PT985042E

PT985042E - Enzimas proteases para limpeza difícil e/ou redução de manchas e filmes e composições incluindo as mesmas

Info

Publication number: PT985042E
Application number: PT98921676T
Authority: PT
Inventors: Saroj Rai Nmn; Paul Elliott Correa; Yong Zhu; Thomas Paul Graycar; Richard Ray Bott
Original assignee: Genecor Int Inc
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-02
Publication date: 2007-01-31
Also published as: DK0985042T3; US6369011B1; CA2293695C; EP0985042A1; CA2293695A1; JP2002502256A; DE69835814D1; ES2273417T3; DE69835814T2; ATE338823T1; WO1998055634A1; JP4031055B2; EP0985042B1

Description

ΡΕ0985042 1 DESCRIÇÃO "ENZIMAS PROTEASES PARA LIMPEZA PROFUNDA E/OU REDUÇÃO DE MANCHAS E PELÍCULAS E COMPOSIÇÕES INCLUINDO AS MESMAS"

CAMPO DO INVENTO O presente invento está relacionado com enzimas proteases para a limpeza profunda e/ou redução de manchas e películas em várias composições e métodos para a sua utilização, mais particularmente com enzimas proteases que são variantes de carbonil hidrolase.

FUNDAMENTO DO INVENTO Vários tipos de enzimas são usados desde há muito em detergentes de lavandarias para ajudar a remover determinados corantes dos tecidos. Cada uma das classes de enzima (amilase, protease, etc.), de um modo geral, catalisa uma reacção química diferente. Por exemplo, as enzimas proteases são conhecidas pela sua capacidade para hidrolisar (partir um composto em dois ou mais compostos mais simples) outras proteínas. Esta capacidade tem sido aproveitada através da incorporação de enzimas proteases, naturais ou manipuladas, em composições de detergentes de lavandaria.

Nos últimos anos a utilização de enzimas também ΡΕ0985042 tem sido investigada para usar em composições de lavagem de loiça automática. Infelizmente, muitas enzimas, especialmente as enzimas proteases, não funcionam bem no ambiente da lavagem. Especialmente, a estabilidade térmica, estabilidade ao pH, estabilidade oxidativa e especificidade de substrato necessitam de ser optimizadas para assegurar um desempenho satisfatório.

Para optimizar as caracteristicas da enzima protease, uma alteração na sequência de aminoácidos é frequentemente empregue. Uma alteração na sequência de aminoácidos pode alterar as propriedades da enzima em grau variável dependendo da localização, natureza e/ou grandeza da alteração na sequência de aminoácidos. Foram feitas várias tentativas para alterar a sequência de aminoácidos das enzimas proteases na expectativa de modificar as suas propriedades, com o objectivo global de aumentar a eficácia das proteases para fins de limpeza, como seja no ambiente de lavagem.

Ainda, o interesse dos consumidores nas composições para lavagem automática de loiça que requerem limpeza difícil de alimentos está a aumentar. Produtos lácteos cozinhados e ovos têm sido difíceis de remover através da lavagem de loiça automática. Ainda, as manchas e as películas no vidro são um problema vulgar na lavagem automática de loiça. Ainda, os consumidores querem agora menos lavagem manual ou pré-lavagem da loiça e maior capacidade de limpeza através da máquina de lavar loiça. 3 ΡΕ0985042

Assim, mantém-se a necessidade de composições que possam oferecer limpeza profunda e/ou limpeza com redução de manchas e películas sem a formação de manchas/películas. Mais particularmente, mantém-se a necessidade de composições de lavagem automática de loiça que possam efectuar limpeza profunda de alimentos e reduzir a formação de manchas/películas através de enzimas proteases projectadas para introduzir tais benefícios.

TÉCNICA ANTERIOR

Os documentos que se seguem contêm informação que podem ou não ser relevantes para o presente invento: WO 95/10615 de Genencor International, Inc.; WO 89/06270 de Novo Nordisk A/S; Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 4th. Ed., Vol. 9, Wiley 1994, páginas 567-620, intitulado "Enzyme Applications-Industrial",

Nielsen et al. e as referências aqui apresentadas. WO 95/10591 e WO 95/10592 de Procter & Gamble Company. WO 95/27671 (Genentech, Inc.) descreve variantes de subtilisina como proteínas de limpeza de fusão com ligandos substratos básicos.

SUMÁRIO DO INVENTO

Esta necessidade é satisfeita através do presente invento, pelo que são proporcionadas composições tendo uma enzima protease capaz de limpar em profundidade alimentos e 4 ΡΕ0985042 reduzir a formação de manchas/películas. A enzima protease preferida é uma variante carbonil hidrolase tendo uma sequência de aminoácidos não encontrada na natureza. A protease é manipulada para produzir limpeza profunda e/ou redução de manchas e filmes e formação reduzida e manchas e películas ao dotar a protease com especificidade do tipo tripsina. Assim, a protease é altamente eficaz nas sujidades de lacticínios, tais como leite e queijo, e em sujidades de gema de ovo e reduz significativamente a formação de manchas e películas que tais sujidades podem causar no processo de lavagem de loiça automática. A protease é modificada por substituição de uma pluralidade de resíduos de aminoácidos de uma carbonil hidrolase percursora com diferentes aminoácidos. Ainda, a protease preferida é manipulada para ter um nível mais elevado de estabilidade na presença de branqueadores. Ainda, as enzimas do presente invento podem proporcionar uma melhor remoção de sujidade também em lavandarias.

De acordo com uma primeira forma de realização do presente invento, é proporcionada uma composição de limpeza como descrito na reivindicação 1. A composição de limpeza compreende: (a) uma quantidade eficaz de uma enzima protease que é uma variante de subtilisina tendo os aminoácidos 210I/76D/103A/104I/156E/166D nas posições equivalentes às posições da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens tendo a sequência de aminoácidos descrita na Figura 3 (SEQ ID NO:2) . 5 ΡΕ0985042 (b) um ou mais materiais aditivos de limpeza compatíveis com a enzima protease. 0 presente invento também está relacionado com métodos de limpeza de objectos necessitados de limpeza pelo contacto do objecto com uma enzima protease que é uma variante de carbonil hidrolase como aqui descrito. 0 invento ainda inclui um método para a limpeza de tecidos compreendendo o contacto, de preferência com agitação, de tecidos com uma solução aquosa contendo a enzima protease. 0 método pode ser realizado a temperaturas abaixo de 60°C mas, certamente, é muito eficaz às temperaturas das lavandarias incluindo a de fervura. 0 presente invento também está relacionado com um método para a limpeza de loiça através do contacto de loiça necessitada de limpeza com uma enzima protease como aqui descrito. Os métodos do presente invento também incluem métodos para a higiene pessoal, os métodos compreendendo o contacto da parte do corpo humano ou animal necessitado de limpeza com uma enzima protease como aqui descrito.

Assim, o presente invento proporciona uma composição de limpeza tendo uma enzima protease subtilisina capaz de limpar em profundidade e/ou reduzir manchas e películas, particularmente numa composição para lavagem de loiça para limpeza de sujidade profunda ou de alimentos.

Todas as percentagens, razões e proporções aqui 6 ΡΕ0985042 apresentadas são numa base por peso a menos que de outra forma seja indicado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figs. IA e 1B descrevem a sequência de DNA e de aminoácidos da subtilisina derivada de Bacillus lentus (Seq. ID N°6 e 7) . A proteina subtilisina madura é codificada pelos codões que começam no codão GCG (334-336) correspondendo a Ala.

Figs. 2A e 2B descrevem a sequência de aminoácidos de quatro subtilisinas. A linha de topo representa a sequência de aminoácidos de subtilisina derivada de Bacillus amyloliquefaciens (igualmente por vezes referida como subtilisina BPN') (Seq. ID N°2). A segunda linha descreve a sequência de aminoácidos de subtilisina derivada de Bacillus subtilis (Seq. ID N° 3) . A terceira linha descreve a sequência de aminoácidos de subtilisina de B. licheniformis (Seq. ID N° 4) . A quarta linha descreve a sequência de aminoácidos de subtilisina derivada de Bacillus lentus (também referida como subtilisina 309 em PCT WO 89/06276) (Seq ID n° 5). O simbolo * significa a ausência de resíduos de aminoácidos específicos comparativamente com a subtilisina BPN'.

Figs. 3A-C descrevem o DNA e a sequência de aminoácidos da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens e um mapa de restrição parcial deste gene (Seq. ID N° 1). 7 ΡΕ0985042

Fig. 4 descreve os resíduos de aminoácidos conservados entre subtilisinas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens (BPN') e Bacillus lentus (selvagem).

Figs. 5A e 5B descrevem as sequências de DNA e de aminoácidos de uma forma de realização preferida do invento (P2101/S156E/S166D/N76D/S103A/V1041) (Seq. ID N° 8 e 9) . 0 DNA nesta figura foi modificado pelos métodos descritos para codificar aspartato nas posições 76 e 166, glutamato na posição 156, alanina na posição 103 e isoleucina nas posições 210 e 104. A proteína variante de subtilisina madura é codificada pelos codões começando no codão GCG (334-336) correspondendo a Ala.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

Enzimas proteases - O invento inclui enzimas proteases subtilisina que são variantes de carbonil hidro-lase não naturais tendo actividade proteolitica, estabilidade, especificidade de substrato, perfil de pH e/ou características de desempenho diferentes comparativamente com o percursor subtilisina carbonil hidrolase a partir da qual deriva a sequência de aminoácidos da variante. Conforme estabelecido anteriormente, as enzimas proteases subtilisina são projectadas para possuírem especificidade do tipo tripsina e, de preferência, também serem estáveis à presença de branqueadores. O precursor subtlisina carbonil hidrolase pode ser uma carbonil hidrolase natural ou uma ΡΕ0985042 hidrolase recombinante. Especificamente, tais variantes de subtilisina carbonil hidrolase possuem uma sequência de aminoácidos não encontrada na natureza, que deriva pela substituição de uma pluralidade de resíduos de aminoácidos de um precursor subtilisina carbonil hidrolase com diferentes aminoácidos. A pluralidade de resíduos de aminoácidos da enzima precursora corresponde às posições descritas abaixo em combinação com um ou mais dos seguintes resíduos: +33, +62, +67, +100, +101, +107, +128, +129, +130, +132, +135, +158, +164, +167, +170, +209, +215, +217, +218 e +222, onde a posição numerada corresponde à subtilisina natural de Bacillus amyloliquefaciens ou a resíduos de aminoácidos equivalentes noutras carbonil hidrolases ou subtilisinas, tais como subtilisina de Bacillus lentus.

Sequências de DNA variantes codificadoras de tais variantes de carbonil hidrolase ou subtilisina derivam de uma sequência de DNA precursora que codifica uma enzima natural ou recombinante. As sequências de DNA variantes são derivadas por modificação da sequência de DNA precursora para codificarem a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos específicos codificados pela sequência de DNA precursora. aminoácidos aqui identificados de amyloliquefaciens identificação de

Se bem que os resíduos de identificados para modificação sejam acordo com a numeração aplicável a B. (que se tornou o método convencional para 9 ΡΕ0985042 posições de resíduos em todas as subtilisinas) , uma sequência de DNA precursora preferida útil para o presente invento é a sequência de DNA de Bacillus lentus como se mostra na Fig. 1.

As enzimas proteases úteis neste caso incluem a substituição de qualquer um dos dezanove L-aminoácidos naturais nas posições de resíduos de aminoácidos designadas. Tais substituições podem ser feitas em qualquer subtilisina precursora (procariótica, eucariótica, mamífera, etc.). Ao longo deste pedido de patente é feita referência a vários aminoácidos pelos códigos comuns de uma e três letras. Tais códigos são identificados em Dale, M.W. (1989), Molecular Genetics of Bactéria, John Wiley & Sons, Ltd., Apêndice B.

De preferência, a substituição a ser feita para cada uma das posições de resíduos de aminoácidos identificadas inclui mas não está limitada a substituições na posição +210 incluindo I, V, L e A, substituições nas posições +33, +62, +76, +100, +101, +103, +104, +107, +128, +129, +130, +132, +135, +156, +158, +164, +166, +167, +170, +209, +215, +217 e +218 de D ou E, substituições na posição 76 incluindo D, Η, E, G, F, K, P e N, substituições na posição 103 incluindo Q, T, D, E, Y, K, G, R, E, G, F, K, P e N; substituições na posição 103, incluindo Q, T, D, E, Y, K, G, R e S; e substituições na posição 104 incluindo S, Y, I, L, Μ, A, W, D, T, G e V; e substituições na posição 222 incluindo S, C, A. Os aminoácidos especificamente prefe- ΡΕ0985042 10 ridos para serem substituídos em cada uma dessas posições estão descritos na Tabela I. Ainda que os aminoácidos específicos sejam apresentados na Tabela I, deverá ser entendido que qualquer aminoácido pode ser substituído nos resíduos identificados.

Tabela I

Resíduo de Aminoácido

Aminoácido preferido para ser substituído/inserido + 210 +33, +62, +100, +101, +107

I, V, L, A D, E + 128, + 129, + 130, + 135 + 156, + 158, + 164, + 166 + 167, + 170, + 209, + 215 + 217 < b +218

+ 76 D, H + 103 A, Q, T, D, E, Y, K, G, R + 104 I, Y, S, L, A, T, G + 222 S, c, A

As carbonil hidrolases são enzimas proteases que hidrolizam compostos contendo liqações

O

C-X em que X é oxiqénio ou azoto. Elas incluem carbonil hidrolases naturais e carbonil hidrolases recombinantes. Carbo- 11 ΡΕ0985042 nil hidrolases naturais incluem principalmente hidrolases, e.g., hidrolases de peptideos tais como subtilisinas ou metaloproteases. As hidrolases de peptideos incluem hidro-lase de α-aminoacilpeptídeos, hidrolase de peptidilamino-ácido, acilamino hidrolase, serina carboxipeptidase, me-talocarboxipeptidase, tiol proteinase, carboxilproteinase e metaloproteinase. Estão incluídas proteases serinicas, metaloproteases, tiol proteases e proteases ácidas, assim como endoproteases e exoproteases.

As subtilisinas são carbonil hidrolases bacteri-anas ou fúngicas que, de um modo geral, actuam de forma a clivar ligações peptídicas de proteínas ou peptideos. Como aqui é usado, "subtilisina" significa uma subtilisina natural ou uma subtilisina recombinante. Uma série de subtilisinas naturais é conhecida como sendo produzida e muitas vezes secretada por várias espécies microbianas. As sequências de aminoácidos dos membros desta série não são totalmente homólogas. No entanto, as subtilisinas nesta série apresentam o mesmo tipo ou um tipo semelhante de actividade proteolítica. Estas classe de proteases serinicas partilha uma sequência de aminoácidos que define uma tríade catalítica e que a distingue da classe das proteases serinicas relacionada com quimiotripsinas. As subtilisinas e as proteases serinicas relacionadas com quimiotripsina possuem ambas uma tríade catalítica compreendendo aspartato, histidina e serina. Nas proteases relacionadas com subtilisina a ordem relativa destes aminoácidos, lendo a partir do extremo amina para o extremo 12 ΡΕ0985042 carboxilo, é aspartato-histidina-serina. Nas proteases relacionadas com quimiotripsina a ordem relativa, no entanto, é histidina-aspartato-serina. Assim, subtilisina refere-se aqui a uma protease serinica tendo a tríade catalítica de proteases relacionadas com subtilisina. Os exemplos incluem, mas não estão limitados às subtilisinas identificadas na Fig. 2 aqui apresentada. "Subtilisina recombinante" refere-se a uma subtilisina em que a sequência de DNA codificadora da subtilisina é modificada de forma a produzir uma sequência de DNA variante (ou mutante) que codifica a substituição, elminação ou inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de aminoácidos da subtilisina natural. Métodos adequados para produzir tal modificação e que podem ser combinados com os aqui descritos, incluem os divulgados na Patente U.S. 4760025, patente US 5204015 e Patente US 5185258 .

Um resíduo (aminoácido) de uma carbonil hidrolase precursora é equivalente a um resíduo de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens se for homólogo (i.e. correspondente na posição da estrutura primária ou terciária) ou análogo a um resíduo específico ou porção desse resíduo em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens {i.e., tendo a mesma capacidade funcional ou uma semelhante para combinar, reagir ou interagir quimicamente).

Por forma a estabelecer homologia com a estrutura 13 ΡΕ0985042 primária, a sequência de aminoácidos de uma carbonil hidrolase precursora é directamente comparada com a sequência primária de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens e particularmente com uma série de resíduos conhecidos como sendo invariantes em subtilisinas para as quais é conhecida a sequência. A Fig. 4 mostra os resíduos conservados como seja entre a subtilisina de B. amyloliquefaciens e a subtilisina de B. lentus. Após alinhamento dos resíduos conservados, permitindo as inserções e deleções necessárias para manter o alinhamento (i.e., evitando a eliminação de resíduos conservados através da deleção e inserção arbitrária) , são definidos os resíduos equivalentes a aminoácidos particulares na sequência primária da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. 0 alinhamento dos resíduos conservados, de preferência, deverá conservar 100% de tais resíduos. No entanto, o alinhamento com mais de 75% ou pelo menos 50% de resíduos conservados é também adequado para definir resíduos equivalentes. A conservação da tríade catalítica, Asp32/His64/Ser221 deverá ser mantida.

Por exemplo, na Fig. 2 a sequência de aminoácidos de subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformes (carlsbergensis) e Bacillus lentus são alinhados para proporcionar a quantidade máxima de homologia entre sequências aminoácidos. Uma comparação destas sequências mostra que existe um número de resíduos conservados em cada uma das sequências. Estes resíduos conservados (como seja entre BPN' e B. lentus) estão identificados na Fig. 4. 14 ΡΕ0985042

Estes resíduos conservados, podem assim ser usados para definir os correspondentes resíduos de aminoácidos equivalentes da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens noutras carbonil hidrolases tais como subtilisina de Bacillus lentus (Publicação PCT N° WO89/06279publicada em 13 de Julho, 1989) e a enzima precursora de subtilisina preferida aqui descrita. Estas sequências de aminoácidos particulares estão alinhadas nas Figs. 2A e 2B com a sequência da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens para produzir a homologia máxima de resíduos conservados. Como pode ser observado, existe uma série de deleções na sequência de Bacillus lentus comparativamente com a subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Assim, por exemplo, o aminoácido equivalente a Vall65 em subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens nas outras subtilisinas é isoleucina para B. lentus e B. licheniformis.

Assim, por exemplo, o aminoácido na posição +210 é prolina (P) nas subtilisinas de B. amyloliquefaciens e de B. lentus. Na variante de subtilisina preferida útil no invento, no entanto, o aminoácido equivalente a +210 em Bacillus amyloliquefaciens está substituído com isoleucina (I). Uma comparação dos resíduos de aminoácidos preferidos aqui identificados para substituição versus a substituição preferida para cada uma de tais posições está apresentada na Tabela II. ΡΕ0985042 15

Tabela II

+ 104 + 210 + 156 + 166 + 217 + 76 + 103 B. amyloliquefaciens Y (selvagem) P E G Y N Q B. lentus (selvagem) V P S S L N S Substituição mais preferida I E/D E/D E/D D A

I/Y

Os resíduos equivalentes podem também ser definidos através da determinação da homologia ao nível da estrutura terciária relativamente à carbonil hidrolase precursora cuja estrutura terciária foi determinada por cristalografia de raios X. Os resíduos equivalentes são definidos como aqueles para os quais as coordenadas atómicas de dois ou mais dos átomos da cadeia principal de um resíduo de aminoácido particular da carbonil hidrolase precursora e subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens (N em N, CA em CA, C em C e 0 em 0) estão dentro de 0,13 nm e de preferência 0,1 nm após o alinhamento. 0 alinhamento é conseguido após o melhor modelo ter sido orientado e posicionado para dar a sobreposição máxima de coordenadas atómicas, de átomos da proteína que não sejam hidrogénio, da carbonil hidrolase em questão com a subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. O melhor modelo é o modelo 16 ΡΕ0985042 cristalográfico que dá o factor R mais baixo para os dados de difracção experimental na resolução mais elevada disponível.

Factor R - Iferijj Σ>|ΡοΗ

Resíduos equivalentes que são funcionalmente análogos a um resíduo específico da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens são definidos como os aminoácidos das carbonil hidrolases precursoras que podem adoptar uma conformação tal que alteram, modificam ou contribuem para a estrutura proteica, ligação do substrato ou catálise numa forma definida e atribuída a um resíduo específico da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. Ainda, eles são os resíduos da carbonil hidrolase precursora (para a qual foi obtida uma estrutura terciária por cristalografia de raios X) que ocupam uma posição análoga até ao ponto de, apesar dos átomos da principal cadeia de determinado resíduo puderem não satisfazer o critério de equivalência com base na ocupação de uma posição homóloga, as coordenadas atómicas de pelo menos dois átomos das cadeias laterais do resíduo situarem-se dentro de 0,13 nm dos átomos da cadeia lateral correspondente da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens. As coordenadas da estrutura tridimensional da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens estão descritas na Publicação EPO N° 0251446 e podem ser usadas como descrito atrás para determinar os resíduos equivalentes ao nível da estrutura terciária. 17 ΡΕ0985042

Alguns dos resíduos identificados para substituição, inserção ou deleção são resíduos conservados enquanto que outros não o são. No caso dos resíduos que não são conservados, a substituição de um ou mais aminoácidos é limitada a substituições que produzem uma variante tendo uma sequência de aminoácidos que não corresponde a uma encontrada na natureza. No caso dos resíduos conservados, tais substituições não deverão resultar numa sequência natural. As variantes de carbonil hidrolase úteis no presente invento incluem as formas maduras das variantes de carbonil hidrolases, assim como as pro- e prepro-formas de tais variantes de hidrolase. As prepro-formas são a construção preferida uma vez que esta facilita a expressão, secreção e maturação de variantes de carbonil hidrolases. Métodos e processos para a preparação de enzimas de acordo com o presente invento são conhecidos e estão descritos em PCT Publicação N° WO 95/10615.

As enzimas do presente invento possuem especificidade do tipo tripsina. Ou seja, as enzimas do presente invento hidrolisam proteínas ao clivarem preferencialmente as ligações peptídicas dos resíduos de aminoácidos carregados, mais especificamente resíduos tais como arginina e lisina, em vez de preferencialmente clivarem as ligações peptídicas dos resíduos de aminoácidos hidrofóbicos, mais especificamente fenilalanina, triptofano e tirosina. As enzimas tendo este último perfil, possuem uma especifici- 18 ΡΕ0985042 dade tipo quimotripsina. A especificidade de substrato como discutido atrás está ilustrada pela acção da enzima em dois substratos sintéticos. As proteases tendo especificidade do tipo tripsina hidrolisam o substrato sintético bVGR-pNA preferencialmente em relação ao substrato sintético sucAAPF-pNA. As enzimas da protease tipo tripsina, pelo contrário, hidrolisam o último mais rapidamente do que o primeiro. Para fins do presente invento o procedimento que se segue foi empregue para definir a especificidade do tipo tripsina das enzimas proteases do presente invento.

Uma quantidade fixa de um tampão glicina, a um pH de 10 e uma temperatura de 25°C, é adicionada a um tubo de ensaio padrão de 10 ml. 0,5 ppm da enzima activa a ser testada é adicionada ao tubo de ensaio. Aproximadamente, 1,25 mg do substrato sintético por ml de solução tampão é adicionada ao tubo de ensaio. A mistura é deixada a incubar durante 15 minutos a 25°C. Quando terminado o período de incubação, um inibidor da enzima, PMSF, é adicionado à mistura a um nível de 0,5 mg por ml de solução tampão. A absorvância ou valor de DO da mistura foi lido a um comprimento de onda de 410 nm. A absorvância indica então a actividade da enzima no substrato sintético. Quanto maior a absorvância, maior o nível de actividade contra aquele substrato.

Para determinar então a especificidade de uma enzima individual, a absorvância das proteínas para os dois substratos sintéticos pode ser convertida numa proporção ΡΕ0985042 específica. Para fins do presente invento, a proporção é determinada pela fórmula da especificidade de: [actividade em sAAPF-pNA]/[actividade em bVGR-pNA]

Uma enzima tendo uma proporção inferior a cerca de 10, mais de preferência inferior a cerca de 5, e mais de preferência inferior a cerca de 2,5 pode então ser considerada como apresentando actividade tipo tripsina.

Materiais aditivos de limpeza - As composições de limpeza do presente invento também compreendem, para além da enzima protease descrita anteriormente, um ou mais materiais aditivos de limpeza compatíveis com a enzima protease. O termo "materiais aditivos de limpeza", como aqui é usado, significa qualquer material líquido, sólido ou gasoso seleccionado para o tipo particular de composição de limpeza pretendido e a forma do produto (e.g., líquido; grânulo; composição de vaporização), materiais esses que são compatíveis com a enzima protease usada na composição. A selecção específica dos materiais aditivos de limpeza é facilmente feita considerando a superfície, item ou tecido a ser limpo, e a forma pretendida da composição para as condições de limpeza durante a utilização (e.g., através da utilização de detergente de lavagem). O termo "compatível", como aqui é usado, significa que os materiais de composição de limpeza não reduzem a actividade proteolítica da enzima protease até ao ponto em que a protease não deixe de ser eficaz como se pretende durante as situações de utilização 20 ΡΕ0985042 normais. Materiais de composição de limpeza específicos sao exemplificados detalhadamente a seguir.

Uma quantidade eficaz de uma ou mais enzimas proteases descritas atrás é incluída nas composições úteis para a limpeza de uma variedade de superfícies necessitadas de remoção de corantes proteicos. Tais composições de limpeza incluem composições de detergentes para limpeza difícil de superfícies, de forma ilimitada (e.g., líquido e granular); composições detergentes para limpeza de tecidos, de forma ilimitada (e.g., formulações granulares, líquidas e em barra); composições de lavagem de loiça (não limitadas na forma e incluindo lavagem de loiça automática com grânulos ou com líquido); composições de limpeza orais, não limitadas na forma (e.g., composições de dentífrico, pasta de dentes e elixir bucal); e composições de limpeza de dentaduras, forma não limitada (e.g., líquida, pastilha). Como aqui é usado, "quantidade eficaz de enzima protease" refere-se à quantidade de enzima protease aqui já descrita necessária para se conseguir a actividade enzimática necessária na composição de limpeza específica. Tais quantidades eficazes são facilmente determinadas pelos familiarizados com a matéria e baseiam-se em muitos factores, como sejam a variante de enzima particular usada, a aplicação de limpeza, a composição específica da composição de limpeza e se é necessário uma composição líquida ou seca (e.g., granular, em barra) e similares.

De preferência, as composições de limpeza do 21 ΡΕ0985042 presente invento compreendem entre 0,0001% e cerca de 10% de uma ou mais das enzimas proteases, mais de preferência entre cerca de 0,001% e cerca de 1%, ainda mais de preferência entre cerca de 0,001% e cerca de 0,1%. Igualmente, de preferência a enzima protease está presente nas composições numa quantidade suficiente para proporcionar uma proporção de mg de protease activa por 100 gramas de composição relativamente ao ppm teórico de O2 disponível ("AVO2") de qualquer peroxiácido no liquido de lavagem, aqui referido como a razão de Enzima/Branqueador (razão E/B) , variando entre cerca de 1:1 e cerca de 20:1. Vários exemplos de várias composições de limpeza em que as enzimas proteases podem ser empregues são discutidos mais detalha-damente abaixo. Igualmente, as composições do presente invento podem incluir dentre cerca de 1% a cerca de 99,9% por peso da composição dos materiais aditivos.

Enzimas detersivas facultativas - As composições de detergente aqui descritas podem também conter facultativamente uma ou mais tipos de enzimas detergentes. Tais enzimas podem incluir proteases, amilases, celulases e lipases. Tais materiais são conhecidos na área e estão comercialmente disponíveis como marcas registadas. Elas podem ser incorporadas nas composições de detergentes líquidos não aquosos, neste caso na forma de suspensões, "partículas" ou "grânulos". Um outro tipo adequado de enzimas compreende as que tenham a forma de pastas de enzimas em tensioactivos não iónicos, e.g., as enzimas comercializadas por Novo Nordisk com a marca comercial "SL" 22 ΡΕ0985042 ou as enzimas microencapsuladas comercializadas pela Novo Nordisk com o nome comercial "LDP". Enzimas e níveis de utilização adequados estão descritos em Pat. U.S. Nos. 5576282, 5705464, 5705464 e 5710115.

As enzimas adicionadas às composições aqui descritas na forma de grânulos de enzimas convencionais são especialmente preferidas para utilização neste caso. Tais grânulos variarão, de um modo geral, em tamanho entre cerca de 100 e 1000 microns, mais de preferência entre cerca de 200 e 800 microns e serão suspensos na fase líquida não aquosa da composição. Encontrou-se que os grânulos nas composições do presente invento, comparativamente com outras formas da enzima, apresentam estabilidade enzimática especialmente desejável em termos de retenção da actividade enzimática ao longo do tempo. Assim, composições que utilizam grânulos de enzima não necessitam de conter estabilizadores de enzimas convencionais, tal como deve ser frequentemente usado quando são incorporadas enzimas nos detergentes líquidos aquosos. "Enzima detersiva", como aqui é usado, significa qualquer enzima tendo um efeito de limpeza com remoção de corantes ou outro efeito benéfico na lavagem de roupa, limpeza difícil de superfícies ou na composição de detergentes para cuidados pessoais. As enzimas detersivas preferidas são hidrolases, tais como proteases, amilases e lipases. As enzimas preferidas para lavagem de roupa incluem, mas não estão limitadas a proteases, celulases, 23 ΡΕ0985042 lipases e peroxidases. São altamente preferidas para lavagem de loiça automática amilases e/ou proteases, incluindo tipos correntemente disponíveis no comércio e tipos melhorados que, apesar de cada vez mais compatíveis com branqueadores através de sucessivos melhoramentos, possuem ainda algum grau de susceptibilidade à desactivação por branqueadores.

Exemplos de enzimas adequadas incluem, mas não estão limitadas a hemicelulases, peroxidases, proteases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, estearases, cutinases, pectinases, queratanases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, linhinases, pululanases, ta-nases, pentosanases, malanases, β-glucanase, arabinosi-dases, hialuronidase, condroitinase, lacase e amilases conhecidas ou misturas das mesmas.

Exemplos de tais enzimas adequadas estão descritos nas Patentes U.S. Nos. 5705464, 5710115, 5576282, 5728671 e 5707950.

Proteases particularmente úteis estão descritas em publicações PCT: WO 95/30010 publicada em 9 de Novembro, 1995 da "The Procter & Gamble Company"; WO 95/30011 publicada em 9 de Novembro, 1995 da "The Procter & Gamble Company"; e WO 95/29979 publicada em 9 de Novembro, 1995 da "The Procter & Gamble Company". Proteases adequadas estão comercialmente disponíveis como ESPERASE®, ALCALASE®, DURAZYM® e SAVINASE® todas da Novo Nordisk A/S da ΡΕ0985042 - 24 -

Dinamarca, e como MAXATASE®, MAXACAL®, PROPERASE® e MAXAPEM® todas da Gist-Brocades da Holanda.

Para além das enzimas peroxidases descritas nas Patentes U.S. Nos. 5705464, 5710115, 5576282, 5728671 e 5707950, outras enzimas peroxidases adequadas estão descritas no pedido de Patente Europeia EP No. 96870013.8, entregue em 20 de Fevereiro, 1996. Também é adequada a enzima lacase. São potenciadores preferidos fentiazina e feno-xasina ácido 10-fenotiazinopropiónico (PPT), ácido 10-etilfenotiazino-4-carboxilico (EPC), ácido 10-fenoxazino-propiónico (POP) e 10-metilfenoxazina (descrito em WO 94/12621) e siringatos substituídos (siringatos substituídos com alquilo C3-C5) e fenóis. Percarbonato ou perborato de sódio são fontes preferidas de peróxido de hidrogénio.

As referidas peroxidases são normalmente incorporadas na composição de detergente em níveis entre 0,0001% e 2% da enzima activa por peso da composição de detergente.

Outras enzimas preferidas que podem ser incluídas nas composições de detergentes do presente invento incluem lipases. Enzimas lipases adequadas para utilização como detergente incluem as produzidas pelos microrganismos do grupo das Pseudomonas, tais como Pseudomonas stutzeri ATCC 19.154, como descrito na Patente Britânica 1372034. Lipases adequadas incluem as que apresentam uma reacção imunológica 25 ΡΕ0985042 cruzada positiva com o anticorpo da lipase, produzida pelo microrganismo Pseudomonas fluorescent IAM 1057. Esta lipase está disponível em Amano Pharmaceutical Co. Ltd., Nagoya, Japão, com a marca registada Lipase P "Amano", daqui em diante referido como "Amano-P". Outras lipases comerciais adequadas incluem Amano-CES, lipases ex Chromobacter viscosum, e.g., Chromobacter viscosum var. lipolyticum NRRLB 3673 de Toyo Jozo Co., Tagata, Japão; lipases de Chromobacter viscosum da U.S. Biochemical Corp., U.S.A. e Disoynth Co., The Netherlands, e lipases ex Pseudomonas gladioli. Lipases especialmente adequadas são lipases tais como Ml LIPASE® e LIPOMAX® (Gist-Brocades) e LIPOLASE® e LIPOLASE ULTRA® (Novo) que se demonstrou serem muito eficazes quando usadas em combinação com as composições do presente invento. São igualmente adequadas cutinases [EC 3.1.1.50] que podem ser consideradas como um tipo especial de lipase, nomeadamente lipases que não requerem activação interfacial. A adição de cutinases a composições detergentes foram descritas em, e.g., WO 88/09367(Genencor).

Para além das lipases atrás referidas, as fosfo-lipases podem ser incorporadas nas composições detergentes do presente invento. Exemplos não limitantes de fosfo-lipases adequadas incluem: EC 3.1.1.32 Fosfolipase Al; EC 3.1.1.4 Fosfolipase A2; EC 3.1.1.5 Lisofoliase; EC 3.1.4.3 Fosfolipase C; EC 3.1.4.4. Fosfolipase D. Fosfolipases comercializadas incluem LECITASE® da Novo Nordisk A/S da 26 ΡΕ0985042

Dinamarca e Fosfolipase A2 da Sigma. Quando as fosfolipases são incluídas nas composições do presente invento, prefere-se que também as amilases sejam incluídas. Sem pretender ficar amarrado à teoria, crê-se que a acção combinada da fosfolipase e amilase ofereça remoção de manchas substantiva, especialmente gordurosas/oleosas, de amido e manchas e sujidades de cor intensa. De preferência, a fosfolipase e a amilase, quando presentes, são incluídas nas composições do presente invento numa razão de peso de enzima pura entre 4500:1 e 1:5, mais de preferência entre cerca de 50:1 e 1:1.

Amilases conhecidas (a e/ou β) podem ser incluídas para remoção de corantes baseados em açúcares. WO 94/02597, Novo Nordisk A/S publicada em 3 de Fevereiro, 1994, descreve composições de limpeza que incorporam amilases mutantes. Ver igualmente W094/18314, Genencor, publicado em 18 de Agosto, 1994 e WO95/10603, Novo Nordisk A/S, publicado em 20 de Abril, 1995. Outras amilases conhecidas para usar em composições detergentes incluem amilases α e β. As amilases α são conhecidas na área e incluem as descritas na Pat. US 5003257; EP 252666; WO 91/00353; FR 2676456; EP 285123; EP 525610; EP 368341; e Especificação de Patente Britânica N° 1296839 (Novo). Outras amilases adequadas são as amilases com maior estabilidade incluindo PURAFACT OX AM® descrito em wo 94/18314, publicado em 18 DE Agosto, 1994 e WO96/05295, Genencor, publicado em 22 de Fevereiro, 1996, e variantes de amilases da Novo Nordisk A/S, descrito em WO 95/10603, publicado em Abril de 1995. 27 ΡΕ0985042

Exemplos de produtos comerciais de a-amilases são TERMAMYL®, BAN®, FUNGAMYL®, e DURAMYL®, todos disponíveis em Novo Nordisk A/S Dinamarca. W095/26397 descreve outras amilases adequadas: α-amilases caracteri-zadas por terem uma actividade específica pelo menos 25% superior à actividade específica de TERMAMYL® numa gama de temperatura de 25°C a 55°C e um valor de pH na gama de 8 a 10, medido pelo ensaio de actividade da α-amilase. Outras enzimas amidolíticas com melhores propriedades relativamente ao nível de actividade e a combinação de termos-tabilidade e um nível de actividade superior estão descritas em W095/35382.

As enzimas atrás referidas podem ser de qualquer origem adequada, como seja vegetal, animal, bacteriana, fúngica e de levedura. Podem ser usadas formas purificadas ou não purificadas destas enzimas. Também são incluídos por definição, os mutantes de enzimas nativas. Os mutantes podem ser obtidos e.g., por manipulação de proteínas e/ou genéticas, modificações químicas e/ou físicas das enzimas nativas. É igualmente prática comum a expressão da enzima em organismos hospedeiros em que o material genético responsável pela produção da enzima foi clonado.

As referidas enzimas sao normalmente incorporadas na composição de detergente em níveis entre cerca de 0,0001% e 2% de enzima activa por peso da composição detergente. As enzimas podem ser adicionadas como 28 ΡΕ0985042 ingredientes isolados separados (partículas, granulados, líquidos estabilizados, etc. contendo uma enzima) ou como misturas de duas ou mais enzimas (e.g. cogranulados).

Outros ingredientes detergentes adequados que podem ser adicionados são captores de oxidação de enzimas. São exemplos de tais captores de oxidação de enzimas as tetra-etilenopoliaminas etoxiladas.

Uma gama de materiais enzimáticos e meios para a sua incorporação em composições detergentes sintéticas está também descrito em WO 9307263 e WO 9307260 de Genencor International, WO 8908694 de Novo e U.S. 3553139, 5 de Janeiro, 1971 de McCarthy et al. As enzimas estão ainda descritas em U.S. 4101457, Place et al ., 18 de Julho, 1978, e em U.S. 4507219, Hughes, 26 de março, 1985. Materiais enzimáticos úteis em formulações de detergente líquidas e sua incorporação em tais formulações, estão descritas em U.S. 4261868, Hora et al., 14 de Abril, 1981.

Estabilizadores de enzimas - As enzimas para usar em detergentes podem ser estabilizadas por várias técnicas. As técnicas de estabilização de enzimas estão descritas e exemplificadas em U.S. 3600319, 17 de Agosto, 1971, Gedge et al., EP199405 e EP 200586, 29 de Outubro, 1986, Venegas. Os sistemas de estabilização de enzimas estão também descritos, por exemplo, em US. 3519570. Um Bacillus útil, sp. AC13 produtor de proteases, xilanases e celulases, está descrito em WO 9401532 de Novo. As enzimas aqui empregues 29 ΡΕ0985042 podem ser estabilizadas pela presença de fontes solúveis em água de iões cálcio e/ou magnésio nas composições acabadas que proporcionam tais iões às enzimas. Estabilizadores de enzimas adequados e níveis de utilização estão descritos nas Pat. U.S. Nos. 5705464, 570115 e 5576282.

Agentes guelantes - As composições detergentes aqui descritas podem também, facultativamente, conter um agente quelante que serve para quelatar iões metálicos, e.g., ferro e/ou manganês, dentro das composições detergentes não aquosos. Tais agentes de quelatação servem assim para formar complexos com impurezas metálicas da composição que, de outra forma, tenderão a desactivar componentes da composição tais como agentes branqueantes de peroxigénio. Agentes quelantes úteis podem incluir aminocarboxilatos, fosfonatos, aminofosfonatos, agentes quelantes aromáticos polifuncionalmente substituídos e suas misturas. Outros exemplos de agentes quelantes adequados e níveis de utilização estão descritos nas Pat. U.S. Nos. 5705464, 5710115 e 5576282.

Substâncias orgânicas que aumentam a eficiência de limpeza - As composições aqui descritas também contêm facultativamente, mas de preferência, até cerca de 50%, mais de preferência entre cerca de 1% e cerca de 40%, mesmo mais de preferência entre cerca de 5% e cerca de 30%, por peso de um material que aumenta a eficiência de limpeza do detergente. No entanto, não se pretende excluir níveis mais baixos ou mais altos de substâncias que aumentam a efi- 30 ΡΕ0985042 ciência da limpeza. As substâncias que aumentam a eficiência de limpeza do detergente podem facultativamente ser incluídos nas composições aqui descritas para avaliar o controlo da dureza mineral. Podem ser usadas substâncias inorgânicas , assim como orgânicas, que aumentam a ef i- ciência de limpeza. As substâncias que aumentam a ef i- ciência de limpeza são tipicamente usados em composições para lavandaria de tecidos para ajudar a remoção de par- tícuias de sujidade . As substâncias que aumentam a ef i- ciência de limpeza dos detergentes adequados estão des- critos nas Patentes U.S . Nos. 5705464, 5710115, 5576282, 4321165 e 4284532. Os materiais que aumentam a eficiência de limpeza preferidos para usar em detergentes líquidos aqui descritos estão apresentados nas Patentes U.S. Nos. 5705464, 5710115, 5576282 e 4284532.

Substâncias inorgânicas que aumentam a eficiência de limpeza - As composições detergentes aqui descritas podem também, facultativamente, conter um ou mais tipos de substâncias que aumentam a eficiência de limpeza de detergentes inorgânicos para além dos referidos atrás que também funcionam como fontes de alcalinidade. Tais substâncias inorgânicas facultativas que aumentam a eficiência de limpeza podem incluir, por exemplo, alumino-silicatos tais como zeolitos. Zeolitos de alumino-silicato e a sua utilização como substâncias que aumentam a eficiência de limpeza dos detergentes estão mais detalhadamente descritos em Corkill et al., Patente U.S. N° 4605509; Publicado em 12 de Agosto, 1986, a descrição da qual é aqui incluída como 31 ΡΕ0985042 referência. Igualmente silicatos em camadas cristalinas, como os discutidos nesta Patente U.S. 509, são também adequadas para usar nas composições de detergentes descritas. Se utilizados, os materiais que aumentam a eficiência de limpeza de detergentes inorgânicos facultativos podem compreender entre cerca de 2% e 25% por peso das composições descritas. Exemplos adicionais de substâncias inorgânicas que aumentam a eficiência de limpeza estão descritos nas Patentes U.S. Nos. 5705464 e 5710115.

Tensioactivos - Tensioactivos detersivos incluídos nas composições nas composições de detergentes completamente formuladas proporcionadas pelo presente invento constituem pelo menos 0,01%, de preferência entre cerca de 0,5% e cerca de 50% por peso de composição detergente dependendo dos tensioactivos particulares usados e dos efeitos pretendidos. Numa forma de realização altamente preferida, o tensioactivo detersivo compreende entre cerca de 0,5% e cerca de 20% por peso da composição. O tensioactivo detersivo pode ser não iónico, aniónico, anfolítico, zuiteriónico ou catiónico, exemplos não limitantes dos quais estão descritos nas Patentes U.S. Nos. 5707950 e 5576282. As misturas destes tensioactivos podem ser igualmente usadas. Composições de detergentes preferidas compreendem tensioactivos detersivos aniónicos ou misturas de tensioactivos aniónicos, especialmente tensioactivos não iónicos. 32 ΡΕ0985042

Exemplos não limitantes de tensioactivos úteis neste caso incluem os benzenossulfonatos de alquilo Cn-Cis e alcoxissulf atos de alquilo Cio-Cis, poliglicósidos de alquilo Cio-Cis e os seus correspondentes poliglicósidos sulfatados, ésteres de ácidos gordos alfa sulfonados C12-C18 e alcoxilatos de alquilfenol (especialmente etoxilatos e etoxi/propoxi mistos), betainas e sulfobetainas C12-C18 (" sultaínas") , aminóxidos Cio-Cis e similares. Outros tensioactivos úteis convencionais estão apresentados em textos convencionais.

Os tensioactivos particularmente preferidos nas composições de lavagem automática preferidas (ADD) do presente invento são tensioactivos não iónicos com baixa produção de espuma (LFNI) que estão descritos nas Patentes U.S. Nos. 5705464 e 5710115. LFNI pode estar presente em quantidades entre 0,01% e cerca de 10% por peso, de preferência entre cerca de 0,1% e cerca de 10% e, mais de preferência, entre cerca de 0,25% e cerca de 4%. Os LFNIs são mais tipicamente usados em ADDs tendo em conta o melhoramento da acção de revestimento com água (especialmente de vidro) que conferem ao produto ADD. Eles também incluem materiais poliméricos não siliconados e não fosfatados ainda ilustrados à frente, que se sabe removerem a espuma da sujidade de alimentos encontrada em lavagem de loiça automática. LFNIs preferidos incluem tensioactivos alcoxila-dos não iónicos, especialmente etoxilados, derivados de 33 ΡΕ0985042 alcoóis primários e suas misturas com mais tensioactivos sofisticados, tais como os polímeros de blocos reversos polioxipropileno/po1ioxietileno/polioxipropileno (PO/EO/PO) como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5705464 e 5710115. ADDs altamente preferidos aqui tratados, em que LFNI está presente usam mono-hidroxi-álcool etoxilado ou alquilfenol e adicionalmente compreendem um composto polimérico de blocos polioxietileno e polioxipropileno como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5705464 e 5710115. LFNIs que podem também ser usados incluem os tensioactivos não iónicos POLY-TERGENT® SLF-18 de Olin Corp., e qualquer LFNI biodegradável tendo as propriedades de ponto de fusão aqui discutidas.

Estes e outros tensioactivos são bem conhecidos na área, estando descritos mais detalhadamente em "Kirk Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology", 3rd Ed., Vol. 22, pp. 360-379, "Surfactants and detersive systems", aqui incluído como referência. São preferidas as composições ADD compreendendo tensioactivos mistos em que a formação de espuma (ausente qualquer agente de controle de espuma de silicone) é inferior a 2 polegadas, de preferência menos de 1 polegada, conforme determinado pela descrição abaixo. O equipamento útil para estas medições sao: uma 34 ΡΕ0985042 máquina de lavar loiça Whirpool (modelo 900) equipada com uma porta transparente em "plexiglass", recolha de dados por um computador IBM com programas Labview e Excel, sensor de proximidade (Newark Corp. - modelo 95F5203) usando a interface SCXI e uma régua de plástico.

Os dados foram colhidos como se segue. O sensor de proximidade está fixado ao fundo da grelha da máquina de lavar loiça num suporte metálico. As faces sensoras para baixo no sentido do braço rotativo da máquina de lavar loiça no fundo da máquina (distância de aproximadamente 2 cm ao braço rotativo). Cada um dos passos do braço rotativo é medido pela proximidade ao sensor e registado. Os pulsos registados pelo computador são convertidos em rotações por minuto (RPM) do braço do fundo pelos pulsos de contagem ao longo de um intervalo de 30 segundos. A velocidade da rotação do braço é directamente proporcional à quantidade de espuma na máquina e na bomba da máquina de lavar loiça (i.e., quanto mais espuma produzida, mais lenta a rotação do braço). A régua de plástico é presa à grelha do fundo da máquina de lavar loiça e estende-se até ao fundo da máquina. No final do ciclo de lavagem, a altura da espuma é medida usando a régua de plástico (observado através da porta transparente) e registado como altura da espuma. O procedimento que se segue é seguido da avaliação das composições ADD relativamente à produção de 35 ΡΕ0985042 espuma assim como relativamente à avaliação da utilidade de tensioactivos não iónicos. (Para separar a avaliação do tensioactivo não iónico, uma fórmula de base ADD, como seja pó Cascade, é usada juntamente com os tensioactivos não iónicos que são adicionados separadamente em ampolas de vidro à máquina de lavar loiça).

Em primeiro lugar, a máquina é cheia com água (ajustar a água à temperatura e dureza adequadas) e seguindo-se um ciclo de enxaguamento. 0 RPM é controlado ao longo do ciclo (aproximadamente 2 min.) sem qualquer produto ADD (ou tensioactivos) adicionado (um teste de controlo da qualidade para assegurar que a máquina está a funcionar adequadamente). À medida que a máquina começa a encher para o ciclo de lavagem, a água é novamente ajustada para temperaturas e dureza, e depois o produto ADD é adicionado ao fundo da máquina (no caso de tensioactivos separadamente avaliados, a fórmula de base ADD é primeiro adicionada ao fundo da máquina e depois os tensioactivos são adicionados colocando as ampolas de vidro contendo o tensioactivo na prateleira de cima da máquina). 0 RPM é então controlado ao longo do ciclo de lavagem. No final do ciclo de lavagem, a altura da espuma é registada usando a régua de plástico. A máquina é novamente cheia com água (ajustar a água à temperatura e dureza adequadas) e efectuado um outro ciclo de enxaguamento. 0 RPM é controlado ao longo deste ciclo.

Um RPM médio foi calculado para o primeiro 36 ΡΕ0985042 enxaguamento, lavagem principal e enxaguamento final. A eficiência da %RPM foi então calculada pela divisão da RPM média para os tensioactivos a testar pelo RPM médio para o sistema controlo (formulação ADD de base sem tensioactivo nao iónico) . A eficiência de RPM e as medições da altura da espuma foram usados para dimensionar o perfil global de espuma foram usados para dimensionar o perfil global de espuma do tensioactivo.

Agentes de branqueamento - As fontes de peróxido de hidrogénio estão descritas detalhadamente no aqui referido "Kirk Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology", 4th Ed (1992, John Wiley & Sons), Vol. 4, pp. 271-300 "Bleaching Agents (Survey)", e incluem as várias formas de perborato de sódio e percarbonato de sódio, incluindo várias formas revestidas e modificadas. Uma "quantidade eficaz" de uma fonte de peróxido de hidrogénio é qualquer quantidade capaz de melhorar, de forma mensurável, a remoção de manchas (especialmente manchas de chá) de loiça manchada comparativamente com uma composição sem fonte de peróxido de hidrogénio quando a loiça manchada é lavada pelo consumidor numa máquina de lavar loiça doméstica automática na presença de bases.

De um modo mais generalizado, uma fonte de peróxido de hidrogénio é neste caso qualquer composto ou mistura adequado que nas condições de utilização do consumidor proporcione uma quantidade eficaz de peróxido de hidrogénio. Os níveis podem variar largamente e são 37 ΡΕ0985042 geralmente na gama entre cerca de 0,1% e cerca de 70%, mais tipicamente entre cerca de 0,5% e cerca de 30%, por peso das composições ADD aqui descritas. A fonte preferida de peróxido de hidrogénio aqui usada pode ser qualquer fonte conveniente, incluindo o próprio peróxido de hidrogénio. Por exemplo, perborato, e.g., perborato de sódio (qualquer hidrato, mas de preferência o mono- ou tetra-hidrato), carbonato de sódio peroxi-hidratado ou sais de percarbonato equivalentes, pirofosfato de sódio peroxi-hidratado, ureia peroxi-hidra-tada ou peróxido de sódio podem ser aqui usados. São igualmente úteis fontes de oxigénio disponível tais como branqueador persulfato (e.g., OXONE, fabricada pela DuPont). Perborato de sódio mono-hidratado e percarbonato de sódio são particularmente preferidos. Podem ser também usadas misturas de quaisquer fontes de peróxido de hidrogénio adequadas.

Um branqueador percarbonato preferido compreende partículas secas tendo um tamanho de partículas médio na gama de cerca de 500 micrómetros a cerca de 1000 micró-metros, não mais de cerca de 10% por peso das referidas partículas sendo inferiores a cerca de 200 micrómetros e não mais de cerca de 10% por peso das referidas partículas sendo inferiores a cerca de 1 250 micrómetros. Faculta tivamente, o percarbonato pode ser revestido com um sili-cato, borato ou tensioactivos solúveis em água. O percarbonato está também disponível de várias fontes comerciais tais como FMC, Solvay e Tokai Denka. 38 ΡΕ0985042

Ainda que não preferidos para composições ADD do presente invento que compreendem enzimas detersivas, as composições do presente invento podem também compreender como agente de branqueamento um material de branqueamento tipo cloro. Tais agentes são bem conhecidos na área e incluem, por exemplo, dicloro-isocianurato de sódio ("NaDCC").

Se bem que composições ADD eficazes aqui descritas possam compreender apenas o tensioactivo não iónico e materiais que aumentam a eficiência da limpeza, composições ADD completamente formuladas tipicamente compreenderão igualmente outros materiais aditivos detergentes para lavagem de loiça automática para melhorar ou modificar o desempenho. Estes materiais são seleccionados conforme adequado relativamente às propriedades necessárias de uma composição de lavagem de loiça automática. Por exemplo, caso se pretenda baixa formação de manchas e películas - as composições preferidas possuem graus de formação de manchas e películas de 3 ou menos, de preferência inferior a 2, e mais de preferências inferior a 1, conforme medido pelo teste padronizado da "The American Society for Testing and Materials" ("ASTM") D3556-85 (reaprovado em 1989) "Standard Test Method for Deposition on Glassware During Mechanical Dishwashing" (Método de Teste Padronizado para o Depósito em Vidro durante a Lavagem de Loiça Mecânica). 39 ΡΕ0985042 (a) Activadores de branqueamento - De preferência, o componente branqueador de peroxigénio na composição é formulado com um activador (precursor perácido). 0 activador está presente em níveis entre cerca de 0,01% e cerca de 15%, de preferência entre cerca de 0,5% e cerca de 10%, mais de preferência entre cerca de 1% e cerca de 8%, por peso da composição. Os activadores preferidos são seleccionados do grupo consistindo em tetra-acetiletile-nodiamina (TAED), benzoilcaprolactama (BzCl), 4-nitroben-zoilcaprolactama, 3-clorobenzoilcaprolactama, benzoilo-xibenzenossulfonato (BOBS), nonanoiloxibenzenossulfonato (NOBS), fenilbenzoato (PhBz), decanoiloxibenzenossulfonato (Cio-OBS), benzoilvalerolactama (BZVL),octanoilbenzenos-sulfonato (Cs-OBS), ésteres per-hidrolizáveis e suas misturas, mais de preferência benzoilcaprolactama e benzoilva-lerolactmama. São particularmente preferidos os activadores de branqueamento na gama de pH entre cerca de 8 e cerca de 9,5, os seleccionados tendo um grupo migrante OBS ou VL.

Os activadores de branqueamento preferidos são os descritos nas Patentes U.S. Nos. 5698504, 5695679, 5686014, 5130045 e 4412934, e pedidos de patente copendentes Nos. De Série U.S. 08/064624, 08/064623, 08/064621, 08/064562, 08/064564, 08/082270 e pedido de patente copendente de M. Burns, A.D. Willey, R.T. Hartshorn, C.K. Ghosh, intitulado "Bleaching Compounds Comprising Peroxyacid Activators Used with Enzymes" e tendo o N° de Série U.S. 08/133691 (P&G Case 4890R), todos eles são aqui incluídos como referência. 40 ΡΕ0985042 A proporção molar do composto de branqueamento peroxigénio (como AvO) relativamente ao activador de branqueamento no presente invento, de um modo geral, varia entre pelo menos 1:1, de preferência entre cerca de 20:1 e cerca de 1:1, mais de preferência entre cerca de 10:1 e cerca de 3:1.

Podem ser incluídos activadores de branqueamento quaternários substituídos. As presentes composições de detergentes, de preferência, compreendem um activador de branqueamento quaternário substituído (QSBA) ou um perácido quaternário substituído (QSP); mais de preferência, o primeiro. As estruturas QSBA preferidas estão ainda descritas em U.S. copendentes N° de Série 08/298903, 08/298650, 08/298906 e 08/298904 entregue em 31 de Agosto, 1994, agora respectivamente Patente U.S. Nos. 5686015, 5460747, 5584888 e 5578136, aqui incluído como referência.

Os activadores de branqueamento altamente preferidos úteis neste caso são os substituídos com amida como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5698504, 5695679 e 5686014. Exemplos preferidos de tais activadores de branqueamento incluem: (6-octanamidocaproiloxibenzenossulfonato, (6-nona-namidocaproil)oxibenzenossulfonato, (6-decanamidocaproil)-oxibenzenossulfonato e suas misturas.

Outros activadores úteis, descritos nas Patentes U.S. Nos. 5698504, 5695679, 5686014 e 4966723, incluem activadores do tipo benzoxazina, tais como um anel C6H4 a que está fundido nas posições 1,2 um grupo -C(O)OC(R1) =N-. 41 ΡΕ0985042

Dependendo do activador e aplicação precisa, podem ser obtidos bons resultados de branqueamento a partir de sistemas de branqueamento tendo um pH de utilização entre cerca de 6 e cerca de 13, de preferência ente cerca de 9,0 e cerca de 10,5. Tipicamente, por exemplo, os activadores com grupos que removem electrões são usados para gamas de pH perto do neutro ou sub-neutro. As bases e agentes tamponantes podem ser usados para assegurar tal pH.

Os activadores acil-lactamas, como descrito nas Patentes U.S Nos. 5698504, 5695679 e 5686014, são aqui muito úteis, especialmente as acilprolactamas (ver por exemplo WO 94-28102A) e acilvalerolactamas (ver Patente U.S. N° 5503639). (b) Peróxidos orgânicos, especialmente diacil-peróxidos - Estes estão extensivamente ilustrados em Kirk Othmer, "Encyclopedia of Chemical Technology", Vol. 17, John Wiley and Sons, 1982 nas páginas 27-90 e especialmente nas páginas 63-72, todos aqui incorporados como referência. Caso se use um diacilperóxido será, de preferência, um que exerça um impacto adverso mínimo na formação de manchas/películas. (c) Catalisadores de branqueamento contendo metais - As composições e métodos do presente invento utilizam catalisadores de branqueamento contendo metais que são eficazes para usar em composições ADD. São preferidos catalisadores de branqueamento contendo manganês e cobalto. 42 ΡΕ0985042

Um tipo de catalisador de branqueamento contendo metais é um sistema catalisador compreendendo um catião de metais de transição de actividade catalítica de branqueamento definida, tais como catiões de cobre, ferro, titânio, ruténio tungsténio, molibdénio ou manganês, um catião metálico auxiliar tendo pouca ou nenhuma actividade catalítica de branqueamento, como sejam catiões de zinco ou alumínio, e um sequestrato tendo constantes de estabilidade definidas para os catiões metálicos catalíticos e auxiliares, particularmente ácido etilenodiaminatetracético, ácido etilenodiaminatetra(metilenofosfónico) e seus sais solúveis em água. Tais catalisadores estão descritos na Pat. U.S. 4430243 .

Caso se pretenda, as composições aqui apresentadas podem ser catalisadas por meio de um composto de manganês. Tais compostos e níveis são bem conhecidos na área e incluem, por exemplo, os catalisadores baseados em manganês descritos em Pat. U.S. No. 5576282, Pat. U.S. 5246621, Pat. U.S. 5244594; Pat. U.S. 5194416; Pat. U.S. 5114606; e Pedidos de Pat. Europeia Nos. 549271A1, 549272A1, 544440A2 e 544490A1; Exemplos preferidos destes catalisadores incluem MnIV2 (u-O) 3 (1,4, 7-trimetil-l, 4, 7-tri-azaciclononano) 2 (PF6) 2, ΜηΣΣΣ2 (u-O) 1 (u-Oac) 2 (1, 4, 7-trimetil-1, 4, 7-triazaciclononano) 2(C104)2, MnIV4 (u-O) 6 (1, 4, 7-tria-

Outros zaciclononano) 4 (C104) 4, ΜηΣΣΣΜηιν4 (u-Oac) 2- (1, 4, 7-trimetil-1,4, 7-triazaciclononano) 2(C104)3, MnIV(l,4, 7-trimetil-1, 4,7-triazaciclononano)-(OCH3) 3 (PF6) , e suas misturas. 43 ΡΕ0985042 catalisadores de branqueamento baseados em metais incluem os descritos na Pat. U.S. 4430243 e Pat. U.S. 5114611. A utilização de manganês com vários ligandos complexos para aumentar o branqueamento está também descrito nas seguintes Patentes do Estados Unidos: 4728455; 5284944; 5246612; 5256779; 5280117; 5274147; 5153161; e 5227084.

Os catalisadores de branqueamento com cobalto úteis neste caso são conhecidos e estão descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 5597936, 5595967, 5703030 e M.L. Tobe, "Base Hydrolisis of Transition-Metal Complexes", Adv. Inorg. Bionorg. Mech., (1983), 2, páginas 1-94. O catalisador cobalto mais preferido útil neste caso é os sais acetato de cobalto penta-amina tendo a fórmula [Co(NH3) 5OAc]Ty. Em que "Oac" representa um grupo acetato e "Ty" é um anião e especialmente cloreto de cobalto penta-amina acetato, [Co (NH3 ) 5OAc] Cl2; assim como [Co (NH3) 5OAc] (Oac) 2; [Co(NH3)5OAc] (PF6)2; [Co(NH3)5OAc] (S04)2; [Co(NH3)5OAc] (BF4) 2; e [Co (NH3) 50Ac] (N03) 2 (aqui "PAC").

Estes catalisadores de cobalto são facilmente preparados por processos conhecidos, tais como os ensinados por exemplo nas Patentes U.S. Nos. 5597936, 5595967, 5703030, no artigo de Tobe e as referências ali citadas e na Patente U.S. 4810410, de Diakun et al., publicada em 7 de Março, 1989, J. Chem Ed. (1989), 66 (12), 1043-45; The Synthesis and Characterization of Inorganic Compounds, W.L. Jolly (Prentice-Hall; 1970), pp. 461-3; Inorg. Chem., 18, 1497-1502 (1979); Inorg. Chem., 21, 2881-2885 (1982); 21, 44 ΡΕ0985042

Inorg. Chem., 18:2023-2025 (1979); Inorg.Synthesis, 173-176 (1960); e Journal of Physical Chemistry, 56, 22-25 (1952).

Os catalisadores de branqueamento úteis nas composições de lavagem de loiça automática e composições detergentes em pó concentrado podem também ser selec-cionados conforme adequado para o presente invento. Para exemplos de catalisadores de branqueamento adequados ver Pat. U.S. 4246612 e Pat. U.S. 5227084.

Por questões práticas e não como limitação, as composições e processos de limpeza aqui descritos podem ser ajustados para proporcionar na ordem de pelo menos uma parte por cem milhões da espécie activa de catalisador de branqueamento no meio de lavagem aquoso e, proporcionarão de preferência entre cerca de 0,01 ppm e cerca de 25 ppm, mais de preferência entre cerca de 0,05 ppm e cerca de 10 ppm, e mais de preferência entre cerca de 0,1 ppm e cerca de 5 ppm, da espécie de catalisador de branqueamento no meio de lavagem. Para se obter tais niveis no meio de lavagem de um processo de lavagem automática, composições tipicas compreenderão entre cerca de 0,0005% e cerca de 0,2%, mais de preferência entre cerca de 0,004% e cerca de 0, 08% de catalisador de branqueamento, especialmente catalisadores de manganês ou de cobalto, por peso das composições de limpeza.

Variação do pH e de tamponação - Muitas composições detergentes aqui descritas serão tamponadas, i.e., 45 ΡΕ0985042 elas são resistentes à queda de pH na presença de sujidade ácida. No entanto, outras composições aqui descritas podem ter capacidade tamponante excepcionalmente baixa ou podem ser substancialmente não tamponadas. Técnicas para o controlo ou variação do pH nos niveis de utilização recomendados, mais geralmente incluem a utilização não só de outros tampões, como também de bases, ácidos, sistemas de salto de pH, recipientes com duplo compartimento, etc. adicionais, e são do conhecimento dos familiarizados com a área.

As composições ADD preferidas aqui descritas compreendem um componente de ajuste do pH seleccionado entre sais inorgânicos alcalinos solúveis em água e materiais orgânicos ou inorgânicos, solúveis em água, que aumentam a eficiência de limpeza como descrito nas Patentes U.S. Nos 5705464 e 5710115.

Silicatos solúveis em água - As presentes composições de detergentes de lavagem de loiça automática podem ainda compreender silicatos solúveis em água como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5705464 e 5710115.

Agentes de protecção de materiais - As composições ADD preferidas podem conter um ou mais agentes protectores de materiais que são eficazes como inibidores de corrosão e/ou auxiliares anti-embaciamento como descrito nas Patentes U.S. Nos. 5705464, 5710115 e 5646101. Quando presentes, tais materiais de protecção são de preferência 46 ΡΕ0985042 incorporados em níveis baixos, e.g., entre cerca de 0,01% e cerca de 5% da composição ADD.

Outros materiais - Ingredientes ou aditivos detersivos, facultativamente incluídos nas presentes composições, podem incluir um ou mais materiais para ajudar ou aumentar o desempenho da limpeza, tratamento do substrato a ser limpo ou projectados para melhorar a estética das composições. Os aditivos que podem também ser incluídos nas composições do presente invento, nos seus níveis convencionados para utilização (de um modo geral, os materiais aditivos compreendem, no total, entre cerca de 30% e cerca de 99,9%, de preferência entre cerca de 70% e cerca de 95%, por peso das composições), incluem outros ingredientes activos tais como substâncias que aumentam a eficiência de limpeza não fosfato, quelantes, enzimas, supressores de espuma, polímeros dispersantes (e.g., da BASF Corp. ou Rohm & Haas), grânulos de cor, protecção de pratas, agentes anti-embaciamento e/ou anti-corrosão, corantes, agentes de enchimento, germicidas, fontes de alcalinidade, hidrotropos, anti-oxidantes, agentes estabilizadores de enzimas, perfumes, agentes de solubilização, veículos, auxiliares de processamento e agentes de controlo do pH como descrito nas Patentes U.S. 5705464, 5710115, 5698504, 5695679, 5686014 e 5646101.

Os exemplos que se seguem não limitantes ilustram ainda as composiçoes ADD do presente invento. ΡΕ0985042 EXEMPLO 1

Ingredientes: Peso% A B Tripolifosfato de sódio (STPP) 24, 0 45 Carbonato de sódio 20,0 13,5 Silicato hidratado 2,0r 15 13,5 Tensioactivps não iónicos 2,0 2,0 Polímero1 4,0 — Protease2(4% activa) 0, 83 0, 83 Amilase (0,8% activa) 0,5 0,5 Perborato mono-hidratado 14, 5 14, 5 (15,5% Activo AvO)3 Catalisador Cobalto4 0, 008 — Peróxido de dibenzoilo (18% activo) 4,4 4,4 Água, sulfato de sódio e mist. A perfazer A perfazer 1 Terpolímero seleccionado entre 60% ácido acrílico/20% ácido maleico/20% acrilato de etilo ou 70% ácido acrí- lico/10% ácido maleico/20% acrilato de etilo. 2 Uma variante carbonil hidrolase da subtilisina de B. amyloliquefaciens com as substituições de aminoácidos 210I/76D/103A/104I/156E/166D. 3 Disponível na DeGussa Corp. 0 nível de AvO da fórmula acima é de 2,2%. 4 Nitrato de penta-amino-acetatocobalto(111) preparado como aqui descrito atrás; pode ser substituído por MnTACN.

Os ADDs dos exemplos da composição detergente de 48 ΡΕ0985042 lavagem de loiça atrás descritos são usados para lavar vidros sujos com leite, superfícies planas sujas com amido, queijo, ovo ou alimentos de bebés, através da colocação da loiça suja numa máquina de lavar loiça doméstica automática e lavagem usando enchimento a frio, pico de 60°C ou ciclos de lavagem uniforme a 45-50°C, com uma concentração de produto das composições exemplificadas entre cerca de 1000 e cerca de 8000 ppm, com excelentes resultados. EXEMPLO 2

As fórmulas de detergentes líquidos para máquinas de lavar loiça menos exigentes são como se segue:

Composição

Ingrediente A B %Peso C Tensioactivo 32,0 29,50 30, 75 Etanol 4,0 4, 00 4, 00 Citrato de sódio 0,06 0,06 0, 06 Cloreto de magnésio 3,32 3,32 3,32 Sulfato de amónio 0,08 0,08 0, 08 Peróxido de hidrogénio 200 ppm 200 ppm 200 ppm Perfume 0,18 0,18 0, 18 Proteasel 0,50 0,50 0,50 Água e componentes pouco abundantes ------A perfazer------ 1 Uma variante carbonil hidrolase da subtilisina de B. amyloliquefaclens com as substituições de aminoácidos 210I/76D/103A/104I/156E/166D. ΡΕ0985042

Tendo descrito o invento detalhadamente com referência a formas de realização preferidas e aos exemplos, será claro para os familiarizados com a matéria que podem ser feitas várias alterações e modificações sem afastamento do âmbito do invento e o invento não deve ser considerado limitado ao que está descrito na especificação. ΡΕ0985042 50

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS 1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Rai, Saroj

Corrêa, Paul E.

Zhu, Yong Graycar, Thomas P.

Bott, Richard R. (ii) TÍTULO DO INVENTO: Enzimas proteases para limpeza difícil e/ou redução de manchas e filmes e composições incluindo as mesmas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 9

(iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÉRIO: The ProcterS Gamble Company (B) RUA: 11810 East Miami River Road (C) CIDADE: Ross

(D) ESTADO: OH

(E) PAÍS: USA (F) CÓDIGO POSTAL: 45061 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE ENTREGA: 4 de junho, 1997 (C) CLASSIFICAÇÃO:

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE PROCURADOR/AGENTE (A) NOME: Bolam, Brian M. (B) NÚMERO DE REGISTO: 37513

(C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/RESUMO: 6689P (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÃO: (A) TELEFONE: 513/627-2457 (B) TELEFAX: 513/627-0318 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1497 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:1 51 ΡΕ0985042 GGTCT&CTAA ΑΑΤΑΤΤΑ'ΓΤ c CAffftCTATA.C AATTAATACA CAORATAÃTC 'TOTCTATTGS «Θ TTÃTTCTGCft Α&ΓΰΑΑΑΑΑΑ AGG&SAGGAT AQ5CA&AA&A GtAfSGATCA 120 gtttgctgtí' TSCTTTAGCG TTAMCHTA OSATQGCfííT CSGCAQCSiCA Tocfcrsocc ISO AGP CGG C AíjG SAftATCBAAC GCGOAAAAÇA AftTATATT^T aSGGWTAAA CACÍACA&TGA 240 GOACQkmm OSCCSCTAAG AA<3A8AGAT<3 2CMT7CTCA AftAASGCSGQ AAAGTGCAAA Í00 AGCAATTCSÁ AmTSTAGAC SGASCTTCAíS TCAGATTAAA CSSAAAAGCT GTÁAÀASAftt 3 60 T&BÀAAA&&A CCCGAGCGTC ecrrAcsrrs AAGAÃáÁtCA CGTÃGCACAt âOSTACQCQC 420 ÃGTCCOTGCC TT&COGCGTA TCACAAATFA AAgCCCCTGC TCIGCACTCT CAAGGCTACA 400 C?GGATCAAA TCITAftftSTA sosarrATCG A.CAQCGGTAT cG&trcTTCt CATCCtfSATt 540 taaácss c &mcmmcc A9CATSSTTC CTTCfGÃÂÁC AAArCCTTTC CÁASACAACft SCO ^CTCTCACGQ .AACtCAOSTÇ' aCiSSSCACAS TTSCGGCTCi' TAATAACTCA ATCGCTGTAT §60 TAs<jo3'rroc GCCftftGCSCA TCACrriACS CTGTAAAAOT TCTCSGTGCT GACGGTTCOS 720 GCCA&mCAO ÇTGSATÇATí JACeSAATca AGTG&SCGAT CX5CMÃCAAT Aras&CG-rm 760 TTAACATGAG CCrOGGCfââA cerrerasTT CTGCXSCTTr arPSATAAAG §40 CCGTfGCÃtC CÍSOCSTCGTA OTcarrocoo CAGCCQGTAA eCAftSSCAc-r TCCOGCAGCT SÔO CARSCACAOT GGGCmeect SGTAAATACC CTTCTSTCAT TGCASTAOGC SCTGTTGACA 9S0 CA/i.CCÂ ÃAGAGCATCT TTCTCSAOOS3 T.AGCACCTGA QCrTGATGTC RTGCCACCTG 1026 ÇC^FATCTAT CCftAA3GAOS eríccrasAA ACAAATACGO CO T&C&AC SGTACGTCAA 10S0 XQGCAÍCrCC GCACSTTSCC SSftGCGSCTtS cmoATTcr TICmftGCAC CQOARCTOGA 2240 <ayia.cACTCA ASTCCOCASC ASTTTASAAA acaccactac AAAÁSTStíGT •riATTCrrTQT 1206 ACmTOSAAA AGGí3CfqATC AACSfftC&AG cgí3cagctc:ã GTAAAftCATA ÃAAAACOSGC 2. ^.£3 cttggccccs ccoaTTfTTT ATTArrrrrc rrccrccccA TOTTCAATCC GCTCCATAAT 1320 erax^cT&A AAATTTTAAC GAGAAACGSC GGsriSAccc õqctcaotcc USO cmmcGccc AACTCCT&AA AD3TCTCAAT CQCC8CTTCC asaTTTecGs TCAGCTCAAT 1440 efOC&TAACôâ TceaeG&osr TT T CCi GATA CCÇGGAGACG GCftTtWTAft. TPSGAtC 1497 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 275 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 52 ΡΕ0985042 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

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Ala Ala Cie 27S (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 275 aminoácidos 53 ΡΕ0985042 (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3:

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2?S (2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 274 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4:

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Oly Vai Vai Vai Vai Ala Ala Ala Oly As» Ser Oly A*ft Ser Oly Ser

145 150 155 ISO

Oly Ala Vai Asp Ser Asa Ser Asa Ar» Ala Ser Pàe Ser Ser vai §Iy IS9 105 190

Ala Si» Leu 61« Vai Iter Ala Pro Oly Ala Oly Vai Tyr Ser thr Tyr 195 290 205

Sis Vai Ala. Gly Ma Leu lie LfiU Ser Lys iíis Pr» Asa Lee 2.23 230 33S 24S Ser Ala Ser Gin vai Arg Asíi Ârg Lee Ser Ser Thr Ala tter Tyr Leu 345 250 :25$ Gly Ser Ser Phe Tyr tyr Gly Lys Gly Lee Ile Asa vai Giu Ala. Ala 250 255 270 Ai a Gla (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 269 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Ala Gin Ser Vai Oro Trp Gly lie Ser Arg Vai Gin Ala Pr o Ala Ala i $ 20 25 Kis Asa Atg Gly Leu Thr Gly Se λ* Gly Vai Lys VAI Ala Vai Leu ASp 20 23 30 Thr Gly Tle Ser Thr His Orrt ÃSp Leu Asn li». srg siy Gly Ala Ser SB 4« 4 S Fha vai 1 ro 01.y Glu Pro Ser Thr Gla Asp Gly Asn Gly His- Gly Thr s« 5S 50 Hls vai Ala Gly Thr Ile Ala Aia Leu Aan Asn Sér Ilê Gly Vai Leu ss 7¾ ?£ 80 Gly vai Ala FrG Sar Ala OU; Leu •Wv -v.· * y* Ala Vai Lys Vai Leu Gly Ala os 90 95 Ser Gly Ser Gly Ssr Vai Ser jS&S-jT lis Ma Gin Gly Leu Gly Vrp Ala ISO LOS 210 Gly Asn ASís Gly Hat His Vai Ala Asn Leu Ser Leu oiy Ser Oro Ser 11S 220 12 § 3?re> Ser Ala Thr Leu GIu Gin Ala Vai Asn Ser Ala Ttisr Ser Arg Gly 130 135 140 Vai Leu Vai Vai Ala Ala Ser Gly Asrs Ser eiy Ala SXy Ser He Ser 24 S ISO 1SS X€Q tyr ?r<3 Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Vai Gly Ala Thr Asp Gin 1S5 2 TO 2?S 56 ΡΕ0985042 ASn Asn AS» Arg Ala Ser vhe Ser Gin xyr 3l.y Ala Gly Leu Asp lia ISO 185 Vai Ala Pm âiy Vai Asa Vai Gin S«r Thr TV* Pro Gly Ser Thr Tyr 135 »00 2ds Ala ser Lau Asa fâly Tbr Ser Mas; Ala Thr Pro Mis Vai Ala Ol y Ala K1Q 2i§ 22G Ala Ala L®U vai Lys Gin Lys Aan Ser Trp Ser Asn Vai em Ile »25 230 235 24Ô Arg Asn Hie Leu Lys Jum Thr Ala Ths ser Le» <3ly Ser Thr As ti Leu aas 2S0· 255 Tyr &ly Ser Gly Leu vai ASS Ala QlU Ala Alâ Thr Arg (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1140 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CRACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1140 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ M D 2 O 05 : ATO AAG AM CCG TTO (KaÇí AAA ATT OTC OCA AGC ACC ú.CA CTA ctc ATT 48 Ha fc Lys Lys Pro Leu Gly Lys ile Vai A1& Ser Tnr Ale Leu Lee «8 1 5 IS 15 TCT GTT GCT rrr A3T TOA TCG ATC GCA TCG £CT C-CT OAA GPA. GCA M 3« S«r Vai Ala Ser sar Ser n« Ala ser Ala *01 u Glu Ala Lys »0 3S 30 «3M AM 7AT TTA ATT GGC TTT AAT GA6 CAG uAA GCT GTC AGT C-PiG TTT 144 Glu Lyn iyr Leu Ile Gly Phe Asa Glu Gin Glu Ale vai Ger Glu Phe 3 5 «0 45 <57 A SM CAA STA GAG GOA MT GAC GAO OTC occ ATT CTC <K “ví.· & GAG CAA 192 Vai GlU Gin Vai > . ... V? Λ *VV Ala Asn Asp C5.1, & Vai Ala. Ile Leu Ser Glu GXm SQ S5 60 GAG OAA ísTC GAA ATT GAA TTG CTT CAT Gftft TTT SM ACG ATT CGT GTT Glu GiU vai Glu lie Glu Leu Leu Sis Glu Phe Giu Thr lis Pra Vai 65 70 7S 80 T7& TCC G7T SAG 7TÂ AGC CCA SM GAT OTO GAC g-cg CTT GÁÁ CTC GAT Leu Ser Vai Glu Leu ser Pre Glu Asp Vai Asp Ala Leu Glu Leu Asp 85 se 57 ΡΕ0985042

cm GCG· ATT TCT VÀT ATT QAÂ GAfl «AT «CA (SM uTA A05 A0A ATS GCG 33€ P ro Ms IU Ser Tyr lie Glu Glu ASp Ala GlU VaL Thif Thr Ala. 100 LOS 110 CAA TCA CTG CCA TGG GGA ATT AGC CGT GTG CAA GCC CCA «CT GCC C.AT 3 84 Sla Ser Vai Pr* T?p Gly lie Ser Arçj Vai Gin Ale Pr* Ala Ala Hio 1XS 120 12S AAC cac GGA. TT3 ACA CGT TCT GGT GTA ΑΛΑ GTT GCT «TC CTC «AT ACA 433 Asa Arg Qly Leu Tfir Gly Ser Gly val Ws Vai Ala Val .Leu Asp Thr 130 13S M0 «ST ATT TÇC act C&T CCA «AC TTA AAT ATT CGT GST fí&C i3cr ASC -m 4â0 «ly Il8 Ser Thr His Pr* Asp Lee Asa 11 e Arg Gly Giy Ala Ser The 145 150 158 1¾¾ <3?A ecA G«S OAA CCA tcc ACT C&A GAT SS8 AAT GGG CAT SGC AOS CAT 52 S v*l Pro Gly Glu Pr* ser Thr Gin Asp Gly Asn Gly His Sly Thr His 1SS 170 13S gts «CC GOS AOS ATT GCT GCT TTA AAC AAT TCG ATT Q3C «TT CTT GGC S?6 vaí Ai a Ciy Thr TI 8 Ala Ala Leu A#» Aan Ser Ile C?Iy Val Leu Gly ISO 1SS 19Õ ÇTÂ GCG CCS A3C GCG GAA CTA 'TAC GCT 0TT AAA sm TTA 3«S ®C® AGC 524 Vai Ala Pr* Sar Ala Glu Lee Tyr Ale vai Lys Val Le« Sly Ala Ser 195 im 205 GGT TCA GQT TCG GVC AGC TCG ATT GCC CAA GGA 'TTS SAA TCS GCA G0« G72 Gly Ser CUy Ser vai Ser Ser n« Ala Gin Gly leu Glu Trp Ala Gly 210 215 22« AAC AÃT CGC ATS CAC GYT GCT AAT 3TG AGT TTA GGA ASC GCT TCG CCA 02 0 As» Asm Qly MaE. Ilis Vai Ala hsn Leu Ser Le« Gly Ser Ser Pre 22:5 23 0 23 S 240 AST GCG ACÃ CTT SÃG CÂÃ GCT GT? AAT MC GCG ACT TCT AGA CGC CTT 76 8 Ser Ala Thr Leu SI a Gl* Ala Vai Asa Ser Ala Thr Ser Arg Oly Vai 24S 250 2SS οττ OTT GTA «03 GCA TCT GGG ART TGA GST GCA GSC TCA ATC AGC TÃT Si. 5 i»au vai Vai Ala Ãla Ser Cly Aan Ser Giy Aia Gly Sor Ile Ser Tyr 260 28S 220 CCS GCC CGT TAT GCG ftÂC «CA ÃTC «CA GTC GSA GST1 ACT (3AC CAA AAC 854 Ργώ Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Hfit Ala vai Gly Ala. Thr Asp Gla Ahíi STS 280 2« 5 AAC AAC CGC GCC AGC TTT TCÃ CA® TAT ogc «CA G«G CTT' GAC ATT GCC 01.2 Asn ÃSS Arg Ala Ser Pho ser Gin. Tyr Gly Ala Gly IíSU Asp Ha Val 2m 29S 300· GCA CCA CGT cm AAC GTG CÂG AGC ASA TAC CCA GST TCA AGG TAT GCC $SO Ãla Pr* Gly Vai Ase vai Giíi Ser Th* Tyr Pre Gly Ser Thr Tyr Ala 3 OS 310 SIS ·? 3 ç AGC TTA AAC GGT ACA TOS ATS GCT ACT ecr CAT GTT CCA GGT G«A GCA X0 08 Ser Lee As» Gly Thr Ser «•et Al s Thr Pro «i* Val Ãla. Gly Ãla Ãla 325 330 33 S ΡΕ0985042 58 SCO CTT V? > -4 MA CÃA ÃAG AAC CCA Ala Leu Vai lys Cio l'/â AOO Pro 340 AAT CRU cm A&a AAT acq GCA AOS Asn Ma LíSU Lys Afiti Thr Ala Thr 355 350 GGA AGC GOA CTT GTC AAT GCA GA& «ly Ser Gly leu Vai ASO Ala Slu 300 375 TC? TGG TCC AAT 6TA CAA i^íTC CSC Ser Trp Ser ASO vai Si» Xl« Ar>g 345 35 & A0Ç TTÃ soa AGC ACS AAC TTS TAT Ser L«U ôly Ser Thr Aso Lao. Tyr 355 SOS GCA ACA CSC AÍ s Ala. TM Arg 330 IOSê· 1X04 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 380 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7:

Lys Lya Pro Qly tya Vai Ala Ser Thr Ale Leu Leu íle 1 J 5· 13 15

Ser V*1 Ala Phe Ser Ser S«r 11« Ma Ser Ala Ala Slu Slu Ala &y» 20 as 3« q|U Lys Tyr Leu íle Cly SPhe As» ®lu «X» «lu Ais Vai Ser Glu W*e IS 40 45

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Vai Ala Oly Th* Ile AXa Ala· Leu Asa Aa« Sar Ϊ1» Giy Vai Leu Sly ião ias ise 59 ΡΕ0985042

Vel Ala Fro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Vai Lyss Vai Leu Gly Ala Ser 19S soo 30S.

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Ser ííOtt Asn Gly Thr .Ser &et Ala Thr fixo His vai Ala Gly Ais ala 335 3.30 335

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Ae« Mis Leu lya As» Thr Ala Thr Ser fceu Gly Sor Thr Asn Leu tyx 355 350 355 <Síy Ser Gly &6tt Vai ASh Ala Glu Ala Ala Thr Arg 370 375 380 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1140 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CRACTERÍSTICA:

(C) NOME/CHAVE: CDS (D) LOCALIZAÇÃO: 1..1140 (ix) CRACTERÍSTICA:

(E) NOME/CHAVE: MAT_PEPTIDE (F) LOCALIZAÇÃO: 334..1140 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8:

ATS MG AM C<3G TTG CGÔ MA ATT ÚTC ©CÃ A3C &CC GCA CTA CTC .ATT 4S mt í.y* Lys firo Lsu Gly Ly® lie Vai Ale Ser Thr Ala teu Leu lie -111-110 -105 *100 60 ΡΕ0985042 ÃCT GTT OCT TT? AGT TCA TCO ATC 3CA TCG SCT GCT GAA GAA GCA AAft 96 Ser Vai Ala Phe Ser Ser Ser 11 e Ala. Ser Ala Ala Cl p Glu Ala Lys *95 -90 -gs -80 d&A MA TAT TTA Α7Ϊ GCÕ TT? MT G&3 CAG SAA GCT GTC AGT GAG ΤΓΪ 14 4 Glu Lys Tyr ti&U Xi8 01ϋ Fhe Mn Slu Sl.n. 01 ti Ala val Ser Glu she -75 “TO -6S «a <3A& CAA STA GAG OCA AAT GAC ÓAS GTC scc ATT CTC TC? <sm OM 193 Vai elu Gin val Glu Ala Asn Asp 01« Val Ala n« Leu Ser Glu Glu -60 -8S "SO SAS SSA GTC GAA ATT GAA TTO CTT CAT Gftft TXT GAA ACC AT? CCT GTT 240 Qlu 01« Vai &X« lia Glu Leu Leu tíis Glu Phe Glu Thr Hé Pro Val -45 *40 -3S TTA rcc et? GAG ?m M3C CCA CAA GA? GTO GAC G06 CTT Í*AA CTC QAT 2S3 Leu Ser vai Glu Leu Ser P r© Glu Aap Val Asp Ala Lsu Glu Leu Asp -IS -as -20 CCA ees a?? Ter TÂT ATT GAA GAG GA? gca GA4 ea ACG ACA ATS GCG 3 36 Pr© Ala .;!« Ser Tyr íle ôl.u Glu Assp Ala Glu Val Thr Thr Het. Ale -is -10 -5 1 CAA TCA CTEJ CCA TGG GGA ATT AG C CGT CTC? CM GCC CCA GCT GCC CAT 394 Glrs Ser Vsl Pr© Trp Gly 11« Ser Arg Val Glu Ala Pra Ala Ala Híe S 10 15 ÂAC COT SOA TTG ACA CGT ?c? ggt cm AM GTT GCT G?C CTC CAT ACA 433 Asa Ar3 01 y Leu 7hr Gly Ser Oly Val i<ys Val AU Val Leu Asp Thr 2Õ 25 33 03? ATT TCC ÃCT CA? CCA GAC TTA AAT ATT CGT CGT OGC GCT AGC TTT 480 Gly íis Ser Thr H.is Fria Asp Leu Asn Ue Arg Gly Gly Ala Ser Phe 3S 40 4S GTA CCA GSS GAA CCA TCC ACT CAA GAT GOG AAT CSG CAT GGC ACG CAT 528 vai Pr© C-iy Glu £r<s Ser Thr Gin Asp Gly Asn Gly Hia Gly Thr His so SS so SS gts GCC GOG ÃCG ΑΤΓ oer SCI' TTA GAC AAC TCG ATT GGC GTT CTT GGC 576 Val Ala Giy Thr 11« Ala Ala Leu Asp Asn Ser He Gly Val Leu Gly IS· 7S $0 em SC3: CCS AGC OCw GM CTA TAC OCT GTT m GTA m &3G GCÚ ÂGC 624 VAX Ala PrO Ser Ala Glu Leu Tyr Ai a v*l tye Val Leu Gly Ala Ssr 85 SS 55 OGT tca «se eec ATC AOC TCO ATT occ CM GGA TTG CM TGC CCA SGG 672 Gly Sér Gly Ala. Ils S®:S Ser 11« Alâ Gin Gly .Leu Glu Trp Ala Gly 133 185 uo AAC M? SSC ATO C&C GTT OCT AAT T?G AGT TTA GSA AGC CGT TCG CCA 725 Asn Asn Qly «ee HiS Val Ala Asn Leu §«r Leu Gly Ser Tr© Ser Pr© UB 12 S ias AGT GCC ACA CTT GAG CAA SC? ST? AAT JM8C SOS ACT TCT AGA GÇC GTT TS8 Ser Ala ar T->m GIu. Gin Ala Val ãs» ser Ala TAr Ser Aí.-g Giy val 130 :us y« 145 ΡΕ0985042 CTT 0^*? GtA acs «CA KT AAT GAA GGT GCft GOC TOA ATC ÚAC TAT 816 Leu Vai VAX Ala Ala S-ô;sr Ôly ASrt dlu Sly Ala Sly Ser Xle Aáp Tyr ISO 15$ 150 CCS cec CGT TAT 503 AAC SCA ATS GCA CTC SOA .•ΗγΗΛ?! \2'\_· X. ACT GAC CAA AAC 864 Aro Ala Asg Tyr Ala hsn Ala Ftet jA-+.‘S. Vãl Sly Ala Thr Asp Gin Aan i«5 170 17$ AAC AAC CSC GCC AGC TTT TCA CAG TAT CSC GCA GGS CTT «AC ATT íítC $12 Ais Ser Ph« S«3f Sl a iyr G1 y Ala Sly Leu Aep XX e v31 160 19S ISO GCA CCA G0T STA AAC ΰ'ίΰ CAS ÂOC ACA mc CCA ATT TCA ACS TAT GCC 060 Mã Fr® •Gly VãX Asa val Sim ser Thr Tyr Aro Ile Ser Th2r Tyr Ala Í3S 200 205 AGC TTA AAC CGT aCa TCá ATG SCT ACT CCT CAT st? SCA CCT SCA CCA 1008 Ser L<5tí. A&n Gly Tbr Ser mt Alá Thf pró HiS val Ala >Sly Ala Alã 210 SIS 220 225 SCC CTT CTT AAA CAA mç AAC CCA TCT TGG TCC AAT GTA CAA ATC CSC 105« Ais Leu. ml Lys SI is. Lys &sn Psrs Sor Trp Ser Asa Vai Qli: lie Arg 23 0 23$ 240 ΑΑΧ CA? CTA AAG AAT AOG OCA AEG AOC TTA GOA AGC AOS AAC TT<3 TAT 1104 Asa Hls L-SU Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Aí-fc Leu Tyr 2*15 250 25S GGA AGC SGA CTT STC AAT G-CA GAA CCS SCA ACA CSC 1140 Qiy Gly Le.U Vai A.síi Ala SiUs Ala Ala Thr Arg 260 265 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 380 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii .) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi .) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: S i; Mat •Lyss prp Leu âly Ly.s Π& Vai Ala Ser Thr Ala Leu Lea Ile -11' X -110 -3 tos •100 Ser Val Ala Fhs Ser Ser Jk Ala Ser Alé AXa Glu G.ru. Ala Lys -55 -so -β.§ • SO Glu Lye Tyr Léu. 11® GXy Ph® Asm Siu Gin GlU Alia Vâl Sêr Glu Phè -75 -70 •SS Val Slu ®ln Val Slu Ala. Asr. Aap clu Val Al.e Ha IdSíÍl Ser Gl« Glu -sa -55 -50 Giu Cie Val Ola XI® GXu Lsss Lei! <>u ghe Glu Thr Jls Fro val -45 ~4 Cf - 35

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Ser Trp Ser Asn Vai «In lia Arg 25 S 240 ser Lsu «ly Ser Thr Asn Leu Tyr 2SS .255

Ala .Ala Thr Arg

Lisboa, 17 de Novembro de 2006 ΡΕ0985042 63

Claims

ΡΕ0985042 ι REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição de limpeza compreendendo: (a) uma quantidade eficaz de enzima protease que é uma variante da subtilisina tendo os aminoácidos 210I/76D/103A/ 104I/156E/166D nas posições da subtilisina de Bacillus amyloliquefaciens tendo a sequência de aminoácidos como descrito na Figura 3 (SEQ ID N0:2); (b) um ou mais materiais aditivos de limpeza compatíveis com a enzima protease.
2. Uma composição de limpeza de acordo com a reivindicação 1 em que a referida composição de limpeza é uma composição detergente de lavagem de loiça compreendendo : (a) entre 5% e 90% por peso da composição de uma substância que aumenta a eficiência de limpeza; (b) entre 5% e 90% por peso da composição de tensioactivo detersivo; (c) entre 0,1% e 10% por peso da composição da referida enzima protease. (d) facultativamente, entre 0,1% e 40% por peso da composição de um agente de branqueamento; e (e) materiais aditivos de limpeza.
3. As composições de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-2 em que os materiais aditivos de 2 ΡΕ0985042 limpeza são seleccionados do grupo consistindo em tensioactivos, solventes, tampões, enzimas, agentes de libertação de sujidade, agentes de remoção de sujidade de barro, agentes dispersantes, abrilhantadores, supressores de espuma, amaciadores de tecidos, auxiliadores de espuma, estabilizadores de enzimas, substâncias que aumentam a eficiência de limpeza, agentes de branqueamento, corantes, perfumes e misturas dos mesmos.
4. A composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 compreendendo ainda entre cerca de 5% e cerca de 50% de uma substância que aumenta a eficiência de limpeza seleccionada do grupo consistindo em zeolitos, policarboxilatos, silicatos em camadas, fosfatos e suas misturas.
5. As composições de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-4 em que os materiais aditivos de limpeza compreendem pelo menos um agente de branqueamento.
6. As composições de acordo com a Reivindicação 5 em que o agente de branqueamento é seleccionado do grupo consistindo em percarbonatos, perboratos e suas misturas e, facultativamente, compreendendo ainda pelo menos um activador de branqueamento.
7. As composições de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 em que a composição ainda inclui pelo menos uma enzima detersiva seleccionada do grupo 3 ΡΕ0985042 consistindo em celulases, lipases, amilases, fosfolipases, proteases, peroxidases e suas misturas.
8. Um método de limpeza de tecidos, o referido método compreendendo o contacto de um tecido necessitado de limpeza com a composição como reivindicado em qualquer uma das Reivindicações 1 e 3-7.
9. Um método de limpeza de loiça, o referido método compreendendo o contacto de uma loiça necessitada de limpeza com uma composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-7.
10. Um método de limpeza pessoal, o referido método compreendendo o contacto da parte do ser humano ou do animal inferior necessitado de limpeza com uma composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1-7. Lisboa, 17 de Novembro de 2006