MX2014006216A - Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotidos que los codifican. - Google Patents

Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotidos que los codifican.

Info

Publication number
MX2014006216A
MX2014006216A MX2014006216A MX2014006216A MX2014006216A MX 2014006216 A MX2014006216 A MX 2014006216A MX 2014006216 A MX2014006216 A MX 2014006216A MX 2014006216 A MX2014006216 A MX 2014006216A MX 2014006216 A MX2014006216 A MX 2014006216A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
polypeptide
sec
lysozyme
nro
mature
Prior art date
Application number
MX2014006216A
Other languages
English (en)
Other versions
MX353710B (es
Inventor
Kirk Matthew Schnorr
Original Assignee
Novozymes As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes As filed Critical Novozymes As
Publication of MX2014006216A publication Critical patent/MX2014006216A/es
Publication of MX353710B publication Critical patent/MX353710B/es

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
    • A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/174—Vitamins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/184—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/189—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/20—Inorganic substances, e.g. oligoelements
    • A23K20/30—Oligoelements
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K40/00—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs
    • A23K40/20—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs by moulding, e.g. making cakes or briquettes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K40/00—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs
    • A23K40/25—Shaping or working-up of animal feeding-stuffs by extrusion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/70—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds
    • A23K50/75—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for birds for poultry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K50/00—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals
    • A23K50/80—Feeding-stuffs specially adapted for particular animals for aquatic animals, e.g. fish, crustaceans or molluscs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/10—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting
    • C11B1/102—Production of fats or fatty oils from raw materials by extracting in counter-current; utilisation of an equipment wherein the material is conveyed by a screw
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
    • Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
    • Y02A40/818—Alternative feeds for fish, e.g. in aquacultures

Abstract

La presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de lisozima, y a polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La invención además se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos, al igual que a métodos para la producción y el uso de los polipéptidos.

Description

POLIPEPTIDOS QUE TIENEN ACTIVIDAD DE LISOZIMA Y POLINUCLEOTIDOS QUE LOS CODIFICAN ANTECEDENTES DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de lisozima, a dominios catalíticos y polinucleótidos que codifican los polipéptidos y los dominios catalíticos. La invención además se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos , al igual que a métodos para la producción y el uso de los polipéptidos y los dominios catalíticos .
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La lisozima es una O-glicosil hidrolasa producida como un mecanismo de defensa contra bacterias, por muchos organismos. La enzima causa la hidrólisis de las paredes celulares bacterianas mediante la disociación de los enlaces glucosídicos del peptidoglucano, una molécula estructural importante en bacterias. Luego del debilitamiento de las paredes celulares por la acción de la lisozima, las células bacterianas se lisan, como consecuencia de la presión osmótica.
La lisozima se produce en muchos organismos, tales como virus, plantas, insectos, aves, reptiles y mamíferos. En mamíferos, la lisozima ha sido aislada de secreciones Ref. 248357 nasales, saliva, lágrimas, intestinos, orina y leche. La enzima disocia el enlace glucosídico entre el número carbónico 1 de ácido IV-acetilmurámico y el número carbónico 4 de N-acetil-D-glucosamina . In vivo, estos dos carbohidratos son polimerizados para formar el polisacárido de la pared celular .
Existe un creciente interés en el potencial de las enzimas lisozimas como agentes antimicrobianos. Por ejemplo, la actividad de la lisozima se ha demostrado contra patógenos tales como Streptococcus pneumoniae, Bacillus anthracis, Enterococcus faecium, Bacillus stearothermophilus, Clostridium botulinum, Clostridium butyrícum, Clostridium perfringens, Clostridium sporogenes, Clostridium tyrobutyricum y Listeria monocytogenes.
Las lisozimas se han clasificado en cinco diferentes familias de glucósido hidrolasas (GH) (CAZy, www.cazy.org) : la lisozima de clara de huevo de gallina (GH22) , la lisozima de clara de huevo de ganso (GH23) , la lisozima de bacteriófago T4 (GH24) , proteína flagelar de Sphingomonas (GH73) y lisozimas de Chalaropsis (GH25) . Las lisozimas de las familias GH23 y GH24 se conocen, principalmente, de bacteriófagos, y no se han identificado en hongos. Se ha hallado que la familia de lisozimas GH25 no está estructuralmente relacionada con las otras familias de lisozimas.
Se ha sugerido el uso de las lisozimas en alimentaciones animal (ver, por ejemplo, las Solicitudes Internacionales WO 00/21381 y WO 04/026334), en la producción de quesos (ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 05/080559) , en la conservación de alimentos (Hughey y Johnson (1987), Appl . Environ. Microbiol . , 53: 2165), en detergentes (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 5,041,236 y Patente Europea EP 0425016), en el cuidado oral (ver, por ejemplo, Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 4,355,022, Solicitud Internacional WO 04/017988 y Solicitud Internacional WO 08/124764) , en cosmetología y dermatología, en anticoncepción, urología y ginecología (ver, por ejemplo, Solicitud Internacional WO 08/124764) .
Se ha informado una lisozima GH25 de Chalaropsis (Felsch, J. W. , Ingagami, T. , y Hash, J. H. (1975), "The N,0-Diacetylmuramidase of Chalaropsis species; V The complete aminoácido sequence, J. Biol . Chem. , 250 (10): 3713-3720).
La lisozima de clara de huevo de gallina, que es el producto primario que puede obtenerse en el mercado comercial, no disocia N, 6-O-diacetilmuramidasa en, por ejemplo, las paredes celulares de Staphylococcus aureus, y por lo tanto, no puede lisar este importante patógeno humano, entre otros (Masschalck, B., Deckers, D. , Michiels, C. W. (2002) , "Lytic and nonlytic mechanism of inactivation of gram-positive bacteria by lisozima under atmospheric and high hydrostatic pressure" , J. Food Prot., 65 (12): 1916-23).
Se ha observado que diferentes lisozimas tienen diferentes especificidades hacia distintos microorganismos. Por lo tanto, es conveniente poder obtener varias lisozimas a fin de poder seleccionar las enzimas adecuadas para cada aplicación particular. Por consiguiente, se desean nuevos polipéptidos que tengan actividad de lisozima.
SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a polipéptidos fúngicos aislados que pertenecen a las familias GH23 o GH24 y que tienen actividad de lisozima.
La presente invención además se refiere a polipéptidos aislados que tienen actividad de lisozima, seleccionados del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6; (b) un polipéptido que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2; (c) un polipéptido que tiene por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO . : 4 ; (d) un polipéptido codificado por un polinucleotido que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 1 ; (e) un polipéptido codificado por un polinucleotido que tiene por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleotido que tiene por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO . : 5 ; (g) un polipéptido codificado por un polinucleótido que híbrida en condiciones de media-alta rigurosidad con la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 1, SEC. ID. NRO.: 3 o SEC. ID. NRO.: 5, o su complemento de longitud completa; (h) una variante del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2, SEC. ID. NRO.: 4 o SEC. ID. NRO.: 6, que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (i) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) que tiene actividad de lisozima.
La presente invención además se refiere a polinucleótidos aislados que codifican los polipéptidos de la presente invención; construcciones de ácido nucleico; vectores de expresión recombinados; células hospederas recombinadas que comprenden los polinucleótidos; y métodos para la producción de los polipéptidos.
La presente invención además se refiere a los polipéptidos de la invención que tienen actividad antimicrobiana, y métodos de uso de los polipéptidos de la invención como inhibidores de la formación de biopelícula, en composiciones detergentes, en alimentaciones animales y para la extracción de ADN genómico bacteriano.
La presente invención además se refiere a un polinucleótido que codifica un péptido de señal que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO. : 2, los aminoácidos 1 a 20 de SEC. ID. NRO. : 4 o aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO. : 6, que está funcionalmente ligado a un gen que codifica una proteína; a construcciones de ácido nucleico, vectores de expresión y células hospederas recombinadas que comprenden los polinucleótidos ; y a métodos para la producción de una proteína.
BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEC. ID. NRO. : 1 es la secuencia de ADN del P8EH GH23 aislada de Aspergillus aculeatus CBS 172.66.
SEC. ID. NRO. : 2 es la secuencia de aminoácidos deducida de SEC . ID . NRO . : 1.
SEC. ID. NRO. : 3 es la secuencia de ADN del gen P242MS GH24 aislada de Acremonium alkalophilum CBS114.92.
SEC. ID. NRO. : 4 es la secuencia de aminoácidos deducida de SEC . ID . NRO . : 3.
SEC. ID. NRO. : 5 es la secuencia de ADN del gen P244A7 GH24 aislada de Acremonium alkalophilum CBS114.92.
SEC. ID. NRO. : 6 es la secuencia de aminoácidos deducida de SEC . ID . NRO . : 5.
SEC. ID. NRO.: 7 es la secuencia de ADN del gen P242M9 GH25 aislada de Acremonium alkalophilum CBS114.92.
SEC. ID. NRO. : 8 es la secuencia de aminoácidos deducida de SEC. ID. NRO. : 7.
SEC. ID. NRO.: 9 es el cebador delantero F-P8EH.
SEC. ID. NRO.: 10 es el cebador inverso R-P8EH.
SEC. ID. NRO.: 11 es el cebador delantero F-P242MS.
SEC. ID. NRO.: 12 es el cebador inverso R-P242MS.
SEC. ID. NRO.: 13 es el cebador delantero F-P244A7.
SEC. ID. NRO.: 14 es el cebador inverso R-P244A7.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra ensayos de difusión radial de la lisozima de Acremonium alcalophilum GH24 (EXP03890, SEC. ID. NRO.: 6), la lisozima de Acremonium alcalophilum GH25 (EXP03864, SEC. ID. NRO.: 8) y una lisozima de referencia de Aspergillus fumigatus GH25 en S. carnosus y E. coli.
DEFINICIONES Lisozima: El término actividad de "lisozima" se define en esta solicitud como una O-glicosil hidrolasa, que cataliza la hidrólisis del enlace glucosídico entre dos o más carbohidratos, o entre un carbohidrato y un resto no carbohidrato. Las lisozimas disocian el enlace glucosídico entre ciertos residuos en mucopolisacáridos y mucopéptidos de las paredes celulares bacterianas, tales como las uniones 1,4-beta entre residuos ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglucano, y entre residuos W-acetil-D-glucosamina, en quitodextrinas , de modo de lograr la bacteriólisis . La lisozima pertenece a la clase de enzimas EC 3.2.1.17. Para los propósitos de la presente invención, la actividad de la lisozima se determina de acuerdo con el ensayo de turbiedad descrito en el Ejemplo 4. En un aspecto, los polipéptidos de la presente invención tienen por lo menos 20%, por ejemplo, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, o por lo menos 100% de la actividad de la lisozima del polipéptido maduro de una de SEC. ID. NRO. : 2 , SEC . ID . NRO .: 4 o SEC . ID . NRO . : 6.
Variante alélica: El término "variante alélica" significa cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede producir polimorfismo dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser imperceptibles (sin cambio en el polipéptido codificado) , o pueden codificar polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos alteradas. Una variante alélica de un polipéptido es un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.
Actividad antimicrobiana: El término "actividad antimicrobiana" se define en esta solicitud como una actividad que mata o inhibe el crecimiento de microorganismos, tales como algas, arqueobacterias , bacterias, hongos y protozoos. La actividad antimicrobiana puede ser, por ejemplo, bactericida, con el significado de la muerte de bacterias; o puede ser bacterioestática, con el significado de la prevención del crecimiento bacteriano. La actividad antimicrobiana puede incluir la catálisis de la hidrólisis de uniones 1,4-beta entre residuos ácido N-acetilmurámico y W-acetil-D-glucosamina en un peptidoglucano, y entre residuos N-acetil-D-glucosamina, en quitodextrinas . La actividad antimicrobiana además puede incluir la unión de la lisozima a la superficie del microorganismo, y la inhibición de su crecimiento. El efecto antimicrobiano también puede incluir el uso de las lisozimas de la presente invención para la activación de autolisinas bacterianas, como un inmunoestimulante , mediante la inhibición o reducción de toxinas bacterianas y por un efecto de opsonina . Para los propósitos de la presente invención, la actividad antimicrobiana se determina de acuerdo con el ensayo de difusión radial que se describe en el Ejemplo 4.
Propiedad alterada/modificada: El término "propiedad alterada/modificada" se define en esta solicitud como una característica asociada con una variante que está alterada o modificada, en comparación con la lisozima progenitora o con una secuencia de referencia identificada. La propiedad alterada o modificada puede ser una característica asociada con una variante que está mejorada, a menos que se establezca lo contrario, en relación con otra lisozima de referencia, o con la lisozima progenitora. Ejemplos de propiedades que pueden ser alteradas/modificadas, o mejoradas, se proporcionan a continuación.
Termoestabilidad: El término "termoestabilidad" se refiere a la actividad de la lisozima después de un período de incubación a elevada temperatura, en relación con la progenitora o con una secuencia de referencia identificada, o bien en un regulador, o en condiciones tales como aquellas que se presentan durante el almacenamiento o el transporte del producto, o en condiciones similares a aquellas que se presentan durante el uso industrial de una variante. Una variante puede exhibir o no exhibir un perfil de actividad térmica alterado en relación con la progenitora. En un aspecto, la termoestabilidad de una variante que tiene actividad de lisozima es por lo menos 1.0 vez, por ejemplo, por lo menos 1.1 veces, por lo menos 1.5 veces, por lo menos, 1.8 veces, por lo menos 2 veces, por lo menos 5 veces, por lo menos 10 veces, por lo menos 15 veces, por lo menos 20 veces, y por lo menos 25 veces más termoestable que la progenitora o que una secuencia de referencia a la temperatura seleccionada. Preferentemente, la actividad se evalúa empleando el ensayo de actividad de turbiedad de lisozima que se describe en la sección titulada "Materiales y métodos" .
Perfil de temperatura/estabilidad térmica: El término "perfil de temperatura/estabilidad térmica" se refiere a la enzima variante que muestra un perfil modificado de temperatura en comparación con la progenitora o con una secuencia de referencia identificada, donde el perfil de temperatura se determina como la actividad de lisozima como una función de la temperatura. La actividad a cada temperatura, preferentemente, se indica como actividad relativa (en %) normalizada al valor a temperatura óptima. La temperatura óptima es aquella temperatura dentro de las temperaturas evaluadas (es decir, aquellas con saltos de 5-10°C) donde la actividad es más alta.
Estabilidad de pH: El término "estabilidad de pH" se refiere a la enzima variante que exhibe estabilidad estructural en relación con la lisozima progenitora o con una secuencia de referencia identificada, luego de un período de incubación a un pH que se encuentra fuera del intervalo de pH donde la enzima es activa (intervalo de actividad de pH) . La variante puede exhibir o no exhibir un alterado perfil de actividad de pH en relación con la progenitora. Por ejemplo, una variante puede no ser activa al pH mayor o menor, si bien puede mantener su estructura tridimensional y luego recobrar la actividad, una vez que retorna al intervalo de actividad de pH. Alternativamente, una variante puede tener mejorada capacidad para el replegado, en relación con la progenitora, luego de la incubación a mayor o menor pH.
En un aspecto, el perfil de estabilidad de pH es alterado, de manera que una variante de lisozima tiene 3 mejorada estabilidad a pH ácido. De acuerdo con esta solicitud, el pH ácido significa de pH 2 a 5.5, preferentemente, de 2.5 a 5.25, más preferentemente, de 3 a 5, aun más preferentemente, de 3.5 a 4. Preferentemente, la variante de lisozima mantiene por lo menos 40%, preferentemente, por lo menos 50%, 60%, 70% u 80%, más preferentemente, por lo menos 90%, aun más preferentemente, por lo menos 95% de actividad residual luego de la incubación a un pH determinado durante 1 hora, cuando se compara con una variante que se ha mantenido a pH 6.5 durante el mismo tiempo. Preferentemente, la actividad residual de una variante de lisozima es por lo menos 1.1 vez, por lo menos 1.3 veces, por lo menos 1.5 veces, preferentemente por lo menos 2 veces, más preferentemente, por lo menos 5 veces, con mayor preferencia, por lo menos 7 veces, y aun con mayor preferencia, por lo menos 10 veces más alta que la actividad residual de la lisozima progenitora, o de una secuencia de referencia identificada, que se ha tratado en las mismas condiciones. Preferentemente, la actividad es evaluada utilizando el ensayo de actividad de turbiedad de lisozima que se describe en la sección de "Materiales y métodos" .
Perfil de actividad de pH : El término "perfil de actividad de pH" se define en esta solicitud como una variante de lisozima que exhibe una alteración del perfil de actividad dependiente del pH cuando se compara con el perfil de actividad de pH de la lisozima progenitora o de una secuencia de referencia identificada. El perfil de actividad de pH proporciona una medida de la eficiencia de la enzima en la prevención del crecimiento microbiano, la eliminación de células microbianas, o la modalidad de la catálisis de una reacción de hidrólisis sobre un intervalo de pH en condiciones determinadas, tales como la temperatura y la composición de solvente. Una lisozima tiene un intervalo de pH específico donde el polipéptido es estable y retiene su actividad enzimática,- fuera de este intervalo, la lisozima se torna menos activa y potencialmente , además, menos estable. Dentro del intervalo de pH, en general, hay un pH óptimo, donde la lisozima muestra la actividad más alta.
Una variante de lisozima con mejorada actividad a pH alcalino (por ejemplo, de pH 7.5 a 12, preferentemente, de 8 a 11, más preferentemente, de 8.5 a 10, aun más preferentemente, de 9 a 9.5) podrá funcionar en entornos más alcalinos, tales como detergentes.
Una variante con mejorada actividad a pH ácido (por ejemplo, de pH 2 a 6.5; preferentemente, de 2.5 a 6, más preferentemente, de 3 a 5.5, aun más preferentemente, de 3.5 a 5) podrá funcionar en condiciones más ácidas, como conservante en ciertos alimentos o molécula eubiótica en alimentaciones .
En un aspecto, el perfil de actividad de pH es alterado de modo tal que una variante de lisozima tiene mejorada actividad a un pH más alcalino. Preferentemente, la actividad de una variante de lisozima a un pH de por lo menos 0.5 unidades más alto, preferentemente, por lo menos 1.0 unidades de pH más alto, más preferentemente, por lo menos 1.5 unidades de pH más alto, aun más preferentemente, por lo menos 2.0 unidades de pH más alto, es por lo menos 1.1 veces, preferentemente, por lo menos 1.5 veces, más preferentemente, por lo menos 2 veces, aun más preferentemente, por lo menos 5 veces, y con mayor preferencia, por lo menos 10 veces más alta que aquella de la enzima progenitora o de una secuencia de referencia identificada. Preferentemente, una variante de lisozima, al mismo tiempo, mantiene por lo menos 40%, preferentemente, por lo menos 50%, 60%, 70% u 80%, o 90%, más preferentemente, por lo menos 95%, aun más preferentemente, por lo menos 100% de la actividad que la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada exhibe a su pH óptimo. Preferentemente, la actividad es evaluada usando el ensayo de actividad de turbiedad de lisozima que se describe en la sección de "Materiales y métodos" .
En otro aspecto, el perfil de actividad de pH es alterado de modo tal que una variante de lisozima tiene mejorada actividad a un pH más ácido. Preferentemente, la actividad de una variante de lisozima a un pH por lo menos 0.5 unidades inferior, preferentemente, por lo menos 1.0 unidades de pH inferior, más preferentemente, por lo menos 1.5 unidades de pH inferior, aun más preferentemente, por lo menos 2.0 unidades de pH inferior, es por lo menos 1.1 veces, preferentemente, por lo menos 1.5 veces, más preferentemente, por lo menos 2 veces, aun más preferentemente, por lo menos 5 veces, y con mayor preferencia, por lo menos 10 veces más alta que aquella de la enzima progenitora o de una secuencia de referencia identificada. Preferentemente, una variante de lisozima, al mismo tiempo, mantiene por lo menos 40%, preferentemente, por lo menos 50%, 60%, 70% u 80%, o 90%, más preferentemente, por lo menos 95%, aun más preferentemente, por lo menos 100% de la actividad que la lisozima progenitora o una secuencia de referencia identificada exhibe a un pH óptimo. Preferentemente, la actividad es evaluada usando el ensayo de actividad de turbiedad de lisozima que se describe en la sección titulada "Materiales y métodos" .
Sensibilidad a la glicación: La glicación no enzimática es un proceso postraducción espontáneo donde los azúcares reductores se unen covalentemente a grupos amino libres en proteínas, principalmente, en residuos lisina (K) . La glicación puede afectar la actividad de la lisozima. De acuerdo con la presente invención, la sensibilidad de la lisozima a la glicación no enzimática puede reducirse por medio de cambios de aminoácidos especificados.
Las propiedades mejoradas además pueden abarcar propiedades térmicas, tales como la estabilidad a la miniesferización, la estabilidad al vapor de agua y un perfil más amplio de actividad térmica. Otras propiedades mejoradas pueden comprender la sensibilidad a la proteasa, o el patrón de glicosilación. Preferentemente, los me oramientos son evaluados en relación con las condiciones de aplicación deseadas .
Dominio catalítico: El término "dominio catalítico" significa la región de una enzima que contiene la maquinaria catalítica de la enzima.
ADNc: El término "ADNc" significa una molécula de ADN que puede prepararse mediante la transcripción inversa a partir de una molécula madura, empalmada, de ARNm, obtenida a partir de una célula eucariota o procariota. El ADNc carece de secuencias intrónicas que pueden presentarse en el correspondiente ADN genómico. La transcripción de ARN primaria inicial es un precursor para el ARNm que se procesa a través de una serie de etapas, que incluyen el empalme, antes de aparecer como ARNm empalmado maduro.
Secuencia codificadora: El término "secuencia codificadora" significa un polinucleótido, que especifica directamente la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Las limitaciones de la secuencia codificadora, en general, son determinadas por un marco de lectura abierta, que comienza con un codón de inicio tal como ATG, GTG, o TTG, y termina con un codón de detención, tal como TAA, TAG, o TGA. La secuencia codificadora puede ser un ADN genómico, ADNc, ADN sintético o una de sus combinaciones.
Secuencias de control: El término "secuencias de control" significa secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro de la presente invención. Cada secuencia de control puede ser nativa (es decir, del mismo gen) o extraña (es decir, de un gen diferente) con respecto al polinucleótido que codifica el polipéptido, o puede ser nativa o extraña con respecto a las demás. Las secuencias de control incluyen, sin limitación, una secuencia líder, una secuencia de poliadenilación, una secuencia de propéptido, un promotor, una secuencia de péptido de señal y un terminador de transcripción. Como mínimo, las secuencias de control incluyen un promotor, y señales de detención de transcripción y de traducción. Las secuencias de control pueden estar provistas de conectores, con el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región codificadora del polinucleótido que codifica un polipéptido.
Expresión: El término "expresión" incluye cualquier etapa involucrada en la producción de un polipéptido, que abarca, sin limitación, la transcripción, la modificación postranscripción, la traducción, la modificación postraducción y la secreción.
Vector de expresión: El término "vector de expresión" significa una molécula de ADN lineal o circular que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido y que está funcionalmente ligada a secuencias de control que proporcionan su expresión.
Fragmento: El término "fragmento" significa un polipéptido o un dominio catalítico que tiene uno o más (por ejemplo, varios) aminoácidos ausentes del término amino y/o carboxilo de un dominio o polipéptido maduro; donde el fragmento tiene actividad de lisozima. En un aspecto, un fragmento contiene por lo menos 198 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 59 a 256 de SEC. ID. NRO. : 2) , o por lo menos 230 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 32 a 261 de SEC. ID. NRO. : 2) . En otro aspecto, un fragmento contiene por lo menos 159 residuos de aminoácidos (por ejemplo, los aminoácidos 25 a 183 de SEC. ID. NRO. : 4) . En un aspecto adicional, un fragmento contiene por lo menos 150 residuos de aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos 24 a 173 de SEC. ID. NRO. : 6) .
Célula hospedera: El término "célula hospedera" significa cualquier tipo de célula que es sensible a la transformación, transfección, traducción o proceso similar, con una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. El término "célula hospedera" contempla cualquier descendiente de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación.
Aislado/a: El término "aislado/a" significa una sustancia en una forma o en un entorno que no se produce en la naturaleza. Ejemplos no limitativos de sustancias aisladas incluyen (1) cualquier sustancia no natural, (2) cualquier sustancia que incluye, sin limitación, cualquier enzima, variante, ácido nucleico, proteína, péptido o cofactor, que está por lo menos parcialmente desprovista de uno o más o de la totalidad de los constituyentes naturales con los cuales se asocia en la naturaleza; (3) cualquier sustancia modificada por la mano del hombre, en relación con la sustancia hallada en la naturaleza; o (4) cualquier sustancia modificada mediante el aumento de la cantidad de la sustancia, en relación con otros componentes con los cuales se asocia naturalmente (por ejemplo, múltiples copias de un gen que codifica la sustancia; uso de un promotor más fuerte que el promotor naturalmente asociado con el gen que codifica la sustancia) . Una sustancia aislada puede presentarse en una muestra de caldo de cultivo de fermentación.
Polipéptido maduro: El término "polipéptido maduro" significa un polipéptido en su forma final luego de la traducción y de cualquier modificación posterior a la traducción, tal como el procesamiento N-terminal, la truncación C-terminal, la glicosilación, fosforilación, etc. En un aspecto, el polipéptido maduro tiene los aminoácidos 20 a 264 de SEC . ID. NRO. 2, los aminoácidos 21 a 186 de SEC. ID. NRO.: 4, o los aminoácidos 20 a 176 de SEC. ID. NRO.: 6, sobre la base del programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), que predice que los aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO.: 2, los aminoácidos 1 a 20 de SEC. ID. NRO. : 4 y los aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO. 6 son péptidos de señal. Se sabe en la técnica que una célula hospedera puede producir una mezcla de dos o más diferentes polipéptidos maduros (es decir, con un aminoácido diferente C-terminal y/o N-terminal) expresados por el mismo polinucleótido .
Secuencia codificadora de polipéptido maduro: El término "secuencia codificadora de polipéptido maduro" significa un polinucleótido que codifica un polipéptido maduro que tiene actividad de lisozima. En un aspecto, la secuencia codificadora de polipéptido maduro es la secuencia unida de los nucleótidos 58 a 571 y los nucleótidos 639 a 859 de SEC. ID. NRO. : 1, la secuencia unida de nucleótidos 61 a 267 y los nucleótidos 335 a 625 de SEC. ID. NRO. : 3 o la secuencia unida de los nucleótidos 58 a 133, los nucleótidos 215 a 345 y los nucleótidos 516 a 779 de SEC. ID. NRO. 5, sobre la base del programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que predice que los nucleótidos 1 a 57 de SEC. ID. NRO . : 1, los nucleótidos 1 a 60 de SEC. ID. NRO. 3 y los nucleótidos 1 a 57 de SEC. ID. NRO.: 5 codifican péptidos de señal.
Construcción de ácido nucleico: El término "construcción de ácido nucleico" significa una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra simple, ya sea de hebra doble, que es aislada de un gen natural o que es modificada de manera de contener segmentos de ácidos nucleicos de un modo que no se presenta en la naturaleza, o que es sintética, que comprende una o más secuencias de control.
Funcionalmente ligada/o: El término "funcionalmente ligada/o" significa una configuración en la cual se coloca una secuencia de control en una posición apropiada en relación con la secuencia codificadora de un polinucleótido, de modo que la secuencia de control dirige la expresión de la secuencia codificadora.
Identidad de secuencia: La relación entre dos secuencias de aminoácidos o entre dos secuencias de nucleótidos se describe por medio del parámetro "identidad de secuencia" .
Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman- unsch (Needleman and unsch, 1970, J. Mol. Biol . 48: 443-453), implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet . 16: 276-277), preferentemente, la versión 5.0.0 o versión posterior. Los parámetros utilizados son: penalidad de abertura de espacio de 10; penalidad de extensión de espacio de 0.5; y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BL0SUM62) . La salida de Needle rotulada "identidad más larga" (obtenida usando la opción no breve) se usa como el porcentaje de identidad, y se calcula de la siguiente manera : (Residuos idénticos x 100) / (Longitud de alineación -Número total de espacios en la alineación) .
Para los propósitos de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de desoxirribonucleótido se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, supra) implementado en el programa Needle del paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferentemente, la versión 5.0.0 o versión posterior. Los parámetros utilizados son: penalidad de abertura de espacio de 10; penalidad de extensión de espacio de 0.5; y la matriz de sustitución EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4). La salida de Needle rotulada "identidad más larga" (obtenida usando la opción no breve) se usa como el porcentaje de identidad, y se calcula de la siguiente manera: (Desoxirribonucleótidos idénticos x 100)/ (longitud de alineación - Número total de espacios en la alineación) .
Condiciones de rigurosidad: Las diferentes condiciones de rigurosidad se definen de la siguiente manera.
El término "condiciones de rigurosidad muy baja" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 25% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS, a 45°C.
El término "condiciones de baja rigurosidad" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 25% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2 X SSC, 0.2% de SDS, a 50 °C.
El término "condiciones de rigurosidad media" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42 °C en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 35% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern hlotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS, a 55°C.
El término "condiciones de rigurosidad media-alta" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C en 5X SSPE, 0.3% SDS , 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 35% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern hlotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos usando 2X SSC, 0.2% de SDS, a 60°C.
El término "condiciones de alta rigurosidad" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C, en 5X SSPE, 0.3% de SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 50% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS, a 65°C.
El término "condiciones de rigurosidad muy alta" significa, para sondas de por lo menos 100 nucleótidos de longitud, la prehibridación e hibridación a 42°C, en 5X SSPE, 0.3% SDS, 200 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desmenuzado y desnaturalizado, y 50% de formamida, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting durante 12 a 24 horas. El material portador es finalmente lavado tres veces, cada vez, durante 15 minutos, usando 2X SSC, 0.2% de SDS a 70°C.
Subsecuencia: El término "subsecuencia" significa un polinucleótido que tiene uno o más (por ejemplo, varios) nucleótidos ausentes del extremo 5' y/o 3' de una secuencia codificadora de polipéptido maduro; donde la subsecuencia codifica un fragmento que tiene actividad de lisozima. En un aspecto, una subsecuencia contiene por lo menos 594 nucleótidos (por ejemplo, la secuencia unida de nucleótidos 175 a 571 y los nucleótidos 639 a 835 de SEC. ID. NRO. : 1) , o por lo menos 690 nucleótidos (por ejemplo, la secuencia unida de nucleótidos 94 a 571 y los nucleótidos 639 a 850 de SEC. ID. NRO. 1) . En otro aspecto, una subsecuencia contiene por lo menos 477 nucleótidos (por ejemplo, la secuencia unida de nucleótidos 73 a 267 y los nucleótidos 335 a 616 de SEC. ID. NRO. : 3) . En un aspecto adicional, una subsecuencia contiene por lo menos 450 nucleótidos (por ejemplo, la secuencia unida de nucleótidos 70 a 133, los nucleótidos 215 a 345 y los nucleótidos 516 a 770 de SEC. ID. NRO.: 5).
Polinucleótido sustancialmente puro: El término "polinucleótido sustancialmente puro" significa una preparación de polinucleótido libre de otros nucleótidos extraños o indeseados, y en una forma adecuada para el uso dentro de sistemas de producción de polipéptidos genéticamente diseñados. En consecuencia, un polinucleótido sustancialmente puro contiene, como máximo, 10%, como máximo, 8%, como máximo, 6%, como máximo, 5%, como máximo, 4%, como máximo, 3%, como máximo, 2%, como máximo, 1%, y como máximo, 0.5% en peso, de otro material de polinucleótido con el cual se encuentra nativa o recombinantemente asociado. Un polinucleótido sustancialmente puro, sin embargo, puede incluir regiones naturales 5' y 3' no traducidas, tales como promotores y terminadores . Preferentemente, el polinucleótido es por lo menos 90% puro, por ejemplo, por lo menos 92% puro, por lo menos 94% puro, por lo menos 95% puro, por lo menos 96% puro, por lo menos 97% puro, por lo menos 98% puro, por lo menos 99% puro, y por lo menos 99.5% puro, en peso. Los polinucleótidos de la presente invención, preferentemente, se presentan en una forma sustancialmente pura.
Polipéptido sustancialmente puro: El término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación que contiene, como máximo, 10%, como máximo, 8%, como máximo, 6%, como máximo, 5%, como máximo, 4%, como máximo, 3%, como máximo, 2%, como máximo, 1%, y, como máximo, 0.5% en peso, de otro material de polipéptido con el cual se encuentra nativa o recombinantemente asociado. Preferentemente, el polipéptido es por lo menos 92% puro, por ejemplo, por lo menos 94% puro, por lo menos 95% puro, por lo menos 96% puro, por lo menos 97% puro, por lo menos 98% puro, por lo menos 99%, por lo menos 99.5% puro, y 100% puro, en peso, del material de polipéptido total presente en la preparación. Los polipéptidos de la presente invención, preferentemente, se presentan en una forma sustancialmente pura. Esto puede lograrse, por ejemplo, por medio de la preparación del polipéptido por métodos de biotecnología bien conocidos, o por métodos de purificación clásicos .
Variante: El término "variante" significa un polipéptido que tiene actividad de lisozima que comprende una alteración, es decir, una sustitución, inserción, o supresión, de uno o más (varios) residuos de aminoácidos, en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. Una sustitución significa el reemplazo del aminoácido que ocupa una posición, con un aminoácido diferente; una supresión significa la eliminación del aminoácido que ocupa una posición; y una inserción significa la adición de 1, 2, o 3 aminoácidos adyacentes al aminoácido que ocupa la posición, y siguiendo inmediatamente a este. Una variante de acuerdo con la invención puede comprender de 1 a 5; de 1 a 10; de 1 a 15; de 1 a 20; de 1 a 52; de, es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 o 52 alteraciones.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Polipéptidos que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2 de por lo menos 80%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 de por lo menos 85%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2 de por lo menos 90%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 de por lo menos 91%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 de por lo menos 92%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 de por lo menos 93%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 de por lo menos 94%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 de por lo menos 95%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2 de por lo menos 96%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2 de por lo menos 97%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 de por lo menos 98%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 de por lo menos 99%, que tienen actividad de lisozima.
En un aspecto, los polipéptidos difieren por no más de 52 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o 51, del polipéptido maduro de SEC . ID . NRO . : 2.
Un polipéptido de la presente invención, preferentemente, comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. NRO. : 2 o una de sus variantes alélicas; o es uno de sus fragmentos, que tiene actividad de lisozima. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 20 a 264 de SEC. ID. NRO . : 2.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4 de por lo menos 85%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 90%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 91%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 92%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO..- 4 de por lo menos 93%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 94%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4 de por lo menos 95%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4 de por lo menos 96%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4 de por lo menos 97%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 98%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 de por lo menos 99%, que tienen actividad de lisozima.
En un aspecto, los polipéptidos difieren por no más de 27 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26, del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4.
Un polipéptido de la presente invención, preferentemente, comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. NRO.: 4 o una de sus variantes alélicas; o es uno de sus fragmentos, que tiene actividad de lisozima. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 21 a 186 de SEC. ID. NRO.: 4.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 6 de por lo menos 90%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 6 de por lo menos 91%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 6 de por lo menos 92%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 6 de por lo menos 93%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6 de por lo menos 94%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6 de por lo menos 95%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 6 de por lo menos 96%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia 5 con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6 de por lo menos 97%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6 de por lo menos 98%, que tienen actividad de lisozima.
En una modalidad, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados que tienen una identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 6 de por lo menos 99%, que tienen actividad de lisozima.
En un aspecto, los polipéptidos difieren por no más de 17 aminoácidos, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16, del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO . : 6.
Un polipéptido de la presente invención, preferentemente, comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEC. ID. NRO. : 6 o una de sus variantes alélicas; o es uno de sus fragmentos, que tiene actividad de lisozima. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6. En otro aspecto, el polipéptido comprende o consiste en los aminoácidos 20 a 176 de SEC. ID. NRO.: 6.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima codificado por un polinucleótido que híbrida, en condiciones de media rigurosidad, en condiciones de rigurosidad media-alta, en condiciones de alta rigurosidad, o en condiciones de muy alta rigurosidad, con la secuencia codificadora de polipéptido maduro de (i) SEC. ID. NRO . : 1, SEC. ID. NRO . : 3 o SEC. ID. NRO.: 5, (ii) su secuencia de ADNc, o (iii) su complemento de longitud completa de (i) o (ii) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York) .
El polinucleótido de SEC. ID. NRO. : 1, SEC. ID. NRO. : 3 o SEC. ID. NRO. : 5 o una de sus subsecuencias , al igual que el polipéptido de SEC. ID. NRO.: 2, SEC. ID. NRO.: 4 O SEC. ID. NRO. : 6 o uno de sus fragmentos, pueden usarse para diseñar sondas de ácido nucleico para la identificación y clonación de ADN codificador de polipéptidos que tienen actividad de lisozima de cepas de diferentes géneros o especies, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. En particular, las sondas pueden usarse para la hibridación con el ADN genómico o ADNc de una célula de interés, siguiendo procedimientos convencionales de Southern blotting, a fin de identificar y aislar allí el correspondiente gen. Las sondas pueden ser considerablemente más cortas que la secuencia entera, si bien deben ser de por lo menos 15, por ejemplo, por lo menos 25, por lo menos 35, o por lo menos 70 nucleotidos de longitud. Preferentemente, la sonda de ácido nucleico es de por lo menos 100 nucleotidos de longitud, por ejemplo, por lo menos 200 nucleótidos, por lo menos 300 nucleótidos, por lo menos 400 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos, por lo menos 600 nucleótidos, por lo menos 700 nucleótidos, por lo menos 800 nucleótidos, o por lo menos 900 nucleótidos de longitud. Pueden usarse tanto sondas de ADN como de ARN. Las sondas habitualmente son marcadas para la detección del correspondiente gen (por ejemplo, con 32P, 3H, 35S, biotina, o avidina) . Las sondas están contempladas por la presente invención.
Una genoteca de ADN genómico o ADNc preparada a partir de las otras cepas puede someterse a la detección sistemática para detectar ADN que híbrida con las sondas descriptas con anterioridad y que codifica un polipéptido que tiene actividad de lisozima. Puede separarse ADN genómico u otro ADN de las otras cepas, por medio de la electroforesis de gel de poliacrilamida o agarosa, u otras técnicas de separación. El ADN de las genotecas o el ADN separado puede transferirse a nitrocelulosa u otro material portador adecuado, e inmovilizarse sobre este. A fin de identificar un clon o ADN que híbrida con SEC . ID. NRO . : 1, SEC. ID. NRO . : 3 o SEC . ID. NRO. : 5 o una de sus subsecuencias , el material portador se usa en un Southern blot .
Para los propósitos de la presente invención, la hibridación indica que el polinucleótido híbrida a una sonda de ácido nucleico marcada correspondiente a (i) SEC. ID.
NRO. : 1, SEC. ID. NRO. : 3 o SEC. ID. NRO . : 5; (ii) la secuencia codificadora de polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 1, SEC. ID. NRO.: 3 o SEC. ID. NRO.: 5; (iii) su secuencia de ADNc ; (iv) su complemento de longitud completa; o (v) una de sus subsecuencias ; en condiciones de media a muy alta rigurosidad. Las moléculas a las cuales la sonda de ácido nucleico hibrida en estas condiciones pueden detectarse usando, por ejemplo, película de rayos X o cualquier otro medio de detección conocido en la técnica.
En un aspecto, la sonda de ácido nucleico comprende los nucleótidos 58 a 571, o los nucleótidos 639 a 859 de SEC. ID. NRO. : 1, los nucleótidos 61 a 267 o los nucleótidos 335 a 625 de SEC. ID. NRO. : 3, o los nucleótidos 58 a 133, los nucleótidos 215 a 345 o los nucleótidos 516 a 779 de SEC. ID. NRO.: 5. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es un polinucleótido que codifica el polipéptido de SEC. ID. NRO. : 2, SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO.: 6; SU polipéptido maduro; o uno de sus fragmentos. En otro aspecto, la sonda de ácido nucleico es SEC. ID. NRO.: 1, SEC. ID. NRO.: 3 o SEC. ID. NRO. : 5 o su secuencia de ADNc.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima codificado por un polinucleótido que tienen una identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 1 o su secuencia de ADNc de por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100%.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima codificado por un polinucleótido que tienen una identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO . : 3 o su secuencia de ADNc de por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o 100%.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima codificado por un polinucleótido que tienen una identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 5 o su secuencia de ADNc de por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100%.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2 que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una modalidad, el número de sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2 no es superior a 52, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 o 51.
En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 4 que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una modalidad, el número de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 4 no es superior a 27, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26.
En una modalidad adicional, la presente invención se refiere a variantes del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6 que comprenden una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones. En una modalidad, el número de sustituciones, supresiones y/o inserciones de aminoácidos introducidas en el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6 no es superior a 17, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16.
Los cambios de aminoácidos pueden ser de naturaleza menor, esto es, inserciones o sustituciones conservadoras de aminoácidos que no afectan de manera significativa el plegado o la actividad de la proteína; supresiones pequeñas, habitualmente, de 1-30 aminoácidos; extensiones pequeñas amino- o carboxilo-terminales , como un residuo metionina amino-terminal ; un péptido conector pequeño de hasta 20-25 residuos; o una extensión pequeña que facilita la purificación mediante el cambio de la carga neta u otra función, tal como un tracto de poli-histidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión.
Ejemplos de sustituciones conservadoras se encuentran dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina) , aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico) , aminoácidos polares (glutamina y asparagina) , aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina y valina) , aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina) . Las sustituciones de aminoácidos que no alteran generalmente la actividad específica son conocidas en la técnica, y son descriptas, por ejemplo, por H. Neurath y R. L. Hill, 1979, en: The Proteins, Academic Press, New York. Las sustituciones comunes son: Ala/Ser, Val/lie, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lie, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly. 4 Alternativamente, los cambios de aminoácidos son de tal naturaleza que las propiedades fisicoquímicas de los polipéptidos son alteradas. Por ejemplo, los cambios de aminoácidos pueden mejorar la estabilidad térmica del polipéptido, alterar la especificidad de sustrato, cambiar el pH óptimo y similares.
Los aminoácidos esenciales en un polipéptido pueden identificarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a sitio, o la mutagénesis de barrido de alanina (Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). En esta última técnica, se introducen mutaciones individuales de alanina en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son evaluadas a fin de establecer la actividad de lisozima de modo de identificar residuos de aminoácidos que son decisivos para la actividad de la molécula. Ver, además, la referencia de Hilton et al., 1996, J. Biol . Chem. 271: 4699-4708. El sitio activo de la enzima u otra interacción biológica también puede determinarse por medio del análisis físico de la estructura, según lo determinado por técnicas tales como la resonancia magnética nuclear, la cristalografía, la difracción de electrones o el marcado de fotoafinidad, en conjunto con la mutación de aminoácidos de sitios de contacto putativos. Ver, por ejemplo, las referencias de: de Vos et al., 1992, Science, 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol.
Biol.f 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett . , 309: 59-64. La identidad de los aminoácidos esenciales también puede ser inferida a partir de una alineación con un polipéptido relacionado.
Las sustituciones, supresiones o inserciones de aminoácidos individuales o múltiples pueden efectuarse y evaluarse usando métodos conocidos de mutagénesis, recombinación y mezcla (shuffling) , seguidos de un procedimiento de detección sistemática pertinente, por ejemplo, aquellos descritos por Reidhaar-Olson and Sauer, 1988, Science, 241: 53-57; Bowie and Sauer, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; o WO 95/22625. Otros métodos que pueden emplearse incluyen la PCR propensa al error, la exhibición de fagos (por ejemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente de los Estados Unidos de América Nro. 5.223.409; WO 92/06204) y la mutagénesis dirigida a región (Derbyshire et al., 1986, Gene, 46: 145; Ner et al., 1988, DNA 7: 127).
Los métodos de mutagénesis/mezcla {shuffling) pueden combinarse con métodos de detección sistemática automatizados, de alto rendimiento, a fin de detectar la actividad de polipéptidos clonados mutagenizados expresados por células hospederas. (Ness et al., 1999, iVature Biotechnology 17: 893-896). Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican polipéptidos activos pueden recuperarse de las células hospederas y pueden ser rápidamente secuenciadas usando métodos convencionales en la técnica. Estos métodos permiten la rápida determinación de la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido híbrido, en el cual una región de un polipéptido se fusiona en el N-terminal o en el C-terminal de una región de otro polipéptido.
El polipéptido puede ser un polipéptido de fusión o un polipéptido de fusión disociable en el cual se fusiona otro polipéptido en el N-terminal o en el C-terminal del polipéptido de la presente invención. Un polipéptido de fusión se produce mediante la fusión de un polinucleótido que codifica otro polipéptido, a un polinucleótido de la presente invención. Las técnicas para la producción de polipéptidos de fusión son conocidas en la técnica, e incluyen la ligación de las secuencias codificadoras que codifican los polipéptidos, de manera de encontrarse en marco, y que la expresión del polipéptido de fusión se encuentra bajo el control de los mismos promotores y terminadores . Los polipéptidos de fusión pueden construirse además usando tecnología de inteínas, en la cual los polipéptidos de fusión son creados de manera posterior a la traducción (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).
Un polipéptido de fusión, asimismo, puede comprender un sitio de disociación entre los dos polipéptidos . Con la secreción de la proteína de fusión, el sitio es disociado, de modo de liberar los dos polipéptidos. Ejemplos de sitios de disociación incluyen, sin limitación, los sitios revelados en las referencias de Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol . Biotechnol., 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol . 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl . Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; y Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Cárter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; y Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.
Fuentes de polipéptidos que tienen actividad de lisozima.
Un polipéptido que tiene actividad de lisozima de la presente invención puede obtenerse a partir de microorganismos de cualquier género. Para los propósitos de la presente invención, el término "obtenerse/obtenido de", de acuerdo con la presente solicitud, en relación con una fuente determinada, significará que el polipéptido codificado por un polinucleótido es producido por la fuente o por una cepa donde el polinucleótido de la fuente se ha insertado. En un aspecto, el polipéptido obtenido de una fuente determinada es secretado de manera extracelular .
El polipéptido puede ser un polipéptido fúngico. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un polipéptido fúngico filamentoso, tal como un polipéptido de Acremonium, Aspergillus, Chrysosporium, Fusarium, Humícola, Penicillium, Thielavia o Trichodermun .
En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grísea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededoniu , Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, o Trichoderma viride.
En otro aspecto, el polipéptido es un polipéptido de Aspergillus aculeatus o Acremonium alcalophilum, por ejemplo, un polipéptido obtenido de Aspergillus aculeatus CBS 172.66 o Acremonium alcalophilum CBS 114.92.
Se entenderá que para las especies mencionadas con anterioridad, la invención contempla tanto los estados perfectos como imperfectos, y otros equivalentes taxonómicos, por ejemplo, anamorfos, sin consideración de la denominación de la especie por la cual se conocen. Los expertos en la técnica reconocerán sin dificultad la identidad de los equivalentes apropiados .
Las cepas de estas especies son fácilmente accesibles para el público en una cantidad de colecciones de cultivos, tales como las American Type Culture Collection (ATCC) [Colección de Cultivos Tipificados Americanos] , Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) , Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS) y Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) .
El polipéptido puede identificarse y obtenerse de otras fuentes que incluyen microorganismos aislados de la naturaleza (por ejemplo, el suelo, abono orgánico, agua, etc.) o muestras de ADN obtenidas directamente de materiales naturales (por ejemplo, suelo, abono orgánico, agua, etc.) usando las sondas mencionadas anteriormente. Las técnicas para el aislamiento de microorganismos y ADN directamente de hábitats naturales son bien conocidos en la técnica. Un polinucleótido que codifica el polipéptido entonces puede obtenerse por medio de la detección sistemática similar de una genoteca de ADN genómico o ADNc de otro microorganismo o de una muestra mixta de ADN. Una vez que se ha detectado con las sondas un polinucleótido que codifica un polipéptido, el polinucleótido puede aislarse o clonarse mediante la utilización de técnicas conocidas por los expertos en la materia (ver, por ejemplo, la referencia de Sambrook et al., 1989, supra) .
Polinucleótidos .
La presente invención además se refiere a polinucleótidos aislados que codifican un polipéptido de la presente invención, como se describe en la solicitud.
Las técnicas empleadas para el aislamiento o la clonación de un polinucleótido son conocidas en el arte, e incluyen el aislamiento a partir de ADN genómico o ADNc, o una de sus combinaciones. La clonación de los polinucleótidos a partir de ADN genómico puede ser efectuada, por ejemplo, mediante la utilización de la bien conocida reacción en cadena de la polimerasa (PCR, según su sigla en inglés) o la detección sistemática de anticuerpos de genotecas de expresión para la detección de fragmentos de ADN clonados con rasgos estructurales compartidos. Ver, por ejemplo, la referencia de Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, New York. Pueden emplearse otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico, tales como la reacción de cadena de ligasa (LCR, según su sigla en inglés) , la transcripción activada por la ligación (LAT, según su sigla en inglés) y la amplificación sobre la base de polinucleótidos (NASBA, según su sigla en inglés) . Los polinucleótidos pueden clonarse a partir de una cepa de Aspergillus o Acremonium, o de un microorganismo relacionado, y en consecuencia, por ejemplo, puede ser una variante alélica o de especie de la región codificadora del polipéptido, del polinucleótido .
La modificación de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención puede ser necesaria para la síntesis de polipéptidos sustancialmente similares al polipéptido. El término "sustancialmente similar" al polipéptido se refiere a formas no naturales del polipéptido. Estos polipéptidos pueden diferir, en alguna forma de diseño, del polipéptido aislado de su fuente nativa, por ejemplo, variantes que difieren en la actividad específica, la termoestabilidad, el pH óptimo y factores similares. Las variantes pueden construirse sobre la base del polinucleótido presentado como la secuencia codificadora de polipéptido maduro de SEC. ID. NRO . : 1, SEC. ID. NRO. : 3 o SEC . ID. NRO . : 5 o sus secuencias de ADNc, por ejemplo, por ejemplo, una de sus subsecuencias, y/o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que no producen un cambio en la secuencia de aminoácidos del polipéptido, pero que corresponden al uso de codón del organismo hospedero propuesto para la producción de la enzima,- o mediante la introducción de sustituciones de nucleótidos que pueden dar origen a una secuencia diferente de aminoácido. Para una descripción general de sustitución de nucleótido ver, por ejemplo, la referencia de Ford et al., 1991, Protein Expresión and Purification 2: 95-107.
Construcciones de ácido nucleico.
La presente invención además se refiere a construcciones de ácido nucleico que comprenden un polinucleótido de la presente invención funcionalmente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la expresión de la secuencia codificadora en una célula hospedera adecuada, en condiciones compatibles con las secuencias de control.
Un polinucleótido puede ser manipulado de una diversidad de maneras, a fin de proporcionar la expresión del polipéptido. La manipulación del polinucleótido antes de su inserción en un vector puede ser conveniente o necesaria de acuerdo con el vector de expresión. Las técnicas para la modificación de los polinucleótidos utilizando métodos de ADN recombinado son bien conocidas en el arte.
La secuencia de control puede ser un promotor, un polinucleótido que es reconocido por una célula hospedera para la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención. El promotor contiene secuencias de control de transcripción que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier polinucleótido que muestra actividad de transcripción en la célula hospedera que incluye promotores mutantes, truncados e híbridos, y puede obtenerse de genes que codifican polipéptidos extracelulares o intracelulares , ya sea homólogos o heterólogos con respecto a la célula hospedera.
Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera bacteriana son los promotores obtenidos del gen de alfa-amilasa de Bacillus amyloliquefaciens (a yQ) , el gen de alfa-amilasa de Bacillus licheniformis (amyL) , el gen de penicilinasa de Bacillus licheniformis (penP) , el gen de amilasa maltogénica de Bacillus stearothermophilus {amyM) , el gen de levansucrasa de Bacillus subtilis (sacB) , los genes de Bacillus subtilis xylA y xylB, el gen de Bacillus thuringiensis cryIIIA (Agaisse and Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), el operón de E. coli lac, el promotor de E. coli trc (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), el gen de agarasa de Streptomyces coelicolor (dagA) y el gen de beta-lactamasa procariota (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci . USA 75: 3727-3731), al igual que el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Otros promotores se describen en "Useful proteins from recombinant bacteria" en la referencia de Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; y en la referencia de Sambrook et al., 1989, supra. Ejemplos promotores en tándem se revelan en la Solicitud Internacional WO 99/43835.
Ejemplos de promotores adecuados para la dirección de la transcripción de las construcciones de ácido nucleico de la presente invención en una célula hospedera fúngica filamentosa son promotores obtenidos de los genes para acetamidasa de Aspergillus nidulans, alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger, alfa-amilasa estable al ácido de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger o Aspergillus awamori (glaA) , TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, proteasa alcalina de Aspergillus oryzae, triosa fosfato isomerasa de Aspergillus oryzae, proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), amiloglucosidasa de Fusarium venenatu (WO 00/56900) , Daría de Fusarium venenatum (WO 00/56900) , Quinn de Fusarium venenatu (WO 00/56900) , lipasa de Rhizomucor miehei, proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidasa de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa I de Trichoderma reesei, celobiohidrolasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa I de Trichoderma reesei, endoglucanasa II de Trichoderma reesei, endoglucanasa III de Trichoderma reesei, endoglucanasa IV de Trichoderma reesei, endoglucanasa V de Trichoderma reesei, xilanasa I de Trichoderma reesei, xilanasa II de Trichoderma reesei, beta-xilosidasa de Trichoderma reesei, al igual que el promotor NA2-tpi (un promotor modificado de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el cual el líder no traducido se ha reemplazado por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus; ejemplos, sin limitación, incluyen promotores modificados de un gen de alfa-amilasa neutra de Aspergillus en el cual el líder no traducido se ha reemplazado por un líder no traducido de un gen de triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae) ; y sus promotores mutantes, truncados e híbridos.
En un hospedero de levadura, los promotores útiles se obtienen a partir de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , galactocinasa de Saccharomyces cerevisiae (GAL1) , alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triosa fosfato isomerasa de Saccharomyces cerevisiae (TPI) , metalotioneína de Saccharomyces cerevisiae (CUP1) y 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae. Otros promotores útiles para células hospederas de levaduras se describen en la referencia de Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.
La secuencia de control además puede ser un terminador de transcripción, que es reconocido por una célula hospedera para terminar la transcripción. El terminador está funcionalmente ligado al extremo 3' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Puede usarse cualquier terminador que sea funcional en la célula hospedera, en la presente invención .
Los terminadores preferidos para células hospederas bacterianas se obtienen de los genes para proteasa alcalina de Bacillus clausii (aprH) , alfa-amilasa de Bacillus licheniformis {amyL) y ARN ribosómico de Escherichia coli (rrnB) .
Los terminadores preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Los terminadores preferidos para células hospederas de levaduras se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C de Saccharomyces cerevisiae (CYC1) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae . Otros terminadores útiles para células hospederas de levaduras son descritos por Romanos et al., 1992, supra.
La secuencia de control además puede ser una región estabilizadora de ARNm corriente descendente de un promotor y corriente ascendente de la secuencia codificadora de un gen que aumenta la expresión del gen.
Ejemplos adecuados de regiones estabilizadoras de ARNm se obtienen de un gen de Bacillus thuringiensis cryIIIA (WO 94/25612) y de un gen de Bacillus subtilis SP82 (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).
La secuencia de control también puede ser un líder, una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula hospedera. El líder está funcionalmente ligado al extremo 5' del polinucleótido que codifica el polipéptido. Cualquier líder que sea funcional en la célula hospedera puede usarse.
Los líderes preferidos para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans .
Los líderes adecuados para células hospederas de levaduras se obtienen de los genes para enolasa de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1) , 3-fosfoglicerato cinasa de Saccharomyces cerevisiae, factor alfa de Saccharomyces cerevisiae y alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia funcionalmente ligada al extremo 3' del polinucleótido y, que cuando es transcripta, es reconocida por la célula hospedera como una señal para agregar residuos de poliadenosina a AR m transcripto. Puede usarse cualquier secuencia de poliadenilación que sea funcional en la célula hospedera.
Las secuencias de poliadenilación preferidas para células hospederas fúngicas filamentosas se obtienen de los genes para antranilato sintasa de Aspergillus nidulans, glucoamilasa de Aspergillus niger, alfa-glucosidasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae y proteasa de tipo tripsina de Fusarium oxysporum.
Las secuencias de poliadenilación útiles para células hospederas de levaduras son descriptas por Guo y Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol . 15: 5983-5990.
La secuencia de control además puede ser una región codificadora de péptido de señal que codifica un péptido de señal ligado al N-terminal de un polipéptido, y que dirige el polipéptido hacia la vía secretoria de la célula. El extremo 5' de la secuencia codificadora del polinucleótido puede contener, inherentemente, una secuencia codificadora de péptido de señal naturalmente ligada en marco de lectura de traducción, con el segmento de la secuencia codificadora que codifica el polipéptido. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificadora puede contener una secuencia codificadora de péptido de señal que es extraña con respecto a la secuencia codificadora. Una secuencia codificadora de péptido de señal extraña puede requerirse cuando la secuencia codificadora no contiene naturalmente una secuencia codificadora de péptido de señal. Alternativamente, una secuencia codificadora de péptido de señal extraña, simplemente, puede reemplazar la secuencia codificadora de péptido de señal natural a fin de mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, puede usarse cualquier secuencia codificadora de péptido de señal que dirija el polipéptido expresado hacia la vía secretoria de una célula hospedera.
Las secuencias codificadoras de péptido de señal eficaces para células hospederas bacterianas son las secuencias codificadoras de péptido de señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamasa de Bacillus licheniformis, alfa-amilasa de Bacillus stearothermophilus, proteasas neutras de Bacillus stearothermophilus (nprT, nprS, nprM) y Bacillus subtilis prsA. Otros péptidos de señal son descritos por Simonen y Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.
Las secuencias codificadoras de péptido de señal eficaces para células hospederas fúngicas filamentosas son las secuencias codificadoras de péptido de señal obtenidas de los genes para la amilasa neutra de Aspergillus niger, glucoamilasa de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, celulasa de Humicola insolens, endoglucanasa V de Humicola insolens, lipasa de Humicola lanuginosa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei.
Los péptidos de señal útiles para células hospederas de levaduras se obtienen de los genes para factor alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertasa de Saccharomyces cerevisiae . Otras secuencias codificadoras de péptido de señal útiles son descriptas por Romanos et al., 1992, supra.
La secuencia de control además puede ser una secuencia codificadora de propéptido que codifica un propéptido posicionado en el N-terminal de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como una proenzima o un propolipéptido (o un zimógeno, en algunos casos) . Un propolipéptido es generalmente inactivo, y puede ser convertido en un polipéptido activo por medio de la disociación catalítica o autocatalítica del propéptido, a partir del propolipéptido. La secuencia codificadora de propéptido puede obtenerse de los genes para la proteasa alcalina de Bacillus subtilis (aprE) , proteasa neutra de Bacillus subtilis (nprT) , lacasa de Myceliophthora thermophila (WO 95/33836) , proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei y factor alfa de Saccharomyces cerevisiae .
Cuando se presentan tanto secuencias de péptido de señal como de propéptido, la secuencia de propéptido se posiciona junto al N-terminal de un polipéptido, y la secuencia de péptido de señal se posiciona junto al N-terminal de la secuencia de propéptido.
Puede ser conveniente, además, agregar secuencias reguladoras que regulan la expresión del polipéptido en relación con el crecimiento de la célula hospedera. Ejemplos de sistemas reguladores son aquellos que causan el encendido o apagado de la expresión del gen, en respuesta a un estímulo químico o físico, que incluye la presencia de un compuesto regulador. Los sistemas reguladores en sistemas procariotos incluyen los sistemas lac, tac y trp. En levaduras, pueden usarse el sistema ADH2 o el sistema GAL1. En hongos filamentosos, pueden usarse el promotor de glucoamilasa de Aspergillus niger, el promotor de TAKA alfa-amilasa de Aspergillus oryzae y el promotor de glucoamilasa de Aspergillus oryzae. Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellas que permiten la amplificación de genes. En sistemas eucariotos, estas secuencias reguladoras incluyen el gen de dihidrofolato reductasa, que es amplificado en presencia de metotrexato, y los genes de metalotioneína, que son amplificados con metales pesados. En estos casos, el polinucleótido que codifica el polipéptido estará funcionalmente ligado con la secuencia reguladora.
Vectores de expresión.
La presente invención además se refiere a vectores de expresión recombinados que comprenden un polinucleótido de la presente invención, un promotor y señales de detención de transcripción y traducción. Las diversas secuencias de control y de nucleótidos pueden unirse para producir un vector de expresión recombinado, que puede comprender uno o más sitios de restricción convenientes a fin de permitir la inserción o sustitución del polinucleótido que codifica el polipéptido, en los sitios. Alternativamente, el polinucleótido puede ser expresado mediante la inserción del polinucleótido o de una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido, en un vector apropiado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificadora se ubica en el vector de manera tal que la secuencia codificadora es funcionalmente ligada con las secuencias de control apropiadas para la expresión.
El vector de expresión recombinado puede ser cualquier vector (por ejemplo, un plásmido o virus) que puede ser convenientemente sometido a procedimientos de ADN recombinado y que puede producir la expresión del polinucleótido. La elección del vector, habitualmente , dependerá de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual debe introducirse el vector. El vector puede ser un plásmido lineal o circular cerrado.
El vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación croraosómica, por ejemplo, un plásmido, un elemento extracromosómico, un minicromosoma, o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio para garantizar la autorreplicació . Alternativamente, el vector puede ser un vector que, cuando es introducido en la célula hospedera, es integrado en el genoma y replicado junto con los cromosomas dentro de los cuales se ha integrado. Asimismo, pueden usarse un solo vector o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos, que, en conjunto, contienen el ADN total por ser introducido en el genoma de la célula hospedera, o un transposón.
El vector, preferentemente, contiene uno o más marcadores de selección que permiten la fácil selección de células transformadas, transíectadas , transducidas , o similares. Un marcador de selección es un gen cuyo producto proporciona resistencia biocida o viral, resistencia a metales pesados, prototrofia a auxotrofos, y similares.
Ejemplos de marcadores de selección bacterianos son genes de Bacillus licheniformis o Bacillus subtilis dal , o marcadores que confieren resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a ampicilina, cloranfenicol , kanamicina, neomicina, espectinomicina o tetraciclina . Los marcadores adecuados para células hospederas de levaduras incluyen, sin limitación, ADE2 , HIS3, LEU2 , LYS2 , MET3 , TRP1 y URA3. Los marcadores de selección para el uso en una célula hospedera fúngica filamentosa incluyen, sin limitación, amdS (acetamidasa) , argB (ornitina carbamoiltransferasa) , jbar (fosfinotricina acetiltransferasa) , hph (higromicina fosfotransferasa) , niaD (nitrato reductasa) , pyrG (orotidina-5 '-fosfato decarboxilasa) , sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa) , al igual que sus equivalentes. Se prefieren para el uso en una célula de Aspergillus los genes de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae amdS y pyrG y un gen de Streptomyces hygroscopicus bar.
El vector, preferentemente, contiene uno o más elementos que permiten la integración del vector en el genoma de la célula hospedera, o la replicación autónoma del vector en la célula, independiente del genoma.
Para la integración en el genoma de la célula hospedera, el vector puede sustentarse en la secuencia del polinucleót do que codifica el polipéptido, o cualquier otro elemento del vector para la integración en el genoma mediante la recombinación homologa o no homologa. Alternativamente, el vector puede contener polinucleótidos adicionales para dirigir la integración por medio de la recombinación homologa en el genoma de la célula hospedera en una ubicación precisa en los cromosomas. Con el objetivo de aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos de integración deben contener una cantidad suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10 000 pares de bases, 400 a 10 000 pares de bases y 800 a 10 000 pares de bases, que tienen un alto grado de identidad de secuencia con respecto a la correspondiente secuencia blanco a fin de aumentar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos de integración pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con respecto a la secuencia blanco en el genoma de la célula hospedera. Además, los elementos de integración pueden ser polinucleótidos no codificadores o codificadores. Por otra parte, el vector puede ser integrado en el genoma de la célula hospedera por medio de la recombinación no homologa .
Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite al vector la replicación autónoma en la célula hospedera en cuestión. El origen de replicación puede ser cualquier replicador plásmido que media la replicación autónoma que funciona en una célula. El término "origen de replicación" o "replicador plásmido" significa un polinucleótido que permite la replicación de un plásmido o vector in vivo.
Ejemplos de orígenes de replicación bacterianos son los orígenes de replicación de los plásmidos pBR322, pUC19, pACYC177 y pACYC184, que permiten la replicación en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060 y pAMSl, que permiten la replicación en Bacillus .
Ejemplos de orígenes de replicación para el uso en una célula hospedera de levadura son el origen de replicación de 2 micrones, ARS1, ARS4 , la combinación de ARS1 y CEN3 y la combinación de ARS4 y CEN6.
Ejemplos de orígenes de replicación útiles en una célula fúngica filamentosa son AMA1 y ANSI (Gems et al., 1991, Gene, 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). El aislamiento del gen AMA1 y la construcción de plásmidos o vectores que comprenden el gen pueden llevarse a cabo de acuerdo con los métodos que se describen en la Solicitud Internacional WO 00/24883.
Puede insertarse más de una copia de un polinucleótido de la presente invención, en una célula hospedera, de manera de aumentar la producción de un polipéptido. Un aumento en el número de copias del polinucleótido puede obtenerse mediante la integración de por lo menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula hospedera, o mediante la inclusión de un gen marcador de selección amplificable , con el polinucleótido, donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador de selección, y por lo tanto, copias adicionales del polinucleótido, pueden seleccionarse mediante el cultivo de las células en presencia del agente de selección apropiado.
Los procedimientos utilizados para ligar los elementos descritos anteriormente para la construcción de los vectores de expresión recombinados de la presente invención son bien conocidos por el experto en la técnica (ver, por ejemplo, la referencia de Sambrook et al., 1989, supra) .
Péptido de señal .
La presente invención además se refiere a un polinucleótido aislado que codifica un péptido de señal que comprende o consiste en los aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO. : 2, los aminoácidos 1 a 20 de SEC. ID. NRO. : 4, o los aminoácidos 1 a 19 de SEC. ID. NRO.: 6. Los polinucleótidos además pueden comprender un gen que codifica una proteína, que está funcionalmente ligado al péptido de señal. La proteína, preferentemente, es extraña con respecto al péptido de señal. En un aspecto, el polinucleótido que codifica el péptido de señal tiene los nucleótidos 1 a 57 de SEC. ID. NRO. : 1, los nucleótidos 1 a 60 de SEC. ID. NRO. : 3 o los nucleótidos 1 a 57 de SEC. ID. NRO.: 5.
La presente invención además se refiere a construcciones de ácido nucleico, vectores de expresión y células hospederas recombinadas que comprenden los polinucleótidos.
La presente invención además se refiere a métodos para la producción de una proteína, que comprenden (a) el cultivo de una célula hospedera recombinada que comprende el polinucleótido; y (b) la recuperación de la proteína.
La proteína puede ser nativa o heteróloga con respecto a una célula hospedera. El término "proteína" en esta solicitud, no tiene la intención de hacer referencia a una longitud específica del producto codificado, y por lo tanto, abarca péptidos, oligopéptidos y polipéptidos. El término "proteína" además contempla dos o más polipéptidos combinados para formar el producto codificado. Las proteínas además incluyen polipéptidos híbridos y polipéptidos fusionados.
Preferentemente, la proteína es una hormona, enzima, un receptor o una de sus porciones, un anticuerpo o una de sus porciones, o un reportero. Por ejemplo, la proteína puede ser una hidrolasa, isomerasa, ligasa, liasa, oxidorreductasa o transferasa, por ejemplo, una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celobiohidrolasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa , desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, beta-glucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, xilanasa o beta-xilosidasa .
El gen puede obtenerse de cualquier fuente procariota, eucariota, u otra fuente.
Células hospederas.
La presente invención además se refiere a células hospederas recombinadas , que comprenden un polinucleótido de la presente invención funcionalmente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la producción de un polipéptido de la presente invención, una construcción o un vector que comprende un polinucleótido se introduce en una célula hospedera, de modo que la construcción o el vector se mantiene como un integrante cromosómico o como un vector extracromosómico de autorreplicación, como se describe con anterioridad. El término "célula hospedera" abarca cualquier descendiente de una célula progenitora que no es idéntica a la célula progenitora debido a mutaciones que se producen durante la replicación. La elección de una célula hospedera dependerá, en gran medida, del gen que codifica el polipéptido y su fuente.
La célula hospedera puede ser cualquier célula útil en la producción recombinada de un polipéptido de la presente invención, por ejemplo, un procarioto o un eucarioto.
La célula hospedera procariota puede ser cualquier bacteria Grampositiva o Gramnegativa . Las bacterias Grampositivas incluyen, sin limitación, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus y Streptomyces. Las bacterias Gramnegativas incluyen, sin limitación, Campylojbac er, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella y Ureaplasma .
La célula hospedera bacteriana puede ser cualquier célula de Bacillus, que incluye, sin limitación, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis y Bacillus thuringiensis .
La célula hospedera bacteriana además puede ser cualquier célula de Streptococcus que incluye, sin limitación, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis y Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus .
La célula hospedera bacteriana también puede ser cualquier célula de Streptomyces que incluye, sin limitación, células de Streptomyces achromogen.es, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus y Streptomyces lividans.
La introducción de ADN en una célula de Bacillus puede efectuarse por medio de la transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, la referencia de Chang and Cohén, 1979, Mol. Gen. Genet . 168: 111-115), la transformación de células competentes (ver, por ejemplo, la referencia de Young and Spizizen, 1961, J. Bacteriol . 81: 823-829, o aquella de Dubnau and Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol . 56: 209-221) , la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), o la conjugación (ver, por ejemplo, la referencia de Koehler and Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). La introducción de ADN en una célula de E. coli puede efectuarse por medio de la transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, la referencia de Hanahan, 1983, J. Mol. Biol., 166: 557-580) o la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). La introducción de ADN en una célula de Streptomyces puede efectuarse por medio de la transformación de protoplasto, la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Gong et al., 2004, Folia Microbiol . (Praha) 49: 399-405), la conjugación (ver, por ejemplo, la referencia de Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), o la transducción (ver, por ejemplo, la referencia de Burke et al., 2001, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 98: 6289-6294). La introducción de ADN en una célula de Pseudomonas puede efectuarse por medio de la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) o la conjugación (ver, por ejemplo, la referencia de Pinedo and Smets, 2005, Appl . Environ. Microbiol. 71: 51-57). La introducción de ADN en una célula de Streptococcus puede efectuarse por medio de la competencia natural (ver, por ejemplo, la referencia de Perry and Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), la transformación de protoplasto (ver, por ejemplo, la referencia de Catt and Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), la electroporación (ver, por ejemplo, la referencia de Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), o la conjugación (ver, por ejemplo, la referencia de Cle ell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436) . Sin embargo, puede usarse cualquier método conocido en la técnica, para la introducción de ADN en una célula hospedera .
La célula hospedera puede ser, asimismo, un eucarioto, tal como una célula de mamífero, insecto, planta, o fúngica.
La célula hospedera puede ser una célula fúngica. El término "hongos", tal como se usa en esta solicitud, incluye los filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridio ycota y Zygomyco a, al igual que los hongos Oomycota y todos los hongos mitospóricos (como lo definen Hawksworth efc al., en Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi, 8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) .
La célula hospedera fúngica puede ser una célula de levadura. El término "levadura", como se usa en esta 7 solicitud, incluye levaduras ascosporógenas (Endomicetales) , levaduras basidiosporógenas y levaduras que pertenecen a la familia de Fungí Imperfecti (hongos imperfectos) (Blastomicetos) . Debido a que la clasificación de levaduras puede cambiar en el futuro, para los propósitos de esta invención, las levaduras se definirán tal como se describe en Biology and Activities oí Yeast (Skinner, Passmore, and Davenport, editors, Soc. App. Bacteriol . Symposium Series No. 9, 1980) .
La célula hospedera de levadura puede ser una célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichía, Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Yarrowia, tal como una célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii , Saccharomyces kluyveri , Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis o Yarrowia lipolytica .
La célula hospedera fúngica puede ser una célula fúngica filamentosa. Los "hongos filamentosos" incluyen todas las formas filamentosas de las subdivisiones Eumycota y Oomycota (como se define en la referencia de Hawksworth et al., 1995, supra) . Los hongos filamentosos se caracterizan, generalmente, por una pared micelial compuesta por quitina, celulosa, glucano, quitosano, mañano y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetal es por elongación de las hifas, y el catabolismo de carbono es obligatoriamente aerobio. En contraste, el crecimiento vegetal por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae es mediante el brote de un talo unicelular, y el catabolismo de carbono puede ser fermentativo.
La célula hospedera fúngica filamentosa puede ser una célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filíbasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllu , Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, o Trichoderma .
Por ejemplo, la célula hospedera fúngica filamentosa puede ser una célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila , Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii , Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei o Trichoderma viridel .
Las células fúngicas pueden ser transformadas por un proceso que involucra la formación de protoplasto, transformación de los protoplastos y regeneración de la pared celular, de manera conocida per se. Los procedimientos adecuados para la transformación de células hospederas de Aspergillus y Trichoderma se describen en la Patente Europea EP 238023, y en las referencias de Yelton et al., 1984, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 81: 1470-1474, y Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Los métodos adecuados para la transformación de especies de Fusarium son descriptas por Malardier et al., 1989, Gene, 78: 147-156, y en el documento WO 96/00787. La levadura puede ser transformada empleando los procedimientos descritos por Becker y Guarente, en la referencia de Abelson, J. N. y Simón, M. I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volumen 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; la referencia de Ito et al., 1983, J. Bacteriol . 153: 163; y la referencia de Hinnen et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 1920.
Métodos de producción.
La presente invención además se refiere a métodos para la producción de un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) el cultivo de una célula, que, en su forma de tipo silvestre, produce el polipéptido, en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido. En un aspecto preferido, la célula es una célula de Aspergillus o Acremonium. En un aspecto más preferido, la célula es una célula de Aspergillus aculeatus o Acremonium alcalophilum. En un aspecto de mayor preferencia, la célula es una célula de Aspergillus aculeatus CBS172.66 o Acremonium alcalophilum CBS114.92.
La presente invención además se refiere a métodos para la producción de un polipéptido de la presente invención, que comprenden (a) el cultivo de una célula hospedera recombinada de la presente invención en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido .
Las células hospederas se cultivan en un medio nutriente adecuado para la producción del polipéptido, usando métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la célula puede cultivarse por medio del cultivo en matraces de agitación, o la fermentación de pequeña escala o de gran escala (que incluye las fermentaciones continua, en lotes, de alimentación de lotes, o de estado sólido) en termentadores de laboratorio o industriales, realizada en un medio adecuado y en condiciones que permiten la expresión y/o el aislamiento del polipéptido. El cultivo tiene lugar en un medio nutriente adecuado que comprende fuentes de carbono y nitrógeno y sales inorgánicas, usando procedimientos conocidos en la técnica. Los medios adecuados pueden obtenerse de proveedores comerciales, o pueden prepararse de acuerdo con composiciones publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection) . Si el polipéptido es secretado en el medio nutriente, el polipéptido puede ser recuperado directamente del medio. Si el polipéptido no es secretado, puede ser recuperado de los lisados celulares.
El polipéptido puede detectarse usando métodos conocidos en la técnica, que son específicos para los polipéptidos , por ejemplo, el ensayo de mancha de lisozima que se describe a continuación. Estos métodos de detección incluyen, sin limitación, el uso de anticuerpos específicos, la formación de un producto enzimático, o la desaparición de un sustrato enzimático. Por ejemplo, puede utilizarse un ensayo enzimático para determinar la actividad del polipéptido.
El polipéptido puede recuperarse empleando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, el polipéptido puede recuperarse del medio nutriente por medio de procedimientos convencionales que incluyen, sin limitación, la recolección, centrifugación, filtración, extracción, secado por pulverización, evaporación o precipitación.
El polipéptido puede purificarse mediante una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, que incluyen, sin limitación, la cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, hidrófoba, de cromatofocalización y de exclusión por tamaño) , los procedimientos de electroforesis (por ejemplo, la focalización isoeléctrica preparatoria) , la solubilidad diferencial (por ejemplo, la precipitación de sulfato de amonio) , SDS-PAGE [electroforesis de gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, según su sigla en inglés] , o la extracción (ver, por ejemplo, la referencia Protein Purification, Janson and Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989) , a fin de obtener polipéptidos sustancialmente puros.
En un aspecto alternativo, el polipéptido no es recuperado; en cambio, se usa una célula hospedera de la presente invención que expresa el polipéptido, como fuente del polipéptido.
Plantas .
La presente invención además se refiere a plantas aisladas, por ejemplo, una planta transgénica, parte de planta o célula de planta, que comprende un polinucleótido de la presente invención, de manera de expresar y producir un polipéptido o dominio en cantidades recuperables. El polipéptido o dominio puede ser recuperado de la planta o parte de planta. Alternativamente, la planta o parte de planta que contiene el polipéptido o dominio puede usarse como tal, para mejorar la calidad de un alimento o de una alimentación, por ejemplo, para mejorar el valor nutricional, la aceptabilidad y las propiedades reológicas, o para destruir un factor antinutritivo.
La planta transgénica puede ser dicotiledónea (una dicot.) o monocotiledónea (una monocot . ) . Ejemplos de plantas monocot. son pasturas, tales como prados (césped, Poa) , pastura de forraje, tal como Festuca, Lolium, pasturas templadas, tales como Agrostis, y cereales, por ejemplo, trigo, avena, centeno, cebada, arroz, sorgo y maíz (choclo) .
Ejemplos de plantas dicot. son tabaco, legumbres tales como lupinos, papa, remolacha azucarera, arvejas, habas y soja, y plantas cruciferas (familia de las Brasicáceas) , tales como coliflor, semilla de colza, y el organismo modelo estrechamente relacionado Arabidopsis thaliana .
Ejemplos de partes de plantas son tallo, callo, hojas, raíces, frutos, semillas y tubérculos, al igual que los tejidos individuales que comprenden estas partes, por ejemplo, epidermis, mesófilo, parénquima, tejidos vasculares, meristemas. Los compartimientos celulares de plantas específicos, tales como cloroplastos , apoplastos, mitocondrias , vacuolas, peroxisomas y citoplasma, también se consideran partes de plantas. Asimismo, cualquier célula de planta, cualquiera sea el origen de tejido, se considera una parte de planta. Además, las partes de plantas tales como células y tejidos específicos aislados para facilitar la utilización de la invención, también se consideran partes de plantas, por ejemplo, embriones, endospermos, aleuronas y coberturas de semillas.
Se incluyen además dentro del alcance de la presente invención la descendencia de las plantas, partes de plantas y células de plantas .
La célula de planta o planta transgénica que expresa el polipéptido o dominio puede construirse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica. En síntesis, la planta o célula de planta se construye mediante la incorporación de una o más construcciones de expresión que codifican el polipéptido o dominio, en el genoma hospedero de la planta o genoma del cloroplasto, y la propagación de la planta o célula de planta resultante modificada en una célula de planta o planta transgénica.
La construcción de expresión es, convenientemente, una construcción de ácido nucleico que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido o dominio funcionalmente ligado con secuencias reguladoras apropiadas necesarias para la expresión del polinucleótido en la planta o parte de planta de elección. Además, la construcción de expresión puede comprender un marcador de selección útil para la identificación de células de plantas en las cuales se ha integrado la construcción de expresión, y secuencias de ADN necesarias para la introducción de la construcción en la planta en cuestión (estas últimas dependen del método de introducción de ADN por utilizar) .
La elección de secuencias reguladoras, tales como secuencias de promotor y terminador, y opcionalmente , secuencias de señal o tránsito, es determinada, por ejemplo, sobre la base de cuándo, dónde y cómo se desea expresar el polipéptido o dominio. Por ejemplo, la expresión del gen que codifica un polipéptido o dominio puede ser constitutiva o inducible, o puede ser específica de tejido, etapa o desarrollo, y el producto génico puede ser dirigido a una parte de planta o un tejido específico tal como semillas u hojas. Las secuencias reguladoras son descriptas, por ejemplo, por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
Para la expresión constitutiva, puede usarse el promotor 35S-CaMV, el promotor ubiquitina 1 de maíz, o el promotor actina 1 de arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol . 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Los promotores específicos de órganos pueden ser, por ejemplo, un promotor de tejidos de almacenamiento enterrado, tales como semillas, tubérculos de papa y frutos (Edwards and Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet . 24: 275-303), o de tejidos enterrados metabólicos, tales como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878); un promotor específico de semilla, tal como el promotor de glutelina, prolamina, globulina, o albúmina del arroz (Wu efc al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889) , un promotor de Vicia faba de la legúmina B4 y el gen de proteína de semilla desconocido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711); un promotor de una proteína de cuerpo oleaginoso de semilla (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), el promotor de proteína de almacenamiento napA de Brassica napus, o cualquier otro promotor específico de semilla conocido en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Solicitud Internacional WO 91/14772. Además, el promotor puede ser un promotor específico de hoja, tal como el promotor rbcs de arroz o tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000) , el promotor del gen de adenina metiltransferasa del virus de Chlorella (Mitra y Higgins, 1994, Plant Mol. 1 Biol . 26: 85-93), el promotor del gen aldP de arroz (Kagaya efc al., 1995, Mol. Gen. Genet . 248: 668-674), o un promotor inducible por herida tal como el promotor pin2 de la papa (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). Asimismo, el promotor puede ser inducido por tratamientos abióticos tales como la temperatura, la sequía, o alteraciones en la salinidad, o inducido por sustancias exógenamente aplicadas que activan el promotor, por ejemplo, etanol, estrógenos, hormonas de plantas, como etileno, ácido abscísico y ácido giberélico, y metales pesados.
Además, puede usarse un elemento mejorador de promotor a fin de lograr la mayor expresión de un polipéptido o dominio en la planta. Por ejemplo, el elemento mejorador de promotor puede ser un intrón, que se coloca entre el promotor y el polinucleótido que codifica un polipéptido o dominio. A modo de ejemplo, Xu et al., 1993, supra, revelan el uso del primer intrón del gen de actina 1 del arroz para mejorar la expresión.
El gen marcador de selección y cualquier otra parte de la construcción de expresión pueden seleccionarse de aquellas que pueden obtenerse en la técnica.
La construcción de ácido nucleico se incorpora en el genoma de la planta de acuerdo con técnicas convencionales conocidas en la materia, que incluyen la transformación mediada por Agrobacterium, la transformación mediada por virus, la microinyección, el bombardeo de partículas, la transformación biolística y la electroporación (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/'Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
La transferencia de genes mediada por Agrobacterium turnefaciens es un método para la generación de dicotiledóneas transgénicas (para una reseña, ver la referencia de Hooykas and Schilperoort , 1992, Plant Mol. Biol . 19: 15-38) y para la transformación de monocotiledóneas, si bien, para estas plantas, pueden usarse otros métodos de transformación. Un método para la generación de monocotiledóneas transgénicas es el bombardeo de partículas (partículas microscópicas de oro o tungsteno revestidas con el ADN de transformación) de callos embrionarios o embriones en desarrollo (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol . 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Un método alternativo para la transformación de monocotiledóneas se basa en la transformación de protoplasto, como lo describen Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Otros métodos de transformación incluyen aquellos descritos en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros. 6.395.966 y 7.151.204 (ambas, incorporadas a modo de referencia en su totalidad) .
Luego de la transformación, los transformantes que tienen incorporada la construcción de expresión se seleccionan y se regeneran en plantas enteras, de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Con frecuencia, el procedimiento de transformación es diseñado para la eliminación selectiva de genes de selección, ya sea durante la regeneración, ya sea en las siguientes generaciones usando, por ejemplo, la cotransformación con dos construcciones separadas de ADN-T o la escisión específica de sitio del gen de selección por una recombinasa específica.
Además de la transformación directa de un genotipo de planta particular con una construcción de la presente invención, las plantas transgénicas pueden prepararse mediante el cruce de una planta que tiene la construcción, con una segunda planta que carece de la construcción. Por ejemplo, una construcción que codifica un polipéptido o dominio puede introducirse en una variedad de planta particular mediante el cruce, sin la necesidad de la transformación directa de una planta de la variedad determinada. Por lo tanto, la presente invención contempla no solo una planta directamente regenerada a partir de células que se han transformado de acuerdo con la presente invención, sino, además, la descendencia de las plantas. De acuerdo con la presente invención, la descendencia puede referirse a la descendencia de cualquier generación de una planta progenitora preparada de acuerdo con la presente invención. La descendencia puede incluir una construcción de ADN preparada de acuerdo con la presente invención. El cruce logra la introducción de un transgén en una línea de planta mediante la polinización cruzada de una línea inicial con una línea de planta donante. Ejemplos, sin limitación, de las etapas se describen en la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 7.151.204.
Las plantas pueden ser generadas a través de un proceso de conversión por retrocruce. Por ejemplo, las plantas incluyen plantas denominadas de tipo genotipo convertido por retrocruce, de líneas, endogámicas o híbridas.
Pueden usarse marcadores genéticos para asistir en la introgresión de uno o más transgenes de la invención, desde un fondo genético hacia otro. La selección asistida por marcadores ofrece ventajas en relación con el cultivo convencional, ya que puede usarse para evitar errores causados por variaciones fenotípicas. Además, los marcadores genéticos pueden proporcionar información relacionada con el grado relativo de plasma germinal de élite en la descendencia individual de un cruce particular. Por ejemplo, cuando una planta con un rasgo deseado, que, de otro modo, tiene un fondo genético no agroquímicamente deseado, se cruza con una progenitora de élite, los marcadores genéticos pueden usarse para seleccionar la descendencia que no solo posee el rasgo de interés, sino, además, que tiene una proporción relativamente grande del plasma germinal deseado. De esta manera, la cantidad de generaciones necesarias para la introgresión de uno o más rasgos en un fondo genético particular se minimiza.
La presente invención además se refiere a métodos para la producción de un polipéptido o dominio de la presente invención, que comprenden (a) el cultivo de una planta transgénica o una célula de planta que comprende un polinucleotido que codifica el polipéptido o dominio, en condiciones que conducen a la producción del polipéptido o dominio; y (b) la recuperación del polipéptido o dominio.
Usos .
A continuación, se proporcionan ejemplos de usos preferidos de la lisozima o de sus composiciones de la presente invención. La dosificación de la lisozima y otras condiciones en las cuales se usa la lisozima pueden determinarse sobre la base de métodos conocidos en la técnica .
Los polipéptidos de la invención habitualmente son útiles en cualquier sitio sometido a la contaminación por bacterias, hongos, levaduras o algas. Habitualmente, los loci (lugares) son en sistemas acuosos tales como sistemas de agua refrigerante, agua de enjuague de lavado de ropa, sistemas de aceites tales como aceites de corte, lubricantes, yacimientos petrolíferos y similares, donde se desea matar los microorganismos o por lo menos controlar su crecimiento. Sin embargo, la presente invención puede usarse además en todas las aplicaciones para las cuales son útiles las lisozimas conocidas, tales como la protección de madera, látex, adhesivos, cola, papel, cartón, productos textiles, cuero, plásticos, calafateo y alimentaciones.
Una lisozima, o una composición de lisozima, de la presente invención puede usarse en varias aplicaciones para degradar un material que comprende un peptidoglucano o una quitodextrina , mediante el tratamiento del material con la lisozima o su composición (ver, por ejemplo, las referencias de Proctor and Cunningham, (1988) Critical Reviews in Food Science and Nutrition 26: 359-395; Carini et al. (1985), Microbiol . Alimen. Nutr. 3: 299-320; Hughey and Johnson (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53:2165-2170; Cunningham et al. (1991) World's Poultry Science Journal 47:141-163).
Usos de las lisozimas de la invención para limpieza y/o detergentes .
Una lisozima de la presente invención, preferentemente, se incorpora o se usa con composiciones detergentes como se describe a continuación. Cuando el lavado se realiza repetidamente a temperaturas inferiores a 60°C, hay mayor riesgo de malos olores en la máquina de lavado (lavarropas, al igual que lavavaj illas) y en los productos textiles o artículos lavados en la máquina. Estos malos olores, probablemente, son causados por microorganismos microbianos tales como bacterias, hongos, algas u otros organismos unicelulares que crecen en la máquina de lavado.
Además, la invención se refiere a un proceso para el lavado de textiles, que comprende el tratamiento de los textiles con una solución de lavado que contiene una composición detergente y una lisozima o una composición de lisozima de la invención. El tratamiento de lavado de textiles, por ejemplo, puede llevarse a cabo en un proceso de lavado a máquina, o en un proceso de lavado manual. La solución de lavado, por ejemplo, puede ser una solución de lavado acuosa que contiene la composición detergente y que tiene un pH entre 3 y 12.
Los textiles sometidos a los métodos de la presente invención pueden ser prendas para lavado convencional, por ejemplo, ropa de lavado hogareño. Preferentemente, la mayor parte de la ropa de lavado comprende prendas de vestir y textiles, que incluyen productos tejidos, tramados, mezclilla, hilados y toallas, hechos de algodón, combinaciones de algodón o productos celulósicos naturales o fabricados por el hombre (por ejemplo, que se originan de la pulpa de la madera) o sus combinaciones. Ejemplos de combinaciones son combinaciones de algodón o rayón/viscosa con uno o más materiales compañeros tales como lana, fibras sintéticas (por ejemplo, fibras de poliamida, fibras acrílicas, fibras de poliéster, fibras de alcohol polivinílico, fibras de cloruro de polivinilo, fibras de poliuretano, fibras de poliurea, fibras de aramida) y fibras que contienen celulosa (por ejemplo, rayón/viscosa, ramio, lino, yute, fibras de acetato de celulosa, Lyocell) .
La presente invención proporciona un método para la reducción de la contaminación microbiana sobre una superficie, tal como una prenda textil o una superficie dura tal como metal, plástico o partes de caucho en una máquina de lavado o lavavaj illas, azulejos de baños, pisos, mesas, drenajes, sumideros y lavatorios, mediante el tratamiento de la superficie microbianamente contaminada con una lisozima o composición de lisozima de la presente invención. Se espera además que el tratamiento reduzca los malos olores sobre los productos textiles y las superficies duras que contienen la contaminación microbiana.
La reducción de la contaminación microbiana puede ser evaluada de varias maneras, por ejemplo, por un panel que evalúa si el olor ha disminuido; alternativamente, puede tomarse una muestra de la superficie, y cultivarse a fin de evaluar si el recuento microbiano se ha reducido como consecuencia del tratamiento, en comparación con un tratamiento sin lisozima.
Usos de las lisozimas de la invención en alimentaciones animales .
Una lisozima de la invención puede usarse también en alimentaciones animales. En una modalidad, la presente invención provee un método para la preparación de una composición de alimentación animal que comprende la adición de una lisozima de la presente invención, a uno o más ingredientes de alimentación animal.
Una lisozima de la presente invención, por ejemplo, puede utilizarse para estabilizar la microflora saludable de los animales, en particular, en ganado, tal como, sin limitación, ovejas, cabras, vacas (incluyendo, sin limitación, ganado de carne de res, vacas y terneros), ciervos, cerdos o chanchos (que incluyen, sin limitación, cochinos, cerdos de crecimiento y puercas) , aves (que incluyen, sin limitación, gansos, pavos, patos y pollos, tales como pollos parrilleros, polluelos y gallinas) ; caballos, alces y conejos, y además, peces (que incluyen, sin limitación, salmón, trucha, tilapia, pez gato y carpas; y crustáceos (que incluyen, sin limitación, camarones y langostinos)). En una modalidad preferida, la lisozima reemplaza antibióticos en dietas animales. En una modalidad adicional, se usa una lisozima de la presente invención como un aditivo de alimentación, donde puede proporcionar un efecto positivo sobre el balance microbiano del aparato digestivo del pollo, y de este modo, puede mejorar el comportamiento animal .
Una lisozima de la presente invención además puede usarse en alimentaciones animales como enzima mejoradora de la alimentación, que mejora la digeribilidad de la alimentación a fin de aumentar la eficiencia de su utilización de acuerdo con las Solicitudes Internacionales WO 00/21381 y WO 04/026334.
En una modalidad adicional, una lisozima de la presente invención puede usarse como un aditivo de alimentación, donde puede proporcionar un efecto positivo sobre el aparato digestivo de los animales y, de este modo, mejorar el comportamiento animal de acuerdo con el aumento de peso, la relación de conversión de alimentación (FCR, por sus siglas en inglés), o la mejorada salud animal, tal como menor tasa de mortalidad. La FCR se calcula como la ingesta de alimentación en g/animal en relación con el aumento de peso en g/animal .
Usos de las lisozimas de la invención como agentes antimicrobianos .
Una lisozima de la presente invención puede utilizarse como agente antimicrobiano. Un aspecto de la presente invención comprende un método para la reducción de la contaminación microbiana, que comprende el tratamiento de una superficie con contaminación microbiana, con una lisozima de la presente invención.
A fin de evaluar si una lisozima de la presente invención es capaz de actuar como un agente antimicrobiano, puede evaluarse en un ensayo de turbiedad. En este ensayo, se evalúa si la lisozima es capaz de degradar células microbianas, por ejemplo, un sustrato desecado de células de Exiguobacteriu undae (aisladas de una media con olor) o células de Micrococcus luteus disueltas en regulador o detergente, y de ese modo, reducir la densidad óptica (DO) a, por ejemplo, 540 nm, cuando se compara con una suspensión microbiana tratada solo con regulador.
Usos de las lisozimas de la invención para la desinfección o como un desinfectante.
Una lisozima de la presente invención puede ser de utilidad como un desinfectante, o puede usarse para la desinfección, por ejemplo, para el tratamiento de infecciones en los ojos o la boca, o para la limpieza y desinfección de lentes de contacto, y para la prevención o eliminación de biopelícula sobre una superficie, de acuerdo con la Patente de los Estados Unidos de América Nro. 6.777.223.
Una lisozima de la presente invención, además, puede usarse en el cuidado oral. Por ejemplo, la lisozima puede utilizarse sola o en combinación con otras enzimas, o incluso, con péptidos antimicrobianos, en pasta dental y otros productos para el cuidado oral. Los polipéptidos pueden introducirse en la cavidad oral o aplicarse a un artículo que debe ser introducido en la cavidad oral. Ver, por ejemplo, la Solicitud Internacional WO 08/124764.
En general, se contempla que los polipéptidos de la presente invención son útiles para la limpieza, desinfección o inhibición del crecimiento microbiano sobre cualquier superficie. Ejemplos de superficies que pueden ponerse en contacto, convenientemente, con los polipéptidos de la invención son superficies de equipamiento de procesamiento utilizado, por ejemplo, en plantas de procesamiento de lácteos, productos químicos o farmacéuticos, sistemas de saneamiento de agua, plantas de procesamiento de aceites, plantas de procesamiento de pulpa de papel, plantas de tratamiento de agua y torres de enfriamiento. Los polipéptidos de la invención deben ser usados en una cantidad eficaz para la limpieza, desinfección o inhibición del crecimiento microbiano sobre la superficie en cuestión.
Los polipéptidos de la invención, adicionalmente , pueden usarse para la limpieza de superficies y utensilios de cocina en plantas de procesamiento de alimentos, y en cualquier área en la cual se prepara o sirve la comida, tal como hospitales, geriátricos y restaurantes.
Usos de las lisozimas de la invención en aplicaciones de alimentos .
Una lisozima de la presente invención puede usarse, asimismo, para la inhibición selectiva del crecimiento descontrolado de Clostridium tyrobutyricum durante la maduración de quesos, en particular, aquellos elaborados a partir de cuajadas prensadas y cocidas, por ejemplo, queso suizo, parmesano, Edam, Gouda, Cheddar y muchos otros.
Una lisozima de la presente invención se puede utilizar también en la elaboración de vinos, a fin de controlar o inhibir la contaminación microbiana.
Usos de las lisozimas de la invención como tratamientos. Una lisozima de la presente invención puede usarse además en el tratamiento tópico de lesiones distróficas e inflamatorias de la piel y los tejidos blandos. Ver, por ejemplo, la referencia de Palmieri y Boraldi (1977) , Arch. Sci. Med. (Torino) 134: 481-485.
Una lisozima de la presente invención puede utilizarse en el cuidado de la piel. Por ejemplo, el polipéptido se aplica a la piel de un paciente que sufre de una infección cutánea, tal como acné. La lisozima puede usarse también en un vendaje para heridas, que se aplica a la piel herida, por ejemplo, a fin de auxiliar en la curación de la herida. Ver, por ejemplo, la referencia de la Solicitud de los Estados Unidos Nro. 20080254079.
Una lisozima de la presente invención, asimismo, puede usarse en lápices labiales, bálsamos labiales, geles labiales, o brillos labiales. Por ejemplo, los productos pueden usarse para el tratamiento de una infección localizada labial, por ejemplo, una llaga. Ver, por ejemplo, la referencia de la Solicitud de los Estados Unidos Nro. 20080254079.
Una lisozima de la presente invención también puede usarse en el tratamiento de enfermedades broncopulmonares.
Una lisozima de la presente invención puede usarse, asimismo, como enzima digestiva o auxiliar digestivo. Una lisozima de la presente invención puede usarse para mejorar el uso de bacterias muertas o vivas como fuente de alimento, por ejemplo, mediante el control de contaminantes microbianos indeseados .
Una lisozima de la presente invención puede utilizarse, además, como agente terapéutico en un humano u otro animal, por ejemplo, para el control o la inhibición del crecimiento bacteriano excesivo en los intestinos de un humano que sufre una enfermedad, por ejemplo, enfermedad pancreática, o en un paciente inmunocomprometido .
Usos de las lisozimas de la invención para la extracción de ADN genómico bacteriano.
Una lisozima de la presente invención puede usarse además a fin de auxiliar en la extracción de ADN genómico bacteriano. A fin de poder secuenciar ADN bacteriano, la pared celular bacteriana debe descomponerse, de manera de aislar el ADN que se halla en su interior. Puede resultar difícil descomponer la pared celular, especialmente la de bacterias grampositivas .
La lisozima de clara de huevo de gallina es la enzima convencional utilizada para el aislamiento de ADN de bacterias Grampositivas , y funciona mediante la hidrolización de las cadenas de peptidoglucano presentes en la pared de la célula, de modo de auxiliar en la degradación de las paredes celulares. Sin embargo, algunas paredes celulares Grampositivas no son degradadas por las lisozimas de clara de huevo de gallina. Por ejemplo, se recomienda que las células de, por ejemplo, Staphylococcus aureus sean lisadas con lisostafina, como lo describen Pitcher y Saunders (1989) , App. Environ. Microbiol . 56 (3): 782-787. No obstante, estos métodos no funcionan para todos los tipos de bacterias Grampositivas, y por lo tanto, las nuevas lisozimas ofrecen potencialmente el acceso a nuevos genomas que no pueden ser aislados con soluciones comerciales de lisozimas.
Otros usos de las lisozimas de la invención.
Una lisozima de la presente invención además se puede usar en el control del crecimiento microbiano en un proceso de fermentación, tal como en la elaboración de etanol u otros productos a partir de biomasa. Ver, por ejemplo, la referencia de la Solicitud Internacional WO 2007/109750. Por consiguiente, la lisozima puede utilizarse, por ejemplo, en un proceso para la elaboración de un producto de fermentación, que comprende: (a) la licuación y/o sacarificación de un material de carbohidrato; y (b) la fermentación usando un organismo de fermentación, donde se aplica una lisozima de la presente invención al proceso de fermentación, antes o después de la fermentación, o durante la fermentación, en concentraciones suficientes para matar o inhibir el crecimiento de células bacterianas.
Una lisozima de la presente invención también se puede usar en el control del crecimiento microbiano en un criadero de peces o langostinos.
Otros usos comprenden la preservación de alimentos, bebidas, cosméticos, tales como lociones, cremas, geles, pomadas, jabones, champús, acondicionadores, antitranspirantes, desodorantes, formulaciones enzimáticas o ingredientes de alimentos.
Composiciones .
En aun otro aspecto, la presente invención se refiere a composiciones que comprenden un polipéptido de la presente invención, que tienen actividad antimicrobiana y/o actividad de lisozima.
La composición puede comprender un polipéptido de la invención como el principal componente enzimático, por ejemplo, una composición de monocomponente. Alternativamente, la composición puede comprender múltiples actividades enzimáticas, tales como una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa , carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, deoxirribonucleasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta- galactosidasa, glucoamilasa , alfa-glucosidasa , beta-glucosidasa, haloperoxidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peptidoglutaminasa, peroxidasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa o xilanasa .
Las composiciones pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica, y pueden presentarse en forma de una composición líquida o seca. Por ejemplo, la composición de polipéptido puede presentarse en forma de un granulado o microgranulado . El polipéptido por incluir en la composición puede estabilizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.
A continuación, se proporcionan ejemplos de usos preferidos de las composiciones de polipéptido de la invención. La dosificación de la composición de polipéptido de la invención y otras condiciones en las cuales se usa la composición pueden determinarse sobre la base de métodos conocidos en la técnica.
Composiciones de alimentación animal.
La presente invención se dirige además a métodos para el uso de los polipéptidos de la presente invención que tienen actividad de lisozima, en alimentación animal, al igual que a composiciones de alimentaciones y aditivos de alimentaciones que comprenden las lisozimas de la invención.
El término "animal" incluye todos los animales, incluso, seres humanos. Ejemplos de animales son aquellos rumiantes y no rumiantes. Los animales rumiantes incluyen, por ejemplo, animales tales como ovejas, cabras y vacas, por ejemplo, ganado de carne de res y vacas. En una modalidad particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales monogástricos , por ejemplo, cerdos o chanchos (que incluyen, sin limitación, cochinos, cerdos de crecimiento y puercas); aves, tales como gansos, pavos, patos y pollos (que incluyen, sin limitación, pollos parrilleros y gallinas) ; caballos (que incluyen, sin limitación, pura sangre, de sangre fría y de sangre caliente) ; terneros jóvenes; y peces (que incluyen, sin limitación, salmón, trucha, tilapia, pez gato y carpas) ; y crustáceos (que incluyen, sin limitación, camarones y langostinos) .
El término "alimentación" o "composición de alimentación" significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición, adecuada o propuesta para la ingesta por un animal. En el uso de acuerdo con la invención, la lisozima puede ser suministrada al animal antes o después de la dieta, o, preferentemente, en forma simultánea con la dieta. Las composiciones de lisozima, naturalmente, pueden mezclarse con otras enzimas.
La lisozima puede agregarse a la alimentación en cualquier forma, por ejemplo, como una lisozima relativamente pura, o en mezcla con otros componentes propuestos para la adición a la alimentación animal, es decir, en forma de aditivos de alimentación animal, como las así denominadas premezclas para alimentación animal. En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a composiciones para el uso en alimentación animal, tal como alimentación animal y aditivos de alimentación animal, por ejemplo, premezclas.
Aparte de la lisozima de la invención, los aditivos de alimentación animal de la invención contienen por lo menos una vitamina soluble en grasa, y/o por lo menos una vitamina soluble en agua, y/o por lo menos un oligoelemento, y/o por lo menos un macroelemento .
Asimismo, ingredientes opcionales, aditivos de alimentación, son agentes colorantes, por ejemplo, carotenoides tales como beta-caroteno, astaxantina y luteína; estabilizadores; aditivos mej oradores del crecimiento y compuestos aromáticos o saborizantes, por ejemplo, creosol, anetol, deca-, undeca- y/o dodeca-lactonas, iononas, irona, gingerol, piperidina, propilideno ftalida, butilideno ftalida, capsaicina y/o tanino; ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, según su sigla en inglés) ; especies generadores de oxígeno reactivo; además, puede usarse un soporte que contiene, por ejemplo, 40-50% en peso de fibras de madera, 8-10% en peso de estearina, 4-5% en peso de polvo de Cúrcuma, 4-58% en peso de polvo de romero, 22-28% en peso de caliza, 1-3% en peso de una goma, tal como goma arábiga, 5-50% en peso de azúcar y/o almidón, y 5-15% en peso de agua.
Una alimentación o un aditivo de alimentación de la invención además puede comprender por lo menos una enzima adicional seleccionada de fitasa (EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.2.1.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); proteasa (EC 3.4), fosfolipasa Al (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); amilasa, tal como alfa-amilasa (EC 3.2.1.1) ; y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6) .
Ejemplos de ácidos grasos poliinsaturados son ácidos grasos poliinsaturados C18, C20 y C22, tales como ácido araquidónico, ácido docosohexaenoico, ácido eicosapentaenoico y ácido gamma-linoleico .
Ejemplos de especies generadoras de oxígeno reactivo son agentes químicos tales como perborato, persulfato o percarbonato; y enzimas tales como una oxidasa, una oxigenasa o una sintetasa.
Habitualmente , las vitaminas solubles en agua y en grasa, al igual que los oligoelementos , forman parte de una así denominada premezcla propuesta para la adición a la alimentación, mientras que los macroelementos habitualmente se agregan en forma separada a la alimentación. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando se enriquece con una proteasa de la invención, es un aditivo de alimentación animal de la invención.
En una modalidad particular, el aditivo de alimentación animal de la invención se propone para la inclusión (o se prescribe para la inclusión) en dietas animales o en alimentación animal en concentraciones de 0.1 p. p. m. a 1000 p. p. m. , preferentemente, 0.5 p. p. m. a 200 p. p. m. , y más preferentemente, 1 p. p. m. a 100 p. p. m. Los niveles de dosificación recién mencionados también pueden usarse para premezclas.
La composición de alimentación animal de la invención puede contener por lo menos una proteína vegetal, como aquella derivada o que se origina de un vegetal, que incluye proteínas modificadas y derivados de proteínas. Las proteínas vegetales pueden derivar de fuentes de proteínas vegetales, como legumbres y cereales, por ejemplo, materiales de plantas de las familias FaJbaceae (Leguminosae) , Cruciferaceae, Chenopodiaceae y Poaceae, tales como harina de soja, harina de lupinos y harina de semilla de colza. Alternativamente, la fuente de proteína vegetal es material de una o más plantas de la familia Chenopodiaceae, por ejemplo, remolacha, remolacha azucarera, espinaca o quínoa. Otros ejemplos de fuentes de proteínas vegetales son semilla de colza, semilla de girasol, semilla de algodón y repollo, y cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz (choclo), arroz, triticale y sorgo.
La composición de alimentación animal de la invención además puede contener proteína animal, como harina de carne y huesos, harina de plumaje y/o harina de pescado, habitualmente, en una cantidad de 0-25%. La composición de alimentación animal de la invención también puede comprender granos desecados de la destilación con solubles (DDGS, según su sigla en inglés), habitualmente, en cantidades de 0-30%.
Aun en otras modalidades particulares, la composición de alimentación animal de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soja; y/o 0-25% de harina de pescado; y/o 0-25% de harina de carne y huesos; y/o 0-20% de suero.
Las dietas animales, por ejemplo, pueden fabricarse como alimentación en puré (no miniesferizada) o alimentación miniesferizada . Habitualmente, las alimentaciones molidas se mezclan, y se agregan cantidades suficientes de minerales y vitaminas esenciales de acuerdo con las especificaciones para la especies en cuestión. Pueden agregarse las enzimas como formulaciones enzimáticas sólidas o líquidas. Por ejemplo, para alimentaciones en puré, puede agregarse una formulación enzimática sólida o líquida antes de la etapa de mezcla de ingredientes, o durante la etapa. Para alimentaciones miniesferizadas , la preparación (líquida o sólida) de lisozima/enzima también puede agregarse antes de la etapa de mezcla de ingredientes de la alimentación, o durante la etapa. Habitualmente, se agrega una preparación líquida de lisozima/enzima después de la etapa de miniesferización . La enzima también puede ser incorporada en una premezcla o un aditivo de alimentación.
La concentración de enzima final en la dieta se encuentra dentro del intervalo de 0.01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo, en el intervalo de 0.5-25 mg de proteína enzimática por kg de dieta animal.
Composiciones detergentes o de limpieza.
La lisozima de la invención puede agregarse a una composición detergente, y en consecuencia, tornarse un componente de la composición, en particular, un detergente líquido que tiene un pH de 7 o inferior.
La composición detergente de la invención, por ejemplo, puede ser formulada como una composición detergente para el lavado de ropa manual o en lavarropas, que incluye una composición aditiva para el lavado de ropa adecuada para el pretratamiento de textiles manchados, y una composición suavizante de textiles agregada como enjuague; o puede ser formulada como una composición detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras hogareñas generales; o puede ser formulada para operaciones de lavado de vajilla manual o en lavavaj illas .
En un aspecto específico, la invención provee un aditivo de detergente que comprende la lisozima de la invención. El aditivo de detergente, al igual que la composición detergente, pueden comprender una o más enzimas adicionales, como una proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa, una carbohidrasa, una celulasa, una pectinasa, una mananasa, una arabinasa, una galactanasa, una xilanasa, una oxidasa, por ejemplo, una lacasa, y/o una peroxidasa.
En general, las propiedades de las enzimas seleccionadas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y las enzimas deben presentarse en cantidades eficaces.
En una modalidad, la invención se dirige a composiciones detergentes o de limpieza que comprenden una enzima de la presente invención en combinación con uno o más componentes de limpieza adicionales. La elección de componentes de limpieza adicionales se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica, e incluye ingredientes convencionales, que abarcan los componentes no limitativos ejemplares que se exponen a continuación.
La elección de componentes puede incluir, para el cuidado de productos textiles, la consideración del tipo de producto textil por limpiar, el tipo y el grado de suciedad, la temperatura a la cual debe tener lugar la limpieza, y la formulación del producto detergente. Si bien los componentes mencionados a continuación se categorizan conforme a una función particular, esta categorización no debe interpretarse como una limitación, ya que el componente puede tener una o más f ncionalidades adicionales, que apreciará el experto en la técnica.
La composición detergente o de limpieza puede ser adecuada para el lavado de productos textiles tales como textiles, lienzos o blanquería; para la limpieza de superficies duras, tales como pisos y mesas; o para el lavado de vajilla.
La invención además se refiere a polinucleótidos que codifican los polipéptidos ; a construcciones de ácido nucleico, vectores y células hospederas que comprenden los polinucleótidos ; al igual que a métodos para la producción y el uso de los polipéptidos.
Tensioactivos .
La composición detergente puede comprender uno o más tensioactivos, que pueden ser aniónicos, catiónicos, no iónicos, semipolares, zwiteriónicos , o una mezcla de los anteriores. En una modalidad particular, la composición detergente incluye una mezcla de uno o más tensioactivos no iónicos y uno o más tensioactivos aniónicos. Los tensioactivos habitualmente se presentan en concentraciones de alrededor de 0.1% a 60% en peso, tal como alrededor de 1% a alrededor de 40%, o alrededor de 3% a alrededor de 20%, o alrededor de 3% a alrededor de 10%. Los tensioactivos se seleccionan sobre la base de la aplicación de limpieza deseada, e incluyen cualquier tensioactivo convencional conocido en la técnica. Puede utilizarse cualquier tensioactivo conocido en la técnica para el uso en detergentes .
Cuando se incluye, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 1% a aproximadamente 40% en peso, tal como de aproximadamente 5% a aproximadamente 30%, lo que incluye de aproximadamente 5% a aproximadamente 15%, o de aproximadamente 20% a aproximadamente 25%, de un tensioactivo aniónico. Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos aniónicos incluyen sulfatos y sulfonatos, en particular, alquilbencenosulfonatos lineales (LAS, según su sigla en inglés) , isómeros de LAS, alquilbencenosulfonatos ramificados (BABS, según su sigla en inglés), fenilalcanesulfonatos , alfa-olefinasulfonatos (AOS) , olefinasulfonatos , alqueno sulfonatos, alcano-2 , 3-diilbis (sulfatos) , hidroxialcanosulfonatos y disulfonatos , alquilsulfatos (AS) tales como dodecil sulfato de sodio (SDS) , sulfatos de alcoholes grasos (FAS, según su sigla en inglés) , sulfatos de alcoholes primarios (PAS, según su sigla en inglés) , alcohol etersulfatos (AES o AEOS o FES, también conocidos como alcohol etoxisulfatos o éter sulfatos de alcohol graso) , alcanosulfonatos secundarios (SAS) , sulfonatos de parafina (PS) , éster sulfonatos, glicerol ásteres de ácidos grasos sulfonados, ésteres metílicos de alfa-sulfo ácidos grasos (alfa-SF e o SES) que incluyen metil éster sulfonato (MES) , ácido alquil- o alquenilsuccínico, ácido dodecenil/tetradecenil succínico (DTSA, según su sigla en inglés) , derivados de ácidos grasos de aminoácidos, diésteres y monoésteres de jabón o ácido sulfosuccínico y sus combinaciones .
Cuando se incluyen, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo catiónico. Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos catiónicos incluyen aquilidimetiletanolamina quat (ADMEAQ) , bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) , cloruro de dimetildiestearilamonio (DSDMAC) y alquilbencildimetilamonio, compuestos de alquilo amonio cuaternario, compuestos de amonio cuaternario alcoxilados (AQA) y sus combinaciones.
Cuando se incluye, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 0.2% a aproximadamente 40% en peso de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, de aproximadamente 0.5% a aproximadamente 30%, en particular, de aproximadamente 1% a aproximadamente 20%, de aproximadamente 3% a aproximadamente 10%, tal como de aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, o de aproximadamente 8% a aproximadamente 12%. Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos no iónicos incluyen alcohol etoxilados (AE o AEO) , alcohol propoxilados , alcoholes grasos propoxilados (PFA) , ésteres de alquilo de ácidos grasos alcoxilados, tales como ésteres de alquilo de ácidos grasos etoxilados y/o propoxilados, alquilfenol etoxilados (APE) , nonilfenol etoxilados (NPE) , alquilpoliglicósidos (APG) , aminas alcoxiladas, monoetañolamidas de ácidos grasos (FAM) , dietanolamidas de ácidos grasos (FADA) , monoetanolamidas de ácidos grasos etoxilados (EFAM) , monoetanolamidas de ácidos grasos propoxilados (PFAM) , amidas de ácidos grasos de polihidroxi alquilo, o N-acil W-alquil derivados de glucosamina (glucamidas, GA, o glucamida de ácidos grasos, FAGA) , al igual que productos que pueden obtenerse con las denominaciones comerciales SPAN y TWEEN, y sus combinaciones.
Cuando se incluye, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo semipolar. Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos semipolares incluyen óxidos de amina (AO) tales como óxido de alquildimetilamina , óxido de N-(coco alquil) --V,W-dimetilamina y óxido de N- (sebo-alquil) -JV,N-bis (2-hidroxietil) amina, alcanolamidas de ácidos grasos y alcanolamidas de ácidos grasos etoxilados, y sus combinaciones .
Cuando se incluye, el detergente habitualmente contendrá de aproximadamente 0% a aproximadamente 10% en peso de un tensioactivo zwiteriónico . Ejemplos, sin limitación, de tensioactivos zwiteriónicos incluyen betaína, alquildimetilbetaína, sulfobetaína y sus combinaciones.
Hidrótropos .
Un hidrótropo es un compuesto que solubiliza compuestos hidrofóbicos en soluciones acuosas (u, opuestamente, sustancias polares en un entorno no polar) . Habitualmente , los hidrótropos tienen tanto carácter hidrófilico como hidrofóbico (así denominadas propiedades anfifílicas como se conocen de los tensioactivos) ; sin embargo, la estructura molecular de los hidrótropos generalmente no favorece la autoagregación espontánea; ver, por ejemplo, la reseña de Hodgdon y Kaler (2007) , Current Opinión in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Los hidrótropos no exhiben una concentración crítica sobre la cual se produce la autoagregación, como se halla para tensioactivos y lípidos que forman fases micelares, lamelares u otras mesofases bien definidas. En cambio, muchos hidrótropos muestran un proceso continuo de agregación, donde los tamaños de los agregados crecen a medida que aumenta la concentración. Sin embargo, muchos hidrótropos alteran el comportamiento de fases, la estabilidad y las propiedades coloidales de sistemas que contienen sustancias de carácter polar y no polar, que incluyen mezclas de agua, aceite, tensioactivos y polímeros. Los hidrótropos se usan clásicamente a través de todas las 10 industrias, desde la farmacia, el cuidado personal, los alimentos, hasta aplicaciones técnicas. El uso de hidrótropos en composiciones detergentes permite, por ejemplo, formulaciones de tensioactivos más concentradas (como en el proceso de la compactación de detergentes líquidos mediante la eliminación de agua) , sin inducir fenómenos indeseados tales como la separación de fases, o la alta viscosidad.
El detergente puede contener 0-5% en peso, tal como alrededor de 0.5 a aproximadamente 5%, o aproximadamente 3% a aproximadamente 5%, de un hidrótropo. Puede utilizarse cualquier hidrótropo conocido en la técnica para el uso en detergentes. Ejemplos no limitativos de hidrótropos incluyen benceno sulfonato de sodio, p-tolueno sulfonato de sodio (STS) , xileno sulfonato de sodio (SXS) , eumeno sulfonato de sodio (SCS) , cimeno sulfonato de sodio, óxidos de amina, alcoholes y poliglicol éteres, hidroxinaftoato de sodio, hidroxinaftaleno sulfonato de sodio, etil hexil sulfato de sodio y sus combinaciones.
Reforzadores y correforzadores.
La composición detergente puede contener aproximadamente 0-65% en peso, tal como aproximadamente 5% a aproximadamente 45% de un reforzador o correforzador de detergente, o una de sus mezclas. En un detergente de lavado de vajilla, el nivel de reforzador habitualmente es de 40-65%, en particular, 50-65%. El reforzador y/o correforzador, en particular, pueden ser un agente quelante que forma complejos solubles en agua con Ca y Mg. Puede utilizarse cualquier reforzador y/o correforzador conocido en la técnica para el uso en detergentes para el lavado de ropa. Ejemplos, sin limitación, de reforzadores incluyen zeolitas, difosfatos (pirofosfatos) , trifosfatos tales como trifosfato de sodio (STP o STPP) , carbonatos tales como carbonato de sodio, silicatos solubles tales como metasilicato de sodio, silicatos estratificados (por ejemplo, SKS-6, de Hoechst) , etanolaminas tales como 2-aminoetan-l-ol (MEA) , dietanolamina (DEA, también conocida como iminodietanol) , trietanolamina (TEA, también conocida como 2 , 2 ' , 2"-nitrilotrietanol) y carboximetil inulina (CMI) , y sus combinaciones.
La composición detergente además puede contener 0-20% en peso, tal como aproximadamente 5% a aproximadamente 10%, de un correforzador de detergente, o una de sus mezclas. La composición detergente puede comprender un correforzador solo, o en combinación con un reforzador, por ejemplo, un reforzador de zeolita. Ejemplos no limitativos de correforzadores incluyen homopolímeros de poliacrilatos o sus copolímeros, tales como poli (ácido acrílico) (PAA) o copoli (ácido acrílico/ ácido maleico) (PAA/PMA) . Otros ejemplos, sin limitación, abarcan citrato, quelantes tales como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos y fosfonatos, y ácido alquil- o alquenilsuccínico . Otros ejemplos específicos abarcan ácido 2 , 2 ' , 2"-nitrilotriacético (NTA) , ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA) , ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) , ácido iminodisuccínico (IDS) , ácido etilenodiamina-N, N' -disuccínico (EDDS) , ácido metilglicinadiacético (MGDA) , ácido glutámico-N, - ácido diacético (GLDA) , ácido 1-hidroxietano-l , 1-difosfónico (HEDP) , etilenodiaminatetra- ( ácido metilenofosfónico) (EDT PA) , dietilenotriaminapentakis (ácido metilenofosfónico) (DTPMPA o DT PA) , ácido N- (2-hidroxietil ) iminodiacético (EDG) , ácido aspártico-N- ácido monoacético (ASMA) , ácido aspártico-N, N- ácido diacético (ASDA) , ácido aspártico-N-ácido monopropiónico (ASMP) , ácido iminodisuccínico (IDA) , ácido N- (2-sulfometil ) -aspártico (SMAS) , ácido N-(2-sulfoetil) -aspártico (SEAS), ácido N- (2-sulfometil) -glutámico (SMGL) , ácido N- (2-sulfoetil) -glutámico (SEGL) , ácido N-metiliminodiacético (MIDA) , ácido a-alanina-N, N-diacético ( -ALDA) , ácido serina-N, N-diacético (SEDA) , ácido isoserina-N, N-diacético (ISDA) , ácido fenilalanina-N, N-diacético (FDA) , ácido antranílico-N, N-diacético (ANDA) , ácido sulfanílico-N, N-diacético (SLDA) , ácido taurina-iV, iV-diacético (TUDA) y ácido sulfometil-N, N-diacético (SMDA) , N- (2-hidroxietil) -etilidendiamina-N, N' , N'-triacetato (HEDTA) , dietanolglicina (DEG) , dietilenotriamina penta (ácido metilenofosfónico) (DTPMP) , aminotris (ácido metilenofosfónico) (ATMP) , y sus combinaciones y sales. Otros reforzadores y correforzadores ejemplares se describen, por ejemplo, en la Solicitud Internacional WO 09/102854, y Patente de los Estados Unidos de América Nro. US 5977053 Sistemas de blanqueo.
El detergente puede contener 0-50% en peso, tal como aproximadamente 0.1% a aproximadamente 25%, de un sistema de blanqueo. Puede utilizarse cualquier sistema de blanqueo conocido en la técnica para el uso en detergentes de lavado de ropa. Los componentes adecuados de sistemas de blanqueo incluyen catalizadores de blanqueo, fotoblanqueadores, activadores de blanqueo, fuentes de peróxido de hidrógeno tales como percarbonato de sodio y perboratos de sodio, perácidos preformados y sus mezclas. Los perácidos preformados adecuados incluyen, sin limitación, ácidos peroxicarboxílicos y sales, ácidos percarbónicos y sales, ácidos perimídicos y sales, ácidos peroximonosulfúricos y sales, por ejemplo, Oxone (R) , y sus mezclas. Ejemplos no limitativos de sistemas de blanqueo contemplan sistemas de blanqueo a base de peróxidos, que pueden comprender, por ejemplo, una sal inorgánica, que incluye sales metálicas alcalinas tales como sales de sodio de perborato (habitualmente , mono- o tetra-hidrato) , percarbonato, persulfato, perfosfato, sales de persilicato, en combinación con un activador de blanqueo de formación de perácido. El término activador de blanqueo significa, en esta solicitud, un compuesto que reacciona con blanqueo de peroxígeno como peróxido de hidrógeno, para formar un perácido. El perácido formado de esta manera constituye el blanqueo activado. Los activadores de blanqueo adecuados para ser utilizados en la presente invención incluyen aquellos que pertenecen a la clase de ésteres amidas, imidas o anhídridos. Ejemplos adecuados son tetracetiletileno diamina (TAED) , 4- [ (3,5,5-trimetilhexanoil) oxi] benceno sulfonato de sodio (ISONOBS) , ácido diperoxi dodecanoico, 4- (dodecanoiloxi) bencenosulfonato (LOBS) , 4- (decanoiloxi) bencenosulfonato, 4- (decanoiloxi) benzoato (DOBS) , 4- (nonanoiloxi) -bencenosulfonato (NOBS) , y/o aquellos revelados en la Solicitud Internacional WO 98/17767. Una familia particular de activadores de blanqueo de interés fue revelada en la Patente Europea EP 624154, y en particular, preferentemente, en la familia, el acetil trietil citrato (ATC) . El ATC o un triglicérido de cadena corta como triacetina posee la ventaja de ser seguro para el medio ambiente, ya que finalmente se degrada en ácido cítrico y alcohol. Además, el acetil trietil citrato y la triacetina tienen buena estabilidad hidrolítica en el producto con el almacenamiento, y son activadores de blanqueo eficientes. Por último, ATC proporciona una buena capacidad reforzadora al aditivo para el lavado de ropa. Alternativamente, el sistema de blanqueo puede comprender peroxiácidos de, por ejemplo, el tipo amida, imida, o sulfona. El sistema de blanqueo además puede comprender perácidos, tales como ácido 6- (ftalimido) peroxihexanoico (PAP) . El sistema de blanqueo también puede incluir un catalizador de blanqueo. En algunas modalidades, el componente de blanqueo puede ser un catalizador orgánico seleccionado del grupo que consiste en catalizadores orgánicos que tienen las siguientes fórmulas: (iii) y sus mezclas; donde cada R1 es, de manera independiente, un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 24 carbonos, o grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 24 carbonos; preferentemente, cada R1 es, de manera independiente, un grupo alquilo ramificado que contiene de 9 a 18 carbonos, o un grupo alquilo lineal que contiene de 11 a 18 carbonos; más preferentemente, cada R1 es de manera independiente seleccionado del grupo que consiste en 2- propilheptilo, 2-butiloctilo, 2-pentilnonilo, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n-tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, iso- nonilo, iso-decilo, iso-tridecilo e iso-pentadecilo . Otros ejemplos de sistemas de blanqueo se describen, por ejemplo, en las Solicitudes Internacionales WO 2007/087258, WO 2007/087244, WO 2007/087259 y WO 2007/087242. Los fotoblanqueadores adecuados, por ejemplo, pueden ser ftalocianina de zinc sulfonada.
Polímeros .
El detergente puede contener 0-10% en peso, tal como 0.5-5%, 2-5%, 0.5-2% o 0.2-1% de un polímero. Puede utilizarse cualquier polímero conocido en la técnica para el uso en detergentes. El polímero puede funcionar como un correforzador, como se menciona con anterioridad, o puede proporcionar actividad contra el redepósito, protección de fibras, liberación de manchas, inhibición de la transferencia de tinturas, propiedades de limpieza de grasa y/o antiespumantes . Algunos polímeros pueden tener más de una de las propiedades recién mencionadas, y/o más de uno de los factores mencionados a continuación. Ejemplos de polímeros incluyen (carboximetil) celulosa (CMC), poli (vinil alcohol) (PVA) , poli (vinilpirrolidona) (PVP) , poli (etilenglicol) o poli (etilenóxido) (PEG) , poli (etilenimina) etoxilada, carboximetil inulina (CMI) y policarboxilatos tales como PAA, PAA/PMA, ácido poli-aspártico y copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico, CMC hidrófobamente modificada (HM-CMC) y siliconas, copolímeros de ácido tereftálico y glicoles oligómeros, copolímeros de poli (etilentereftalato) y poli (oxieteno tereftalato) (PET-POET) , PVP, poli (vinilimidazol) (PVI) , poli (vinilpiridina-N-óxido) (PVPO o PVPNO) y polivinilpirrolidona-vinilimidazol (PVPVI) . Otros polímeros ejemplares abarcan policarboxilatos sulfonados, óxido de polietileno y óxido de polipropileno (PEO-PPO) y dicuaternio etoxi sulfato. Otros polímeros ejemplares se revelan, por ejemplo, en la Solicitud Internacional WO 2006/130575. Se contemplan además las sales de los polímeros mencionados anteriormente.
Agentes matizantes de textiles.
Las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir además agentes matizantes de textiles tales como tinturas o pigmentos, que, cuando son formulados en composiciones detergentes, pueden depositarse sobre un textil cuando el textil se pone en contacto con un licor de lavado que comprende las composiciones detergentes, y en consecuencia, se altera el tinte del textil a través de la absorción o el reflejo de luz visible. Los agentes blanqueadores fluorescentes emiten por lo menos cierta luz visible. En contraste, los agentes matizantes de textiles alteran el tinte de una superficie, a medida que absorben por lo menos una porción del espectro de luz visible. Los agentes matizantes de textiles adecuados incluyen tinturas y conjugados de tintura-arcilla, y además, pueden incluir pigmentos. Las tinturas adecuadas incluyen tinturas de molécula pequeña y tinturas poliméricas. Las tinturas de molécula pequeña incluyen tinturas de molécula pequeña seleccionadas del grupo que consiste en tinturas que se encuentran en la clasificación del índice de Colores (C.I.) de Direct Blue (azul directo) , Direct Red (rojo directo) , Direct Violet (violeta directo) , Acid Blue (azul ácido) , Acid Red (rojo ácido) , Acid Violet (violeta ácido) , Basic Blue (azul básico) , Basic Violet (violeta básico) y Basic Red (rojo básico), o sus mezclas, por ejemplo, como se describe en las Solicitudes Internacionales WO 2005/03274, WO 2005/03275, WO 2005/03276 y en la Patente Europea EP 1876226 (incorporadas en esta solicitud a modo de referencia) . La composición detergente, preferentemente, comprende de aproximadamente 0.00003% en peso a aproximadamente 0.2% en peso, de aproximadamente 0.00008% en peso a aproximadamente 0.05% en peso, o aun de aproximadamente 0.0001% en peso a aproximadamente 0.04% en peso de agente matizante de textil. La composición puede comprender de 0.0001% en peso a 0.2% en peso de agente matizante de textil; este intervalo puede ser especialmente preferido cuando la composición se presenta en la forma de una bolsa de dosis unitaria. Los agentes matizantes adecuados se describen además, por ejemplo, en las Solicitudes Internacionales WO 2007/087257 y WO 2007/087243.
Enzimas adicionales.
En un aspecto, la presente invención provee un aditivo de detergente que comprende una lisozima de la presente invención. El aditivo de detergente, al igual que la composición detergente, pueden comprender una o más enzimas [adicionales] , tales como una proteasa, lipasa, cutinasa, una amilasa, carbohidrasa, celulasa, pectinasa, mananasa, arabinasa, galactanasa, xilanasa, oxidasa, por ejemplo, una lacasa y/o peroxidasa.
En general, las propiedades de las enzimas seleccionadas deben ser compatibles con el detergente seleccionado (es decir, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y no enzimáticos, etc.), y las enzimas deben presentarse en cantidades eficaces.
Celulasas : Las celulasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. Las celulasas adecuadas incluyen celulasas de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ejemplo, las celulasas fúngicas producidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila y Fusarium oxysporu que se revelan en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros . US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 y en la Solicitud Internacional WO 89/09259.
Las celulasas especialmente adecuadas son las celulasas alcalinas o neutras que tienen beneficios para el cuidado del color. Ejemplos de las celulasas son celulasas descriptas en las Patentes Europeas EP 0 495 257, EP 0 531 372, y en las Solicitudes Internacionales WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Otros ejemplos son celulasas variantes tales como aquellas que se describen en los documentos WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 y PCT/DK98/00299.
Las celulasas comerciales abarcan Celluzyme™ y Carezyme™ (Novozymes A/S) , Clazinase™ y Puradax HA™ (Genencor International Inc.), y KAC-500(B)™ (Kao Corporation) .
Proteasas : Las proteasas adecuadas incluyen aquellas de origen animal, vegetal o microbiano. Se prefiere el origen microbiano. Se incluyen mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. La proteasa puede ser una serina proteasa o una metaloproteasa, preferentemente, una proteasa microbiana alcalina o una proteasa de tipo tripsina. Ejemplos de proteasas alcalinas son subtilisinas , en especial, aquellas derivadas de Bacillus, por ejemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 y subtilisina 168 (que se describen en la Solicitud Internacional WO 89/06279) . Ejemplos de proteasas de tipo tripsina son tripsina (por ejemplo, de origen porcino o bovino) y la proteasa de Fusarium que se describe en las Solicitudes Internacionales WO 89/06270 y WO 94/25583.
Ejemplos de proteasas útiles son las variantes que se describen en las Solicitudes Internacionales WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116 y WO 98/34946, en especial, las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 27, 36, 57, 76, 87, 97, 101, 104, 120, 123, 167, 170, 194, 206, 218, 222, 224, 235 y 274.
Las enzimas proteasas comerciales preferidas incluyen Alcalase™, Savinase™, Primase™, Duralase™, Esperase™, y Kannase™ (Novozymes A/S) , Maxatase™, Maxacal™, Maxapem™, Properase™, Purafect™, Purafect OxP™, FN2™ y FN3™ (Genencor International Inc.).
Lipasas y cutinasas: Las lipasas y cutinasas adecuadas incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen enzimas mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. Ejemplos incluyen lipasa de Thermomyces, por ejemplo, de T. lanuginosus (previamente denominada Humicola lanuginosa) como se describe en la Patente EP 258068 y en la Patente EP 305216; cutinasa de Humicola, por ejemplo, H. insolens (WO 96/13580) ; lipasa de cepas de Pseudomonas (algunas de estas, ahora renombradas como BurJ olderia) , por ejemplo, P. alcaligenes o P. pseudoalcaligenes (EP 218272) , P. cepacia (EP 331376) , cepa P. sp. SD705 (WO 95/06720 y WO 96/27002) , P. wisconsinensis (WO 96/12012) , lipasas de tipo GDSL de Streptomyces (WO 10/065455) ; cutinasa de Magnaporthe grísea (WO 10/107560) , cutinasa de Pseudomonas mendocina (US 5.389.536); lipasa de Thermobifida fusca (WO 11/084412), lipasa de Geobacillus stearothermophilus (WO 11/084417) , lipasa de Bacillus subtilis (WO 11/084599) y lipasa de Streptomyces griseus (WO 11/150157) y S. pristinaespiralis (WO 12/137147) .
Otros ejemplos son variantes de lipasas tales como aquellas descriptas en la Patente Europea EP 407225, en las Solicitudes Internacionales WO 92/05249, WO 94/01541, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/30744, WO 95/35381, WO 95/22615, WO 96/00292, WO 97/04079, WO 97/07202, WO 00/34450, WO 00/60063, WO 01/92502, WO 07/87508 y WO 09/109500.
Los productos preferidos de lipasas comerciales incluyen Lipolase™, Lipex™; Lipolex™ y Lipoclean™ (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente de Genencor) y Lipomax (originalmente, de Gist-Brocades) .
Aun otros ejemplos son lipasas a veces denominadas aciltransferasas o perhidrolasas , por ejemplo, aciltransferasas con homología a la lipasa A de Candida antárctica (WO 10/111143) , aciltransferasa de Mycobacterium smegmatis (WO 05/56782) , perhidrolasas de la familia CE 7 (WO 09/67279) y variantes de la perhidrolasa de M. smegmatis, en particular, la variante S54V utilizada en el producto comercial Gentle Power Bleach de Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO 10/100028) .
Amilasas : Las amilasas adecuadas (a y/o ß) incluyen aquellas de origen bacteriano o fúngico. Se incluyen imitantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. Las amilasas incluyen, por ejemplo, a-amilasas obtenidas de Bacillus, por ejemplo, una cepa especial de Bacillus licheniformis, descripta en más detalle en la Patente Británica GB 1,296,839.
Ejemplos amilasas útiles son las variantes que se describen en las Solicitudes Internacionales O 94/02597, O 94/18314, WO 96/23873 y WO 97/43424, en especial, las variantes con sustituciones en una o más de las siguientes posiciones: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305, 391, 408 y 444.
Las amilasas comerciales son Duramyl™, Termamyl™, Fungamyl™, Stainzyme ™, Natalase™ y BAN™ (Novozymes A/S) , Rapidase™ y Purastar™ (de Genencor International Inc.).
Peroxidasas/Oxidasas : Las peroxidasas/oxidasas adecuadas incluyen aquellas de origen de planta, bacteriano o fúngico. Se incluyen las mutantes químicamente modificadas o con diseño de proteína. Ejemplos de peroxidasas útiles incluyen peroxidasas de Coprinus, por ejemplo, de C. cinereus, y sus variantes, como aquellas descriptas en las Solicitudes Internacionales WO 93/24618, WO 95/10602 y WO 98/15257. Las peroxidasas comerciales incluyen Guardzyme™ (Novozymes A/S) .
Las enzimas de detergentes pueden incluirse en una composición detergente mediante la adición de aditivos separados que contienen una o más enzimas, o mediante la adición de un aditivo combinado que comprende la totalidad de estas enzimas. Un aditivo de detergente de la invención, es decir, un aditivo separado o un aditivo combinado, puede formularse, por ejemplo, como un granulado, líquido, una suspensión, etc. Las formulaciones de aditivos detergentes preferidas son granulados, en particular, granulados no polvorosos, líquidos, en particular, líquidos estabilizados, o suspensiones.
Los granulados no polvorosos pueden producirse, por ejemplo, como se revela en las Patentes de los Estados Unidos de América Nros . US 4.106.991 y 4.661.452, y opcionalmente , pueden revestirse por métodos conocidos en la técnica. Ejemplos de materiales de revestimiento cerosos son productos de poli (etilenóxido) (polietilenglicol , PEG) con medias de peso molar de 1000 a 20 000; nonilfenoles etoxilados que tienen de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos etoxilados en los cuales el alcohol contiene de 12 a 20 átomos de carbono, y en los cuales hay 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoholes grasos; ácidos grasos; y mono-, di- y triglicéridos de ácidos grasos. Ejemplos de materiales de revestimiento formadores de película adecuados para la aplicación por medio de técnicas de lecho fluido se proporcionan en la Patente Británica GB 1483591. Las preparaciones enzimáticas líquidas, por ejemplo, pueden ser estabilizadas mediante la adición de un poliol, tal como propilenglicol , un azúcar o alcohol de azúcar, ácido láctico o ácido bórico, de acuerdo con métodos establecidos. Las enzimas protegidas pueden prepararse de acuerdo con el método que se revela en la Patente Europea EP 238,216.
Materiales coadyuvantes .
Puede emplearse además cualquier componente detergente conocido en la técnica para el uso en detergentes de lavado de ropa. Otros componentes detergentes opcionales incluyen agentes anticorrosivos, agentes contra el encogimiento, agentes contra el redepósito de suciedad, agentes contra las arrugas, bactericidas, aglutinantes, inhibidores de la corrosión, agentes desintegrantes o de desintegración, tinturas, estabilizadores enzimáticos (que incluyen ácido bórico, boratos, CMC, y/o polioles tales como propilenglicol) , acondicionadores de textiles, que incluyen arcillas, rellenos/auxiliares de procesamiento, agentes blanqueadores fluorescentes/abrillantadores ópticos, reforzadores de la espuma, reguladores de la espuma (jabonadura), perfumes, agentes de suspensión de suciedad, suavizantes, supresores de la jabonadura, inhibidores de la decoloración y agentes de enjuague, solos o en combinación. Puede utilizarse cualquier ingrediente conocido en la técnica para el uso en detergentes de lavado de ropa. La elección de los ingredientes se encuentra dentro de la capacidad del experto en la técnica.
Dispersantes : Las composiciones detergentes de la presente invención además pueden contener dispersantes. En particular, los detergentes en polvo pueden comprender dispersantes. Los materiales orgánicos solubles en agua adecuados incluyen los ácidos homo- o copoliméricos o sus sales, en los cuales el ácido policarboxílico comprende por lo menos dos radicales carboxilo separados entre sí por no más de dos átomos de carbono. Los dispersantes adecuados se describen, por ejemplo, en Powdered Detergents, Surfactant science series volume 71, Marcel Dekker, Inc.
Agentes de inhibición de la transferencia de tinturas: Las composiciones detergentes de la presente invención pueden incluir además uno o más agentes de inhibición de la transferencia de tinturas. Los agentes de inhibición de la transferencia de tinturas poliméricos adecuados incluyen, sin limitación, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxido de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona y N-vinilimidazol , poliviniloxazolidonas y polivinilimidazoles o sus mezclas. Cuando se presentan en una composición de la presente invención, los agentes de inhibición de la transferencia de tinturas pueden hallarse en concentraciones de aproximadamente 0.0001% a aproximadamente 10%, de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 5% o aun de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 3% en peso de la composición .
Agente blanqueador fluorescente: Las composiciones detergentes de la presente invención, preferentemente, contienen además componentes adicionales que pueden dar un tinte a los artículos limpiados, tales como agentes blanqueadores fluorescentes o abrillantadores ópticos. Cuando se presenta, el abrillantador, preferentemente, se encuentra en una concentración de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 0.5%. Puede utilizarse cualquier agente blanqueador fluorescente adecuado para el uso en una composición detergente para el lavado de ropa, en la composición de la presente invención. Los agentes blanqueadores fluorescentes más comúnmente utilizados son aquellos que pertenecen a las clases de derivados de diaminoestilbeno-ácido sulfónico, derivados de diarilpirazolina y derivados de bisfenil-diestirilo . Ejemplos de agentes blanqueadores fluorescentes del tipo derivado de diaminoestilbeno-ácido sulfónico incluyen las sales de sodio de : 4,4' -bis- (2-dietanolamino-4-anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 2 ' -disulfonato; 4,4' -bis- (2 , 4-dianilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2.2 ' -disulfonato; 4, 4' -bis- (2-anilino-4 (N-metil-N-2-hidroxi-etilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 2 " -disulfonato, 4,4' -bis- (4-fenil-2 , 1 , 3-triazol-2-il) estilbeno-2 , 21 -disulfonato; 4 , 4 ' -bis- (2-anilino-4 (1-metil-2-hidroxi-etilamino) -s-triazin-6-ilamino) estilbeno-2 , 2 ' -disulfonato y 2- (estilbil-4 "-napto-1. , 21 : , 5) -1 , 2 , 3-trizol-2 "-sulfonato. Los agentes blanqueadores fluorescentes preferidos son Tinopal DMS y Tinopal CBS, que pueden obtenerse en Ciba-Geigy AG, Basel, Suiza. Tinopal DMS es la sal disódica de 4 , 41 -bis- (2-morfolino-4 anilino-s-triazin-6-ilamino) estilbeno disulfonato. Tinopal CBS es la sal disódica de 2 , 21 -bis- (fenil-estiril) disulfonato. Además, se prefieren los agentes blanqueadores fluorescentes como aquel que puede obtenerse en el mercado como Parawhite KX, provisto por Paramount Minerals and Chemicals, Mumbai, India. Otros fluorescentes adecuados para el uso en la invención incluyen las 1-3-diaril pirazolinas y las 7-alquilaminocumarinas . Las concentraciones adecuadas de abrillantadores fluorescentes incluyen concentraciones menores, de aproximadamente 0.01, de 0.05, de aproximadamente 0.1 o aun de aproximadamente 0.2% en peso, a concentraciones superiores, de 0.5 o aun de 0.75% en peso.
Polímeros liberadores de suciedad: Las composiciones detergentes de la presente invención además pueden comprender uno o más polímeros liberadores de suciedad que ayudan en la eliminación de suciedad de textiles tales como textiles a base de algodón y poliéster, en particular, en la eliminación de suciedades hidrófobas de textiles a base de poliéster. Los polímeros liberadores de suciedad, por ejemplo, pueden ser polímeros no iónicos o aniónicos a base de tereftalato, polivinil caprolactama y copolímeros relacionados, copolímeros de injertos de vinilo, poliéster poliamidas; ver, por ejemplo, Capítulo 7 en Powdered Detergente, Surfactant Science Series Volume 71, Marcel Dekker, Inc. Otro tipo de polímeros liberadores de suciedad son los polímeros anfifílicos de limpieza de grasas alcoxilados, que comprenden una estructura central y una pluralidad de grupos alcoxilato unidos a la estructura central . La estructura central puede comprender una estructura de polialquilenimina o una estructura de polialcanolamina como se revela en detalle en la Solicitud Internacional WO 2009/087523 (incorporada en esta solicitud a modo de referencia) . Además, los copolímeros de injertos de azar son adecuados como polímeros liberadores de suciedad. Los copolímeros de injertos adecuados se describen en más detalle en las Solicitudes Internacionales WO 2007/138054, WO 2006/108856 y WO 2006/113314 (incorporadas en esta solicitud a modo de referencia) . Otros polímeros liberadores de suciedad son estructuras de polisacáridos sustituidos, en especial, estructuras celulósicas sustituidas tales como derivados de celulosa modificada, como aquellos descritos en la Patente Europea EP 1867808 o en la Solicitud Internacional WO 2003/040279 (ambas, incorporadas en esta solicitud a modo de referencia) . Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, amidas de celulosa y sus mezclas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen celulosa aniónicamente modificada, celulosa no iónicamente modificada, celulosa catiónicamente modificada, celulosa zwiteriónicamente modificada, y sus mezclas. Los polímeros celulósicos adecuados incluyen metil celulosa, carboxi metil celulosa, etil celulosa, hidroxil etil celulosa, hidroxil propil metil celulosa, éster carboxi metil celulosa y sus mezclas .
Agentes contra el redepósito.: Las composiciones detergentes de la presente invención además pueden incluir uno o más agentes contra el redepósito tales como carboximetilcelulosa (CMC) , polivinil alcohol (PVA), polivinilpirrolidona (PVP), polioxietileno y/o poliet ilenglicol (PEG), homopol ímeros de ácido acrílico, copolímeros de ácido acrílico y ácido maleico, y pol iet i leniminas etoxiladas. Los polímeros a base de celulosa que se describen en la sección de polímeros liberadores de suciedad anterior pueden funcionar también como agentes contra el redepósito.
Otros materiales coadyuvantes incluyen, sin limitación, agentes contra el encogimiento, agentes contra arrugas, bactericidas, aglutinantes, portadores, tinturas, estabilizadores enzimáticos, suavizantes de textiles, rellenos, reguladores de la espuma, hidrótropos, perfumes, pigmentos, supresores de la jabonadura, solventes y estructurantes para detergentes líquidos, y/o agentes elastizantes de la estructura.
Biopelículas .
Los microorganismos que crecen en biopelículas son menos sensibles a todos los tipos de agentes antimicrobianos, en comparación con los mismos microorganismos cuando crecen en cultivos de suspensión convencionales.
Es bien sabido que las bacterias privadas de alimento pueden ser mucho menos sensibles a una diversidad de desafíos antimicrobianos. Por ejemplo, una cantidad de antibióticos clásicos, tales como penicilina, no funcionan bien en bacterias de lenta división, o sin división. Debido a que la lisozima ataca y destruye la capa de peptidoglucano, sin consideración del estado de crecimiento de las bacterias, permanece eficaz.
Control de biopelícula; líneas de agua dental ejemplares .
La formación de biopelícula dentro de una línea de agua dental puede contener biopelículas que consisten en Pseudomonas aeruginosa, Proteus mirabilis, género Legionella, entre otros. Además, existe la posibilidad de colonización de especies halladas generalmente dentro de la cavidad oral como consecuencia de la falla de las válvulas contra la retracción dentro del sistema. El riesgo de infección cruzada se torna aún más que un riesgo potencial cuando se trata de pacientes inmunocomprometidos , y actualmente, la cantidad de pacientes dentro de esta categoría continúa en firme incremento. Existe la necesidad del control eficaz de la acumulación de biopelícula bacteriana en líneas de aguas dentales. Puede hallarse una reseña de biopelículas en la referencia de: Watnick, P. y Kolter, R. (2000) "Biofilm, city of microbes", J. Bacterial.; 182 (10): 2675-9.
Un ejemplo típico de un producto comercial de comprimido de disolución bucal para la garganta es Lysopaine, producido por: BOEHRINGER INGELHEIM FRANCE Ingredientes activos: BACITRACINA, 200 U. I. (a 65 u. i./mg) PAPAÍNA, 2 mg a 30 NK / mg LISOZIMA, CLORHIDRATO, 5 mg a 26 000 U FIP / mg: unidades determinadas mediante la medición de la cinética de DO de la lisis de bacterias suspendidas en regulador. La determinación de unidades se midió por el cambio inducido por la lisis, en la turbiedad de un cultivo bacteriano suspendido en regulador.
Ingredientes no activos: SACARINA, excipiente ESTEARATO DE MAGNESIO, excipiente Mentol, aromatizante SORBITOL, excipiente Para el tratamiento local de infecciones puntuales limitadas a las membranas bucales de la orofaringe. Precaución: si hay indicaciones clínicas evidentes de infección bacteriana general, se aconseja tratamiento antibiótico.
Pasta dental : La lisozima puede usarse sola o en combinación con otras enzimas, o incluso, con péptidos antimicrobianos. Ejemplos de otras enzimas son glucosa oxidasa y lactoperoxidasa .
Una composición típica de pasta dental que incluye lisozima es "Biotene" , de Laclede, Inc., 2030, East University Drive, Rancho Domiguez, CA 90220, USA.
Ingredientes activos: Contiene: Lactoperoxidasa (100 g) .
Ingredientes inactivos: Glucosa oxidasa, lisozima, monofluorfosfato de sodio, sorbitol, glicerina, pirofosfato de calcio, sílice hidratada, zilitol, goma de celulosa, saborizante, benzoato de sodio, beta-d-glucosa , tiocianato de potasio.
La presente invención se describe adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos, que no deben ser interpretados como un límite al alcance de la invención.
EJEMPLOS Cepas .
Se usó la cepa de Aspergillus aculeatus CBS 172.66 como fuente de ADN para la obtención de la región codificadora que codifica el candidato de lisozima GH23. De acuerdo con el Central Bureau vor Schnimmelkulture , CBS 172.66 de Aspergillus aculeatus fue aislada por K.B. Raper en 1962 a partir de suelo tropical.
Se usó la cepa de Aspergillus oryzae MT3568 para la expresión del gen de A. aculeatus que codifica la enzima. MT3568 de A. oryzae es un derivado génico interrumpido de amdS (acetamidasa) de Aspergillus oryzae JaL355 (WO 2002/40694) donde se restauró la auxotrofia de pyrG mediante la interrupción del gen de A. oryzae de acetamidasa (amdS) con el gen pyrG. De acuerdo con el Central Bureau vor Schnimmelkulture, CBS 114.92 de Acremonium alkalophilum fue aislada por A. Yoneda en 1984, a partir del sedimento de abono orgánico de heces de cerdo, cerca de Tsukui Lake, Japón.
Medios y soluciones.
Medio YP: compuesto por 10 g de extracto de levadura, 20 g de bactopeptona y agua desionizada a 1 litro.
Medio LB: compuesto por 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 5 g de cloruro de sodio y agua desionizada a 1 litro.
Medio Horikoshi agar: compuesto por: 1% (p/v) de dextrosa, 1% de almidón soluble, 0.5% (p/v) de peptona, 0.5% (p/v) de extracto de levadura, 0.02% (p/v) de MgS04-7H20, 0.1% (p/v) de K2HP04 y 15 g (p/v) de Bacto-agar. Se agregó 1% (p/v) de Na2C03 en forma separada, luego de la esterilización.
Placas de PDA agar: compuestas por infusión de papa (la infusión de papa se preparó mediante el hervido de 300 g de papas en rodajas (lavadas, pero sin pelar) en agua, durante 30 minutos, y luego, la decantación o el colado del caldo a través de un lienzo. Entonces se agregó agua destilada hasta que el volumen total de la suspensión fue de un litro, seguido de 20 g (p/v) de dextrosa y 20 g (p/v) de polvo de agar. El medio se esterilizó mediante el autoclave a 0.1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998) .
Placas de sacarosa COVE: compuestas por 342 g de sacarosa, 20 g de polvo de agar, 20 mi de solución salina de COVE y agua desionizada a 1 litro. El medio se esterilizó mediante el autoclave a 0.1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998) . Se enfrió el medio hasta 60°C, y se agregaron acetamida, 10 mM; CsCl, 15 mM; y Tritón X-100 (50 µ1/500 mi) .
Placas de agar LB: compuestas por 37 g de agar LB y agua desionizada a 1 litro.
Solución salina COVE: compuesta por 26 g de MgS04*7H20, 26 g de KC1 , 26 g de KH2P04, 50 mi de solución de oligoelemento metálico COVE y agua desionizada a 1 litro.
Solución de oligoelemento metálico COVE: compuesta por 0.04 g de Na2B4O7»10H2O, 0.4 g de CuS04«5H20, 1.2 g de FeS04«7H20, 0.7 g de MnS04*H20, 0.8 g de Na2Mo04»2H20, 10 g de ZnS04»7H20 y agua desionizada a 1 litro.
Medio Dap-4C: compuesto por 20 g de dextrosa, 10 g de maltosa, 11 g de MgS04-7H20, 1 g de KHP04f 2 g de ácido cítrico, 5.2 g de ?3?04·?20, 0.5 g de extracto de levadura (Difco) , 1 mi de antiespumante , 0.5 mi de solución de oligoelementos metálicos KU6 , 2.5 g de CaC03 y agua desionizada a 1 litro. El medio se esterilizó mediante el autoclave a 0.1 MPa (15 psi) durante 15 minutos (Bacteriological Analytical Manual, 8th Edition, Revisión A, 1998). Antes de su uso, se agregaron 3.5 mi de (NH4)2HP04 al 50% estéril y 5 mi de ácido láctico al 20% estéril por cada 150 mi de medio.
Medio YP + 2% de glucosa: compuesto por 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 2% de glucosa.
Ejemplo 1: Ensayo de lisozima.
Xanthomonas campestris es el organismo de producción para toda la producción de goma de xantano. La separación de células de Xanthomonas de la solución de xantano altamente viscosa es un proceso de alto costo, en la producción industrial (Homma et al., EP690072, Murofushi et al., EP718311, US5702927) . Actualmente, el método favorecido para la recuperación de xantano del líquido de fermentación es la precipitación con alcohol, principalmente, isopropanol, después de la pasteurización para la destrucción de las células bacterianas y enzimas (Cottrell, W. I.; Kang, S. K. Dev. (1978) , "Xanthan gum: A unique bacterial polysaccharide for food applications" , Ind. Microbiol, 19:177). Posteriormente, el precipitado de restos celulares y xantano se seca mediante la pulverización y se tritura hasta un polvo. El alcohol se recupera mediante la destilación. Debido a las cantidades significativas de restos de paredes celulares de Xanthomonas en algunas preparaciones comerciales de goma de xantano, y a que estos restos se componen de material de pared celular de Xanthomonas rico en peptidoglucano, la goma puede usarse como un ensayo conveniente para establecer la actividad de degradación de peptidoglucano .
Ensayo de placa sólida.
La goma de xantano preparada comercialmente (Sigma #G- 1253) se disuelve en una solución regulada o un medio de crecimiento bacteriano hasta 0.5% p/v, en presencia de agarosa al 0.7%, y luego se somete al autoclave. Las preparaciones enzimáticas, los sobrenadantes o los organismos enteros se depositan en pocilios cortados de las placas de Bacto agar, o se depositan directamente sobre la superficie de los medios. Las preparaciones son capaces de formar zonas de aclaramiento en las placas. Estas zonas de aclaramiento pueden indicar la degradación del material de pared celular bacteriana.
Ensayo de aclaramiento líquido.
Se disuelve la goma de xantano comercialmente preparada en una solución regulada, en presencia o ausencia de cloruro de sodio. La solución se somete al autoclave y se usa para los estudios de aclaramiento de goma de xantano. Las preparaciones enzimáticas, los sobrenadantes o los organismos enteros se agregan al medio de ensayo, y este medio se incuba. Se miden los tratamientos resultantes en un espectrofotómetro, a fin de determinar la DO de la solución. Habitualmente, se usa una longitud de onda de 600 nm.
Ejemplo 2: Clonación y caracterización de la lisozima GH23 de Aapergillus aculeat s (SEC. ID. NRO. : 2) La información de secuencia genómica fue generada por el Departamento de Energía de la Junta del Instituto Genómico de los Estados Unidos [U. S. Department of Energy Joint Genome Institute (JGI)]. De acuerdo con el Central Bureau vor Schnimmelkulture, CBS 172.66 de Aspergillus aculeatus fue aislada por K.B. Raper en 1962 a partir de suelo tropical. Se descargó un montaje preliminar del genoma desde el JGI y se analizó usando el programa de análisis de secuencias Pedant-ProTM Sequence Analysis Suite (Biomax Informatics AG, Martinsried, Alemania) . Se usaron modelos de genes construidos por el soporte lógico, como un punto inicial para la detección de homólogos de GH23 en el genoma. Se construyeron modelos de genes más precisos en forma manual, usando múltiples secuencias de proteínas conocidas de GH23 como una guía.
Para generar ADN genómico para la amplificación por PCR, se propagó Aspergillus aculeatus CBS 172.66 en placas con agar PDA cultivándolo a 26 °C durante 7 días. Las esporas recolectadas de las placas de PDA se utilizaron para inocular 25 mi de medio YP + 2% de glucosa en un matraz para agitación con deflectores y se incubaron a 26 °C durante 48 horas con agitación a 200 rpm.
El ADN genómico se aisló de acuerdo con un protocolo FastDNA® SPIN modificado (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA) . Resumiendo, se utilizó un equipo FastDNA® SPIN Kit for Soil (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA) en un sistema de homogeneización FastPrep® 24 (MP Biosciences, Santa Ana, CA, USA) . Se recolectaron dos mi de material fúngico de los cultivos anteriores por centrifugación a 14 000 x g durante 2 minutos. Se eliminó el sobrenadante y la miniesfera se resuspendió en 500 µ? de agua desionizada. La suspensión se transfirió a un tubo Lysing Matrix E FastPrep® (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA) y se agregaron al tubo 790 µ? de regulador de fosfato sódico y 100 µ? de regulador MT del equipo FastDNA® SPIN Kit. Luego la muestra se aseguró en el instrumento FastPrep® (Qbiogene, Inc., Carlsbad, CA, USA) y se procesó durante 60 segundos a una velocidad de 5.5 m/s .
Luego la muestra se centrifugó a 14 000 x g durante dos minutos y el sobrenadante se transfirió a un tubo EPPENDORF® limpio. Se agregó un volumen de 250 µ? del reactivo PPS del equipo FastDNA® SPIN Kit y luego la muestra se mezcló cuidadosamente invirt iéndola . La muestra se volvió a centrifugar a 14 000 x g durante 5 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo de 15 mi, a continuación se agregó 1 mi de suspensión Binding Matrix del equipo FastDNA® SPIN Kit y luego se mezcló invirtiéndolo durante dos minutos. La muestra se colocó en una rejilla estacionaria para tubos y se permitió que la matriz de sílice sedimentara durante 3 minutos. Se retiró un volumen de 500 µ? del sobrenadante y se descartó y luego la muestra remanente se resuspendió en la matriz. Luego la muestra se transfirió a un tubo con filtro SPIN del equipo FastDNA® SPIN Kit y se centrifugó a 14 000 x g durante 1 minuto. El tubo de captura se vació y la suspensión de matriz remanente se agregó al tubo con filtro SPIN. Se volvió a centrifugar la muestra (14 000 x g, 1 minuto) . Se agregó un volumen de 500 µ? de solución SEWS-M del equipo FastDNA® SPIN Kit al tubo con filtro SPIN y la muestra se centrifugó a la misma velocidad durante 1 minuto. El tubo de captura se vació y se reemplazó el filtro SPIN en el tubo de captura. La unidad se centrifugó a 14 000 x g durante 2 minutos para "secar" la matriz eliminando la solución de lavado SEWS-M residual. El filtro SPIN se colocó en un tubo de captura nuevo y se permitió que se secara al aire durante 5 minutos a temperatura ambiente. La matriz se resuspendió cuidadosamente en 100 µ? de DES (DNasa/agua exenta de pirógenos) con la punta de una pipeta. La unidad se centrifugó (14 000 x g, 1 minuto) para eluir el ADN genómico, luego se eluyó con 100 µ? de Tris 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 8.0 mediante una centrifugación renovada a 14 000 x g durante 1 minuto y se combinaron las fracciones eluidas . La concentración del ADN recolectado a partir del tubo de captura se midió con un espectrofotómetro UV a 260 nm .
Construcción de un vector de expresión de Aspergil lus oryzae que contiene una secuencia genómica de Aspergillus aculeatus CBS 172.66 que codifica un polipéptido P24DZF de la familia GH23 que tiene actividad de lisozima.
Se diseñaron los dos cebadores de oligonucleótidos sintéticos que se muestran en la Tabla 1 a continuación para amplificar por PCR el gen de Aspergillus aculeatus CBS 172.66 P8EH GH23 a partir del ADN genómico. Se usó un equipo IN-FUSION™ Cloning Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA) para la clonación del fragmento directamente en el vector de expresión pDaul09 ( O 2005/042735) . 14 Tabla 1: Cebadores utilizados para la amplificación de PCR de GH23.
Los caracteres en negrita representan la secuencia codificadora. La secuencia subrayada es homologa a los sitios de inserción de pDaul09.
La reacción de PCR (25 µ?) estaba compuesta por 12.5 µ? de mezcla 2X IPROOF™ HF Master Mix, 0.5 µ? de cebador F-P24DZF (100 µ?) , 0.5 µ? de cebador R-P24DZF (100 µ?) , 0.5 µ? de genómico (100 ng/µ?) y 11 µ? de agua desionizada. La reacción de PCR se incubó en un ciclador térmico DYAD® Dual-Block Thermal Cycler (MJ Research Inc., Waltham, MA, USA) programado para 1 ciclo a 98°C durante 30 segundos; 30 ciclos, cada uno a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 10 segundos y 72°C durante 60 segundos; y 1 ciclo a 72°C durante 10 minutos. Las muestras se enfriaron hasta 10 °C antes de la eliminación y el posterior procesamiento.
Se analizaron 5 µ? de la reacción de PCR por medio de la electroforesis de gel de agarosa al 1% usando regulador TAE, donde se observó una banda de producto de aproximadamente 770 p. b. La reacción de PCR restante se purificó usando un equipo de purificación ILLUSTRA™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
El fragmento luego se clonó en pDaul09 digerido con Hind III y Bam HI usando un equipo de clonación IN-FUSION™ Cloning Kit de modo de lograr el plásmido pP8EH. La clonación del gen P24DZF en pDaul09 digerido con Hind III-Bam HI logró la transcripción del gen de Aspergillus aculeatus P24DZF bajo el control de un promotor doble NA2-tpi. NA2-tpi es un promotor modificado del gen que codifica la alfa-amilasa neutra de Aspergillus niger en el cual el líder no traducido ha sido reemplazado por un líder no traducido del gen que codifica la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans.
El protocolo de clonación se realizó de acuerdo con las instrucciones del equipo de clonación IN-FUSION™ Cloning Kit de modo de generar una construcción P24DZF GH23. El plásmido tratado y la inserción se transformaron en células de E. coli Fusión Blue™ (Clontech, Mountain View, CA, USA) de acuerdo con el protocolo del fabricante, y se plaquearon en placas de LB suplementadas con 50 ug de ampicilina por mi. Después de la incubación a 37°C durante la noche, se observaron colonias en desarrollo bajo la selección en las placas de LB ampicilina. Diez colonias transformadas con la construcción P24DZF GH23 se cultivaron en medio LB suplementado con 50 µ9 de ampicilina por mi, y se aisló el plásmido usando un equipo FASTPlasmid mini kit de 5Prime (5 PRIME GmbH, Kónigstrasse 4a, 22767 Hamburg, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante .
Los plásmidos aislados se secuenciaron con cebadores de vector y a fin de determinar un clon de expresión de plásmido representativo que estuviera libre de errores de la PCR.
Caracterización de las secuencias genómicas de Aspergillus aculeatus CBS 172.66 que codifican el polipéptido GH23 El secuenciamiento de ADN del clon genómico de Aspergillus aculeatus CBS172.66 P24DZF GH23 se efectuó con un secuenciador de ADN Applied Biosystems Model 3730x1 Automated DNA Sequencer usando la versión 3.1 BIG-DYE™ de química de terminador (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) y una estrategia de camino de cebador. La información de la secuencia de nucleótidos se examinó a fin de establecer la calidad y todas las secuencias se compararon entre sí con la ayuda del soporte lógico PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA) . La secuencia obtenida fue idéntica a la secuencia del JGI y se muestra en SEC. ID. NRO.: 1.
La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del gen de Aspergillus aculeatus P24DZF GH23 se muestran en SEC. ID. NRO . : 1 y SEC. ID. NRO . : 2, respectivamente. La secuencia codificadora es de 862 p. b., que incluye el codón de detención, y es interrumpida por un único intrón de 67 p. b. (nucleótidos 572 a 638) . La proteína pronosticada codificada es de 264 aminoácidos y se muestra en SEC. ID. NRO.: 2. Usando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se pronosticó un péptido de señal de 19 residuos. La proteína madura pronosticada contiene 245 aminoácidos.
Se usó la cepa de Aspergillus oryzae MT3568 para todos los experimentos. La cepa de Aspergillus oryzae MT3568 es un derivado alterado de amdS (acetamidasa) de A. oryzae JaL355 (WO 2002/40694) en el cual se restauró la auxotrofia de pyrG en el proceso de noqueo {knockout : inactivación de genes específicos como modelo de enfermedad; una mutante individual donde se ha reemplazado un solo gen funcional por una forma no funcional del gen) del gen de A. oryzae de amdS . Se prepararon los protoplastos de MT3568 de A. oryzae de acuerdo con el método de la Patente Europea EP 0238023, pp. 14-15. Se prepararon protoplastos nuevos de MT3568 de A. oryzae y se transformaron con el plásmido P24DZF GH23. Se usó ADN plásmido del procedimiento mini prep anterior a fin de transformar MT3568 de A. oryzae. 4 Se usaron 6 ul que contenían aproximadamente 3.0 µg de ADN total, para la transformación. El ADN se agregó suavemente a 100 µ? de protoplastos de MT3568 de A. oryzae, y se prepararon 250 µ? de PEG 4000 al 60% (Sigma-Aldrich Cat . Nro. 95904) . El PEG 4000 al 60% (P/V) se preparó de la siguiente manera: se disolvió polvo de PEG 4000 en H20 doble destilada y luego se trató durante 10-20 seg en un horno de microondas a 800 vatios, hasta la disolución. La solución disuelta se enfrió hasta temperatura ambiente y luego se ajustó con solución de CaCl2 y solución de Tris-HCl (pH 7.5) para una concentración final de 10 mM de cada uno. Después de agregar la solución al 60% de PEG 4000, el tubo se mezcló suavemente y se incubó a 37°C durante 30 minutos. Se agregó la mezcla a 6 mi de agar superior con acetamida, 10 mM, y se plaqueó en placas de COVE-sorbitol con acetamida, 10 mM.
Las placas se incubaron a 37 °C durante 3 o más días, y luego se movieron a 26 °C durante dos días. Las esporas de 8 colonias individuales se recogieron primer mediante el sumergido de una espiga de inoculación blanca de 10 µ? (Nunc A/S, Dinamarca) En una solución al 0.1% de T EEN® 80, el contacto de la colonia de esporulación sobre la placa de selección, y nuevamente, el salpicado con la espiga sobre placas nuevas de COVE sorbitol que contenían acetamida, 10 mM. Después de 5 días a 26 °C, se usaron las esporas de las colonias nuevamente salpicadas a fin de inocular una placa de discos profunda de 96 pocilios (NUNC, Cat . NRO. 260251, Thermoscientific, USA) . Los pocilios de la placa de disco profunda contenían 500 ul o bien de medio YP + 2% de glucosa o medio DAP4C. La placa inoculada se selló con cinta permeable al gas (89009-656, VWR.com). Las placas se incubaron estacionariamente a 30 °C durante 5 días. Se verificó la expresión por medio del análisis de 20 ul de fluido de cultivo cosechado, en SDS-PAGE usando un gel NUPAGE® 10% Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) y tinción de azul de Coomassie. Se seleccionó un transformante para el trabajo posterior, y se designó A. oryzae EXP03899.
Se inocularon con esporas de EXP03899 el medio YP + 2% de glucosa y el medio DAP-4C-1 (100 mi en un matraz de agitación de 500 mi Erlenmeyer con deflectores) . Los cultivos se incubaron a 26°C y a 150 r. p. m. , 3 días, y si fue necesario, 4 días. Se hizo correr un gel de SDS como anteriormente, a fin de evaluar la cantidad de proteína.
Ensayo de placa para la actividad de lisozima.
Se efectuó un ensayo de salpicado con goma de xantano, a pH 5, 7 y 8 como se describe en la sección de ensayo de placa de lisozima.
Se preparó una solución al 1.5% de agarosa (Invitrogen Cat. 15510-027, grado de electroforesis) en los siguientes reguladores : pH ~5 - en agua H ~7 - en fosfato de potasio, 0.02 M, pH 7 pH ~8 - en fosfato de potasio, 0.02 M, pH 8 La agarosa se sometió al autoclave durante 20 minutos a 121°C. Se disolvió goma de xantano al 0.5% (Sigma G1253) en la agarosa al 1.5 % fundida, y la mezcla se vertió en discos de Petri . Cuando las placas es establecieron, los pocilios de aplicación de muestra se prepararon con una punta de pipeta P-1000 (corte a un diámetro de 3 mm) unida a una línea de vacío .
Se depositaron 20 ul del fluido de cultivo de EXP03899 en los pocilios de aplicación, y se incubaron a 37 °C durante la noche. Las muestras con actividad de lisozima se observaron para detectar las zonas de aclaramiento donde los restos celulares en la goma de xantano fueron observados. Los fluidos de cultivo de EXP03899 exhibieron la zona de aclaramiento, mientras que el hopedero MT3568 de transformación no transformado de Aspergillus oryzae no produjo una zona de aclaramiento capaz de ser advertida. El fluido de cultivo restante de EXP03899 se filtró a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0.22 µ??? y se almacenó en alícuotas a -20°C hasta el uso posterior.
Ejemplo 3: Clonación y caracterización de dos genes codificadores de lisozimas de Acremonioum alkalophilum 6H24 (SEC. ID. NROs. : 4 y 6) .
La información de secuencia genómica fue generada por el Departamento de Energía de la Junta del Instituto Genómico de los Estados Unidos [U. S. Department of Energy Joint Genome Institute (JGI) 3. De acuerdo con el Central Bureau vor Schnimmelkulture, Acremonium alkalophilum CBS 114.92 fue aislado por A. Yoneda en 1984, del sedimento de abono orgánico de heces de cerdo, cerca de Tsukui Lake, Japón. Se descargó un montaje preliminar del genoma desde el JGI y se analizó usando el programa de análisis de secuencias Pedant-ProTM Sequence Analysis Suite (Biomax Informatics AG, Martinsried, Alemania) . Se usaron modelos de genes construidos por el soporte lógico, como un punto inicial para la detección de homólogos de GH24 en el genoma. Se construyeron modelos de genes más precisos en forma manual, usando múltiples secuencias de proteínas conocidas de GH24 como una guía.
Se propagó Acremonium alkalophilum CBS 114.92 en agar de Horikoshi, pH 9, durante 7 días a 30°C. Se cosecharon las micelas directamente de la placa y se aisló el ADN de acuerdo con el equipo FastDNA SPIN Kit for Soil (www.mpbio.com). El ADN se eluyó en 100 µ? de regulador TRIS, 10 mM; EDTA, 0.1 mM; pH 7.5, y se almacenó a 4°C hasta el uso.
Los pares de cebadores de oligonucleótidos sintéticos que se muestran en la Tabla 2 a continuación se diseñaron para amplificar por PCR el gen de A. alkalophilum CBS114.92 P242MS GH24 o el gen P244A7 GH24 del ADN genómico de A. alkalophilum descrito en el Ejemplo 2 anterior.
Tabla 2: Cebadores utilizados para la amplificación de PCR de GH24 y GH25 Los caracteres en negrita representan la secuencia codificadora. La secuencia subrayada es homologa a los sitios de inserción de pDaul09.
El secuenciamiento de ADN de los clones genómicos de Acremonium alkalophilum CBS114.92 GH24 se efectuó con un secuenciador de ADN Applied Biosystems Model 3730x1 Automated DNA Sequencer usando la versión 3.1 BIG-DYE™ de química de terminador (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA) y 15 una estrategia de camino de cebador. La información de la secuencia de nucleótidos se examinó a fin de establecer la calidad y todas las secuencias se compararon entre sí con la ayuda del soporte lógico PHRED/PHRAP (University of Washington, Seattle, WA, USA) . Las secuencias obtenidas fueron idénticas a las secuencias del JGI .
Gen P242MS GH24 La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del gen de Acremonium alkalophilum GH24 se muestran en SEC. ID. NRO . : 3 y SEC. ID. NRO.: 4, respectivamente. La secuencia codificadora es de 628 p. b., que incluye el codón de detención, y es interrumpida por un único intrón de 67 p. b. (nucleótidos 268 a 334) . La proteína pronosticada codificada es de 186 aminoácidos. Usando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6), se pronosticó un péptido de señal de 20 residuos. La proteína madura pronosticada contiene 166 aminoácidos.
Gen P244A7 GH24 La secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida del gen de Acremonium alkalophilum P244A7 GH24 se muestran en SEC. ID. NRO.: 5 y SEC. ID. NRO.: 6, respectivamente. La secuencia codificadora es de 782 p. b., que incluye el codón de detención, y es interrumpida por dos intrones de 81 p. b. (nucleótidos 134 a 214) y 170 p. b. (nucleótidos 346 a 515) . La proteína pronosticada codificada es de 176 aminoácidos. Usando el programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) , se pronosticó un péptido de señal de 19 residuos. La proteína madura pronosticada contiene 157 aminoácidos.
Los plásmidos para P242MS y P244A7 se produjeron y transformaron en Aspergillus orzyzae como en el Ejemplo 2. Los transformantes con fluidos de cultivo que produjeron el producto de proteína recombinante se identificaron mediante SDS-PAGE como en el Ejemplo 2 y se denominaron: EXP03865 en el caso de P242MS y EXP03890 en el caso de P244A7. Los fluidos de cultivo de EXP03865 y EXP03890 fermentados en medio YP + 2% de glucosa y medio DAP4C se añadieron a las placas con restos celulares bacterianos y xantano. Se identificó que DAP4C produjo la mejor expresión de la proteína, mientras que YP + 2% de glucosa produjo la mejor expresión para EXP03890 tanto en el análisis de SDS-PAGE como en la actividad del ensayo de salpicado.
Ejemplo 4: RDA (Ensayos de difusión radial, por su siglas en inglés) .
Inicialmente , la actividad antimicrobiana de los sobrenadantes de cultivo y las fracciones purificadas que contenían las lisozimas expresadas de manera recombinada se confirmó usando un ensayo RDA como se describe previamente en la referencia de Lehrer et al. (Lehrer, R. I., Rosenman, M . , Harwig, S. S., et al. (1991) , "Ultrasensit ive assays 5 for endogenous antimicrobial polypeptides" , J Immunol Methods, 137:167-73), con varias modificaciones. En resumen, 30 mi de caldo fundido 1/10 Mueller-Hinton (MHB) (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) con 1% de agarosa se enfriaron hasta 42°C, se suplementaron a 5.0xl05 ufc/ml con S. carnosus ATCC 51365 o E. coli DSM682 (ATCC 10536) y se volcaron en una placa de un solo pocilio Omnitray (Nunc) . La placa Omnitray se superpuso con una placa TSP (Nunc) y se dejaron solidificar. Después de 1 h, la placa TSP se extrajo, de modo de dejar 96 pocilios de 1 mm en los cuales pudieron evaluarse 10 µ? del compuesto de interés.
Se colocaron 10 µ? de la solución de ensayo por pocilio, y las placas se incubaron O/N a 37°C. Al día siguiente, las zonas de aclaramiento indicaron que no hubo crecimiento de las bacterias de ensayo, y en consecuencia, hubo actividad antimicrobiana. Las zonas de aclaramiento se visualizaron mediante la coloración con MTT (bromuro de 3-(4 , 5-dimetiltiazol-2-il ) -2 , 5-difeniltetrazolio, un tertrazol amarillo) , reducido a formazano púrpura en las células vivas (Mosmann, Tim (1983), "Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival : application to proliferation and cytotoxicity assays", Journal of Immunological Methods, 65 (1-2) : 55-63) . Esta coloración proporciona una coloración oscura de las células vivas, y no proporciona coloración a las zonas de aclaramiento, sin células vivas .
La lisozima de Aspergillus fumigatus GH25 (preparada como se revela en la referencia de Korczynska et al . , Acta Crys . (2010) F66, 973-977) se incluyó en el ensayo como una referencia. Las muestras purificadas que se exponen en la Tabla 3 a continuación se han ensayado en el ensayo de RDA.
Tabla 3: Ensayo de difusión radial de la lisozima GH24.
Medición de zonas de aclaramiento.
El experimento se realizó por triplicado de manera de lograr las mismas zonas de aclaramiento y zonas de inhibición medidas, ver Figura 1. La Tabla 4 a continuación muestra las zonas de aclaramiento en mm.
Tabla 4: Zonas de aclaramiento antimicrobiano de la lisozima GH24 contra Staphylococcus carnosus y Escherichia coli .
La lisozima purificada que tiene SEC. ID. NRO. : 6 mostró actividad antimicrobiana contra células viables de las bacterias Grampositivas Staphylococcus carnosus y las bacterias Gramnegativas Escherichia coli.
La actividad antimicrobiana no se presentó en los sobrenadantes de cultivo del hopedero no transformado de Aspergillus (resultados no expuestos) .
Se observaron grandes zonas de aclaramiento con bordes no definidos, alrededor de la zona de aplicación para A. alcalophilum GH24 (SEC. ID. NRO. : 6) . El experimento indica que la lisozima de A. alcalophilum (SEC. ID. NRO. : 6) y la lisozima de referencia de Aspergillus fumigatus GH25 tienen diferentes actividad y especificidad contra las dos bacterias ensayadas en este ejemplo.
Ejemplo 5: Ensayo de turbiedad.
La actividad de la lisozima se determinó midiendo la disminución (caída) en la absorbancia/densidad óptica de una solución de Micrococcus lysodeikticus ATCC Nro. 4698 ( S igma-Aldrich M3770) o Exiguobacterium undea (DSM14481) resuspendidas , medida en un espectrofotómetro a 540 nm .
Preparación de sustrato de Micrococcus lysodeikticus . Antes de usar, las células se resuspendieron en ácido cítrico - regulador de fosfato, pH 6.5, hasta una concentración de 0.5 mg de células/ml, y se midió la densidad óptica (DO) a 540 nm . La suspensión de células luego se ajustó de modo tal que la concentración de células se equiparó a una DO 540 = 1.0. La suspensión celular ajustada luego se almacenó en frío, antes del uso. Las células resuspendidas se usaron dentro de las 4 horas .
Preparación de ácido cítrico - regulador de fosfato, pH 6.5.
Se mezclaron 29 mi de ácido cítrico, 0.1 M, con 61 mi de Na2HP04, 0.2 M, y se ajustó el pH con HC1 o NaOH hasta pH 6.5. 1 7 Preparación de células desecadas de Exiguobacterium undae (el sustrato) .
Se preparó un cultivo de E. undae (DS 14481) en 100 mi de medio LB (Fluka 51208, 25 g/1) en un matraz de agitación de 500 mi a 30°C, 250 r. p. m. , durante la noche. El cultivo de la noche entonces se centrifugó a 20 °C y 5000 g durante 10 minutos, y la miniesfera se lavó dos veces con agua estéril milliQ, y se resuspendió en agua Milli-Q. Las células lavadas se centrifugaron durante 1 minuto a 13 000 r. p. m. , y se decantó la mayor cantidad posible del sobrenadante. Las células lavadas se secaron en una centrífuga al vacío durante 1 hora. La miniesfera de células se resuspendió en ácido cítrico - regulador de fosfato, pH 6.5, de manera de lograr una densidad óptica (DO) a 540 nm = 1.
Medición de la actividad antimicrobiana de lisozima en el ensayo de turbiedad.
La muestra de lisozima por ser medida se diluyó a una concentración de 100-200 mg de proteína enzimática/1 , en ácido cítrico - regulador de fosfato, pH 6.5, y se mantuvo en hielo hasta el uso. En una placa de microvaloración de 96 pocilios (Nunc) , se agregaron 200 µ? del sustrato a cada pocilio, y la placa se incubó a 25°C o 37°C durante 5 minutos en un lector de microplaca VERSAmax (Molecular Devices) . Después de la incubación, se midió la absorbancia de cada pocilio a 540 nm (valor inicial) . A fin de iniciar la medición de actividad, se agregaron 20 µ? de la muestra de lisozima diluida a cada sustrato (200 µ?) , y se inició la medición cinética de la absorbancia a 540 nm durante un período de tiempo mínimo de 30 minutos hasta 24 horas, a 25°C o 37 °C. La absorbancia medida a 540 nm se monitoreó para cada pocilio, y en función del tiempo, se observó una caída en la absorbancia si la lisozima tenía actividad de lisozima.
La lisozima de Aspergillus fu igatus GH25 (Korczynska et al. (2010) supra.) se incluyó en el ensayo como una referencia, y los resultados se muestran en la Tabla 5 que se expone a continuación.
Tabla 5: Actividad de lisozima de lisozimas GH25 contra Micrococcus lysodeikticus y Exiguobacterium undea, medida por la caída de la densidad óptica. ' significa no ensayado.
Significa sin efecto, significa efecto pequeño ++ significa efecto medio. +++ significa efecto grande.
Ejemplo 6: Expresión de la proteína P242MS GH24 y la proteína ?244?7 GH24 en Aspergillus oryzae.
Las construcciones que comprendían el gen de lisozima relevante se utilizaron para construir los vectores de expresión para Aspergillus . Los vectores de expresión de Aspergillus consisten en un cásete de expresión basado en el promotor de amilasa II neutro de Aspergillus niger fusionado con la secuencia líder no traducida de la triosa fosfato isomerasa de Aspergillus nidulans (Pna2/tpi) y el terminador de la amiloglucosidasa de Aspergillus niger (Tamg) . En el plásmido también estaba presente el marcador selectivo para Aspergillus amdS de Aspergillus nidulans, que hace posible el crecimiento en acetamida como única fuente de nitrógeno. Los plásmidos de expresión se transformaron en Aspergillus como se ha descrito en el Ejemplo 3. Para cada una de las construcciones, se aislaron 10-20 cepas, se purificaron y se cultivaron en matraces para agitación.
Ejemplo 7: Purificación de la proteína P242MS GH24 y la proteína P244A7 GH24 en Aspergillus oryzae Purificación de la proteína P242MS GH24 El sobrenadante de la fermentación con la lisozima se filtró a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0.22 µp?. Se ajustó el pH a 7.5 con NaOH 0.1 M y la solución resultante se concentró (se redujo el volumen en un factor de 8) en una unidad de ultrafiltración (Sartorius) con una membrana de corte de 5 kDa.
Después del tratamiento previo, se purificaron aproximadamente 55 mi de la solución que contenía la lisozima, mediante la cromatografía en Q Sepharose, aproximadamente 50 mi en una columna XK26, usando como regulador A, TRIS, 50 mM, pH 7.5, y como regulador B, TRIS, 50 mM + NaCl , 1 M, pH 7.5. Las fracciones de la columna se reunieron sobre la base del cromatograma (absorción a 280 y 254 nm) y el análisis de SDS-PAGE. Las fracciones reunidas se cambiaron de regulador, a a-acetato, 50 mM, pH 5.5, y se concentraron usando filtros PES de 5kDa, 250 mi, Vivacell.
El peso molecular, estimado a partir de SDS-PAGE, fue de aproximadamente 20 kDa, y la pureza fue de >95%.
Purificación de la proteína P244A7 GH24 El sobrenadante de la fermentación con la lisozima se filtró a través de un sándwich de cuatro filtros de microfibra de vidrio Whatman (2.7, 1.6, 1.2 y 0.7 micrómetros) y luego a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0.22 ym. Se ajustó el pH a 4.5 con ácido acético al 10%. Después del ajuste del pH, la solución se tornó algo turbia, y esta turbiedad se eliminó mediante la filtración a través de un filtro superior Fast PES Bottle con un corte de 0.22 µp?.
Después del tratamiento previo, se purificaron aproximadamente 970 mi de la solución que contenía la lisozima, mediante la cromatografía en SP Sepharose, aproximadamente 50 mi en una columna XK26, usando como regulador A, a-acetato, 50 mM, pH 4.5, y como regulador B, a-acetato, 50 mM, + NaCl, 1 M, pH 4.5. Las fracciones de la columna se reunieron sobre la base del cromatograma (absorción a 280 y 254 nm) y el análisis de SDS-PAGE. Las fracciones reunidas se cambiaron de regulador, a Na-acetato, 50 mM, pH 5.5, y se concentraron usando filtros centrífugos Amicon con un corte de 10 kDa.
El peso molecular, estimado a partir de SDS-PAGE, fue de aproximadamente 20 kDa, y la pureza fue de >90%.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (27)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un polipéptido aislado que tiene actividad de lisozima, caracterizado porque es seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que tiene por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 6; (b) un polipéptido que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2 ; (c) un polipéptido que tiene por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto al polipéptido maduro de SEC . ID. NRO. : 4 ; (d) un polipéptido codificado por un polinucleotido que tiene por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 1; (e) un polipéptido codificado por un polinucleotido que tiene por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 3; (f) un polipéptido codificado por un polinucleotido que tiene por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99% o 100% de identidad de secuencia con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 5; (g) un polipéptido codificado por un polinucleotido que híbrida en condiciones de media-alta rigurosidad con la secuencia codificadora del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO . : 1, SEC. ID. NRO. : 3 o SEC. ID. NRO . : 5, o SU complemento de longitud completa; (h) una variante del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2, SEC. ID. NRO.: 4 o SEC. ID. NRO.: 6, que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (por ejemplo, varias) posiciones; y (i) un fragmento del polipéptido de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) o (h) que tiene actividad de lisozima.
2. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es seleccionado entre polipéptidos que comprenden o consisten en SEC. ID. NRO.: 2, SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO. : 6 o el polipéptido maduro de SEC. ID. NRO.: 2, SEC. ID. NRO.: 4 o SEC. ID. NRO.: 6.
3. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el polipéptido maduro se selecciona entre los aminoácidos 20 a 264 de SEC. ID. NRO.: 2, los aminoácidos 21 a 186 de SEC. ID. NRO.: 4 o los aminoácidos 20 a 176 de SEC. ID. NRO.: 6.
4. El polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque es una variante del polipéptido maduro de SEC. ID. NRO. : 2, SEC. ID. NRO. : 4 o SEC. ID. NRO. : 6 que comprende una sustitución, supresión y/o inserción en una o más (varias) posiciones.
5. Una composición caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
6. La composición de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una composición detergente.
7. La composición detergente de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque es para el lavado de ropa, el lavado de vajilla, o la limpieza de superficies duras .
8. La composición detergente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, caracterizada porque comprende una o más enzimas adicionales seleccionadas del grupo que comprende proteasas, amilasas, lipasas, cutinasas, celulasas, endoglucanasas , xiloglucanasas , pectinasas, pectina liasas, xantanasas, peroxidasas, haloperoxigenasas , catalasas y mananasas, o cualquiera de sus mezclas.
9. La composición detergente de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque comprende uno o más componentes seleccionados del grupo que comprende tensioactivos , mejoradores, hidrótropos, sistemas de blanqueo, polímeros, agentes matizantes de textiles, materiales coadyuvantes, dispersantes, agentes inhibidores de la transferencia de tinturas, agentes blanqueadores fluorescentes, polímeros liberadores de suciedad y agentes contra el redepósito.
10. Una composición de alimentación animal caracterizada porque comprende el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
11. La composición de alimentación animal de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende una o más amilasas; fitasas; xilanasas; galactanasas ; alfa-galactosidasas ; proteasas, fosfolipasas , beta-glucanasas, o cualquiera de sus mezclas.
12. Un aditivo de alimentación animal caracterizado porque comprende : por lo menos un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y por lo menos una vitamina soluble en grasa; y/o por lo menos una vitamina soluble en agua; y/o por lo menos un oligoelemento.
13. El aditivo de alimentación animal de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque comprende una o más amilasas; fitasas; xilanasas; galactanasas; alfa-galactosidasas ; proteasas, fosfolipasas , beta-glucanasas, o cualquiera de sus mezclas .
14. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, como un inhibidor de la formación de biopelícula.
15. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en una composición dental.
16. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en una composición detergente .
17. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la alimentación animal .
18. El uso de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la descomposición de las paredes celulares de bacterias.
19. El polipéptido de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque se utiliza en un proceso para el aislamiento de ADN de paredes celulares.
20. Un método de aislamiento de ADN de bacterias, caracterizado porque comprende: (a) el tratamiento de las paredes celulares aisladas con el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4; y (b) la recuperación del ADN bacteriano.
21. Un polinucleótido aislado caracterizado porque codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
22. Una construcción de ácido nucleico o un vector de expresión caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21, funcionalmente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un hospedero de expresión.
23. Una célula hospedera recombinada caracterizada porque comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 21 f ncionalmente ligado a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido .
24. Un método para la producción del polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de una célula, que, en su forma de tipo silvestre, produce el polipéptido, en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
25. Un método para la producción de un polipéptido que tiene actividad de lisozima, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 23 en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
26. Una planta, parte de planta o célula de planta transgénica transformada con un polinucleótido, caracterizada porque que codifica el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4.
27. Un método para la producción de un polipéptido que tiene actividad de lisozima, caracterizado porque comprende: (a) el cultivo de la planta o célula de planta transgénica de conformidad con la reivindicación 26 en condiciones que conducen a la producción del polipéptido; y (b) la recuperación del polipéptido.
MX2014006216A 2011-11-25 2012-11-23 Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotidos que los codifican. MX353710B (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11190690 2011-11-25
PCT/EP2012/073493 WO2013076259A2 (en) 2011-11-25 2012-11-23 Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
MX2014006216A true MX2014006216A (es) 2014-08-21
MX353710B MX353710B (es) 2018-01-25

Family

ID=47226164

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014006155A MX351916B (es) 2011-11-25 2012-11-23 Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotdos que los codifican.
MX2014006216A MX353710B (es) 2011-11-25 2012-11-23 Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotidos que los codifican.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MX2014006155A MX351916B (es) 2011-11-25 2012-11-23 Polipeptidos que tienen actividad de lisozima y polinucleotdos que los codifican.

Country Status (18)

Country Link
US (7) US9701952B2 (es)
EP (2) EP2782592B1 (es)
JP (1) JP6105615B2 (es)
CN (2) CN103957929B (es)
AR (2) AR088976A1 (es)
AU (1) AU2012342456B2 (es)
BR (2) BR112014012160B1 (es)
CA (1) CA2856593C (es)
CL (1) CL2014001317A1 (es)
DK (1) DK2782592T3 (es)
ES (2) ES2631605T3 (es)
IN (1) IN2014CN04586A (es)
MX (2) MX351916B (es)
PE (1) PE20151745A1 (es)
PL (1) PL2782592T3 (es)
RU (1) RU2619051C2 (es)
WO (2) WO2013076253A1 (es)
ZA (1) ZA201403761B (es)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2782592B1 (en) 2011-11-25 2017-03-15 Novozymes A/S Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same
JP6591998B2 (ja) * 2014-03-28 2019-10-16 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 低ｐＨでのタンパク質結晶の再可溶化
US20160030528A1 (en) * 2014-07-01 2016-02-04 Vanderbilt University Antimicrobial muramidase
WO2016030472A1 (en) 2014-08-28 2016-03-03 Novozymes A/S Solubilization of msw with blend enzymes
WO2017000922A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Novozymes A/S Animal feed compositions and uses thereof
CN107809912B (zh) * 2015-07-02 2022-07-15 诺维信公司 动物饲料组合物及其用途
WO2017001703A1 (en) 2015-07-02 2017-01-05 Novozymes A/S Methods of improving animal performance
EP3361882A1 (en) * 2015-10-13 2018-08-22 DSM IP Assets B.V. Feed additives for aquatic animals comprising essential oils and lysozyme
JP6154091B1 (ja) * 2015-12-02 2017-06-28 日清オイリオグループ株式会社 被覆用油脂組成物
WO2017140807A1 (en) 2016-02-16 2017-08-24 Monaghan Mushrooms Group Fungal polypeptides having lysozyme activity
US11130800B2 (en) 2016-05-20 2021-09-28 Novobind Livestock Therapeutics Inc. Antibodies against microorganisms and uses thereof
CN106046173B (zh) * 2016-06-07 2019-05-10 江南大学 一种n端融合多聚六肽提高猪溶菌酶抗菌性能的方法
CN105861468B (zh) * 2016-06-07 2019-12-06 江南大学 一种n端融合hlh功能域提高猪溶菌酶抗菌性能的方法
CN106701373A (zh) * 2016-12-11 2017-05-24 深圳市美益洁生物科技有限公司 茶具生物酶除菌清洗剂及其制备方法和应用
BR112019012802A2 (pt) 2016-12-21 2019-12-03 Novozymes As polipeptídeo gh25 isolado, métodos para hidrolisar peptidoglicano em paredes celulares bacterianas, para aumentar a digestibilidade de peptidoglicanos em ração animal, para produzir o polipeptídeo, para aperfeiçoar a saúde intestinal em um animal e para promover a eliminação de células de lactobacillus johnsonii mortas, aditivo de ração animal, ração animal, composição, polinucleotídeo, célula hospedeira recombinante, uso do polipeptídeo, e, aditivo zootécnico para uso em ração
WO2018113743A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Novozymes A/S Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof
AU2018205999A1 (en) 2017-01-04 2019-06-27 Novozymes A/S Microbial lysozyme for use in the treatment of irritable bowel syndrome or inflammatory bowel disease
EP3606936B1 (en) * 2017-04-03 2021-10-20 Novozymes A/S Recovery process
CA3058622A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Novozymes A/S Animal chew toy with dental care composition
WO2018206001A1 (en) * 2017-05-12 2018-11-15 Novozymes A/S Polypeptides having lysozyme activity, polynucleotides encoding same and uses and compositions thereof
WO2019036654A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 President And Fellows Of Harvard College NANOSUPPORTS FOR THE ADMINISTRATION OF ACTIVE PRINCIPLES
WO2019050902A1 (en) * 2017-09-05 2019-03-14 Adaptive Phage Therapeutics, Inc. METHODS OF DETERMINING THE SENSITIVITY PROFILE OF A BACTERIAL STRAIN TO A THERAPEUTIC COMPOSITION
CN108251440B (zh) * 2017-12-18 2021-04-13 宁波大学 缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用
BR112020012498A2 (pt) 2017-12-20 2020-11-24 Dsm Ip Assets B.V. composições de ração animal e usos das mesmas
US20200305465A1 (en) 2017-12-20 2020-10-01 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions comprising muramidase and uses thereof
CN110115776A (zh) * 2018-02-07 2019-08-13 沈阳药科大学 一种具有抗菌活性的可吸收淀粉微球止血粉及其应用
BR112020018166A2 (pt) 2018-03-05 2021-02-02 Novozymes A/S composição de ração para ruminantes compreendendo uma muramidase
BR112020021365A2 (pt) 2018-04-25 2021-01-19 Novozymes A/S Ração animal, método para melhoria do fator de eficiência de produção europeu, ganho de peso corporal e/ou razão de conversão de ração de um animal monogástrico, uso de pelo menos um probiótico em combinação com um polipeptídeo tendo atividade de muramidase em uma composição de ração, e, composição de ração ou uma composição de pré-mistura, ou um aditivo de ração para animais.
AU2019339736A1 (en) 2018-09-11 2021-03-04 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed composition and use thereof
MX2021002748A (es) 2018-09-11 2021-05-28 Dsm Ip Assets Bv Composiciones de alimento animal y usos de las mismas.
BR112021004464A8 (pt) 2018-09-11 2021-06-01 Dsm Ip Assets Bv composição de ração animal e uso da mesma
CN112469825A (zh) * 2018-09-11 2021-03-09 诺维信公司 用于饲料组合物的稳定颗粒
CN112654256A (zh) 2018-09-11 2021-04-13 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 动物饲料组合物及其用途
CA3108944A1 (en) 2018-09-11 2020-03-19 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed composition and use thereof
MX2021003045A (es) 2018-09-17 2021-08-11 Dsm Ip Assets Bv Composiciones de alimento animal y usos de las mismas.
US20210292725A1 (en) 2018-09-17 2021-09-23 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
BR112021004817A2 (pt) 2018-09-17 2021-06-08 Dsm Ip Assets B.V. composições de ração animal e usos das mesmas
EP3852547A1 (en) 2018-09-17 2021-07-28 DSM IP Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
WO2020058225A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
WO2020099490A1 (en) 2018-11-14 2020-05-22 Novozymes A/S Oral care composition comprising enzymes
CN113316641A (zh) * 2018-12-21 2021-08-27 诺维信公司 串联蛋白表达
EP3898962A2 (en) * 2018-12-21 2021-10-27 Novozymes A/S Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same
GB201901364D0 (en) * 2019-01-31 2019-03-20 Axitan Ltd Endolysins
CN110501983B (zh) * 2019-07-31 2021-03-26 农业农村部南京农业机械化研究所 基于批次式包衣机的专家控制系统及控制方法
US20220307036A1 (en) * 2019-08-06 2022-09-29 Novozymes A/S Fusion proteins for improved enzyme expression
EP4045642A1 (en) * 2019-10-17 2022-08-24 DSM IP Assets B.V. Animal feed compositions and uses thereof
CN115335530A (zh) 2020-04-03 2022-11-11 诺维信公司 深层发酵方法
CN111471621B (zh) * 2020-04-20 2021-09-28 河北萌帮水溶肥料股份有限公司 水域微小杆菌mb338及其应用
CN111398537A (zh) * 2020-04-25 2020-07-10 燕京啤酒(曲阜三孔)有限责任公司 一种成品啤酒泡持指标的预测和调控方法
CN111378635B (zh) * 2020-05-29 2020-10-16 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种共表达溶菌酶和木聚糖酶的方法、及制备作为替代抗生素的饲料添加剂的方法
EP4199897A2 (en) 2020-08-24 2023-06-28 Novozymes A/S Oral care composition comprising a fructanase
US20240034960A1 (en) 2020-08-27 2024-02-01 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
US20240034961A1 (en) * 2020-12-16 2024-02-01 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2022194728A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Dsm Ip Assets B.V. Animal feed composition and use thereof
CN113151228A (zh) * 2021-03-16 2021-07-23 李明达 一种病毒消杀用的复合酶制剂及其制备方法与应用
EP4312537A1 (en) 2021-04-01 2024-02-07 Sterilex LLC Quat-free powdered disinfectant/sanitizer
CN113769148B (zh) * 2021-09-27 2023-03-21 中国科学院微生物研究所 PslG蛋白在隐形眼镜护理液中的应用
WO2023110957A1 (en) 2021-12-15 2023-06-22 Dsm Ip Assets B.V. Methods and uses for improving egg production and egg quality involving administering feed comprising muramidase (ec 3.2.1.17)
WO2023131629A1 (en) 2022-01-06 2023-07-13 Novozymes A/S Animal feed composition and use thereof
WO2023168234A1 (en) * 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
CN115094051B (zh) * 2022-04-08 2023-09-22 福建福大百特生物科技有限公司 一种来源于海科贝特氏菌的重组溶菌酶及其制备方法和应用
WO2023225459A2 (en) 2022-05-14 2023-11-23 Novozymes A/S Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections

Family Cites Families (131)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (es) 1969-05-29 1972-11-22
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
US4355022A (en) 1981-07-01 1982-10-19 Interon, Inc. Method of dental treatment
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
JPH0697997B2 (ja) 1985-08-09 1994-12-07 ギスト ブロカデス ナ−ムロ−ゼ フエンノ−トチヤツプ 新規の酵素的洗浄剤添加物
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
ATE110768T1 (de) 1986-08-29 1994-09-15 Novo Nordisk As Enzymhaltiger reinigungsmittelzusatz.
US5389536A (en) 1986-11-19 1995-02-14 Genencor, Inc. Lipase from Pseudomonas mendocina having cutinase activity
ES2076939T3 (es) 1987-08-28 1995-11-16 Novo Nordisk As Lipasa recombinante de humicola y procedimiento para la produccion de lipasas recombinantes de humicola.
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
JP2624859B2 (ja) 1988-01-07 1997-06-25 ノボ‐ノルディスク アクティーゼルスカブ 酵素洗剤
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US5648263A (en) 1988-03-24 1997-07-15 Novo Nordisk A/S Methods for reducing the harshness of a cotton-containing fabric
JP2728531B2 (ja) 1988-03-24 1998-03-18 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ セルラーゼ調製品
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5376288A (en) * 1989-06-21 1994-12-27 Noro Nordisk A/S Detergent additive granulate and detergent
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
DK0425016T3 (da) 1989-10-27 1996-05-06 Genencor Int Antimikrobiel fremgangsmåde og formulering med anvendelse af type II endoglycosidase og antimikrobielt middel
US5041236A (en) 1989-10-27 1991-08-20 The Procter & Gamble Company Antimicrobial methods and compositions employing certain lysozymes and endoglycosidases
IL97645A (en) 1990-03-23 1997-03-18 Gist Brocades Nv Production of enzymes in seeds and their use
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
KR100237148B1 (ko) 1990-05-09 2000-01-15 한센 핀 베네드 엔도글루칸아제 효소를 함유하는 셀룰라제 제조물
US6395966B1 (en) 1990-08-09 2002-05-28 Dekalb Genetics Corp. Fertile transgenic maize plants containing a gene encoding the pat protein
ATE169671T1 (de) 1990-09-13 1998-08-15 Novo Nordisk As Lipase-varianten
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
ES2174820T3 (es) 1991-01-16 2002-11-16 Procter & Gamble Composiciones detergentes compactas con celulasa de alta actividad.
DK0583339T3 (da) 1991-05-01 1999-04-19 Novo Nordisk As Stabiliserede enzymer og detergentsammensætninger
EP0624154B1 (en) 1991-12-13 1999-09-08 The Procter & Gamble Company Acylated citrate esters as peracid precursors
US5595892A (en) 1991-12-20 1997-01-21 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. Process for preparation of purified xanthan gum
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
DE69334295D1 (de) 1992-07-23 2009-11-12 Novo Nordisk As MUTIERTE -g(a)-AMYLASE, WASCHMITTEL UND GESCHIRRSPÜLMITTEL
JP3681750B2 (ja) 1992-10-06 2005-08-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ セルラーゼ変異体
JP3741734B2 (ja) 1994-06-30 2006-02-01 信越化学工業株式会社 キサンタンガムの回収精製方法
NZ262623A (en) 1993-02-11 1998-03-25 Genencor Int Alpha-amylase mutant, dna and vectors encoding such and detergent compositions thereof
JP3618748B2 (ja) 1993-04-27 2005-02-09 ジェネンコー インターナショナル インコーポレイテッド 洗剤に使用する新しいリパーゼ変異体
FR2704860B1 (fr) 1993-05-05 1995-07-13 Pasteur Institut Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire.
DK52393D0 (es) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
CA2173946A1 (en) 1993-10-13 1995-04-20 Anders Hjelholt Pedersen H2o2-stable peroxidase variants
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
WO1995022615A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Novo Nordisk A/S A method of preparing a variant of a lipolytic enzyme
EP1632557B1 (en) 1994-03-08 2011-02-23 Novozymes A/S Novel alkaline cellulases
DE69528524T2 (de) 1994-05-04 2003-06-26 Genencor Int Lipasen mit verbesserten tensiostabilitaet
CN1192108C (zh) 1994-06-03 2005-03-09 诺沃奇梅兹生物技术有限公司 纯化的毁丝霉属漆酶及编码该酶的核酸
WO1995035381A1 (en) 1994-06-20 1995-12-28 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
AU2884695A (en) 1994-06-23 1996-01-19 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
WO1996000787A1 (en) 1994-06-30 1996-01-11 Novo Nordisk Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
EP1995303A3 (en) 1994-10-06 2008-12-31 Novozymes A/S Enzyme preparation with endoglucanase activity
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
WO1996013580A1 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Novo Nordisk A/S An enzyme with lipolytic activity
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
CN101955921A (zh) 1995-03-17 2011-01-26 诺沃奇梅兹有限公司 新的内切葡聚糖酶
JP3741751B2 (ja) 1995-07-11 2006-02-01 信越化学工業株式会社 キサンタンガムの改質方法
CN1193346A (zh) 1995-07-14 1998-09-16 诺沃挪第克公司 一种具有脂解活性的修饰酶
DE19528059A1 (de) 1995-07-31 1997-02-06 Bayer Ag Wasch- und Reinigungsmittel mit Iminodisuccinaten
AU6655196A (en) 1995-08-11 1997-03-12 Novo Nordisk A/S Novel lipolytic enzymes
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
AU3938997A (en) 1996-08-26 1998-03-19 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
DE69735767T2 (de) 1996-09-17 2007-04-05 Novozymes A/S Cellulasevarianten
DE69718351T2 (de) 1996-10-08 2003-11-20 Novozymes As Diaminobenzoesäure derivate als farbstoffvorläufer
WO1998017767A1 (en) 1996-10-18 1998-04-30 The Procter & Gamble Company Detergent compositions
EP0948610B1 (en) 1996-11-04 2011-05-25 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions
CA2270180C (en) 1996-11-04 2011-01-11 Novo Nordisk A/S Subtilase variants and compositions
US6159731A (en) 1997-02-12 2000-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis
JP2997800B2 (ja) * 1997-12-01 2000-01-11 農林水産省食品総合研究所長 細胞壁溶解酵素遺伝子、該遺伝子を含むベクター及び形質転換体
US5955310A (en) 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
AU753232B2 (en) 1998-10-15 2002-10-10 Dsm N.V. Antimicrobial enzymes in animal feed
DE69932345T2 (de) 1998-10-26 2007-07-19 Novozymes A/S Erstellung und durchmusterung von interessierenden dna-banken in zellen von filamentösen pilzen
EP1137761B1 (en) 1998-12-04 2007-08-01 Novozymes A/S Cutinase variants
EP2278016B1 (en) 1999-03-22 2012-09-26 Novozymes Inc. Promoter sequences derived from Fusarium Venenatum and uses thereof
US6939702B1 (en) 1999-03-31 2005-09-06 Novozymes A/S Lipase variant
US6710023B1 (en) * 1999-04-19 2004-03-23 Procter & Gamble Company Dishwashing detergent compositions containing organic polyamines
CA2408406C (en) 2000-06-02 2014-07-29 Novozymes A/S Cutinase variants
AU2001269939A1 (en) 2000-06-19 2002-01-02 Novozymes Biotech, Inc. Methods for eliminating the formation of biofilm
US20020104126A1 (en) * 2000-10-18 2002-08-01 Pogue Gregory P. Production of bovine lysozyme by plant viral vectors
AU2002223504A1 (en) 2000-11-17 2002-05-27 Novozymes A/S Heterologous expression of taxanes
US7151204B2 (en) 2001-01-09 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof
EP1367908B1 (en) 2001-02-14 2014-04-09 Ventria Bioscience Expression of human milk proteins in transgenic plants
RU2306774C2 (ru) * 2001-07-13 2007-09-27 Даниско А/С Композиция, обладающая бактериостатической и бактерицидной активностью против спор бактерий и вегетативных клеток, и способ обработки ею продуктов питания
GB0127036D0 (en) 2001-11-09 2002-01-02 Unilever Plc Polymers for laundry applications
WO2003070956A1 (en) 2002-02-19 2003-08-28 Novozymes A/S Expression cloning methods in filamentous fungi
DE10237317B4 (de) 2002-08-15 2010-04-08 3M Espe Ag Enzymhaltige Zusammensetzung, Verfahren zu deren Herstellung und deren Verwendung
CA2404356A1 (en) 2002-09-18 2004-03-18 Canadian Inovatech Inc. Gram-positive antibacterial composition and method for use
GB2379166A (en) 2002-10-22 2003-03-05 Dsm Nv Animal feed
RU2232818C1 (ru) 2002-11-06 2004-07-20 Федеральное государственное учреждение Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Способ выделения хромосомной днк из бактериальных клеток возбудителя чумы yersinia pestis
GB0314210D0 (en) 2003-06-18 2003-07-23 Unilever Plc Laundry treatment compositions
GB0314211D0 (en) 2003-06-18 2003-07-23 Unilever Plc Laundry treatment compositions
BRPI0411568A (pt) 2003-06-18 2006-08-01 Unilever Nv composição de tratamento para lavagem de roupa
WO2005042735A1 (en) 2003-10-30 2005-05-12 Novozymes A/S Carbohydrate-binding modules of a new family
DK2664670T3 (da) 2003-12-03 2015-07-27 Danisco Us Inc Perhydrolase
CA2553731A1 (en) 2004-01-21 2005-08-04 Novozymes A/S Production of a monoclonal antibody in a heterokaryon fungus or in a fungal host cell
NZ549198A (en) * 2004-02-25 2009-05-31 Novozymes As Fungal cell wall degrading lysozyme for use as an inhibitor of dental biofilms
JP2006182662A (ja) 2004-12-27 2006-07-13 Lion Corp 歯磨剤組成物
CN101160385B (zh) 2005-04-15 2011-11-16 巴斯福股份公司 具有内部聚氧化乙烯嵌段和外部聚氧化丙烯嵌段的两亲水溶性烷氧基化聚亚烷基亚胺
MX292760B (es) 2005-04-15 2011-11-28 Procter & Gamble Composiciones detergentes liquidas para lavanderia con polimeros de polietilenimina modificada y enzima lipasa.
CA2605451A1 (en) 2005-05-31 2006-12-07 The Procter & Gamble Company Polymer-containing detergent compositions and their use
US8518675B2 (en) 2005-12-13 2013-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company Production of peracids using an enzyme having perhydrolysis activity
RU2479627C2 (ru) 2006-01-23 2013-04-20 Дзе Проктер Энд Гэмбл Компани Композиции моющих средств
ES2629332T3 (es) 2006-01-23 2017-08-08 Novozymes A/S Variantes de lipasa
EP2248882A1 (en) 2006-01-23 2010-11-10 The Procter and Gamble Company Enzyme and fabric hueing agent containing compositions
BRPI0710440A2 (pt) 2006-01-23 2011-08-16 Procter & Gamble composições contendo enzima e fotobranqueador
CA2635946C (en) 2006-01-23 2012-09-18 The Procter & Gamble Company A composition comprising a lipase and a bleach catalyst
EP1979456A2 (en) 2006-01-23 2008-10-15 The Procter & Gamble Company A composition comprising a lipase and a bleach catalyst
AR059156A1 (es) 2006-01-23 2008-03-12 Procter & Gamble Composiciones detergentes
US8076112B2 (en) 2006-03-22 2011-12-13 Novozymes A/S Fermentation processes
CA2653880C (en) 2006-05-31 2014-08-05 Basf Se Amphiphilic graft polymers based on polyalkylene oxides and vinyl esters
DE602006020852D1 (de) 2006-07-07 2011-05-05 Procter & Gamble Waschmittelzusammensetzungen
KR20100016416A (ko) 2007-04-10 2010-02-12 새인트 시메온 엘디에이 리소자임 및 ｃ-1/ｃ-4 다당류를 함유하는 조성물, 및 구강 관리, 미용학 및 피부과, 피임, 비뇨기과 및 부인과에서의 이의 용도
CN104673532A (zh) 2008-01-04 2015-06-03 宝洁公司 包含糖基水解酶的衣物洗涤剂组合物
WO2009102755A1 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Danisco Us Inc., Genencor Division Enzyme with microbial lysis activity from trichoderma reesei
US20090209447A1 (en) 2008-02-15 2009-08-20 Michelle Meek Cleaning compositions
US7919298B2 (en) 2008-02-29 2011-04-05 Novozymes A/S Polypeptides having lipase activity and polynucleotides encoding same
EP2367923A2 (en) 2008-12-01 2011-09-28 Danisco US Inc. Enzymes with lipase activity
WO2010100028A2 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Huntsman Advanced Materials (Switzerland) Gmbh Enzymatic textile bleach-whitening methods
EP2408805A2 (en) 2009-03-18 2012-01-25 Danisco US Inc. Fungal cutinase from magnaporthe grisea
BRPI1013425A2 (pt) 2009-03-23 2015-09-01 Danisco Us Inc Aciltransferases relacionadas com cal a e métodos de uso das mesmas
WO2010115156A2 (en) * 2009-04-03 2010-10-07 Synthetic Genomics, Inc. Endophytic fungus and uses therefor
JP2013515139A (ja) 2009-12-21 2013-05-02 ダニスコ・ユーエス・インク サーモビフィダ・フスカのリパーゼを含む洗剤組成物、及びその使用方法
US8741609B2 (en) 2009-12-21 2014-06-03 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing Geobacillus stearothermophilus lipase and methods of use thereof
US20120258900A1 (en) 2009-12-21 2012-10-11 Danisco Us Inc. Detergent compositions containing bacillus subtilis lipase and methods of use thereof
EP2539447B1 (en) * 2010-02-25 2017-07-26 Novozymes A/S Variants of a lysozyme and polynucleotides encoding same
AR081423A1 (es) 2010-05-28 2012-08-29 Danisco Us Inc Composiciones detergentes con contenido de lipasa de streptomyces griseus y metodos para utilizarlas
MX2013011617A (es) 2011-04-08 2013-11-21 Danisco Us Inc Composiciones.
EP2782592B1 (en) 2011-11-25 2017-03-15 Novozymes A/S Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same

Also Published As

Publication number Publication date
CL2014001317A1 (es) 2014-11-07
EP2782592A1 (en) 2014-10-01
EP2782593A2 (en) 2014-10-01
MX353710B (es) 2018-01-25
CN103957929A (zh) 2014-07-30
ES2624531T3 (es) 2017-07-14
US10829750B2 (en) 2020-11-10
EP2782593B1 (en) 2017-04-26
RU2619051C2 (ru) 2017-05-11
US20190153415A1 (en) 2019-05-23
JP6105615B2 (ja) 2017-03-29
CA2856593C (en) 2022-06-07
WO2013076259A2 (en) 2013-05-30
US20200399625A1 (en) 2020-12-24
AR088976A1 (es) 2014-07-23
US20140380527A1 (en) 2014-12-25
US10039300B2 (en) 2018-08-07
BR112014012170A2 (pt) 2020-06-23
AR113177A2 (es) 2020-02-05
US20170223986A1 (en) 2017-08-10
CA2856593A1 (en) 2013-05-30
RU2014125559A (ru) 2015-12-27
CN107090445A (zh) 2017-08-25
AU2012342456A1 (en) 2014-05-22
US10119130B2 (en) 2018-11-06
US20170327808A1 (en) 2017-11-16
IN2014CN04586A (es) 2015-09-18
MX351916B (es) 2017-11-03
WO2013076253A1 (en) 2013-05-30
BR112014012160A2 (pt) 2020-06-23
MX2014006155A (es) 2014-08-27
PL2782592T3 (pl) 2017-09-29
US10829751B2 (en) 2020-11-10
US20140325711A1 (en) 2014-10-30
EP2782592B1 (en) 2017-03-15
DK2782592T3 (en) 2017-06-19
US9701952B2 (en) 2017-07-11
JP2015506667A (ja) 2015-03-05
CN103957929B (zh) 2017-06-30
ZA201403761B (en) 2015-12-23
US20180298365A1 (en) 2018-10-18
WO2013076259A3 (en) 2013-07-25
AU2012342456B2 (en) 2016-11-24
US9663775B2 (en) 2017-05-30
BR112014012160B1 (pt) 2022-08-30
PE20151745A1 (es) 2015-12-20
ES2631605T3 (es) 2017-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10829750B2 (en) Polypeptides having lysozyme activity and polynucleotides encoding same
MX2014008764A (es) Uso de polipeptidos que tienen actividad proteasa en alimentos para animales y detergentes.
EP2751266B1 (en) Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
US20150023945A1 (en) Lysozymes
EP2934177B1 (en) Polypeptides having protease activiy and polynucleotides encoding same

Legal Events

Date Code Title Description
FG Grant or registration