BR112015028666B1

BR112015028666B1 - Composição detergente, método para produzir a mesma, método para a limpeza de um objeto e usos da composição

Info

Publication number: BR112015028666B1
Application number: BR112015028666-6A
Authority: BR
Inventors: Kim Borch; Marco Malten; Lise Munch Mikkelsen; Thomas Agersten Poulsen; Luise Erlandsen; Hanne Philbert Nielsen; Carsten H0Rslev Hansen; Allan Svendsen; Christian Lundager Gylstorff; Jesper Vind; Christian Jãckel
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2013-05-14
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2022-04-12
Also published as: US20160076012A1; WO2014186464A1; CN105209612A; ES2691080T3; MY192746A; MX367018B; WO2014186464A8; US20160068787A1; CN115521831A; US11312946B2; EP2997140A1; RU2020101263A; US20220213453A1; EP3418381A1; BR112015028666B8; BR112015028666A2; WO2014184164A1; EP2997140B1; US10457920B2; EP2997139B1

Abstract

patente de invenção para composições detergentes a presente invenção se relaciona com composições detergentes compreendendo uma variante de uma lipase genitora em que a variante tem atividade de lipase, tem pelo menos 60% mas menos do que 100% de identidade de sequência com a seq id nº: 2, e compreende as substituições nas posições correspondentes a t231r+n233r e, pelo menos, uma ou mais (e.g., várias) de d96e, d111a, d254s, g163k, p256t, g91t, e g38a da seq id nº: 2. a presente invenção também se relaciona com a utilização de composições, métodos de produzir as composições e métodos de limpeza. a presente invenção se relaciona, além disso, com variantes e polinucleotídeos codificando as variantes; constructos de ácidos nucleicos, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos.

Description

REFERÊNCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0001] Esta aplicação contém uma Listagem de Sequências em forma legível por computador, que é aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Área da Invenção

[0002] A presente invenção refere-se a composições que compreendem as variantes de lipase, métodos de produção e utilização das referidas composições, variantes de lipase, polinucleótidos que codificam as variantes, assim como métodos para produzir e utilizar as referidas variantes. Descrição da Técnica Relacionada

[0003] As lipases são biocatalisadores importantes que têm mostrado ser úteis para várias aplicações e um grande número de lipases diferentes têm sido identificadas e muitas comercializada. No entanto, são desejáveis novas lipases adequadas para uso em várias composições adaptadas às condições atualmente utilizadas.

[0004] As lipases têm sido usadas em composições para a remoção de manchas de lípidos por hidrólise de triglicerídeos para gerar ácidos graxos. As composições detergentes correntes, de cuidado e/ou limpeza de tecidos, compreendem vários ingredientes ativos que estão a interferir com a capacidade de lipases para remover manchas de lípidos, além disso, tais composições não são utilizadas imediatamente após a sua produção e, como consequência, a estabilidade da lipase pode ser afectada durante armazenamento. Assim, existe uma necessidade para lipases que são ativas e estáveis no ambiente severo de composições detergentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[05] A presente invenção se relaciona com composições detergentes compreendendo uma variante de uma lipase genitora em que a variante tem atividade de lipase, tem pelo menos 60% mas menos do que 100% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 2, e compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e, pelo menos, uma ou mais (por exemplo, várias) de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, e G38A da SEQ ID N°: 2. A presente invenção também se relaciona com a utilização de composições, métodos para a produção de composições e métodos de limpeza.

[06] A presente invenção se relaciona, além disso, com variantes e polinucleotídeos codificando as variantes; constructos de ácidos nucleicos, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos.

DEFINIÇÕES

[07] Lipase: Os termos "lipase", "enzima lipase", "enzima lipolítica", "esterase lipídica", "polipeptídeo lipolítico", e "proteína lipolítica" refere-se a uma enzima na classe EC3.1.1 como definido pela Enzyme Nomenclature. Pode ter atividade de lipase (triacilglicerol lipase, EC3.1.1.3), atividade de cutinase (EC3.1.1.74), atividade de esteril esterase(EC3.1.1.13) e/ou atividade de éster-cera hidrolase (EC3.1.1.50). Para propósitos da presente invenção, a atividade da lipase é determinada de acordo com o procedimento descrito nos Exemplos. Em um aspeto, as variantes da presente invenção têm pelo menos 20 %, por ex., pelo menos 25 %, pelo menos 30 %, pelo menos 35 %, pelo menos 40 %, pelo menos 45 %, pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou 100 % da atividade de lipase do polipeptídeo de SEQ ID N°: 2.

[08] Variante alélica: O termo "variante alélica" significa qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro de populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (nenhuma mudança no polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.

[09] cDNA: O termo "cDNA" significa uma molécula de DNA que pode ser preparada por transcrição reversa de uma molécula de mRNA madura, processada, obtida de uma célula eucariótica ou procariótica. O cDNA não tem sequências de íntron que possam estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário inicial é um precursor de mRNA que é processado através de uma série de passos, incluindo processamento, antes de aparecer como mRNA maduro processado.

[010] Sequência codificante: O termo "sequência codificante" significa um polinucleotídeo, que especifica diretamente a sequência de aminoácidos de uma variante. As fronteiras da sequência codificante são geralmente determinadas por uma grelha de leitura aberta, que começa com um códon de iniciação tal como ATG, GTG, ou TTG e termina com um códon de terminação tal como TAA, TAG, ou TGA. A sequência codificante pode ser um DNA genômico, cDNA, DNA sintético, ou uma sua combinação.

[011] Sequências de controle: O termo "sequências de controle" significa sequências de ácido nucleico necessárias para expressão de um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa do (/.e., do mesmo gene) ou estranha (/.e., de um gene diferente) ao polinucleotídeo codificando a variante ou nativa ou estranha entre si. Tais sequências de controle incluem, mas não estão limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de pró-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo sinal, e terminador da transcrição. No mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sequências de terminação transcricional e translacional. As sequências de controle podem ser proporcionadas com ligantes para o propósito de introdução de locais de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle à região codificante do polinucleotídeo codificando uma variante.

[012] Expressão: O termo "expressão" inclui qualquer passo envolvido na produção de uma variante incluindo, mas não se limitando a, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós- translacional, e secreção.

[013] Vetor de expressão: O termo "vetor de expressão" significa uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante e está operacionalmente ligado a sequências de controle que proporcionam a sua expressão.

[014] Fragmento: O termo "fragmento" significa um polipeptídeo tendo um ou mais (por ex., vários) aminoácidos ausentes do terminal amino e/ou carboxila de um polipeptídeo; em que o fragmento tem atividade de lipase. Em um aspeto, um fragmento tem pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 % mas menos do que 100 %, do número de aminoácidos 1 a 369 da SEQ ID N°: 2.

[015] Condições de elevada estringência: O termo "condições de elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 65 °C.

[016] Célula hospedeira: O termo "célula hospedeira" significa qualquer tipo de célula que seja suscetível a transformação, transfecção, transdução, ou similares com um constructo de ácidos nucleicos ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação.

[017] Propriedade melhorada: O termo "propriedade melhorada" significa uma característica associada a uma variante que é melhorada em comparação com a lipase genitora. Tais propriedades melhoradas incluem, mas não estão limitas a, estabilidade detergente, estabilidade em detergente com protease presente, estabilidade de protease, estabilidade química, estabilidade à oxidação, estabilidade ao pH, estabilidade em condições de armazenamento, e termoestabilidade.

[018] Isolado: O termo "isolado" significa uma substância em uma forma ou ambiente que não ocorre na natureza. Exemplos não limitantes de substâncias isoladas incluem (1) qualquer substância não ocorrendo naturalmente, (2) qualquer substância incluindo, mas não se limitando a, qualquer enzima, variante, ácido nucleico, proteína, peptídeo ou cofator, que é pelo menos parcialmente removida de um ou mais ou todos os constituintes ocorrendo naturalmente com os quais está associada na natureza; (3) qualquer substância modificada pelo homem em relação a essa substância encontrada na natureza; ou (4) qualquer substância modificada por aumento da quantidade da substância em relação a outros componentes aos quais está naturalmente associada (p.ex., múltiplas cópias de um gene codificando a substância ou uso de um promotor mais forte do que o promotor naturalmente associado ao gene codificando a substância). Uma substância isolada pode estar presente em uma amostra de caldo de fermentação.

[019] Condições de baixa estringência: O termo "condições de baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 50 °C.

[020] Polipeptídeo maduro: O termo "polipeptídeo maduro" significa um polipeptídeo em sua forma final após tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, tais como processamento N-terminal, truncação C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é os aminoácidos 1 a 269 de SEQ ID N°: 2. É conhecido na técnica que uma célula hospedeira pode produzir uma mistura de dois ou mais polipeptídeos maduros diferentes (/.e., com um aminoácido C-terminal e/ou N-terminal diferente) expressos pelo mesmo polinucleotídeo.

[021] Sequência codificante do polipeptídeo maduro: O termo "sequência codificante do polipeptídeo maduro" significa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo maduro tendo atividade de enzima lipase. Em um aspecto, a sequência codificante do polipeptídeo maduro é os nucleotídeos 1 a 807 de SEQ ID N°: 1.

[022] Condições de média estringência: O termo "condições de média estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 55 °C.

[023] Condições de média-elevada estringência: O termo "condições de média-elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 35 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 60 °C.

[024] Mutante: O termo "mutante" significa um polinucleotídeo codificando uma variante.

[025] Constructo de ácido nucleico: O termo "constructo de ácido nucleico" significa uma molécula de ácido nucleico, de fita simples ou dupla, que é isolada de um gene ocorrendo naturalmente ou é modificada para conter segmentos de ácidos nucleicos de um modo que de outra maneira não existiria na natureza ou que é sintética, que compreende uma ou mais sequências de controle.

[026] Operacionalmente ligado: O termo "operacionalmente ligado" significa uma configuração na qual uma sequência de controle é colocada em uma posição apropriada em relação à sequência codificante de um polinucleotídeo tal que a sequência de controle dirija a expressão da sequência codificante.

[027] Genitor ou lipase genitora: O termo "genitor" ou "lipase genitora" significa uma lipase à qual é feita uma alteração para produzir as variantes de enzima da presente invenção. A lipase genitora pode ser um polipeptídeo que ocorre naturalmente (tipo selvagem) ou uma sua variante ou fragmento.

[028] Identidade de sequência: A relação entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrita pelo parâmetro "identidade de sequência".

[029] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Resíduos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[030] Para propósitos da presente invenção, a identidade de sequência entre duas sequências de desoxirribonucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, supra), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). O resultado de Needle marcado "identidade mais longa" (obtido usando a opção -nobrief) é usado como a percentagem de identidade e é calculado como se segue: (Desoxirribonucleotídeos Idênticos x 100)/(Comprimento do Alinhamento - Número Total de Intervalos no Alinhamento)

[031] Estabilidade: A estabilidade de uma lipase pode ser expressa como a atividade residual ou o desempenho residual da referida lipase durante ou após a exposição a várias condições de teste, tais como por exemplo, armazenamento numa composição detergente, a várias temperaturas, a vários pH, na presença de diferentes componentes, tais como protease, produtos químicos, e/ou substâncias oxidativas (condições de estresse). A estabilidade de uma variante de lipase pode ser medida em relação a uma atividade conhecida ou desempenho de uma lipase genitora, ou, alternativamente, a uma atividade ou desempenho conhecida da variante de lipase quando inicialmente é adicionada à composição detergente, opcionalmente armazenada a frio ou congelada, ou em relação à variante de lipase armazenada a frio ou congelada (condições sem estresse).

[032] Subsequência: O termo "subsequência" significa um polinucleotídeo tendo um ou mais (por ex., vários) nucleotídeos ausentes da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência codificante do polipeptídeo maduro; em que a subsequência codifica um fragmento tendo atividade de lipase. Em um aspeto, a subsequência tem pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 %, mas menos do que 100 %, do número de nucleotídeos 1 a 807 da SEQ ID N°: 1.

[033] Variante: O termo "variante" significa um polipeptídeo tendo atividade de lipase compreendendo uma alteração, /.e., uma substituição, inserção, e/ou deleção, em uma ou mais (por ex., várias) posições. Uma substituição significa substituição do aminoácido ocupando uma posição por um aminoácido diferente; uma deleção significa remoção do aminoácido ocupando uma posição; e uma inserção significa adição de um aminoácido adjacente e imediatamente a seguir ao aminoácido ocupando uma posição. As variantes da presente invenção têm pelo menos 20 %, por ex., pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 100 % da atividade de lipase do polipeptídeo de SEQ ID N°: 2.

[034] Condições de muito elevada estringência: O termo "condições de muito elevada estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 50 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 70 °C.

[035] Condições de muito baixa estringência: O termo "condições de muito baixa estringência" significa, para sondas com pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, pré-hibridação e hibridação a 42 °C em 5X SSPE, SDS a 0,3 %, 200 microgramas/mL de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e formamida a 25 %, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão durante 12 a 24 horas. O material transportador é finalmente lavado três vezes cada uma durante 15 minutos usando 2X SSC, SDS a 0,2 % a 45 °C.

[036] Lipase de tipo selvagem: O termo lipase de "tipo selvagem" significa uma lipase expressa por um microrganismo ocorrendo naturalmente, tal como uma bactéria, levedura, ou fungo filamentoso encontrado na natureza.

Convenções para Designação de Variantes

[037] Para propósitos da presente invenção, o polipeptídeo divulgado na SEQ ID N°: 2 é usado para se determinar o resíduo de aminoácido correspondente em outra lipase. A sequência de aminoácidos de outra lipase é alinhada com a SEQ ID N°: 2, e, com base no alinhamento, o número de posição do aminoácido correspondendo a qualquer resíduo de aminoácido no polipeptídeo divulgado em SEQ ID N°: 2 é determinado usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferencialmente versão 5.0.0 ou posterior. Os parâmetros usados são penalidade de intervalo aberto de 10, penalidade de extensão de intervalo de 0,5, e a matriz de substituição EBLOSUM62 (versão EMBOSS de BLOSUM62).

[038] A identificação do resíduo de aminoácido correspondente em outra lipase pode ser determinada por um alinhamento de múltiplas sequências de polipeptídeos usando vários programas de computador incluindo, mas não se limitando a, MUSCLE (comparação de múltiplas sequências por expectativa log; versão 3.5 ou superior; Edgar, 2004, Nucleic Acids Research 32: 1792-1797), MAFFT (versão 6.857 ou posterior; Katoh e Kuma, 2002, Nucleic Acids Research 30: 3059-3066; Katoh et al., 2005, Nucleic Acids Research 33: 511-518; Katoh e Toh, 2007, Bioinformatics 23: 372-374; Katoh et al., 2009, Methods in Molecular Biology 537: 39-64; Katoh e Toh, 2010, Bioinformatics 26: 1899-1900), e EMBOSS EMMA empregando ClustalW (1.83 ou posterior; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research 22: 4673-4680), usando seus respectivos parâmetros de definição.

[039] Quando a outra enzima divergiu do polipeptídeo de SEQ ID N°: 2 tal que a comparação tradicional baseada em sequências falha em detectar a sua relação (Lindahl e Elofsson, 2000, J. Mol. Biol. 295: 613-615) podem ser usados outros algoritmos de comparação de sequência par a par. Pode ser alcançada maior sensibilidade na pesquisa com base em sequências usando programas de pesquisa que utilizam representações probabilísticas de famílias de polipeptídeos (perfis) para pesquisar bases de dados. Por exemplo, o programa PSI-BLAST gera perfis através de um processo iterativo de pesquisa de bases de dados e é capaz de detectar homólogos remotos (Atschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389- 3402). Pode ser alcançada ainda maior sensibilidade se a família ou superfamília para o polipeptídeo tiver um ou mais representantes nas bases de dados de estrutura de proteína. Programas tais como GenTHREADER (Jones, 1999, J. Mol. Biol. 287: 797-815; McGuffin e Jones, 2003, Bioinformatics 19: 874-881) utilizam informação de uma variedade de fontes (PSI-BLAST, previsão de estrutura secundária, perfis de alinhamentos estruturais, e potenciais de solvatação) como entrada para uma rede neural que prevê a dobragem estrutural para uma sequência de consulta. Similarmente, o método de Gough et al., 2000, J. Mol. Biol. 313: 903-919, pode ser usado para alinhar uma sequência de estrutura desconhecida com os modelos de superfamília presentes na base de dados SCOP. Estes alinhamentos podem por sua vez ser usados para gerar modelos de homologia para o polipeptídeo, e tais modelos podem ser avaliados quanto à precisão usando uma variedade de ferramentas desenvolvidas para esse propósito.

[040] Para proteínas de estrutura conhecida estão disponíveis várias ferramentas e recursos para recuperar e gerar alinhamentos estruturais. Por exemplo, as superfamílias de proteínas SCOP foram estruturalmente alinhadas, e esses alinhamentos estão acessíveis e podem ser baixados. Duas ou mais estruturas de proteína podem ser alinhadas usando uma variedade de algoritmos tais como a matriz de alinhamento de distância (Holm e Sander, 1998, Proteins 33: 88-96) ou extensão combinatória (Shindyalov e Bourne, 1998, Protein Engineering 11: 739-747), e pode ser adicionalmente utilizada implementação destes algoritmos para consultar bases de dados de estruturas com uma estrutura de interesse de modo a descobrir possíveis homólogos estruturais (p.ex., Holm e Park, 2000, Bioinformatics 16: 566-567).

[041] Ao descrever as variantes da presente invenção, a nomenclatura descrita em baixo é adaptada para facilidade de referência. É usada a abreviatura de aminoácidos de letra única ou três letras da IUPAC aceite.

[042] Substituições. Para uma substituição de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido substituído. Em conformidade, a substituição de treonina na posição 226 por alanina é designada como "Thr226Ala" ou "T226A". Mutações múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), por ex., "Gly205Arg + Ser411Phe" ou "G205R + S411F", representando substituições nas posições 205 e 411 da glicina (G) por arginina (R) e serina (S) por fenilalanina (F), respectivamente.

[043] Deleções. Para uma deleção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição*. Em conformidade, a deleção de glicina na posição 195 é designada como "Gly195*" ou "G195*". Deleções múltiplas são separadas por sinais de adição ("+"), por ex., "Gly195* + Ser411*" ou "G195* + S411*".

[044] Inserções. Para uma inserção de aminoácidos é usada a seguinte nomenclatura: Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido. Em conformidade, a inserção de lisina após glicina na posição 195 é designada "Gly195GlyLys" ou "G195GK". Uma inserção de múltiplos aminoácidos é designada [Aminoácido original, posição, aminoácido original, aminoácido inserido #1, aminoácido inserido #2; efc.]. Por exemplo, a inserção de lisina e alanina após glicina na posição 195 é indicada como "Gly195GlyLysAla" ou "G195GKA".

[045] Em tais casos, o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s) é(são) numerado(s) pela adição de minúsculas ao número de posição do resíduo de aminoácido precedendo o(s) resíduo(s) de aminoácido(s) inserido(s). No exemplo acima, a sequência seria então:

[046] Alterações múltiplas. Variantes compreendendo múltiplas substituições são separadas por sinais de adição ("+"), por ex., "Arg170Tyr+Gly195Glu" ou "R170Y+G195E" representando uma substituição de arginina e glicina nas posições 170 e 195 por tirosina e ácido glutâmico, respectivamente.

[047] Diferentes alterações. Onde alterações diferentes podem ser introduzidas em uma posição, as alterações diferentes são separadas por uma vírgula, por ex., "Arg170Tyr,Glu" representa uma substituição de arginina na posição 170 por tirosina ou ácido glutâmico. Assim, "Tyr167Gly,Ala + Arg170Gly,Ala" designa as seguintes variantes: "Tyr167Gly+Arg 170Gly", "Tyr167Gly+Arg 170Ala", "Tyr167Ala+Arg 170Gly", e "Tyr167Ala+Arg170Ala".

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[048] A presente invenção se relaciona com composições que compreendem variantes de lipase em que a variante compreende substituições em posições correspondentes a T231R+N233R e, pelo menos, um ou mais (por exemplo, vários) do polipéptido de SEQ ID N°: 2, em que a variante tem atividade de lipase. Variantes

[049] A presente invenção proporciona variantes de lipase, e compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e, pelo menos, uma ou mais (por ex., várias) de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, e G38A da SEQ ID N°: 2, em que a variante tem atividade de lipase. Em alguns aspectos a variante compreende adicionalmente as substituições nas posições correspondentes a D27R e/ou N33Q da SEQ ID N°: 2.

[050] Em um aspecto, a variante tem identidade de sequência de pelo menos 60 %, por ex., pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, com a sequência de aminoácidos da lipase genitora. Em outro aspecto, a variante tem pelo menos 60 %, por ex., pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, tal como pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos do que 100 %, de identidade de sequência com SEQ ID N°: 2.

[051] Em um aspecto, o número de substituições nas variantes da presente invenção é 1-40, por ex., 1-30, 1-20, 1-10 e 1-5, tal como 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 substituições.

[052] Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e, pelo menos, uma ou mais (por exemplo, várias) de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, e G38A da SEQ ID N°: 2. Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e em duas posições correspondendo a qualquer uma das posições D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2. Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e em três posições correspondendo a qualquer uma das posições D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2. Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e em quatro posições correspondendo a qualquer uma das posições D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2. Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e em cinco posições correspondendo a qualquer uma das posições D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2. Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e em seis posições correspondendo a qualquer uma das posições D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2. Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e em sete posições correspondendo a qualquer uma das posições D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2. Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e em oito posições correspondendo a qualquer uma das posições D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2. Em outro aspecto, a variante compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e em nove posições correspondendo a qualquer uma das posições D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2.

[053] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 96. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 96 está substituído por Glu, Gly, Ser, ou Val, preferencialmente por Glu. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição D96E da SEQ ID N°: 2.

[054] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 111. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 111 está substituído por Ala, Gly, Ile, Leu, Met, ou Val, preferencialmente por Ala. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição D111A da SEQ ID N°: 2.

[055] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 254. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 254 está substituído por Ser, ou Thr, preferencialmente por Ser. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição D254S da SEQ ID N°: 2.

[056] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 163. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 163 está substituído por Asp, Glu, His, ou Lys. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição G163K da SEQ ID N°: 2.

[057] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 256. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 256 está substituído por Lys, Ser, ou Thr, preferencialmente por Thr. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição P256T da SEQ ID N°: 2.

[058] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 91. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 91 está substituído por Ala, Asn, Gln, Glu, Ile, Leu, Ser, Thr, Trp, ou Val, preferencialmente por Thr. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição G91T da SEQ ID N°: 2.

[059] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 38. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 38 está substituído por Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Ile, Leu, Met, ou Val, preferencialmente por Ala. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição G38A da SEQ ID N°: 2.

[060] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 27. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 27 está substituído por Arg, His, ou Lys, preferencialmente por Arg. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição D27R da SEQ ID N°: 2.

[061] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e posição 33. Em outro aspecto, o aminoácido em uma posição correspondendo à posição 33 está substituído por Gln, Lys, Ser, ou Thr, preferencialmente por Gln. Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste na substituição N33Q da SEQ ID N°: 2.

[062] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições T231R+N233R e uma de 27+33; 27+38; 27+91; 27+96; 27+111; 27+163; 27+254; 27+256; 33+38; 33+91; 33+96; 33+111; 33+163; 33+254; 33+256; 38+91; 38+96; 38+111; 38+163; 38+254; 38+256; 91+96; 91+111; 91+163; 91+254; 91+256; 96+111; 96+163; 96+254; 96+256; 111+163; 111+254; 111+256; 163+254; 163+256; ou 254+256, tal como aquelas descritas acima.

[063] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições T231R+N233R e uma de 27+33+38; 27+33+91; 27+33+96; 27+33+111; 27+33+163; 27+33+254; 27+33+256; 27+38+91; 27+38+96; 27+38+111; 27+38+163; 27+38+254; 27+38+256; 27+91+96; 27+91+111; 27+91+163; 27+91+254; 27+91+256; 27+96+111; 27+96+163; 27+96+254; 27+96+256; 27+111+163; 27+111+254; 27+111+256; 27+163+254; 27+163+256; 27+254+256; 33+38+91; 33+38+96; 33+38+111; 33+38+163; 33+38+254; 33+38+256; 33+91+96; 33+91+111; 33+91+163; 33+91+254; 33+91+256; 33+96+111; 33+96+163; 33+96+254; 33+96+256; 33+111+163; 33+111+254; 33+111+256; 33+163+254; 33+163+256; 33+254+256; 38+91+96; 38+91+111; 38+91+163; 38+91+254; 38+91+256; 38+96+111; 38+96+163; 38+96+254; 38+96+256; 38+111+163; 38+111+254; 38+111+256; 38+163+254; 38+163+256; 38+254+256; 91+96+111; 91+96+163; 91+96+254; 91+96+256; 91+111+163; 91+111+254; 91+111+256; 91+163+254; 91+163+256; 91+254+256; 96+111+163; 96+111+254; 96+111+256; 96+163+254; 96+163+256; 96+254+256; 111+163+254; 111+163+256; 111+254+256; ou 163+254+256 tal como aquelas descritas acima.

[064] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições T231R+N233R e uma de 27+33+38+91; 27+33+38+96; 27+33+38+111; 27+33+38+163; 27+33+38+254; 27+33+38+256; 27+33+91+96; 27+33+91+111; 27+33+91+163; 27+33+91+254; 27+33+91+256; 27+33+96+111; 27+33+96+163; 27+33+96+254; 27+33+96+256; 27+33+111+163; 27+33+111+254; 27+33+111+256; 27+33+163+254; 27+33+163+256; 27+33+254+256; 27+38+91+96; 27+38+91+111; 27+38+91+163; 27+38+91+254; 27+38+91+256; 27+38+96+111; 27+38+96+163; 27+38+96+254; 27+38+96+256; 27+38+111+163; 27+38+111+254; 27+38+111+256; 27+38+163+254; 27+38+163+256; 27+38+254+256; 27+91+96+111; 27+91+96+163; 27+91+96+254; 27+91+96+256; 27+91+111+163; 27+91+111+254; 27+91+111+256; 27+91+163+254; 27+91+163+256; 27+91+254+256; 27+96+111+163; 27+96+111+254; 27+96+111+256; 27+96+163+254; 27+96+163+256; 27+96+254+256; 27+111+163+254; 27+111+163+256; 27+111+254+256; 27+163+254+256; 33+38+91+96; 33+38+91+111; 33+38+91+163; 33+38+91+254; 33+38+91+256; 33+38+96+111; 33+38+96+163; 33+38+96+254; 33+38+96+256; 33+38+111+163; 33+38+111+254; 33+38+111+256; 33+38+163+254; 33+38+163+256; 33+38+254+256; 33+91+96+111; 33+91+96+163; 33+91+96+254; 33+91+96+256; 33+91+111+163; 33+91+111+254; 33+91+111+256; 33+91+163+254; 33+91+163+256; 33+91+254+256; 33+96+111+163; 33+96+111+254; 33+96+111+256; 33+96+163+254; 33+96+163+256; 33+96+254+256; 33+111+163+254; 33+111+163+256; 33+111+254+256; 33+163+254+256; 38+91+96+111; 38+91+96+163; 38+91+96+254; 38+91+96+256; 38+91+111+163; 38+91+111+254; 38+91+111+256; 38+91+163+254; 38+91+163+256; 38+91+254+256; 38+96+111+163; 38+96+111+254; 38+96+111+256; 38+96+163+254; 38+96+163+256; 38+96+254+256; 38+111+163+254; 38+111+163+256; 38+111+254+256; 38+163+254+256; 91+96+111+163; 91+96+111+254; 91+96+111+256; 91+96+163+254; 91+96+163+256; 91+96+254+256; 91+111+163+254; 91+111+163+256; 91+111+254+256; 91+163+254+256; 96+111+163+254; 96+111+163+256; 96+111+254+256; 96+163+254+256; ou 111+163+254+256 tal como aquelas descritas acima.

[065] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições T231R+N233R e uma de 27+33+38+91+96; 27+33+38+91+111; 27+33+38+91+163; 27+33+38+91+254; 27+33+38+91+256; 27+33+38+96+111; 27+33+38+96+163; 27+33+38+96+254; 27+33+38+96+256; 27+33+38+111+163; 27+33+38+111+254; 27+33+38+111+256; 27+33+38+163+254; 27+33+38+163+256; 27+33+38+254+256; 27+33+91+96+111; 27+33+91+96+163; 27+33+91+96+254; 27+33+91+96+256; 27+33+91+111+163; 27+33+91+111+254; 27+33+91+111+256; 27+33+91+163+254; 27+33+91+163+256; 27+33+91+254+256; 27+33+96+111+163; 27+33+96+111+254; 27+33+96+111+256; 27+33+96+163+254; 27+33+96+163+256; 27+33+96+254+256; 27+33+111+163+254; 27+33+111+163+256; 27+33+111+254+256; 27+33+163+254+256; 27+38+91+96+111; 27+38+91+96+163; 27+38+91+96+254; 27+38+91+96+256; 27+38+91+111+163; 27+38+91+111+254; 27+38+91+111+256; 27+38+91+163+254; 27+38+91+163+256; 27+38+91+254+256; 27+38+96+111+163; 27+38+96+111+254; 27+38+96+111+256; 27+38+96+163+254; 27+38+96+163+256; 27+38+96+254+256; 27+38+111+163+254; 27+38+111+163+256; 27+38+111+254+256; 27+38+163+254+256; 27+91+96+111+163; 27+91+96+111+254; 27+91+96+111+256; 27+91+96+163+254; 27+91+96+163+256; 27+91+96+254+256; 27+91+111+163+254; 27+91+111+163+256; 27+91+111+254+256; 27+91+163+254+256; 27+96+111+163+254; 27+96+111+163+256; 27+96+111+254+256; 27+96+163+254+256; 27+111+163+254+256; 33+38+91+96+111; 33+38+91+96+163; 33+38+91+96+254; 33+38+91+96+256; 33+38+91+111+163; 33+38+91+111+254; 33+38+91+111+256; 33+38+91+163+254; 33+38+91+163+256; 33+38+91+254+256; 33+38+96+111+163; 33+38+96+111+254; 33+38+96+111+256; 33+38+96+163+254; 33+38+96+163+256; 33+38+96+254+256; 33+38+111+163+254; 33+38+111+163+256; 33+38+111+254+256; 33+38+163+254+256; 33+91+96+111+163; 33+91+96+111+254; 33+91+96+111+256; 33+91+96+163+254; 33+91+96+163+256; 33+91+96+254+256; 33+91+111+163+254; 33+91+111+163+256; 33+91+111+254+256; 33+91+163+254+256; 33+96+111+163+254; 33+96+111+163+256; 33+96+111+254+256; 33+96+163+254+256; 33+111+163+254+256; 38+91+96+111+163; 38+91+96+111+254; 38+91+96+111+256; 38+91+96+163+254; 38+91+96+163+256; 38+91+96+254+256; 38+91+111+163+254; 38+91+111+163+256; 38+91+111+254+256; 38+91+163+254+256; 38+96+111+163+254; 38+96+111+163+256; 38+96+111+254+256; 38+96+163+254+256; 38+111+163+254+256; 91+96+111+163+254; 91+96+111+163+256; 91+96+111+254+256; 91+96+163+254+256; 91+111+163+254+256; ou 96+111+163+254+256 tal como aquelas descritas acima.

[066] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições T231R+N233R e uma de 27+33+38+91+96+111; 27+33+38+91+96+163 27+33+38+91+96+254; 27+33+38+91+96+256; 27+33+38+91+111+163 27+33+38+91+111+254; 27+33+38+91+111+256; 27+33+38+91+163+254 27+33+38+91+163+256; 27+33+38+91+254+256; 27+33+38+96+111+163 27+33+38+96+111+254; 27+33+38+96+111+256; 27+33+38+96+163+254 27+33+38+96+163+256; 27+33+38+96+254+256 27+33+38+111+163+254; 27+33+38+111+163+256 27+33+38+111+254+256; 27+33+38+163+254+256 27+33+91+96+111+163; 27+33+91+96+111+254; 27+33+91+96+111+256 27+33+91+96+163+254; 27+33+91+96+163+256; 27+33+91+96+254+256 27+33+91+111+163+254; 27+33+91+111+163+256 27+33+91+111+254+256; 27+33+91+163+254+256 27+33+96+111+163+254; 27+33+96+111+163+256 27+33+96+111+254+256; 27+33+96+163+254+256 27+33+111+163+254+256; 27+38+91+96+111+163 27+38+91+96+111+254; 27+38+91+96+111+256; 27+38+91+96+163+254 27+38+91+96+163+256; 27+38+91+96+254+256 27+38+91+111+163+254; 27+38+91+111+163+256 27+38+91+111+254+256; 27+38+91+163+254+256 27+38+96+111+163+254; 27+38+96+111+163+256 27+38+96+111+254+256; 27+38+96+163+254+256 27+38+111+163+254+256; 27+91+96+111+163+254 27+91+96+111+163+256; 27+91+96+111+254+256 27+91+96+163+254+256; 27+91+111+163+254+256 27+96+111+163+254+256; 33+38+91+96+111+163 33+38+91+96+111+254; 33+38+91+96+111+256; 33+38+91+96+163+254 33+38+91+96+163+256; 33+38+91+96+254+256 38+96+111+163+254+256; ou 91+96+111+163+254+256 tal como aquelas descritas acima.

[067] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições T231R+N233R e uma de 27+33+38+91+96+111+163; 27+38+96+111+163+254+256; 27+91+96+111+163+254+256; 33+38+91+96+111+163+254; 33+38+91+96+111+163+256; 33+38+91+96+111+254+256; 33+38+91+96+163+254+256; 33+38+91+111+163+254+256; 33+38+96+111+163+254+256; 33+91+96+111+163+254+256; ou 38+91+96+111+163+254+256 tal como aquelas descritas acima.

[068] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições T231R+N233R e uma de 27+33+38+91+96+111+163+254; 27+33+38+91+96+111+163+256; 27+33+38+91+96+111+254+256; 27+33+38+91+96+163+254+256; 27+33+38+91+111+163+254+256; 27+33+38+96+111+163+254+256; 27+33+91+96+111+163+254+256; 27+38+91+96+111+163+254+256; ou 33+38+91+96+111+163+254+256 tal como aquelas descritas acima.

[069] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições correspondendo às posições T231R+N233R e 27+33+38+91+96+111+163+254+256 tal como aquelas descritas acima.

[070] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em T231R+N233R e uma ou mais (por ex., várias) substituições selecionadas do grupo consistindo em D27R, N33Q, G38A, G91T, D96E, D111A, G163K, D254S, e P256T.

[071] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e uma de D27R+N33Q; D27R+G38A; D27R+G91T; D27R+D96E; D27R+D111A; D27R+G163K; D27R+D254S; D27R+P256T; N33Q+G38A; N33Q+G91T; N33Q+D96E; N33Q+D111A; N33Q+G163K; N33Q+D254S; N33Q+P256T; G38A+G91T; G38A+D96E; G38A+D111A; G38A+G163K ; G38A+D254S; G38A+P256T; G91T+D96E; G91T+D111A; G91T+G163K ; G91T+D254S; G91T+P256T; D96E+D111A; D96E+G163K; D96E+D254S; D96E+P256T; D111A+G163K; D111A+D254S; D111A+P256T; G163K+D254S; G163K+P256T; ou D254S+P256T da SEQ ID N°: 2.

[072] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e uma de D27R+N33Q+G38A; D27R+N33Q+G91T; D27R+N33Q+D96E; D27R+N33Q+D111A; D27R+N33Q+G163K; D27R+N33Q+D254S; D27R+N33Q+P256T; D27R+G38A+G91T; D27R+G38A+D96E; D27R+G38A+D111A; D27R+G38A+G163K; D27R+G38A+D254S; D27R+G38A+P256T; D27R+G91T+D96E; D27R+G91T+D111A; D27R+G91T+G163K; D27R+G91T+D254S; D27R+G91T+P256T; D27R+D96E+D111A; D27R+D96E+G163K; D27R+D96E+D254S; D27R+D96E+P256T; D27R+D111A+G163K; D27R+D111A+D254S; D27R+D111A+P256T; D27R+G163K+D254S; D27R+G163K+P256T; D27R+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T; N33Q+G38A+D96E; N33Q+G38A+D111A; N33Q+G38A+G163K; N33Q+G38A+D254S; N33Q+G38A+P256T; N33Q+G91T+D96E; N33Q+G91T+D111A; N33Q+G91T+G163K; N33Q+G91T+D254S; N33Q+G91T+P256T; N33Q+D96E+D111A; N33Q+D96E+G163K; N33Q+D96E+D254S; N33Q+D96E+P256T; N33Q+D111A+G163K; N33Q+D111A+D254S; N33Q+D111A+P256T; N33Q+G163K+D254S; N33Q+G163K+P256T; N33Q+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E; G38A+G91T+D111A; G38A+G91T+G163K; G38A+G91T+D254S; G38A+G91T+P256T; G38A+D96E+D111A; G38A+D96E+G163K; G38A+D96E+D254S; G38A+D96E+P256T; G38A+D111A+G163K; G38A+D111A+D254S; G38A+D111A+P256T; G38A+G163K+D254S; G38A+G163K+P256T; G38A+D254S+P256T; G91T+D96E+D111A; G91T+D96E+G163K; G91T+D96E+D254S; G91T+D96E+P256T; G91T+D111A+G163K; G91T+D111A+D254S; G91T+D111A+P256T; G91T+G163K+D254S; G91T+G163K+P256T; G91T+D254S+P256T; D96E+D111A+G163K; D96E+D111A+D254S; D96E+D111A+P256T; D96E+G163K+D254S; D96E+G163K+P256T; D96E+D254S+P256T; D111A+G163K+D254S; D111A+G163K+P256T; D111A+D254S+P256T; ou G163K+D254S+P256T da SEQ ID N°: 2.

[073] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e uma de D27R+N33Q+G38A+D111A; D27R+N33Q+G38A+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E; D27R+N33Q+G91T+G163K; D27R+N33Q+G91T+P256T; D27R+N33Q+D96E+G163K; D27R+N33Q+D96E+P256T; D27R+N33Q+D111A+D254S; D27R+N33Q+G163K+D254S; D27R+N33Q+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A; D27R+G38A+G91T+D254S; D27R+G38A+D96E+D111A; D27R+G38A+D96E+D254S; D27R+G38A+D111A+G163K; D27R+G38A+D111A+P256T; D27R+G38A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E D27R+N33Q+G38A+G163K D27R+N33Q+G38A+P256T D27R+N33Q+G91T+D111A D27R+N33Q+G91T+D254S D27R+N33Q+D96E+D111A D27R+N33Q+D96E+D254S D27R+N33Q+D111A+G163K D27R+N33Q+D111A+P256T D27R+N33Q+G163K+P256T D27R+G38A+G91T+D96E D27R+G38A+G91T+G163K D27R+G38A+G91T+P256T D27R+G38A+D96E+G163K D27R+G38A+D96E+P256T D27R+G38A+D111A+D254S D27R+G38A+G163K+D254S D27R+G38A+D254S+P256T D27R+G91T+D96E+D111A; D27R+G91T+D96E+D254S; D27R+G91T+D111A+G163K; D27R+G91T+D111A+P256T; D27R+G91T+G163K+P256T; D27R+D96E+D111A+G163K; D27R+D96E+D111A+P256T; D27R+D96E+G163K+P256T; D27R+D111A+G163K+D254S; D27R+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E; N33Q+G38A+G91T+G163K; N33Q+G38A+G91T+P256T; N33Q+G38A+D96E+G163K; N33Q+G38A+D96E+P256T; N33Q+G38A+D111A+D254S; N33Q+G38A+G163K+D254S; N33Q+G38A+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+G163K; N33Q+G91T+D96E+P256T; N33Q+G91T+D111A+D254S; N33Q+G91T+G163K+D254S; N33Q+G91T+D254S+P256T; N33Q+D96E+D111A+D254S; N33Q+D96E+G163K+D254S; N33Q+D96E+D254S+P256T; N33Q+D111A+G163K+P256T; D27R+G91T+D96E+G163K D27R+G91T+D96E+P256T D27R+G91T+D111A+D254S D27R+G91T+G163K+D254S D27R+G91T+D254S+P256T D27R+D96E+D111A+D254S D27R+D96E+G163K+D254S D27R+D96E+D254S+P256T D27R+D111A+G163K+P256T D27R+G163K+D254S+P256T N33Q+G38A+G91T+D111A N33Q+G38A+G91T+D254S N33Q+G38A+D96E+D111A N33Q+G38A+D96E+D254S N33Q+G38A+D111A+G163K N33Q+G38A+D111A+P256T N33Q+G38A+G163K+P256T N33Q+G91T+D96E+D111A N33Q+G91T+D96E+D254S N33Q+G91T+D111A+G163K N33Q+G91T+D111A+P256T N33Q+G91T+G163K+P256T N33Q+D96E+D111A+G163K N33Q+D96E+D111A+P256T N33Q+D96E+G163K+P256T N33Q+D111A+G163K+D254S N33Q+D111A+D254S+P256T N33Q+G163K+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E+G163K; G38A+G91T+D96E+P256T; G38A+G91T+D111A+D254S; G38A+G91T+G163K+D254S; G38A+G91T+D254S+P256T; G38A+D96E+D111A+D254S; G38A+D96E+G163K+D254S; G38A+D96E+D254S+P256T; G38A+D111A+G163K+P256T; G38A+G163K+D254S+P256T; G91T+D96E+D111A+D254S; G91T+D96E+G163K+D254S; G91T+D96E+D254S+P256T; G91T+D111A+G163K+P256T; G91T+G163K+D254S+P256T; D96E+D111A+G163K+P256T; G38A+G91T+D96E+D111A G38A+G91T+D96E+D254S G38A+G91T+D111A+G163K G38A+G91T+D111A+P256T G38A+G91T+G163K+P256T G38A+D96E+D111A+G163K G38A+D96E+D111A+P256T G38A+D96E+G163K+P256T G38A+D111A+G163K+D254S G38A+D111A+D254S+P256T G91T+D96E+D111A+G163K G91T+D96E+D111A+P256T G91T+D96E+G163K+P256T G91T+D111A+G163K+D254S G91T+D111A+D254S+P256T D96E+D111A+G163K+D254S D96E+D111A+D254S+P256T D96E+G163K+D254S+P256T; ou D111A+G163K+D254S+P256T da SEQ ID N°: 2.

[074] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e uma de D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A; D27R+N33Q+G38A+G91T+D254S; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A; D27R+N33Q+G38A+D96E+D254S; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K; D27R+N33Q+G38A+D96E+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A; D27R+N33Q+G91T+D96E+D254S; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K; D27R+N33Q+G91T+D111A+P256T; D27R+N33Q+G91T+G163K+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K; D27R+G38A+G91T+D96E+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+D254S; D27R+G38A+G91T+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+D254S; D27R+G38A+D96E+G163K+D254S; D27R+G38A+D96E+D254S+P256T; D27R+G38A+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+D111A+D254S+P256T; D27R+G38A+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K; D27R+N33Q+G91T+D96E+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+D254S; D27R+N33Q+G91T+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+D96E+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A; N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K; N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S; N33Q+G38A+G91T+D96E+P256T; N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K; N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S; N33Q+G38A+G91T+D111A+P256T; N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S; N33Q+G38A+G91T+G163K+P256T; N33Q+G38A+G91T+D254S+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K; N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S; N33Q+G38A+D96E+D111A+P256T; N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S; N33Q+G38A+D96E+G163K+P256T; N33Q+G38A+D96E+D254S+P256T; N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S; N33Q+G38A+D111A+G163K+P256T; N33Q+G38A+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K; N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S; N33Q+G91T+D96E+D111A+P256T; N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S; N33Q+G91T+D96E+G163K+P256T; N33Q+G91T+D96E+D254S+P256T; N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S; N33Q+G91T+D111A+G163K+P256T; N33Q+G91T+D111A+D254S+P256T; N33Q+G91T+G163K+D254S+P256T; N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S; N33Q+D96E+D111A+G163K+P256T; N33Q+D96E+D111A+D254S+P256T; N33Q+D96E+G163K+D254S+P256T; N33Q+D111A+G163K+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E+D111A+G163K; G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; G38A+G91T+D96E+D111A+P256T; G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; G38A+G91T+D96E+G163K+P256T; G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; G38A+G91T+D111A+G163K+D254S; G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; G38A+G91T+D111A+D254S+P256T; G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; G38A+D96E+D111A+G163K+D254S; G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; G38A+D96E+D111A+D254S+P256T; G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; G38A+D111A+G163K+D254S+P256T; G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; ou D96E+D111A+G163K+D254S+P256T da SEQ ID N°: 2.

[075] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e uma de D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S; N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S; N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; ou G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T da SEQ ID N°: 2.

[076] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e uma de D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; ou G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T da SEQ ID N°: 2.

[077] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e uma de D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+G91T+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G38A+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+N33Q+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; D27R+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T; ou N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T da SEQ ID N°: 2.

[078] Em outro aspecto, a variante compreende ou consiste em substituições em posições nas posições correspondendo a T231R+N233R e D27R+N33Q+G38A+G91T+D96E+D111A+G163K+D254S+P256T da SEQ ID N°: 2.

[079] Em outro aspeto, as variantes compreendem as ou consistem nas substituições correspondendo às seguintes da SEQ ID N°: 2: D96E T231R N233R;

[080] As variantes podem adicionalmente compreender uma ou mais substituições adicionais em uma ou mais (por ex., várias) outras posições.

[081] As mudanças de aminoácidos podem ser de uma natureza mínima, isto é, substituições ou inserções de aminoácidos conservativas que não afetam significativamente o dobramento e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de 1-30 aminoácidos; pequenas extensões do terminal amino ou carboxila, tal como um resíduo de metionina no terminal amino; um pequeno peptídeo ligante de até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita a purificação por mudança da carga total ou outra função, tal como um trato de poli-histidina, um epítopo antigênico ou um domínio de ligação.

[082] Exemplos de substituições conservativas estão dentro dos grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, Em, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. Substituições comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.

[083] Alternativamente, as mudanças de aminoácidos são de uma tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas. Por exemplo, as mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade quanto ao substrato, mudar o pH ótimo, e similares.

[084] Aminoácidos essenciais em um polipeptídeo podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, tais como mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese de varredura da alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, mutações de alanina simples são introduzidas em todos os resíduos da molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a atividade de lipase para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O local ativo da enzima ou outra interação biológica pode ser também determinado por análise física da estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com mutação de aminoácidos de local de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. A identidade de aminoácidos essenciais pode ser também inferida a partir de um alinhamento com um polipeptídeo relacionado.

[085] As variantes podem consistir ou conter pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % do número de aminoácidos da SEQ ID N°: 2.

[086] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade melhorada em detergente com protease presente em comparação com a lipase genitora.

[087] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade detergente melhorada em comparação com a lipase genitora.

[088] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade de protease melhorada em comparação com a lipase genitora.

[089] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade química melhorada em comparação com a lipase genitora.

[090] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade na oxidação melhorada em comparação com a lipase genitora.

[091] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade a pH melhorada em comparação com a lipase genitora.

[092] Em uma forma de realização, a variante tem estabilidade melhorada sob condições de armazenamento em comparação com a lipase genitora.

[093] Em uma forma de realização, a variante tem termoestabilidade melhorada em comparação com a lipase genitora. Lipases genitoras

[094] A lipase genitora pode ser (a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID N°: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de baixa estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo de SEQ ID N°: 1, (ii) o seu complemento de comprimento total de (i); ou (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60 % de identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo de SEQ ID N°: 1.

[095] Em um aspecto, o genitor tem uma identidade de sequência com o polipeptídeo de SEQ ID N°: 2 de pelo menos 60 %, por exemplo, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %, que têm atividade de lipase. Em um aspecto, a sequência de aminoácidos do genitor difere em até 40 aminoácidos, porex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou 40 do polipeptídeo de SEQ ID N°: 2.

[096] Em outro aspecto, o genitor compreende a ou consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2.

[097] Em outro aspecto, o genitor é um fragmento do polipeptídeo da SEQ ID N°: 2 contendo pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % do número de aminoácidos da SEQ ID N°: 2.

[098] Em outra forma de realização, o genitor é uma variante alélica do polipeptídeo de SEQ ID N°: 2.

[099] Em outro aspeto, o genitor é codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de muito baixa estringência, condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo de SEQ ID N°: 1, (ii) o complemento de comprimento total de (i) (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor, Nova Iorque).

[0100] O polinucleotídeo de SEQ ID N°: 1, ou uma sua subsequência, bem como o polipeptídeo de SEQ ID N°: 2 ou um seu fragmento, pode ser usado para desenhar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando um genitor de estirpes de diferentes gêneros ou espécies de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Em particular, tais sondas podem ser usadas para hibridação com o DNA genômico ou cDNA de uma célula de interesse, seguindo procedimentos de transferência de Southern padrão, de modo a identificar e isolar o gene correspondente aí. Tais sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência inteira, mas devem ter pelo menos 15, por ex., pelo menos 25, pelo menos 35, ou pelo menos 70 nucleotídeos de comprimento. Preferencialmente, a sonda de ácido nucleico tem pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, por ex., pelo menos 200 nucleotídeos, pelo menos 300 nucleotídeos, pelo menos 400 nucleotídeos, pelo menos 500 nucleotídeos, pelo menos 600 nucleotídeos, pelo menos 700 nucleotídeos, pelo menos 800 nucleotídeos, ou pelo menos 900 nucleotídeos de comprimento. Podem ser usadas sondas tanto de DNA como de RNA. As sondas são tipicamente marcadas para detectar o gene correspondente (por exemplo, com 32P, 3H, 35S, biotina, ou avidina). Tais sondas são englobadas pela presente invenção.

[0101] Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir de tais outras estirpes pode ser rastreada quanto a DNA que hibrida com as sondas descritas acima e codifica um genitor. O DNA genômico ou outro de tais outras estirpes pode ser separado por eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida, ou por outras técnicas de separação. O DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material transportador adequado. De modo a identificar um clone ou DNA que hibrida com SEQ ID N°: 1 ou uma sua subsequência, o material transportador é usado em uma transferência de Southern.

[0102] Para propósitos da presente invenção, hibridação indica que o polinucleotídeo hibrida com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondendo a (i) SEQ ID N°: 1; (ii) à sequência codificante do polipeptídeo de SEQ ID N°: 1; (iii) ao seu complemento de comprimento total; ou (iv) uma sua subsequência; sob condições de muito baixa a muito elevada estringência. As moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibrida sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios X ou qualquer outro meio de detecção conhecido na técnica.

[0103] Em um aspecto, a sonda de ácido nucleico é a sequência codificante do polipeptídeo de SEQ ID N°: 1. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é pelo menos 50 %, pelo menos 55 %, pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 % ou pelo menos 95 % do número de nucleotídeos da SEQ ID N°: 1. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo de SEQ ID N°: 2; o seu polipeptídeo; ou um seu fragmento. Em outro aspeto, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID N°: 1.

[0104] Em outra forma de realização, o genitor é codificado por um polinucleotídeo tendo uma identidade de sequência com a sequência codificante do polipeptídeo de SEQ ID N°: 1 de pelo menos 60 %, p.ex., pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 91 %, pelo menos 92 %, pelo menos 93 %, pelo menos 94 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, ou 100 %.

[0105] O polipeptídeo pode ser um polipeptídeo híbrido no qual uma região de um polipeptídeo está fundida ao terminal N ou terminal C de uma região de outro polipeptídeo.

[0106] Um genitor pode ser um polipeptídeo de fusão ou polipeptídeo de fusão clivável ao qual outro polipeptídeo está fundido no terminal N ou terminal C do polipeptídeo da presente invenção. Um polipeptídeo de fusão é produzido por fusão de um polinucleotídeo codificando um outro polipeptídeo com um polinucleotídeo da presente invenção. Técnicas para produção de polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das sequências codificantes codificando os polipeptídeos tal que fiquem em grelha e que a expressão do polipeptídeo de fusão esteja sob controle do(s) mesmo(s) promotor(es) e terminador. Polipeptídeos de fusão podem ser também construídos usando tecnologia de inteína na qual são criados polipeptídeos de fusão pós-translacionalmente (Cooper et al., 1993, EMBO J. 12: 2575-2583; Dawson et al., 1994, Science 266: 776-779).

[0107] Um polipeptídeo de fusão pode adicionalmente compreender um local de clivagem entre os dois polipeptídeos. Após secreção da proteína de fusão, o local é clivado liberando os dois polipeptídeos. Exemplos de locais de clivagem incluem os, mas não estão limitados aos, locais divulgados em Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen- Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381; Eaton et al., 1986, Biochemistry 25: 505-512; Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987; Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetics 6: 240-248; e Stevens, 2003, Drug Discovery World 4: 35-48.

[0108] O genitor pode ser obtido a partir de microrganismos de qualquer gênero. Para propósitos da presente invenção, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o genitor codificado por um polinucleotídeo é produzido pela fonte ou por uma estirpe na qual o polinucleotídeo da fonte foi inserido. Em um aspecto, o genitor é secretado extracelularmente.

[0109] O genitor pode ser uma lipase bacteriana. Por exemplo, o genitor pode ser um polipeptídeo bacteriano Gram-positivo tal como uma lipase de Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, ou Thermobifida ou um polipeptídeo bacteriano Gram- negativo tal como uma lipase de Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, Ilyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, ou Ureaplasma.

[0110] Em um aspecto, o genitor é uma lipase de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis.

[0111] Em outro aspecto, o genitor é uma lipase de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0112] Em outro aspecto, o genitor é uma lipase de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans.

[0113] Em outro aspecto, o genitor é uma lipase de Thermobifida alba ou Thermobifida fusca (anteriormente conhecida como Thermomonaspora fusca).

[0114] O genitor pode ser uma lipase fúngica. Por exemplo, o genitor pode ser uma lipase de levedura tal como uma lipase de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia; ou uma lipase fúngica filamentosa tal como uma lipase de Acremonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xylaria.

[0115] Em outro aspecto, o genitor é uma lipase de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis.

[0116] Em outro aspecto, o genitor é uma lipase de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia setosa, Thielavia spededonium, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[0117] Em outro aspecto, o genitor é uma lipase de Thermomyces lanuginosus, por ex. a lipase de SEQ ID N°: 2.

[0118] Será entendido que, para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por ex., anamorfos, independentemente do nome da espécie pelo qual sejam conhecidos. Aqueles peritos na técnica reconhecerão prontamente a identidade de equivalentes apropriados.

[0119] Estirpes destas espécies estão prontamente acessíveis ao público em um número de coleções de culturas, tais como a American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

[0120] O genitor pode ser identificado e obtido de outras fontes, incluindo microrganismos isolados da natureza (p.ex., solo, compostos, água, etc.) ou amostras de DNA obtidas diretamente de materiais naturais (p.ex., solo, compostos, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. Técnicas para isolamento de microrganismos e DNA diretamente a partir de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. Um polinucleotídeo codificando o genitor pode ser depois obtido por rastreio similar de uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA de outro microrganismo ou amostra de DNA misto. Uma vez detectado um polinucleotídeo codificando um genitor com a(s) sonda(s), o polinucleotídeo pode ser isolado ou clonado por utilização de técnicas que são conhecidas daqueles de perícia vulgar na técnica (ver, por ex., Sambrook et a/., 1989, supra).

Preparação de Variantes

[0121] A presente invenção se relaciona também com métodos para a obtenção de variantes de lipase, compreendendo: (a) introdução de substituições nas posições correspondendo a T231R+N233R e, pelo menos, uma ou mais (por ex., várias) de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, G38A, D27R, e N33Q da SEQ ID N°: 2; (b) seleção da variante que tem atividade de lipase e na comparação com a lipase genitora tem uma estabilidade melhorada; e (c) recuperação da variante.

[0122] As variantes podem ser preparadas usando qualquer procedimento de mutagênese conhecido na técnica, tal como mutagênese sítio-dirigida, construção de gene sintética, construção de gene semissintética, mutagênese aleatória, embaralhamento, etc.

[0123] A mutagênese sítio-dirigida é uma técnica na qual uma ou mais (por ex., várias) mutações são introduzidas em um ou mais locais definidos em um polinucleotídeo codificando a lipase genitora.

[0124] A mutagênese sítio-dirigida pode ser alcançada in vitro por PCR envolvendo o uso de iniciadores de oligonucleotídeos contendo a mutação desejada. A mutagênese sítio-dirigida pode ser também realizada in vitro por mutagênese de cassete envolvendo a clivagem por uma enzima de restrição em um local no plasmídeo compreendendo um polinucleotídeo codificando a lipase genitora e subsequente ligação de um oligonucleotídeo contendo a mutação no polinucleotídeo. Usualmente, a enzima de restrição que digere o plasmídeo e o oligonucleotídeo é a mesma, permitindo que as extremidades viscosas do plasmídeo e da inserção se liguem umas às outras. Ver, p.ex., Scherer e Davis, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4949-4955; e Barton et al., 1990, Nucleic Acids Res. 18: 7349-4966.

[0125] A mutagênese sítio-dirigida pode ser também alcançada in vivo por métodos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, US2004/0171154; Storici et al., 2001, Nature Biotechnol. 19: 773-776; Kren et al., 1998, Nat. Med. 4: 285-290; e Calissano e Macino, 1996, Fungal Genet. Newslett. 43: 15-16.

[0126] Pode ser usado qualquer procedimento de mutagênese sítio- dirigida na presente invenção. Existem muitos estojos comerciais disponíveis que podem ser usados para preparar variantes.

[0127] A construção de gene sintética implica síntese in vitro de uma molécula de polinucleotídeo desenhada para codificar um polipeptídeo de interesse. A síntese de gene pode ser realizada utilizando um número de técnicas, tal como a tecnologia à base de microchip em multiplex descrita por Tian et al. (2004, Nature 432: 1050-1054) e tecnologias similares em que oligonucleotídeos são sintetizados e montados em chips microfluídicos fotoprogramáveis.

[0128] Substituições, deleções, e/ou inserções simples ou múltiplas de aminoácidos podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese, recombinação, e/ou embaralhamento, seguidos por um procedimento de rastreio relevante, tal como aqueles divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156; WO95/17413; ou WO95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR propensa a erros, exibição de fagos (por ex., Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 1083210837; Patente dos E.U.A. No. 5,223,409; WO 92/06204) e mutagênese direcionada para região (Derbyshire et al., 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, -NA 7: 127).

[0129] Podem ser combinados métodos de mutagênese/embaralhamento com métodos de rastreio automatizados, de elevado rendimento, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressos por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893-896). Moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrão na técnica. Estes métodos permitem a determinação rápida da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo.

[0130] A construção de gene semissintética é alcançada por combinação de aspectos da construção de gene sintética, e/ou mutagênese sítio-dirigida, e/ou mutagênese aleatória, e/ou embaralhamento. A construção semissintética é tipificada por um processo utilizando fragmentos de polinucleotídeos que são sintetizados, em combinação com técnicas de PCR. Regiões definidas de genes podem assim ser sintetizadas de novo, enquanto outras regiões podem ser amplificadas usando iniciadores mutagênicos sítio-específicos, enquanto outras regiões ainda podem estar sujeitas a amplificação por PCR propensa a erros ou PCR não propensa a erros. Subsequências de polinucleotídeos podem ser depois embaralhadas. Polinucleotídeos

[0131] A presente invenção se relaciona também com polinucleotídeos isolados codificando uma variante da presente invenção. Em certos aspectos, a presente invenção se relaciona com um constructo de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo da invenção. Em certos aspectos, a presente invenção se relaciona com um vetor de expressão compreendendo o polinucleotídeo da invenção. Em certos aspectos, a presente invenção se relaciona com uma célula hospedeira compreendendo o polinucleotídeo da invenção. Em certos aspectos, a presente invenção se relaciona com métodos de produção de uma variante de lipase, compreendendo: (a) cultivo da célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperação da variante.

Constructos de Ácido Nucleico

[0132] A presente invenção se relaciona também com constructos de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a expressão da sequência codificante em uma célula hospedeira adequada sob condições compatíveis com as sequências de controle.

[0133] O polinucleotídeo pode ser manipulado em uma variedade de modo a proporcionar expressão de uma variante. A manipulação do polinucleotídeo antes da sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificação de polinucleotídeos utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica.

[0134] A sequência de controle pode ser um promotor, um polinucleotídeo que é reconhecido por uma célula hospedeira para expressão do polinucleotídeo. O promotor contém sequências de controle transcricional que medeiam a expressão da variante. O promotor pode ser qualquer polinucleotídeo que mostre atividade transcricional na célula hospedeira incluindo promotores mutantes, truncados, e híbridos, e pode ser obtido de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos à célula hospedeira.

[0135] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácidos nucleicos da presente invenção em uma célula hospedeira bacteriana são os promotores obtidos do gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, gene crylllA de Bacillus thuringiensis (Agaisse e Lereclus, 1994, Molecular Microbiology 13: 97-107), operon lac de E. coli, promotor trc de E. coli (Egon et al., 1988, Gene 69: 301-315), gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, e gene da betalactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), bem como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25). Promotores adicionais são descritos em "Useful proteins from recombinant bacteria" em Gilbert et al., 1980, Scientific American 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra. Exemplos de promotores tandem são divulgados em WO 99/43835.

[0136] Exemplos de promotores adequados para direcionamento da transcrição dos constructos de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira fúngica filamentosa são os promotores obtidos dos genes da acetamidase de Aspergillus nidulans, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase ácida estável de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum (WO96/00787), amiloglucosidase de Fusarium venenatum (WO00/56900), Daria de Fusarium venenatum (WO00/56900), Quinn de Fusarium venenatum (WO00/56900), lipase de Rhizomucor miehei, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, beta-glucosidase de Trichoderma reesei, celobiohidrolase I de Trichoderma reesei, celobiohidrolase II de Trichoderma reesei, endoglucanase I de Trichoderma reesei, endoglucanase II de Trichoderma reesei, endoglucanase III de Trichoderma reesei, endoglucanase IV de Trichoderma reesei, endoglucanase V de Trichoderma reesei, xilanase I de Trichoderma reesei, xilanase II de Trichoderma reesei, beta-xilosidase de Trichoderma reesei, bem como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus no qual o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus; exemplos não limitantes incluem promotores modificados de um gene da alfa-amilase neutra de Aspergillus niger nos quais o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene da triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

[0137] Em um hospedeiro de levedura, promotores úteis são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, galactocinase (GAL1) de Saccharomyces cerevisiae, álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH1, ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae, triose fosfato isomerase (TPI) de Saccharomyces cerevisiae, metalotioneína (CUP1) de Saccharomyces cerevisiae, e 3-fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, Yeast 8: 423-488.

[0138] A sequência de controle pode ser também um terminador da transcrição, que é reconhecido por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência do terminador está operacionalmente ligada ao terminal 3' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer terminador que seja funcional na célula hospedeira.

[0139] Terminadores preferenciais para células hospedeiras bacterianas são obtidos dos genes da protease alcalina (aprH) de Bacillus clausii, alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, e RNA ribossômico (rrnB) de Escherichia coli.

[0140] Terminadores preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0141] Terminadores preferenciais para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase de Saccharomyces cerevisiae, citocromo C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.

[0142] A sequência de controle pode ser também uma região estabilizante de mRNA a jusante de um promotor e a montante da sequência codificante de um gene que aumenta a expressão do gene.

[0143] Exemplos de regiões estabilizadoras de mRNA adequadas são obtidos de um gene crylllA de Bacillus thuringiensis (WO94/25612) e um gene SP82 de Bacillus subtilis (Hue et al., 1995, Journal of Bacteriology 177: 3465-3471).

[0144] A sequência de controle pode ser também um líder, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. A sequência líder está operacionalmente ligada ao terminal 5' do polinucleotídeo codificando a variante. Pode ser usado qualquer líder que seja funcional na célula hospedeira.

[0145] Líderes preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidos dos genes da amilase TAKA de Aspergillus oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

[0146] Líderes adequados para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes da enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3- fosfoglicerato cinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae.

[0147] A sequência de controle pode também ser uma sequência de poliadenilação, uma sequência operacionalmente ligada ao terminal 3' da sequência de codificação da variante e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina a mRNA transcrito. Pode ser usada qualquer sequência de poliadenilação que seja funcional na célula hospedeira.

[0148] Sequências de poliadenilação preferenciais para células hospedeiras fúngicas filamentosas são obtidas dos genes da antranilato sintase de Aspergillus nidulans, glucoamilase de Aspergillus niger, alfa- glucosidase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e protease do tipo tripsina de Fusarium oxysporum.

[0149] Sequências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Mol. Cellular Biol. 15: 5983-5990.

[0150] A sequência de controle pode ser também uma região codificante do peptídeo sinal que codifica um peptídeo sinal ligado ao terminal N de uma variante e dirige a variante para a via secretora da célula. A extremidade 5' da sequência codificante do polinucleotídeo pode conter inerentemente uma sequência codificante do peptídeo sinal naturalmente ligada em grelha de leitura de tradução ao segmento da sequência codificante que codifica a variante. Alternativamente, a extremidade 5' da sequência codificante pode conter uma sequência codificante de um peptídeo sinal que é estranha à sequência codificante. Uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode ser requerida onde a sequência codificante não contém naturalmente uma sequência codificante do peptídeo sinal. Alternativamente, uma sequência codificante do peptídeo sinal estranha pode simplesmente substituir a sequência codificante do peptídeo sinal natural de modo a intensificar a secreção da variante. No entanto pode ser usada qualquer sequência codificante do peptídeo sinal que dirija a variante expressa para a via secretora de uma célula hospedeira.

[0151] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras bacterianas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, subtilisina de Bacillus licheniformis, beta-lactamase de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Peptídeos sinal adicionais são descritos por Simonen e Palva, 1993, Microbiological Reviews 57: 109-137.

[0152] Sequências codificantes do peptídeo sinal eficazes para células hospedeiras fúngicas filamentosas são as sequências codificantes do peptídeo sinal obtidas dos genes da amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, amilase TAKA de Aspergillus oryzae, celulase de Humicola insolens, endoglucanase V de Humicola insolens, lipase de Humicola lanuginosa, e proteinase aspártica de Rhizomucor miehei.

[0153] Peptídeos sinal úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes do fator alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras sequências codificantes do peptídeo sinal úteis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.

[0154] A sequência de controle pode ser também uma sequência codificante de pró-peptídeos que codifica um pró-peptídeo posicionado no terminal N de uma variante. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptídeo (ou um zimogênio em alguns casos). Um pró-polipeptídeo está geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo ativo por clivagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo a partir do pró-polipeptídeo. A sequência codificante do pró-peptídeo pode ser obtida dos genes da protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, lacase de Myceliophthora thermophila (WO95/33836), proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e fator alfa de Saccharomyces cerevisiae.

[0155] Onde estiverem presentes sequências do peptídeo sinal e pró- peptídeo, a região do pró-peptídeo está posicionada junto ao terminal N da variante e a sequência do peptídeo sinal está posicionada junto ao terminal N da sequência do pró-peptídeo.

[0156] Pode ser também desejável adicionar sequências reguladoras que regulem a expressão da variante em relação ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas reguladores são aqueles que fazem com que a expressão do gene seja ligada ou desligada em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulador. Sistemas reguladores em sistemas procarióticos incluem os sistemas operadores lac, tac, e trp. Em levedura pode ser usado o sistema ADH2 ou sistema GAL1. Em fungos filamentosos podem ser usados o promotor de glucoamilase de Aspergillus niger, o promotor de alfa-amilase TAKA de Aspergillus oryzae, e o promotor de glucoamilase de Aspergillus oryzae. Outros exemplos de sequências reguladoras são aquelas que permitem amplificação do gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências reguladoras incluem o gene da diidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Em estes casos, o polinucleotídeo codificando a variante estaria operacionalmente ligado à sequência reguladora. Vetores de Expressão

[0157] A presente invenção se relaciona também com vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo codificando uma variante da presente invenção, um promotor, e sinais de terminação transcricional e translacional. As várias sequências de nucleotídeos e de controle podem ser unidas para produzir um vetor de expressão recombinante que possa incluir um ou mais locais de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição do polinucleotídeo codificando a variante em tais locais. Alternativamente, o polinucleotídeo pode ser expresso por inserção do polinucleotídeo ou um constructo de ácido nucleico compreendendo o polinucleotídeo em um vetor apropriado para expressão. Na criação do vetor de expressão, a sequência codificante está localizada no vetor tal que a sequência codificante esteja operacionalmente ligada às sequências de controle apropriadas para expressão.

[0158] O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (p.ex., um plasmídeo ou vírus) que possa ser convenientemente sujeito a procedimentos de DNA recombinante e possa provocar expressão do polinucleotídeo. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira na qual o vetor é para ser introduzido. O vetor pode ser um plasmídeo linear ou circular fechado.

[0159] O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, /.e., um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente da replicação cromossômica, por ex., um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter quaisquer meios para assegurar a autorreplicação. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, seja integrado no genoma e replicado em conjunto com o(s) cromossomo(s) nos(s) qual(ais) foi integrado. Além disso pode ser usado um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que contenham em conjunto o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transpóson.

[0160] O vetor contém preferencialmente um ou mais marcadores selecionáveis que permitam seleção fácil de células transformadas, transfectadas, transduzidas, ou similares. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a auxotrofos, e similares.

[0161] Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são genes dal de Bacillus licheniformis ou Bacillus subtilis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos tal como resistência a ampicilina, cloranfenicol, canamicina, neomicina, espectinomicina, ou tetraciclina. Marcadores adequados para células hospedeiras levedura incluem, mas não estão limitados a, ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira fúngica filamentosa incluem, mas não estão limitados a, amdS (acetamidase), argB (ornitina carbamoíltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5’- fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), bem como seus equivalentes. Preferenciais para uso em uma célula de Aspergillus são genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e um gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

[0162] O vetor contém preferencialmente um elemento(s) que permite(m) a integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor na célula independente do genoma.

[0163] Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear na sequência do polinucleotídeo codificando a variante ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Alternativamente, o vetor pode conter polinucleotídeos adicionais para direcionamento da integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local(ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em uma localização precisa, os elementos de integração devem conter um número suficiente de ácidos nucleicos, tal como 100 a 10000 pares de bases, 400 a 10000 pares de bases, e 800 a 10000 pares de bases, que têm um elevado grau de identidade de sequência com a sequência alvo correspondente para intensificar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos de integração podem ser qualquer sequência que seja homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos de integração podem ser polinucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.

[0164] Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação permitindo que o vetor se replique autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem da replicação pode ser qualquer replicador de plasmídeo mediando a replicação autônoma que funcione em uma célula. O termo "origem da replicação" ou "replicador de plasmídeo" significa um polinucleotídeo que permite que um plasmídeo ou vetor se replique in vivo.

[0165] Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177 e pACYC184 permitindo replicação em E. coli, e pUB110, pE194, pTA1060 e pAMβl permitindo replicação em Bacillus.

[0166] Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.

[0167] Exemplos de origens de replicação úteis em uma célula fúngica filamentosa são AMA1 e ANSI (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15: 9163-9175; WO 00/24883). O isolamento do gene AMA1 e a construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser alcançados de acordo com os métodos divulgados em WO 00/24883.

[0168] Pode ser inserida mais do que uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção em uma célula hospedeira para aumentar a produção de uma variante. Um aumento no número de cópias do polinucleotídeo pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional da sequência no genoma da célula hospedeira ou por inclusão de um gene marcador selecionável amplificável com o polinucleotídeo onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e deste modo cópias adicionais do polinucleotídeo, podem ser selecionadas por cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

[0169] Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos de um perito na técnica (ver, p.ex., Sambrook et al., 1989, supra).

Células Hospedeiras

[0170] A presente invenção se relaciona também com células hospedeiras recombinantes, compreendendo uma variante da presente invenção operacionalmente ligada a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção de uma variante da presente invenção. Um constructo ou vetor compreendendo um polinucleotídeo é introduzido em uma célula hospedeira de forma a que o constructo ou vetor seja mantido como integrante cromossômico ou como um vetor extracromossômico autorreplicante como descrito anteriormente. O termo "célula hospedeira" engloba qualquer descendência de uma célula genitora que não é idêntica à célula genitora devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande medida do gene codificando a variante e sua fonte.

[0171] A célula hospedeira pode ser qualquer célula útil na produção recombinante de uma variante, por exemplo um procariota ou um eucariota.

[0172] A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram-positiva ou Gram-negativa. Bactérias Gram-positivas incluem, mas não estão limitadas a, Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Geobacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Oceanobacillus, Staphylococcus, Streptococcus, e Streptomyces. Bactérias Gram-negativas incluem, mas não estão limitadas a, Campylobacter, E. coli, Flavobacterium, Fusobacterium, Helicobacter, llyobacter, Neisseria, Pseudomonas, Salmonella, e Ureaplasma.

[0173] A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus incluindo, mas não se limitando a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.

[0174] A célula hospedeira bacteriana pode ser também qualquer célula de Streptococcus incluindo, mas não se limitando a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.

[0175] A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces, incluindo mas não se limitando a células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lividans.

[0176] A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, p.ex., Chang e Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168: 111-115), transformação com células competentes (ver, p.ex., Young e Spizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, J. Mol. Biol. 56: 209-221), eletroporação (ver, por ex., Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, p.ex., Koehler e Thorne, 1987, J. Bacteriol. 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E. coli pode ser efetuada por transformação com protoplastos (ver, por ex., Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eletroporação (ver, p.ex., Dower et al., 1988, Nucleic Acids Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode ser efetuada por transformação com protoplastos, eletroporação (ver, por ex., Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), conjugação (ver, p.ex., Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou transdução (ver, p.ex., Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas pode ser efetuada por eletroporação (ver, p.ex., Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397), ou conjugação (ver, p.ex., Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode ser efetuada por competência natural (ver, p.ex., Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), transformação com protoplastos (ver, p.ex., Catt e Jollick, 1991, Microbios 68: 189-207), eletroporação (ver, p.ex., Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804), ou conjugação (ver, p.ex., Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409-436). No entanto pode ser usado qualquer método conhecido na técnica para introdução de DNA em uma célula hospedeira.

[0177] A célula hospedeira pode ser também um eucariota, tal como uma célula de mamífero, de inseto, de planta, ou fúngica.

[0178] A célula hospedeira pode ser uma célula fúngica. "Fungos" como usado aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota bem como os Oomycota e todos os fungos mitospóricos (como definido por Hawksworth et al., Em, Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, RU).

[0179] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula de levedura. "Levedura" como usado aqui inclui levedura ascosporógena (Endomycetales), levedura basidiosporógena, e levedura pertencendo aos Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Uma vez que a classificação de leveduras pode mudar no futuro, para os propósitos desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities of Yeast (Skinner, Passmore, e Davenport, editores, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).

[0180] A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia, como uma célula de Kluyveromyces lactis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, ou Yarrowia lipolytica.

[0181] A célula hospedeira fúngica pode ser uma célula fúngica filamentosa. "Fungos filamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parede micelial composta por quitina, celulose, glucana, quitosana, manana, e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento de hifas e o catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, o crescimento vegetativo por leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae é por floração de um talo unicelular e o catabolismo de carbono pode ser fermentativo.

[0182] A célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Chrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.

[0183] Por exemplo, a célula hospedeira fúngica filamentosa pode ser uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gilvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium inops, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxysporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola insolens, Humicola lanuginose, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.

[0184] As células fúngicas podem ser transformadas por um processo envolvendo formação de protoplastos, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma forma conhecida per se. Procedimentos adequados para transformação de células hospedeiras de Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP238023, Yelton et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470-1474, e Christensen et al., 1988, Bio/Technology 6: 1419-1422. Métodos adequados para transformação de espécies de Fusarium são descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO96/00787. A levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, Em Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp. 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, J. Bacteriol. 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1920. Métodos de Produção

[0185] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante, compreendendo: (a) cultivo de uma célula hospedeira da presente invenção sob condições adequadas para expressão da variante; e (b) recuperação da variante.

[0186] As células hospedeiras são cultivadas em um meio nutriente adequado para produção da variante usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínua, descontínua, descontínua alimentada, ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizado em um meio adequado e sob condições permitindo que a variante seja expressa e/ou isolada. O cultivo tem lugar em um meio nutriente adequado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na técnica. Meios adequados estão disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por ex., em catálogos da American Type Culture Collection). Se a variante for secretada para o meio nutriente, a variante pode ser recuperada diretamente do meio. Se a variante não for secretada pode ser recuperada de lisados de células.

[0187] A variante pode ser detectada usando métodos conhecidos na técnica que são específicos para as variantes. Estes métodos de detecção incluem, mas não estão limitados a, uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo pode ser usado um ensaio de enzima para determinar a atividade da variante tal como os descritos nos exemplos.

[0188] A variante pode ser recuperada usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a variante pode ser recuperada do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não se limitando a, coleta, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.

[0189] A variante pode ser purificada por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, cromatografia (p.ex., permuta iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocagem, e exclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (p.ex., focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (p.ex., precipitação com sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, p.ex., Protein Purification, Janson e Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter variantes substancialmente puras.

[0190] Em um aspecto alternativo, a variante não é recuperada, mas ao invés uma célula hospedeira da presente invenção expressando a variante é usada como uma fonte da variante. Composições

[0191] As composições que compreendem o polipeptídeo da presente invenção são contempladas.

[0192] Em certos aspectos, a presente invenção se relaciona com composição detergente compreendendo uma variante de uma lipase genitora em que a variante tem atividade de lipase, tem pelo menos 60% mas menos do que 100% de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 2, e compreende as substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e, pelo menos, uma ou mais (por exemplo, várias) de D96E, D111A, D254S, G163K, P256T, G91T, e G38A da SEQ ID N°: 2. Em certos aspectos a composição compreende adicionalmente as substituições nas posições correspondentes a D27R elou N33Q da SEQ ID N°: 2.

[0193] Em certos aspectos a referida variante tem maior estabilidade em comparação com a lipase genitora. Em certos aspectos, a estabilidade é a estabilidade em condições de armazenamento, estabilidade na presença de agentes tensoativos; estabilidade na presença de protease, estabilidade na presença de protease e agentes tensoativos; estabilidade na presença de componentes de detergentes; estabilidade química, estabilidade à oxidação, estabilidade ao pH, elou termoestabilidade. A maior estabilidade pode ser expressa como um fator de melhoria de semivida (HIF) superior a 1, como descrito no Exemplo 1. Em certos aspectos, as variantes têm um valor de HIF acima de 1,0; acima de 1,5; acima de 2,0; acima de 2,5; acima de 3,0; acima de 3,5; acima de 4,0; acima de 4,5; acima de 5,0; acima de 5,5; ou acima de 6,0.

[0194] A lista não limitante de componentes da composição ilustrada doravante é adequada para uso nas composições e métodos aqui pode ser desejavelmente incorporada em certas formas de realização da invenção, p.ex., para ajudar ou intensificar o desempenho de limpeza, para tratamento do substrato a ser limpo, ou para modificar a estética da composição como seja o caso com perfumes, tinturas, corantes ou similares. Os níveis de quaisquer tais componentes incorporados em quaisquer composições são em adição a quaisquer materiais previamente recitados para incorporação. A natureza precisa destes componentes adicionais, e seus níveis de incorporação, dependerá na forma física da composição e da natureza da operação de lavagem para a qual é para ser usada. Embora os componentes mencionados em baixo estejam categorizados por cabeçalho geral de acordo com uma funcionalidade particular, isto não é para ser interpretado como uma limitação, pois um componente pode compreender funcionalidades adicionais como será apreciado pelo especialista perito.

[0195] A não ser que indicado de outro modo, as quantidades em percentagem são por peso da composição (% por peso). Materiais de componentes adequados incluem, mas não estão limitados a, tensoativos, adjuvantes, agentes quelantes, agentes de inibição da transferência de corantes, dispersantes, enzimas, e estabilizantes de enzimas, materiais catalíticos, ativadores do branqueamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agentes dispersantes polimêricos, agentes de remoção de sujidades de argila/antirredeposição, abrilhantadores, supressores de solução saponífera, corantes, corantes tonalizantes, perfumes, sistemas de distribuição de perfumes, agentes elastificantes da estrutura, amaciadores de tecidos, transportadores, hidrótopos, auxiliares do processamento, solventes e/ou pigmentos. Adicionalmente à divulgação em baixo, exemplos adequados de tais outros componentes e níveis de uso são encontrados em US5576282, US6306812, e US6326348, deste modo incorporadas por referência.

[0196] Assim, em certas formas de realização, a invenção não contém um ou mais dos seguintes materiais adjuntos: tensoativos, sabões, adjuvantes, agentes quelantes, agentes de inibição da transferência de corantes, dispersantes, enzimas adicionais, estabilizantes de enzimas, materiais catalíticos, ativadores do branqueamento, peróxido de hidrogênio, fontes de peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados, agentes dispersantes polimêricos, agentes de remoção de sujidades de argila/antirredeposição, abrilhantadores, supressores de solução saponífera, corantes, perfumes, sistemas de distribuição de perfumes, agentes elastificantes da estrutura, amaciadores de tecidos, transportadores, hidrótopos, auxiliares do processamento, solventes e/ou pigmentos. No entanto, quando estão presentes um ou mais componentes, tal um ou mais componentes podem estar presentes como detalhado em baixo:

[0197] Tensoativos - As composições de acordo com a presente invenção podem compreender um tensoativo ou um sistema de tensoativos, em que o tensoativo pode ser selecionado a partir de tensoativos não iônicos, tensoativos aniônicos, tensoativos catiônicos, tensoativos anfolíticos, tensoativos zwiteriônicos, não-iônicos semi-polares e as suas misturas. Quando presente, o tensoativo está normalmente presente a um nível de cerca de 0,1 a 60 % em peso, de 0,2 a 40 % em peso, de 0,5 a 30 % em peso, de 1 a 50 % em peso, de 1 a 40 % em peso, de 1 a 30 % em peso, de 1 a 20 % em peso, de 3 a 10 % em peso, de 3 a 5 % em peso, de 5 a 40 % em peso, de 5 a 30 % em peso, de 5 a 15 % em peso, de 3 a 20 % em peso, de 3 a 10 % em peso, de 8 a 12 % em peso, de 10 a 12 % em peso, de 20 a 25 % em peso ou de 25-60%.

[0198] Os detersivos tensoativos aniônicos apropriados incluem detersivos tensoativos de sulfato e sulfonato.

[0199] Detersivos tensoativos de sulfonato incluem alquilbenzenossulfonatos, num aspecto, alquilbenzenossulfonato C10.13. Um alquilbenzenossulfonato (LAS) adequado pode ser obtido por meio da sulfonação disponível comercialmente de alquilbenzeno linear (LAB); LAB adequado inclui 2-fenilo LAB de cadeia curta, tais como Isochem® ou Petrelab®, outro LAB adequado inclui 2-fenilo LAB de cadeia longa, tal como Hyblene®. Um detersivo tensoativo aniônico adequado é o alquilbenzenossulfonato que é obtido pelo processo catalisado por DETAL, embora outras vias de síntese, tais como HF, também podem ser adequadas. Em um aspecto, um sal de magnésio de LAS é usado.

[0200] Um detersivo tensoativo de sulfato adequado inclui sulfato de alquila, num aspecto, sulfato de alquila C8.18, ou predominantemente sulfato de alquila C12.

[0201] Um outro detersivo tensoativo de sulfato adequado é o sulfato de alquila alcoxilado, em um aspecto, sulfato de alquila etoxilado, em um aspecto, um sulfato de alquila alcoxilado C8.18, em outro aspecto, um sulfato de alquila etoxilado C8.18, tipicamente o sulfato de alquila alcoxilado tem um grau de alcoxilação em média de 0,5 a 20, ou de 0,5 a 10, tipicamente o sulfato de alquila alcoxilado é um sulfato de alquila etoxilado C8.18 com um grau de etoxilação em média de 0,5 a 10, de 0,5 a 7, de 0,5 a 5 ou de 0,5 a 3.

[0202] O sulfato de alquila, o sulfato de alquila alcoxilado e os alquilbenzenossulfonatos podem ser lineares ou ramificados, substituídos ou não substituídos.

[0203] O detersivo tensoativo pode ser um detersivo tensoativo de cadeia intermediária ramificada, em um aspecto, um detersivo tensoativo aniônico de cadeia intermediária ramificada, em um aspecto, um sulfato de alquila de cadeia intermediária ramificada e/ou um alquilbenzenossulfonato de cadeia intermediária ramificada, por exemplo, um sulfato de alquila de cadeia intermediária ramificada. Em um aspecto, a cadeia intermediária ramificada são grupos alquila C1_4, tipicamente grupos metila e/ou etila.

[0204] Exemplos não limitantes de tensoativos aniônicos incluem sulfatos e sulfonatos, em particular, alquilbenzenossulfonatos lineares (LAS), isômeros de LAS, alquilbenzenossulfonatos ramificados (BABS), fenilalcanossulfonatos, alfa-olefinossulfonatos (AOS), sulfonatos de olefina, sulfonatos de alqueno, alcano-2,3-diilbis(sulfatos), hidroxialcanossulfonatos e dissulfonatos, sulfatos de alquila (AS) tais como dodecil sulfato de sódio (SDS), sulfatos de álcool graxo (FAS), sulfatos de álcool primário (PAS), etersulfatos de álcool (AES ou AEOS ou FES, também conhecidos como etoxissulfatos de álcool ou éter sulfatos de álcool graxo), alcanossulfonatos secundários (SAS), sulfonatos de parafina (PS), éster sulfonatos, glicerol ésteres de ácido graxo sulfonados, ésteres de metila de ácido graxo alfa- sulfo (alfa-SFMe ou SES) incluindo éster sulfonato de metila (MES), ácido alquil- ou alquenilsuccínico, ácido succínico de dodecenila/tetradecenila (DTSA), derivados de ácido graxo de aminoácidos, diésteres e monoésteres de ácido sulfo-succínico ou sabão, e suas combinações.

[0205] Detersivos tensoativos não iônicos são selecionados a partir do grupo consistindo em: alquila etoxilado C8-C18, tal como, NEODOL®; alcoxilados de alquilfenol C6-C12 em que as unidades alcoxiladas podem ser unidades etilenoxi, unidades propilenoxi ou uma sua mistura; álcool C12-C18 e fenol alquila C6-C12 condensados com óxido de etileno/óxido de propileno tal como Pluronic®; álcoois de cadeia intermediária ramificada C14-C22; alquila alcoxilados de cadeia intermediária ramificada C14-C22, tipicamente com um grau de alcoxilação de 1 a 30; alquil polissacáridos, em um aspecto, alquil poliglucosídeos; amidas poliidroxi de ácido graxo; tensoativo de álcool poli(oxialquilado) tamponado com éter; e as suas misturas.

[0206] Detersivos tensoativos não iônicos incluem poliglucosídeos de alquila e/ou um álcool de alquila alcoxilado.

[0207] Em um aspecto, detersivos tensoativos não iônicos incluem álcool de alquila alcoxilado, em um aspecto álcool de alquila alcoxilado C8. 18, por ex., álcool de alquila etoxilado C8.18, o álcool de alquila alcoxilado pode ter um grau de alcoxilação de 1 a 50, de 1 a 30, de 1 a 20, ou de 1 a 10. Em um aspecto, o álcool de alquila alcoxilado pode ser um álcool de alquila etoxilado C8.18 com um grau de etoxilação de 1 a 10, de 1 a 7, mais de 1 a 5 ou de 3 a 7. O álcool de alquila alcoxilado pode ser linear ou ramificado, e substituído ou não substituído. Tensoativos não iônicos adequados incluem Lutensol®.

[0208] Exemplos não limitantes de tensoativos não iônicos incluem etoxilatos de álcool (AE ou AEO), propoxilatos de álcool, álcoois graxos propoxilados (PFA), ésteres de alquila de ácido graxo alcoxilados, tais como ésteres de alquila de ácido graxo etoxilados e/ou propoxilados, etoxilados de alquilfenol (APE), etoxilados de nonilfenol (NPE), alquilpoliglicosídeos (APG), aminas alcoxiladas, monoetanolamidas de ácido graxo (FAM), dietanolamidas de ácido graxo (FADA), monoetanolamidas de ácido graxo etoxiladas (EFAM), monoetanolamida de ácido graxo propoxilada (PFAM), amidas poliidroxi alquila de ácido graxo, ou derivados de glucosamina de M-acila e M-alquila (glucamidas, GA, ou glucamidas de ácido graxo, FAGA), bem como produtos disponíveis sob os nomes registrados SPAN e TWEEN, e suas combinações.

[0209] Detersivos tensoativos catiônicos adequados incluem compostos de piridínio de alquila, compostos de amônio quaternário de alquila, compostos de fosfônio quaternário de alquila, compostos de sulfônio ternário de alquila, e as suas misturas.

[0210] Detersivos tensoativos catiônicos adequados são compostos de amônio quaternário com a fórmula geral: (R)(R1)(R2)(R3)N+ X', em que, R é uma fração alquila ou alquenila C6.18, linear ou ramificada, substituída ou não substituída, R1 e R2 são independentemente selecionados de frações metila ou etila, R3 é uma fração hidroxila, hidroximetila ou hidroxietila, X é um ânion que proporciona neutralidade de cargas, ânions adequados incluem: haletos, por exemplo, cloreto; sulfato; e sulfonato. Detersivos tensoativos catiônicos adequados são cloretos de amônio quaternário di- metila mono-hidroxietila alquila mono-C6.18. Detersivos tensoativos catiônicos altamente adequados são cloretos de amônio quaternário di- metila mono-hidroxietila alquila mono-C8.10, cloretos de amônio quaternário di-metila mono-hidroxietila alquila mono-C10.12, e cloretos de amônio quaternário di-metila mono-hidroxietila alquila mono-C10.

[0211] Exemplos não limitantes de tensoativos catiônicos incluem alquildimetiletanolamina quat (ADMEAQ), brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB), cloreto de dimetildistearilamônio (DSDMAC) e alquilbenzildimetilamônio, compostos de amônio quaternário de alquila, compostos de amônio quaternário alcoxilado (AQA), ésteres quats, e suas combinações.

[0212] Tensoativos anfotéricos/zwiteriônicos adequados incluem óxidos de amina e betaínas, tais como alquildimetilbetaína, sulfobetaína, ou suas combinações. Tensoativos aniônicos amino neutralizados - Tensoativos aniônicos da presente invenção e co-tensoativos aniônicos auxiliares, podem existir numa forma de ácido, e a referida forma de ácido pode ser neutralizado para formar o sal de agente tensoativo que é desejável para uso nas presentes composições detergentes. Os agentes típicos para neutralização incluem a base contra-ião do metal, tais como hidróxidos, por exemplo, NaOH ou KOH. Outros agentes preferidos para neutralizar tensioativos aniônicos da presente invenção e co-tensioativos aniônicos auxiliares ou co-tensioativos na sua forma ácida, incluem amônia, aminas, ou alcanolaminas. Alcanolaminas são preferidas. Exemplos não limitativos adequados incluindo monoetanolamina, dietanolamina, trietanolamina, e outras alcanolaminas lineares ou ramificadas conhecidas na técnica; por exemplo, alcanolaminas altamente preferidas incluem 2- amino-1-propanol, 1-aminopropanol, monoisopropanolamina, ou 1-amino-3- propanol. Neutralização de aminas pode ser feita de forma completa ou parcial, por exemplo, parte da mistura de agente tensoativo aniônico pode ser neutralizada com sódio ou potássio e parte da mistura de agente tensoativo aniônico pode ser neutralizada com aminas ou alcanolaminas.

[0213] Exemplos não limitativos de tensoativos semipolares incluem óxidos de amina (OA), tal como o óxido de alquildimetilamina.

[0214] Pode ser preferido sistemas de tensoativos compreendendo misturas de um ou mais aniônico e em adição um ou mais tensoativos não iônicos com, opcionalmente, um agente tensoativo adicional tal como um agente tensoativo catiônico. Razão de peso preferidas de tensoativo aniônico para não iônico, pelo menos, 2:1, ou, pelo menos, 1:1 a 1:10.

[0215] Em um aspecto, um sistema tensoativo pode compreender uma mistura de tensoativos isoprenoides representados pela fórmula A e fórmula B:

em que Y é CH2 ou nula, e Z pode ser escolhido de tal forma que o tensoativo resultante é selecionado a partir dos seguintes tensoativos: um tensoativo de carboxilato de alquila, um tensoativo polialcoxi de alquila, um tensoativo aniônico de sulfato polialcoxi de alquila, um tensoativo de glicerol éster sulfonato de alquila, um tensoativo óxido de dimetilamina de alquila, um tensoativo à base de poliidroxi de alquila, um tensoativo éster de fosfato de alquila, um tensoativo glicerol sulfonato de alquila, um tensoativo poligluconato de alquila, um tensoativo éster de polifosfato de alquila, um tensoativo fosfonato de alquila, um tensoativo poliglicosídeo de alquila, um tensoativo monoglicosídeo de alquila, um tensoativo diglicosídeo de alquila, um tensoativo de sulfossuccinato de alquila, um tensoativo dissulfato de alquia, um tensoativo dissulfonato de alquila, um tensoativo sulfosuccinamato de alquila, um tensoativo de glucamida de alquila, um tensoativo taurinato de alquila, um tensoativo de sarcosinato de alquila, um tensoativo de glicinato de alquila, um tensoativo isetionato de alquila, um tensoativo dialcanolamida de alquila, um tensoativo monoalcanolamida de alquila, um tensoativo de sulfato de monoalcanolamida de alquila, um tensoativo diglicolamida de alquila, um tensoativo de sulfato de diglicolamida de alquila, um tensoativo de glicerol éster de alquila, um tensoativo de glicerol éster de sulfato de alquila, um tensoativo de glicerol éter de alquila, um tensoativo de glicerol éter de sulfato de alquila, um tensoativo éster de sulfonato de metila alquila, um tensoativo de poliglicerol éter de alquila, um tensoativo de poliglicerol éter de sulfato de alquila, um tensoativo éster de sorbitano de alquila, um tensoativo amonioalcanosulfonato de alquila, um tensoativo betaína amidopropil de alquila, um tensoativo à base de alquilato de alquila quat, um tensoativo à base de monohidroxialquilo-di-alquilado quat de alquila, um tensoativo à base de di-hidroxialquil monoalquilo quat de alquila, um tensoativo alquilado quat, um quat de tensoativo alquil trimetilamónio, um tensoativo à base de alquil polyhydroxalkyl oxipropilo quat, um grupo alquilo de glicerol éster de quat de tensoativo, um grupo alquilo-glicol amina quaternária tensoativo, um grupo alquilo de monometilo dihidroxietil agente tensoativo de amónio quaternário, um grupo alquilo dimetil monohydroxyethyl agente tensoativo de amónio quaternário, um alquil trimetilamónio tensoativo, um tensoativo à base de imidazolina alquilo, um tensoativo succinato alqueno-2-ilo, um grupo alquilo um tensoativo sulfonado-ácido carboxílico, um grupo alquilo- sulfonado um ácido alquil-carboxílico éster tensoativo, um tensoativo de sulfonato de alfa olefina, de um alquilfenol tensoativo etoxilado, um benzenossulfonato tensoativo alquilo, um sulfobetaína tensoativo alquilo, um tensoativo hidroxisulfobetaine de alquila, um tensoativo amoniocarboxilato betaína de alquila, um tensoativo éster de sacarose de alquila, um tensoativo alcanolamida de alquila, um tensoativo di(polioxietileno) monoalquil amónio de alquila, um tensoativo dialquil amónio mono(polioxietileno) de alquila, um tensoativo benzil dimetilamónio alquila, um tensoativo aminopropionato de alquila, um tensoativo amidopropil dimetilamina de alquila, ou uma sua mistura; e, se Z é uma porção carregada, Z está carregado de modo equilibrado por um metal adequado ou contra-ião orgânico. Contra-iões adequados incluem um contra-ião de metal, uma amina, ou uma alcanolamina, por exemplo, alcanolamónio C1-C6. Mais especificamente, os contra-iões adequados incluem Na+, Ca+, Li+, K+, Mg+, por exemplo, monoetanolamina (MEA), dietanolamina (DEA), trietanolamina (TEA), 2- amino-l-propanol, 1- aminopropanol, metildietanolamina, dimetiletanolamina, monoisopropanolamina, triisopropanolamina, l-amino-3-propanol, ou suas misturas. Em uma forma de realização, as composições contêm entre 5% a 97% de um ou mais tensoativos não-isoprenoides; e um ou mais aditivos de limpeza adjuntos; em que a razão de pesos de tensoativo com a fórmula A a tensoativo de fórmula B é de 50:50 a 95:5.

[0216] Sabão - As composições da presente invenção podem conter sabão. Sem estar limitado pela teoria, pode ser desejável incluir sabão uma vez que este atua em parte como um tensoativo e, em parte, como um constituinte e pode ser útil para a supressão de espuma e pode, além disso, interagir favoravelmente com os vários compostos catiônicos da composição para melhorar suavidade em tecidos têxteis tratados com as composições da invenção. Pode ser usado qualquer sabão conhecido na técnica para uso em detergentes de lavagem de roupa. Em uma forma de realização, as composições contêm sabão de 0 % em peso a 20 % em peso, de 0,5 % em peso a 20 % em peso, de 4 % em peso a 10 % em peso, ou de 4 % em peso a 7 % em peso.

[0217] Exemplos de sabão úteis nesta invenção incluem os sabões de ácido oleico, sabões de ácido palmítico, sabões de ácidos graxos de núcleo de palma e suas misturas. Sabões típicos estão na forma de misturas de sabões de ácidos graxos com diferentes comprimentos de cadeia e graus de substituição. Uma tal mistura é ácidos graxos de núcleo de palma coberto.

[0218] Em uma forma de realização, o sabão é selecionado a partir de ácidos graxos livres. Os ácidos graxos adequados são saturados e/ou insaturados e podem ser obtidos a partir de fontes naturais tais como, ésteres de uma planta ou animal (por exemplo, óleo de amêndoa de palma, óleo de palma, óleo de coco, óleo de babaçu, óleo de cártamo, óleo de sebo, óleo de rícino, óleos de sebo e de peixe, gordura, e suas misturas), ou sinteticamente preparados (por exemplo, através da oxidação de petróleo ou por hidrogenação de monóxido de carbono através do processo Fischer-Tropsch).

[0219] Exemplos de ácidos graxos saturados adequados para utilização nas composições da presente invenção incluem ácido cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico e beênico. Espécies de ácidos graxos insaturados adequados incluem: ácido palmitoleico, oleico, linoleico, linolênico e ricinoleico. Os exemplos de ácidos graxos preferidos são ácidos graxos saturados Cn, ácidos graxos saturados Ci2-Ci4, e ácidos graxos saturados ou insaturados Cn a Ci8, e suas misturas.

[0220] Quando presente, a razão de peso do co-tensoativo catiônico amaciador de tecidos para ácido graxo é preferivelmente de cerca de 1:3 a cerca de 3: 1, mais preferencialmente desde cerca de 1:1,5 a cerca de 1,5:1, mais preferivelmente cerca de 1:1.

[0221] Os níveis aqui de tensoativos aniônicos de sabão e sem serem de sabão são percentagens em peso da composição detergente, especificada numa base de forma ácida. No entanto, como é geralmente entendido na técnica, os tensoativos e sabões aniônicos são na prática neutralizados utilizando as bases de sódio, potássio ou alcanolamônio, tais como hidróxido de sódio ou monoetanolamina.

[0222] Hidrótopos - As composições da presente invenção podem compreender um ou mais hidrótopos. Um hidrótopo é um composto que solubiliza compostos hidrofóbicos em soluções aquosas (ou de forma oposta, substâncias polares em um ambiente não polar). Tipicamente, os hidrótopos têm caráter hidrofílico e hidrofóbico (assim chamadas propriedades anfifílicas como conhecidas dos tensoativos); no entanto, a estrutura molecular dos hidrótopos não favorece geralmente a autoagregação espontânea, ver por ex. revisão por Hodgdon e Kaler (2007), Current Opinion in Colloid & Interface Science 12: 121-128. Os hidrótopos não exibem uma concentração crítica acima da qual a autoagregação ocorre como encontrado em tensoativos e lípidos formando mesofases micelares, lamelares e outras bem conhecidas. Em vez disso, muitos hidrótopos mostram um processo de agregação do tipo contínuo onde os tamanhos dos agregados crescem à medida que a concentração aumenta. No entanto, muitos hidrótopos alteram o comportamento de fase, estabilidade, e propriedades coloidais de sistemas contendo substâncias de caráter polar e não polar, incluindo misturas de água, óleo, tensoativos, e polímeros. Os hidrótopos são classicamente usados em várias indústrias desde indústrias farmacêutica, de higiene pessoal, alimentar, a aplicações técnicas. O uso de hidrótopos em composições detergentes permite, por exemplo, formulações de tensoativos mais concentradas (como no processo de compactação de detergentes líquidos por remoção de água) sem induzir fenômenos indesejados tais como separação de fases ou elevada viscosidade.

[0223] O detergente pode conter de 0 a 10 % em peso, tal como cerca de 0 a 5 % em peso, ou de 3% a 5 % em peso, de um hidrótopo. Pode ser usado qualquer hidrótopo conhecido na técnica para uso em detergentes. Exemplos não limitantes de hidrótopos incluem benzenossulfonato de sódio, p-toluenossulfonato de sódio (STS), xilenossulfonato de sódio (SXS), cumenossulfonato de sódio (SCS), cimenossulfonato de sódio, óxidos de amina, álcoois e poliglicoléteres, hidroxinaftoato de sódio, hidroxinaftalenossulfonato de sódio, etilhexilssulfato de sódio, e suas combinações.

[0224] Adjuvantes - As composições da presente invenção podem compreender um ou mais adjuvantes, coadjuvantes, sistema de adjuvantes ou uma sua mistura. Quando um adjuvante é usado, a composição de limpeza irá compreender tipicamente adjuvante de 0 a 65 % em peso, pelo menos 1 % em peso, de 2 a 60 % em peso ou de 5 a 10 % em peso. Em uma composição de lavagem de louça, o nível de adjuvante é tipicamente 40 a 65 % em peso ou 50 a 65 % em peso. A composição pode ser substancialmente livre de adjuvante; substancialmente livre significa zeolite e/ou fosfato "não deliberadamente adicionado". Adjuvantes de zeólito típicos incluem zeólito A, zeólito P e zeólito MAP. Um adjuvante de fosfato típico é o tri-polifosfato de sódio.

[0225] O adjuvante e/ou coadjuvante pode ser particularmente um agente quelante que forma complexos solúveis em água com Ca e Mg. Pode ser utilizado qualquer adjuvante e/ou coadjuvante conhecido na técnica para uso em detergentes. Exemplos não limitativos de adjuvantes incluem zeólitos, difosfatos (pirofosfatos), trifosfatos como trifosfato de sódio (STP ou STPP), carbonatos como carbonato de sódio, silicatos solúveis como metassilicato de sódio, silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 da Hoechst), etanolaminas como 2-aminoetan-1-ol (MEA), iminodietanol (DEA) e 2,2’,2”-nitrilotrietanol (TEA) e carboximetilinulina (CMI), e suas combinações.

[0226] A composição de limpeza pode incluir um coadjuvante sozinho, ou em combinação com um adjuvante, por exemplo um adjuvante de zeólito. Exemplos não limitantes de coadjuvantes incluem homopolímeros de poliacrilatos ou seus copolímeros, tais como poli(ácido acrílico) (PAA) ou copoli(ácido acrílico/ácido maleico) (PAA/PMA). Outros exemplos não limitantes incluem citrato, quelantes tais como aminocarboxilatos, aminopolicarboxilatos e fosfonatos, e ácido alquil- ou alquenilsuccínico. Exemplos específicos adicionais incluem ácido 2,2’,2”-nitrilotriacético (NTA), ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA), ácido iminodisuccínico (IDS), ácido etilenodiamina-N,N’-disuccínico (EDDS), ácido metilglicinodiacético (MGDA), ácido glutâmico ácido-N,N- diacético (GLDA), 1 -hidroxietano-1,1 -diilbis(ácido fosfônico) (HEDP), etilenodiaminotetraquis(metileno)tetraquis(ácido fosfônico) (EDTMPA), dietilenotriaminepentaquis(metileno)pentaquis(ácido fosfônico) (DTPMPA), ácido N-(2-hidroxietil)iminodiacético (EDG), ácido aspártico ácido-N- monoacético (ASMA), ácido aspártico ácido- N,N-diacético (ASDA), ácido aspártico ácido-N- monopropiônico (ASMP), ácido iminodisuccínico (IDA), ácido N- (2-sulfometil) aspártico (SMAS), ácido N- (2-sulfoetil) aspártico (SEAS), ácido N- (2- sulfometil) glutâmico (SMGL), ácido N- (2- sulfoetil) glutâmico (SEGL), ácido N- metiliminodiacético (MIDA), ácido α- alanina- N,N-diacético (α -ALDA), ácido serina-N,N-diacético (SEDA), ácido isoserina-N,N-diacético (ISDA), ácido fenilalanina-N,N-diacético (PHDA), ácido antranílico ácido- N,N - diacético (ANDA), ácido sulfanílico ácid-N, N- diacético (SLDA), ácido taurina-N, N-diacético (TUDA) e ácido sulfometil- N,N-diacético (SMDA), N-(hidroxietila)-etilidenodiaminotriacetato (HEDTA), dietanolglicina (DEG), Dietilenotriamina Penta (ácido metilenofosfônico) (DTPMP), aminotris(ácido metilenofosfônico) (ATMP), e suas combinações e seus sais. Adjuvantes e/ou coadjuvantes exemplares adicionais são descritos em, por ex., WO09/102854, US5977053.

[0227] Agentes quelantes e Inibidores de Crescimento de Cristais - As composições desta invenção podem conter um agente quelante e/ou um inibidor de crescimento de cristais. Moléculas adequadas incluem agentes quelantes de cobre, ferro e/ou manganês e as suas misturas. Moléculas adequadas incluem DTPA (Ácido Dietilenotriaminopentaacético), HEDP (Ácido hidroxietano-difosfónico), DTPMP ((Ácido metileno fosfónico) dietilenotriaminopenta), Sal dissódico hidrato de ácido 1,2-Di- hidroxibenzeno-3,5-dissulfónico, etilenodiamina, dietilenotriamina, dietilenetriamina, ácido etilenodiaminodisuccínico (EDDS), ácido N- (hidroxietila)-etilidenodiaminotriacetato (HEDTA), ácido trietilenotetraaminohexaacético (TTHA), ácido N-hidroxietiliminodiacético (HEIDA), dihidroxietilglicina (DHEG), ácido etilenediaminotetrapropionico (EDTP), inulina de carboximetilo e ácido 2-fosfonobutano 1,2,4-tricarboxílico (Bayhibit® AM) e seus derivados. Tipicamente a composição pode compreender um agente quelante ou um inibidor de crescimento de cristais de 0,005 a 15 % em peso ou de 3,0 a 10 % em peso.

[0228] Componente Branqueador - O componente branqueador adequado para incorporação nos métodos e composições da invenção compreende um ou uma mistura de mais de um componente branqueador. Componentes branqueadores adequados incluem catalisadores branqueadores, fotobranqueadores, ativadores de branqueamento, fontes de peróxido de hidrogênio, peróxido de hidrogênio, perácidos pré-formados e as suas misturas. Em geral, quando um componente branqueador é usado, as composições da presente invenção podem compreender de 0 a 30 % em peso, de 0,00001 a 90 % em peso, 0,0001 a 50 % em peso, de 0,001 a 25 % em peso ou de 1 a 20 % em peso. Exemplos de agentes branqueadores adequados incluem:

[0229] (1) Perácidos pré-formados: Perácidos pré-formados adequados incluem, mas não estão limitados a, compostos selecionados do grupo que consiste em peroxiácidos pré-formados ou seus sais, tipicamente ou um ácido peroxicarboxílico ou seu sal, ou um ácido peroxisulfônico ou seu sal.

[0230] O pré-formado peroxiácido ou um sal é de preferência um ácido peroxicarboxílico ou um seu sal, tipicamente tendo uma estrutura química correspondendo à seguinte fórmula química: o

em que: R14 é selecionado a partir de grupos alquilo, aralquilo, cicloalquilo, arilo ou heterocíclicos; o grupo R14 pode ser linear ou ramificado, substituído ou não substituído; e Y é qualquer contra-ião adequado que atinja a neutralidade da carga eléctrica, de preferência Y é selecionado a partir de hidrogênio, sódio ou potássio. De preferência, R14 é uma alquila C6.9 linear ou ramificada, substituída ou não substituída. De preferência, o peroxiácido ou um seu sal é selecionado a partir de ácido peroxihexanoico, ácido peroxiheptanoico, ácido peroxioctanoico, ácido peroxinonanoico, ácido peroxidecanóico, e um seu sal, ou qualquer sua combinação. Ácidos peroxi particularmente preferidos são os ácidos ftalimidoperoxialcanoicos, em particular ácido ε-ftalimidoperoxihexanoico (PAP). De preferência, o peroxiácido ou um seu sal tem um ponto de fusão na gama de 30 °C a 60 °C.

[0231] O pré-formado peroxiácido ou seu sal pode ser também umácido peroxisulfônico ou seu sal, tipicamente tendo uma estrutura química correspondendo à seguinte fórmula química:

em que: R15 é selecionado a partir de grupos alquilo, aralquilo, cicloalquilo, arilo ou heterocíclicos; o grupo R15 pode ser linear ou ramificado, substituído ou não substituído; e Z é qualquer contra-ião adequado que atinja a neutralidade da carga eléctrica, de preferência Z é selecionado a partir de hidrogênio, sódio ou potássio. De preferência, R15 é uma alquila C6-9 linear ou ramificada, substituída ou não substituída. De preferência, tais componentes de branqueamento podem estar presentes nas composições da invenção em uma quantidade de 0,01 a 50 % em peso ou de 0,1 a 20 % em peso.

[0232] (2) Fontes de peróxido de hidrogênio incluem, por exemplo, sais de peridratos inorgânicos, incluindo sais de metais alcalinos tais como sais de metais alcalinos tais como sais de sódio de perborato (usualmente mono- ou tetra-hidrato), sais de percarbonato, persulfato, perfosfato, persilicato e suas misturas. Em um aspeto da invenção, os sais de peridratos inorgânicos como os que são selecionados do grupo consistindo em sais de sódio de perborato, percarbonato e suas misturas. Quando empregues, os sais de peridratos inorgânicos estão tipicamente presentes em quantidades de 0,05 a 40 % em peso, ou 1 a 30 % em peso da composição global e são tipicamente incorporados em tais composições como um sólido cristalino que pode estar revestido. Revestimentos adequados incluem: sais inorgânicos tais como silicato de metais alcalinos, sais de carbonatos ou boratos ou suas misturas, ou materiais orgânicos tais como polímeros solúveis em água ou dispersíveis, ceras, óleos ou sabões graxos. De preferência, tais componentes de branqueamento podem estar presentes nas composições da invenção em uma quantidade de 0,01 a 50 % em peso ou 0,1 a 20 % em peso.

[0233] (3) O termo ativador do branqueamento se entende aqui como um composto que reage com o peróxido de hidrogênio para formar um perácido através de perhidrólise. O perácido assim formado constitui a lixívia ativada. Ativadores de lixívia adequados a serem usados aqui incluem aqueles pertencendo à classe de amidas, imidas ou anidridos de éster. Ativadores de branqueamento adequados são aqueles tendo R- (C=O)-L, em que R é um grupo alquila, opcionalmente ramificado, tendo, quando o ativador de branqueamento é hidrofóbico, de 6 a 14 átomos de carbono, ou de 8 a 12 átomos de carbono e, quando o ativador de branqueamento é hidrofílico, menos do que 6 átomos de carbono ou mesmo menos do que 4 átomos de carbono; e L é um grupo lábil. Exemplos de grupos lábeis adequados são ácido benzoico e seus derivados - especialmente benzenossulfonato. Os ativadores de branqueamento adequados incluem oxibenzenossulfonato de dodecanoíla, oxibenzenossulfonato de decanoíla, ácido oxibenzoico de decanoíla ou seus sais, hexanoíloxibenzenossulfonato de 3,5,5-trimetila, etilenodiamina de tetraacetila (TAED),4-[(3,5,5-trimetilhexanoíl)oxi]benzenossulfonato de sódio (ISONOBS), 4-(dodecanoíloxi)benzenossulfonato (LOBS), 4- (decanoíloxi)benzeno-1-sulfonato, 4-(decanoíloxi)benzoato (DOBS ou DOBA), 4-(nonanoíloxi)benzenossulfonato (NOBS), e/ou os divulgados em WO98/17767. Uma família de ativadores de branqueamento é divulgada em EP624154 e particularmente preferencial em essa família é o citrato de trietila acetil (ATC). ATC ou um triglicérido de cadeia curta como triacetina tem a vantagem de ser amigo do ambiente. Além disso, o citrato de trietila acetil e a triacetina têm uma boa estabilidade hidrolítica no produto após armazenamento e são ativadores de branqueamento eficazes. Finalmente ATC é multifuncional, uma vez que o citrato libertado na reação de perhidrólise pode funcionar como um adjuvante. Alternativamente, o sistema de branqueamento pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida, ou sulfona. O sistema de branqueamento pode compreender também perácidos tais como ácido 6- (ftalimido)peroxihexanoico (PAP). Ativadores de branqueamento adequados são também divulgados em WO98/17767. Embora qualquer ativador de branqueamento adequado possa ser empregue, em um aspeto da invenção, a composição de limpeza em questão pode compreender NOBS, TAED ou suas misturas. Quando presentes, o perácido e/ou ativador de branqueamento estão geralmente presentes na composição em uma quantidade de 0,1 a 60 % em peso, de 0,5 a 40 % em peso ou mesmo de 0,6 a 10 % em peso com base na composição para cuidado de tecidos e da casa. Um ou mais perácidos hidrofóbicos ou seus precursores podem ser usados em combinação com um ou mais perácidos hidrofílicos ou seu precursor. De preferência, tais componentes de branqueamento podem estar presentes nas composições da invenção em uma quantidade de 0,01 a 50 % em peso ou 0,1 a 20 % em peso.

[0234] As quantidades de fonte de peróxido de hidrogênio e perácido ou ativador de branqueamento podem ser selecionadas tal que a razão molar de oxigênio disponível (da fonte de peróxido) em relação a perácido seja de 1:1 a 35:1, ou mesmo 2:1 a 10:1.

[0235] (4) Peróxidos de diacila - espécies de branqueamento com peróxido de diacila preferidas incluem aquelas selecionadas a partir de peróxidos de diacila da fórmula geral: R1-C(O)-OO-(O)C-R2, em que R1 representa um grupo alquila C6-C18, de preferência um grupo alquila C6-C12 contendo uma cadeia linear de pelo menos 5 átomos de carbono e contendo opcionalmente um ou mais substituintes (por exemplo, -N+ (CH3)3, -COOH ou -CN) e/ou uma ou mais frações interrompendo (por exemplo, -CONH- ou -CH=CH-) interpolados entre átomos de carbono adjacentes do radical alquila, e R2 representa um grupo alifático compatível com uma fração peróxido, de modo que R1 e R2 em conjunto contêm um total de 8 a 30 átomos de carbono. Em um aspeto preferencial, R1 e R2 são 1 cadeias alquila C6-C12 lineares, não substituídas. Mais preferencialmente R e R2 são idênticos. Peróxidos de diacila, em que ambos R1 e R2 são grupos alquila C6-C12, são particularmente preferidos. Preferencialmente, pelo menos um de, e mais preferencialmente, apenas um dos, grupos R (R1 ou R2), não contem ramificação ou anéis pendentes na posição alfa, ou, de preferência, nem nas posições alfa nem beta, ou mais preferencialmente em nenhuma das posições alfa ou beta ou gama. Em uma outra forma de realização preferida, o DAP pode ser assimétrico, de preferência de tal modo que a hidrólise do grupo acila R1 é rápida para gerar perácido, mas a hidrólise do grupo acila R2 é lenta.

[0236] As espécies de branqueamento com peróxido de tetracila são de preferência selecionadas a partir de peróxidos de tetracila com a fórmula geral: R3-C(O)-OO-C(O)-(CH2)n-C(O)-OO-C(O)-R3, na qual R3 representa um grupo alquila C1-C9, ou C3-C7, e n representa um número inteiro de 2 a 12, ou 4 a 10, inclusivamente.

[0237] De preferência, as espécies de branqueamento de peróxido de diacila e/ou tetracila estão presentes numa quantidade suficiente para proporcionar pelo menos 0,5 ppm, pelo menos 10 ppm, ou pelo menos 50 ppm por peso de licor de lavagem. Numa forma de realização preferida, as espécies de branqueamento está presente numa quantidade suficiente para proporcionar de 0,5 a 300 ppm, de 30 a 150 ppm por peso de líquido de lavagem.

[0238] Preferencialmente o componente branqueador compreende um catalisador de branqueamento (5 e 6).

[0239] (5) Catalisadores de branqueamento orgânicos (não metálicos) preferidos incluem catalisadores de branqueamento capazes de aceitar um átomo de oxigênio a partir de um peroxiácido e/ou seu sal, e transferir o átomo de oxigênio a um substrato oxidável. Catalisadores de branqueamento adequados incluem, mas não estão limitados a: cátions e poliíons de imínio; zwitterions de imínio; aminas modificadas; óxidos de aminas modificadas; iminas de N-sulfonila; iminas de N-fosfonila; iminas de N-acila; dióxidos de tiadiazol; perfluoroiminas; cetonas de açúcares cíclicas e suas misturas.

[0240] Catiões de imínio e poli-iões adequados incluem, mas não estão limitados a, tetrafluoroborato de N-metil-3,4-di-hidro-isoquinolinio, preparado como descrito em Tetrahedron (1992), 49(2), 423-38 (por exemplo, composto 4, p.433); p-tolueno-sulfonato de N-metil-3,4-dihidro- isoquinolinio, preparado como descrito em US5360569 (por exemplo, coluna 11, Exemplo 1); e p-tolueno-sulfonato de N-octil-3,4-di-hidro- isoquinolinio, preparado como descrito em US5360568 (por exemplo, coluna 10, Ex. 3).

[0241] Zwitterions imínio adequados incluem, mas não estão limitadas a, N- (3-sulfopropil)-3,4-dihidroisoquinolinio, sal interno, preparado como descrito em US5576282 (por exemplo, coluna 31, Ex. II); N- [2- (sulfoxi)dodecil]-3,4-dihidroisoquinolinio, sal interno, preparado como descrito em US5817614 (por exemplo, coluna 32, Ex V); 2- [3-[(2-etil- hexil)oxi]-2-(sulfoxi)propil]-3,4-dihidroisoquinolinio, sal interno, preparado como descrito no documento WO05/047264 (por exemplo, p.18, Ex. 8), e 2- [3-[(2-butilocti)oxi]-2-(sulfoxi)propil]-3,4-dihidroisoquinolinio, sal interno.

[0242] Os catalisadores adequados de transferência de oxigênio da amina modificada incluem, mas não estão limitados a, 1,2,3,4- tetra-hidro-2- metil-1 -isoquinolinol, que pode ser feita de acordo com os procedimentos descritos em Tetrahedron Letters (1987), 28(48), 6061-6064. Catalisadores adequados de transferência de oxigênio do óxido de amina modificado incluem, mas não estão limitados a, 1-hidroxi-N-oxi-N- [2- (sulfoxi)decil] - 1,2,3,4-tetra-hidroisoquinolina de sódio.

[0243] Os catalisadores adequados de transferência de oxigênio de imina N-sulfonilo incluem, mas não estão limitados a, 1,1-dióxido 3-metil- 1,2-benzisotiazol preparado de acordo com o procedimento descrito no Journal of Organic Chemistry (1990), 55(4), 1254-61.

[0244] Catalisadores adequados de transferência de oxigênio de imina N-fosfonilo incluem, mas não estão limitados a, amida [R-(E)]-N-[(2-cloro-5- nitrofenil)metileno]-P-fenil-P-(2,4,6-trimetilfenil)-fosfínica, que pode ser feita de acordo com os procedimentos descritos no Journal of the Chemical Society, Chemical Communications (1994), (22), 2569-70.

[0245] Os catalisadores adequados de transferência de oxigênio de imina de N-acilo incluem, mas não estão limitados a, acetamida de [N (E)]- N-(fenilmetileno), que pode ser feita de acordo com os procedimentos descritos em Polish Journal of Chemistry (2003), 77(5), 577-590.

[0246] Catalisadores adequados de transferência de oxigênio de dióxido de tiadiazole incluem, mas não estão limitados a, 1,1-dióxido de 3- metil-4-fenil-1,2,5-tiadiazole, o qual pode ser feito de acordo com os procedimentos descritos em US5753599 (coluna 9, Ex. 2).

[0247] Os catalisadores adequados de transferência de oxigênio de perfluiroimina incluem, mas não estão limitados a, fluoreto de (Z)- 2,2,3,3,4,4,4-heptafluoro-N-(nonafluorobutil)butanimidoil, que pode ser feita de acordo com os procedimentos descritos em Tetrahedron Letters (1994), 35(34), 6329-30.

[0248] Os catalisadores adequados de transferência de oxigênio da cetona de açúcar cíclica incluem, mas não estão limitados a, 1,2: 4,5-di-O- isopropilideno-D-eritro-2,3-hexodiuro-2,6-piranose como preparado em US6649085 (coluna 12, Ex. 1).

[0249] De preferência, o catalisador de branqueamento compreende um grupo funcional de imínio e/ou carbonilo e é geralmente capaz de formar um grupo funcional oxaziridina e ou dioxirano após a aceitação de um átomo de oxigênio, especialmente após a aceitação de um átomo de oxigênio a partir de um peroxiácido e/ou um seu sal. De preferência, o catalisador de branqueamento compreende um grupo funcional oxaziridina e/ou é capaz de formar um grupo funcional oxaziridina após a aceitação de um átomo de oxigênio, especialmente após a aceitação de um átomo de oxigênio a partir de um peroxiácido e/ou um seu sal. De preferência, o catalisador de branqueamento compreende um grupo funcional de imínio cíclico, de preferência em que a fração cíclica tem um tamanho de anel de cinco a oito átomos (incluindo o átomo de nitrogênio), de preferência de seis átomos. De preferência, o catalisador de branqueamento compreende um grupo funcional ariliminio, de preferência um grupo funcional ariliminio bi-cíclico, de preferência um grupo funcional 3,4-dihidroisoquinolinio. Tipicamente, o grupo funcional imina é um grupo funcional imina quaternário e é tipicamente capaz de formar um grupo funcional oxaziridinio quaternário após a aceitação de um átomo de oxigênio, especialmente após a aceitação de um átomo de oxigênio a partir de um peroxiácido e/ou um seu sal. Num outro aspecto, a composição detergente compreende um componente de branqueamento tendo um logP0/w não seja maior que 0, não maior do que -0,5, não maior do que -1,0, não maior do que -1,5, não maior do que -2,0, não maior do que -2,5, não maior do que -3,0, ou não maior do que -3,5. O método para determinar logPo/w é descrito em mais detalhe em baixo.

[0250] Tipicamente, o ingrediente branqueador é capaz de gerar uma espécie de branqueamento tendo um XSO de 0,01 a 0,30, de 0,05 a 0,25, ou de 0,10 a 0,20. O método para determinar XSO é descrito em mais detalhe em baixo. Por exemplo, ingredientes de branqueamento tendo uma estrutura isoquinolínio são capazes de gerar uma espécie de branqueamento que tem uma estrutura oxaziridinio. Neste exemplo, XSO é o das espécies de branqueamento oxaziridinio.

[0251] De preferência, o catalisador de branqueamento tem uma estrutura química que corresponde à seguinte fórmula química:

R6 R5 em que: n e m são independentemente de 0 a 4, de preferência nem são ambos 0; cada R1 é independentemente selecionado a partir de um radical substituído ou não substituído, selecionado a partir do grupo de radicais que consiste em hidrogênio, alquila, cicloalquila, arila, arila fundido, anel heterocíclico, anel fundido heterocíclico, nitro, halo, ciano, sulfonato, alcoxi, ceto, carboxílico, e carboalcoxi; e quaisquer dois substituintes R1 vicinais podem combinar para formar um arilo fundido, carbocíclico fundido ou um anel heterocíclico condensado; cada R2 é independentemente selecionado a partir de um radical substituído ou não substituído selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em hidrogênio, hidroxi, alquila, cicloalquila, alcarila, arila, aralquila, alquilenos, anel heterocíclico, alcoxis, grupos arilcarbonilo, grupos carboxialquilo e grupos amida; qualquer R2 pode ser unido em conjunto com qualquer outro de R2 para formar parte de um anel comum; qualquer R2 geminais podem combinar para formar um grupo carbonilo; e quaisquer dois R2 podem combinar-se para formar um radical insaturado substituído ou não substituído fundido; R3 é uma alquila C1 a C20 substituída ou não substituída; R4 é hidrogênio ou a fração Qt-A, em que: Q é um alquileno ramificado ou não ramificado, t = 0 ou 1 e A é um grupo aniônico selecionado de entre o grupo que consiste em OSO3, SO3, CO2, OCO2, OPO32, OPO3H e OPO2; R5 é hidrogênio ou a fração -CR11R12-Y-Gb-Yc-[(CR9R10)y-O]k-R8, em que: cada Y é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em O, S, NH, ou N-R8; e cada R8 é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em alquila, arila e heteroarila, sendo as referidas frações substituídas ou não substituídas, e se substituídas ou não substituídas as referidas frações têm menos de 21 átomos de carbono; cada G é selecionado independentemente a partir do grupo que consiste em CO, SO2, SO, PO e PO2; R9 e R10 são independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em H e alquila C1-C4; R11 e R12 são selecionados independentemente de entre o grupo que consiste em H e alquila, ou quando tomados em conjunto, podem juntar-se para formar um carbonilo; b = 0 ou 1; c pode = 0 ou 1, mas deve ser c = 0 se b = 0; y é um número inteiro de 1 a 6; k é um número inteiro de 0 a 20; R6 é H, ou um grupo alquila, arila ou heteroarila; as referidas frações sendo substituídas ou não substituídas; e X, se presente, é uma carga adequada de equilíbrio do contra-ião, de preferência, X está presente quando R4 é hidrogénio, X adequado inclui, mas não está limitado a: cloreto, brometo, sulfato, metossulfato, sulfonato, p-toluenossulfonato, borotetraflouride e fosfato.

[0252] Em uma forma de realização da presente invenção, o catalisador de branqueamento tem uma estrutura que corresponde à fórmula geral seguinte:

em que R13 é um grupo alquila de cadeia ramificada contendo de três a 24 átomos de carbono (incluindo os átomos de carbono de ramificação) ou um grupo alquila linear contendo de um a 24 átomos de carbono; de um modo preferido R13 é um grupo alquila ramificado contendo de oito a 18 átomos de carbono ou um grupo alquilo linear contendo de oito a dezoito átomos de carbono; preferivelmente R13 é selecionado a partir do grupo que consiste em 2-propilheptil, 2-butiloctil, 2-pentilnonil, 2-hexildecilo, n-dodecilo, n- tetradecilo, n-hexadecilo, n-octadecilo, isononilo, isodecilo, isotridecil e isopentadecilo; R13 é preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em 2-butiloctil, 2-pentilnonil, 2-hexildecilo, iso-tridecilo e iso-pentadecilo.

[0253] De preferência, o componente branqueador compreende uma fonte de perácido para além do catalisador de branqueamento, particularmente catalisadores de branqueamento orgânicos. A fonte de perácido pode ser selecionada a partir de (a) perácido pré-formado; (b) percarbonato, perborato ou persulfato de sal (fonte de peróxido de hidrogênio), de preferência em combinação com um ativador de branqueamento; e (c) enzima perhidrolase e um éster para perácido a formar in situ na presença de água em um passo de tratamento têxtil ou de superfície dura.

[0254] Quando presentes, o perácido e/ou ativador de branqueamento estão geralmente presentes na composição em uma quantidade de 0,1 a 60 % em peso, de 0,5 a 40 % em peso ou mesmo de 0,6 a 10 % em peso com base na composição. Um ou mais perácidos hidrofóbicos ou seus precursores podem ser usados em combinação com um ou mais perácidos hidrofílicos ou seu precursor.

[0255] As quantidades de fonte de peróxido de hidrogênio e perácido ou ativador de branqueamento podem ser selecionadas tal que a razão molar de oxigênio disponível (da fonte de peróxido) em relação a perácido seja de 1:1 a 35:1, ou de 2:1 a 10:1.

[0256] (6) Catalisadores de Branqueamento contendo Metal - O componente de branqueamento pode ser fornecido por um complexo de metal catalítico. Um tipo de catalisador de branqueamento contendo metal é um sistema catalisador compreendendo um catião de metal de transição de atividade catalítica de branqueamento definida, tal como cobre, ferro, titânio, rutênio, tungstênio, molibdénio ou catiões manganês, um catião metálico auxiliar com pouca ou nenhuma atividade catalítica de branqueamento, tal como catiões de zinco ou alumínio, e um sequestrado tendo constantes de estabilidade definidas para os catiões metálicos catalíticos e auxiliares, particularmente o ácido etilenodiaminotetracético, etilenodiaminotetra(ácido metilenofosfónico) e sais solúveis em água dos mesmos. Tais catalisadores são divulgados em US4430243. Catalisadores preferenciais são descritos em WO09/839406, US6218351 e WO00/012667. Particularmente preferidos são catalisadores ou ligandos de metais de transição, portanto, que são ligandos poli dentados contendo grupos N-doadores de ponte cruzada.

[0257] Se desejado, as composições desta invenção podem ser catalisados por meio de um composto de manganês. Tais compostos e níveis de utilização são bem conhecidos na arte e incluem, por exemplo, os catalisadores baseados em manganês descritos em US5576282.

[0258] Os catalisadores de branqueamento de cobalto úteis nesta invenção são conhecidos, e estão descritos, por exemplo, em US5597936; US5595967. Tais catalisadores de cobalto são prontamente preparados por procedimentos bem conhecidos, tais como os divulgados, por exemplo, em US5597936 e US5595967.

[0259] As composições desta invenção podem também adequadamente incluir um complexo de metal de transição de ligandos, tais como bispidonas (US7501389) e/ou ligandos rígidos macropoliciclicos - abreviado como "MRL". Como um assunto prático, e não como forma de limitação, as composições e processos desta invenção podem ser ajustados para proporcionar na ordem de pelo menos uma parte por cem milhões da espécie MRL ativas no meio de lavagem aquoso, e tipicamente irá fornecer de 0,005 a 25 ppm, de 0,05 a 10 ppm, ou de 0,1 a 5 ppm, do MRL no líquido de lavagem.

[0260] Metais de transição adequados no catalisador instantâneo de branqueamento de metal de transição incluem, por exemplo, manganês, ferro e cromo. MRLs adequados incluem 5,12-dietil-1,5,8,12-tetra- azabiociclo[6.6.2] hexadecano. MRLs de metais de transição adequados são prontamente preparados por procedimentos conhecidos, tais como por exemplo, ensinado em US6225464 e WO00/32601.

[0261] (7) Fotobranqueadores - fotobranqueadores adequados incluem por exemplo, ftalocianina de zinco sulfonada, ftalocianinas de alumínio sulfonadas, corantes de xanteno e suas misturas. Componentes de branqueamento preferidos para uso nas presentes composições da invenção compreendem uma fonte de peróxido de hidrogênio, ativador de branqueamento e/ou de peroxiácido orgânico, opcionalmente gerado in situ pela reação de um ativador da fonte de peróxido de hidrogênio e ativador de branqueamento, em combinação com um catalisador de branqueamento. Componentes de branqueamento preferidos incluem catalisadores de branqueamento, de preferência catalisadores de branqueamento orgânicos, como descrito acima.

[0262] Componentes de branqueamento particularmente preferidos são os catalisadores de branqueamento, em particular os catalisadores de branqueamento orgânicos.

[0263] Sistemas de branqueamento exemplares são também descritos, por ex., em WO2007/087258, WO2007/087244, WO2007/087259 e WO2007/087242.

[0264] Agentes de Matização de Tecidos - A composição pode compreender um agente de matização de tecidos. Agentes de matização de tecidos adequados incluem corantes, conjugados de corante-argila, e pigmentos. Corantes adequados incluem corantes de molécula pequena e corantes poliméricos. Corantes de molécula pequena adequados incluem corantes de molécula pequena selecionados do grupo consistindo em corantes se enquadrando nas classificações do Índice de Cor (C.I.) de Azul Direto, Vermelho Direto, Violeta Direto, Azul Ácido, Vermelho Ácido, Violeta Ácido, Azul Básico, Violeta Básico e Vermelho Básico, ou suas misturas.

[0265] Num outro aspecto, corantes de molécula pequena adequadas incluem pequenas moléculas de corante selecionada a partir do grupo consistindo no Índice de Cor (Society of Dyers and Colorists, Bradford, Reino Unido) números Violeta Direto 9, Violeta Direto 35, o Violeta Direto 48, Violeta Direto 51, Violeta Direto 66, Violeta Direto 99, Azul Direto 1, Azul Direto 71, Azul Direto 80, Azul Direto 279, Vermelho Ácido 17, Vermelho Ácido 73, Vermelho Ácido 88, Vermelho Ácido 150, Violeta Ácido 15, Violeta Ácido 17, Violeta Ácido 24, Violeta Ácido 43, Vermelho Ácido 52, Violeta Ácido 49, Violeta Ácido 50, Azul Ácido 15, Azul Ácido 17, Azul Ácido 25, Azul Ácido 29, Azul Ácido 40, Azul Ácido 45, Azul Ácido 75, Azul Ácido 80, Azul Ácido 83, Azul Ácido 90 e Azul Ácido 113, Preto Ácido 1, Violeta Básico 1, Violeta Básico 3, Violeta Básico 4, Violeta Básico 10, Violeta Básico 35, Violeta Básico 3, Azul Básico 16, Azul Básico 22, Azul Básico 47, Azul Básico 66, Azul Básico 75, Azul Básico 159 e suas misturas. Num outro aspecto, corantes de molécula pequena adequados incluem corantes de molécula pequena selecionados a partir do grupo consistindo no Índice de Cor (Society of Dyers and Colorists, Bradford, Reino Unido) números Violeta Ácido 17, Violeta Ácido 43, Vermelho Ácido 52, Vermelho Ácido 73, Vermelho Ácido 88, Vermelho Ácido 150, Azul Ácido 25, Azul Ácido 29, Azul Ácido 45, Azul Ácido 113, Azul Ácido 1, Azul Direto 1, Azul Direto 71, Violeta Direto 51 e suas misturas. Num outro aspecto, corantes de molécula pequena adequados incluem corantes de molécula pequena selecionados a partir do grupo consistindo no Índice de Cor (Society of Dyers and Colorists, Bradford, Reino Unido) números Violeta Ácido 17, Azul Direto 71, Violeta Direto 51, Azul Direto 1, Vermelho Ácido 88, Vermelho Ácido 150, Azul Ácido 29, Azul Ácido 113 ou suas misturas.

[0266] Corantes poliméricos adequados incluem os corantes poliméricos selecionados a partir do grupo que consiste em polímeros que contêm cromogênios conjugados (conjugados de polímero corante) e polímeros com cromogênios co-polimerizado na estrutura principal do polímero e as suas misturas.

[0267] Num outro aspecto, corantes poliméricos adequados incluem os corantes poliméricos selecionados a partir do grupo que consiste em corantes substantivos de tecido vendidos sob o nome de Liquitint® (Milliken), conjugados de corante-polímero formado a partir de pelo menos um corante reativo e um polímero selecionado de entre o grupo que consiste em polímeros compreendendo uma fração selecionada de entre o grupo consistindo em uma fração hidroxilo, uma fração amina primário, uma fração amina secundária, uma fração tiol e as suas misturas. Em ainda outro aspecto, corantes poliméricos adequados incluem os corantes poliméricos selecionados a partir do grupo que consiste em corantes Liquitint® Violet CT, celulose de carboximetila (CMC) conjugado com um corante reativo azul, reativo violeta ou corante reativo vermelho, tal como CMC conjugado com C.I. Azul Reativo 19, vendido por Megazyme, Wicklow, Irlanda sob o nome de produto AZO-CM-CELLULOSE, o código do produto S-ACMC, corantes poliméricos alcoxilado de trifenil-metano, corantes alcoxilados poliméricos de tiofeno, e suas misturas.

[0268] Agentes de matização de tecidos preferidos incluem os agentes de branqueamento encontrados em WO08/87497. Os agentes de branqueamento podem ser caracterizados pela estrutura (I) seguinte:

em que R1 e R2 podem ser selecionados independentemente de: a) [(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH] em que R' é selecionado do grupo que consiste em H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH, e suas misturas; em que R" é selecionado do grupo que consiste em H, CH2O(CH2CH2O)zH, e suas misturas; em que x + y < 5; em que y > 1; e em que z = 0 to 5; b) R1 = alquila, arila ou alquil arila e R2 = [(CH2CR'HO)x(CH2CR"HO)yH] em que R' é selecionado do grupo que consiste em H, CH3, CH2O(CH2CH2O)zH, e suas misturas; em que R" é selecionado do grupo que consiste em H, CH2O(CH2CH2O)zH, e suas misturas; em que x + y < 10; em que y > 1; e em que z = 0 to 5; c) Ri = [CH2CH2(OR3)CH2OR4] e R2 = [C^CH2(O R3)CH2O R4] em que R3 é selecionado do grupo consistindo em H, (CH2CH2O)zH, e suas misturas; e em que z = 0 a 10; em que R4 é selecionado do grupo consistindo em grupos arila, alquila (C1-C16), e suas misturas; e d) em que R1 e R2 pode ser independentemente selecionados a partir do produto de adição de amina do óxido de estireno, éter glicidilo de metila, éter glicidilo de isobutila, éter isopropilglicidil, éter glicidilo t-butílico, éter 2-etilhexilgicidilo, e éter glicidilhexadecilo, seguido pela adição de 1 a 10 unidades de óxido de alquileno.

[0269] Um agente de branqueamento preferido da presente invenção pode ser caracterizado pela estrutura (II) seguinte:

em que R' é selecionado CH2O(CH2CH2O)zH, e suas misturas; em que R" é selecionado do grupo que consiste em H, CH2O(CH2CH2O)zH, e suas misturas; em que x + y < 5; em que y > 1; e em que z = 0 to 5.

[0270] Um agente de branqueamento adicional preferido da presente invenção pode ser caracterizado pela estrutura (III) seguinte:

tipicamente compreendendo uma mistura tendo um total de 5 grupos EO. Moléculas preferidos adequados são aquelas na Estrutura I tendo os seguintes grupos pendentes na "parte a" acima. TABELA 1

[0271] Agentes de branqueamento adicional de uso incluem aqueles descritos em US2008/34511 (Unilever). Um agente preferido é "Violeta 13".

[0272] Os conjugados de corante de argila adequados incluem conjugados de selecionados a partir do grupo que compreende pelo menos um corante catiônico/básico e uma argila de esmectite, e as suas misturas. Em outro aspecto, os conjugados de argila corantes adequados incluem corantes de conjugados de argila selecionados a partir do grupo que consiste em um corante catiônico/básico selecionado a partir do grupo que consiste em C.l. Amarelo Básico 1 a 108, C.I. Laranja básico de 1 a 69, C.I. Vermelho básico de 1 a 118, C.I. Violeta básico 1 a 51, C.I. Azul básico de 1 a 164, C.I. Verde básico 1 a 14, C.I. Castanho Básico de 1 a 23, Preto Básico CI de 1 a 11, e uma argila selecionada de entre o grupo que consiste em argila Montmorillonita, argila Hectorite, argila Saponite e suas misturas. Em ainda outro aspecto, os conjugados de argila corantes adequados incluem corantes de argila conjugados selecionados de entre o grupo consistindo em: Montmorillonita Azul Básico B7 C.I. conjugado 42595, Montmorillonita Azul Básico B9 C.I. conjugado 52015, Montmorillonita Violeta Básico B9 C.I. conjugado 42555, Montmorillonita Verde Básico G1 C.I. conjugado 42040, Montmorillonita Vermelho Básico R1 C.I. conjugado 45160, Montmorillonita C.I. Preto Básico 2, Hectorite Azul Básico B7 C.I. conjugado 42595, Hectorite Azul Básico B9 C.I. conjugado 52015, Hectorite Violeta Básico B9 C.I. conjugado 42555, Hectorite Verde Básico G1 C.I. conjugado 42040, Hectorite Vermelho Básico R1 C.I. conjugado 45160, Hectorite C.I. Preto Básico 2, Saponite Azul Básico B7 C.I. conjugado 42595, Saponite Azul Básico B9 C.I. conjugado 52015, Saponite Violeta Básico B9 C.I. conjugado 42555, Saponite Verde Básico G1 C.I. conjugado 42040, Saponite Vermelho Básico R1 C.I. conjugado 45160, Saponite C.I. Básico Preto 2 conjugado e as suas misturas.

[0273] Os pigmentos adequados incluem os pigmentos selecionados do grupo que consiste em flavantrona, indantrona, indantrona clorada contendo desde 1 a 4 átomos de cloro, pirantrona, dicloropirantrona, monobromodicloropirantrona, dibromodichloropirantrona, tetrabromo pirantrona, di-imida de ácido perileno-3,4,9,10-tetracarboxílico, em que os grupos imida podem ser não substituído ou substituído por C1-C3-alquilo ou fenilo ou um radical heterocíclico, e em que o fenilo e radicais heterocíclicos podem adicionalmente transportar substituintes que não conferem solubilidade em água, antrapirimidina amidas de ácido carboxílico, violantrona, isoviolantrona, pigmentos de dioxazina, ftalocianina de cobre, que pode conter até dois átomos de cloro por molécula, policloro- ftalocianina de cobre ou ftalocianina de polibromocloro-cobre contendo até 14 átomos de bromo por molécula e misturas destes.

[0274] Em um outro aspecto, pigmentos adequados incluem os pigmentos selecionados de entre o grupo constituído por Azul Ultramarino (C.I. Azul Pigmento 29), Violeta Ultramarino (C.I. Violeta Pigmento 15) e suas misturas.

[0275] Os agentes de matização de tecidos mencionados acima podem ser usados em combinação (qualquer mistura de agentes de matização de tecidos pode ser usada) Agentes de matização adequados são descritos em maior detalhe em US7208459. Níveis preferenciais de corante nas composições da invenção são 0,00001 a 0,5 % em peso, ou 0,0001 a 0,25 % em peso. A concentração preferida de corantes em água para o tratamento e/ou passo de limpeza é de 1 ppb a 5 ppm, 10 ppb a 5ppm ou 20 ppb a 5 ppm. Em composições preferidas, a concentração de tensoativo será de 0,2 a 3 g/L.

[0276] Encapsulado - A composição pode compreender um encapsulamento. Num aspecto, um encapsulado que compreende um núcleo, um invólucro tendo uma superfície interior e exterior, o referido invólucro de encapsulando o dito núcleo.

[0277] Num aspecto do dito encapsulado, o referido núcleo pode compreender um material selecionado a partir do grupo que consiste nem perfumes; branqueadores; corantes; repelentes de insectos; silicones; ceras; sabores; vitaminas; agentes amaciadores de tecidos; agentes de cuidados da pele, em um aspecto, parafinas; enzimas; agentes anti- bacterianos; descolorantes; amaciador; e suas misturas; e o referido invólucro pode compreender um material selecionado a partir do grupo que consiste de polietilenos; poliamidas; alcoóis polivinílicos, opcionalmente contendo outros co-monômeros; poliestirenos; polisoprenos; policarbonatos; poliésteres; poliacrilatos; aminoplásticos, em um aspecto, aminoplásticos podem compreender poliureias, poliuretano e/ou poliureauretano, em um aspecto a referida poliureia pode compreender polioxi-metilleno-urea e/ou formaldeído de melamina; poliolefinas; polissacáridos, num aspecto, o referido polissacarídeo pode compreender alginato e/ou quitosano; gelatina; goma-laca; resinas epóxi; polímeros de vinilo; inorgânicos insolúveis em água; de silicone; e suas misturas.

[0278] Num aspecto do dito encapsulado, o referido núcleo pode compreender perfume.

[0279] Num aspecto do dito encapsulado, o referido invólucro pode compreender formaldeído de melamina e/ou formaldeído de melamina reticulado.

[0280] Em um aspecto, os encapsulados adequados podem compreender um material de núcleo e um invólucro, o referido invólucro, pelo menos, parcialmente em torno do referido material de núcleo, é divulgado. Pelo menos 75 %, 85 % ou 90 % dos ditos encapsulados podem ter uma resistência à fractura de 0,2 a 10 MPa, de 0,4 a 5 MPa, de 0,6 a 3,5 MPa, ou de 0,7 a 3 MPa; e um agente de vazamento benéfico de 0 a 30 %, de 0 a 20 %, ou de 0 a 5 %.

[0281] Em um aspecto, pelo menos, 75 %, 85 % ou 90 % dos ditos encapsulados podem ter um tamanho de partícula de 1 a 80 mícrones, 5 a 60 mícrones, de 10 a 50 mícrones, ou de 15 a 40 mícrones.

[0282] Em um aspecto, pelo menos, 75 %, 85 % ou 90 % dos ditos encapsulados podem ter uma espessura da parede da partícula de 30 a 250 nm, de 80 a 180 nm, ou de 100 a 160nm.

[0283] Em um aspecto, o referido material de núcleo encapsulado pode compreender um material seleccionado a partir do grupo que consiste de um perfume matéria-prima e / ou, opcionalmente, um material seleccionado a partir do grupo que consiste em óleo vegetal, incluindo os óleos vegetais puros e / ou em mistura, incluindo o óleo de rícino, óleo de coco, óleo de semente de algodão, óleo de uva, semente de colza, óleo de soja, óleo de milho, óleo de palma, óleo de linhaça, óleo de cártamo, óleo de oliva, óleo de amendoim, óleo de coco, óleo de semente de palma, óleo de rícino, óleo de limão e suas misturas; ésteres de óleos vegetais, ésteres de adipato de dibutilo, incluindo, ftalato de dibutilo, adipato de benzilo e butilo, benzilo adipato de octilo, fosfato de tricresilo, fosfato de trioctilo e suas misturas; linear ou hidrocarbonetos de cadeia ramificada, incluindo esses hidrocarbonetos de cadeia linear ou ramificada possuindo um ponto de ebulição mais elevado do que cerca de 80 °C; terfenilos parcialmente hidrogenados, ftalatos de dialquilo, incluindo alquilo, bifenilos, naftaleno alquilado monoisopropilbifenil, incluindo dipropilnaftaleno, éter de petróleo, incluindo o querosene, óleo mineral e suas misturas; solventes aromáticos, incluindo benzeno, tolueno e suas misturas; óleos de silicone; e suas misturas.

[0284] Em um aspeto, o referido material de parede encapsulados pode compreender uma resina adequada incluindo o produto da reação de um aldeído e uma amina, aldeídos adequados incluem formaldeído. As aminas adequadas incluem melamina, ureia, benzoguanamina, glicoluril, e suas misturas. Melaminas apropriados incluem melamina metilol, melamina metilada de metilol, imino melamina e suas misturas. Ureias adequados incluem ureia dimetilol, ureia dimetilol metilada, ureia-resorcinol, e suas misturas.

[0285] Num aspecto, eliminadores de formaldeído adequados podem ser empregues com a encapsula, por exemplo, numa suspensão de cápsula e/ou adicionados a uma composição antes, durante ou após os encapsulados serem adicionados a essa composição. Cápsulas adequadas podem ser feitos pelo seguinte ensinamento da US2008/0305982; e/ou US2009/0247449.

[0286] Em um aspecto preferido, a composição também pode incluir um auxiliar de deposição, preferivelmente consistindo nos grupos compreendendo polímeros catiônicos ou não iônicos. Os polímeros adequados incluem amidos catiônicos, hidroxietilcelulose catiônica, polivinilformaldeído, goma de alfarroba, mananas, xiloglucanas, goma de tamarindo, tereftalato de polietileno e polímeros contendo metacrilato de dimetilaminoetilo, opcionalmente com um ou monômeros selecionados a partir do grupo que compreende ácido acrílico e acrilamida.

[0287] Perfumes - Num aspecto, a composição compreende um perfume que compreende um ou mais perfumes matérias-primas selecionadas a partir do grupo que consiste em 1,1'-oxibis-2-propanol; ácido 1,4-ciclohexanodicarboxílico, éster dietílico; (etoximetoxi) ciclododecano; 1,3-nonanodiol, monoacetato; éster de (3-metil-butoxi)- acético 2-propenilo; ciclododecaneethanol beta-metilo; 2-metil-3 - [(1,7,7- trimetilbiciclo [2.2.1]hept-2-il)oxi] -1-propanol; oxacyclohexadecan-2-ona; acetato de alfa-metil-benzenometanol; trans-3-etoxi-1,1,5-trimetilciclo- hexano; acetato de 4-(1,1 -dimetiletil) ciclohexanol; dodecahidro-3a, 6,6,9a- tetrametilnafto [2,1 -b]furano; beta-metilo benzenepropanal; beta-metil-3-(1- metiletil) benzenepropanal; 4-fenil-2-butanona; ácido 2-metilbutanóico, éster etílico; benzaldeído; 2-metilbutanóico, éster 1-metiletilo; (3H)furanona di- hidro-5-2-pentilo; (2E)-1 -(2,6,6-trimetil-2-ciclo-hexen-1 -il)-2-buten-1 -ona; dodecanal; undecanal; 2-etil-alfa, alfa-dimethylbenzenepropanal; decanal; alfa, acetato de alfa-dimetilbenzenoetanol; 2-(fenilmetileno) octanal; 2-[[3-[4- (1,1-dimetiletil) fenil]-2-metilpropilideno]amino]benzóico, éster metílico; 1- (2,6,6-trimetil-3-ciclo-hexen-1 -il)-2-buten-1 -ona; 2-pentilciclopentanona; ácido éster metílico ciclopentanoacético de 3-oxo-2-pentilo; 4-hidroxi-3- metoxibenzaldeído; 3-etoxi-4-hidroxibenzaldeído; 2-heptylcyclopentanone; 1-(4-metilfenil)etanona; (3E)-4-(2,6,6-trimetil-1-ciclo-hexen-1-il) -3-buten-2- ona; (3E)-4-(2,6,6-trimetil-2-ciclo-hexen-1-il) -3-buten-2-ona; benzenoetanol; 2H-1-benzopirano-2-ona; 4-metoxibenzaldeído; 10-undecenal; propanóico, éster fenilmetílico; beta-methylbenzenepentanol; 1,1-dietoxi-3,7-dimetil-2,6- octadieno; alfa, alfa-dimetilbenzenoetanol; (2E)-1-(2,6,6-trimetil-1-ciclo- hexen-1-il)-2-buten-1-ona; ácido acético de éster fenilmetílico; ácido ciclohexanepropanoico de éster de 2-propenilo; ácido hexanóico de éster de 2-propenilo; 1,2-dimetoxi-4-(2-propenil) benzeno; 1,5-dimetil- biciclo[3.2.1 ]octano-8-ona; 4-(4-hidroxi-4-metilpentil) -3-ciclohexeno-1 - carboxaldeído; 3-buten-2-ol; 2 - [[[2,4 (ou 3,5) -dimetil-3-ciclo-hexen-1- il]metileno]amino] benzóico, éster metílico; 8-ciclohexadecen-1-ona; metil ionona; 2,6-dimetil-7-octen-2-ol; (2-propenil) fenol 2-metoxi-4-; (2E) -3,7- dimetil-2,6-Octadien-1-ol; 2-hidroxi-benzóico, ácido (3Z) -3-hexenilo éster; 2-tridecenenitrile; 4- (2,2-dimetil-6-metilenociclo-hexil) -3-metil-3-buten-2- ona; tetra-hidro-4-metil-2- (2-metil-1 -propenil) -2H-pirano; Ácido acético, (2- metilbutoxi) -, éster de 2-propenilo; Ácido benzóico, 2-hidroxi-, éster de 3- metilbutilo; 2-buten-1-ona, 1- (2,6,6-trimetil-1-ciclo-hexen-1-il) -, (Z) -; Ciclopentanocarboxílico, 2-hexil-3-oxo-, éster metílico; Benzenepropanal, 4- etil-alfa.,.alfa-dimetil-; 3-ciclo-hexeno-1-carboxaldeído, 3- (4-hidroxi-4- metilpentil)-; Oxima de 1- (2,3,4,7,8,8a-hexa-hidro-3,6,8,8-tetrametil-1H-3a, 7- methanoazulen-5-il) -, [3R- (3.alfa.,3a.beta.,7.beta.,8a.alfa)]-; Undecanal, 2-metil-2H-piran-2-ona, 6-butiltetrahidro-; Benzenepropanal, 4-(1,1- dimetiletil)-alfa-metil-.; 2(3H)-furanona, 5-heptyldihydro-; Ácido benzóico, 2- [(7-hidroxi-3,7-dimethyloctylidene)amino]-, um grupo metilo; Ácido benzóico, 2-hidroxi-, éster fenilmetílico; Naftaleno, 2-metoxi-; 2-ciclopenten-1-ona, 2- hexil-; 2 (3H) -furanona, 5-hexyldihydro-; Ácido oxiranocarboxílico, 3-metil- 3-fenil-, éster de etilo; 2-oxabiciclo [2.2.2] octano, 1,3,3-trimetil-; Benzenepentanol, y-metil-; 3-octanol, 3,7-dimetil-; 3,7-dimetil-2,6- octadienenitrile; 3,7-dimetil-6-octen-1-ol; Terpineol de etilo; 2-metil-6- metileno-7-octen-2-ol, derivado de hidro; 3a, 4,5,6,7,7a-hexahidro-4,7- metano-1H-inden-6-ol propanoato de etilo; 3-metil-2-buten-1-ol; (Z) etilo -3- hexen-1-ol; 2-etil-4- (2,2,3-trimetil-3-ciclopenten-1-il) -2-buten-1-ol; 4- (octa- hidro-4,7-metano-5H-indeno-5-ilideno)-butanal; 3-2,4-dimetil-ciclo-hexeno- 1-carboxaldeído; 1-(1,2,3,4,5,6,7,8-octa-hidro-2,3,8,8-tetrametil-2- naftalenil)-etanona; Ácido 2-hidroxi-benzóico, éster metílico; Ácido 2-hidroxi- benzóico, éster de hexilo; 2-fenoxi-etanol; Ácido 2-hidroxi-benzóico, éster de pentilo; 2,3-heptanodiona; 2-hexen-1-ol; 6-octen-2-ol, 2,6-dimetil-; damascona (alfa, beta, gama ou delta ou suas misturas), 4,7-metano-1H- inden-6-ol, 3a, 4,5,6,7,7a-hexa-hidro-, etilo; 9-Undecenal; 8-Undecenal; Isocyclocitral; Oxima de 1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-octa-hidro-2,3,8,8-tetrametil-2- naftalenil) -; 3-ciclo-hexeno-1-carboxaldeído, 3,5-dimetil-; 3-ciclo-hexeno-1- carboxaldeído, 2,4-dimetil-; 1,6-Octadien-3-ol, 3,7-dimetil-; 1,6-Octadien-3- ol, 3,7-dimetil-, etilo; Lilial (pt-Bucinal), e ciclopentanona, 2- [2- (4-metil-3- ciclo-hexen-1-il) propil] - e 1-metil-4- (1-metiletenil) ciclo-hexeno e suas misturas.

[0288] Em um aspecto, a composição pode compreender partículas de perfume encapsulado compreendendo quer um composto hidroxílico solúvel em água ou de melamina-formaldeído ou o álcool polivinílico modificado. Em um aspecto, o encapsulado compreende (a) uma matriz sólida, pelo menos, parcialmente solúvel em água, compreendendo um ou mais compostos hidroxílicos solúveis em água, de preferência amido; e (b) um óleo de perfume encapsulado pela matriz sólida.

[0289] Num outro aspecto, o perfume pode ser pré-complexado com uma poliamina, de preferência, uma polietilenimina, de modo a formar uma base de Schiff.

[0290] Polímeros - A composição pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carboximetilcelulose, poli(vinilpirrolidona), poli(etileno glicol), poli(álcool de vinila), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos tais como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico, e copolímeros de metacrilato de laurila/ácido acrílico.

[0291] A composição pode compreender um ou mais polímeros de limpeza antifílicos, tais como o composto possuindo a seguinte estrutura geral: bis((C2H5O)(C2H4O)n)(CH3)-N+-CxH2x-N+-(CH3)-bis((C2H5O)(C2H4O)n), onde n = de 20 a 30, e x = 3 a 8, ou sulfatados ou variantes sulfonados dos mesmos.

[0292] A composição pode compreender polímeros de limpeza de gordura antifílicos alcoxilados que têm propriedades hidrofílicas e hidrofóbicas balançadas de modo a que eles removem partículas de gordura de tecidos e superfícies. Formas de realização específicas dos polímeros de limpeza de gordura antifílicos alcoxilados da presente invenção compreendem uma estrutura central e uma pluralidade de grupos alcoxilato ligados a essa estrutura de núcleo. Estes podem compreender polialquilleniminas alcoxiladas, de preferência tendo um bloco interno de óxido de polietileno e um bloco exterior de óxido de polipropileno.

[0293] Os policarboxilatos alcoxilados, tais como os preparados a partir de poliacrilatos, são úteis na presente invenção para fornecer desempenho adicional na remoção de gordura. Tais materiais são descritos na WO91/08281 e PCT90/01815. Quimicamente, estes materiais compreendem poliacrilatos que possuem uma cadeia lateral etoxi por cada 7-8 unidades de acrilato. As cadeias laterais têm a fórmula -(CH2CH2O)m (CH2)nCH3 em que m é 2-3 e n é 6-12. As cadeias laterais são ligadas a um éster através de uma "estrutura principal" de poliacrilato que proporcionam uma estrutura do polímero tipo "pente". O peso molecular pode variar, mas é normalmente na gama de 2000 a 50.000. Tais policarboxilatos alcoxilados podem compreender entre 0, 05 % em peso a 10% em peso das composições aqui descritas.

[0294] Os tensoativos derivados de isoprenoides da presente invenção, e as suas misturas com outros agentes co-tensoativos e outros ingredientes auxiliares, são particularmente adequadas para serem usadas com um copolímero com enxerto anfifílico, de preferência o enxerto de copolímero anfifílico compreende a (i) estrutura principal de polietileleno glicol; e (ii) e pelo menos uma fração pendente selecionada de acetato de polivinilo, álcool polivinílico e suas misturas. Um co-polímero de enxerto anfifílico preferido é Sokalan HP22, fornecido pela BASF. Os polímeros adequados incluem copolímeros de enxerto aleatórios, de preferência um copolímero de óxido de polietileno de acetato de polivinilo enxertado tendo uma estrutura principal de óxido de polietileno e várias cadeias laterais de acetato de polivinilo. O peso molecular da cadeia principal de óxido de polietileno é de preferência 6000 e a razão em peso do óxido de polietileno para o acetato de polivinilo é de 40 a 60 e não mais do que 1 ponto de enxertia por 50 unidades de óxido de etileno.

[0295] Polímero de carboxilato - A composição da presente invenção pode também incluir um ou mais polímeros de carboxilato tais como um copolímero aleatório de maleato/acrilato ou homopolímero de poliacrilato. Num aspecto, o polímero de carboxilato é um homopolímero de poliacrilato tendo um peso molecular de 4.000 a 9.000 Da, ou de 6.000 a 9.000Da.

[0296] Polímero de liberação de sujidade - A composição da presente invenção pode também incluir um ou mais polímeros de liberação da sujidade que possuem uma estrutura, tal como definido por uma das seguintes estruturas (I), (II) ou (III): (I) -[(OCHR1-CHR2)a-O-OC-Ar-CO-]d (II) -[(OCHR3-CHR4)b-O-OC-sAr-CO-]e (III) -[(OCHR5-CHR6)c-OR7]f em que: a, b e c são de 1 a 200; d, e e f são de 1 a 50; Ar é um fenileno 1,4-substituído; sAr é um fenileno 1,3-substituído, sendo substituído na posição 5 com SO3Me; Me é Li, K, Mg/2, Ca/2, Al/3, amônio, mono-, di-, tri-, ou tetraalquilamônio em que os grupos alquila são alquila C1-C18 ou hidroxialquila C2-C10, ou suas misturas; R1, R2, R3, R4, R5 e R6 são independentemente selecionados de H ou C1-C18n- ou iso-alquila; e R7 é uma alquila C1-C18 linear ou ramificada, ou alquenila C2C30 linear ou ramificada, ou um grupo cicloalquila com 5 a 9 átomos de carbono, ou um grupo arilo C8-C30, ou um grupo arilalquila C6-C30.

[0297] Os polímeros de libertação de sujidade adequados são polímeros de poliéster de libertação de sujidade tais como polímeros Repel- o-tex, incluindo Repel-o-tex, SF-2 e SRP6 fornecidos por Rhodia. Outros polímeros de libertação de sujidade adequados incluem polímeros Texcare, incluindo Texcare SRA100, SRA300, SRN100, SRN170, SRN240, SRN300 e SRN325 fornecidos pela Clariant. Outros polímeros de libertação de sujidade adequados são polímeros Marloquest, tais como Marloquest SL fornecidos por Sasol.

[0298] Polímero celulósico - A composição da presente invenção pode também incluir um ou mais polímeros celulósicos, incluindo os selecionados a partir de celulose de alquila, celulose alcoxialquila de alquila, celulose de carboxialquila, celulose carboxialquila de alquila. Em um aspecto, os polímeros celulósicos são selecionados a partir do grupo que compreende a celulose de carboximetilo, celulose de metilo, celulose de hidroxietil de metilo, celulose carboximetil de metilo, e suas misturas. Num aspecto, a celulose de carboximetilo tem um grau de substituição de carboximetilo de 0,5 a 0,9 e um peso molecular de 100.000 a 300.000 Da.

[0299] Enzimas - A composição pode compreender uma ou mais enzimas que proporcionam desempenho de limpeza e/ou beneficia o cuidado de tecidos. Exemplos de enzimas adequadas incluem, mas não estão limitados a, hemicelulases, peroxidases, proteases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, mananases, pectato liases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, β-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, clorofilases, amilases, ou suas misturas. Uma combinação típica é uma mistura de enzimas, que pode compreender, por exemplo, uma protease e uma lipase em conjunção com amilase. Quando presente na composição, as outras enzimas acima mencionadas podem estar presentes em níveis de 0,00001 a 2% em peso, de 0,0001 a 1% em peso ou de 0,001 a 0,5 % em peso de proteína enzimática por peso da composição

[0300] Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) devem ser compatíveis com o detergente selecionado (/.e., pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a(s) enzima(s) devem estar presente(s) em quantidades eficazes.

[0301] Em um aspecto, enzimas preferenciais incluirão uma celulase. Celulases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou mutantes resultantes da manipulação de proteínas. Celulases adequadas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremonium, por ex., as celulases fúngicas produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum divulgadas em US4435307, US5648263, US5691178, US5776757 e WO89/09259.

[0302] Celulases especialmente adequadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidados da cor. Exemplos de tais celulases são celulases descritas em EP0495257, EP0531372, WO96/11262, WO96/29397, WO98/08940. Outros exemplos são variantes de celulases tais como aquelas descritas em WO94/07998, EP0531315, US5457046, US5686593, US5763254, WO95/24471, WO98/12307 and PCT/DK98/00299.

[0303] Celulases comercialmente disponíveis incluem Celluzyme™, e Carezyme™ (Novozymes A/S), Clazinase™, e Puradax HA™ (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).

[0304] Em um aspecto, enzimas preferenciais incluirão uma protease. Proteases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana, fúngica, vegetal, viral ou animal, p.ex., origem vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferencial. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Pode ser uma protease alcalina, tal como uma serina protease ou uma metaloprotease. Uma serina protease pode por exemplo ser da família S1, tal como tripsina, ou da família S8 tal como subtilisina. Uma protease das metaloproteases pode por exemplo ser uma termolisina da, p.ex., família M4 ou outra metaloprotease tal como aquelas das famílias M5, M7 ou M8.

[0305] O termo "subtilases" se refere a um subgrupo de serina proteases acordo com Siezen et al., Protein Engng. 4 (1991) 719-737 e Siezen et al. Protein Science 6 (1997) 501-523. As serina proteases são um subgrupo de proteases caracterizadas por terem uma serina no local ativo, que forma um aducto covalente com o substrato. As subtilases podem ser divididas em 6 subdivisões, i.e., a família das Subtilisinas, a família das Termitases, a família da Proteinase K, a família das Peptidades lantibióticas, a família das Quexinas e a família das Pirolisinas.

[0306] Exemplos de subtilases são aquelas derivadas de Bacillus tais como Bacillus lentus, B. alkalophilus, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, Bacillus pumilus e Bacillus gibsonii descritas em US7262042 e WO09/021867, e subtilisina lentus, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, Bacillus licheniformis, subtilisina BPN>, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 descritas em WO89/06279 e protease PD138 descrita em (WO93/18140). Outras proteases úteis podem ser aquelas descritas em WO92/175177, WO01/016285, WO02/026024 e WO02/016547. Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsina (p.ex., de origem suína ou bovina) e a protease de Fusarium descrita em WO89/06270, WO94/25583 e WO05/040372, e as quimiotripsina proteases derivadas de Cellumonas descritas em WO05/052161 e WO05/052146.

[0307] Uma protease preferencial adicional é a protease alcalina de Bacillus lentus DSM 5483, como descrito por exemplo em WO95/23221, e suas variantes que são descritas em WO92/21760, WO95/23221, EP1921147 e EP1921148.

[0308] Exemplos de metaloproteases são a metaloprotease neutra como descrita em WO07/044993 (Genencor Int.) tais como aquelas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens.

[0309] Exemplos de proteases úteis são as variantes descritas em: WO92/19729, WO96/034946, WO98/20115, WO98/20116, WO99/011768, WO01/44452, WO03/006602, WO04/03186, WO04/041979, WO07/006305, WO11/036263, WO11/036264, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 3, 4, 9, 15, 27, 36, 57, 68, 76, 87, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 106, 118, 120, 123, 128, 129, 130, 160, 167, 170, 194, 195, 199, 205, 206, 217, 218, 222, 224, 232, 235, 236, 245, 248, 252 e 274 usando a numeração BPN’. Mais preferencial, as variantes de subtilase podem compreender as mutações: S3T, V4I, S9R, A15T, K27R, *36D, V68A, N76D, N87S,R, *97E, A98S, S99G,D,A, S99AD, S101G,M,R S103A, V104I,Y,N, S106A, G118V.R, H120D,N, N123S, S128L, P129Q, S130A, G160D, Y167A, R170S, A194P, G195E, V199M, V205I, L217D, N218D, M222S, A232V, K235L, Q236H, Q245R, N252K, T274A ( usando numeração BPN').

[0310] Enzimas proteases comercialmente disponíveis adequadas incluem aquelas vendidas sob os nomes registrados Alcalase®, Blase®, Duralase™, Durazym™, Relase®, Relase® Ultra, Savinase®, Savinase® Ultra, Primase®, Polarzyme®, Kannase®, Liquanase®, Liquanase® Ultra, Ovozyme®, Coronase®, Coronase® Ultra, Neutrase®, Everlase® e Esperase® todas poderiam ser vendidas como Ultra® ou Evity® (Novozymes A/S), aquelas vendidas sob o nome registrado Maxatase®, Maxacal®, Maxapem®, Purafect®, Purafect Prime®, Preferenz™, Purafect MA®, Purafect Ox®, Purafect OxP®, Puramax®, Properase®, Effectenz™, FN2®, FN3®, FN4®, Excellase®, Opticlean® e Optimase® (Danisco/DuPont), Axapem™ (Gist- Brocases N.V.), BLAP (sequência mostrada na Figura 29 de US5352604) e suas variantes (Henkel AG) e KAP (subtilisina de Bacillus alkalophilus) da Kao.

[0311] Em um aspecto, enzimas preferenciais incluirão uma amilase. Amilases adequadas podem ser uma alfa-amilase ou uma glucoamilase e podem ser de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas de Bacillus, por ex., uma estirpe especial de Bacillus licheniformis, descrita em mais detalhe em GB1296839.

[0312] Amilases adequadas incluem amilases tendo a SEQ ID N°: 3 em WO95/10603 ou variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID N°: 3. Variantes preferenciais são descritas em WO94/02597, WO94/18314, WO97/43424 e SEQ ID N°: 4 de WO99/019467, tais como variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 178, 179, 181, 188, 190, 197, 201, 202, 207, 208, 209, 211,243, 264, 304, 305, 391,408, e 444.

[0313] Diferentes amilases adicionais incluem amilases tendo SEQ ID N°: 6 em WO02/010355 ou suas variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID N°: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID N°: 6 são aquelas tendo uma deleção nas posições 181 e 182 e uma substituição na posição 193.

[0314] Outras amilases que são adequadas são alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID N°: 6 de WO2006/066594 e resíduos 36-483 da alfa-amilase de B. licheniformis mostrada em SEQ ID N°: 4 em WO2006/066594 ou variantes tendo 90 % da sua identidade de sequência. Variantes preferenciais desta alfa-amilase híbrida são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: G48, T49, G107, H156, A181, N190, M197, I201, A209 e Q264. Variantes mais preferenciais da alfa-amilase híbrida compreendendo os resíduos 1-33 da alfa-amilase derivada de B. amyloliquefaciens mostrada na SEQ ID N°: 6 de WO2006/066594 e resíduos 36-483 de SEQ ID N°: 4 são aquelas tendo as substituições: M197T; H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S; ou G48A+T49I+G107A+H156Y+A181 T+N 190F+I201F+A209V+Q2 64S.

[0315] Amilases adicionais que são adequadas são amilases tendo SEQ ID N°: 6 em WO99/019467 ou suas variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID N°: 6. Variantes preferenciais de SEQ ID N°: 6 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: R181, G182, H183, G184, N195, I206, E212, E216 e K269. Amilases particularmente preferenciais são aquelas tendo deleção nas posições R181 e G182, ou posições H183 e G184.

[0316] Amilases adicionais que podem ser usadas são aquelas tendo SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 3, SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 7 em WO96/023873 ou suas variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 7. Variantes preferenciais de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2, SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 7 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 140, 181, 182, 183, 184, 195, 206, 212, 243, 260, 269, 304 e 476. Variantes mais preferenciais são aquelas tendo uma deleção nas posições 181 e 182, ou posições 183 e 184. Variantes de amilases mais preferenciais de SEQ ID N°: 1, SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 7 são aquelas tendo uma deleção nas posições 183 e 184 e uma substituição em uma ou mais das posições 140, 195, 206, 243, 260, 304 e 476.

[0317] Outras amilases que podem ser usadas são amilases tendo SEQ ID N°: 2 de WO08/153815, SEQ ID N°: 10 em WO01/66712 ou suas variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID N°: 2 de WO 08/153815 ou 90 % de identidade de sequência com SEQ ID N°: 10 em WO01/66712. Variantes preferenciais de SEQ ID N°: 10 em WO01/66712 são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: 176, 177, 178, 179, 190, 201, 207, 211 e 264.

[0318] Amilases adequadas adicionais são amilases tendo SEQ ID N°: 2 de WO09/061380 ou variantes tendo 90 % de identidade de sequência com SEQ ID N°: 2. Variantes preferenciais de SEQ ID N°: 2 são aquelas tendo uma truncação do terminal C e/ou uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições: Q87, Q98, S125, N128, T131, T165, K178, R180, S181, T182, G183, M201, F202, N225, S243, N272, N282, Y305, R309, D319, Q320, Q359, K444 e G475. Variantes mais preferenciais de SEQ ID N°: 2 são aquelas tendo uma substituição em uma ou mais das seguintes posições: Q87E,R, Q98R, S125A, N128C, T131I, T165I, K178L, T182G, M201L, F202Y, N225E,R, N272E,R, S243Q,A,E,D, Y305R, R309A, Q320R, Q359E, K444E e G475K e/ou deleção na posição R180 e/ou S181 ou de T182 e/ou G183. Variantes de amilases mais preferenciais de SEQ ID N°: 2 são aquelas tendo as substituições: N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K; S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K; ou S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K em que as variantes são truncadas C-terminalmente e compreendem opcionalmente adicionalmente uma substituição na posição 243 e/ou uma deleção na posição 180 e/ou posição 181.

[0319] Outras amilases adequadas são a alfa-amilase tendo SEQ ID N°: 12 em WO01/66712 ou uma variante tendo pelo menos 90 % de identidade de sequência com SEQ ID N°: 12. Variantes de amilases preferenciais são aquelas tendo uma substituição, uma deleção ou uma inserção em uma ou mais das seguintes posições de SEQ ID N°: 12 em WO01/66712: R28, R118, N174; R181, G182, D183, G184, G186, W189, N195, M202, Y298, N299, K302, S303, N306, R310, N314; R320, H324, E345, Y396, R400, W439, R444, N445, K446, Q449, R458, N471, N484. Amilases preferenciais particulares incluem variantes tendo uma deleção de D183 e G184 e tendo as substituições R118K, N195F, R320K e R458K, e uma variante tendo adicionalmente substituições em uma ou mais posições selecionadas do grupo: M9, G149, G182, G186, M202, T257, Y295, N299, M323, E345 e A339, o mais preferencial uma variante que tem adicionalmente substituições em todas estas posições.

[0320] Outros exemplos são variantes de amilase tais como aquelas descritas em WO2011/098531, WO2013/001078 e WO2013/001087.

[0321] Amilases comercialmente disponíveis são Duramyl™, Termamyl™, Termamyl Ultra™, Fungamyl™, Ban™, Stainzyme™, Stainzyme Plus™, Amplify®, Supramyl™, Natalase™, Liquozyme X and BAN™ (da Novozymes A/S), KEMZYM® AT 9000 Biozym Biotech Trading GmbH Wehlistrasse 27b A-1200 Viena Áustria, e Rapidase™, Purastar™/Effectenz™, Powerase, Preferenz S100, Preferenx S110, ENZYSIZE®, OPTISIZE HT PLUS®, e PURASTAR OXAM® (Danisco/DuPont) and KAM® (Kao).

[0322] Lipases e cutinases adequadas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. São incluídos mutantes quimicamente modificados ou com manipulação de proteínas. Exemplos incluem lipase de Thermomyces, p.ex., de T. lanuginosus (previamente nomeada Humicola lanuginosa) como descrito em EP258068 e EP305216, cutinase de Humicola, p.ex., H. insolens (WO96/13580), lipase de estirpes de Pseudomonas (algumas destas agora renomeadas Burkholderia), p.ex., P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP218272), P. cepacia (EP331376), estirpe de P. sp. SD705 (WO95/06720 & WO96/27002), P. wisconsinensis (WO96/12012), lipases do tipo GDSL de Streptomyces (WO10/065455), cutinase de Magnaporthe grisea (WO10/107560), cutinase de Pseudomonas mendocina (US5,389,536), lipase de Thermobifida fusca (WO11/084412, WO13/033318), lipase de Geobacillus stearothermophilus (WO11/084417), lipase de Bacillus subtilis (WO11/084599), e lipase de Streptomyces griseus (WO11/150157) e S. pristinaespiralis (WO12/137147).

[0323] Outros exemplos são variantes de lipase tais como aquelas descritas em EP407225, WO92/05249, WO94/01541, WO94/25578, WO95/14783, WO95/30744, WO95/35381, WO95/22615, WO96/00292, WO97/04079, WO97/07202, WO00/34450, WO00/60063, WO01/92502, WO07/87508 e WO09/109500.

[0324] Produtos de lipase comerciais preferenciais incluem LipolaseTM, Lipex™; LipolexTM e LipocleanTM (Novozymes A/S), Lumafast (originalmente da Genencor) e Lipomax (originalmente da Gist-Brocades).

[0325] Ainda outros exemplos são lipases por vezes referidas como aciltransferases ou perhidrolases, p.ex., aciltransferases com homologia com lipase A de Candida antarctica (WO10/111143), aciltransferase de Mycobacterium smegmatis (WO05/56782), perhidrolases da família CE 7 (WO09/67279), e variantes da perhidrolase de M. smegmatis, em particular a variante S54V usada no produto comercial Gentle Power Bleach da Huntsman Textile Effects Pte Ltd (WO10/100028).

[0326] Em um aspecto, outras enzimas preferidas incluem as endoglucanases derivadas de microbianos que exibem atividade endo-beta- 1,4-glucanase (EC3.2.1.4), incluindo um polipéptido endógeno bacteriana a um membro do gênero Bacillus que tem uma sequência de pelo menos 90 %, 94 %, 97 % ou 99 % de identidade com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO:2 em US7141403 e as suas misturas. Endoglucanases adequadas são vendidas sob os nomes registrados Celluclean® e Whitezyme® (Novozymes).

[0327] Outras enzimas preferidas incluem liases de pectato vendidas sob os nomes registrados Pectawash®, Pectaway®, Xpect® e mananases vendidas sob os nomes registrados Mannaway® (Novozymes), e Purabrite® (Danisco/DuPont).

[0328] A(s) enzima(s) de detergente pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente por adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou por adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo de detergente da invenção, /.e., um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como granulado, líquido, pasta, etc. Formulações de aditivo de detergente preferenciais são granulados, em particular granulados sem formação de poeiras, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou pastas.

[0329] Podem ser produzidos granulados sem formação de poeiras, por ex., como divulgado em US4106991 e US4661452 e podem ser opcionalmente revestidos por métodos conhecidos na técnica. Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonolfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados nos quais o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e nos quais existem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de filme adequados para aplicação por técnicas de leito fluidizado são dados em GB1483591. Preparações de enzimas líquidas podem, por exemplo, ser estabilizadas pela adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Podem ser preparadas enzimas protegidas de acordo com o método divulgado em EP238216.

[0330] Agentes de Inibição de Transferência de Corantes - As composições da presente invenção podem também incluir um ou mais agentes de inibição de transferência de corantes. Agentes de inibição de transferência de corantes adequados incluem, mas não estão limitados a, polímeros de polivinilpirrolidona, polímeros de N-óxidos de poliamina, copolímeros de N-vinilpirrolidona e N-vinilimidazol, poliviniloxazolidonas e polivinilimidazóis ou suas misturas. Quando presentes em uma composição, os agentes de inibição de transferência de corantes podem estar presentes a níveis de 0,0001 % a 10 % em peso, de 0,01 % a 5 % em peso ou de 0,1 % a 3 % em peso.

[0331] Branqueadores - As composições da presente invenção podem conter também componentes adicionais que poderão tingir os artigos sendo limpos, tais como branqueadores fluorescentes.

[0332] A composição pode compreender o C.I. branqueador fluorescente 260 na forma alfa-cristalina possuindo a seguinte estrutura:

[0333] Num aspecto, o branqueador é um branqueador solúvel em água fria, tal como C.I. branqueador fluorescente 260 na forma alfa- cristalina. Em um aspecto, o branqueador está predominantemente na forma alfa-cristalina, o que significa que, normalmente, pelo menos, 50 % em peso, pelo menos 75 % em peso, pelo menos 90 % em peso, pelo menos 99 % em peso, ou mesmo substancialmente todo, do C.I. branqueador fluorescente 260 está na forma alfa-cristalina.

[0334] O branqueador está tipicamente na forma de partículas micronizadas, possuindo um peso médio de tamanho de partícula primária compreendido entre 3 e 30 micrômetros, de 3 micrômetros a 20 micrômetros, ou de 3 a 10 micrômetros.

[0335] A composição pode compreender o C.I. branqueador fluorescente 260 na forma beta-cristalina, e a razão em peso de: (i) C.I. branqueador fluorescente 260 na forma alfa-cristalina, a (ii) C.I. branqueador fluorescente 260 na forma beta-cristalina pode ser pelo menos 0,1, ou, pelo menos, 0,6. BE680847 refere-se a um processo para a fabricação de C.I. branqueador fluorescente 260 na forma alfa-cristalina.

[0336] Branqueadores ópticos comerciais que podem ser úteis na presente invenção podem ser classificados em subgrupos, que incluem, mas não estão necessariamente limitados a, derivados de estilbeno, pirazolina, cumarina, ácido carboxílico, metinocianinas, dibenzotiofeno-5,5- dióxido, azóis, heterociclos com anel de 5 e 6 membros, e outros agentes variados. Exemplos de tais branqueadores são divulgados em "The Production and Application of Fluorescent Brightening Agents", M. Zahradnik, Publicado por John Wiley & Sons, Nova Iorque (1982). Exemplos específicos não limitativos de branqueadores ópticos que são úteis nas presentes composições são aqueles identificados na US4790856 e US3646015.

[0337] Um branqueador adequado adicional tem a estrutura em baixo:

Níveis de branqueador fluorescente adequados incluem níveis inferiores de 0,01 % em peso, de 0,05 % em peso, de 0,1 % em peso ou de 0,2 % em peso até níveis superiores de 0,5 % em peso ou 0,75 % em peso.

[0338] Num aspecto, o branqueador pode ser carregado numa argila para formar uma partícula. Sais de Silicato - As composições da presente invenção também podem conter sais de silicato, tal como silicato de sódio ou de potássio. A composição pode compreender desde 0 % em peso a menos do que 10 % em peso de sal de silicato, a 9 % em peso, ou a 8 % em peso, ou a 7 % em peso, ou a 6 % em peso, ou a 5% em peso, ou a 4 % em peso, ou a 3% em peso, ou mesmo a 2 % em peso, e de cima de 0 % em peso ou de 0,5 % em peso, ou de 1 % em peso de sal de silicato. Um sal de silicato adequado é o silicato de sódio.

[0339] Dispersantes - As composições da presente invenção podem também conter dispersantes. Materiais orgânicos solúveis em água adequados incluem os ácidos homo- ou copoliméricos ou seus sais, nos quais o ácido policarboxílico compreende pelo menos dois radicais carboxila separados um do outro por não mais do que dois átomos de carbono.

[0340] Estabilizantes de enzimas - Enzimas para uso nas composições podem ser estabilizadas por diferentes técnicas. As enzimas empregues na presente invenção podem ser estabilizadas através da presença de fontes de íons de cálcio e/ou magnésio, solúveis em água. Exemplos de agentes estabilizantes convencionais são, por exemplo, um poliol tal como propilenoglicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, um aldeído peptídeo, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster aromático de borato, ou um derivado de ácido fenilborónico, tal como ácido 4-formilfenil, e a composição pode ser formulada como descrito em, por exemplo, WO92/19709 e WO92/19708. No caso de composições aquosas compreendendo proteases, um inibidor reversível de protease, tal como um composto de boro, incluindo borato, ácido 4-formil fenilborónico, o ácido fenilborónico e seus derivados, ou compostos tais como o formiato de cálcio, formato de sódio e 1,2- propanodiol, podem ser adicionados para adicionalmente melhorar a estabilidade. O aldeído peptídeo pode ter a fórmula B2-B1-B0-R aqui apresentada: R é hidrogênio, CH3, CX3, CHX2, ou CH2X, em que X é um átomo de halogênio; B0 é um resíduo de fenilalanina com um substituinte OH na posição p e/ou na posição m; B1 é um resíduo de um único aminoácido; e B2 consiste em um ou mais resíduos de aminoácidos, opcionalmente compreendendo um grupo de proteção ^-terminal. Aldeídos peptídeos preferidos incluem, mas não estão limitados, a: Z-RAY-H, Ac- GAY-H, Z-GAY-H, Z-GAL-H, Z-GAF-H, Z-GAV-H, Z-RVY-H, Z-LVY-H, Ac- LGAY-H, Ac-FGAY-H, Ac-YGAY-H, Ac-FGVY-H or Ac-WLVY-H, em que Z é benziloxicarbonilola e Ac é acetila.

[0341] Solventes - Solventes adequados incluem água e outros solventes tais como fluídos lipofílicos. Exemplos de fluidos lipofílicos adequados incluem siloxanos, outros silicones, hidrocarbonetos, éteres de glicol, derivados de glicerina, tais como éteres de glicerina, aminas perfluoradas, solventes perfluorados e hidrofluoréter, solventes orgânicos não fluorados de baixa volatilidade, solventes de diol, outros solventes amigos do ambiente e as suas misturas.

[0342] Estruturante/Espessantes - Líquidos estruturantes podem ser estruturados internamente, pelo que a estrutura é formada por ingredientes primários (por exemplo, material tensoativo) e/ou externamente estruturados, fornecendo uma estrutura de matriz tridimensional usando ingredientes secundários (por exemplo, polímeros, argila e/ou material de silicato). A composição pode compreender um estruturante, de 0,01 a 5 % em peso, ou de 0,1 a 2,0 % em peso. O estruturante é tipicamente selecionado a partir do grupo que consiste em diglicerídeos e triglicerídeos, diestearato de etileno glicol, celulose microcristalina, materiais à base de celulose, de microfibras de celulose, emulsões alcalinas incháveis hidrofobicamente modificadas, tais como Polygel W30 (3VSigma), biopolímeros, goma de xantano, goma de gelano, e suas misturas. Um estruturante adequado inclui óleo de rícino hidrogenado, e derivados não- etoxilados do mesmo. Um estruturante adequado é divulgado em US6855680. Tais estruturantes possuem um sistema de estruturação filiforme que tem uma gama de razões de aspecto. Outros estruturantes adequados e os processos para sua preparação são descritos em WO10/034736.

[0343] Agentes de condicionamento - A composição da presente invenção pode incluir um composto graxo com um ponto de fusão elevado. Os compostos graxos com ponto de fusão elevado úteis na presente invenção têm um ponto de fusão de 25 °C ou mais elevado, e é selecionado a partir do grupo que consiste em alcoóis graxos, ácidos graxos, derivados de alcoóis graxos, derivados de ácidos graxos e suas misturas. Tais compostos de baixo ponto de fusão não se destinam a ser incluídas na presente seção. Exemplos não limitativos dos compostos de elevado ponto de fusão encontram-se em International Cosmetic Ingredient Dictionary, Quinta Edição, 1993, e CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Segunda Edição, 1992.

[0344] O composto graxo de elevado ponto de fusão é incluído na composição a um nível desde de 0,1 a 40 % em peso, de 1 a 30 % em peso, de 1,5 a 16 % em peso, de 1,5 a 8 % em peso, de modo a proporcionar melhores benefícios de condicionamento, tais como sensação escorregadia durante a aplicação nos cabelos molhados, maciez e sensação de hidratação no cabelo seco.

[0345] As composições da presente invenção podem conter um polímero catiônico. As concentrações do polímero catiônico na composição variam tipicamente de 0,05 a 3 % em peso, de 0,075 a 2,0 % em peso, ou de 0,1 a 1,0 % em peso. Polímeros catiônicos adequados terão densidades de carga catiônica de pelo menos 0,5 meq/gm, pelo menos 0,9 meq/gm, pelo menos 1,2 meq/gm, pelo menos, 1,5 meq/g ou inferior a 7 meq/g e, menos de 5 meq/g, em que na altura de uso pretendido o pH da composição, que o pH estará geralmente na gama de pH 3 a pH 9 ou entre pH 4 e pH 8. Na presente invenção, "densidade de carga catiônica" de um polímero refere-se à relação do número de cargas positivas no polímero para o peso molecular do polímero. O peso molecular médio de tais polímeros catiônicos adequados será geralmente entre 10.000 e 10.000.000, entre 50.000 e 5.000.000, ou entre 100.000 e 3.000.000.

[0346] Polímeros catiônicos adequados para uso nas composições da presente invenção contêm frações contendo nitrogênio catiônico, tais como amônio quaternário ou frações amino catiônicas protonadas. Qualquer contra-iões aniônicos podem ser utilizados em associação com os polímeros catiônicos, desde que os polímeros permaneçam solúveis em água, na composição, ou em uma fase de coacervato da composição, e, desde que os contra- iões sejam fisicamente e quimicamente compatíveis com os componentes essenciais da composição, ou de outra forma não prejudiquem indevidamente o desempenho, estabilidade ou estética da composição. Exemplos não limitativos de tais contra-iões incluem halogenetos (por exemplo, cloreto, fluoreto, brometo, iodeto), sulfato e metilsulfato.

[0347] Exemplos não limitativos de tais polímeros estão descritos em CTFA Cosmetic Ingredient Dictionary, 3° edição, editado por Estrin, Crosley e Haynes, (The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc., Washington, DC (1982)).

[0348] Outros polímeros catiônicos adequados para o uso na composição incluem polímeros de polissacarídeos, derivados catiônicos de goma de guar, éteres de celulose contendo azoto quaternário, polímeros sintéticos, copolímeros de celulose eterificada, guar e amido. Quando utilizados, os polímeros catiônicos são quer solúveis na composição ou são solúveis na fase complexa de coacervato na composição formada pelo polímero catiônico e o componente descrito anteriormente tensoativo aniônico, anfotérico e/ou zwiteriônico. Coacervatos complexos do polímero catiônico podem também ser formados com outros materiais carregados na composição. Polímeros catiônicos adequados são descritos em US3962418; US3958581; e US2007/0207109.

[0349] As composições da presente invenção podem incluir um polímero não iônico como agente de condicionamento. Glicóis de polialquileno tendo um peso molecular de mais do que 1000 são úteis na presente invenção. Úteis são aqueles possuindo a seguinte fórmula geral:

em que R95 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, metilo, e suas misturas. Agentes de condicionamento, e em particular os silicones, podem estar incluídos na composição. Os agentes de condicionamento úteis nas composições da presente invenção compreendem, tipicamente, um líquido que forma emulsionados, partículas líquidas, insolúvel em água, dispersável em água, não volátil. Agentes de condicionamento adequados para utilização na composição são os agentes de condicionamento caracterizados geralmente como silicones (por exemplo, óleos de silicone, silicones catiônicos, gomas de silicone, silicones de alta de refração, e resinas de silicone), os óleos orgânicos de condicionamento (por exemplo, óleos de hidrocarbonetos, poliolefinas, e ésteres graxos) ou suas combinações, ou os agentes de condicionamento, que de outra forma formam partículas líquidas, dispersas na matriz aquosa do tensoativo aqui. Tais agentes de condicionamento devem ser físicamente e quimicamente compatíveis com os componentes essenciais da composição, e não devem de outra forma prejudicar indevidamente o desempenho, estabilidade ou estética da composição.

[0350] A concentração do agente de condicionamento na composição deve ser suficiente para proporcionar os benefícios desejados de condicionamento. Tal concentração pode variar com o agente de condicionamento, o desempenho de condicionamento desejado, o tamanho médio das partículas de agente de condicionamento, o tipo e concentração de outros componentes, e de outros fatores semelhantes.

[0351] A concentração do agente de condicionamento de silicone tipicamente varia de 0,01 a 10 % em peso. Exemplos não limitativos de agentes de condicionamento de silicone adequados, e agentes de suspensão facultativos para o silicone, são descritas na U.S. Reissue Pat. No. 34,584; US5104646; US5106609; US4152416; US2826551; US3964500; US4364837; US6607717; US6482969; US5807956; US5981681; US6207782; US7465439; US7041767; US7217777; US2007/0286837A1; US2005/0048549A1; US2007/0041929A1; GB849433; DE10036533, que são incorporados aqui por referência; Chemistry and Technology of Silicones, Nova Iorque: Academic Press (1968); General Electric Silicone Rubber Product Data Sheets SE 30, SE 33, SE 54 and SE 76; Silicon Compounds, Petrarch Systems, Inc. (1984); e em Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, vol. 15, 2a ed., pp 204-308, John Wiley & Sons, Inc. (1989).

[0352] As composições da presente invenção podem também compreender de 0,05 a 3 % em peso de pelo menos um óleo de condicionamento orgânico como agente de condicionamento, isoladamente ou em combinação com outros agentes de condicionamento, tais como os silicones (aqui descrito). Óleos adequados de condicionamento incluem óleos de hidrocarbonetos, poliolefinas e ésteres de ácidos graxos. Também adequados para utilização nas composições desta invenção são os agentes de condicionamento descritos em US5674478 e US5750122 ou US4529586 em; US4507280; US4663158; US4197865; US4217914; US4381919; e US4422853.

[0353] Higiene e mau odor - As composições da presente invenção podem também compreender um ou mais de ricinoleato de zinco, timol, sais de amônio quaternário tais como BARDAC®, tais como polietileniminas (Lupasol® da BASF) e os complexos de zinco das mesmas, prata e compostos de prata, especialmente as destinadas a liberar lentamente Ag+ ou nano-dispersões de prata.

[0354] Probióticos - As composições podem compreender probióticos, tais como os descritos em WO09/043709.

[0355] Impulsionadores de espuma - Se for desejada formação elevada de espuma, impulsionadores de espuma, tais como as alcanolamidas C10-C16 ou os sulfatos de alquila C10-C14 podem ser incorporados nas composições, tipicamente a níveis de 1 a 10 % em peso. As amidas monoetanol e dietanol C10-C14 ilustram uma classe típica de tais impulsionadores de espuma. O uso de tais impulsionadores de espuma com tensoativos adjuntos de formação elevada de espuma, como os óxidos de amina, betaínas e sultaínas, indicado acima, também é vantajosa. Se desejado, os sais de magnésio e/ou cálcio solúveis em água, tais como MgCl2, MgSO4, CaCl2, CaSO4 e semelhantes, podem ser adicionados em níveis de, tipicamente, 0,1 a 2 % em peso, para proporcionar espuma adicional e para fornecer desempenho adicional na remoção de gordura.

[0356] Supressores de espuma - Compostos para reduzir ou suprimir a formação de espuma podem ser incorporados nas composições da presente invenção. Supressão de espuma podem ser de particular importância no chamado "processo de limpeza de alta concentração", como descrito em US4489455 e US4489574, e em máquina de lavagem de roupa de carga frontal. Uma ampla variedade de materiais pode ser usada como supressores de espuma, e os supressores de espuma são bem conhecidos daqueles peritos na técnica. Ver por ex., Kirk Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, Terceira Edição, Volume 7, p.430-447 (John Wiley & Sons, Inc., 1979). Exemplos supressores de espuma incluem ácido graxo monocarboxílico e seus sais solúveis, hidrocarbonetos de elevado peso molecular tal como a parafina, ésteres de ácidos graxos (por exemplo, triglicéridos de ácidos graxos), ésteres de ácidos graxos de álcoois monovalentes, alifáticos cetonas C18-C40 (por exemplo, estearona), triazinas amino N-alquilados, hidrocarbonetos cerosos de preferência tendo um ponto de fusão inferior a cerca de 100 °C, supressores de espuma de silicone, e alcoóis secundários. Supressores de espuma estão descritos em US2954347; US4265779; US4265779; US3455839; US3933672; US4652392; US4978471; US4983316; US5288431; US4639489; US4749740; US4798679; US4075118; EP89307851.9; EP150872; e DOS 2,124,526.

[0357] Para quaisquer composições de detergentes a serem usadas em máquinas de lavar roupa automáticas, não deve formar espuma na medida em que eles transbordam na máquina de lavar roupa. Supressores de espuma, quando utilizados, estão preferencialmente presentes numa "quantidade supressora de espuma. Por "quantidade supressora de espuma" pretende significar que o formulador da composição pode selecionar uma quantidade deste agente controlador de espuma que controle suficientemente a água de sabão para resultar num detergente de lavandaria de baixa formação de espuma para utilização em máquinas de lavar roupa automáticas.

[0358] As composições desta invenção compreenderão geralmente entre 0 a 10 % em peso de supressor de espuma. Quando utilizados como supressores de espuma, os ácidos graxos monocarboxílicos e os seus sais, no seu interior, estarão presentes tipicamente em quantidades de até 5 % em peso. De um modo preferido, de 0,5 a 3% em peso de monocarboxilato graxo supressor de espuma é utilizado. Supressores de espuma de silicone são tipicamente usados em quantidades até 2,0% em peso, embora possam ser usadas quantidades mais elevadas. Monoestearilo fosfato supressores de espuma são geralmente utilizados em quantidades que variam de 0,1 a 2% em peso. Supressores de espuma de hidrocarbonetos são tipicamente usados em quantidades que variam de 0,01 a 5,0 % em peso, embora níveis mais altos possam ser usados. Os supressores de espuma de álcool são tipicamente usados em 0,2 a 3 % em peso.

[0359] As composições desta invenção podem ter uma atividade de limpeza ao longo de um largo intervalo de pH. Em certas concretizações as composições de limpeza têm atividade de pH 4 a pH 11,5. Em outras formas de realização, as composições são ativas de pH 6 a pH 11, de pH 7 a pH 11, de pH 8 a pH 11, de pH 9 a pH 11, ou de pH 10 a pH 11,5.

[0360] As composições desta invenção podem possuir atividade de limpeza numa ampla gama de temperaturas, por exemplo, de 10 °C ou inferior a 90 °C. De preferência, a temperatura será inferior a 50 °C ou 40 °C ou até 30 °C. Em certas formas de realização, o intervalo de temperaturas ótimo para as composições é de 10 °C a 20 °C, de 15 °C a 25 °C, de 15 °C a 30 °C, de 20 °C a 30 °C, de 25 °C a 35 °C, de 30 °C a 40 °C, de 35 °C até 45 °C, ou de 40 °C a 50 °C. Forma da composição

[0361] As composições descritas na presente invenção podem encontrar uso na limpeza de superfícies duras, aplicações de lavagem de louça automáticas, bem como aplicações cosméticas tais como dentaduras, dentes, cabelo e pele. As composições da invenção são em particular as composições de limpeza e/ou tratamento de sólido ou líquido. Em um aspecto, a invenção diz respeito a uma composição, em que a forma da composição composição é selecionada do grupo que consiste num líquido normal, compacto ou concentrado; um gel; uma pasta; uma barra de sabão; um pó normal ou compactado; um sólido granulado; um comprimido homogêneo ou com camadas múltiplas com duas ou mais camadas (fases iguais ou diferentes); uma bolsa tendo um ou mais compartimentos; uma forma doseada num único ou em múltiplos compartimentos; ou qualquer sua combinação.

[0362] A forma da composição pode separar os componentes fisicamente um do outro em compartimentos, como por exemplo, bolsas de água ou solúveis em diferentes camadas de comprimidos. Desta forma pode ser evitada interação de armazenamento negativa entre componentes. Diferentes perfis de dissolução de cada um dos compartimentos podem dar origem a dissolução retardada de componentes selecionados na solução de lavagem.

[0363] As bolsas podem ser configuradas como compartimentos simples ou múltiplos. Podem apresentar qualquer forma, formato e material adequados para conter a composição, p.ex., sem permitir a liberação da composição da bolsa antes do contato com a água. A bolsa é feita de filme solúvel em água que encerra um volume interior. O referido volume interior pode ser dividido em compartimentos da bolsa. Filmes preferenciais são materiais poliméricos, preferencialmente polímeros que são formados em um filme ou folha. Polímeros, copolímeros ou seus derivados preferenciais são poliacrilatos selecionados, e copolímeros de acrilato solúveis em água, celulose de metila, celulose de carboxi e metila, dextrina de sódio, celulose de etila, celulose de hidroxietila, celulose de hidropropila e metila, maltodextrina, polimetacrilatos, o mais preferencialmente copolímeros de álcool de polivinila, e celulose de hidroxipropila e metila (HPMC). Preferencialmente, o nível de polímeros no filme, por exemplo PVA, é pelo menos cerca de 60 %. O peso molecular médio preferencial será tipicamente cerca de 20.000 a cerca de 150.000. Os filmes podem ser também de composições combinadas compreendendo combinações de polímeros hidroliticamente degradáveis e solúveis em água tais como polilactídeo e álcool de polivinila (conhecido sob a Referência comercial M8630 como vendido pela MonoSol LLC, Indiana, EUA) mais plastificantes como glicerol, etileno glicerol, propileno glicol, sorbitol e suas misturas. As bolsas podem compreender uma composição sólida de limpeza de roupa ou componentes parciais e/ou uma composição líquida de limpeza ou componentes parciais separados pelo filme solúvel em água. O compartimento para componentes líquidos pode ser diferente na composição do que os compartimentos contendo sólidos (US2009/0011970 A1).

[0364] Filme solúvel em água - As composições da presente invenção pode também ser encapsulada dentro de uma película solúvel em água. Materiais de película preferidos são materiais poliméricos de preferência. O material de película pode, por exemplo ser obtidos por vazamento, moldagem por sopro, extrusão ou extrusão do material fundido polimérico, tal como é conhecido na técnica. Os polímeros preferidos, copolímeros ou seus derivados adequados para utilização como material de embalagem são selecionados a partir de alcoóis de polivinilo, polivinilpirrolidona, óxidos de polialquileno, acrilamida, ácido acrílico, celulose, éteres de celulose, ésteres de celulose, amidas de celulose, acetatos de polivinilo, os ácidos policarboxílicos e os seus sais, poliaminoácidos ou péptidos, poliamidas, poliacrilamida, co-polímeros de ácidos acrílicos/maleico, polissacáridos incluindo amido e gelatina, gomas naturais, tais como xantana e carragum. Os polímeros mais preferidos são selecionados a partir de poliacrilatos e copolímeros de acrilato solúveis em água, metilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, dextrina, etilcelulose, hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, maltodextrina, polimetacrilatos e, com maior preferência seleccionado a partir de alcoóis de polivinilo, copolímeros de álcool polivinílico e hidroxipropil metil celulose (HPMC ), e suas combinações. De preferência, o nível de polímero no material da bolsa, por exemplo, um polímero de PVA, é pelo menos 60% em peso. O polímero pode ter qualquer peso molecular médio em peso, preferencialmente desde cerca de 1.000 a 1.000.000, de cerca de 10.000 a 300.000, de cerca de 20.000 a 150.000. As misturas de polímeros também pode ser utilizada como material de bolsa.

[0365] Naturalmente, o material de filme diferente e/ou filmes de diferentes espessuras podem ser empregues na produção dos compartimentos da presente invenção. Um benefício na seleção de diferentes filmes é que os compartimentos resultantes podem apresentar diferentes características de solubilidade ou de libertação.

[0366] Materiais de película preferidos são filmes de PVA conhecido sob a referência comercial Monosol M8630, M8900, H8779 e aqueles descritos em US6166117 e US6787512 e filmes de PVA características de solubilidade e deformabilidade correspondentes.

[0367] O material de película pode também aqui compreender um ou mais ingredientes aditivos. Por exemplo, pode ser benéfico adicionar plastificantes, por exemplo, glicerol, etilenoglicol, dietilenoglicol, propilenoglicol, sorbitol e suas misturas. Outros aditivos incluem aditivos funcionais dos detergentes a ser entregues à água de lavagem, por exemplo, dispersantes poliméricos orgânicos, etc. Processos de fabrico das composições

[0368] As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer forma adequada e preparado por qualquer processo escolhido pelo formulador, exemplos não limitantes dos quais estão descritos nos exemplos dos Requerentes e em US4990280; US20030087791A1; US20030087790A1; US20050003983A1; US20040048764A1; US4762636; US6291412; US20050227891A1; EP1070115A2; US5879584; US5691297; US5574005; US5569645; US5565422; US5516448; US5489392; US5486303 todos os quais são aqui incorporados por referência. As composições do invento ou preparadas de acordo com o invento compreendem uma limpeza e/ u a composição de tratamento, incluindo, mas não se limitando a, composições para tratamento de tecidos, superfícies duras e quaisquer outras superfícies na área de tecido e cuidados em casa, incluindo: cuidados de ar incluindo purificadores de ar e sistemas de distribuição de perfume, cuidado de carro, lavar louça, tecido condicionado (incluindo amolecimento e/ou refrescar), lavanderia detergência, lavanderia e lavar aditivo e/ou de cuidados, limpeza de superfícies duras e/ou tratamento, incluindo piso e vaso sanitário limpeza, granular ou em forma de pó para todos os fins ou "heavy-duty" agentes de lavagem, especialmente detergentes de limpeza; líquido, gel ou pastaforma agentes de lavagem para todos os fins, especialmente os chamados tipos de líquidos pesados; detergentes líquidos fino tecido; agentes de lavagem manual de louça ou agentes dever de lavar louça luz, especialmente aqueles do tipo de alta formação de espuma; agentes de lavar louça máquina, incluindo os vários comprimido, granular, líquido e abrilhantador tipos para uso doméstico e institucional: carro ou tapete xampus, limpadores de banheiro, incluindo limpadores de vasos sanitários; bem como auxiliares de limpeza, tais como aditivos de branqueamento e "adesão de nódoas" ou tipos de pré-tratamento, composições de substratos-laden, tais como secador de folhas acrescentado. São preferidas as composições e métodos para a limpeza e/ou tratamento de têxteis e/ou superfícies duras, mais preferencialmente têxteis. As composições são de preferência composições utilizadas num passo de pré-tratamento ou a principal etapa de lavagem de um processo de lavagem, com maior preferência para utilização no passo de lavagem têxtil.

[0369] Tal como usado na presente invenção, o termo "limpeza de tecido e/ou superfícies duras e/ou composição de tratamento" é um subconjunto de composições de limpeza e de tratamento, que inclui, a não ser que indicado de outro modo, agentes de lavagem universais ou reforçados em forma granular ou pó, especialmente detergentes de limpeza; agentes de lavagem universais em forma líquida, gel ou pasta, especialmente os assim chamados tipos líquidos reforçados; detergentes líquidos de tecidos finos; agentes de lavagem de louça ou agentes de lavagem de louça de pequena potência manuais, especialmente aqueles do tipo de elevada formação de espuma; agentes de lavagem de louça à máquina, incluindo os vários tipos de comprimidos, granulares, líquidos e auxiliares do enxaguamento para uso doméstico ou institucional; agentes de limpeza e desinfeção líquidos, xampus para carros ou tapetes, produtos de limpeza de banheiros, incluindo produtos de limpeza de vasos sanitários; as composições de condicionamento de tecidos, incluindo amaciadores e/ou purificadores, que podem estar na forma líquida, sólida e/ou folha de secador; bem como os auxiliares de limpeza, tais como aditivos de branqueamento e tipos "adesão de nódoas" ou de pré-tratamento, ou pré- tratar tipos, composições de substratos-laden, tais como secador de folhas acrescentado. Todas essas composições que são aplicáveis podem estar em uma forma padrão, concentrada ou mesmo altamente concentradas mesmo na medida em que estas composições podem, em certos aspectos, ser não-aquosas.

Métodos de Uso

[0370] A presente invenção inclui um método para a limpeza de qualquer superfície, incluindo o tratamento de um têxtil ou uma superfície dura ou outras superfícies, no campo de cuidados de tecido e/ou da casa. É contemplado que a limpeza, como descrita, pode ser tanto em pequena escala, como por exemplo numa casa de família, mas que assegura bem a grande escala, como por exemplo em ambientes industriais e profissionais. Num aspecto da invenção, o método compreende o passo de fazer contatar a superfície a ser tratada numa passo de pré-tratamento ou o principal passo de lavagem de um processo de lavagem, com maior preferência para utilização num passo de lavagem têxtil ou, alternativamente, para uso em lavagem de louça, incluindo tanto manual, bem como automatizada/lavagem mecânica da louça. Numa forma de realização da invenção, a variante de lipase e outros componentes são adicionados sequencialmente no método para a limpeza e/ou o tratamento da superfície. Alternativamente, a variante de lipase e outros componentes são adicionados em simultâneo.

[0371] Tal como usada na presente invenção, a lavagem inclui, mas não está limitado a, esfregar, e agitação mecânica. A lavagem pode ser realizada com uma composição de espuma, tal como descrito em WO08/101958 e/ou pela aplicação de pressão alternada (pressão/vácuo) adicionalmente ou como uma alternativa a esfregar e à agitação mecânica. A secagem de tais superfícies ou tecidos pode ser realizada por qualquer um dos meios comuns empregues, quer em ambientes domésticos ou industriais. As composições de limpeza da presente invenção são idealmente adequados para uso na lavagem de roupa, bem como aplicações de lavagem de louça. Em conformidade, a presente invenção inclui um método para a limpeza de um objecto incluindo, mas não se limitando a, tecido, pratos, utensílios de cozinha e talheres. O método compreende os passos de contactar o objecto a ser limpo com uma referida composição de limpeza compreendendo, pelo menos, uma forma de realização dos Requerentes da composição de limpeza, aditivo de limpeza ou mistura dos mesmos. O tecido pode compreender qualquer tecido capaz de ser lavado em condições normais de consumo ou condições de uso institucional. A solução pode ter um pH de 8 a 10,5. As composições podem ser empregues em concentrações de 500 a 15.000 ppm em solução. As temperaturas da água normalmente variam de 5 °C a 90 °C. A razão de água para tecido é tipicamente de 1:1 a 30:1.

[0372] Num aspecto, a invenção refere-se a um método de utilização do polipéptido com pelo menos 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2 para a produção de uma composição. Num aspecto, a invenção refere-se a utilização da composição para a limpeza de um objecto.

[0373] Num aspecto, a invenção refere-se a um método de produzir a composição, que compreende a adição de um polipéptido com pelo menos com 60% de identidade com a SEQ ID NO: 2, e um tensoativo. Num aspecto, a invenção refere-se a um método para a limpeza de uma superfície, compreendendo o contacto de uma mancha de lípidos presentes na superfície a ser limpa com a composição de limpeza. Num aspecto, a invenção refere-se a um método para a hidrólise de um lípido presente no solo e/ou uma mancha sobre uma superfície, compreendendo o contato do solo e/ou a mancha com a composição de limpeza. Num aspecto, a invenção refere-se à utilização da composição na hidrólise de um éster de ácido carboxílico. Num aspecto, a invenção refere-se à utilização da composição na hidrólise, a síntese ou interesterificação de um éster. Num aspecto, a invenção refere-se a utilização da composição para o fabrico de uma formulação estável. Plantas

[0374] A presente invenção se relaciona também com plantas, por ex., uma planta, parte de planta, ou célula de planta transgênica, compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção de modo a expressarem e produzirem a variante em quantidades recuperáveis. A variante pode ser recuperada da planta ou parte de planta. Alternativamente, a planta ou parte de planta contendo a variante pode ser usada como tal para melhoria da qualidade de um alimento ou ração, p.ex., melhoria do valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

[0375] A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicot) ou monocotiledônea (uma monocot). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, tais como gramíneas dos prados (poácea, Poa), gramíneas forrageiras, tais como Festuca, Lolium, gramíneas temperadas, tais como ^grosf/s, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e maís (milho).

[0376] Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, tais como lupinos, batata, beterraba sacarina, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), tais como couve flor, colza, e o organismo modelo relacionado de perto Arabidopsis thaliana.

[0377] Exemplos de partes de plantas são caule, calo, folhas, raiz, frutos, sementes, e tubérculos, bem como os tecidos individuais compreendendo estas partes, p.ex., epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Compartimentos específicos de células de plantas, tais como cloroplastos, apoplastos, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomos e citoplasma, são também considerados uma parte de planta. Além do mais, qualquer célula de planta, independentemente da origem do tecido, é considerada como sendo uma parte de planta. De igual modo, partes de plantas tais como tecidos e células específicos isolados para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes de plantas, por ex., embriões, endospérmios, aleurona e revestimentos de sementes.

[0378] Também incluída dentro do escopo da presente invenção é a descendência de tais plantas, partes de plantas, e células de plantas.

[0379] A planta ou célula de planta transgênica expressando a variante pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída por incorporação de um ou mais constructos de expressão codificando uma variante no genoma da planta hospedeira ou genoma do cloroplasto e propagação da planta ou célula de planta modificada resultante em uma planta ou célula de planta transgênica.

[0380] O constructo de expressão é convenientemente um constructo de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando uma variante operacionalmente ligada a sequências reguladoras apropriadas requeridas para expressão do polinucleotídeo na planta ou parte de planta de escolha. Além do mais, o constructo de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificação de células de plantas nas quais foi integrada o constructo de expressão e sequências de DNA necessárias para introdução do constructo na planta em questão (estas últimas dependem do método de introdução de DNA a ser usado).

[0381] A escolha de sequências reguladoras, tais como sequências promotoras e terminadoras e opcionalmente sequências sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde, e como é desejado que a variante seja expressa. Por exemplo, a expressão do gene codificando uma variante pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser específica quanto ao desenvolvimento, etapa ou tecido, e o produto de gene pode ser dirigido para um tecido ou parte de planta específico tal como sementes ou folhas. Sequências reguladoras são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.

[0382] Para expressão constitutiva pode ser usado o promotor de 35S- CaMV, ubiquitina 1 do milho, ou actina 1 do arroz (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Promotores específicos quanto a órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de dreno de armazenamento tais como sementes, tubérculos de batata, e frutos (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de dreno metabólico tais como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863-878), um promotor específico quanto a sementes tal como o promotor de glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteína de sementes desconhecida de Vicia faba (Conrad et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 708-711), um promotor de uma proteína do corpo oleaginoso de sementes (Chen et al., 1998, Plant Cell Physiol. 39: 935-941), o promotor da proteína de armazenamento napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico quanto a sementes conhecido na técnica, por ex., como descrito em WO 91/14772. Além do mais, o promotor pode ser um promotor específico quanto a folhas tal como o promotor rbcs do arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiol. 102: 991-1000), o promotor do gene de adenina metiltransferase do gene promotor (Mitra e Higgins, 1994, Plant Mol. Biol. 26: 85-93), o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya et al., 1995, Mol. Gen. Genet. 248: 668-674), ou um promotor induzível por ferida tal como o promotor pin2 da batata (Xu et al., 1993, Plant Mol. Biol. 22: 573-588). De igual modo, o promotor pode ser induzido por tratamentos abióticos, como temperatura, seca, ou alterações da salinidade, ou induzido por substâncias aplicadas de modo exógeno que ativam o promotor, por exemplo, etanol, estrogênios, hormônios de plantas, como etileno, ácido abscísico, e ácido giberélico, e metais pesados.

[0383] Um elemento intensificador de promotores pode ser também usado para alcançar expressão mais elevada de uma variante na planta. Por exemplo, o elemento intensificador de promotores pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e o polinucleotídeo codificando uma variante. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, divulgam o uso do primeiro íntron do gene da actina 1 do arroz para intensificar a expressão.

[0384] O gene de marcador selecionável e quaisquer outras partes do constructo de expressão podem ser escolhidos daqueles disponíveis na técnica.

[0385] O constructo de ácido nucleico é incorporado no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na área, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeamento de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).

[0386] A transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é um método para geração de dicots transgênicos (para uma revisão ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Mol. Biol. 19: 15-38) e para transformação de monocots, embora outros métodos de transformação possam ser usados para estas plantas. Um método para gerar monocotiledôneas transgênicas consiste no bombardeamento com partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA de transformação) de calos embrionários ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant J. 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Curr. Opin. Biotechnol. 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocots é baseado em transformação com protoplastos como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Mol. Biol. 21: 415-428. Métodos adicionais de transformação incluem aqueles descritos em US6395966 e US7151204 (ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade).

[0387] Após transformação, os transformantes tendo incorporado o constructo de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. Frequentemente, o procedimento de transformação é desenhado para a eliminação seletiva de genes de seleção durante a regeneração ou nas gerações seguintes por uso, por exemplo, de cotransformação com dois constructos separados de T-DNA ou excisão sítio-específica do gene de seleção por uma recombinase específica.

[0388] Adicionalmente à transformação direta de um genótipo particular de planta com um constructo da presente invenção podem ser feitas plantas transgênicas por cruzamento de uma planta tendo o constructo com uma segunda planta à qual falta o constructo. Por exemplo, um constructo codificando uma variante pode ser introduzida em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem necessidade de transformação direta de uma planta dessa dada variedade. Portanto, a presente invenção engloba não só uma planta diretamente regenerada a partir de células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a descendência de tais plantas. Como usado aqui, descendência pode se referir à descendência de qualquer geração de uma planta genitora preparada de acordo com a presente invenção. Tal descendência pode incluir um constructo de DNA preparado de acordo com a presente invenção. O cruzamento resulta em introdução de um transgene em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora. Exemplos não limitantes de tais passos são descritos em US7151204.

[0389] Podem ser geradas plantas através de um processo de conversão por retrocruzamento. Por exemplo, plantas incluem plantas referidas como um genótipo, linhagem, planta endogâmica, ou híbrido convertido de modo retrocruzado.

[0390] Podem ser usados marcadores genéticos para auxiliar a ingressão de um ou mais transgenes da invenção de um fundo genético para outro. A seleção auxiliada por marcadores oferece vantagens em relação ao melhoramento convencional na medida em que pode ser usada para evitar erros causados por variações fenotípicas. Adicionalmente, marcadores genéticos podem proporcionar dados dizendo respeito ao grau relativo de plasma germinativo de elite na descendência individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outro modo tem um fundo genético agronomicamente não desejável é cruzada com uma genitora de elite, podem ser usados marcadores genéticos para selecionar descendência que não só possui o traço de interesse, como tem também uma proporção relativamente grande do plasma germinativo desejado. Deste modo, o número de gerações requerido para ingressar um ou mais traços em um fundo genético particular é minimizado.

[0391] A presente invenção se relaciona também com métodos de produção de uma variante da presente invenção compreendendo: (a) cultivo de uma planta ou célula de planta transgênica compreendendo um polinucleotídeo codificando a variante sob condições conducentes à produção da variante; e (b) recuperação da variante.

[0392] A presente invenção é adicionalmente descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser considerados como limitantes do escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Ensaio de estabilidade de armazenamento em tempo real Protocolo A: Detergente

[0393] Após titulação ativa local, as variantes de lipase purificadas foram diluídas com um tampão (10 mM de ácido succínico + 2 mM CaCl2 + 0,02 % de Brij 35 ajustado a pH 6,5) até à concentração especificada. Da solução de lipase a 100 ppm, foram adicionados 10 μL a 90 μL de composição detergente, agitou-se durante 5 minutos e selada. As amostras foram armazenadas a 4°C em detergente D002 (não estressado) e em detergente D001 ou D002 a 47 °C (estresse). O tempo de armazenamento foi de 335,5 horas.

[0394] Após armazenamento, o líquido de condensação, se existente, foi recolhido por centrifugação. À amostra de 100 μL de estressado ou não estressado, 235 μL de tampão (Tris-HCl a 0,1 M; CaCl2 a 9 mM; Brij-30 a 0,0225 %, pH 8,0 + 4-FBPA a 0,85 % (31,5 g/L)) foram adicionados correspondendo a uma diluição de 3,35 vezes. Após 10 minutos de agitação, alíquotas de 5 μL de amostra foram diluídas adicionalmente 60 vezes com o mesmo tampão. Em seguida, uma parte desta diluição de lipase foi misturada com quatro partes de pNP-palmitato a 0,5 mM, cloreto de cálcio a 1 mM, Tris a 100 mM (pH 8,0), Desoxicolato a 6,5 mM, 1,4 g/L de AOS e durante 30 minutos a libertação do cromóforo pNP foi medida espectrofotometricamente. Este foi utilizado para determinar a atividade através do declive linear inicial da reação.

[0395] A atividade residual foi calculada como a razão entre as velocidades medidas da amostra estresse comparada com a amostra não estresse. O valor médio da atividade residual foi calculado com base em quatro repetições e normalizada com um ensaio de referência com a variante de lipase com cada conjunto experimental.

[0396] Meia-vida (T1/2) foi calculada baseada na fórmula seguinte: Meia-vida = Tempo de estresse * ln(0,5)/ln(atividade residual)

[0397] O fator resultante de melhoria dos tempos de meia-vida (HIF) de uma mutação específica foi calculado dividindo a meia-vida da variante de lipase com a meia-vida da lipase genitora.

[0398] A meia-vida de Lipex foi determinada com um tempo de incubação de 23,25 h nas mesmas condições. A atividade residual foi de 6 % em D0001 e 20% em D0002 resultando em meias-vidas de 6 e 10 horas, respectivamente. Protocolo B: Detergente com protease

[0399] Após titulação ativa local, as variantes de lipase purificadas foram diluídas com um tampão (10 mM de ácido succínico + 2 mM CaCl2 + 0,02 % de Brij 35 ajustado a pH 6,5) até à concentração especificada. Da solução de lipase a 100 ppm, foram adicionados 10 μL a 70 μL de composição detergente, agitou-se durante 5 minutos e selada. As amostras foram armazenadas a 4°C em detergente D001 sem protease (não estressado) e em detergente D001 e 1,35% Savinase 16L a 30 °C (estresse). O tempo de armazenamento foi de 160 horas.

[0400] Após armazenamento, o líquido de condensação, se existente, foi recolhido por centrifugação. Para a amostra de 100 μL de estressado ou não estressado, 230 μL de tampão (Tris-HCl a 0,1 M; CaCl2 a 9 mM; Brij-30 a 0,0225 %, pH 8,0 + 4-FBPA a 0,85 % (31,5 g/L)) foram adicionados correspondendo a uma diluição de 3,3 vezes. Após 5 minutos de agitação, alíquotas de 5 μL de amostra foram diluídas adicionalmente 60 vezes com o mesmo tampão. Em seguida, uma parte desta diluição de lipase foi misturada com quatro partes de pNP-palmitato a 0,5 mM, cloreto de cálcio a 1 mM, Tris a 100 mM (pH 8,0), Desoxicolato a 6,5 mM, 1,4 g/L de AOS e durante 30 minutos a libertação do cromóforo pNP foi medida espectrofotometricamente. Este foi utilizado para determinar a atividade através do declive linear inicial da reação.

[0401] A atividade residual foi calculada como a razão entre as velocidades medidas da amostra estresse comparada com a amostra não estresse. O valor médio da atividade residual foi calculado com base em quatro repetições e normalizada com um ensaio de referência com a variante de lipase com cada conjunto experimental.

[0402] Meia-vida (T1/2) foi calculada baseada na fórmula seguinte:: Meia-vida = Tempo de estresse * ln(0,5)/ln(atividade residual)

[0403] O fator resultante de melhoria dos tempos de meia-vida (HIF) de uma mutação específica foi calculado dividindo a meia-vida da variante de lipase com a meia-vida da lipase genitora.

[0404] A meia-vida de Lipex foi determinada com um tempo de incubação de 23,25 h nas mesmas codições. A atividade residual foi de 15 % em Savinage resultando uma meia-vida de 8,5 horas. Protocolo C: Detergente com protease

[0405] O protocolo foi conduzido essencialmente como descrito no protocolo B, excepto que a incubação em estresse foi a 25 °C por 164 horas. Lipex tinha nestas condições uma atividade residual de 4% e uma meia-vida de 35 horas. Protocolo D: Detergente

[0406] Após titulação ativa local, as variantes de lipase purificadas foram diluídas com um tampão (10 mM de ácido succínico + 2 mM CaCl2 + 0,02 % de Brij 35 ajustado a pH 6,5) até à concentração especificada. Da solução de lipase a 100 ppm, foram adicionados 10 μL a 90 μL de composição detergente, agitou-se durante 5 minutos e selada. As amostras foram armazenadas a 4°C em detergente D002 (não estressado) e em detergente D001 ou D002 a 47 °C (estresse). O tempo de armazenamento foi de 13,33 horas.

[0407] Após armazenamento, o líquido de condensação, se existente, foi recolhido por centrifugação. À amostra de 100 μL de estressado ou não estressado, 235 μL de tampão (Tris-HCl a 0,1 M; CaCl2 a 9 mM; Brij-30 a 0,0225 %, pH 8,0 + 4-FBPA a 0,85 % (31,5 g/L)) foram adicionados correspondendo a uma diluição de 3,35 vezes. Após 10 minutos de agitação, alíquotas de 5 μL de amostra foram diluídas adicionalmente 60 vezes com o mesmo tampão. Em seguida, uma parte desta diluição de lipase foi misturada com quatro partes de pNP-palmitato a 0,5 mM, cloreto de cálcio a 1 mM, Tris a 100 mM (pH 8,0), Desoxicolato a 6,5 mM, 1,4 g/L de AOS e durante 30 minutos a libertação do cromóforo pNP foi medida espectrofotometricamente. Este foi utilizado para determinar a atividade através do declive linear inicial da reação.

[0408] A atividade residual foi calculada como a razão entre as velocidades medidas da amostra estresse comparada com a amostra não estresse. O valor médio da atividade residual foi calculado com base em quatro repetições e normalizada com um ensaio de referência com a variante de lipase com cada conjunto experimental.

[0409] Meia-vida (T1/2) foi calculada baseada na fórmula seguinte: Meia-vida = Tempo de estresse * ln(0,5)/ln(atividade residual)

[0410] O fator resultante de melhoria dos tempos de meia-vida (HIF) de uma mutação específica foi calculado dividindo a meia-vida da variante de lipase com a meia-vida da lipase genitora. Protocolo E: Detergente com protease

[0411] Após titulação ativa local, as variantes de lipase purificadas foram diluídas com um tampão (10 mM de ácido succínico + 2 mM CaCl2 + 0,02 % de Brij 35 ajustado a pH 6,5) até à concentração especificada. Da solução de lipase a 100 ppm, foram adicionados 10 μL a 90 μL de composição detergente, agitou-se durante 5 minutos e selada. As amostras foram armazenadas a 4 °C em detergente D001 sem protease (não estressado) e em detergente D001 e 1,35% Savinase 16L a 30 °C (estresse). O tempo de armazenamento foi de 13,33 horas.

[0412] Após armazenamento, o líquido de condensação, se existente, foi recolhido por centrifugação. À amostra de 100 μL de estressado ou não estressado, 235 μL de tampão (Tris-HCl a 0,1 M; CaCl2 a 9 mM; Brij-30 a 0,0225 %, pH 8,0 + 4-FBPA a 0,85 % (31,5 g/L)) foram adicionados correspondendo a uma diluição de 3,35 vezes. Após 5 minutos de agitação, alíquotas de 5 μL de amostra foram diluídas adicionalmente 60 vezes com o mesmo tampão. Em seguida, uma parte desta diluição de lipase foi misturada com quatro partes de pNP-palmitato a 0,5 mM, cloreto de cálcio a 1 mM, Tris a 100 mM (pH 8,0), Desoxicolato a 6,5 mM, 1,4 g/L de AOS e durante 30 minutos a libertação do cromóforo pNP foi medida espectrofotometricamente. Este foi utilizado para determinar a atividade através do declive linear inicial da reação.

[0413] A atividade residual foi calculada como a razão entre as velocidades medidas da amostra estresse comparada com a amostra não estresse. O valor médio da atividade residual foi calculado com base em quatro repetições e normalizada com um ensaio de referência com a variante de lipase com cada conjunto experimental.

[0414] Meia-vida (T1/2) foi calculada baseada na fórmula seguinte: Meia-vida = Tempo de estresse * ln(0,5)/ln(atividade residual)

[0415] O fator resultante de melhoria dos tempos de meia-vida (HIF) de uma mutação específica foi calculado dividindo a meia-vida da variante de lipase com a meia-vida da lipase genitora. Protocolo F: caldo de cultura com a variante de enzima produzida incubado em detergente com protease

[0416] Estirpes de Aspergillus oryzae que produzem a lipase variante foram cultivadas durante 5 dias a 37 °C em meio 2xSC com 2% de maltose, sem agitação. O meio 2xSC é 15 g de base de nitrogênio para levedura sem aminoácidos (Disco 291920), 22,6 g de ácido succínico (Merck 822260), 13,6 g de hidróxido de sódio (Merck 106498), 11,2 g de casaminoácidos (ensaio vitamina, Difco 228830) e 0, 2 g de L-triptofano (Merck 108374) dissolvido em 1 L de água desionizada.

[0417] A 10 μL de caldo de cultura foram adicionados 90 μL de composição detergente, agitou-se durante 5 minutos e selada. As amostras foram armazenadas a -20 °C em detergente D001 (não estressado) e em detergente D001 a 47 °C (estresse). O tempo de armazenamento é indicado nas tabelas de dados.

[0418] Após armazenamento, líquido de condensação, se existente, foi recolhido por centrifugação. Para a amostra de 100 μL de estressado ou não estressado, 230 μL de tampão (Tris-HCl a 0,1 M; CaCl2 a 9 mM; Brij-30 a 0,0225 %, pH 8,0 + 4-FBPA a 0,85 % (31,5 g/L)) foram adicionados correspondendo a uma diluição de 3,3 vezes. Após 10 minutos de agitação, alíquotas de 5 μL de amostra foram diluídas adicionalmente 60 vezes com o mesmo tampão. Em seguida, uma parte desta diluição de lipase foi misturada com quatro partes de pNP-palmitato a 0,5 mM, cloreto de cálcio a 1 mM, Tris a 100 mM (pH 8,0), Desoxicolato a 6,5 mM, 1,4 g/L de AOS e durante 30 minutos a libertação do cromóforo pNP foi medida espectrofotometricamente. Este foi utilizado para determinar a atividade através do declive linear inicial da reação.

[0419] A atividade residual foi calculada como a razão entre as velocidades medidas da amostra estresse comparada com a amostra não estresse. Meia-vida (T1/2) foi calculada baseada na fórmula seguinte: Meia-vida = Tempo de estresse * ln(0,5)/ln(atividade residual)

[0420] O valor médio da atividade residual e as meias vidas foi calculado com base em quatro repetições.

[0421] O fator resultante de melhoria dos tempos de meia-vida (HIF) de uma mutação específica foi calculado dividindo a meia-vida da variante de lipase com a meia-vida da lipase genitora. Protocolo G: caldo de cultura com a variante de enzima produzida incubado em detergente com protease

[0422] A 10 μL de caldo de cultura do protocolo F, foram adicionados 90 μL de composição detergente, agitou-se durante 5 minutos e selada. As amostras foram armazenadas a -20°C em detergente D001 sem protease (não estressado) e em detergente D001 e 1,35% Savinase 16L a 30 °C (estresse). O tempo de armazenamento é indicado nas tabelas de dados.

[0423] Após armazenamento, o líquido de condensação, se existente, foi recolhido por centrifugação. Para a amostra de 100 μL de estressado ou não estressado, 230 μL de tampão (Tris-HCl a 0,1 M, CaCl2 a 9 mM, Brij-30 a 0,0225 %, pH 8,0 + 4-FBPA a 0,85 % (31,5 g/L)) foram adicionados correspondendo a uma diluição de 3,3 vezes. Após 10 minutos de agitação, alíquotas de 5 μL de amostra foram diluídas adicionalmente 60 vezes com o mesmo tampão. Em seguida, uma parte desta diluição de lipase foi misturada com quatro partes de pNP-palmitato a 0,5 mM, cloreto de cálcio a 1 mM, Tris a 100 mM (pH 8,0), Desoxicolato a 6,5 mM, 1,4 g/L de AOS e durante 30 minutos a libertação do cromóforo pNP foi medida espectrofotometricamente. Este foi utilizado para determinar a atividade através do declive linear inicial da reação.

[0424] A atividade residual foi calculada como a razão entre as velocidades medidas da amostra estresse comparada com a amostra não estresse. Meia-vida (T1/2) foi calculada baseada na fórmula seguinte: Meia-vida = Tempo de estresse * ln(0,5)/ln(atividade residual)

[0425] O valor médio da atividade residual e as meias-vidas foi calculado com base em quatro repetições.

[0426] O fator resultante de melhoria dos tempos de meia-vida (HIF) de uma mutação específica foi calculado dividindo a meia-vida da variante de lipase com a meia-vida da lipase genitora. TABELA 1A: Composição de D001

TABELA 1B: Composição de D002

Exemplo 2: O efeito estabilizante de D27R

[0427] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de D27R são mostrados. TABELA 2A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 2B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 2D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

TABELA 2E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

TABELA 2F-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 63 h.

TABELA 2F$2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 331 h.

TABELA 2G: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 63 h.

* determinado a partir de um replicado

Exemplo 3: O efeito estabilizante de N33Q

[0428] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de N33Q são mostrados. TABELA: 3A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 3B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 3C: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo C.

TABELA 3E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

Exemplo 4: O efeito estabilizante de G38A

[0429] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de G38A são mostrados. TABELA 4A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 4B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 4D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

TABELA 4E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

Exemplo 5: O efeito estabilizante de G91T

[0430] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de G91T são mostrados. TABELA 5A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

[0431] TABELA 5D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

[0432] Além disso, o efeito de estabilização das substituições G91I, G91N, e G91V determinadas como HIF> 1, foi observado em experiências com detergente realizadas essencialmente de acordo com o protocolo A, bem como em experiências com detergente com protease realizado essencialmente de acordo com o protocolo B. TABELA 5F-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 63 h.

TABELA 5F-2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 331 h.

TABELA 5G-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 18 h.

TABELA 5G-2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 63 h.

Exemplo 6: O efeito estabilizante de D96E

[0433] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de D96E são mostrados. TABELA 6B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 6C: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo C.

TABELA 6D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

TABELA 6E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

TABELA 6F-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 63 h.

TABELA 6F-2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 331 h.

TABELA 6G-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 18 h.

TABELA 6G-2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 63 h.

Exemplo 7: O efeito estabilizante de D111A

[0434] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de D111A são mostrados. TABELA 7A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 7B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 7C: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo C.

TABELA 7E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

TABELA 7F-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 63 h.

TABELA 7F-2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 331 h.

* determinado a partir de dois replicados TABELA 7G-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 18 h.

TABELA 7G-2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 63 h.

* determinado a partir de dois replicados Exemplo 8: O efeito estabilizante de G163K TABELA 8A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 8B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 8D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

TABELA 8E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

Exemplo 9: O efeito estabilizante de D254S

[0435] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de D254S são mostrados. TABELA 9A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 9B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 9D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

TABELA 9E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

TABELA 9F: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 63 h.

* tempo de armazenamento de 331 horas TABELA 9G-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 18 h.

TABELA 9G-2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 63 h.

Exemplo 10: O efeito estabilizante de P256T

[0436] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de P256T são mostrados. TABELA 10A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 10B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 10D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

TABELA 10E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

TABELA 10F: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento de 63 h.

TABELA 10G-1: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 18 h.

TABELA 10G-2: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento de 63 h.

Exemplo 11: O efeito estabilizante de D254S eP256T

[0437] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para o efeito de D254S e P256T são mostrados. TABELA 11A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 11D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

TABELA 11F: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento indicado.

Exemplo 12: Estabilidade melhorada quando comparação com T231R N233R

[0438] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante lipase e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia-vida (HIF) relativamente à variante de lipase com as mutações T231R N233R são mostrados. TABELA 12A: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo A.

TABELA 12B: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo B.

TABELA 12D: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo D.

TABELA 12E: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo E.

TABELA 12F: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento indicado.

TABELA 12G: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo F com o tempo de armazenamento indicado. A meia-vida da variante de lipase com as mutações T231R N233R determinada com o tempo de armazenamento de 63 h foi escolhido. DOO DOO Temp

* determinado a partir de um replicado, ** determinado a partir de dois replicados

Exemplo 13: O efeito estabilizante de D96E e D111A

[0439] Os tempos de meia-vida em horas (T1/2) da variante e a sua lipase de referência e o fator resultante de melhoria dos tempos de meia- vida (HIF) para efeito de D96E e D111A são mostrados. TABELA 13G: A estabilidade de armazenamento foi determinada de acordo com o protocolo G com o tempo de armazenamento indicado.

[0440] A invenção aqui descrita e reivindicada não deve ser limitada no seu escopo pelos aspectos específicos aqui divulgados, uma vez que esses aspectos destinam-se a ilustrar vários aspectos da invenção. É pretendido que quaisquer aspectos equivalentes estejam dentro do escopo da presente invenção. De fato, várias modificações da invenção adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tornarão evidentes àqueles peritos na técnica a partir da descrição acima mencionada. Tais modificações se destinam também a estar dentro do escopo das reivindicações anexas. Em caso de conflito, a presente divulgação, incluindo definições, imperará.

[0441] A invenção é adicionalmente definida pelos seguintes parágrafos:

Claims

1. Composição detergente caracterizada por compreender uma variante de uma lipase genitora em que a variante tem atividade de lipase, tem 1-40 substituições quando comparada com a SEQ ID N°: 2, e compreende substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e pelo menos uma ou mais de D96E e G38A da SEQ ID N°: 2, em que a referida variante tem maior estabilidade em comparação com a lipase genitora.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender adicionalmente substituições nas posições correspondentes a D27R e/ou N33Q da SEQ ID N°: 2.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por a variante de lipase compreender substituições selecionadas do grupo de: a. D96E T231R N233R; b. N33Q D96E T231R N233R; c. N33Q G38A G91T G163K T231R N233R D254S; d. N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; e. D27R N33Q G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; f. D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R P256T; g. D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S; h. D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; i. D96E T231R N233R D254S; j. D27R N33Q G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T; k. D27R G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; l. D96E G163K T231R N233R D254S; m. D27R G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S; n. D27R G38A G91T D96E G163K T231R N233R D254S P256T; o. D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; p. D27R D96E G163K T231R N233R D254S; q. D27R D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; r. D27R G38A D96E G163K T231R N233R D254S P256T s. D27R D96E D111A G163K T231R N233R; t. D27R D96E D111A T231R N233R; u. D27R G38A D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; v. D27R N33Q G38A D96E D111A T231R N233R D254S P256T; w. D27R G38A D96E D111A G163K E210Q T231R N233R D254S P256T; x. D96E D111A G163K T231R N233R; y. D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; z. D96E D111A G163K T231R N233R P256T; aa. D96E D111A T231R N233R; bb. D96E D111A T231R N233R D254S; cc. D96E D111A T231R N233R D254S P256T dd. D96E D111A T231R N233R P256T; ee. D96E G163K T231R N233R D254S P256T; ff. D96E T231R N233R D254S P256T; gg. D96E T231R N233R P256T; hh. G38A D96E D111A T231R N233R; ii. G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; jj. G91T D96E D111A T231R N233R; kk. G91T D96E T231R N233R; ll. N33Q D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T; mm. D27R N33Q G38A G91T D96E D111A G163K T231R N233R D254S P256T.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizada por compreender adicionalmente uma ou mais enzimas selecionadas a partir de: hemicelulases, peroxidases, proteases, celulases, xilanases, lipases, fosfolipases, esterases, cutinases, pectinases, mananases, pectato liases, queratinases, redutases, oxidases, fenoloxidases, lipoxigenases, ligninases, pululanases, tanases, pentosanases, malanases, β-glucanases, arabinosidases, hialuronidase, condroitinase, lacase, clorofilases, amilases, ou suas misturas.

5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizada por a variante ser selecionada do grupo consistindo de: a) um polipeptídeo tendo pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, ou pelo menos 99 %, mas menos de 100 %, de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 2; b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibrida sob condições de baixa estringência, condições de média estringência, condições de média-elevada estringência, condições de elevada estringência, ou condições de muito elevada estringência com (i) a sequência codificante do polipeptídeo da SEQ ID N°: 1 ou (ii) o complemento de comprimento total de (i); c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo tendo pelo menos 60 %, pelo menos 65 %, pelo menos 70 %, pelo menos 75 %, pelo menos 80 %, pelo menos 85 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, pelo menos 96 %, pelo menos 97 %, pelo menos 98 %, pelo menos 99 %, mas menos de 100%, de identidade de sequência com a SEQ ID N°: 1; e d) um fragmento do polipeptídeo de SEQ ID N°: 2.

6. Composição de acordo com com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizada por compreender adicionalmente pelo menos um tensoativo, pelo menos um sistema tensoativo, pelo menos um sabão, ou quaisquer suas misturas.

7. Composição, de acordo com com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizada por a composição ser uma composição de limpeza de roupa, uma composição de limpeza para lavagem de louça, uma composição de limpeza de superfícies duras e/ou uma composição de limpeza para higiene pessoal.

8. Composição, de acordo com com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada por a composição ser formulada como um líquido normal, compacto ou concentrado; um gel; uma pasta; uma barra de sabão; um pó normal ou compactado; um sólido granulado; um comprimido homogêneo ou com camadas múltiplas com duas ou mais camadas (fases iguais ou diferentes); uma bolsa tendo um ou mais compartimentos; uma forma doseada num único ou em múltiplos compartimentos; ou qualquer combinação dos mesmos.

9. Método de produzir a composição conforme definida qualquer uma das reivindicações 1-8 caracterizado por compreender a adição de uma variante de uma lipase genitora em que a variante tem atividade de lipase, tem 1-40 substituições quando comparada com a SEQ ID N°: 2, e compreende substituições nas posições correspondentes a T231R+N233R e pelo menos uma ou mais de D96E e G38A da SEQ ID N°: 2.

10. Método para a limpeza de um objeto, caracterizado por compreender o contato de uma mancha de lipídeo presente no objeto a ser limpo com a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-8.

11. Uso da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado por a composição hidrolisar um éster de ácido carboxílico.

12. Uso da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado por hidrolisar, sintetizar ou interesterificar um éster.

13. Uso da composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado por ser para a fabricação de uma formulação estável.