos solubles en agua con Ca y g. Puede utilizarse cualquier reforzador y/o correforzador conocido en la técnica para el uso en detergentes para el lavado de ropa. Ejemplos, sin limitación, de reforzadores incluyen zeolitas, difosfatos (pirofosfatos) , trifosfatos tales como trifosfato de sodio (STP o STPP) , carbonatos tales como carbonato de sodio, silicatos solubles tales como metasilicato de sodio, silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6, de Hoechst) , etanolaminas tales como 2-aminoetan-l-ol (MEA) , dietanolamina (DEA, también conocida como iminodietanol) , trietanolamina (TEA, también conocida como 2 , 2 ' , 2"-nitrilotrietanol) y carboximetil inulina (CMI) , y sus combinaciones.
La composición detergente además puede contener 0-20% en peso, tal como aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, de un correforzador de detergente, o una de sus mezclas. La composición detergente puede comprender un correforzador solo, o en combinación con un reforzador, por ejemplo, un reforzador de zeolita. Ejemplos no limitativos de correforzadores incluyen homopolímeros de poliacrilatos o sus copolímeros, tales como poli (ácido acrílico) (PAA) o copoli (ácido acrílico/ ácido maleico) (PAA/PMA) . Otros ejemplos, sin limitación, abarcan citrato, quelantes tales como aminocarboxilatos , aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y ácido alquil- o alquenilsuccínico . Otros ejemplos específicos abarcan ácido 2 , 2 ' , 2"-nitrilotriacético (NTA) , ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) , ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) , ácido iminodisuccínico (IDS) , ácido etilenodiamina-N, N' -disuccínico (EDDS) , ácido metilglicinadiacético (MGDA) , ácido glutámico-N, - ácido diacético (GLDA) , ácido 1-hidroxietano-l , 1-difosfónico (HEDP) , etilenodiaminatetra- ( ácido metilenofosfónico) (EDTMPA) , dietilenotriaminapentakis (ácido metilenofosfónico) (DTPMPA o DTMPA) , ácido N- (2-hidroxietil ) iminodiacético (EDG) , ácido aspártico-N- ácido monoacético (ASMA) , ácido aspártico-N, N- ácido diacético (ASDA) , ácido aspártico-N-ácido monopropiónico (ASMP) , ácido iminodisuccínico (IDA) , ácido N- (2-sulfometil) -aspártico (SMAS) , ácido N- (2-sulfoetil) -aspártico (SEAS), ácido N- (2-sulfometil ) -glutámico (SMGL) , ácido N- (2-sulfoetil) -glutámico (SEGL) , ácido N-metiliminodiacético (MIDA) , ácido a-alanina-N, N-diacético (a-ALDA) , ácido serina-N, N-diacético (SEDA), ácido isoserina-N, iV-diacético (ISDA) , ácido fenilalanina-N, N-diacético (FDA) , ácido antranílico-N, N-diacético (ANDA) , ácido sulfanílico-N, iV-diacético (SLDA) , ácido taurina-N, N-diacético (TUDA) y ácido sulfometil-N, N-diacético (SMDA) , N- (2-hidroxietil) -etilidendiamina-N, N' /N'-triacetato (HEDTA) , dietanolglicina (DEG) , dietilenotriamina penta (ácido metilenofosfónico) (DTPMP) , aminotris (ácido metilenofosfónico) (ATMP) , y sus combinaciones y sales. Otros reforzadores y correforzadores ejemplares se describen, por ejemplo, en la Solicitud Internacional WO 09/102854, y Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 5977053 Sistemas de blanqueo.
El detergente puede contener 0-50% en peso, tal como aproximadamente 0.1% a aproximadamente 25%, de un sistema de blanqueo. Puede utilizarse cualquier sistema de blanqueo conocido en la técnica para el uso en detergentes de lavado de ropa. Los componentes adecuados de sistemas de blanqueo incluyen catalizadores de blanqueo, fotoblanqueadores , activadores de blanqueo, fuentes de peróxido de hidrógeno tales como percarbonato de sodio y perboratos de sodio, perácidos preformados y sus mezclas. Los perácidos preformados adecuados incluyen, sin limitación, ácidos peroxicarboxílicos y sales, ácidos percarbónicos y sales, ácidos perimídicos y sales, ácidos peroximonosulfúricos y sales, por ejemplo, Oxone (R) , y sus mezclas. Ejemplos no limitativos de sistemas de blanqueo contemplan sistemas de blanqueo a base de peróxidos, que pueden comprender, por ejemplo, una sal inorgánica, que incluye sales metálicas alcalinas tales como sales de sodio de perborato (habitualmente , mono- o tetra-hidrato) , percarbonato, persulfato, perfosfato, sales de persilicato, en combinación con un activador de blanqueo de formación de perácido. El término activador de blanqueo significa, en esta solicitud, un compuesto que reacciona con blanqueo de peroxígeno como peróxido de hidrógeno, para formar un perácido. El perácido formado de esta manera constituye el blanqueo activado. Los activadores de blanqueo adecuados para ser utilizados en la presente invención incluyen aquellos que pertenecen a la clase de ésteres amidas, imidas o anhídridos. Ejemplos adecuados son tetracetiletileno diamina (TAED) , 4-[(3,5,5-trimetilhexanoil) oxi] benceno sulfonato de sodio (ISONOBS) , ácido diperoxi dodecanoico, 4- (dodecanoiloxi) bencenosulfonato (LOBS) , 4- (decanoiloxi ) bencenosulfonato, 4- (decanoiloxi) enzoato (DOBS) , 4- (nonanoiloxi) -bencenosulfonato (NOBS) , y/o aquellos revelados en la Solicitud Internacional WO 98/17767. Una familia particular de activadores de blanqueo de interés fue revelada en la Patente Europea EP 624154, y en particular, preferentemente, en la familia, el acetil trietil citrato (ATC) . El ATC o un triglicérido de cadena corta como triacetina posee la ventaja de ser seguro para el medio ambiente, ya que finalmente se degrada en ácido cítrico y alcohol. Además, el acetil trietil citrato y la triacetina tienen buena estabilidad hidrolítica en el producto con el almacenamiento, y son activadores de blanqueo eficientes. Por último, ATC proporciona una buena capacidad reforzadora al aditivo para el lavado de ropa.
Alternativamente, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos de, por ejemplo, el tipo amida, imida, o sulfona. El sistema de blanqueo además puede comprender perácidos, tales como ácido 6- (ftalimido) peroxihexanoico (PAP) . El sistema de blanqueo también puede incluir un catalizador de blanqueo. En algunas modalidades, el componente de blanqueo puede ser un catalizador orgánico seleccionado del grupo que consiste en catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: (iii) y sus mezclas; donde cada R1 es, de manera independiente, un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 24 carbonos, o grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 24 carbonos; preferentemente, cada R1 es, de manera independiente, un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 18 carbonos, o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 18 carbonos; más preferentemente, cada R1 es de manera independiente seleccionado del grupo que consiste en 2-propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, iso-nonilo, iso-decilo, iso-tridecilo e iso-pentadecilo . Otros ejemplos de sistemas de blanqueo se describen, por ejemplo, en las Solicitudes Internacionales WO 2007/087258, WO 2007/087244, WO 2007/087259 y WO 2007/087242. Los fotoblanqueadores adecuados, por ejemplo, pueden ser ftalocianina de zinc sulfonada.
Polímeros .
El detergente puede contener 0-10% en peso, tal como 0.5-5%, 2-5%, 0.5-2% o 0.2-1% de un polímero. Puede utilizarse cualquier polímero conocido en la técnica para el uso en detergentes. El polímero puede funcionar como un correforzador, como se menciona con anterioridad, o puede proporcionar actividad contra el redepósito, protección de fibras, liberación de manchas, inhibición de la transferencia de tinturas, propiedades de limpieza de grasa y/o antiespumantes . Algunos polímeros pueden tener más de una de las propiedades recién mencionadas, y/o más de uno de los factores mencionados a continuación. Ejemplos de polímeros incluyen (carboximetil) celulosa (CMC), poli (vinil alcohol) (PVA) , poli (vinilpirrolidona) (PVP) , poli (etilenglicol ) o poli (etilenóxido) (PEG) , poli (etilenimina) etoxilada, carboximetil inulina (CMI) y policarboxilatos tales como PAA, PAA/PMA, ácido poli-aspártico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico, CMC hidrófobamente modificada (HM-CMC) y siliconas, copolímeros de ácido tereftálico y glicoles oligómeros, copolímeros de poli (etilentereftalato) y poli (oxieteno tereftalato) (PET-POET) , PVP, poli (viniliraidazol) (PVI) , poli (vinilpiridina-N-óxido) (PVPO o PVPNO) y polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI) . Otros polímeros ejemplares abarcan policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno y óxido de polipropileno (PEO-PPO) y dicuaternio etoxi sulfato. Otros polímeros ejemplares se revelan, por ejemplo, en la Solicitud Internacional WO 2006/130575. Se contemplan además las sales de los polímeros mencionados anteriormente.
Agentes matizantes de géneros.
Las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir además agentes matizantes de textiles tales como tinturas o pigmentos, que, cuando son formulados en composiciones detergentes, pueden depositarse sobre un textil cuando el textil se pone en contacto con un licor de lavado que comprende dichas composiciones detergentes, y en consecuencia, se altera el tinte del textil a través de la absorción o el reflejo de luz visible. Los agentes blanqueadores fluorescentes emiten por lo menos cierta luz visible. En contraste, los agentes matizantes de textiles alteran el tinte de una superficie, a medida que absorben por lo menos una porción del espectro de luz visible. Los agentes matizantes de textiles adecuados incluyen tinturas y conjugados de tintura-arcilla, y además, pueden incluir pigmentos. Las tinturas adecuadas incluyen tinturas de molécula pequeña y tinturas poliméricas. Las tinturas de molécula pequeña incluyen tinturas de molécula pequeña seleccionadas del grupo que consiste en tinturas que se encuentran en la clasificación del índice de Colores (C.I.) de Direct Blue (azul directo) , Direct Red (rojo directo) , Direct Violet (violeta directo) , Acid Blue (azul ácido) , Acid Red (rojo ácido) , Acid Violet (violeta ácido) , Basic Blue (azul básico) , Basic Violet (violeta básico) y Basic Red (rojo básico) , o sus mezclas, por ejemplo, como se describe en las Solicitudes Internacionales WO 2005/03274, WO 2005/03275, WO 2005/03276 y en la Patente Europea EP 1876226 (incorporadas en esta solicitud a modo de referencia) . La composición detergente, preferentemente, comprende de aproximadamente 0.00003% en peso a aproximadamente 0.2% en peso, de aproximadamente 0.00008% en peso a aproximadamente 0.05% en peso, o aun de aproximadamente 0.0001% en peso a aproximadamente 0.04% en peso de agente matizante de género. La composición puede comprender de 0.0001% en peso a 0.2% en peso de agente matizante de género; este intervalo puede ser especialmente preferido cuando la composición se presenta en la forma de una bolsa de dosis unitaria. Los agentes matizantes adecuados se describen además, por ejemplo, en las Solicitudes Internacionales WO 2007/087257 y WO 2007/087243.
Enzimas adicionales.
En un aspecto, la presente invención provee un aditivo de detergente que comprende una lisozima de la presente invención. El aditivo de detergente, al igual que la composición detergente, pueden comprender una o más enzimas [adicionales] , tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa y/o peroxidasa.
En general, las propiedades de las enzimas seleccionadas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y las enzimas deben presentarse en cantidades eficaces.
Celulasas : Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los textiles Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporum que se revelan en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros . US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y en la Solicitud Internacional WO 89/09259.
Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de dichas celulasas son celulasas descritas en las Patentes Europeas EP 0 495 257, EP 0 531 372, y en las Solicitudes Internacionales WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son celulasas variantes tales como aquellas que se describen en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
Las celulasas comerciales abarcan Celluzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S) , Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)™ (Kao Corporation) .
Proteasas : Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferentemente, una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas, en especial, aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (que se describen en la Solicitud Internacional WO 89/06279) . Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium que se describe en las Solicitudes Internacionales WO 89/06270 y WO 94/25583.
Ejemplos de proteasas útiles son las variantes que se describen en las Solicitudes Internacionales WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, en especial, las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
Las enzimas proteasas comerciales preferidas incluyen Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™, y Kannase™ (Novozymes A/S) , Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OxP™, FN2™ y FN3™ (Genencor International Inc.).
Lipasas y cutinasas: Las lipasas y cutinasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fungico. Se incluyen enzimas mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. Ejemplos incluyen lipasa de Thermomyces, por ejemplo, de T. lanuginosus (previamente denominada Humicola lanuginosa) como se describe en la Patente EP 258068 y en la Patente EP 305216; cutinasa de Humicola, por ejemplo, H. insolens (WO 96/13580); lipasa de cepas de Pseudomonas (algunas de estas, ahora renombradas como Burkholderia) , por ejemplo, P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218272) , P. cepacia (EP 331376), cepa P. sp . SD705 (WO 95/06720 y WO 96/27002) , P. wisconsinensis (WO 96/12012) , lipasas de tipo GDSL de Streptomyces (WO 10/065455); cutinasa de Magnaporthe grísea (WO 10/107560) , cutinasa de Pseudomonas mendocina (US 5.389.536); lipasa de Thermobifida fusca (WO 11/084412), lipasa de Geobacillus stearothermophilus (WO 11/084417), lipasa de Bacillus subtilis (WO 11/084599) y lipasa de Streptomyces griseus (WO 11/150157) y S. pristinaespiralis (WO 12/137147) .
Otros ejemplos son variantes de lipasas tales como aquellas descritas en la Patente Europea EP 407225, en las Solicitudes Internacionales WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 07/87508 y WO 09/109500.
Los productos preferidos de lipasas comerciales incluyen Lipolase™, Lipex™; Lipolex™ y Lipoclean™ (Novozymes A/S) , Lumafast (originalmente de Genencor) y Lipomax (originalmente, de Gist-Brocades) .
Aun otros ejemplos son lipasas a veces denominadas aciltransferasas o perhidrolasas , por ejemplo, aciltransferasas con homología a la lipasa A de Candida antárctica (WO 10/111143) , aciltransferasa de Mycobacterium smegmatis (WO 05/56782) , perhidrolasas de la familia CE 7 (WO 09/67279) y variantes de la perhidrolasa de M. smegmatis, en particular, la variante S54V utilizada en el producto comercial Gentle Power Bleach de Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 10/100028) .
Amilasas : Las amilasas adecuadas (a y/o ß) incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita en más detalle en la Patente Británica GB 1.296.839.
Ejemplos amilasas útiles son las variantes que se describen en las Solicitudes Internacionales WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, en especial, las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.
Las amilasas comerciales son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme ™, Natalase™ y BAN™ (Novozymes A/S) , Rapidase™ y Purastar™ (de Genencor International Inc.) .
Peroxidasas/Oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen de planta, bacteriano o fúngico. Se incluyen las mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y sus variantes, como aquellas descritas en las Solicitudes Internacionales WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Las peroxidasas comerciales incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S) .
Las enzimas de detergentes pueden incluirse en una composición detergente mediante la adición de aditivos separados que contienen una o más enzimas, o mediante la adición de un aditivo combinado que comprende la totalidad de estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse, por ejemplo, como un granulado, líquido, una suspensión, etc. Las formulaciones de aditivos detergentes preferidas son granulados, en particular, granulados no polvorosos, líquidos, en particular, líquidos estabilizados, o suspensiones.
Los granulados no polvorosos pueden producirse, por ejemplo, como se revela en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros . US 4,106,991 y 4,661,452, y opcionalmente , pueden revestirse por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son productos de poli (etilenóxido) (polietilenglicol , PEG) con medias de peso molar de 1000 a 20,000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono, y en los cuales hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento formadores de película adecuados para la aplicación por medio de técnicas de lecho fluido se proporcionan en la Patente Británica GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas, por ejemplo, pueden ser estabilizadas mediante la adición de un poliol, tal como propilenglicol , un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico, de acuerdo con métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden prepararse de acuerdo con el método que se revela en la Patente Europea EP 238,216.
Materiales coadyuvantes .
Puede emplearse además cualquier componente detergente conocido en la técnica para el uso en detergentes de lavado de ropa. Otros componentes detergentes opcionales incluyen agentes anticorrosivos, agentes contra el encogimiento, agentes contra el redepósito de suciedad, agentes contra las arrugas, bactericidas, aglutinantes, inhibidores de la corrosión, agentes desintegrantes o de desintegración, tinturas, estabilizadores enzimáticos (que incluyen ácido bórico, boratos, CMC, y/o polioles tales como propilenglicol) , acondicionadores de géneros, que incluyen arcillas, rellenos/auxiliares de procesamiento, agentes blanqueadores fluorescentes/abrillantadores ópticos, reforzadores de la espuma, reguladores de la espuma (jabonadura) , perfumes, agentes de suspensión de suciedad, suavizantes, supresores de la jabonadura, inhibidores de la decoloración y agentes de enjuague, solos o en combinación. Puede utilizarse cualquier ingrediente conocido en la técnica para el uso en detergentes de lavado de ropa. La elección de los ingredientes se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica.
Dispersantes : Las composiciones detergentes de la presente invención además pueden contener dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Los materiales orgánicos solubles en agua adecuados incluyen los ácidos homo- o copoliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Los dispersantes adecuados se describen, por ejemplo, en Powdered Detergente, Surfactant science series volume 72, Marcel Dekker, Inc.
Agentes de inhibición de la transferencia de tinturas: Las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir además uno o más agentes de inhibición de la transferencia de tinturas. Los agentes de inhibición de la transferencia de tinturas poliméricos adecuados incluyen, sin limitación, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o sus mezclas. Cuando se presentan en una composición de la presente invención, los agentes de inhibición de la transferencia de tinturas pueden hallarse en concentraciones de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5% o aun de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% en peso de la composición.
Agente blanqueador fluorescente: Las composiciones detergentes de la presente invención, preferentemente, contienen además componentes adicionales que pueden dar un tinte a los artículos limpiados, tales como agentes blanqueadores fluorescentes o abrillantadores ópticos. Cuando se presenta, el abrillantador, preferentemente, se encuentra en una concentración de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.5%. Puede utilizarse cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para el uso en una composición detergente para el lavado de ropa, en la composición de la presente invención. Los agentes blanqueadores fluorescentes más comúnmente utilizados son aquellos que pertenecen a las clases de derivados de diaminoestilbeno-ácido sulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados de bisfenil-diestirilo . Ejemplos de agentes blanqueadores fluorescentes del tipo derivado de diaminoestilbeno-ácido sulfónico incluyen las sales de sodio de : 4,4' -bis- (2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 2 ' -disulfonato; 4,4' -bis- (2 , 4-dianilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2.21 -disulfonato; 4, 4 '-bis- (2- anilino-4 (N-metil-N-2-hidroxi-etilamino) -s-triazin-6-ilamino) es ilbeno-2 , 2 ' -disulfonato, 4,4' -bis- (4-fenil-2 , 1 , 3-triazol-2-il) estilbeno-2 , 2 ' -disulfonato ; 4 , 41 -bis- (2-anilino-4 (1-metil-2-hidroxi-etilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 2 ' -disulfonato y 2- (estilbil-4 "-napto-l . , 2 ' : 4 , 5 ) -1 , 2 , 3-trizol-2 "-sulfonato . Los agentes blanqueadores fluorescentes preferidos son Tinopal DMS y Tinopal CBS, que pueden obtenerse en Ciba-Geigy AG, Basel, Suiza. Tinopal DMS es la sal disódica de 4 , 41 -bis- (2-morfolino-4 anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno disulfonato. Tinopal CBS es la sal disódica de 2 , 21 -bis- (fenil-estiril ) disulfonato. Además, se prefieren los agentes blanqueadores fluorescentes como aquel que puede obtenerse en el mercado como Parawhite KX, provisto por Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, India. Otros fluorescentes adecuados para el uso en la invención incluyen las 1-3-diaril pirazolinas y las 7-alquilaminocumarinas . Las concentraciones adecuadas de abrillantadores fluorescentes incluyen concentraciones menores, de aproximadamente 0.01, de 0.05, de aproximadamente 0.1 o aun de aproximadamente 0.2% en peso, a concentraciones superiores, de 0.5 o aun de 0.75% en peso .
Polímeros liberadores de suciedad: Las composiciones detergentes de la presente invención además pueden comprender uno o más polímeros liberadores de suciedad que ayudan en la eliminación de suciedad de textiles tales como textiles a base de algodón y poliéster, en particular, en la eliminación de suciedades hidrófobas de textiles a base de poliéster. Los polímeros liberadores de suciedad, por ejemplo, pueden ser polímeros no iónicos o aniónicos a base de tereftalato, polivinil caprolactama y copolímeros relacionados, copolímeros de injertos de vinilo, poliéster poliamidas; ver, por ejemplo, Capítulo 7 en Powdered Detergente, Surfactant Science Series Volume 71, arcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros liberadores de suciedad son los polímeros anfifílieos de limpieza de grasas alcoxilados, que comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a la estructura central . La estructura central puede comprender una estructura de polialquilenimina o una estructura de polialcanolamina como se revela en detalle en la Solicitud Internacional WO 2009/087523 (incorporada en esta solicitud a modo de referencia) . Además, los copolímeros de injertos de azar son adecuados como polímeros liberadores de suciedad. Los copolímeros de injertos adecuados se describen en más detalle en las Solicitudes Internacionales WO 2007/138054, WO 2006/108856 y WO 2006/113314 (incorporadas en esta solicitud a modo de referencia) . Otros polímeros liberadores de suciedad son estructuras de polisacáridos sustituidos, en especial, estructuras celulósicas sustituidas tales como derivados de celulosa modificada, como aquellos descritos en la Patente Europea EP 1867808 o en la Solicitud Internacional WO 2003/040279 (ambas, incorporadas en esta solicitud a modo de referencia) . Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y sus mezclas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa aniónicamente modificada, celulosa no iónicamente modificada, celulosa catiónicamente modificada, celulosa zwiteriónicamente modificada, y sus mezclas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen metil celulosa, carboxi metil celulosa, etil celulosa, hidroxil etil celulosa, hidroxil propil metil celulosa, éster carboxi metil celulosa y sus mezclas.
Agentes contra el redepósito. : Las composiciones detergentes de la presente invención además pueden incluir uno o más agentes contra el redepósito tales como carboximetilcelulosa (CMC) , polivinil alcohol (PVA) , polivinilpirrolidona (PVP) , polioxietileno y/o polietilenglicol (PEG) , homopolímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico, y polietileniminas etoxiladas. Los polímeros a base de celulosa que se describen en la sección de polímeros liberadores de suciedad anterior pueden funcionar también como agentes contra el redepósito.
Otros materiales coadyuvantes incluyen, sin limitación, agentes contra el encogimiento, agentes contra arrugas, bactericidas, aglutinantes, portadores, tinturas, estabilizadores enzimáticos, suavizantes de géneros, rellenos, reguladores de la espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de la jabonadura, solventes y estructurantes para detergentes líquidos, y/o agentes elastizantes de la estructura.
Biopelículas .
Los microorganismos que crecen en biopelículas son menos sensibles a todos los tipos de agentes antimicrobianos, en comparación con los mismos microorganismos cuando crecen en cultivos de suspensión convencionales.
Es bien sabido que las bacterias privadas de alimento pueden ser mucho menos sensibles a una diversidad de desafíos antimicrobianos. Por ejemplo, una cantidad de antibióticos clásicos, tales como penicilina, no funcionan bien en bacterias de lenta división, o sin división. Debido a que la lisozima ataca y destruye la capa de peptidoglucano, sin consideración del estado de crecimiento de las bacterias, permanece eficaz.
Control de biopelícula ; líneas de agua dental ej emplares .
La formación de biopelícula dentro de una línea de agua dental puede contener biopelículas que consisten en Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, textil Legionella, entre otros. Además, existe la posibilidad de colonización de especies halladas generalmente dentro de la cavidad oral como consecuencia de la falla de las válvulas contra la retracción dentro del sistema. El riesgo de infección cruzada se torna aún más que un riesgo potencial cuando se trata de pacientes inmunocompromet idos , y actualmente, la cantidad de pacientes dentro de esta categoría continúa en firme incremento. Existe la necesidad del control eficaz de la acumulación de biopelícula bacteriana en líneas de aguas dentales. Puede hallarse una reseña de biopelículas en la referencia de: Watnick, P. y Kolter, R. (2000) "Biofilm, city of microbes", J. Bacteriol . ; 182 (10) : 2675-9.
Un ejemplo típico de un producto comercial de comprimido de disolución bucal para la garganta es Lysopaine, producido por: BOEHRINGER INGELHEIM FRANCE Ingredientes activos: BACITRACI A, 200 U. I. (a 65 u . i . /mg) PAPAÍNA, 2 mg a 30 NK / mg LISOZIMA, CLORHIDRATO, 5 mg a 26,000 U FIP / mg : unidades determinadas mediante la medición de la cinética de DO de la lisis de bacterias suspendidas en regulador. La determinación de unidades se midió por el cambio inducido por la lisis, en la turbiedad de un cultivo bacteriano suspendido en regulador.
Ingredientes no activos: SACARINA, excipiente ESTEARATO DE MAGNESIO, excipiente Mentol, aromatizante SORBITOL, excipiente Para el tratamiento local de infecciones puntuales limitadas a las membranas bucales de la orofaringe. Precaución: si hay indicaciones clínicas evidentes de infección bacteriana general, se aconseja tratamiento antibiótico.
Pasta dental : La lisozima puede usarse sola o en combinación con otras enzimas, o incluso, con péptidos antimicrobianos. Ejemplos de otras enzimas son glucosa oxidasa y lactoperoxidasa .
Una composición típica de pasta dental que incluye lisozima es "Biotene" , de Laclede, Inc., 2030, East University Drive, Rancho Domiguez, CA 90220, USA.
Ingredientes activos: Contiene: Lactoperoxidasa (100 g) .
Ingredientes inactivos: Glucosa oxidasa, lisozima, monofluorfosfato de sodio, sorbitol, glicerina, pirofosfato de calcio, sílice hidratada, zilitol, goma de celulosa, saborizante, benzoato de sodio, beta-d-glucosa, tiocianato de potasio.
La presente invención se describe adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que no deben ser interpretados como un límite al alcance de la invención.
EJEMPLOS Cepas .
Se usó la cepa de Aspergillus oryzae MT3568 para la expresión del gen de Acremonium alkalophilum que codifica la enzima GH25. MT3568 de A. oryzae es un derivado génico interrumpido de amdS (acetamidasa) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) donde se restauró la auxotrofia de pyrG mediante la interrupción del gen de A. oryzae de acetamidasa (amdS) con el gen pyrG. De acuerdo con el Central Bureau vor Schnimmelkulture, CBS 114.92 de Acremonium alkalophilum fue aislada por A. Yoneda en 1984, a partir del sedimento de abono orgánico de heces de cerdo, cerca de Tsukui Lake, Japón. Se usó Aspergillus oryzae Tocl512 para la expresión del gen de Acremonium alkalophilum codificador de la enzima GH25 (SEC. ID. NRO . : 7) y variantes. A. oryzae es una cepa deficiente en pyrG que puede ser transformada con un gen pyrG, y los transformantes pueden seleccionarse por su capacidad para desarrollarse en ausencia de uridina .
Medios y soluciones.
Medio YP: compuesto por 10 g de extracto de levadura, 20 g de bactopeptona y agua desionizada a 1 litro.
Medio LB: compuesto por 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio y agua desionizada a 1 litro.
Medio MDU-2 Bp: compuesto por, por litro, 45 g de maltosa-lH20, 7 g extracto de levadura, 12 g de H2P04, 1 g de MgS04-7H20, 2 g de K2S04, 5 g de urea, 1 g de NaCl, 0.5 mi de solución de oligoelemento metálico AMG, pH 5.0.
Medio G2-Gly: compuesto por 18 g de extracto de levadura, 24 g de glicerol (86-88%) , 1 mi de Dowfax 63N10 y agua desionizada a 1 litro.
Medio Horikoshi agar: compuesto por: 1% (p/v) de dextrosa, 1% de almidón soluble, 0.5% (p/v) de peptona, 0.5% (p/v) de extracto de levadura, 0.02% (p/v) de MgS04-7H20, 0.1% (p/v) de K2HP0 y 15 g (p/v) de Bacto-agar. Se agregó 1% (p/v) de Na2C03 en forma separada, luego de la esterilización.
Placas de bacto agar: compuestas por medio LB y 15 g de bacto agar por litro.
Placas de PDA agar: compuestas por infusión de papa (la infusión de papa se preparó mediante el hervido de 300 g de papas en rodajas (lavadas, pero sin pelar) en agua, durante 30 minutos, y luego, la decantación o el colado del caldo a través de un lienzo. Entonces se agregó agua destilada hasta que el volumen total de la suspensión fue de un litro, seguido de 20 g (p/v) de dextrosa y 20 g (p/v) de polvo de agar. El medio se esterilizó mediante el autoclave a 0.1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998) .
Placas de sacarosa COVE : compuestas por 342 g de sacarosa, 20 g de polvo de agar, 20 mi de solución salina de COVE y agua desionizada a 1 litro. El medio se esterilizó mediante el autoclave a 0.1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998) . Se enfrió el medio hasta 60 °C, y se agregaron acetamida, 10 mM; CsCl, 15 mM; y Tritón X-100 (50 µ1/500 mi) .
Placas de NaNQ3 sacarosa: compuestas por 20 mi de solución salina COVE, 20 g de polvo de agar, 342 g de sacarosa y agua desionizada a 1 litro. El medio se esterilizó mediante el autoclave a 0.1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998) . Se enfrió el medio hasta 60°C, y se agregaron NaN03, 10 mM, y Tritón X-100 (50 µ1/500 mi) .
Placas de agar LB: compuestas por 37 g de agar LB y agua desionizada a 1 litro.
Solución salina COVE: compuesta por 26 g de MgS04*7H20, 26 g de KCL, 26 g de KH2P04, 50 mi de solución de oligoelemento metálico COVE y agua desionizada a 1 litro.
Solución de oligoelemento metálico COVE: compuesta por 0.04 g de Na2B4O7«10H2O, 0.4 g de CuS04*5H20, 1.2 g de FeS04»7H20, 0.7 g de MnS04»H20, 0.8 g de Na2Mo04*2H20, 10 g de ZnS04»7H20 y agua desionizada a 1 litro.
Oligoelemento metálicos AMG: compuestos por, por litro, 14.3 g de ZnS04-7H2O, 2.5 g de CuS04-5H20, 0.5 g de NiCl2, 13.8 g de FeS04, 8.5 g de MnS04 , 3.0 g de ácido cítrico.
Declives COVE N-gly: compuestos por 10 g de glicerol al 100%, 50 mi de solución salina COVE, 218 g de sorbitol, 2.02 g de KNO3, 25 g de agar y agua desionizada a 1 litro.
Ejemplo 1; Ensayo de lisozima.
Xanthomonas campestris es el organismo de producción para toda la producción de goma de xantano. La separación de células de Xanthomonas de la solución de xantano altamente viscosa es un proceso de alto costo, en la producción industrial (Homma et al., EP690072, Murofushi et al., EP718311, US5702927) . Actualmente, el método favorecido para la recuperación de xantano del líquido de fermentación es la precipitación con alcohol, principalmente, isopropanol, después de la pasteurización para la destrucción de las células bacterianas y enzimas (Cottrell, W. I.; Kang, S. K. Dev. (1978) , "Xanthan gum : A unique bacterial polysaccharide for food appl icat ions" , Ind. Microbiol, 19:177) . Posteriormente, el precipitado de restos celulares y xantano se seca mediante la pulverización y se tritura hasta un polvo. El alcohol se recupera mediante la destilación. Debido a las cantidades significativas de restos de paredes celulares de Xanthomonas en algunas preparaciones comerciales de goma de xantano, y a que estos restos se componen de material de pared celular de Xanthomonas rico en peptidoglucano, la goma puede usarse como un ensayo conveniente para establecer la actividad de degradación de peptidoglucano .
Ensayo de placa sólida.
La goma de xantano preparada comercialmente (Sigma #G-1253) se disuelve en una solución regulada o un medio de crecimiento bacteriano hasta 0.5% p/v, en presencia de agarosa al 0.7%, y luego se somete al autoclave. Las preparaciones enzimáticas, los sobrenadantes o los organismos enteros se depositan en pocilios cortados de las placas de Bacto agar, o se depositan directamente sobre la superficie de los medios. Las preparaciones son capaces de formar zonas de aclaramiento en las placas. Estas zonas de aclaramiento pueden indicar la degradación del material de pared celular bacteriana .
Ensayo de aclaramiento líquido.
Se disuelve la goma de xantano comercialmente preparada en una solución regulada, en presencia o ausencia de cloruro de sodio. La solución se somete al autoclave y se usa para los estudios de aclaramiento de goma de xantano. Las preparaciones enzimáticas, los sobrenadantes o los organismos enteros se agregan al medio de ensayo, y este medio se incuba. Se miden los tratamientos resultantes en un espectrofotómetro, a fin de determinar la DO de la solución. Habitualmente , se usa una longitud de onda de 600 nm.
Ejemplo 2; Clonación y caracterización del gen codificador de lisozima de Acremoniovm alkalophil m (SEC. ID. NRO . : 4 ) .
La información de secuencia genómica fue generada por el Departamento de Energía de la Junta del Instituto Genómico de los Estados Unidos [U. S. Department of Energy Joint Genome Institute (JGI) ] . De acuerdo con el Central Bureau vor Schnimmelkulture , Acremonium alkalophilum CBS 114.92 fue aislado por A. Yoneda en 1984, del sedimento de abono orgánico de heces de cerdo, cerca de Tsukui Lake, Japón. Se descargó un montaje preliminar del genoma desde el JGI, y se analizó usando el programa de análisis de secuencia Pedant-ProTM Sequence Analysis Suite (Biomax Informatics AG, Martinsried, Alemania) . Se usaron modelos de genes construidos por el soporte lógico, como un punto inicial para la detección de homólogos de GH25 en el genoma. Se construyeron modelos de genes más precisos en forma manual, usando múltiples secuencias de proteínas conocidas de GH25 como una guía.
Se propagó Acremonium alkalophilum CBS 114.92 en agar de Horikoshi , pH 9, durante 7 días a 30 °C. Se cosecharon las micelas directamente de la placa, y se aisló el ADN de acuerdo con el equipo FastDNA SPIN Kit for Soil (www.mpbio.com) . El ADN se eluyó en 100 ul de regulador TRIS, 10 mM; EDTA, 0.1 mM; pH 7.5, y se almacenó a 4°C hasta el uso.
El par de cebadores de oligonucleótidos sintéticos que se muestra en la Tabla 1 a continuación se diseñó a fin de amplificar mediante la PCR [reacción en cadena de la polimerasa, según su sigla en inglés] el gen de A. alkalophilum CBS114.92 P242M9 GH25, a partir del ADN genómico de A. alkalophilum. Se usó un equipo IN-FUSION™ Cloning Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA) para la clonación del fragmento directamente en el vector de expresión pDaul09 (WO 2005/042735) .
Tabla 1: Cebadores utilizados para la amplificación de PCR de GH25.
Los caracteres en negritas representan secuencia codificadora. La secuencia subrayada es homologa a los sitios de inserción de pDaul09.
La reacción de PCR (25 µ?) estaba compuesta por 12.5 de mezcla 2X IPROOF™ HF Master Mix, 0.5 µ? de cebador P242M9 (100 µ?) , 0.5 µ? de cebador R- P242M9 (100 µ?) , 0.5 de genómico (100 ng/µ?) y 11 µ? de agua desionizada.
La reacción de PCR (25 µ?) estaba compuesta por Phusion High-Fidelity ADN Polimerasa (Cat. Nro. F-530S, Thermoscientific, USA), 5 ul de regulador 5X Pfusion, 0.5 ul de d TP, 10 mM; 0.5 µ? de cebador F- P242M9 (100 µ?) , 0.5 µ? de cebador R- P242M9 (100 µ?) , 0.5 µ? de genómico (100 ng/µ?) y 18 µ? de agua desionizada. La reacción de PCR se incubó en un ciclador térmico DYAD® Dual-Block Thermal Cycler (MJ Research Inc., Waltham, MA, USA) programado para 1 ciclo a 95°C durante 2 minutos; 35 ciclos, cada uno, a 98 °C, durante 10 segundos; 72 °C, durante 2 minutos y 30 segundos, 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos. Las muestras se enfriaron hasta 12°C antes de la eliminación y el posterior procesamiento.
Se analizaron 5 µ? de la reacción de PCR por medio de la electroforesis de gel de agarosa al 1% usando regulador TAE, donde se observó una banda de producto de aproximadamente 874 p. b. La reacción de PCR restante se purificó usando un equipo de purificación ILLUSTRA™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
El fragmento luego se clonó en pDaul09 digerido con Hind III y Bam HI usando un equipo de clonación IN-FUSION™ Cloning Kit de modo de lograr le plásmido pP242M9. La clonación del gen P242M9 en pDaul09 digerido con Hind III-Bam HI logró la transcripción del gen de Aspergillus aculeatus P242M9 bajo el control de un promotor doble NA2-tpi. NA2-tpi es un promotor modificado del gen que codifica la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger en el cual el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans .
El protocolo de clonación se realizó de acuerdo con las instrucciones del equipo de clonación IN-FUSION™ Cloning Kit de modo de generar una construcción P242M9 GH25. El plásmido tratado y la inserción se transformaron en células de E. coli Fusión Blue™ (Clontech, Mountain View, CA, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se plaquearon en placas de LB suplementadas con 50 ug de ampicilina por mi. Después de la incubación a 37°C durante la noche, se observaron colonias en desarrollo bajo la selección en las placas de LB ampicilina. Diez colonias transformadas con la construcción P242M9 GH25 se cultivaron en medio LB suplementado con 50 ig de ampicilina por mi, y se aisló el plásmido usando un equipo FASTPlasmid mini kit de 5Prime (5 PRIME GmbH, Kónigstrasse 4a, 22767 Hamburg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los plásmidos aislados se secuenciaron con cebadores de vector y, a fin de determinar un clon de expresión de plásmido representativo que estuviera libre de errores de la PCR. El secuenciamiento de ADN de los clones genómicos de Acremoníum alkalophilum CBS114.92 GH25 se efectuó con un secuenciador de ADN Applied Biosystems Model 3730x1 Automated DNA Sequencer usando la versión 3.1 BIG-DYE™ de química de terminador (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) y una estrategia de camino de cebador. La información de secuencia de nucleótidos se examinó a fin de establecer la calidad, y todas las secuencias se compararon entre sí con la ayuda del soporte lógico PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA) . Las secuencias obtenidas fueron idénticas a las secuencias del JGI .
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del gen de Acremonium alkalophilum P242M9 GH25 se muestran en SEC. ID. NRO . : 3 y SEC . ID. NRO . : 4, respectivamente. La secuencia codificadora es de 838 p. b., que incluye el codón de detención, y es interrumpida por un intrón de 154 p. b. (nucleótidos 148 a 301) . La proteína pronosticada codificada es de 227 aminoácidos. Usando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se pronosticó un péptido de señal de 19 residuos. La proteína madura pronosticada contiene 207 aminoácidos.
Se usó la cepa de Aspergillus oryzae MT3568 para todos los experimentos. La cepa de Aspergillus oryzae MT3568 es un derivado alterado de amdS (acetamidasa) de A. oryzae JaL355 (WO 2002/40694) en el cual se restauró la auxotrofia de pyrG en el proceso de noqueo (knockout : inactivación de genes específicos como modelo de enfermedad; una mutante individual donde se ha reemplazado un solo gen funcional por una forma no funcional del gen) del gen de A. oryzae de amdS. Se prepararon los protoplastos de MT3568 de A. oryzae de acuerdo con el método de la Patente Europea EP 0238023, pp. 14-15. Se prepararon protoplastos nuevos de MT3568 de A. oryzae y se transformaron con el plásmido pP242M9 GH25. Se usó ADN plásmido del procedimiento mini prep anterior a fin de transformar MT3568 de A. oryzae.
Se usaron 6 ul que contenían aproximadamente 3.0 µg de ADN total, para la transformación. El ADN se agregó suavemente a 100 µ? de protoplastos de MT3568 de A. oryzae, y se prepararon 250 µ? de PEG 4000 al 60% {Sigma-Aldrich Cat . Nro. 95904) . El PEG 4000 al 60% (P/V) se preparó de la siguiente manera: se disolvió polvo de PEG 4000 en H20 doble destilada y luego se trató durante 10-20 seg en un horno de microondas a 800 vatios, hasta la disolución. La solución disuelta se enfrió hasta temperatura ambiente y luego se ajustó con solución de CaCl2 y solución de Tris-HCl (pH 7.5) para una concentración final de 10 mM de cada uno. Después de agregar la solución al 60% de PEG 4000, el tubo se mezcló suavemente y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Se agregó la mezcla a 6 mi de agar superior con acetamida, 10 mM, y se plaqueó en placas de COVE-sorbitol con acetamida, 10 mM.
Las placas se incubaron a 37°C durante 3 o más días, y luego se movieron a 26°C durante dos días. Las esporas de 4 colonias individuales se recogieron primer mediante el sumergido de una espiga de inoculación blanca de 10 µ? (Nunc A/S, Dinamarca) En una solución al 0.1% de TWEEN® 80, el contacto de la colonia de esporulación sobre la placa de selección, y nuevamente, el salpicado con la espiga sobre placas nuevas de COVE sorbitol que contenían acetamida, 10 mM. Después de 5 días a 26°C, se usaron las esporas de las colonias nuevamente salpicadas a fin de inocular una placa de discos profunda de 96 pocilios (NUNC, Cat . NRO. 260251, Thermoscientific , USA) . Los pocilios de la placa de disco profunda contenían 500 ul o bien de medio YP + 2% glucosa o YP + 2% de maltodextrina . La placa inoculada se selló con cinta permeable al gas (89009-656, VWR.com). Las placas se incubaron estacionariamente a 30 °C durante 5 días. Se verificó la expresión por medio del análisis de 20 ul de fluido de cultivo cosechado, en SDS-PAGE usando un gel NUPAGE® 10% Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) y tinción de azul de Coomassie. Se seleccionó un transformante para el trabajo posterior, y se designó A. oryzae EXP03864.
Se inocularon con esporas de EXP03864 el medio DAP-4C-1 (100 mi en un matraz de agitación de 500 mi Erlenmeyer con deflectores) . Los cultivos se incubaron a 26°C y a 150 r. p. m. , 3 días, y si fue necesario, 4 días. Se hizo correr un gel de SDS como anteriormente, a fin de evaluar la cantidad de proteína .
Ensayo de placa para la actividad de lisozima.
Se efectuó un ensayo de salpicado con goma de xantano, a pH 5, 7 y 8 como se describe en la sección de ensayo de placa de lisozima.
Se preparó una solución al 1.5% de agarosa (Invitrogen Cat . 15510-027, grado de electroforesis) en los siguientes reguladores : pH ~5 - en agua pH ~7 - en fosfato de potasio, 0.02 M, pH 7 pH ~8 - en fosfato de potasio, 0.02 M, pH 8 La agarosa se sometió al autoclave durante 20 minutos a 121°C. Se disolvió goma de xantano al 0.5% (Sigma G1253) en la agarosa al 1.5 % fundida, y la mezcla se vertió en discos de Petri . Cuando las placas es establecieron, los pocilios de aplicación de muestra se prepararon con una punta de pipeta P-1000 (corte a un diámetro de 3 mm) unida a una línea de vacío .
Se depositaron 20 ul del fluido de cultivo de EXP03899 en los pocilios de aplicación, y se incubaron a 37°C durante la noche. Las muestras con actividad de lisozima se observaron para detectar las zonas de aclaramiento donde los restos celulares en la goma de xantano fueron observados . Los fluidos de cultivo de EXP03864 exhibieron la zona de aclaramiento, mientras que el hospedero MT3568 de transformación no transformado de Aspergillus oryzae no produjo una zona de aclaramiento capaz de ser advertida. El fluido de cultivo restante de EXP03899 se filtró a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0.22 pm y se almacenó en alícuotas a -20°C hasta el uso posterior.
Ejemplo 3; RDA (Ensayos de difusión radial, según su sigla en inglés) .
Inicialmente, la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes de cultivo y las fracciones purificadas que contenían las lisozimas expresadas de manera recombinada se confirmó usando un ensayo RDA como se describe previamente en la referencia de Lehrer et al. (Lehrer, R. I., Rosenman, M., Harwig, S. S., et al. (1991), " Ultrasensit ive assays for endogenous ant imicrobial polypept ides " , J Immunol Methods, 137:167-73), con varias modificaciones. En resumen, 30 mi de caldo fundido 1/10 Mué 11 er-Hinton ( HB) (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) con 1% de agarosa se enfriaron hasta 42°C, se suplementaron a 5.0xl05 ufc/ml con S. carnosus ATCC 51365 o E. coli DSM682 (ATCC 10536) y se volcaron en una placa de un solo pocilio Omnitray (Nunc) . La placa Omnitray se superpuso con una placa TSP (Nunc) y se dejaron solidificar. Después de 1 h, la placa TSP se extrajo, de modo de dejar 96 pocilios de 1 mm en los cuales pudieron evaluarse 10 µ? del compuesto de interés .
Se salpicaron 10 µ? de la solución de ensayo por pocilio, y las placas se incubaron 0/N a 37°C. Al día siguiente, las zonas de aclaramiento indicaron que no hubo crecimiento de las bacterias de ensayo, y en consecuencia, hubo actividad antimicrobiana. Las zonas de aclaramiento se visualizaron mediante la coloración con MTT (bromuro de 3 - ( 4 , 5 -dimet i 11 iazol -2 - i 1 ) -2 , 5 -di feni 11 et razol i o , un tertrazol amarillo) , reducido a formazano púrpura en las células vivas (Mosmann, Tim (1983) , "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival : application to proliferation and cytotoxicity assays", Journal of Immunological Methods, 65 (1-2): 55-63). Esta coloración proporciona una coloración oscura de las células vivas, y no proporciona coloración a las zonas de aclaramiento, sin células vivas.
La lisozima de Aspergillus fumigatus GH25 (preparada como se revela en la referencia de Korczynska et al., Acta Cryst. (2010) F66, 973-977) se incluyó en el ensayo como una referencia. Las muestras purificadas que se exponen en la Tabla 2 a continuación se han ensayado en el ensayo de RDA.
Tabla 2: Ensayo de difusión radial de lisozimas GH24 y GH25.
Medición de zonas de aclaramiento .
El experimento se realizó por triplicado de manera de lograr las mismas zonas de aclaramiento y zonas de inhibición medidas, ver Figura 1. La Tabla 3 a continuación muestra las zonas de aclaramiento en mm.
Tabla 3: Zonas de aclaramiento antimicrobiano de las lisozimas GH25 contra Staphylococcus carnosus y Escherichia coli .
La lisozima de A. alcalophilum GH24 purificada (SEC. ID.
NRO. : 4) mostró actividad antimicrobiana contra células viables de las bacterias Gram positivas Staphylococcus carnosus y las bacterias Gram negativas Escherichia coli.
La actividad antimicrobiana no se presentó en los sobrenadantes de cultivo del hospedero no transformado de Aspergillus (resultados no expuestos) .
Se observaron grandes zonas de aclaramiento con bordes no definidos, alrededor de la zona de aplicación para A. alcalophilum GH24 (SEC. ID. NRO. : 2) . El experimento indica que la lisozima de A. alcalophilum (SEC. ID. NRO. : 2) y la lisozima de referencia de Aspergillus fumigatus GH25 tienen diferentes actividad y especificidad contra las dos bacterias ensayadas en este ejemplo.
Ejemplo 4; Ensayo de turbiedad.
La actividad de la lisozima se determinó midiendo la disminución (caída) en la absorbancia/densidad óptica de una solución de Micrococcus lysodeikticus ATCC Nro. 4698 (Sigma-Aldrich M3770) o Exiguobacterium undea (DSM14481) resuspendidas , medida en un espectrofotómetro a 540 nm.
Preparación de sustrato de Micrococcus lysodeikticus .
Antes de usar, las células se resuspendieron en ácido cítrico - regulador de fosfato, pH 6.5, hasta una concentración de 0.5 mg de células/ml, y se midió la densidad óptica (DO) a 540 nm. La suspensión de células luego se ajustó de modo tal que la concentración de células se equiparó a una DO 540 = 1.0. La suspensión celular ajustada luego se almacenó en frío, antes del uso. Las células resuspendidas se usaron dentro de las 4 horas.
Preparación de ácido cítrico - regulador de fosfato, pH 6.5.
Se mezclaron 29 mi de ácido cítrico, 0.1 M, con 61 mi de Na2HP04, 0.2 M, y se ajustó el pH con HCl o NaOH hasta pH 6.5.
Preparación de células desecadas de Exiguobacterium undae (el sustrato) .
Se preparó un cultivo de E. undae (DSM14481) en 100 mi de medio LB (Fluka 51208, 25 g/1) en un matraz de agitación de 500 mi a 30°C, 250 r. p. m. , durante la noche. El cultivo de la noche entonces se centrifugó a 20°C y 5000 g durante 10 minutos, y la miniesfera se lavó dos veces con agua estéril milliQ, y se resuspendió en agua Milli-Q. Las células lavadas se centrifugaron durante 1 minuto a 13,000 r. p. m. , y se decantó la mayor cantidad posible del sobrenadante. Las células lavadas se secaron en una centrífuga al vacío durante 1 hora. La miniesfera de células se resuspendió en ácido cítrico - regulador de fosfato, pH 6.5, de manera de lograr una densidad óptica (DO) a 540 nm = 1.
Medición de la actividad antimicrobiana de lisozima en el ensayo de turbiedad.
La muestra de lisozima por ser medida se diluyó a una concentración de 100-200 mg de proteína enzimática/1 , en ácido cítrico - regulador de fosfato, pH 6.5 , y se mantuvo en hielo hasta el uso. En una placa de microvaloración de 96 pocilios (Nunc) , se agregaron 200 µ? del sustrato a cada pocilio, y la placa se incubó a 25°C o 37°C durante 5 minutos en un lector de microplaca VERSAmax (Molecular Devices) . Después de la incubación, se midió la absorbancia de cada pocilio a 540 nm (valor inicial) . A fin de iniciar la medición de actividad, se agregaron 20 µ? de la muestra de lisozima diluida a cada sustrato (200 µ?) , y se inició la medición cinética de la absorbancia a 540 nm durante un período de tiempo mínimo de 30 minutos hasta 24 horas, a 25°C o 37°C. La absorbancia medida a 540 nm se monitoreó para cada pocilio, y en función del tiempo, se observó una caída en la absorbancia si la lisozima tenía actividad de lisozima.
La lisozima de Aspergillus fumigatus GH25 (Korczynska et al. (2010) supra.) se incluyó en el ensayo como una referencia, y los resultados se muestran en la Tabla 4 que se expone a continuación.
Tabla 4: Actividad de lisozima de lisozimas GH25 contra Micrococcus lysodeikticus y Exiguobacterium undea, medida por la caída de la densidad óptica.
NT significa no ensayado.
- Significa sin efecto. + significa efecto pequeño. ++ significa efecto medio. +++ significa efecto grande.
Ejemplo 5: Purificación de proteína P242M9 GH25 en Aapergillua oryzae.
El sobrenadante de la fermentación con la lisozima se filtró a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0.22 µ??. Se ajustó el pH a 4.5 con ácido acético al 10%. Después del ajuste del pH, la solución se tornó algo turbia, y esta turbiedad se eliminó mediante la filtración a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0.22 µp?.
Después del tratamiento previo, se purificaron aproximadamente 650 mi de la solución que contenía la lisozima, mediante la cromatografía en SP Sepharose, aproximadamente 50 mi en una columna XK26, usando como regulador A, Na-acetato, 50 mM, pH 4.5, y como regulador B, Na-acetato, 50 mM, + NaCl , 1 M, pH 4.5. Las fracciones de la columna se reunieron sobre la base del cromatograma (absorción a 280 y 254 nm) y el análisis de SDS-PAGE. Las fracciones reunidas se cambiaron de regulador, a Na-acetato, 50 mM, pH 5.5, y se concentraron usando filtros centrífugos Amicon con un corte de 10 kDa.
El peso molecular, estimado a partir de SDS-PAGE, fue de aproximadamente 22 kDa, y la pureza fue de >95%.
Ejemplo 6; Estabilidad de temperatura de P242M9 GH25.
Se determinó la estabilidad de temperatura para la lisozima de Acremonium alcalophilu P242 9 GH25 (SEC. ID. NRO: 4) . El propósito de este estudio fue determinar la actividad residual de lisozima de Acremonium alcalophilum GH25 luego del tratamiento de calor a 60°C-85°C.
Las muestras se incubaron a diferentes temperaturas durante un período de tiempo corto (30 s y 60 s) , después de lo cual se midió la actividad residual durante 1 h a 37°C en un regulador de ácido cítrico - fosfato, usando bacterias Gram positivas Micrococcus luteus como sustrato. Se empleó el ensayo de turbiedad de caída de la densidad óptica (DO) a 540 nm, a fin de determinar la actividad de lisozima.
Tratamiento de calor.
El tratamiento de calor se efectuó en una solución regulada de lisozima de Acremonium alcalophilum GH25 (SEC. ID. NRO.: 4) en un termociclador precalentado de PCR (reacción en cadena de la polimerasa, según su sigla en inglés) (sistema GeneAmp PCR 9700) durante 30/60 segundos, a diferentes temperaturas. Se usaron 60, 65, 70, 75, 80 y 85°C durante o bien 30 o 60 segundos; a continuación, los tubos se colocaron en un baño de hielo, para el enfriamiento instantáneo de las muestras.
Ensayo de turbiedad.
La actividad de la lisozima se determinó midiendo la disminución (caída) en la absorbancia/densidad óptica de una solución de Micrococcus luteus (también denominadas Micrococcus lysodeikticus) , ATCC Nro. 4698 (Sigma-Aldrich M3770) , resuspendidas, medida en un espectrofotómetro a 540 nm.
Preparación de sustrato de Micrococcus luteus.
Antes de usar, las células se resuspendieron en regulador de ácido cítrico -fosfato (preparado mediante la mezcla de 29 mi de ácido cítrico, 0.1 M, con 61 mi de Na2HP04, 0.2 M, y el ajuste a pH 6.5 con HCl o NaOH) hasta una concentración de 0.5 mg de células/ml, y se midió la densidad óptica (DO) a 540 nm. La suspensión de células luego se ajustó de modo tal que la concentración de células se equiparó a una DO 540 = 1.0. La suspensión celular ajustada luego se almacenó en frío, antes del uso. Las células suspendidas se usaron dentro de las 4 horas.
Medición de la actividad antimicrobiana de lisozima en el ensayo de turbiedad.
La muestra de lisozima se diluyó hasta una concentración de 100-200 mg de proteína enzimática/1 , en regulador de ácido cítrico - fosfato, y se mantuvo en hielo hasta el uso. En una placa de microvaloracion de 96 pocilios (Nunc) , se agregaron 200 µ? del sustrato de Micrococcus luteus a cada pocilio, y la placa se incubó a 37°C durante 5 minutos en un lector de microplaca VERSAmax (Molecular Devices) . Después de la incubación, se midió la absorbancia de cada pocilio a 540 nm (valor inicial) . A fin de iniciar la medición de actividad, se agregaron 20 µ? de la muestra de lisozima diluida, al sustrato diluido con ajuste de pH (200 µ?) en cada pocilio, y se inició la medición cinética de la absorbancia a 540 nm durante un período de tiempo mínimo de 30 minutos hasta 24 horas, a 37°C.
La absorbancia medida a 540 nm se monitoreó para cada pocilio, y en función del tiempo, se observó una caída en la absorbancia si la lisozima tenía actividad antimicrobiana. La diferencia entre la absorbancia a T = 0 y los puntos de tiempo se calculó como la ??0 y se comparó entre las sustancias de ensayo (Tabla 5 y Figura 2) . Se calculó el porcentaje de actividad remanente mediante la comparación de la ADO de la muestra tratada con calor, con la ADO de la muestra que no fue tratada con calor. El experimento descrito con anterioridad se efectuó por triplicado.
Tabla 5: Estabilidad de temperatura de la lisozima P242M9 GH25 medida por la caída de DO.
Tabla 6: Porcentaje de actividad remanente de la lisozima P242M9 GH25.
Los resultados muestran que la lisozima P242M9 GH25 es estable luego de 30 segundos, aun a 85°C, y que la enzima GH25 retiene más del 80% de la actividad, incluso después de 60 segundos a 85 °C.
Ejemplo 7; Termoestabilidad de P242M9 GH25 determinada usando DSC.
Una alícuota de la muestra de proteína de lisozima (P242M9 GH25) , purificada como se describe en el Ejemplo 7, se cambió de regulador (ver regulador en la tabla a continuación) usando una columna previamente empaquetada PD-10. La muestra se filtró a través de 0.45 µ?t? y se diluyó con regulador hasta aproximadamente 2 unidades A280. El regulador se usó como solución de referencia. Se determinó la termoestabilidad de la lisozima en diferentes valores de pH, por medio de la Calorimetría de Barrido Diferencial (DSC, según su sigla en inglés) usando un instrumento de DSC de capilar VP (MicroCal Inc., Piscataway, NJ, USA) equipado con un sacamuestras automático. La temperatura de desnaturalización térmica, Td (°C) , se tomó como el punto máximo del pico de desnaturalización (pico endotérmico mayor) en termogramos (Cp frente a T) obtenido luego del calentamiento de las soluciones de lisozima en el regulador, a un índice de calentamiento programado constante.
Las soluciones de muestra y de referencia (aprox. 0.5 mi) se preequilibraron térmicamente durante 10 minutos a 20°C, y se realizó el barrido de DSC de 20 a 110°C a un índice de barrido de 200 K/hora. La manipulación de la información se efectuó usando el programa informático MicroCal Origin (versión 7.0383). Las temperaturas de desnaturalización se determinaron a una exactitud de aproximadamente +/- 0.5°C. Los resultados de las mediciones de DSC se resumen en la Tabla 7 y en la Figura 3.
Tabla 7: Temperatura de desnaturalización de la lisozima P242 9 GH25.
Ejemplo 8: Clonación y expresión de genes codificadores de lisozima de Acremonio m alkalophilum (SEC. ID. NRO. : 8).
Sobre la base de la secuencia de nucleótidos identificada como SEC. ID. NRO.: 3, se sintetizó un gen sintético con la SEC. ID. NRO . : 7, por medio de Gene Art (GENEART AG BioPark, Josef-Engert-Str . 11, 93053, Regensburg, Alemania) . El grupo de cebadores de PCR que se cita a continuación en la Tabla 8 se usó para la amplificación de PCR, del gen sintético GH25. Con propósitos de clonación, se introdujeron los sitios de restricción BamHI y EcoRI en el extremo del fragmento de PCR (los sitios de restricción están subrayados en las secuencias de cebadores que se citan a continuación, y los caracteres en negritas representan secuencia codificadora) .
Tabla 8: Cebadores utilizados para la amplificación de PCR de GH25.
El fragmento de PCR se purificó mediante la centrifugación, se digirió con BamHI y EcoRI (New England Biolabs) y se ligó usando el equipo de ligación de ADN Rapid DNA Ligation kit (Roche) , en el vector de expresión plásmido dual de A. Oryzae/E. coli , pENI1898, que había sido primeramente digerido con BamHI y EcoRI. pENI1898 se modificó a partir del vector pENI1861 ( O 03/070956), ya que la secuencia AMA (Clutterbuck A. J. , et al. (1991), Gene, 98 (1) : 61-67) se había eliminado mediante la digestión del vector con HindIII, seguida de la nueva ligación del vector purificado con gel de agarosa. Además, pENI1861 porta el gen pyrG, y es capaz de complementar una cepa deficiente en pyrG de Aspergí1lus .
Después de 5 minutos de incubación a temperatura ambiente, la reacción de ligación se transformó en células competentes de E.coli TOP10 (Invitrogen) que se plaquearon en placas de agar de LB que contenían 150 µg/ml de ampicilina. Las placas se incubaron durante 16 horas a 37°C. El ADN plásmido se purificó a partir de los transformantes seleccionados, y se secuenció a fin de verificar el procedimiento de clonación.
La proteína pronosticada codificada tenía 248 aminoácidos, y contenía un péptido de señal de 23 residuos y una proteína madura de 207 aminoácidos. La secuencia madura de SEC. ID. NRO.: 4 es idéntica a la secuencia madura de SEC. ID . NRO . : 8.
Ejemplo 9: Clonación y expresión de variantes de lisozima GH25.
Variantes del gen GH25.
Se clonaron y se expresaron 10 variantes que contenían un solo cambio de aminoácido, en el gen de lisozima sintético GH25. Las variantes de la lisozima GH25 consisten en una sola sustitución, de la siguiente manera: 10H, Y28M, S39D, G92P, A93M, E97A, V133M, T142N, F178I o D190A.
Clonación de variantes de GH25.
Con el objetivo de generar las variantes de GH25 que se describen anteriormente, se llevó a cabo una mutagénesis dirigida a sitio sobre la base de la PCR, con cebadores mutagénicos que introdujeron el cambio de secuencia deseado (sustituciones) . Los cebadores se diseñaron de modo tal que la mutación se encuentra en el medio del oligonucleót ido, con suficientes nucleótidos flanqueantes (15-25) . El ADN plásmido que contenía GH25 se usó como patrón, y la PCR se estableció con una polimerasa de ADN con corrección de prueba (polimerasa de ADN Phusion (New England Biolabs) . Los productos de la PCR se usaron para ransformar células competentes de E.coli TOP 10 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plásmido se aisló de cepas transformadas monoclonales de E.coli, y se secuenció a fin de verificar la presencia de la sustitución deseada.
Transformación y expresión de GH25 y variantes.
El ADN plásmido pENI1898 que codificaba el gen de lisozima se usó para la transformación en protoplastos de Aspergí 1 lus oryzae ToC1512 (WO 2005/070962) , como se describe en el Ejemplo 2, y se plaquearon en placas de sacarosa de NaN03 sin uridina, para la selección de transformantes que portaban las construcciones correctas . Las placas se incubaron 72 horas a 37°C.
Se aislaron colonias individuales mediante el nuevo salpicado de las colonias en placas de sacarosa de NaN03 durante 72 horas a 37°C y el cultivo en medio YP a 34°C durante 72 horas. Las colonias que expresaban lisozima se seleccionaron luego de la examinación de los caldos de cultivo por el ensayo de turbiedad, en ácido 3,3-dimetilglutárico, 50 mM, a pH 6.4, con paredes celulares de Micrococcus lysodeikticus como los sustratos. Además, se confirmó la expresión de la lisozima por medio de la inspección visual de una banda de aproximadamente 23 KDa, mediante el análisis de SDS-PAGE.
Los transformantes que expresaban la lisozima se volvieron a salpicar, y se cultivaron en declives de COVE N-gly a 37 °C durante otros 5 días, y se inocularon hasta 200 mi de un matraz de agitación de G2-Gly. Después del cultivo con agitación vigorosa a 30°C durante 1 día, se transfirieron 3 mi de cada cultivo a 200 mi de MDU-2Bp en un matraz de agitación, a fin de cultivar a 30°C durante 3 días. Los caldos de cultivo se purificaron de manera similar a la purificación de la lisozima P242M9 GH25 del Ejemplo 6 anterior .
Ejemplo 10; Actividad antimicrobiana.
La actividad antimicrobiana de la lisozima P242M9 GH25, la lisozima sintética GH25 y 11 variantes de la lisozima sintética GH25 se evaluó frente a dos cepas de Clostridium perfringens .
Métodos y materiales.
La actividad se determinó tanto por medio de la medición de la densidad óptica como de la cantidad de unidades formadoras de colonias de cultivos de Cl . perfringens, antes y después de la exposición a la lisozima. La exposición de Cl . perfringens a lisozimas activas logrará la muerte de las bacterias y una correspondiente disminución tanto en la densidad óptica (caída de la DO) como en la cantidad de unidades formadoras de colonias.
En síntesis, se diluyeron soluciones de carga de lisozima en PBS (pH 6) hasta concentraciones de 50 ug/ml. Se efectuaron series de dilución doble de estas soluciones de 50 yg/ml en PBS (pH 6) hasta concentraciones finales de 0.4 ug/mi .
A continuación, se resuspendieron cultivos de una noche de Cl . perfringens en PBS (pH 6) . Se midió la D0546 y se ajustó a 1. Los cultivos (75 µ?) se mezclaron en placas de microvaloración (Nunc) 1:1 con soluciones preparadas de lisozima (75 µ?) , lo que logró la exposición de Cl . perfringens a concentraciones finales de las lisozimas que variaron de 0.4-25 ug/ral (7 concentraciones en total por lisozima) . Los cultivos se expusieron a las lisozimas durante 4 horas en condiciones anaerobias a 42 °C. Se midieron la D0546 y las UFC/ml en los puntos de tiempo 0 y 4 horas posteriores a la exposición.
Resultados .
Los resultados de la evaluación de actividad se muestran en las Tablas 9, 10 y 11, y en las Figuras 4 y 5. La Tabla 9 muestra la disminución en las unidades formadoras de colonias de dos cepas de Clostridium perfringens por mi (UFC/ml) de lisozima GH25 o variante. La exposición a lisozimas activas logró habitualmente 1-2 reducciones logarítmicas en las UFC/ml. La actividad de la lisozima se evaluó como significativa si la reducción en UFC/ml fue =1 log.
La Tabla 10 muestra la caída en la densidad óptica (DO delta) de Clostridium perfringens NN01260 con la exposición a la lisozima GH25 P242M9 (SEC. ID. NRO . : 4), la lisozima sintética GH25 (SEC. ID. NRO.: 8) u 11 variantes de SEC. ID. NRO.: 8. La Tabla 11 muestra la caída de la densidad óptica (DO delta) de Clostridium perfringens, aislado clínico, con la exposición a la lisozima GH25 P242M9 (SEC. ID. NRO. : 4) , la lisozima sintética GH25 (SEC. ID. NRO. : 8) u 11 variantes de SEC . ID . NRO . : 8.
Tabla 9: Disminución en UFC/ml Clostridium perf ingens cuando se trata con lisozimas de tipo silvestre y variantes GH25. completo de concentraciones de lisozimas evaluadas. + actividad significativa para una cantidad reducida de concentraciones de lisozimas evaluadas. sin actividad significativa de la lisozima.
Tabla 10: Caída de la DO de Clostridium perfringens NN011260 cuando se trata con lisozimas de tipo silvestre y variantes GH25.
Promedio de tres muestras biológicas.
Tabla 11: Caída de la DO de Clostridium perfringens, aislado clínico, cuando se trata con lisozimas de tipo silvestre y variantes GH25.
Promedio de tres muestras biológicas.
Los resultados muestran que la mutación de 9 posiciones no produjo la pérdida de actividad de lisozima. Sin embargo, la mutación de la posición 97 produjo la pérdida de actividad, de manera de indicar que esta posición no puede ser mutada.
Ejemplo 11; Perfil de actividad de pH.
El perfil de actividad de pH de la lisozima de la invención se determinó midiendo la disminución (caída) en la absorbancia/densidad óptica de una solución de Micrococcus luteus resuspendidas, ATTC Nro. 4698 (Sigma-Aldrich M3770) , medida en un espectrofotómetro a 540 nm para un intervalo de valores de pH, a fin de determinar el pH al cual la lisozima GH25 o variante tiene actividad de lisozima pico.
El sustrato de Micrococcus luteus se preparó como se describe en el Ejemplo 6. La actividad antimicrobiana de lisozima se midió como se describe en el Ejemplo 6, excepto que se ajustó el regulador de ácido cítrico - fosfato a uno de los siguientes valores de pH, con HC1 o NaOH, antes del comienzo del experimento: 3.0; 3.5; 4.0; 4.5; 5.0; 5.5; 6.0; 6.5 y 7.0. El experimento descrito anteriormente se efectuó por duplicado o triplicado, y los resultados se proporcionan en la Tabla 12 a continuación.
Tabla 12: Perfil de actividad de pH de lisozimas de tipo silvestre y variantes GH25.
Los resultados muestran que las lisozimas variantes GH25 de la invención, que tienen la sustitución Y28M, G92P, A93M, V133M, T142N o F178I, retuvieron la actividad antimicrobiana sin cambio significativo en el perfil de actividad de pH, en comparación con la lisozima de tipo silvestre. Las variantes de lisozimas GH25 de la invención que tienen la sustitución 10H o S39D lograron un alterado perfil de pH, de modo que el perfil de pH aumentó 0.5 unidades de pH, mientras que retuvieron la actividad antimicrobiana.
Ejemplo 12: Estabilidad gástrica.
La actividad de la lisozima de clara de huevo de gallina, lisozima de A. alcalophilum GH25 (SEC. ID. NRO. : 8) , y de dos variantes (W10H y S39D) se evaluaron mediante el ensayo de turbiedad, luego de la incubación durante hasta 1 hora en jugo gástrico artificial (pH 2) que contenía pepsina. Esta actividad luego se comparó con una curva estándar preparada para cada lisozima, en las mismas o equivalentes condiciones, aunque sin la incubación con jugo gástrico que contenía pepsina.
Las diferentes lisozimas se incubaron en jugo gástrico artificial durante un período de tiempo de 0, 15, 30 o 60 minutos. Después de la incubación, se agregó un regulador de detención de manera de elevar el pH, y de ese modo, evitar que el bajo pH y la pepsina degraden los enlaces péptidos de la lisozima. Después de la desactivación de la pepsina, se efectuó un ensayo de turbiedad de actividad junto con una curva estándar de diferentes concentraciones de la lisozima en cuestión, con propósitos de comparación.
Jugo gástrico artificial: (HC1, pH 2 ; 1 mg/ml de pepsina; NaCl, 0.1 M) .
Solución A: HC1, 0.01 M; NaCl, 0.1 M (preparada mezclando 275 µ? de HC1 , 1 M, con 2.5 mi de NaCl, 1 ; y agregando 22.23 mi de agua MQ a un volumen total de 25 mi) .
Solución B: HC1, 0.01 M; NaCl, 0.1 M; 10 mg/ml de pepsina (preparada pesando 50 mg de pepsina y agregando 5 mi de solución A) .
Preparación de curva estándar.
Se agregó jugo gástrico artificial (160 µ?) a cada pocilio de microvaloración, seguido de 20 µ? de regulador de ácido cítrico - fosfato (pH 7, para la lisozima de clara de huevo de gallina; pH 4, para la lisozima de A. alcalophilum GH25; y pH 4.5, para las variantes W10H y S39D) . Se agregó la solución lisozima (20 µ?) ; luego, se agregó sustrato de Micrococcus luteus (20 µ?, preparado como se describe en el Ejemplo 6) a cada pocilio (curva estándar, al igual que muestras de serie de tiempo) , y se midió la DO 540 nm a cada minuto, durante una hora a 37 °C.
Se midió la actividad antimicrobiana de lisozima como se describe en el Ejemplo 6, excepto que el regulador de ácido cítrico - fosfato se ajustó al pH óptimo para las diferentes lisozimas (como se proporciona en el párrafo previo) , por medio de la adición de HCl o NaOH. El experimento descrito anteriormente se efectuó por duplicado, y los resultados se proporcionan en la Tabla 13 a continuación.
Tabla 13 : Actividad residual de lisozima luego de la incubación con jugo gástrico artificial.
La actividad de lisozima remanente luego de la incubación en jugo gástrico artificial fue drásticamente reducida para las lisozimas de clara de huevo de gallina, aun luego de 15 minutos. En comparación, la lisozima GH25 de Acremonium alcalophilum no mostró reducción en la actividad. Además, las dos variantes GH25 que tenían la sustitución W10H o S39D también retuvieron actividad de lisozima, de manera de mostrar actividad residual similar a las lisozimas GH25 de Acremonium alcalophilum.
Ejemplo 13: Aislamiento de ADN genómico.
El rendimiento de las purificaciones de ADN genómico bacteriano con el agregado de lisozima de Acremonium alcalophilum GH25 (SEC. ID. NRO. 8) y la combinación de lisozima de clara de huevo de gallina y lisozima de Acremonium alcalophilum GH25 (SEC. ID. NRO. 8) se comparó con la purificación de ADN sin lisozima y con lisozima de clara de huevo de gallina sola. El ADN genómico se aisló de cinco bacterias diferentes.
Método .
La masa bacteriana se obtuvo o bien mediante el raspado de las células de una placa de agar con una anilla de inoculación, o mediante la centrifugación de un cultivo líquido (ver Tabla 14) . El ADN se aisló usando una versión modificada del equipo QIAamp DNA Blood Mini Kit (Cat. Nro 51106) y se purificó o bien usando un aparato Qiagen QIAcube o un proceso manual.
Tabla 14: Reseña de cepas bacterianas evaluadas, material inicial celular y método de purificación.
Aislamiento de ADN usando QIAcube Se resuspendió una raspado de colonias que correspondía a una anilla de inoculación de 10 µ? , en 3 mi de regulador M9 (preparado mediante la disolución de 8.77 g de Na2HP0.2H20, 3 g de KH2P04, 4 g de NaCl y 0.2 g de MgS04.7H20 en 1000 mi de H20, y con un ajuste del pH a 7 con NaOH o HCl) . La solución se centrifugó durante 5 min a 3000 r. p. m. , y la miniesfera se resuspendió en 3 mi de regulador Pl (incluido en el equipo Qiagen # 51106) . Se agregaron alícuotas de 200 µ? a 12 tubos de 2 mi, y se agregaron a los tubos, por triplicado, 15 µ? de agua, lisozima de A. alcalophilum GH25 (10 mg/ml) , lisozima de clara de huevo de gallina (10 mg/ml) , o lisozima de A. alcalophilum GH25 (10 mg/ml) + clara de huevo de gallina (10 mg/ml), mezcla 1:1. Los tubos se colocaron en el aparato QIAcube y se procesaron de acuerdo con las recomendaciones de Qiagens Aislamiento de ADN manual: Las miniesferas de cultivo líquido y el raspado de colonias se resuspendieron en 3 mi de regulador M9. Las suspensiones bacterianas de regulador M9 se centrifugaron durante 5 min a 3000 r. p. m. , y las miniesferas se resuspendieron en 3 mi de regulador Pl . Se agregaron alícuotas de 200 µ? a 12 tubos de 2 mi , y se agregaron a los tubos, por triplicado, 15 µ? de agua, lisozima de A. alcalophilum GH25 (10 mg/ml) , lisozima de clara de huevo de gallina (10 mg/ml) , o lisozima de A. alcalophilum GH25 (10 mg/ml) + clara de huevo de gallina (10 mg/ml), mezcla 1:1. Los tubos se incubaron a 37°C durante 30 min, después de lo cual se agregaron 25 µ? de proteasa Qiagen y 200 µ? de regulador Qiagen. Entonces se incubaron los tubos a 56 °C durante 20 min. A continuación, se agregaron a cada tubo 210 µ? de etanol al 96%. Los tubos se sometieron a torbellino, y se transfirieron los líquidos a columnas de centrifugado Qiagen, y se centrifugaron a 8000 r. p. m. durante 1 min. Las columnas se lavaron dos veces con 500 µ? de regulador AW1 (incluido en el equipo Qiagen # 51106) . Después del primer lavado, las columnas se centrifugaron durante 1 min a 8000 R. P. M. , y después de un segundo lavado, las columnas se centrifugaron durante 3 min a 15.000 R. P. M. El ADN genómico se eluyó desde la columna mediante la adición de 100 µ? de agua milliQ (calentada hasta 70°C) a cada columna, se incubó durante 1 min a temperatura ambiente, y se centrifugó en tubos Eppendorf a 8000 R. P. M. durante 1 min. Todas las incubaciones se repitieron por triplicado.
Resultados .
El rendimiento de ADN genómico se estimó haciendo correr el ADN aislado sobre un gel de agarosa, y mediante la inspección visual de la intensidad de la banda de ADN (Tabla 15) . El rendimiento de ADN relativo entre los 4 tratamientos diferentes de cada cepa bacteriana se calculó a simple vista usando 4 puntajes diferentes.
Tabla 15: Comparación del rendimiento de ADN genómico entre diferentes combinaciones de lisozima de Acremonium alcalophilum GH25 (SEC. ID. NRO. 8) y lisozima de clara de huevo de gallina.
Los rendimientos se clasificaron a simple vista usando siguiente escala: - sin banda de ADN visible. + banda débil . ++ banda media. +++ banda fuerte.
El uso de lisozima de A. alcalophilum GH25 proporcionó un rendimiento de ADN genómico tan bueno o mejor, en 3 de 6 casos, en comparación con la lisozima de clara de huevo de gallina. El uso de la combinación de lisozima de A. alcalophilum GH25 y lisozima de clara de huevo de gallina proporcionó un rendimiento de ADN genómico tan bueno o mejor, en 5 de 6 casos, en comparación con cualquiera de las lisozimas solas.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (29)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 o al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 8 ; (b) un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 3 o a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 7; (c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de media-alta rigurosidad con la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 3 o SEC. ID. NRO . : 7, o su complemento de longitud completa ; (d) una variante del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO.: 8, que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (e) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) o (d) que tiene actividad de lisozima.
2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es seleccionado entre polipéptidos que comprenden o consisten en SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO. : 8 o el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID . NRO . : 8.
3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido maduro se selecciona entre los aminoácidos 20 a 227 de SEC. ID. NRO. : 4 o los aminoácidos 1 a 208 de SEC. ID. NRO.: 8.
4. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, el cual es una variante del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO. : 8 caracterizado porque comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (varias) posiciones.
5. Una composición caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una composición detergente.
7. La composición detergente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque es para el lavado de ropa, el lavado de vajilla, o la limpieza de superficies duras .
8. La composición detergente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizada porque comprende una o más enzimas adicionales seleccionadas del grupo que comprende proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas, endoglucanasas , xiloglucanasas , pectinasas, pectina liasas, xantanasas, peroxidasas, haloperoxigenasas , catalasas y mananasas, o cualquiera de sus mezclas .
9. La composición detergente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que comprende tensioactivos , mej oradores, hidrótropos, sistemas de blanqueo, polímeros, agentes matizantes de géneros, materiales coadyuvantes, dispersantes, agentes inhibidores de la transferencia de tinturas, agentes blanqueadores fluorescentes, polímeros liberadores de suciedad y agentes contra el redepósito.
10. Una composición de alimentación animal caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
11. La composición de alimentación animal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque además comprende una o más amilasas; fitasas; xilanasas; galactanasas; alfa-galactosidasas ; proteasas, fosfolipasas , beta-glucanasas , o cualquiera de sus mezclas.
12. Un aditivo de alimentación animal caracterizado porque comprende : por lo menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y por lo menos una vitamina soluble en grasa; y/o por lo menos una vitamina soluble en agua; y/o por lo menos un oligoelemento .
13. El aditivo de alimentación animal de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además comprende una o más amilasas; fitasas; xilanasas; galactanasas; alfa-galactosidasas ; proteasas, fosfolipasas , beta-glucanasas, o cualquiera de sus mezclas.
14. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque que es una composición de extracción de ADN genómico bacteriano.
15. La composición de extracción de ADN genómico bacteriano de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque comprende una o más lisozimas adicionales.
16. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 como un inhibidor de la formación de biopelícula.
17. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en una composición dental.
18. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en una composición detergente.
19. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en la alimentación animal.
20. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la descomposición de las paredes celulares de bacterias.
21. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque se utiliza en un proceso para el aislamiento de ADN de bacterias.
22. Un método de aislamiento de ADN de bacterias, caracterizado porque comprende: (a) el tratamiento de las bacterias aisladas con el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y (b) la recuperación del ADN bacteriano.
23. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
24. Una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 23 funcionalmente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un hospedero de expresión.
25. Una célula hospedera recombinada caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 23 funcionalmente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido .
26. Un método para la producción del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de una célula, que, en su forma de tipo silvestre, produce el polipéptido, en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
27. Un método para la producción de un polipéptido que tiene actividad de lisozima, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 25 en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
28. Una planta, parte de planta o célula de planta transgénica, caracterizada porque está transformada con un polinucleótido que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
29. Un método para la producción de un polipéptido que tiene actividad de lisozima, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de la planta o célula de planta transgénica de conformidad con la reivindicación 28 en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
MX2014006155A 2011-11-25 2012-11-23 Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotdos que los codifican. MX351916B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11190690 2011-11-25
PCT/EP2012/073483 WO2013076253A1 (en) 2011-11-25 2012-11-23 Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014006155A true MX2014006155A (es) 2014-08-27
MX351916B MX351916B (es) 2017-11-03

Family

ID=47226164

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014006155A MX351916B (es) 2011-11-25 2012-11-23 Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotdos que los codifican.
MX2014006216A MX353710B (es) 2011-11-25 2012-11-23 Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotidos que los codifican.

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014006216A MX353710B (es) 2011-11-25 2012-11-23 Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotidos que los codifican.

Country Status (18)

Country Link
US (7) US9701952B2 (es)
EP (2) EP2782592B1 (es)
JP (1) JP6105615B2 (es)
CN (2) CN103957929B (es)
AR (2) AR088976A1 (es)
AU (1) AU2012342456B2 (es)
BR (2) BR112014012160B1 (es)
CA (1) CA2856593C (es)
CL (1) CL2014001317A1 (es)
DK (1) DK2782592T3 (es)
ES (2) ES2624531T3 (es)
IN (1) IN2014CN04586A (es)
MX (2) MX351916B (es)
PE (1) PE20151745A1 (es)
PL (1) PL2782592T3 (es)
RU (1) RU2619051C2 (es)
WO (2) WO2013076253A1 (es)
ZA (1) ZA201403761B (es)

Families Citing this family (68)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2624531T3 (es) 2011-11-25 2017-07-14 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleótidos que codifican los mismos
MX2016012260A (es) * 2014-03-28 2017-01-06 Novozymes As Resolubilizacion de cristales de proteina a bajo ph.
US20160030528A1 (en) * 2014-07-01 2016-02-04 Vanderbilt University Antimicrobial muramidase
EP3186372B1 (en) * 2014-08-28 2020-10-21 Novozymes A/S Solubilization of msw with blend enzymes
AU2016286612B2 (en) 2015-07-02 2021-01-28 Novozymes A/S Animal feed compositions and uses thereof
EP3970506A1 (en) 2015-07-02 2022-03-23 Novozymes A/S Animal feed compositions comprising gh25 lysozyme and ec 3.1.3.26 phytase and uses thereof
US10568344B2 (en) 2015-07-02 2020-02-25 Novozymes A/S Methods of improving animal performance
WO2017064092A1 (en) * 2015-10-13 2017-04-20 Dsm Ip Assets B.V. Feed additives for aquatic animals comprising essential oils and lysozyme
WO2017094818A1 (ja) * 2015-12-02 2017-06-08 日清オイリオグループ株式会社 被覆用油脂組成物
US11685911B2 (en) 2016-02-16 2023-06-27 Monaghan Mushroom S Group Fungal polypeptides having lysozyme activity
US11130800B2 (en) 2016-05-20 2021-09-28 Novobind Livestock Therapeutics Inc. Antibodies against microorganisms and uses thereof
CN105861468B (zh) * 2016-06-07 2019-12-06 江南大学 一种n端融合hlh功能域提高猪溶菌酶抗菌性能的方法
CN106046173B (zh) * 2016-06-07 2019-05-10 江南大学 一种n端融合多聚六肽提高猪溶菌酶抗菌性能的方法
CN106701373A (zh) * 2016-12-11 2017-05-24 深圳市美益洁生物科技有限公司 茶具生物酶除菌清洗剂及其制备方法和应用
AU2017384228B2 (en) * 2016-12-21 2024-07-25 Novozymes A/S Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof
CN110072996A (zh) * 2016-12-21 2019-07-30 诺维信公司 具有溶菌酶活性的多肽、编码其的多核苷酸及其用途和组合物
CA3048773A1 (en) * 2017-01-04 2018-07-12 Novozymes A/S Microbial lysozyme for use in the treatment of irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease
BR112019020772A2 (pt) * 2017-04-03 2020-04-28 Novozymes As processo de recuperação
US11950569B2 (en) 2017-05-09 2024-04-09 Novozymes A/S Animal chew toy with dental care composition
BR112019023329A2 (pt) * 2017-05-12 2020-06-16 Novozymes A/S Composição, grânulo, aditivo de ração animal, ração animal, formulação líquida, métodos para aprimorar um ou mais parâmetros de desempenho de um animal, para preparar uma ração animal e para produzir o polipeptídeo, uso da composição, polipeptídeo isolado, polinucleotídeo, construto ou vetor de expressão de ácido nucleico, e, célula hospedeira recombinante
EP3668991A4 (en) * 2017-08-18 2021-06-09 President and Fellows of Harvard College NANOCARRIERS FOR DELIVERY OF ACTIVE SUBSTANCES
EP3679579A1 (en) * 2017-09-05 2020-07-15 Adaptive Phage Therapeutics, Inc. Methods to determine the sensitivity profile of a bacterial strain to a therapeutic composition
CN108251440B (zh) * 2017-12-18 2021-04-13 宁波大学 缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用
WO2019121930A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
WO2019121937A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions comprising muramidase and uses thereof
CN110115776A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 沈阳药科大学 一种具有抗菌活性的可吸收淀粉微球止血粉及其应用
AU2019232574B2 (en) 2018-03-05 2024-06-13 Novozymes A/S Ruminant feed composition comprising a muramidase
BR112020021365A2 (pt) 2018-04-25 2021-01-19 Novozymes A/S Ração animal, método para melhoria do fator de eficiência de produção europeu, ganho de peso corporal e/ou razão de conversão de ração de um animal monogástrico, uso de pelo menos um probiótico em combinação com um polipeptídeo tendo atividade de muramidase em uma composição de ração, e, composição de ração ou uma composição de pré-mistura, ou um aditivo de ração para animais.
CN112804883A (zh) 2018-09-11 2021-05-14 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 动物饲料组合物及其用途
BR112021004464A8 (pt) 2018-09-11 2021-06-01 Dsm Ip Assets Bv composição de ração animal e uso da mesma
WO2020053276A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed composition and use thereof
WO2020053271A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed composition and use thereof
PE20211490A1 (es) 2018-09-11 2021-08-11 Novozymes As Granulos estables para composiciones de pienso
MX2021002786A (es) 2018-09-11 2021-05-12 Dsm Ip Assets Bv Composiciones de alimento animal y usos de las mismas.
US20210289818A1 (en) 2018-09-17 2021-09-23 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
EP3852547A1 (en) 2018-09-17 2021-07-28 DSM IP Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
WO2020058224A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
MX2021003045A (es) 2018-09-17 2021-08-11 Dsm Ip Assets Bv Composiciones de alimento animal y usos de las mismas.
BR112021004826A2 (pt) 2018-09-17 2021-06-08 Dsm Ip Assets B.V. composições de ração animal e usos das mesmas
EP3880701A4 (en) 2018-11-13 2022-11-02 Novobind Livestock Therapeutics, Inc. ANTIBODIES AGAINST CANID AND FELID PATHOGENS AND THEIR USE
WO2020099491A1 (en) 2018-11-14 2020-05-22 Novozymes A/S Oral care composition comprising a polypeptide having dnase activity
EP3898985B1 (en) * 2018-12-21 2023-02-08 Novozymes A/S Tandem protein expression
WO2020127796A2 (en) * 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same
GB201901364D0 (en) * 2019-01-31 2019-03-20 Axitan Ltd Endolysins
CN110501983B (zh) * 2019-07-31 2021-03-26 农业农村部南京农业机械化研究所 基于批次式包衣机的专家控制系统及控制方法
MX2021015818A (es) * 2019-08-06 2022-02-03 Novozymes As Proteinas de fusion para mejorar la expresion de enzimas.
BR112022007143A2 (pt) * 2019-10-17 2022-07-05 Dsm Ip Assets Bv Composições de ração para animais e usos das mesmas
US20250197909A1 (en) 2020-04-03 2025-06-19 Novozymes A/S Submerged fermentation process
CN111471621B (zh) * 2020-04-20 2021-09-28 河北萌帮水溶肥料股份有限公司 水域微小杆菌mb338及其应用
CN111398537A (zh) * 2020-04-25 2020-07-10 燕京啤酒(曲阜三孔)有限责任公司 一种成品啤酒泡持指标的预测和调控方法
CN111378635B (zh) * 2020-05-29 2020-10-16 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法
CN116322625A (zh) 2020-08-24 2023-06-23 诺维信公司 包含果聚糖酶的口腔护理组合物
CN116323935A (zh) 2020-08-27 2023-06-23 丹尼斯科美国公司 用于清洁的酶和酶组合物
WO2022133068A1 (en) * 2020-12-16 2022-06-23 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
CN113151228A (zh) * 2021-03-16 2021-07-23 李明达 一种病毒消杀用的复合酶制剂及其制备方法与应用
WO2022194728A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed composition and use thereof
WO2022212865A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Sterilex, Llc Quat-free powdered disinfectant/sanitizer
CN113769148B (zh) * 2021-09-27 2023-03-21 中国科学院微生物研究所 PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的应用
CN118382364A (zh) 2021-12-15 2024-07-23 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 改善产蛋量和/或蛋品质的方法和用途，涉及施用包含胞壁质酶(ec 3.2.1.17)的饲料
WO2023131629A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Novozymes A/S Animal feed composition and use thereof
WO2023168234A1 (en) * 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
CN115094051B (zh) * 2022-04-08 2023-09-22 福建福大百特生物科技有限公司 一种来源于海科贝特氏菌的重组溶菌酶及其制备方法和应用
EP4525615A2 (en) 2022-05-14 2025-03-26 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections
WO2024121324A1 (en) 2022-12-08 2024-06-13 Novozymes A/S Polypeptide having lysozyme activity and polynucleotides encoding same
CN117982398A (zh) * 2024-02-04 2024-05-07 广州姿采化妆品厂 一种植物复合提取物及其制备方法及其应用
CN117882801B (zh) * 2024-03-18 2024-05-24 山东润德生物科技有限公司 一种复合发酵剂及其应用
CN118593404B (zh) * 2024-04-10 2025-01-28 广东雅心生物技术有限公司 一种抗皱复合物提取方法
CN119662605B (zh) * 2025-02-20 2025-05-09 腾讯科技（深圳）有限公司 多肽及其用途、制备多肽的方法、组合物或试剂盒

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (es) 1969-05-29 1972-11-22
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
US4355022A (en) 1981-07-01 1982-10-19 Interon, Inc. Method of dental treatment
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
US4933287A (en) 1985-08-09 1990-06-12 Gist-Brocades N.V. Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
ATE110768T1 (de) 1986-08-29 1994-09-15 Novo Nordisk As Enzymhaltiger reinigungsmittelzusatz.
US5389536A (en) 1986-11-19 1995-02-14 Genencor, Inc. Lipase from Pseudomonas mendocina having cutinase activity
ATE125865T1 (de) 1987-08-28 1995-08-15 Novo Nordisk As Rekombinante humicola-lipase und verfahren zur herstellung von rekombinanten humicola-lipasen.
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
WO1989006270A1 (en) 1988-01-07 1989-07-13 Novo-Nordisk A/S Enzymatic detergent
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US5648263A (en) 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
DE68911131T2 (de) 1988-03-24 1994-03-31 Novonordisk As Cellulosezubereitung.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5376288A (en) 1989-06-21 1994-12-27 Noro Nordisk A/S Detergent additive granulate and detergent
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
US5041236A (en) 1989-10-27 1991-08-20 The Procter & Gamble Company Antimicrobial methods and compositions employing certain lysozymes and endoglycosidases
DK0425016T3 (da) 1989-10-27 1996-05-06 Genencor Int Antimikrobiel fremgangsmåde og formulering med anvendelse af type II endoglycosidase og antimikrobielt middel
PT97110B (pt) 1990-03-23 1998-11-30 Gist Brocades Nv Processo para catalisar reaccoes acelaraveis por enzimas, mediante adicao ao meio reaccional de sementes de plantas transgenicas e para obtencao das referidas sementes
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
EP0531372B2 (en) 1990-05-09 2004-04-14 Novozymes A/S A cellulase preparation comprising an endoglucanase enzyme
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
ATE169671T1 (de) 1990-09-13 1998-08-15 Novo Nordisk As Lipase-varianten
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
SG52693A1 (en) 1991-01-16 1998-09-28 Procter & Gamble Detergent compositions with high activity cellulase and softening clays
DK0583339T3 (da) 1991-05-01 1999-04-19 Novo Nordisk As Stabiliserede enzymer og detergentsammensætninger
BR9206918A (pt) 1991-12-13 1995-11-21 Procter & Gamble Esteres de citrato acilado usados como precursores de perácido
US5595892A (en) 1991-12-20 1997-01-21 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. Process for preparation of purified xanthan gum
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
KR100294361B1 (ko) 1992-07-23 2001-09-17 피아 스타르 돌연변이체알파-아밀라제,세정제,접시세척제,및액화제
EP0663950B1 (en) 1992-10-06 2004-03-17 Novozymes A/S Cellulase variants
JP3741734B2 (ja) 1994-06-30 2006-02-01 信越化学工業株式会社 キサンタンガムの回収精製方法
NZ262623A (en) 1993-02-11 1998-03-25 Genencor Int Alpha-amylase mutant, dna and vectors encoding such and detergent compositions thereof
EP0652946B1 (en) 1993-04-27 2005-01-26 Genencor International, Inc. New lipase variants for use in detergent applications
DK52393D0 (es) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
FR2704860B1 (fr) 1993-05-05 1995-07-13 Pasteur Institut Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire.
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
FI961650A0 (fi) 1993-10-13 1996-04-15 Novo Nordisk As H2O2-stabiilit peroksidaasimuunnokset
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
ATE222604T1 (de) 1994-02-22 2002-09-15 Novozymes As Methode zur herstellung einer variante eines lipolytischen enzymes
DK0749473T3 (da) 1994-03-08 2006-02-27 Novozymes As Hidtil ukendte alkaliske cellulaser
US6017866A (en) 1994-05-04 2000-01-25 Genencor International, Inc. Lipases with improved surfactant resistance
DK0765394T3 (da) 1994-06-03 2001-12-10 Novozymes As Oprensede Myceliopthora-laccaser og nukleinsyrer der koder for disse
WO1995035381A1 (en) 1994-06-20 1995-12-28 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
AU2884695A (en) 1994-06-23 1996-01-19 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
JP3167729B2 (ja) 1994-06-30 2001-05-21 ノボ ノルディスク バイオテック，インコーポレイティド 無毒、非毒素原性、非病原性の発現系、並びにその中で利用するためのプロモーター及びターミネーター
DE69535733T2 (de) 1994-10-06 2009-04-23 Novozymes A/S Ein enzympräparat mit endoglucanase aktivität
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
BR9509525A (pt) 1994-10-26 1995-10-26 Novo Nordisk As Construção de dna vetor de expressão recombinante célula processo para produzir a enzima que exibe atividade lipolítica enzima que exibe atividade lipolítica preparação de enzima aditivo de detergente e composição de detergente
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
AU715423B2 (en) 1995-03-17 2000-02-03 Novozymes A/S Novel endoglucanases
JP3741751B2 (ja) 1995-07-11 2006-02-01 信越化学工業株式会社 キサンタンガムの改質方法
AU6414196A (en) 1995-07-14 1997-02-18 Novo Nordisk A/S A modified enzyme with lipolytic activity
DE19528059A1 (de) 1995-07-31 1997-02-06 Bayer Ag Wasch- und Reinigungsmittel mit Iminodisuccinaten
ATE267248T1 (de) 1995-08-11 2004-06-15 Novozymes As Neuartige lipolytische enzyme
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
AU3938997A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
WO1998012307A1 (en) 1996-09-17 1998-03-26 Novo Nordisk A/S Cellulase variants
CA2265734A1 (en) 1996-10-08 1998-04-16 Novo Nordisk A/S Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors
DE69726747T2 (de) 1996-10-18 2004-10-14 The Procter & Gamble Company, Cincinnati Waschmittelzusammensetzungen
WO1998020116A1 (en) 1996-11-04 1998-05-14 Novo Nordisk A/S Subtilase variants and compositions
EP0948610B1 (en) 1996-11-04 2011-05-25 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions
WO1998034946A1 (en) 1997-02-12 1998-08-13 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a novel fas-binding protein that activates jnk and apoptosis
JP2997800B2 (ja) * 1997-12-01 2000-01-11 農林水産省食品総合研究所長 細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
WO2000034450A1 (en) 1998-12-04 2000-06-15 Novozymes A/S Cutinase variants
PL347250A1 (en) 1998-10-15 2002-03-25 Dsm Nv Antimicrobial enzymes in animal feed
EP1124949B1 (en) 1998-10-26 2006-07-12 Novozymes A/S Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells
EP2278016B1 (en) 1999-03-22 2012-09-26 Novozymes Inc. Promoter sequences derived from Fusarium Venenatum and uses thereof
AU3420100A (en) 1999-03-31 2000-10-23 Novozymes A/S Lipase variant
US6710023B1 (en) * 1999-04-19 2004-03-23 Procter & Gamble Company Dishwashing detergent compositions containing organic polyamines
DE60112928T2 (de) 2000-06-02 2006-06-14 Novozymes As Cutinase-varianten
WO2001098214A1 (en) 2000-06-19 2001-12-27 Novozymes Biotech, Inc. Methods for eliminating the formation of biofilm
US20020104126A1 (en) * 2000-10-18 2002-08-01 Pogue Gregory P. Production of bovine lysozyme by plant viral vectors
EP1337657A2 (en) 2000-11-17 2003-08-27 Novozymes A/S Heterologous expression of taxanes
US7151204B2 (en) 2001-01-09 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof
WO2002064814A2 (en) 2001-02-14 2002-08-22 Ventria Bioscience Expression of human milk proteins in transgenic plants
RU2306774C2 (ru) 2001-07-13 2007-09-27 Даниско А/С Композиция, обладающая бактериостатической и бактерицидной активностью против спор бактерий и вегетативных клеток, и способ обработки ею продуктов питания
GB0127036D0 (en) 2001-11-09 2002-01-02 Unilever Plc Polymers for laundry applications
US20050170350A1 (en) 2002-02-16 2005-08-04 Stringer Mary A. Expression cloning methods in filamentous fungi
DE10237317B4 (de) 2002-08-15 2010-04-08 3M Espe Ag Enzymhaltige Zusammensetzung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
CA2404356A1 (en) 2002-09-18 2004-03-18 Canadian Inovatech Inc. Gram-positive antibacterial composition and method for use
GB2379166A (en) * 2002-10-22 2003-03-05 Dsm Nv Animal feed
RU2232818C1 (ru) 2002-11-06 2004-07-20 Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Способ выделения хромосомной днк из бактериальных клеток возбудителя чумы yersinia pestis
GB0314210D0 (en) 2003-06-18 2003-07-23 Unilever Plc Laundry treatment compositions
GB0314211D0 (en) 2003-06-18 2003-07-23 Unilever Plc Laundry treatment compositions
BRPI0411568A (pt) 2003-06-18 2006-08-01 Unilever Nv composição de tratamento para lavagem de roupa
ATE441705T1 (de) 2003-10-30 2009-09-15 Novozymes As Kohlenhydratbindende module
US8772007B2 (en) 2003-12-03 2014-07-08 Danisco Us Inc. Perhydrolase
CA2553731A1 (en) 2004-01-21 2005-08-04 Novozymes A/S Production of a monoclonal antibody in a heterokaryon fungus or in a fungal host cell
NZ549198A (en) 2004-02-25 2009-05-31 Novozymes As Fungal cell wall degrading lysozyme for use as an inhibitor of dental biofilms
JP2006182662A (ja) 2004-12-27 2006-07-13 Lion Corp 歯磨剤組成物
ATE484569T1 (de) 2005-04-15 2010-10-15 Basf Se Amphiphile wasserlösliche alkoxylierte polyalkylenimine mit einem inneren polyethylenoxidblock und einem äusseren polypropylenoxidblock
PL1869155T3 (pl) 2005-04-15 2011-03-31 Procter & Gamble Ciekłe kompozycje detergentu do prania ze zmodyfikowanymi polimerami polietylenoiminy oraz enzymem lipazy
JP2008540814A (ja) 2005-05-31 2008-11-20 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー ポリマーを含有する洗剤組成物及びその使用
US8518675B2 (en) 2005-12-13 2013-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of peracids using an enzyme having perhydrolysis activity
EP2287281A1 (en) 2006-01-23 2011-02-23 The Procter & Gamble Company Lipase and fabric hueing agent containing compositions
US8187854B2 (en) 2006-01-23 2012-05-29 Novozymes A/S Lipase variants
JP2009523901A (ja) 2006-01-23 2009-06-25 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー 洗剤組成物
JP2009523900A (ja) 2006-01-23 2009-06-25 ザ プロクター アンド ギャンブル カンパニー リパーゼと漂白剤触媒を含む組成物
BRPI0707215A2 (pt) 2006-01-23 2011-04-26 Procter & Gamble composições de detergentes
US20070191249A1 (en) 2006-01-23 2007-08-16 The Procter & Gamble Company Enzyme and photobleach containing compositions
WO2007087258A2 (en) 2006-01-23 2007-08-02 The Procter & Gamble Company A composition comprising a lipase and a bleach catalyst
WO2007109750A2 (en) 2006-03-22 2007-09-27 Novozymes North America, Inc. Fermentation processes
MX2008014819A (es) 2006-05-31 2008-12-01 Basf Se Polimeros de injerto anfifilicos basados en oxidos de polialquileno y esteres de vinilo.
ES2363788T3 (es) 2006-07-07 2011-08-16 THE PROCTER & GAMBLE COMPANY Composiciones detergentes.
CA2688736C (en) 2007-04-10 2017-07-04 Saint Simeon Lda Novel compositions containing lysozyme and c-1/c-4 polysaccharides and use thereof in oral care, cosmetology and dermatology, contraception, urology and gynecology
ES2568784T5 (es) 2008-01-04 2023-09-13 Procter & Gamble Una composición detergente para lavado de ropa que comprende glicosil hidrolasa
DK2268806T3 (da) * 2008-02-11 2013-07-15 Danisco Us Inc Enzym med mikrobiel lyseaktivitet fra Trichoderma reesei
US20090209447A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Michelle Meek Cleaning compositions
CA2715829C (en) 2008-02-29 2017-05-23 Novozymes A/S Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
WO2010065455A2 (en) 2008-12-01 2010-06-10 Danisco Us Inc. Enzymes with lipase activity
MX2011008656A (es) 2009-03-06 2011-09-06 Huntsman Adv Mat Switzerland Metodos de decoloracion-blanqueo enzimatico de textiles.
US20120028318A1 (en) 2009-03-18 2012-02-02 Danisco Us Inc. Fungal cutinase from magnaporthe grisea
CN102361972A (zh) 2009-03-23 2012-02-22 丹尼斯科美国公司 Cal a相关的酰基转移酶及其使用方法
WO2010115156A2 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Synthetic Genomics, Inc. Endophytic fungus and uses therefor
BR112012017056A2 (pt) 2009-12-21 2016-11-22 Danisco Us Inc "composições detergentes contendo lipase de bacillus subtilis e métodos para uso das mesmas"
WO2011084417A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing geobacillus stearothermophilus lipase and methods of use thereof
WO2011084412A1 (en) 2009-12-21 2011-07-14 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing thermobifida fusca lipase and methods of use thereof
MX2012009705A (es) * 2010-02-25 2012-12-17 Novozymes As Variantes de lisozima y polinucleotidos que codifican la misma.
WO2011150157A2 (en) 2010-05-28 2011-12-01 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing streptomyces griseus lipase and methods of use thereof
MX2013011617A (es) 2011-04-08 2013-11-21 Danisco Us Inc Composiciones.
ES2624531T3 (es) * 2011-11-25 2017-07-14 Novozymes A/S Polipéptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleótidos que codifican los mismos

Also Published As

Publication number Publication date
US10119130B2 (en) 2018-11-06
WO2013076259A3 (en) 2013-07-25
AR088976A1 (es) 2014-07-23
US10039300B2 (en) 2018-08-07
BR112014012160B1 (pt) 2022-08-30
CA2856593A1 (en) 2013-05-30
JP2015506667A (ja) 2015-03-05
MX2014006216A (es) 2014-08-21
BR112014012160A2 (pt) 2020-06-23
DK2782592T3 (en) 2017-06-19
ES2624531T3 (es) 2017-07-14
BR112014012170A2 (pt) 2020-06-23
ZA201403761B (en) 2015-12-23
CN103957929A (zh) 2014-07-30
AU2012342456B2 (en) 2016-11-24
US9663775B2 (en) 2017-05-30
JP6105615B2 (ja) 2017-03-29
US10829750B2 (en) 2020-11-10
MX351916B (es) 2017-11-03
AR113177A2 (es) 2020-02-05
US20170223986A1 (en) 2017-08-10
CN103957929B (zh) 2017-06-30
PE20151745A1 (es) 2015-12-20
US9701952B2 (en) 2017-07-11
RU2619051C2 (ru) 2017-05-11
US20200399625A1 (en) 2020-12-24
WO2013076253A1 (en) 2013-05-30
US10829751B2 (en) 2020-11-10
ES2631605T3 (es) 2017-09-01
EP2782592B1 (en) 2017-03-15
EP2782593B1 (en) 2017-04-26
CA2856593C (en) 2022-06-07
EP2782592A1 (en) 2014-10-01
EP2782593A2 (en) 2014-10-01
RU2014125559A (ru) 2015-12-27
US20140325711A1 (en) 2014-10-30
US20180298365A1 (en) 2018-10-18
US20170327808A1 (en) 2017-11-16
AU2012342456A1 (en) 2014-05-22
WO2013076259A2 (en) 2013-05-30
IN2014CN04586A (es) 2015-09-18
MX353710B (es) 2018-01-25
PL2782592T3 (pl) 2017-09-29
US20140380527A1 (en) 2014-12-25
CN107090445A (zh) 2017-08-25
CL2014001317A1 (es) 2014-11-07
US20190153415A1 (en) 2019-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10829750B2 (en) Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same
EP2751266B1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
US20150023945A1 (en) Lysozymes
EP2934177B1 (en) Polypeptides having protease activiy and polynucleotides encoding same

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration