ES2302330T3 - Enzimas mejoradas y detergentes que las contienen. - Google Patents
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A PROTEASAS CON PROPIEDADES DE APLICACION MEJORADAS EN LIMPIADORES Y DETERGENTES. LAS MEJORAS SE CONSIGUEN SUSTITUYENDO AMINOACIDOS POSITIVAMENTE CARGADOS O DESCARGADOS EN LA REGION DE UNION DEL SUSTRATO DE LA PROTEASA DE SUBTILISINA DEL TIPO SALVAJE.
Description
Enzimas mejoradas y detergentes que las
contienen.
Esta invención se relaciona con enzimas
proteolíticas mutantes novedosas con propiedades mejoradas relativas
a la enzima de tipo salvaje en formulaciones de limpieza y
detergente, para las secuencias de nucleótido que codifican las
proteasas mejoradas, y para los organismos huésped que contienen las
secuencias de nucleótido que codifican las proteasas novedosas.
Esta invención también incluye dentro de su objetivo un detergente
nuevo y mejorado y composiciones de limpieza que contienen un
cantidad de limpieza efectiva de dichas enzimas.
Las subtilisinas son una familia de proteasas
extracelulares bacterianas con masas moleculares de 20,000 a 45,000
daltons producidos por un bacilo del lodo por ejemplo Bacillus
amyloliquefaciens. Las proteasas son enzimas que catalizan la
hidrólisis del péptido ligado en sustratos de proteínas y péptidos y
de éster unido en algún éster terminal. Las subtilisinas pertenecen
al grupo de proteasas serina que da comienzo al ataque nucleofílico
sobre el péptido (éster) unido por un residuo de serina en el sitio
activo. Las subtilisinas son enzimas física y químicamente bien
caracterizadas. La estructura tri-dimensional de
varias subtilisinas se ha clarificado con detalle por estudios de
difracción de rayos-X (Betzel, C., Pal, G.P., and
Saenger, W. (1988) Eur. J. Biochem. 178, 155-171;
Bott, R., Ultsch, M., Kossiakoff, A., Graycar, T., Katz, B., and
Power, S. (1988) J. Biol. Chem. 263, 7895-7906;
Goddette, D.W., Paech, C., Yang, S.S., Mielenz, J.R., Bystroff, C.,
Wilke, M., and Fletterick, R.J. (1992) J. Mol. Biol. 228,
580-595; Heinz. D.W., Priestle, J.P., Rahuel, J.,
Wilson, KS., and Grütter. M.G. (1991) J. Mol. Biol. 217,
353-371; Kraut, J. (1977) Annu. Rev. Biochem. 46,
331-358; Neidhart, D.J. and Petsko, G.A. (1988)
Protein Eng. 2, 271-276; Teplyakov, A.V., Kuranova,
I.P., Harutyunyan, E.H., Vainshtein, B.K., Frömmel, C., Höhne,
W.-E., and Wilson, K.S. (1990) J. Mol. Biol. 214,
261-279). A pesar de esta riqueza de información, no
han sido explicadas las diferencias estructura/función entre estas
subtilisinas, estrechamente relacionadas.
Las subtilisinas se utilizan ampliamente en
productos comerciales (por ejemplo, en detergentes de lavandería y
lavado de platos, limpiadores de lentes de contacto) y para
propósitos de investigación (catalizadores en química orgánica
sintética). Un miembro de la familia subtilisina, una proteasa
altamente alcalina para utilizar en formulaciones de detergente ha
sido descrito en la aplicación de la patente WO 91/02792. Esta
proteasa alcalina del Bacillus lentus (BLAP) se puede
obtener en cantidades comerciales de la cepa Bacillus
licheniformis ATCC 53926 transformadas por un plásmido de
expresión que hospeda el gen BLAP de tipo salvaje bajo el control
del gen alcalino B. licheniformis ATCC 53926 del promotor de
la proteasa. La estructura de cristal de BLAP se ha deducido
(Goddette, D.W., et al. (1992) J. Mol. Biol. 228,
580-595; WO 92/21760), y las coordenadas se han
depositado con el Brookhaven Protein Data Bank. A menos que se
indique de otra manera la numeración de las posiciones del
aminoácido es de acuerdo con la secuencia en BLAP (269 aminoácidos),
que difiere de aquella de la subtilisina BPN' (275 aminoácidos).
Cuando se alinea para una homología de la secuencia óptima el
siguiente patrón surge. En las posiciones de BLAP 1 a 35, 36 a 54,
55 a 160, y 161 a 269 corresponden a las posiciones 1 a 35, 37 a
55, 57 a 162, y 167 a 275, respectivamente, en la subtilisina
BPN'.
Con el fin de describir las variantes de la
proteasa de acuerdo con la invención, la siguiente nomenclatura se
utiliza: [Aminoácido Original; La posición del
N-terminal de la enzima madura; Aminoácido
Sustituido]. Por ejemplo, la sustitución de valina con isoleucina
en la posición 4 en BLAP se designa como V41. La lista de
abreviaturas para los aminoácidos se muestra en la Tabla 1.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Las mutaciones múltiples dentro la misma
molécula de la proteína se indican como la suma de mutaciones
individuales, i.e. S3T + V41 + A188P + V193M + V1991.
Protección contra inactivación térmica y química
y la mejora del desempeño de lavado y limpieza son objetivos
primarios en la investigación y desarrollo de las proteasas para
aplicaciones técnicas así como para aplicaciones comerciales. Un
gran número de enzimas incluyendo las subtilisinas han sido
generadas por el mutagénesis azar y de
sitio-específico y proporcionan algunas líneas
directivas para una metodología racional para la mejora de
estabilidad térmica y química (Estell, D.A., Graycar, T.P., and
Wells, J.A. (1985) J. Biol. Chem. 260, 6518-6521;
Matsumura, M., Becktel, W.J., Levitt, M., and Matthews, B.W. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6562-6566;
Pantoliano, M.W., Whitlow, M., Wood, J.F., Rollence, M.L., Finzel,
B.C., Gilliland, G.L., Poulos, T.L., and Bryan, P.N. (1988)
Biochemistry 27, 8311-8317; Russell, A.J. and
Fersht, A.R. (1987) Nature 328, 496-500; Siezen,
R.J., De Vos, W.M., Leunissen, J.A.M., and Dijkstra, B.W. (1991)
Protein Eng. 4, 719-737; van Ee, J.H. (1991)
Chimicaoggi (7/8). 31-35; Wells, J.A. and Estell,
D.A. (1988) Trends Biochem. Sci. 13, 291-297). La
modulación de actividad enzimática, en particular una tasa de
mejoramiento u optimización para un subconjunto de sustratos, es un
problema mucho más complejo. EP 0260105 indica la construcción de
los mutantes de subtilisina BPN con relaciones alteradas de tasa de
transesterificación/tasa de hidrólisis y especificidad del
nucleófilo mediante el cambio de residuos de aminoácido específicos
dentro de 15 A de la tríada catalítica. Russell, A.J., and Fersht,
A.R. (1987) J. Mol. Biol. 193: 803-813, indica el
aislamiento de un mutante de subtilisina BPN (D099S) que tuvo un
cambio en la carga de la superficie 14 a 15\ring{A} a partir del
sitio activo. Esta sustitución causa un efecto en la dependencia de
pH de la reacción catalítica de la subtilisina. Ninguna de estas
publicaciones indica como predecir las alteraciones de aminoácido
que mejorarán el desempeño del lavado de la proteasa. EP 0130756,
EP 0247647, y US 4,760,025 indican un método de mutación de
saturación dónde una o múltiples mutaciones se introducen en la
subtilisina BPN' en los residuos de aminoácido (numeración de BPN')
Asp32, Asn155, Tyr104, Met222, Gly166, His64, Ser221, Gly169,
Glu156, Ser33, Phe189, Tyr217, y/o Ala152. Utilizando esta
metodología, se obtienen las proteasas mutantes que muestran
estabilidad oxidativa mejorada, especificidad del sustrato
alterado, y/o actividad del pH alterada. Estas publicaciones también
indican que las mutaciones dentro de la región del sitio activo de
la proteasa son las más probables para influir la actividad. Sin
embargo, ninguna EP0130756, EP 0247647, ni US 4,760,025 indican un
método para predecir las alteraciones de aminoácido que mejorarán
el desempeño del lavado de la proteasa.
La mayor parte de la información en la actividad
catalítica de subtilisinas ha sido recolectada por el examen de la
hidrólisis de sustratos de péptidos pequeños, bien definidos. Sin
embargo, se conoce poco acerca de las interacciones con grandes
sustratos de proteínas. Esto es especialmente cierto por el
desempeño del lavado de proteasas donde el sustrato se une a una
superficie del tejido y la catálisis tiene lugar en la presencia de
compuestos de interferencia tales como lejía, tensoactivos, y
constructores.
EP 0328229 indica el aislamiento y la
caracterización de mutantes de subtilisina PB92 con propiedades
mejoradas para aplicaciones de detergente de lavandería basados en
resultados de prueba de lavado. Esto indica que las propiedades
bioquímicas no son parámetros confiables para predecir el desempeño
de la enzima en el lavado. Los métodos para la selección de
mutaciones involucran la sustitución de aminoácidos por otros
aminoácidos en la misma categoría (polar, no-polar,
aromática, cargada, alifática, y neutra), la sustitución de
aminoácidos polares aspargina y glutamina por aminoácidos cargados,
y el incremento del carácter aniónico de la proteasa en los sitios
no involucrados con el sitio activo. Ningún método para identificar
que aminoácidos específicos deberían ser alterados se enseña. La
aplicación de la patente WO 91/00345 (Novo-Nordisk)
indica un método para mejorar el desempeño del lavado de una
subtilisina por la modificación del punto isoeléctrico de
subtilisina Carlsberg y subtilisina 309 para igualar el pH de la
solución de lavado, dónde la enzima se considera que se utilizará.
Sin embargo, dado que las subtilisinas altamente alcalinas tienen
valores de pH cercanos al pH de los detergentes bajo las
condiciones de lavado Europeas, esta metodología no ofrece ninguna
ventaja evidente. WO 91/00345 también indica que los cambios en los
aminoácidos mayores de 15 \ring{A} de la tríada catalítica pueden
dar lugar a cambios en las propiedades cinéticas de la enzima. Un
total de 116 aminoácidos diferentes, de un total de 269 aminoácidos
presentes en la subtilisina 309 se siguieren como posibles sitios
para la sustitución, adición o deleción para modificar la carga
eléctrica neta de la enzima.
La aplicación de la patente WO 92/11357
(Novo-Nordisk) indica el aumento de la estabilidad
del pH y mejora de la posibilidad de lavado de las subtilisinas por
reducción de cargas dependientes del pH de la molécula. Esto
significa la introducción de mutaciones a la constancia sustancial
de la metodología de carga sobre un rango de pH. Preferiblemente,
un cambio de carga neta casi de cero en el rango de pH de 7 a 11. La
aplicación de la Patente Europea No. 0 57 049 A1 revela ciertas
enzimas proteolíticas mutantes. Estas enzimas se dice que tienen al
menos 70% de homología con la secuencia de aminoácido de la proteasa
serina PB92 y difieren por al menos un aminoácido correspondiente a
99, 102, 116, 126, 127, 128, 130, 160, 203, 211, y 212 en la
proteasa serina PB92. La proteasa mutante se prepara mediante el
cultivo de una cepa huésped del microorganismo transformada con un
vector de expresión que comprende una secuencia de ADN y que
codifica una proteasa mutante para producir la proteasa mutante
diseñada.
Las proteasas hasta ahora propuestas para
utilizar en detergentes y auxiliares de lavado se seleccionaron por
la alta actividad proteolítica. A cuenta de su baja especificidad,
por consiguiente, puede ocurrir daño de la fibra o destrucción de
la fibra por la proteasa en particular en el evento de lavado
repetido de los tejidos de fibras proteinogénicas, por ejemplo
textiles de forma de hoja de seda o lana. Por otra parte, cualquier
reducción en la actividad de la proteasa resulta en una pérdida de
poder de limpieza notable para el usuario del detergente. Por
consiguiente, un problema dirigido por la presente invención fue
desarrollar detergentes que contienen proteasas que deberían
mostrar actividad reducida sobre las fibras proteinogénicas, más
particularmente lana, para sustancialmente la misma actividad de
lavado. Otro problema dirigido por la presente invención fue
desarrollar proteasas específicas del lodo que son proteasas que
quitan manchas específicas sobre los tejidos tales como manchas de
huevo y manchas de sangre y formulaciones de detergente que
contienen dichas proteasas específicas del lodo.
La proteasa de tipo salvaje de las cuales las
proteasas mutantes de acuerdo con la invención se derivan es una
proteasa alcalina Bacillus lentus (BLAP) obtenida a partir de
la DSM 5483 que tiene 269 residuos de aminoácido, una masa
molecular de 26,823 daltons y un punto isoeléctrico calculado de 9.7
sobre la base de valores pk estándar. El gen BLAP se obtuvo por el
aislamiento del ADN cromosómico a partir de la cepa B.
lentus DSM 5483, construyendo las sondas de ADN que tienen
homología a la secuencia putativa de ADNs que codifican las
regiones de la proteasa B. lentus, preparando bancos
genómicos a partir del ADN cromosómico aislado y la selección de
bibliotecas para el gen de interés por hibridación con las
sondas.
Los mutantes de la proteasa B. lentus DSM
5483 con mejora en la estabilidad térmica y del agente tensoactivo
ha sido descrita en la aplicación de la patente Serial No.
07/706,691 archivada el 29 de Mayo de 1991. En general las
mutaciones descritas en esta invención se introducen en la BLAP de
tipo salvaje con las siguientes reposiciones de aminoácido: S3T,
V41, A188P, V193M, y V1991 (numeración de acuerdo con la secuencia
BLAP).
La investigación se dirige hacia el enlace de la
proteasa con el sustrato de la proteína molecular alta sobre el
tejido reflejando la importancia de los aminoácidos cargados
situados en la proximidad del sitio de enlace del sustrato. Se
podría demostrar que la eliminación de residuos de aminoácido
cargados positivamente o la introducción de residuos de aminoácido
cargados negativamente en la región del bolsillo de unión del
sustrato de la proteasa conduce hacia un mejor desempeño del lavado
comparado con el tipo salvaje.
La presente invención también se relaciona con
composiciones de detergentes para el lavado de tejidos compuestos
de fibras proteinogénicas tales como lana sin causar daño a tales
fibras. Los detergentes se comprenden de al menos un agente
tensoactivo y una cantidad activa proteolíticamente de una proteasa
que tiene un índice de actividad de queratinasa/caseinasa inferior
de cerca de 0.80.
Otro aspecto de la presente invención se
relaciona con composiciones de detergentes que son efectivos
particularmente en la eliminación de manchas tales como manchas de
sangre y huevo y especialmente combinaciones de tales manchas a
partir de los tejidos. Los detergentes se comprenden de una
combinación de proteasas que son variantes del Bacillus
lentus DSM 5483 y al menos un agente tensoactivo.
Figura 3 muestra la secuencia de ADN para el
fragmento AvaI/C laI a partir de la región
N-terminal del gen alcalino ATCC 53926 de la
proteasa discutido en el Ejemplo 2. El fragmento incluye el promotor
putativo, sitio de enlace ribosómico, codón de iniciación, y la
mayoría de la pre secuencia. El fragmento de 292 pares de base se
flanquea por los sitios de restricción AvaI y ClaI en sus terminales
5' y 3', respectivamente.
Bacillus licheniformis E312 con el
plásmido pBC56M131 se deposita como ATCC 68614. Escherichia
coli WK6 con el plásmido pMC13C se deposita como ATCC 68615.
E. coli GM33 con el plásmido pCB13C se deposita como ATCC
68616. E. coli WK6 con el plásmido pMa5-8 se
deposita como ATCC 68617. E. coli WK6 con
pMc5-8 se deposita como ATCC 68618.
Un aspecto de la presente invención se relaciona
con una proteasa mutante con mejora del desempeño del lavado. El
desempeño mejorado del lavado se obtuvo por la introducción de
alteraciones de aminoácido dentro de una región del bolsillo de
unión del sustrato de la enzima que resulta en una carga negativa
aumentada. De acuerdo con la presente invención, esto se puede
lograr por el incremento del número de residuos de aminoácidos
cargados negativamente o la disminución del número de residuos de
aminoácido cargados positivamente en la región del bolsillo de
unión del sustrato de la proteasa dentro 7A de un enlace de la
molécula sustrato tal como AAPF. En particular, alteraciones de
aminoácido en las posiciones 99, 154 y 211 dentro de las variantes
de la Proteasa Alcalina Bacillus lentus (BLAP) M130 y M131
se mostraron para potenciar el desempeño del lavado de la
enzima.
Un segundo aspecto de la presente invención se
relaciona con las enzimas proteolíticas mutantes que tienen una
mejora del desempeño del lavado relativa a la proteasa de tipo
salvaje como se determina por pruebas de laboratorio. Las
mutaciones descritas en esta invención se introducen en las
variantes de BLAP M130 o M131 que han sido previamente descritas en
la aplicación de la patente Serial No. 07/706,691 archivada el 29 de
Mayo, 1991. Ambas M130 y M131 se ha demostrado que han mejorado la
estabilidad en comparación con la proteasa de tipo salvaje. El
mutante M130 contiene cuatro alteraciones de aminoácido: S3T; A188P/
V193M y V1991. El mutante M131 contiene cinco alteraciones de
aminoácido: S37; V41; A188P; V193M y V1991. El sistema utilizado
para designar la primera lista de las proteasas preferidas del
residuo de aminoácido en la forma madura de BLAP en la posición
numerada seguido por la reposición del aminoácido utilizando la
letra aceptada del aminoácido codificado. Las secuencias de
aminoácidos para las proteasas M130 y M131 se dan en la SEQ ID NO: 2
y SEQ ID NO: 1, respectivamente, contenidas en la aplicación de la
patente Serie No. 07/706,691 archivada el 29 de Mayo, 1991. Ambas
M130 y M131 sirvieron como la base para las alteraciones adicionales
de aminoácido para lograr las proteasas con desempeño mejorado de
lavado. Las proteasas mutantes de acuerdo con la invención se
caracterizan por al menos una alteración de aminoácido que resulta
en una carga positiva reducida o una carga negativa aumentada en la
región del bolsillo de unión del sustrato, en donde dicha alteración
de aminoácido es L211D de acuerdo con la numeración de la SEQ ID
No. 22. En otra modalidad, las proteasas mutantes son aquellas
derivadas por la reposición de al menos un residuo de aminoácido de
las proteasas mutantes M130 o M131 en donde dicho residuo de
aminoácido se selecciona del grupo que consiste de arginina en la
posición 99 o serina en la posición 154 en adición a la leucina en
la posición 211. La Tabla 2 proporciona una descripción de las
proteasas mutantes BLAP que incluyen F11, F43, F44, F45, F46, F47,
F49, F54 y F55. Por ejemplo F11 mostró en la Tabla 2 se deriva de
M130 y contiene una arginina en la posición 99 reemplazada por una
serina (R99S) junto con las otras mutaciones presentes en M130 que
incluyen: una serina en la posición 3 reemplazada por una treonina
(S3T); una alanina en la posición 188 reemplazada por una prolina
(A188P); una valina en la posición 193 reemplazada por una
metionina (V193M) y una valina en la posición 199 reemplazada por
una isoleucina (V1991). De las proteasas mutantes restantes, F43 a
través de F49 se derivan de M131. Los mutantes F54 y F55 se derivan
a partir del mutante F49. Las secuencias de aminoácidos de las
enzimas proteolíticas preferidas F11, F43, F44,
F45, F46, F47, F49, F54 y F55 se dan en la SEQ ID NO:10 a la SEQ ID NO:18, respectivamente, de esta aplicación.
F45, F46, F47, F49, F54 y F55 se dan en la SEQ ID NO:10 a la SEQ ID NO:18, respectivamente, de esta aplicación.
Otro aspecto de esta invención se relaciona con
los genes que codifican las proteasas mutantes. La construcción
genética de todas las proteasas mutantes en esta invención se
describen con detalle en el Ejemplo 2. En todos los casos las
mutaciones que introducen las alteraciones de aminoácido se
construyen utilizando procedimientos conocidos. Las secuencias de
ADN que codifica las formas maduras de las proteasas referidas F11,
F43, F44, F45, F46, F47, F49, F54 y F55. Cada gen híbrido que
codifica una de las proteasas mutantes enumeradas arriba se abarca
en la dirección de la transcripción, un promotor, un sitio de enlace
ribosómico, y codón de iniciación y la principal porción de la pre
región del gen alcalino del B. licheniformis ATCC 53926 de la
proteasa, ligado operablemente a una porción de la pre región y
toda la pro región y caracterizada por al menos una alteración de
aminoácido que resulta en una carga positiva reducida o una carga
negativa aumentada en la región del bolsillo de unión del sustrato,
en donde dicha alteración de aminoácido es L211D de acuerdo con la
numeración de la SEQ ID No. 22. En otra modalidad, las proteasas
mutantes son regiones maduras de una variante del gen BLAP seguido
por la transcripción de la secuencia de terminación por el gen
alcalino de la proteasa a partir de ATCC 53926. El gen híbrido se
puede integrar en el cromosoma del huésped o se realiza en un
plásmido que replica dentro de la cepa Bacillus de elección.
En particular, el plásmido pUB110 o un derivado de pUB110 es el
plásmido de elección para la producción de la proteasa en cepas del
Bacillus subtilis y el plásmido pBC16 o un derivado de pBC16
es la elección para la producción de la proteasa en cepas de B.
licheniformis. Las proteasas mutantes se producen mediante el
cultivo las cepas de Bacillus transformadas por plásmidos
que contienen los genes híbridos en un medio apropiado.
Otro aspecto de la presente invención se
relaciona con composiciones de detergentes que contienen al menos
un agente tensoactivo y una cantidad activa proteolíticamente de una
proteasa que tiene un índice de actividad queratinasa/caseinasa (a
partir de ahora se refiere como al índice KC) inferior de cerca de
0.80, preferiblemente menor de aproximadamente 0.70 y más
preferiblemente en el rango de cerca de 0.2 a aproximadamente
0.65.
El detergente preferiblemente tiene una
actividad proteolítica en el rango de cerca de 100 PU/g a alrededor
de 7500 PU/g.
La presente invención también se relaciona con
el uso de proteasas con un índice KC inferior de cerca de 0.80,
preferiblemente menor de aproximadamente 0.70 y más preferiblemente
en el rango de cerca de 0.2 a aproximadamente 0.65 para el lavado
de textiles de fibras proteinogénicas o textiles que consisten al
menos en parte de fibras proteinogénicas.
El índice KC incluye la actividad de la proteasa
con respecto a dos sustratos diferentes, caseína y queratina.
La actividad proteolítica de una solución de la
proteasa que, en el caso de caseína como sustrato, produce una
absorción de 0.500 OD bajo las condiciones de medición descritas, se
define como 10 PU (unidades de proteasa) por ml. Los resultados de
limpieza observados por el usuario de un detergente que contiene la
proteasa, se correlacionan con esta actividad expresada en PU. El
daño observado a un tejido de fibras proteinogénicas, se
correlaciona con el índice KC para un resultado de limpieza
constante.
Como era de esperar, a la luz del problema
indicado anteriormente, sólo una mínima diferencia en las
actividades hacia la caseína y queratina se observó en el caso de
las proteasas comerciales, el índice KC que es relativamente
cercano a 1. Se encontró que las proteasas con índices de KC
inferiores del 0.80 tienen que ser utilizados para lograr un grado
significantemente notable no mayor del daño para un tejido
proteinogénico.
Se ha encontrado sorprendentemente que las
proteasas que tienen las propiedades mencionadas arriba pueden
influir sinérgicamente en el efecto de ciertos otros ingredientes
del detergente y que, inversamente, la actividad proteolítica de la
proteasa se puede mejorar sinergísticamente mediante ciertos otros
ingredientes del detergente. Estos efectos ocurren en particular en
el caso dónde el componente del agente tensoactivo de las
composiciones de acuerdo con la invención, contienen agentes
tensoactivos no-iónicos, copoliesteres de liberación
del lodo (más particularmente aquellos que contienen unidades de
ácido tereftálico), constructores orgánicos insolubles en agua,
constructores orgánicos e inorgánicos solubles en agua (más
particularmente sobre la base de carbohidratos oxidados) y agentes
tensoactivos aniónicos sintéticos del tipo sulfato y sulfonato, pero
no muy fuerte -si de algún modo- en el caso de
alquilbencenosulfonatos. Los detergentes de acuerdo con la invención
preferiblemente contienen ingredientes de las propiedades se
mejoran o que resaltan las propiedades de la proteasa.
Las proteasas apropiadas para utilizar de
acuerdo con la invención incluyen variantes diseñadas genéticamente
del Bacillus lentus DSM 5483. Estas variantes se pueden
preparar de acuerdo con el método publicado en la aplicación de la
patente US serial número 08/201,120 archivada el 02/24/94 y en la
patente US número 5,340,735. Las variantes preferidas del
Bacillus lentus DSM 5483 (BLAP) se enumeran en la Tabla 2 en
el Ejemplo 2.
En referencia a la Tabla 2, el sistema utilizado
para identificar las variantes, es el mismo que se utiliza en la
patente US número 5,340,735 y se explica en esta. Por ejemplo, el
mutante F49 se identifica como S3T + V41 + A188P + V 193M + V199I +
L211D. Dicha proteasa es una variante del mutante Bacillus
lentus DSM 5483 en donde el residuo de serina en la posición 3
se reemplaza por la treonina, el residuo de valina en la posición 4
se reemplaza por la isoleucina, el residuo de alanina en la posición
188 se reemplaza por la prolina, el residuo de valina en la
posición 193 se reemplaza por la metionina, el residuo de valina en
la posición 199 se reemplaza por la isoleucina, y el residuo de
leucina en la posición 211 se reemplaza por el ácido aspártico. La
secuencia de aminoácido de la proteasa BLAP de tipo salvaje se
publica como una secuencia ID número 52 en la patente US número
5,340,735.
Se ha encontrado que algunas variantes del
Bacillus lentus DSM 5483 mostraron actividad preferencial
hacia las manchas de sangre mientras otros mostraron actividad
preferencial hacia las manchas de huevo. Los mutantes que son
efectivos particularmente para eliminar las manchas de sangre y
huevo a partir de los tejidos son aquellos mutantes hechos,
haciendo las siguientes reposiciones en la proteína de tipo salvaje
Bacillus lentus DSM 5483: R99G, R99A, R99S, S154D, S154E,
L221D. Los mutantes que tienen reposición de residuos de aminoácido
en las posiciones 99 y 154 son efectivos particularmente para
eliminar manchas de sangre. Los mutantes que tienen reposición de
residuos de aminoácido en la posición 211 son efectivos
particularmente para eliminar manchas de huevo. Se ha encontrado
que una combinación de enzimas mutantes que tienen reposición de los
residuos de aminoácido en las posiciones 99 y 154 y aquellos que
tienen reposición de residuos de aminoácido en la posición 211 son
efectivos particularmente para eliminar una combinación de manchas
de sangre y huevo.
Por consiguiente otro aspecto de la presente
invención se relaciona con las composiciones de detergentes que son
efectivos particularmente para eliminar combinaciones de manchas
tales como manchas de sangre y huevo de los tejidos. Los
detergentes se comprenden de una combinación de proteasas que son
variantes DSM 5483 del Bacillus lentus y un agente
tensoactivo no-iónico, un agente tensoactivo
aniónico, un jabón, o una combinación de tales agentes
tensoactivos. Las combinaciones de proteasa incluyen de dos o más de
las variantes DSM 5483 del Bacillus lentus enumeradas en la
Tabla anterior. Una combinación preferida particularmente es F46 +
F49 para eliminar las manchas que consisten de manchas de sangre y
de huevo.
En una modalidad preferida, un detergente de
acuerdo con la invención contiene agentes tensoactivos
no-iónicos seleccionados de poliglicósidos de
alquilo grasos, polialcoxilatos de alquilo grasos, más
particularmente etoxilatos y/o propoxilatos, polihidroxiamidas de
ácidos grasos y/o productos de etoxilación y/o propoxilación de
alquilaminas grasas, dioles vicinales, ésteres de alquilo de ácidos
grasos y/o aminas de ácido graso y mezclas de estos, más
particularmente en una cantidad del 2% en peso a 25% en peso.
En otra modalidad preferida, un detergente de
acuerdo con la invención contiene un agente tensoactivo aniónico
sintético del tipo sulfato y/o sulfonato, más particularmente
alquilsulfato graso, alquiletersulfato graso, ésteres de ácido
sulfograso y/o disal de ácido sulfograsos, más particularmente en
una cantidad del 2% en peso a 25% en peso. El agente tensoactivo
aniónico preferiblemente se selecciona del alquilo o
alquenilsulfatos y/o el alquilo o alqueniletersulfatos en el grupo
alquilo o alquenilo que contiene 8 a 22 átomos de carbono y, más
particularmente, 12 a 18 átomos de carbono.
En otra modalidad preferida, un detergente de
acuerdo con la invención contiene constructores solubles en agua
y/o insolubles en agua, más particularmente seleccionados de
aluminosilicato de metal alcalino, silicato de metal alcalino
cristalino con un módulo de > 1, policarboxilato monomérico,
policarboxilato polimérico y mezclas de estos, más particularmente
en cantidades de 2.5% en peso a 60% en peso.
Otra, aunque menos preferida, modalidad de un
detergente de acuerdo con la invención pretendida para el lavado de
tejidos de lana o seda pueden contener agentes blanqueadores basados
en peroxígeno, más particularmente peróxido de hidrógeno, perborato
tetrahidrato de metal alcalino, perborato monohidrato de metal
alcalino y/o percarbonato de metal alcalino, más particularmente en
cantidades de 5% en peso a 70% en peso, y opcionalmente activadores
de blanqueo, más particularmente en cantidades de 2% en peso a 10%
en peso.
Finalmente, otra modalidad de un detergente de
acuerdo con la invención contiene agentes liberadores de lodo sobre
la base de copoliesteres de ácidos dicarboxílicos y glicoles que
pueden estar presentes en particular en cantidades de 0.01 % en
peso a 5% en peso. Estos agentes liberadores de lodo, que son
efectivos particularmente en virtud de su similitud química a las
fibras de poliester, sino que también son capaces de desarrollar el
efecto necesario en tejidos de otros materiales son copoliesteres
que contienen unidades de ácido dicarboxílico, unidades de
alquilenglicol y unidades de polialquilenglicol. Los copoliésteres
que liberan el lodo del tipo mencionado y su uso en detergentes se
han conocido durante algún tiempo.
Las composiciones de detergentes de acuerdo con
la invención contienen al menos un agente tensoactivo que incluye
jabones. Los agentes tensoactivos pueden ser agentes tensoactivos
noiónicos o aniónicos o una combinación de agentes tensoactivos
noiónicos o aniónicos o una combinación de agentes tensoactivos
noiónicos o aniónicos y uno o más jabones.
Apropiados agentes tensoactivos
no-iónicos incluyen los alcoxilatos, más
particularmente etoxilatos y/o propoxilatos, de alcoholes lineales
o ramificados saturados o mono- a poli-insaturados
que contienen de 10 a 22 átomos de carbono y preferiblemente 12 a
18 átomos de carbono. El grado de alcoxilación de los alcoholes es
por lo general entre 1 y 20 y preferiblemente entre 3 y 10. Se
pueden obtener de manera conocida, mediante la reacción de los
alcoholes correspondientes con los óxidos de alquileno
correspondientes. Los derivados de los alcoholes grasos
particularmente son apropiados, aunque sus isómeros de cadena
ramificada, más particularmente así llamados oxoalcoholes, también
se pueden utilizar para la producción de alcoxilatos útiles. Por
consiguiente, los alcoxilatos, más particularmente etoxilatos, de
alcoholes primarios que contienen grupos lineales, más
particularmente grupos dodecil, tetradecil, hexadecil u octadecil,
y mezclas de estos se pueden utilizar. Además, los productos de
alcoxilación correspondientes de alquilaminas, dioles vicinales y
amidas de ácido carboxílico correspondiente a los alcoholes
mencionados anteriormente en lo que respecta a la fracción alquilo
también son apropiados. Los poliglicosidos de alquilo apropiados
para la incorporación en los detergentes de acuerdo con la invención
son compuestos correspondientes a la fórmula general
(G)_{n}-OR^{1}, dónde R^{1} es un radical alquilo o alquenilo que contiene de 8 a 22 átomos de carbono, G es una unidad de glicosa y n es un número de 1 a 10. El componente glucósido (G)_{n} es un oligómero o polímero de monómeros aldosa o cetosa de origen natural, incluyendo en particular glucosa, manosa, fructosa, galactosa, talosa, gulosa, altrosa, alosa, idosa, ribosa, arabinosa, xilosa y lixosa. Los oligómeros que consisten de dichos monómeros unidos al glucósido se caracterizan no sólo por el tipo de azúcares presentes en ellos, sino también por su número, el así llamado grado de oligomerización. Como una cantidad determinada analíticamente, el grado de oligomerización n es por lo general un número fraccionado que puede asumir un valor de 1 a 10 y, en el caso de los glucósidos preferiblemente utilizando, un valor inferior de 1.5 y, más particularmente, entre 1.2 y 1.4. La glucosa es la unidad de monómero preferido en virtud de su disponibilidad al alcance. El sustituyente alquilo o alquenilo R^{1} de los glucósidos también preferiblemente desprendidos de los derivados asequibles fácilmente de materias primas renovables, más particularmente a partir de alcoholes grasos, aunque los isómeros de cadena ramificada de estos, más particularmente los así llamados oxoalcoholes, también se pueden utilizar para la producción de glucósidos útiles. Por consiguiente, los alcoholes primarios con grupos lineales octil, decil, dodecil, tetradecil, hexadecil u octadecil y mezclas de estos, son apropiados particularmente. Los glucósidos de alquilo preferidos particularmente contienen un grupo alquilo grasa de coco, i.e. mezclas en las cuales - esencialmente - R^{1} es dodecil y R^{1} es tetradecil.
(G)_{n}-OR^{1}, dónde R^{1} es un radical alquilo o alquenilo que contiene de 8 a 22 átomos de carbono, G es una unidad de glicosa y n es un número de 1 a 10. El componente glucósido (G)_{n} es un oligómero o polímero de monómeros aldosa o cetosa de origen natural, incluyendo en particular glucosa, manosa, fructosa, galactosa, talosa, gulosa, altrosa, alosa, idosa, ribosa, arabinosa, xilosa y lixosa. Los oligómeros que consisten de dichos monómeros unidos al glucósido se caracterizan no sólo por el tipo de azúcares presentes en ellos, sino también por su número, el así llamado grado de oligomerización. Como una cantidad determinada analíticamente, el grado de oligomerización n es por lo general un número fraccionado que puede asumir un valor de 1 a 10 y, en el caso de los glucósidos preferiblemente utilizando, un valor inferior de 1.5 y, más particularmente, entre 1.2 y 1.4. La glucosa es la unidad de monómero preferido en virtud de su disponibilidad al alcance. El sustituyente alquilo o alquenilo R^{1} de los glucósidos también preferiblemente desprendidos de los derivados asequibles fácilmente de materias primas renovables, más particularmente a partir de alcoholes grasos, aunque los isómeros de cadena ramificada de estos, más particularmente los así llamados oxoalcoholes, también se pueden utilizar para la producción de glucósidos útiles. Por consiguiente, los alcoholes primarios con grupos lineales octil, decil, dodecil, tetradecil, hexadecil u octadecil y mezclas de estos, son apropiados particularmente. Los glucósidos de alquilo preferidos particularmente contienen un grupo alquilo grasa de coco, i.e. mezclas en las cuales - esencialmente - R^{1} es dodecil y R^{1} es tetradecil.
El agente tensoactivo no-iónico
preferiblemente esta presente en los detergentes de acuerdo con la
invención en cantidades de 1% en peso a 30% en peso y más
preferiblemente en cantidades de 1% en peso a 25% en peso.
Además de o en lugar del agente tensoactivo
no-iónico, los detergentes de acuerdo con la
invención pueden contener otros agentes tensoactivos,
preferiblemente agentes tensoactivos aniónicos sintéticos del tipo
sulfato o sulfonato, en cantidades de preferiblemente no más del
20% en peso y, más preferiblemente, en cantidades de 0.1% en peso a
18% en peso, sobre la base del detergente como un todo. Los agentes
tensoactivos aniónicos particularmente apropiados para utilizar en
los detergentes de acuerdo con la invención son los alquilo y/o
alquenilsulfatos que contienen de 8 a 22 átomos de carbono que
contienen un metal alcalino, ion amonio o alquilo- o
hidroxialquilo-sustituido amonio como contraion. Los
derivados de alcoholes grasos que contienen de 12 a 18 átomos de
carbono y análogos de cadena ramificada de estos, los así llamados
oxoalcoholes, se prefieren. El alquilo y los alquenilsulfatos se
pueden preparar de manera conocida por reacción del componente de
alcohol correspondiente con un agente de sulfatación típico, más
particularmente trióxido de azufre o ácido clorosulfónico, y la
posterior neutralización con bases de metal alcalino, amonio o
alquilo- o amonio hidroxialquilo-sustituido.
Alquilo y/o alquenilsulfatos tales como estos, preferiblemente se
presentan en los detergentes de acuerdo con la invención en
cantidades de 0.1% en peso a 20% en peso y más preferiblemente en
cantidades de 0.5% en peso a 18% en peso.
Los agentes tensoactivos apropiados del tipo
sulfato también incluyen los productos sulfatados de alcoxilación
de los alcoholes mencionados, los así llamados éter sulfatos. Estos
éteres sulfatos preferiblemente contienen de 2 a 30 y, más
particularmente, 4 a 10 grupos de etilen glicol por molécula. Los
agentes tensoactivos aniónicos apropiados del tipo sulfonato
incluyen los \alpha-sulfoesteres obtenibles por la
reacción de ésteres de ácido graso con trióxido de azufre y la
posterior neutralización, más particularmente los productos de
sulfonación derivados de ácidos grasos C_{8-22} y
preferiblemente C_{12-18} y
C_{1-6} y preferiblemente alcoholes lineales
C_{1-4}, y los ácidos sulfograsos que se
desprenden de estos productos de sulfonación a través de una
saponificación formal.
Otros ingredientes opcionales de
superficie-activa incluyen jabones; los jabones
apropiados que son jabones de ácido graso saturado, tales como las
sales de ácido laurico, ácido mirístico, ácido palmítico o ácido
esteárico, y jabones derivados de mezclas de ácido graso natural,
por ejemplo aceite de coco, aceite de grano de palma o ácidos
grasos de grasa de animal. Las mezclas de jabones de las cuales el
50% en peso a 100% en peso consisten de jabones de ácido graso
saturado C_{12-18} y hasta 50% en peso de jabón de
ácido oleico particularmente se prefieren. Preferiblemente el jabón
esta presente en cantidades de 0.1% en peso a 5% en peso. Sin
embargo, grandes cantidades de jabón de hasta 20% en peso pueden
estar presentes en particular en detergentes líquidos.
Un detergente de acuerdo con la invención
preferiblemente contiene 20% en peso a 55% en peso de constructores
orgánicos y/o inorgánicos, solubles en agua y/o insoluble en agua.
Los constructores orgánicos solubles en agua incluyen, en
particular, aquellos de la clase de ácidos policarboxílicos, más
particularmente ácido cítrico y ácidos de azúcar, y la clase de
ácidos (poli)carboxílicos poliméricos, más particularmente
los policarboxilatos obtenibles por oxidación de polisacáridos,
ácidos acrílicos poliméricos, ácidos metacrílicos, ácidos maleicos
y copolímeros de estos que aún pueden contener pequeñas cantidades
de sustancias polimerizables con ningún ácido carboxílico funcional
en la forma copolimerizada. El peso molecular relativo de los
homopolímeros de ácidos carboxílicos insaturados es por lo general
en el rango de 5,000 a 200,000 mientras que el peso molecular
relativo de los copolímeros es en el rango de 2,000 a 200,000 y
preferiblemente en el rango de 50,000 a 120,000, sobre la base de
ácido libre. Un particularmente preferido copolímero ácido
acrílico/ácido maléico tiene un peso molecular relativo de 50,000 a
100,000. Los compuestos apropiados, pero menos preferidos de esta
clase son los copolímeros de ácido acrílico o ácido metacrílico con
ésteres de vinilo, tales como ésteres de vinilmetil, ésteres de
vinilo, etileno, propileno y estireno, en los que el ácido
constituye al menos 50% en peso. Otros constructores orgánicos
apropiados solubles en agua son terpolímeros que contienen dos
ácidos carboxílicos y/o sales de estos como monómeros y vinil
alcohol y/o un derivado de vinil alcohol o un carbohidrato como el
tercer monómero. El primer monómero ácido o su sal derivada de un
ácido carboxílico C_{3-8} monoetilenicamente
insaturado y preferiblemente de un ácido monocarboxílico
C_{3-4}, más particularmente de ácido
(met)acrílico. El segundo monómero ácido o su sal puede ser
un derivado de un ácido dicarboxílico C_{4-8},
preferiblemente un ácido dicarboxílico C_{4-8},
siendo preferido particularmente el ácido maléico. En este caso, la
tercera unidad de monómero se forma por un vinil alcohol y/o
preferiblemente por un vinil alcohol esterificado. Los derivados
del vinil alcohol en la forma de un éster de ácidos carboxílicos de
cadena corta, preferiblemente ácidos carboxílicos
C_{1-4}, con vinil alcohol se prefieren
particularmente. Los terpolímeros preferidos contienen 60% en peso
a 95% en peso y, más particularmente, 70% en peso a 90% en peso de
ácido (met) acrílico o (met)acrilato, más preferiblemente
ácido acrílico o acrilato, y ácido maléico o maleato y 5% en peso a
40% en peso y preferiblemente 10% en peso a 30% en peso de vinil
alcohol y/o vinil acetato. Los terpolímeros en los que la relación
en peso del ácido (met) acrílico o (met)acrilato con el ácido
maléico o maleato es entre 1:1 y 4:1, preferiblemente entre 2:1 y
3:1 y más preferiblemente entre 2:1 y 2.5:1 se prefieren más
particularmente (ambas las cantidades y las relaciones en peso que
son sobre la base de los ácidos). El segundo monómero ácido o su
sal incluso puede ser un derivado de un ácido alil sulfónico
sustituido en la posición-2 por un radical alquilo,
preferiblemente por un radical alquilo C_{1-4}, o
por un radical aromático preferiblemente derivado del benceno o
derivados del benceno. Los terpolímeros preferidos contienen 40% en
peso a 60% en peso y más particularmente 45% en peso a 55% en peso
de ácido (met) acrílico o (met)acrilato, más preferiblemente
ácido acrílico o acrilato, 10% en peso a 30% en peso y
preferiblemente 15% en peso a 25% en peso de ácido metalil
sulfónico o metalil sulfonato y, como el tercer monómero, 15% en
peso a 40% en peso y preferiblemente 20% en peso a 40% en peso de
un carbohidrato. Este carbohidrato puede ser, por ejemplo, un mono-,
di-, oligo- o polisacárido, siendo preferidos los mono-, di- o
oligosacáridos, siendo particularmente preferida la sacarosa. Los
puntos de debilidad responsables de la biodegradabilidad del
polímero probablemente se incorporan en esta, a través del uso del
tercer monómero. Estos terpolímeros por lo general tienen un peso
molecular relativo en el rango de 1,000 a 200,000, preferiblemente
en el rango de 200 a 50,000 y más preferiblemente en el rango de
3,000 a 10,000. Se pueden utilizar en la forma de soluciones
acuosas, preferiblemente 30 a 50% en peso de soluciones acuosas,
particularmente para la producción de detergentes líquidos. Todos
los ácidos policarboxílicos mencionados son por lo general
utilizados en las formas de sus sales solubles en agua, más
particularmente sus sales de metal alcalino.
Los constructores orgánicos del tipo en cuestión
preferiblemente se presentan en cantidades de hasta 40% en peso,
más preferiblemente en cantidades de hasta 25% en peso y más
preferiblemente en cantidades de 1% en peso a 5% en peso. Las
cantidades cercanas al límite superior mencionado son
preferiblemente utilizadas en forma de pasta o líquido, más
particularmente detergentes, que contienen agua de acuerdo con la
invención.
Los alumosilicatos de metal alcalino cristalinos
o amorfos en particular se utilizan como los constructores
inorgánicos insolubles en agua, dispersables en agua en cantidades
de hasta 50% en peso y preferiblemente en cantidades de no más del
40% en peso y, en detergentes líquidos, en cantidades del 1% en peso
a 5% en peso. Entre estos alumosilicatos, alumosilicatos de sodio
cristalinos en calidad de detergente, más particularmente se
prefieren, zeolite A, P y opcionalmente X. Las cantidades cercanas
al límite superior mencionado preferiblemente se utilizan en
detergentes particulados sólidos. Los alumosilicatos apropiados no
contienen partículas mayores de 30 \mum en tamaño, al menos 80%
en peso que consiste de partículas debajo de 10 \mum en tamaño. Su
capacidad de enlace de calcio es por lo general en el rango de 100
a 200 mg de CaO por gramo.
Los sustituyentes o sustituyentes parciales
apropiados para el alumosilicato mencionado son silicatos
cristalinos de metal alcalino que pueden estar presentes ya sea por
cuenta propia o en mezcla con silicatos amorfos. Los silicatos de
metal alcalino apropiados para utilizar como constructores en los
detergentes de acuerdo con la invención preferiblemente tienen una
relación molar de óxido de metal alcalino con el SiO_{2} inferior
del 0.95 y, más particularmente, en el rango de 1:1.1 a 1:12 y
pueden estar presentes en forma amorfa o cristalina. Los silicatos
de metal alcalino preferidos son los silicatos de sodio, más
particularmente silicatos de sodio amorfos, con una relación molar
de Na_{2}O con SiO_{2} de 1:2 a 1:2.8. Los silicatos de metal
alcalino amorfos tales como estos son comercialmente disponibles,
por ejemplo, como PORTIL®. Aquellos con una relación molar de
Na_{2}O con SiO_{2} de 1:1.9 a 1:2.8 preferiblemente se utilizan
en forma sólida y no en la forma de una solución en la producción
de detergentes de acuerdo con la invención. Los silicatos
cristalinos preferidos, que pueden estar presentes ya sea por
cuenta propia o en mezcla con silicatos amorfos, son silicatos de
capa cristalinos con la fórmula general
Na_{2}Si_{x}O_{2x+1}\cdotyH_{2}O, en la que x -los así
llamados módulos- es un número de 1.9 a 4 y y es un número de 0 a
20, siendo los valores preferidos para x 2, 3 o 4. Los silicatos de
capa cristalinos preferidos son aquellos en los cuales x en la
fórmula general asume el valor 2 o 3. Ambos \beta- y
\delta-disilicatos de sodio
(Na_{2}Si_{2}O_{5}\cdotyH_{2}O) particularmente se
prefieren. Los \delta-silicatos de sodio con un
módulo de 1.9 a 3.2 se prefieren. Sustancialmente silicatos
cristalinos libres de agua de metal alcalino correspondiente a la
anterior fórmula general, en la que x es un número de 1.9 a 2.1
también se pueden utilizar en detergentes de acuerdo con la
invención. Otra modalidad preferida de detergentes de acuerdo con
la invención son silicatos cristalinos de capa de sodio que tienen
un módulo de 2 a 3. Los silicatos cristalinos de sodio con un módulo
de 1.9 a 3.5 se utilizan en otra modalidad preferida de detergentes
de acuerdo con la invención. El contenido del silicato de metal
alcalino de los detergentes de acuerdo con la invención es
preferiblemente 1% en peso a 50% en peso y más preferiblemente 5% en
peso a 35% en peso, sobre la base de la sustancia activa anhidra.
Si un aluminosilicato de metal alcalino, más particularmente
zeolite, también esta presente como un constructor adicional, el
contenido del silicato de metal alcalino es preferiblemente 1% en
peso a 15% en peso y más preferiblemente 2% en peso a 8% en peso,
sobre la base de sustancia activa anhidra. En ese caso, la relación
en peso de alumosilicato con el silicato, sobre la base de
sustancias activas anhidras, es preferiblemente 4:1 a 10:1. En
detergentes que contienen silicatos tanto amorfos como cristalinos
de metal alcalino, la relación en peso de silicatos amorfos de metal
alcalino con silicatos cristalinos de metal alcalino es
preferiblemente 1:2 a 2:1 y más preferiblemente 1:1 a 2:1.
Además del constructor inorgánico mencionado,
otras sustancias inorgánicas solubles en agua o insolubles en agua
se pueden utilizar en los detergentes de acuerdo con la invención.
Los carbonatos de metal alcalino, hidrógenocarbonatos de metal
alcalino y sulfatos de metal alcalino y mezclas de estos son
apropiados a este respecto. El material inorgánico adicional puede
estar presente en cantidades de hasta 70% en peso, pero esta
ausente por completo de preferencia.
Para ajustar opcionalmente un valor de pH ácido
o suavemente alcalino, en particular, cerca de 8.0 a 9.5 en una
solución acuosa del 1% en peso, los detergentes de acuerdo con la
invención pueden contener ácidos sólidos inorgánicos y/o orgánicos
o sales de ácidos, por ejemplo hidrógeno sulfatos de metal alcalino,
ácido succínico, ácido adípico o ácido glutárico y mezclas de
estos. Las sustancias ácidas tales como estos preferiblemente se
presentan en los detergentes de acuerdo con la invención en
cantidades de no más del 5% en peso y, más particularmente, en
cantidades del 0.1% en peso a 3% en peso.
Los detergentes de acuerdo con la invención
adicionalmente pueden contener otros ingredientes típicos de
detergentes. Estos ingredientes opcionales incluyen, en particular,
agentes complejantes de metales pesados, por ejemplo ácidos
aminopolicarboxílicos, ácidos aminohidroxipolicarboxílicos, ácidos
polifosfónicos y/o ácidos aminopolifosfónicos, inhibidores de
redeposición, por ejemplo ésteres de celulosa, inhibidores de
transferencia de coloración, por ejemplo polivinil pirrolidonas,
inhibidores de espuma, por ejemplo organopolisiloxanos o parafinas,
solventes y abrillantadores ópticos, por ejemplo derivados de ácido
disulfónico estilbeno. Los detergentes de acuerdo con la invención
preferiblemente contienen hasta 1% en peso y, más particularmente,
0.01% en peso a 0.5% en peso de abrillantadores ópticos, más
particularmente compuestos de la clase de ácidos
4,4'-bis-(2,4,6-triaminos-triazinil)-estilbeno-2,2'-disulfónicos
sustituidos, hasta 5% en peso y, más particularmente, 0.1% en peso
a 2% en peso de agentes acomplejantes para metales pesados, más
particularmente ácidos aminoalquilen fosfónicos y sales de estos,
hasta 3% en peso y, más particularmente, 0.5% en peso a 2% en peso
de inhibidores de deposición y hasta 2% en peso y, más
particularmente, 0.1% en peso a 1% en peso de inhibidores de espuma,
los porcentajes en peso mencionados se base en el detergente como
un todo.
Además de agua, los solventes que se utilizan en
particular en detergentes líquidos de acuerdo con la invención son
preferiblemente solventes miscibles en agua,
incluyendo-alcoholes inferiores, por ejemplo etanol,
propanol, isopropanol butanoles isoméricos, glicerol, glicoles
inferiores, por ejemplo etileno y propilenglicol, y los ésteres
derivados de las clases de compuestos mencionados.
Los estabilizadores de enzimas típicos
opcionalmente presentes, más particularmente en detergentes líquidos
de acuerdo con la invención, incluyen aminoalcoholes, por ejemplo
mono-, di-, trietanolamina y propanolamina y mezclas de estos, los
ácidos carboxílicos inferiores, ácido bórico o boratos de metal
alcalino, y combinaciones de ácido bórico/ácido carboxílico.
Los inhibidores de espuma apropiados incluyen
jabones de cadena larga, más particularmente jabón behénico, aminas
de ácido graso, parafinas, ceras, ceras microcristalinas,
organopolisiloxanos y mezclas de estos que, además, pueden contener
microfina, opcionalmente silanizados o por otra parte silica
hidrofobizada. Para utilizar en detergentes particulados de acuerdo
con la invención, inhibidores de espuma tales como estos
preferiblemente se depositan sobre soportes granulares solubles en
agua.
Además, el detergente de acuerdo con la
invención puede contener inhibidores de redeposición. La función de
inhibidores de redeposición es mantener el lodo aislado de las
fibras suspendidas en el licor y de esta manera prevenir la
decoloración de las fibras. Los inhibidores de redeposición
apropiados son coloides orgánicos soluble en agua, por lo general,
por ejemplo las sales solubles en agua de ácidos carboxílicos
poliméricos, goma, gelatina, sales de ácidos carboxílicos éter o
ácidos éter sulfónicos o almidón o celulosa o sales de ésteres de
ácido sulfúrico ácido de celulosa o almidón. Las poliamidas solubles
en agua que contienen grupos ácidos también son apropiadas para
este propósito. Las preparaciones solubles en almidón y otros
productos de almidón de aquellos mencionados arriba, por ejemplo en
parte almidón hidrolizado, también se pueden utilizar.
Preferiblemente se utilizan, sodio carboximetilcelulosa, metil
celulosa, metil hidroxietil celulosa y mezclas de estos.
Los agentes blanqueadores que se pueden utilizar
como otros ingredientes de detergentes de acuerdo con la invención
son por lo general los compuestos utilizados en detergentes, tales
como perborato, que puede estar presente como tetrahidrato o
monohidrato, percarbonato, perpirofosfato y persilicato que por lo
general se presentan en la forma de sales de metal alcalino, más
particularmente sales de sodio. Los agentes blanqueadores tales
como estos preferiblemente se presentan en detergentes de acuerdo
con la invención en cantidades de hasta 25% en peso, más
preferiblemente en cantidades de hasta 15% en peso y más
preferiblemente en cantidades de 5% en peso a 15% en peso, sobre la
base del detergente como un todo.
Los activadores de blanqueo presentes como un
componente opcional incluyen los compuestos N-acil u
O-acil usualmente utilizados, por ejemplo
alquilendiaminas poliaciladas, más particularmente tetraacetil
etilendiamina, glicoluriles acilados, más particularmente
tetraacetil glicoluril, hidantoinas N-aciladas,
hidrazidas, triazoles, urazoles, diquetopiperazinas, sulfurilamidas
y cianuratos, también anhídridos carboxílicos, más particularmente
anhídrido ftálico, ésteres de ácido carboxílico, más particularmente
fenol sulfonato isononanoil de sodio, y derivados de azúcar
acilados, más particularmente pentaacetil glucosa. Para evitar la
interacción con los compuestos durante el almacenamiento, los
activadores de blanqueo pueden haber sido recubiertos con sustancias
que forman cáscaras o granulados de manera conocida, tetraacetil
etilendiamina granulada con carboximetilcelulosa con tamaños de
partícula medios de 0.01 mm a 0.8 mm, y/o
1,5-diacetil-2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazina
granulada, siendo preferida particularmente. Los activadores de
blanqueo preferiblemente se presentan en detergentes de acuerdo con
la invención en cantidades de hasta 8%
en peso y más particularmente en cantidades de 2% en peso a 6% en peso, sobre la base del detergente como un todo.
en peso y más particularmente en cantidades de 2% en peso a 6% en peso, sobre la base del detergente como un todo.
Las enzimas opcionalmente presentes además de la
proteasa incluyen, en particular, enzimas de la clase de lipasas,
cutinasas, amilasas, celulasas, pululanasas, oxidasas y peroxidasas
y mezclas de estas. Preferiblemente se utilizan, las enzimas
obtenidas de cepas de hongos o bacterias.
Las amilasas apropiadas para utilizar en
detergentes de acuerdo con la invención incluyen las enzimas
obtenibles de bacterias u hongos que tienen un pH óptimo
preferiblemente en el rango alcalino hasta cerca de pH 10. Los
productos comerciales útiles son, por ejemplo, TERMAMYL® y MAXAMYL®.
La amilasa preferiblemente se utiliza en el detergente de acuerdo
con la invención en tales cantidades que el detergente final
contiene 0.01 KNU/g a 2 KNU/g ("Unidades Kilo Novo" por gramo
de acuerdo con el método estándar de la Novo Company, siendo 1 KNU
la cantidad de enzima que degrada 5.26 kg de almidón a pH 5.6/37ºC
como se determina por el método descrito por Methods in Enzymology,
Vol. 1, 1955, page 149), preferiblemente 0.015 KNU/g a 1.8 KNU/g y
más preferiblemente 0.03 KNU/g a 1.6 KNU/g.
La celulasa apropiada para utilizar de acuerdo
con la invención también pertenece a las enzimas obtenibles de
bacterias u hongos que tienen un pH óptimo preferiblemente en el
rango casi neutro a suavemente alcalino de pH de 6 a 9.5.
Preferiblemente se utilizan en el detergente de acuerdo con la
invención en tales cantidades que el detergente final tiene una
actividad celulolítica de 0.05 IU/g a 1.5 IU/g ("Unidades
Internacionales" por gramo, sobre la base de la hidrólisis
enzimática de Na carboximetilcelulosa a pH 9.0/40ºC, preferiblemente
0.07 IU/g a 1.4 IU/g y más preferiblemente 0.1 IU/g a 1.3 IU/g. Los
productos comerciales apropiados son, por ejemplo, CELLUZYME®, un
producto de Novo Nordisk, o KAC®, un producto de Kao.
Las enzimas se pueden adsorber de manera
conocida sobre soportes, encapsulados en sustancias que forman una
capa y/o granulada en conjunción con sustancias soporte, para hacer
luego más fácil su manipulación y protección contra la inactivación
prematura, si son para ser incorporados en detergentes particulados.
Las enzimas opcionalmente presentes además con la proteasa
preferiblemente se presentan en detergentes de acuerdo con la
invención en cantidades de hasta 2% en peso y más preferiblemente
en cantidades de 0.01% en peso a 1.5% en peso, sobre la base del
detergente como un todo.
En una modalidad preferida, un detergente de
acuerdo con la invención es particulado y contiene 20% en peso a
55% en peso del constructor inorgánico, hasta 15% en peso y más
particularmente de 2% en peso a 12% en peso del constructor
orgánico soluble en agua, 2.5% en peso a 20% en peso de agente
tensoactivo aniónico sintético, 1% en peso a 20% en peso de agente
tensoactivo no-iónico, hasta 25% en peso y, más
particularmente, del 1% en peso a 15% en peso del agente
blanqueador, hasta 8% en peso y, más particularmente, de 0.5% en
peso a 6% en peso del activador de blanqueo y hasta 20% en peso y,
más particularmente, de 0.1% en peso a 15% en peso de sales
inorgánicas, más particularmente carbonato de metal alcalino y/o
sulfato, y hasta 2% en peso y, más particularmente, de 0.4% en peso
a 1.2% en peso de enzimas particuladas además de proteasa, más
particularmente lipasa, cutinasa, amilasa, celulasa, pululanasa,
oxidasa y/o peroxidasa.
En otra modalidad preferida, un detergente en
forma de polvo de acuerdo con la invención se pretende en particular
para utilizar como un detergente ligero contiene 20% en peso a 55%
en peso de los constructores inorgánicos, hasta 15% en peso y, más
particularmente, de 2% en peso a 12% en peso de constructores
orgánicos solubles en agua, de 4% en peso a 24% en peso de agente
tensoactivo no-iónico, hasta 15% en peso y, más
particularmente, del 1% en peso a 10% en peso de agente tensoactivo
aniónico sintético, hasta 65% en peso y, más particularmente, de 1%
en peso a 30% en peso de sales inorgánicas, más particularmente
carbonato de metal alcalino y/o sulfato, y ninguno de los dos
agentes blanqueadores ni activadores de blanqueo.
Otra modalidad preferida del detergente de
acuerdo con la invención es un detergente líquido que contiene 5%
en peso a 35% en peso de constructores orgánicos solubles en agua,
hasta 15% en peso y, más particularmente, de 0.1% en peso a 5% en
peso de constructores inorgánicos insolubles en agua, hasta 15% en
peso y, más particularmente, de 0.5% en peso a 10% en peso de
agente tensoactivo aniónico sintético, de 1% en peso a 25% en peso
de agente tensoactivo no-iónico, hasta 15% en peso
y, más particularmente, de 4% en peso a 12% en peso de jabón y hasta
30% en peso y, más particularmente, de 1% en peso a 25% en peso de
agua y/o solvente miscible en agua y también hasta 10% en peso y,
más particularmente, de 0.01% en peso a 7.5% en peso de un enzima
que estabiliza el sistema. La proteasa en cada una de las
modalidades preferidas citadas anteriormente es una variante F49 que
tiene las sustituciones del aminoácido S3T + V41 + A188P + V193M +
V1991 + L211D.
Los detergentes particulados de acuerdo con la
invención se pueden producir muy fácilmente, mezclando las
partículas individuales en un mezclador estándar, más
particularmente un mezclador de tambor, mezclador de rodillo,
mezclador de cinta o mezclador de caída libre, otros componentes en
forma de polvo opcional y, si se desea, incluso componentes líquido
o licuados, incluyendo en particular agentes tensoactivos
no-iónicos, sino también colorantes y fragancias,
siendo opcionalmente incorporadas por aspersión. Los componentes
capaces de resistir altas temperaturas se convierten
preferiblemente en un producto en forma de polvo de manera conocida,
mediante secado por aspersión de una suspensión acuosa y el polvo
obtenido se mezcla con la proteasa y, opcionalmente, otras
sustancias enzimáticas y otros componentes sensibles al calor,
incluyendo en particular agentes blanqueadores. La incorporación de
constituyentes individuales, mezclando en gránulos o un extruido que
los contiene, también es posible y se prefiere particularmente para
la producción de detergentes de acuerdo con la invención con
densidades aparentes altas de, preferiblemente, 650 g/l a 900 g/l.
Los detergentes fluidos o líquidos de acuerdo con la invención se
pueden producir simplemente mezclando los ingredientes o compuestos
de estos que pueden estar presentes en forma líquida o en la forma
de una solución en agua o un solvente dado.
Una variedad de subtilisinas naturales y otras
serina proteasas se probaron para su eficiencia en el lavado. Los
resultados mostraron que la posibilidad de lavado se relaciona con
el número y distribución de residuos de aminoácidos cargados en la
región de enlace del sustrato. Una mejora en el desempeño del lavado
se vio con un mayor número de residuos de aminoácidos cargados
negativamente o con una disminución del número de residuos de
aminoácidos cargados positivamente en la región de enlace del
sustrato. Por consiguiente, los mutantes BLAP reivindicados aquí
tienen
una reducida carga neta positiva en la región de enlace del sustrato y muestran una mejora en la posibilidad de lavado.
una reducida carga neta positiva en la región de enlace del sustrato y muestran una mejora en la posibilidad de lavado.
El desempeño mejorado del lavado se obtuvo por
la introducción de alteraciones de aminoácido dentro del bolsillo
de unión del sustrato que resultó en una variación en carga. Las
alteraciones se hicieron para los aminoácidos que residen dentro
del bolsillo de unión del sustrato de ya sea la variante BLAP M130 o
la variante BLAP M131. El bolsillo de unión del sustrato de estas
enzimas se define como la región dentro 7 A de un sustrato de
molécula de enlace, AAPF. La AAPF unida a la enzima se modeló sobre
los datos cristalográficos de complejos
subtilisina-inhibidor encontrados en la literatura
y disponibles del Brookhaven Protein Data Bank. La estructura de las
variantes BLAP M130 y M131 dentro del bolsillo de unión del
sustrato es esencialmente idéntica a la BLAP de tipo salvaje
basándose en cristalografía de rayos X. La estructura de BLAP de
tipo salvaje a una resolución 1.4A ha sido publicada en la
aplicación de la patente Serie No. 07/706,691 archivada el 29 de
Mayo, 1991 y las correspondientes coordenadas atómicas depositadas
con el Brookhaven Protein Data Bank. En particular, las alteraciones
de aminoácido en las posiciones 99, 154 y 211 dentro de las
variantes BLAP M130 y M131 se mostraron que potencian el desempeño
del lavado de la enzima. Los aminoácidos parentales que ocupan estos
sitios, Arginina 99, Serina 154, y Leucina 211 se describen en la
Figura 1. Los tres aminoácidos se localizan dentro del radio 7A
específico de AAPF.
Los genes que expresan las proteasas del mutante
B. lentus DSM 5483 de acuerdo con la invención se hacen
mediante la alteración de uno o más codones del gen alcalino de la
proteasa de tipo salvaje B. lentus DSM 5483. La proteasa
M130 se derivó de BLAP por la introducción de las mutaciones S3T,
A188P, V193M y V199I. La proteasa M131 se derivó de BLAP por la
introducción de las mutaciones S3T, V4I, A188P, V193M, y V199I. Los
genes que codifican las proteasas M130 y M131 se construyeron
utilizando el procedimiento pMac (Stanssens, P., Opsomer, C.,
McKeown, Y.M., Kramer, W., Zabeau, M., and Fritz, H.-J. (1989)
Nucleic Acids Res. 17, 4441-4445). Las proteasas
M130 y M131 han sido previamente descritas en la aplicación de la
patente Serie No. 07/706,691 archivada el 29 de Mayo, 1991. Las
proteasas M130 y M131 muestran una mejora en la estabilidad térmica
y del agente tensoactivo sobre la BLAP de tipo salvaje y sirvió
como la base para desarrollar proteasas con desempeño mejorado de
lavado. Las técnicas genéticas utilizadas para modificar el gen BLAP
para producir las proteasas M130 y M131 también han sido descritas
en la aplicación de la patente WO 91/02792.
Las proteasas M130 y M131 se derivaron de la
proteasa alcalina (BLAP) de B. lentus DSM 5483 mediante
mutagénesis del sitio-específico de ADN que
codifica la forma madura de BLAP de tipo salvaje. El fragmento de
ADN que codifica la forma madura de BLAP de tipo salvaje se preparó
utilizando el plásmido pCB13C. El plásmido pCB13C contiene una
fusión híbrida entre el gen de la proteasa de B.
licheniformis ATCC 53926 y el gen BLAP de B. lentus DSM
5483. Específicamente, esta fusión híbrida contiene el ADN que
codifica el promotor, sitio de enlace ribosómico, y 21 residuos de
la pre secuencia del gen de la proteasa ATCC 53926 fusionado a una
secuencia de ADN que codifica los últimos cinco residuos de la pre
secuencia de BLAP y todos los residuos pro y maduros de BLAP. Esta
fusión se refiere como a la fusión ClaI debido a que este sitio de
restricción se localiza en la unión entre los ADN de ATCC 53926 y
DSM 5483. Un nuevo sitio de restricción ClaI tuvo que ser
introducido en el gen alcalino ATCC 53926 de la proteasa cercano a
la unión de las pre y pro secuencias. El sitio C/al se introdujo en
el gen alcalino ATCC 53926 de la proteasa, utilizando la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar un fragmento de ADN
que contiene la información de la secuencia de la parte
N-terminal del gen alcalino ATCC 53926 de la
proteasa. El fragmento amplificado incluyó el promotor de la
proteasa alcalina ATCC 53926, sitio de enlace ribosómico, codón de
iniciación, y más de la pre-secuencia. La secuencia
de ADN de este fragmento se muestra en la Figura 3. Este fragmento
de ADN de 292 bp se flanqueo por los sitios de restricción AvaI y
C/als en sus terminales 5' y 3', respectivamente. El gen BLAP ya
contenido del sitio Clal de origen natural en la posición
correspondiente. El análisis de la secuencia de ADN a través de la
fusión de los genes ATCC 53926 y BLAP confirmó el ADN y las
secuencias de aminoácidos esperados.
Para realizar la mutagénesis, el gen BLAP se
subclona en el vector de mutagénesis pMa5-8. Esto se
logra sintetizando un fragmento de ADN que contiene el gen de la
fusión ClaI y la terminación de la transcripción ATCC 53926 como un
casete SalI utilizando la PCR. La PCR se realizó utilizando las
condiciones como se describen por el fabricante (Perkin Elmer
Cetus, Norwalk, CT). En la PCR, dos oligonucleótidos sintéticos que
llevan los sitios Sa/I se utilizan como cebadores y el ADN del
vector pCB13C de Escherichia coli como una plantilla.
Después del corte del producto de PCR con Sa/l, este fragmento se
clona en el plásmido pMc5-8 mutagénico que se ha
cortado previamente con Sa/I y defosforilado con fosfatasa alcalina
bacteriana. Los plásmidos pMc5-8, y
pMa5-8 se obtuvieron de H.-J. Fritz y se describen
por Stanssens, P., et al. (1989) Nucleic Acids Res.
17, 4441-4454. Los sitios Sa/I se
seleccionan para permitir que el fragmento de PCR sea clonado en el
pMc5-8 en ambas orientaciones. La mezcla de unión
se transforma en E. coli WK6. Los transformantes resistentes
al cloranfenicol (CmR) se seleccionan para la presencia de un
inserto y una construcción correcta del plásmido pMc13C se
identifica. Una vez que el gen se clona en el vector
pMc5-8 y los sitios deseables para la mutación se
identifican, la(s) mutación(s) se introduce utilizando
oligonucleótidos sintéticos de ADN de acuerdo con una modificación
de un protocolo publicado (Stanssens, P., et. al. (1989)
Nucleic Acids Res. 17, 4441-4454). El
oligonucleótido que contiene la(s) mutación(s) que se
introducen se alinea a una estructura bicatenaria incompleta (gd)
que lleva el gen BLAP sobre un segmento de ADN monocatenario (ss).
El bicatenario incompleto se puede formar por hibridación lineal
del ADN ss de pMc13C con ADN de pMa5-8
desnaturalizado y restringido. El plásmido pMa5-8
contiene un gen activo resistente a la penicilina pero tiene un
punto que inactiva la mutación en el gen de resistencia al
cloranfenicol, mientras que el plásmido pMc13C contiene, además a un
gen BLAP intacto, un gen activo de resistencia al cloranfenicol,
pero tiene un punto que inactiva la mutación en el gen resistente a
la penicilina. El producto hibridizado es el ADN gd que en un
heterodúplex bicatenario con un ADN ss discontinuo abarcando el gen
BLAP clonado completo. El oligonucleótido mutante es capaz de
hibridizar con un homólogo de ADNs de BLAP dentro del hueco y el
hueco remanente se llena mediante una polimerasa de ADN I
(fragmento Klenow) y se liga utilizando T4 ADN ligasa (New England
Biolabs Inc., Beverly, MA [NEB]). La eficiencia mutagénica de dicho
sistema se puede mejorar por el uso de Exonucleasa III (Exo III,
NEB). La Exo III es una exodeoxiribonucleasa que digiere el ADN
bicatenario del terminal 3'. Como se necesita un terminal 3' libre,
ADN ss circular cerrado o ADN ds no se afecta por esta enzima. Un
tratamiento posterior del producto de la reacción de relleno con
Exo III elimina cualquier especie con huecos solo parcialmente
llenos. Esto mejora significativamente la eficiencia mutagénica y
es el método de mutagénesis preferido. El producto de la reacción
de relleno entonces se transforma en una cepa E. coli
(WK6mutS) carente de reparación y se seleccionan transformantes
resistentes a la ampicilina (ApR). La replicación de los plásmido
heterodúplex transformado resulta en dos progenies diferentes. Una
progenie contiene el gen BLAP de tipo salvaje y el gen intacto de
resistencia al cloranfenicol, pero un gen inactivo resistente a la
penicilina. La otra progenie contiene un gen BLAP que lleva la
mutación de interés y es resistente a la ampicilina pero no al
cloranfenicol.
La selección de los transformantes mutantes ApR,
CmS con ampicilina no es suficiente para detener algún crecimiento
de fondo de la progenie ApS, CmR que lleva el gen BLAP de tipo
salvaje. Por consiguiente, es necesario realizar una segunda
transformación en E. coli utilizando el ADN del plásmido
preparado de los transformantes ApR de la cepa WK6mutS. Esta
segunda transformación utiliza una baja concentración del plásmido
con un gran número de células receptoras de una cepa deficiente
supresora de E. coli tal como WK6. Esta metodología disminuye
la probabilidad de una célula receptora que reciba el ADN del
plásmido de ambas progenies. Los transformantes ApR se seleccionan
y el ADN del plásmido de varios transformantes se aísla y selecciona
para la presencia de la mutación. El derivado mutante pMa de la
primera ronda de mutagénesis se puede utilizar para una segunda
ronda de mutagénesis, preparando ADN ss de aquella especie e
hibridizarla a XbaI/H indIII restringido y ADN desnaturalizado de
pMc5-8. El plásmido pMc5-8 es
idéntico al pMa5-8 excepto que este contiene un gen
activo de resistencia al cloranfenicol y un gen inactivo resistente
a la penicilina. El procedimiento general es el mismo como aquel
descrito anteriormente. La construcción de los genes que codifican
las proteasas M130 y M131 requiere de dos rondas de mutagénesis. En
la primera ronda de la mutagénesis un oligonucleótido se diseñó
para introducir las mutaciones A188P, V193M, y V1991. En una segunda
ronda de mutagénesis un oligonucleótido se diseñó para introducir
la mutación S3T en el caso de M130 y las mutaciones S3T y V41 en el
caso de M131. La presencia de todas estas mutaciones se verificó,
mediante la secuenciación de ADN.
Las mutaciones R99G, R99A, R99S, S154D, S154E y
L211D se introdujeron en el gen que codifica la proteasa M131
utilizando mutagénesis de PCR mediante extensión traslapada. La
mutación R99S se introdujo en el gen que codifica la proteasa M130
utilizando mutagénesis de PCR por extensión traslapada. La
construcción pCB76M131 se utilizó para construir los mutantes F43,
F44, F45, F46, F47, y F49 (Tabla 2). La construcción pCB76M130 se
utilizó para construir el mutante F11 y la construcción pCB76F49
(un mutante recientemente construido) se utilizó para construir los
mutantes F54 y F55.
Los materiales necesarios para realizar este
procedimiento incluyen: un ADN Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus);
kit GeneAmp (Perkin Elmer Cetus); AmpliWax (Perkin Elmer Cetus); y
tubos de polipropileno estériles de 0.5 ml (Perkin Elmer Cetus);
concentradores Microcon-100 (Amicon, Beverly, MA);
solución reguladora TE (tris 10 mM-(hidroximetil)aminometano
[Tris], etilendiamina disódica ácido tetracético 1 mM (EDTA),
ajustado a pH 8 con HCl 2N); equipo de electroforesis Minigel
(Hoefer Scientific, San Francisco, CA); 1% (peso/vol.) gel agarosa
SeaKem (FMC, Rockland, ME) en solución reguladora TBE (Tris 0.089 M,
ácido bórico 0.089 M, EDTA 2 mM); 0.5 \mug\cdotml^{-1} de
bromuro de etidio en agua; enzimas de restricción Nhel (NEB), XbaI
(NEB); y SstI (BRL, Gaithersburg, MD).
Las PCR se llevaron a cabo utilizando el kit
GeneAmp y AmpliWax como indica por el fabricante. Se sometieron a 1
ciclo de desnaturalización (3 minutos, 95ºC), hibridación (2
minutos, 50ºC) y extensión (2 minutos, 72ºC) y 30 ciclos de
desnaturalización (1 minuto, 94ºC), hibridación (1 minuto, 50ºC) y
extensión (1 minuto, 72ºC) utilizando un ADN Thermal Cycler. Cada
ciclo se extendió por 10 seg. a 72ºC.
La mutagénesis de sitio dirigido por extensión
traslapada se describe por (Ho, S.N., Hunt, H.D., Horton, R.M.,
Pullen, J.K, and Pease, L.R. (1989) Gen 77, 51-59).
Para las BLAP mutantes F43, F44, F45, F46, F47 y F49 10 ng de ADN
del plásmido pCB76M131 se utilizó como plantilla para la ronda
inicial de mutagénesis. Para el mutante F11 de BLAP 10 ng de ADN
del plásmido pCB76M130 se utilizó como plantilla, y para las BLAP
mutantes F54 y F55 10 ng de ADN pCB76F49 se utilizó como plantilla.
Las formas pUB110 de estos plásmidos se seleccionaron debido a que
proporcionan rendimientos más altos de proteasa en el huésped B.
subtilis DB104 que las formas pBC16 de los plásmidos. El
fragmento de PCRs se verificó por electroforesis de gel de agarosa y
se limpió utilizando un concentrador Microcon-100
(Amicon) después de cada ronda de PCR. Después de la segunda ronda
de PCR, los fragmentos se sometieron a digestión con ya sea
Nhel/Xbal o Nhel/Sstl (dependiendo de la localización de la
mutación pretendida) y se clonaron de nuevo en ADN del pCB76M131 en
el caso de los mutantes F43, F44, F45, F46, F47 y F49, ADN de
pCB76M130 en el caso del mutante F11 y pCB76F49 en el caso de los
mutantes F54 y F55 utilizando células competentes de B.
subtilis DB104 como se describe previamente. El aislamiento del
ADN del plásmido se logró utilizando mini columnas de intercambio
iónico (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA) y las mutaciones se
verificaron por secuenciación del ADN ds Sanger como se describe
previamente.
\vskip1.000000\baselineskip
Las proteasas M130 y M131 se pueden producir por
transferencia del gen respectivo que codifica ya sea M130 o M131
del particular vector derivado E. coli pMc13C en un vector
del plásmido que puede replicar en Bacillus. Para lograr
esto, el gen mutante deseado se separa del plásmido pMc13C
apropiado, por digestión con las endonucleasas de restricción
AvaI y SstI, seguido por la unión al fragmento más
grande AvaI/SstI de ya sea el plásmido pH70 o pC51.
Estos fragmentos AvaI/SstI de pH70 y pC51 incluyen las
secuencias de ADN necesarias para la replicación en Bacillus
y codifican tanto la resistencia a la canamisina (Km^{R}) como la
resistencia a la tetraciclina (Tc^{R}), respectivamente. El
plásmido pH70 se construye por clonación del gen alcalino ATCC
53926 de la proteasa llevado en un fragmento
EcoRI/BamHI de ADN en el plásmido pU8110 Km^{R}
entre los sitios EcoRI y BamHI. El plásmido pC51 se construye
por clonación del gen ATCC 53926 de la proteasa llevado en un
fragmento EcoRI/ BamHI en el plásmido pBC16 Tc^{R} entre
los sitios EcoRI y BamHI. El fragmento más grande
AvaI/SstI de tanto pH70 como pC51 utilizado para la
clonación del fragmento de ADN que codifica tanto M130 como M131
primero se purifica de otros fragmentos de ADN del plásmido,
mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en una
columna de intercambio aniónico (Gen-Pak FAX,
diámetro 4.6 mm, largo 100 mm; Waters, Milford, MA). Las
condiciones para la elución del ADN son una velocidad de flujo de
0.75 ml\cdotmin ^{-1} con un gradiente de 50% de Solución
reguladora A (Tris 25 mM, que contiene EDTA 1 mM y ajustado a pH
8.0 con HCl 2N) y Solución reguladora B (Tris 25 mM, que contiene
EDTA 1 mM, NaCl 1 M, y ajustado a pH 8.0 con HCl 2N) a 30% de
Solución reguladora A y 70% de Solución reguladora B en 30 min.
Los dos ADN's ligados se transforman en B.
subtilis DB104. Los genes que codifican las principales
proteasas alcalinas y neutras presentes en esta cepa han sido
inactivadas (Kawamura, F. and Doi, R.A. (1984) J. Bacteriol. 160,
442-444). Las células de B. subtilis DB104
transformadas por estos plásmidos crecieron en un agar nutriente de
leche descremada en la presencia de tanto canamicina como
tetraciclina. Los transformantes de DB104 que fabrican la proteasa
mutante se identifican por la formación de zonas claras de
hidrólisis en la leche descremada. La confirmación de que los
transformantes que producen la proteasa llevan un gen del
plásmido-sostenido M130 o M131 con
la(s)
mutación(s) deseada(s) se logra, purificando el ADN del plásmido de un cultivo de cada transformante. El ADN del plásmido se purifica fuera de la proteína celular y ADN cromosómico por precipitación SDS-sal seguido por la cromatografía sobre una columna de intercambio iónico QIAGEN (QIAGEN,Inc., Chatsworth, CA). Los ADNs del plásmido AvaI/SstI digeridos de diferentes transformantes se comparan con derivados AvaI/SstI-digeridos del plásmido pH70 o pC51 conocidos que llevan un gen intacto BLAP. La restricción digerida de estos plásmidos se compara por electroforesis de gel de agarosa para identificar los plásmidos que tienen el fragmento AvaI/SstI de tamaño apropiado de ADNs. Los seleccionados ADNs del plásmido, entonces se secuencian a través de la región de las mutaciones esperadas M130 o M131 para confirmar que la(s) deseada(s) mutación(es) están presentes. Los genes M130 y M131 clonados en el derivado de plásmido pC51 (TcR) se designan plásmidos pCB56M130 y pCB56M131 respectivamente, mientras los mismos genes clonados en un derivado del plásmido pH70 se designan plásmidos pCB76M130 y pCB76M131 respectivamente. Uno o más clones de cada mutación BLAP se almacenan congelados en 15% glicerol a -70ºC y también se cultivan en matraces oscilantes para producir la proteasa mutante para su caracterización.
mutación(s) deseada(s) se logra, purificando el ADN del plásmido de un cultivo de cada transformante. El ADN del plásmido se purifica fuera de la proteína celular y ADN cromosómico por precipitación SDS-sal seguido por la cromatografía sobre una columna de intercambio iónico QIAGEN (QIAGEN,Inc., Chatsworth, CA). Los ADNs del plásmido AvaI/SstI digeridos de diferentes transformantes se comparan con derivados AvaI/SstI-digeridos del plásmido pH70 o pC51 conocidos que llevan un gen intacto BLAP. La restricción digerida de estos plásmidos se compara por electroforesis de gel de agarosa para identificar los plásmidos que tienen el fragmento AvaI/SstI de tamaño apropiado de ADNs. Los seleccionados ADNs del plásmido, entonces se secuencian a través de la región de las mutaciones esperadas M130 o M131 para confirmar que la(s) deseada(s) mutación(es) están presentes. Los genes M130 y M131 clonados en el derivado de plásmido pC51 (TcR) se designan plásmidos pCB56M130 y pCB56M131 respectivamente, mientras los mismos genes clonados en un derivado del plásmido pH70 se designan plásmidos pCB76M130 y pCB76M131 respectivamente. Uno o más clones de cada mutación BLAP se almacenan congelados en 15% glicerol a -70ºC y también se cultivan en matraces oscilantes para producir la proteasa mutante para su caracterización.
Como se describe arriba, los fragmentos de PCR
amplificados se clonaron de nuevo en plásmidos pCB76M130, pCB76M131
o pCB76F49. Para la expresión en la producción B.
licheniformis de la cepa del fragmento AvaI/SstI que
lleva los genes modificados M130, M131 o F49 se clonan otra vez en
el vector tipo pC51 como se describe previamente.
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La proteína BLAP de tipo salvaje y las proteínas
mutantes se produjeron mediante Bacillus subtilis DB 104
transformados en matraces oscilantes. Un bucle dosificador caliente
se utilizó para pasar cada cepa de mutante de un cultivo criovial
congelado sobre un agar de leche descremada-LB que
contiene ya sea 20 \mug\cdotml^{-1} de canamicina o 15
\mug\cdotml^{-1} de tetraciclina. Las placas se incubaron a
37ºC por 20 a 24 horas. Una única, colonia aislada que produce una
buena zona de hidrólisis de la leche descremada se manipuló en un
frasco erlenmeyer de 250 ml que contiene cerca de 50 ml de Caldo
Luria (LB) que contenía ya sea 20 \mug\cdotml^{-1} de
canamicina o 15 \mug\cdotml^{-1} de tetraciclina. El caldo se
incubó en un New Brunswick Series 25 Incubator Shaker a 37ºC con
agitación a 280 rpm por 7 a 8 horas. 2.5 ml del precultivo turbio se
transfirió en 50 ml de MLBSP que contiene ya sea 20
\mug\cdotml^{-1} de canamicina o 15 \mug\cdotml^{-1} de
tetraciclina en cada una de cuatro matraces de 500 ml amortiguados,
o 5 ml de precultivo se utilizó como un inóculo por 100 ml de caldo
MLBSP con antibiótico contenido en cada uno de los dos 500 ml
matraces amortiguados (un 5%, v/v, se transfiere). Todos los
matraces se incubaron a 240 rpm y 37ºC por 64 horas. Después de 64
horas de incubación, el contenido de un conjunto de matraces para
cada cultivo se consolidó, transfirió a tubos de centrífuga de 50
mL, y se centrifugó a 20,000 x gav. por 15 minutos a 4ºC. El caldo
se filtró a través de Miracloth (Calbiochem Corp., #475855) en un
matraz de 400 mL colocado en hielo. El pH de la solución se ajustó
a 5.8, mediante la adición de ácido acético glacial. Después de 30
minutos de agitación, los desechos finos se eliminaron por
centrifugación a 20,000 x gav por 15 minutos. El volumen del
sobrenadante se registró. Alícuotas de 1 ml se repartieron para el
análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida nativo y
desnaturalizado (PhastSystem, Pharmacia), para la determinación de
la actividad proteolítica total por el método HPE, y por titulación
del sitio activo. El caldo se almacenó en hielo hasta que la
proteasa se pueda purificar. Para un almacenamiento a largo plazo o
para el traslado el caldo se mezcla con un volumen igual de
propano-1,2-diol. La composición
del medio MLBSP utilizado para la producción de BLAP en cultivos en
matraces oscilantes se describe en la Tabla 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Si no se menciona de otro modo, todas las etapas
posteriores se realizaron en hielo o a 4ºC. Las muestras del caldo
como se obtuvieron en el Ejemplo 3 se filtraron a través de un
filtro de 0.2 \mum, y el filtrado se concentró por
ultrafiltración. La membrana de retención tuvo un límite de peso
molecular nominal de 10,000 montados en un casete Minitan
(Millipore) o en una celda de ultrafiltración (Amicon). Para un
posterior traslado o almacenamiento extendido, soluciones del caldo
se mezclaron con un volumen igual de propano-
1,2-diol para estabilizar la proteasa. Por otra
parte, el concentrado se dializó por 16 horas contra fosfato de
sodio 20 mM, pH 7.0 ("solución reguladora de fosfato"), o
contra 20 mM
N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(ácido
2-etanosulfónico) (HEPES), que contiene CaCl_{2}
1 mM y ajustado a pH 7.8 con NaOH ('solución reguladora HEPES'). El
dialisado se clarificó por centrifugación (20,000 x gav. por 10
minutos) y el pH de la solución, si es necesario, se vuelve a
ajustar. Las muestras dializadas contra solución reguladora de
fosfato se equilibraron por 15 minutos con 5% (peso/vol.) de
DEAE-celulosa previamente equilibrada en la misma
solución reguladora para atrapar las proteínas cargadas
negativamente. Después de la eliminación de la
DEAE-celulosa por centrifugación o filtración el
sobrenadante se cargó en una columna de intercambio catiónico
(S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia; diámetro 16 mm,
largo 90 mm, volumen del lecho 18 ml, velocidad de flujo50
ml\cdoth^{-1}) previamente equilibrada con solución reguladora
de fosfato. Las muestras dializadas contra HEPES solución reguladora
se aplicaron directamente a una columna de intercambio catiónico
(S-Sepharose Fast Flow, Pharmacia; diámetro 15 mm,
largo 75 mm, volumen del lecho 13 ml, velocidad de flujo 50
ml\cdoth^{-1}) previamente equilibrada con solución reguladora
HEPES. Cuando todos los subproductos coloreados se eluyeron, la
columna se lavó con 3 a 5 volúmenes de la columna con solución
reguladora de aplicación. La proteasa se eluyó del intercambiador
catiónico, incluyendo NaCl 1.0 M en la solución reguladora de
fosfato o NaCl 0.25 M en la solución reguladora HEPES. Las
fracciones que contienen la enzima activa se mezclaron.
La enzima purificada en solución reguladora de
fosfato se concentró y se le quito la sal por ultrafiltración
utilizando tubos Centricon (límite de peso molecular 10,000;
Amicon). La concentración de la proteína se determinó por el método
de ácido bicincóninico (método BCUn, Pierce Chemical Co., Rockford,
IL). Para la estabilización de la proteasa 50% (v/v) se adicionó
propano-1,2-diol a la solución
stock.
Las fracciones mezcladas con enzima purificada
en solución reguladora HEPES se mezclaron con un exceso de volumen
5 a 8-veces de acetona a -20ºC. La proteína se deja
precipitar por 4 minutos, y la mezcla se centrifugó por 4 minutos a
6,600 x gav. El sobrenadante se desechó, el pellet se expone
brevemente al vacío (aspirador de agua) para retirar más de la
acetona, y el pellet se disolvió en 20 mM ácido
2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), que
contiene CaCl_{2} 1 mM y ajustada a pH 5.8 con NaOH 2N, para dar
una concentración aproximada de la proteína de 30
mg\cdotml^{-1}. La solución se clarificó por centrifugación en
una centrifuga Eppendorf por 3 minutos a toda velocidad (13,000 x
g_{max}) y se almacenaron congelados hasta que se utilizan. La
concentración de la proteína se determinó por el método biuret
(Gornall, A.G., Bardawill, C.S., and David, M.M. (1948) J. Biol.
Chem. 177, 751-766).
\vskip1.000000\baselineskip
La concentración de la enzima activa se
determinó por la titulación del sitio activo con el inhibidor
fenilmetil sulfonilfluoruro. Una solución de la proteasa se preparó
en fosfato de sodio 10 mM, pH 6.5, a una concentración aproximada
de 100 \muM sobre la base de la determinación de la proteína. Las
concentraciones del inhibidor fueron equivalentes a una relación
molar estimada de 0.25, 0.5, 0.75, 1.0 y 1.25. Las mezclas se
dejaron reaccionar por una hora a temperatura ambiente. La
actividad de la enzima residual se midió espectrofotométricamente
por el método AAPF-pNUn (ver más adelante).
\vskip1.000000\baselineskip
Dos ensayos de proteasas diferentes se
utilizaron. Con el método HPE de actividad de la proteasa se
estabilizó a una única concentración de caseina como sustrato. En
el ensayo de AAPF-pNA inicial de los índices de
catálisis sostenidas de
succinil-L-alanil-L-alanil-L-prolil-L-fenilalanil-
p -nitroanilida (AAPF-pNA; Bachem Bioscience,
Philadelphia, PA) se utilizaron para determinar los parámetros
cinéticos K_{m}, k_{cat}, y k_{cat}/K_{m}.
La actividad proteolítica se determinó por un
ensayo discontinuo utilizando caseina como un sustrato. Las
concentraciones finales de la solución del sustrato fueron de 12
mg.ml^{-1} de caseina (preparada de acuerdo con Hammarsten;
Merck, Darmstadt, #2242) y Tris 30 mM en agua potable sintética. El
agua potable sintética es una solución de 0.029% (peso/vol.) de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0.014% (peso/vol.) de
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O, y 0.021% (peso/vol.) NaHCO_{3} con
una dureza de 15ºdH. La solución del sustrato se calienta a 70ºC y
el pH se ajusta a 8.5 a 50ºC utilizando NaOH 0.1 N. La solución de
la proteasa se prepara con 2% (peso/vol.) de tripolifosfato
pentasodio anhidro en agua potable sintética, ajustado a pH 8.5 con
ácido clorhídrico. Para 600 \mul de solución de caseina del
sustrato 200 \mul de solución de enzima se adiciona. La mezcla se
incuba a 50ºC por 15 minutos. La reacción se termina por la adición
de 600 \mul de 0.44 M ácido tricloroacético (TCA), acetato de
sodio 0.22 M en 3% (v/v) de ácido acético glacial. Después de
enfriar en hielo por 15 minutos, la proteína insoluble en TCA se
retira por centrifugación, una alícuota de 900 \mul se mezcla con
300 \mul de NaOH 2N y la absorbancia de esta mezcla que contiene
los péptidos solubles en TCA se registra a 290 nm. Los valores de
control se producen adicionando 600 \mul de solución de TCA a 600
\mul de solución de caseina seguido por 200 \mul de solución de
enzima.
Una solución de la proteasa que produce, bajo
las condiciones de este ensayo un cambio de absorbancia de 0.500 OD
a 290 nm se declara que tienen una actividad de 10 HPE por ml. Los
datos para las proteínas de los mutantes BLAP y BLAP se resumen
abajo (Tabla 4).
Las muestras de proteasa se diluyeron con 50%
(v/v) de 1,2-propanediol en Tris 100 mM, se ajusta
con HCl 2N a pH 8.6 a 25ºC ("solución reguladora
Tris-propanodiol"), en los que fueron estables
por al menos 6h a temperatura ambiente. Una solución stock de 160
mM AAPF-pNA se preparó en dimetilsulfóxido seco
sobre cuentas de tamiz molecular (Aldrich; 4 A, 4-8
malla) por al menos 24h previo al uso. Los puntos de ensayo fijos se
realizaron a 25ºC con AAPF-pNA 1.6 mM en Tris 100
mM, se ajusta con HCl 2N a pH 8.6 a 25ºC, en un volumen total de
1.020 ml. El sustrato se adicionó a la solución reguladora de
ensayo 1 minuto antes de el inicio del ensayo y la reacción se
comenzó por la adición de la enzima a una concentración final de 20
ng a 1.3 \mug de proteína por ml (0.75 a 48.5 nM enzima)
dependiendo de la actividad específica. La liberación de la
p-nitroanilida se monitoreó a 410 nm, y un
coeficiente de extinción molar de 8,480 M^{-1}cm^{-1} se utilizó
para calcular la cantidad y concentración del producto formado
(DelMar, E.G., Largman, C., Brodrick, J.W., y Geokas, M.C. (1979)
Anal Biochem. 99, 316-320).
Los parámetros cinéticos se calcularon de un
registro velocidad vs. concentración del sustrato, construido de
índices iniciales medidos una vez cada 12 diferentes concentraciones
de AAPF-pNA fluctuando de 0.16 a 3.2 mM. Los datos
se ajustaron a una curva hiperbólica y ponderado proporcionalmente
utilizando el programa ENZFITTER (Leatherbarrow, R.J. (1987)
ENZFITTER. Biosoft, Cambridge, UK). Un peso molecular nominal de
26.8 kDa se utilizó en todos los cálculos que requieren la
interconversión de concentración de la proteína y molaridad de
enzima proteasa (Tabla 4).
Las mutaciones introducidas en el BLAP se
verificaron, mediante el análisis de secuencia de ADN a través de
la cercanía del punto de mutación. Sin embargo, se conoce que
ocurren mutaciones espontáneas fuera de la región de la mutagénesis
de sitio-dirigida y fue imperativo establecer que la
propiedad determinada de un proteasa mutante ciertamente resida con
la secuencia de aminoácido deducida de la secuencia del nucleótido.
Por consiguiente, un mapa tríptico de BLAP se produjo que se
verificó por análisis de la secuencia de aminoácido de cada uno de
los picos individuales y al que todas las proteínas BLAP mutantes se
compararon. No solo en péptidos con \leq 17 residuos de
aminoácido, pero también en péptidos 5T, 7T, y 10T con 48, 44, y 49
residuos de aminoácido, una sustitución única (incluso
conservadora) resultó en un cambio significante en el tiempo de
retención bajo las condiciones de la separación. Particularmente
cercana denominadas se resolvieron por la
co-digestión de cantidades iguales de la referencia
(BLAP) y la proteína mutante.
Una alícuota de hasta 5 mg de proteasa de una
solución stock se colocó en hielo en tubo Eppendorf de
2.2-ml, entonces se mezcla con 1.0 ml de HCl 0.15 N
y agua (ambas heladas) para dar una concentración final de 3.33
mg\cdotml^{-1} de proteína y 0.1 N HCl en un volumen total de
1.5 ml. Después de la mezcla ha sido incubado por 30 minutos, la
proteína se precipitó por la adición de 165 \mul de 50%
(peso/vol.) ácido tricloroacético (TCA) helado. El precipitado se
deja decantar sobre hielo por 5 minutos y luego se forman pellets
por centrifugación durante 4 minutos a 13,000 x g_{max}
(centrifuga Eppendorf). El pellet se lavó una vez con 1 ml de 80%
(v/v) de acetona y se secó brevemente con vacío.
Todas las soluciones reactivos y agua
necesitados para la digestión del tríptico se pasaron a través de un
filtro de 0.45 \mum (Ultrafree- MC, Millipore Products) previo al
uso. El pellet de la proteína desnaturalizada (5 mg; 185 nmol) se
disolvió en 90 \mul del bicarbonato de amonio 0.8 M, que contiene
úrea 8 M. Esta solución se diluyó lentamente con 360 \mul de agua
y luego se pasa por centrifugación a través de un filtro de 0.45
\mum. Las etapas posteriores se llevaron a cabo en microtubos
siliconizados de 0.5-ml (Phenix Res. Products). Una
alícuota de 300 \mul se mezcla con 13 \mul de 2.5
mg\cdotml^{-1} de tripsina en HCl 1 mM (relación de masa de
BLAP:tripsina = 100:1). Para un control, 100 \mul de la solución
de la proteína se mezcla con 4.5 \mul de HCl 1 mM. La alícuota
remanente de 50 \mul de la solución de la proteína se mezcla con 5
\mul de 10% (v/v) de ácido trifluoroacético (TFA) y utilizado
como control de la materia prima. Las dos otras soluciones se
incubaron por 10 minutos a 37ºC. Las reacciones se terminaron
adicionando 30 \mul y 10 \mul de 10% (v/v) de TFA para la
digestión y el control, respectivamente. La mezcla de péptidos se
separó por HPLC de fase reversa.
El equipo de HPLC fue de Waters y consiste de un
automuestreador (modelo 715 Ultra Wisp), un sistema de bomba dual
(modelo 600E) y un detector de arreglo de diodos (modelo 990). El
muestreo y la formación del gradiente se programó por el programa
de software de Waters "990* Powerline". Los péptidos del
tríptico se separaron sobre una columna C18 (Vydac modelo 218TP54;
4.6 x 250 mm; tamaño de partícula 5 \mu; tamaño de poro 300
\ring{A}). En línea con la columna de separación fue un guarda
columna C18 (modelo Vydac 218FSK104, tamaño de partícula 10\mu).
La columna de separación y el guarda columna se alojan en un
conjunto de calentamiento de columna a 301ºC. El sistema de
solvente utilizado fue: Solvente A = 0.1% (v/v) TFA en agua;
Solvente B = 0.08% (v/v) TFA en acetonitrlo. Después de cargar la
muestra de la columna C18 se desarrollo por 3 minutos con Solvente
A seguido por un gradiente de 0 a 35% (v/v) de Solvente B en
Solvente A en 70 minutos. A los 70 minutos el aumento del gradiente
a 100% del Solvente B en 15 minutos y luego se regresa a 100% del
Solvente A en 15 minutos. Previo a la siguiente inyección, la
columna se equilibró por al menos 20 minutos con el Solvente A.
El cambio de absorbancia se registró a 215 nm y
a 280 nm. Las cantidades de mezclas de péptidos separados para
propósitos analíticos y preparitivos fluctuando de 11 \mug (0.4
nmol) a 500 \mug (18 nmol) en un volumen de 5 a 50 \mul a
concentraciones de 2.2 a 10 mg\cdotml^{-1}.
Para la secuenciación del péptido, el eluato fue
fraccionado a mano de acuerdo con el cambio de absorbancia
observado en el registrador adjunto. Previos estudios con
\beta-mercaptoetanol mostraron que el tiempo de
retraso del tiempo de registro con el tiempo de elución del sistema
fue menor de 2 segundos. Las fracciones se concentraron con vacío
en un Speed Vac Concentrator (Savant, Hicksville, NY) a menos de 100
\mul y se llevan a 100 \mul con TFA acuoso para lograr una
concentración final de TFA del 1%. Se tomó cuidado que durante la
concentración las muestras no alcanzan completa sequedad.
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad del mutante de las proteasas a
los tensoactivos se probó con SDS como detergente aniónico típico.
La estabilidad se probó en carbonato de sodio 50 mM, pH 10.5 a 50ºC,
que contiene 1% (peso/vol.) de SDS. La proteínas de la proteasa se
incubaron a una concentración final de la proteína de 0.25
mg\cdotml^{-1}. Periódicamente, una alícuota se retira de la
mezcla de incubación y se diluye en solución reguladora
Tris-propanodiol enfriada en hielo. La actividad
residual de la proteasa se determinó por el ensayo
AAPF-pNA a una concentración del sustrato de 1.1
mM. La estabilidad se expresa como vida media (t1/2) de la actividad
determinada de registros semi-logarítmicos de
actividad residual como función de tiempo.
\vskip1.000000\baselineskip
El desempeño del lavado se probó con una prueba
de lavado especialmente desarrollada utilizando tejidos de muestras
de algodón manchadas con huevo y hollín (ER) y con sangre, leche y
hollín (BMR). Las pruebas de lavado se realizaron en un medidor de
lavado Atlas (tipo LP 2), equipado con recipientes de prueba de
acero inoxidable, que contienen una composición definida de
detergente más la proteasa para ser probada.
El algodón pre-lavado se manchó
con una cantidad definida de lodo y aire-seco por 6
días. Los vasos de laboratorio del medidor de lavado se llenaron
con 1 muestra de tejido manchada y 3 muestras de tejidos de algodón
sin manchas. Se adicionaron diez bolas metálicas (diámetro 10 mm)
para tratamiento mecánico. El tiempo de lavado fue de 30 minutos
con una temperatura final de 30ºC alcanzada después de 4 minutos de
calentamiento.
Los detergentes de lavandería para estas pruebas
fueron de composición típica para uso Europeo (Jakobi, G. and Löhr,
A. (1987) Detergents and Textile Washing, VCH, Weinheim,
Germany). Las concentraciones de un detergente de tejido delicado
para tejidos de fácil-cuidado y coloreados (agentes
tensoactivos aniónicos 5-15% (peso/peso),
1-5% (peso/peso) agentes tensoactivos
no-iónicos), un detergente compacto pesado (8%
(peso/peso) agentes tensoactivos aniónicos, 6% (peso/peso) agentes
tensoactivos no-iónicos, con
tetraacetiletilendiamina (TAED) y perborato de lejía) y un
detergente concentrado super compacto (18% (peso/peso) agentes
tensoactivos aniónicos, 2.5% (peso/peso) agentes tensoactivos
no-iónicos, con TAED y perborato de lejía) fueron
0.5 g, 0.5 g, y 0.4 g, respectivamente, en 100 ml de agua a 16ºdH.
El detergente super compacto es un detergente granulado extruido,
descrito por la aplicación de las patentes número (WO 91/02047, WO
91/13678, WO 93/02176, WO 93/15180, WO 94/01526). En todos los
casos el pH fue 10.4. Una proteasa se adicionó a las soluciones de
lavado en la base de su actividad enzimática medida en HPE a una
relación de 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 700 y 1000 HPE por
gramo de detergente.
Posterior al lavado, el tejido se enjuagó con
corridas de agua potable, aire-seco y se planchó. El
efecto de lavado enzimático se determinó por el cambio
(\DeltaRem) de la remisión (%Rem) a 440 nm
(400-500 nm) medidos en un instrumento de medición
de diferencia de color Dr. Lange (Micro Color). \DeltaRem es la
diferencia en remisión después del lavado con la proteasa añadida y
la remisión después de lavado sin proteasa añadida. Los resultados
de las pruebas de desempeño de lavado se presentan en la Tablas 5 y
6.
La mejora en el desempeño de lavado se determinó
por la relación de enzima de tipo salvaje necesaria para lograr un
\DeltaRem estándar, contra la cantidad de enzima mutante para
lograr un efecto idéntico. De esta manera una mejora de 2 indica
que mitad de la enzima mutante si se necesita para conseguir el
mismo efecto como con la enzima de tipo salvaje.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Una composición enzimática de detergente se
prepara mezclando cerca de 30% en peso de una preparación
concentrada de un proteasa mutante como se define en la
reivindicación 6, con cerca de 5% en peso de celulosa, 5% en peso
de sacarosa, 20% en peso de harina de trigo, 30% en peso de almidón,
5% en peso de carboximetilcelulosa y 5% de polietilenglicol (mw
20,000). La mezcla resultante se granula por granulación de
extrusión. Después del secado, el granulado tien una actividad de
70,000 a 250,000 HPE/g. El granulado se recubre con polietilenglicol
(mw 6000) que contiene TiO_{2}. La enzima de proteasa granulada,
entonces se mezcla con 100 g de Detergente Compacto Pesado (Porsil
supra) que contienen perborato de sodio\TAED resultando en
una actividad de la proteasa estándar de 1200 HPE/g.
Una composición enzimática de detergente se
prepara de acuerdo con el Ejemplo 11 excepto la proteasa que se
reemplaza por la proteasa como se define en la reivindicación 7.
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Una composición enzimática de detergente líquido
se prepara mezclando junto con una temperatura ambiente cerca de
13% en peso del ácido alquilbenceno-sulfónico lineal
C_{10}-C_{13}, cerca de 5% en peso de
alquilpoliglicósido(C_{12}-C_{14}),
cerca de 10% en peso de un alcohol polietoxilato C_{13} que tiene
7 unidades EO, cerca de 6% en peso de ácido laurico, cerca de 7% en
peso de ácido oleico, cerca de 5% en peso de trietanolamina, cerca
de 5% en peso de propanodiol 1,2, cerca de 2% en peso de hidróxido
de sodio, cerca de 1% en peso de ácido cítrico, cerca de 7% en peso
de etanol, cerca de 1% en peso de ácido cítrico cerca de 7% en peso
de etanol, cerca de ácido
1-hidroxietano-1,1-difosfónico
y siendo el remanente agua.
El pH de la solución resultante es 8.1 (medidos
como una solución acuosa al 10%). Una cantidad suficiente de la
proteasa como se define en la reivindicación 6 se adiciona para
producir una composición que tiene cerca de 0.5% en peso de
proteasa líquida concentrada (1250 HPE/g).
El índice KC de la proteasa F49 y, por
comparación, el índice KCs de tres proteasas comerciales se
determinó por el método descrito anteriormente. Se obtuvieron los
siguientes resultados:
1 g de lana yam se adicionó a 50 ml de una
solución reguladora de carbonato de sodio que contiene F49 (pH
10.5) con una actividad proteolítica de 5.6 PU/ml y el conjunto se
dejó reaccionar por 1 hora a temperatura ambiente. La cantidad de
aminoácidos liberados y los péptidos luego se determinaron con TNBS
(determinación del control en solución reguladora sin proteasa). El
valor obtenido de lana dañada bajo estas condiciones por la
proteasa BLAP se colocó a 100%. Bajo estas condiciones, la proteasa
F49 tuvo un valor de 31%.
La prueba descrita en el Ejemplo 2 se repitió
utilizando 1 g de seda yam. Los siguientes valores de la seda
dañada se obtuvieron:
En una máquina de lavado MIELE® Electronic W
793, los artículos de ropa de lana se lavaron 9 veces a 40ºC
(dureza de agua 16ºd, relación del licor 1:15) en la presencia de
lavado de balasto de algodón (carga total 1.2 kg). 98 g de un
detergente de color libre de enzima (prueba control), para que 49 ml
de una solución BLAP 140 (prueba de comparación) o una cantidad
activa a partes iguales, expresada en PU de F 49 (invención) ha
sido adicionada, se utilizaron en el licor de lavado. Los tejidos de
lana lavados se secaron y pedazos de dimensiones específicas se
cortaron y pesaron. La reducción en peso, expresada en % del valor
antes del lavado, se muestra en la siguiente Tabla:
a) Mezcla de 80% de lana Merino y 20% de
poliamida
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 4 se repitió utilizando calcetines
grises de lana pura, la proteasas otra vez se utilizaron en
cantidades de igual actividad (1080 PU/g del detergente); en
contraste con el Ejemplo 4, 5 los lavados se llevaron a cabo a
60ºC. La reducción en peso fue solo del 10.7% dónde la proteasa F 49
se utilizó y 40.5% dónde BLAP® se utilizó.
Una solución que contiene 12 g/l del sustrato
(caseina o queratina) y 30 mM de tripolifosfato de sodio en agua
con una dureza de 15ºdH (que contiene 0.058% en peso de
CaCl_{2}\cdot2H_{2}O, 0.028% en peso de
MgCl_{2}\cdot6H_{2}O y 0.042% en peso de NaHCO_{3}) se
calienta a 70ºC y el pH se ajusta a un valor de 8.5 por adición de
NaOH 0.1 N a 50ºC 200 \mul de una solución de la enzima para ser
probada en 2% en peso de solución reguladora de sodio
tripolifosfato (pH 8.5) se adicionaron a 600 \mul de la solución
del sustrato. La mezcla de reacción se incuba por 15 minutos a
50ºC. La reacción luego se termina por adición de 500 \mul de
solución de TCA (0.44 M de ácido tricloroacético y 0.22 M de acetato
de sodio en 3% por volumen de ácido acético) y enfriar (baño de
hielo a 0ºC, 15 minutos). La proteína insoluble en TCA se retira por
centrifugación y 900 \mul de la fase sobrenadante se diluyen con
300 \mul de NaOH 2N. La absorción de esta solución a 290 nm se
determina con un espectrómetro de absorción, el valor cero de
absorción tiene que ser determinado por la medición de una solución
centrifugada preparada mezclando 600 \mul de la solución de TCA
mencionada anteriormente con 600 \mul de la solución del sustrato
mencionada anteriormente y posterior adición de la solución de
enzima.
Los tejidos de algodón
pre-lavado se mancharon con cantidades iguales de
lodo y aire seco por 3 días. Los vasos de laboratorio del
Launderometer se llenaron con 6 muestras de tejidos manchados y de
algodón sin manchas y 10 bolas metálicas (1 cm de diámetro) y se
lavaron en un laundrometer Atlas tipo LP-2 por 30
minutos con una temperatura final de 30ºC, que fue alcanzada
después de 4 minutos de calentamiento. Un formulación de detergente
especialmente fino se utilizó para tejidos coloreados y de fácil
cuidado (0.75 g/100 ml). Un detergente compacto pesado (0.5 g/100
ml) y un detergente concentrado super compacto (0.4 g/100 ml)
también se utilizaron. La composición de los detergentes se
describe en "Detergents y Textile Washing", G. Jacobi & A.
Löhr, VCH, Weinheim, ISBN
0-89573-687-X, 1987.
El agua utilizada fue 16º dH y el pH fue 4. Las actividades de la
enzima de los detergentes fueron 0, 50, 100, 200, 300, 400, 500,
700, y 1000 HPE/g de detergente. Después del lavado, las muestras
de tejido de prueba se enjuagaron con agua potable, aire seco, y se
plancharon. El efecto de lavado enzimático se determinó por el
cambio (\DeltaRem) en la remisión (%Rem) a 440 nm medidos
utilizando un instrumento de medición de diferencia de color Dr.
Lange Micro Color, siendo el \DeltaRem la diferencia en remisión
después del lavado con la proteasa añadida y la remisión después del
lavado sin proteasa. Los resultados de desempeño de lavado para
varios detergentes que contienen la enzima y las composiciones de
detergentes que contienen una combinación de enzimas se dan en la
Tablas 2 y 3 abajo. Cada entrada es una relación de la cantidad de
mutante de enzima que logra un \DeltaRem estándar, contra la
cantidad de la enzima de tipo salvaje para lograr un efecto de
limpieza idéntico. Una entrada de 2 indica que el doble de la enzima
de tipo salvaje fue necesario como un mutante particular para
lograr el mismo efecto de limpieza. Los datos también mostraron que
una composición de detergente que contiene una combinación de
mutantes F46 y F49 produjo un efecto de limpieza mayor que la media
de las enzimas individuales.
\vskip1.000000\baselineskip
Una composición similar como se describe en el
ejemplo 13 se prepara excepto que la proteasa se reemplaza por la
proteasa como se define en la reivindicación 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\bullet WO 9102792 A [0003] [0066]
\bullet WO 9221760 A [0003]
\bullet EP 0260105 A [0006]
\bullet EP 0130756 A [0006] [0006]
\bullet EP 0247647 A [0006] [0006]
\bullet US 4760025 A [0006] [0006]
\bullet EP 0328229 A [0008]
\bullet WO 9100345 A [0008] [0008]
\bullet WO 9211357 A [0009]
\bullet EP 057049 A1 [0009]
\bullet US 201120 A [0028]
\bullet US 5340735 A [0028] [0029] [0029]
\bullet WO 9102047 A [0097]
\bullet WO 9113678 A [0097]
\bullet WO 9302176 A [0097]
\bullet WO 9315180 A [0097]
\bullet WO 9401526 A [0097]
\bullet US 08201120 B [0113]
\bullet US 08373818 B [0113]
\bulletBETZEL, C.; PAL, G.P.;
SAENGER, W. Eur. J. Biochem., 1988, vol. 178,
155-171 [0002]
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7895-7906 [0002]
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\bulletDELMAR, E.G.; LARGMAN,
C.; BRODRICK, J.W.; GEOKAS, M.C. Anal Biochem.,
1979, vol. 99, 316-320
\global\parskip0.000000\baselineskip
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- APLICANTE: Wilson, Charles R
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Proteasas con Rendimiento de Lavado Mejorado
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Henkel Corporation
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 140 Germantown Pike, Suite 150
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Plymouth Meeting
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: Pennsylvania
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 19462
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE APLICACIÓN ACTUALES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE APLICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE ARCHIVO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- ABOGADO/INFORMACIÓN DEL AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Drach, John E.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 32891
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: H0587
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 215-832-2215
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 215-941-6067
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, R99S, A188P, V193M, V199I
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N0:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, V41, R99G, A188P, V193M, V1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, V41, R99A, A188P, V193M, V1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, V41, R99S, A188P, V193M, V1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, V41, S154E, A188P, V193M, V1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, V41, S154D, A188P, V193M, V1991
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, V41, A188P, V193M, V1991, L211D
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, V41, R99G, A188P, V193M, V1991, L211D
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 807 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5483
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: S3T, V41, S154E, A188P, V193M, V1991, L211D
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F11
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F43
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F44
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F45
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F46
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F47
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F49
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F54
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 269 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Serina Proteasa
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CEPA: Bacillus lentus DSM 5843
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CLON: F55
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Henkel Kommanditgesellschaft auf
Aktien
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Enzimas mejoradas y detergentes que
las contienen
\vskip0.400000\baselineskip
<130> H 587/876/939 PCT/EP
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 95912559.2
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1995-02-23
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/201120
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1994-02-24
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 08/373818
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1995-01-17
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F44
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F46
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F49
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F55
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F49
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F54
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone F55
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone M130
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 807
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone M131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone M130
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus lentus DSM 5483
clone M131
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1727
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis ATCC
53926
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 5'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (240)..(313)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (314)..(1450)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> sigpéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (314)..(397)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> matpéptido
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (626)..(1447)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> terminal
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1394)..(1563)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> 3'UTR
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1451)..(1727)
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc rasgo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (84)..(89)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción Ava I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc rasgo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (376)..(381)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción Cla I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc rasgo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (638)..(643)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción Nco I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mis crasgo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (950)..(955)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción Kpn I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mis crasgo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1394)..(1399)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción Kpn I
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> mis crasgo
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1558)..(1563)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sitio de restricción Kpn I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bacillus licheniformis ATCC
53926
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (34)
1. Una proteasa subtilisina mutante,
caracterizado por al menos una alteración de aminoácido que
resulta en una carga positiva reducida o un carga negativa
aumentada en la región del bolsillo de unión del sustrato, en donde
dicha alteración de aminoácido es L211D de acuerdo con la numeración
de la SEQ ID NO. 22.
2. La proteasa mutante de acuerdo con la
reivindicación 1, derivada de la proteasa descrita por la SEQ ID
NO. 22 por la siguiente alteración del aminoácido: L211D.
3. La proteasa mutante de acuerdo con la
reivindicación 1, derivada de la proteasa descrita por la SEQ ID
NO. 24 por la siguiente alteración de aminoácido: L211D,
preferiblemente una proteasa descrita por la SEQ ID NO. 16, SEQ ID
NO. 17 o SEQ ID NO. 18.
4. La proteasa mutante de acuerdo con la
reivindicación 1, derivada de la proteasa descrita por la SEQ ID NO
23 por una de las siguientes alteraciones adicionales de aminoácido:
R99G, R99A o R99S.
5. Gen que codifica por un proteasa mutante de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
preferiblemente descrita por la SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID
NO. 9.
6. Gen híbrido, que comprende, en la dirección
de transcripción, un promotor, un sitio de enlace ribosómico, un
codón de iniciación, la principal porción de la
pre-región de la SEQ ID NO. 25 ligada operablemente
a una porción de una pre región y todas las pro y regiones maduras
del gen respectivo de acuerdo con la reivindicación 5 seguido por
la transcripción de la secuencia de terminación del gen de la
proteasa SEQ ID NO. 25.
7. Plásmido capaz de una replicación en especies
del género Bacillus en donde dicho plásmido lleva un gen de
proteasa mutante de acuerdo con la reivindicación 6.
8. Un huésped transformado del género
Bacillus que comprende un plásmido de acuerdo con la
reivindicación 7.
9. Una célula de huésped Bacillus
transformada de acuerdo con la reivindicación 8 en donde dicha
célula de huésped es el Bacillus licheniformis ATCC
53926.
10. Una célula de huésped Bacillus
transformada de acuerdo con la reivindicación 8 en donde dicha
célula de huésped es el Bacillus subtilis.
11. Una composición de detergente que comprende
al menos un agente tensoactivo y una proteasa subtilisina mutada de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
12. Una composición de detergente de acuerdo con
la reivindicación 11 que comprende una cantidad activa
proteolíticamente de dicha proteasa mutada en donde dicha proteasa
tiene un índice de actividad queracinasa/caseinasa (índice KC)
inferior del 0.80, preferiblemente inferior del 0.70, por otro lado
preferiblemente entre 0.2 y 0.65.
13. Una composición de detergente de acuerdo con
la reivindicación 12 para el lavado de tejidos compuestos de fibras
proteinogénicas.
14. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en donde dicha proteasa
tiene una actividad proteolítica de 100 PU/g a 7500 PU/g.
15. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 donde dicha proteasa se
codifica por la SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17 o SEQ ID NO. 18,
preferiblemente SEQ ID NO. 16.
16. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en donde al menos dicho
agente tensoactivo comprende un agente tensoactivo
no-iónico seleccionado del grupo que consiste de un
poliglicósido alquilo graso, un polialcoxilato alquilo graso, un
polihidroxamida de ácido graso, una alquilamina grasa etoxilada,
una alquilamina grasa propoxilada, un diol vicinal etoxilado, un
diol vicinal propoxilado, un alquiléster de ácido graso etoxilado,
un alquiléster de ácido graso propoxilado, una amida de ácido graso
etoxilado, una amida de ácido graso propoxilado, y mezclas de
estos.
17. Una composición de detergente de acuerdo con
la reivindicación 16 en donde dicho agente tensoactivo
no-iónico esta presente en una cantidad del 2% al
25% en peso.
18. Una composición de detergente de acuerdo con
la reivindicación 16 o 17 que además comprende un agente
tensoactivo aniónico seleccionado del grupo que consiste de un
alquilsulfato graso, un alquiletersulfato graso, un éster de ácido
graso sulfo, una disal de ácido graso sulfo, y combinaciones de
estos.
19. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 en donde al menos dicho
agente tensoactivo se comprende de un agente tensoactivo aniónico
seleccionado del grupo que consiste de un alquilsulfato graso, un
alquiletersulfato graso, un éster de ácido graso sulfo, una disal de
ácido graso sulfo, y combinaciones de estos.
20. Una composición de detergente de acuerdo con
la reivindicación 18 o 19 en donde dicho agente tensoactivo
aniónico esta presente en una cantidad del 2% al 25% en peso.
21. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20 en donde dicho agente
tensoactivo aniónico se selecciona del grupo que consiste de un
alquilsulfato, un alquenilsulfato, un alquiletersulfato, un
alqueniletersulfato en donde el grupo alquilo o alquenilo contiene
de 8 a 22 átomos de carbono, preferiblemente de 12 a 18 átomos de
carbono.
22. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 21 que además comprende un
constructor seleccionado del grupo que consiste de un
aluminosilicato de metal alcalino, un silicato metal alcalino
cristalino con un módulo superior de 1, un policarboxilato
monomérico, un policarboxilato polimérico y mezclas de estos.
23. Una composición de detergente de acuerdo con
la reivindicación 22 en donde dicho constructor esta presente en
una cantidad del 2.5% al 60% en peso.
24. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 23 que además comprende del
20% al 55% en peso de un constructor inorgánico; hasta 15% en peso
de un constructor orgánico soluble en agua; del 2.5% a 20% en peso
de un agente tensoactivo aniónico; de 1% a 20% en peso de un agente
tensoactivo no-iónico; hasta 25% en peso de un
agente blanqueador; hasta 8% en peso de un activador de blanqueo;
hasta 20% en peso de una sal inorgánica; de 0.4% a 1.2% en peso de
enzimas, preferiblemente lipasas, cutinasas, amilasas, celulasas,
pululanasas, oxidasas, peroxidasas o mezclas de estos.
25. Una composición de detergente de acuerdo con
la reivindicación 24 en donde dicha sal inorgánica es un carbonato
de metal alcalino, un hidrógenocarbonato de metal alcalino, o un
sulfato de metal alcalino.
26. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 25 que adicionalmente
comprende una segunda proteasa subtilisina mutante, en donde dicha
segunda proteasa mutante se caracteriza por al menos una
alteración de aminoácido que resulta en una carga positiva reducida
o una carga negativa aumentada en la región del bolsillo de unión
del sustrato, y se selecciona del grupo de las alteraciones de
aminoácido R99D, R99E, R99G, R99A, R99S de acuerdo con la numeración
de la SEQ ID NO. 22, o es una variante con las alteraciones de
aminoácido S3T/V4I/S154E/A188P/V193M/V199I o
S3T/V4I/S1S4D/A188P/V193M/V199I.
27. Una composición de detergente de acuerdo con
la reivindicación 26 donde dicha primera proteasa mutante se
codifica por la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO. 16.
28. Una composición de detergente de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 26 a 27 donde dicha segunda
proteasa mutante se codifica por la secuencia de aminoácido de la
SEQ ID NO. 14.
29. Una composición que comprende una primera y
una segunda proteasa subtilisina mutante, en donde dicha primera
proteasa mutante es una proteasa mutante de acuerdo con las
reivindicaciones 1-4 y en donde dicha segunda
proteasa mutante se caracteriza por al menos una alteración
de aminoácido que resulta en una carga positiva reducida o una
carga negativa aumentada en la región del bolsillo de unión del
sustrato, seleccionado del grupo de las alteraciones de aminoácido
R99D, R99E, R99G, R99A, R99S de acuerdo con la numeración de la SEQ
ID NO. 22, o es una variante con las alteraciones de aminoácido
S3TN41/S154EIA188P/V193M/V1991 o
S3T/V41/S154D/A188P/V193M/V199I.
30. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 29 donde dicha primera proteasa mutante se codifica
por la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO. 16.
31. Una composición de acuerdo con la
reivindicación 29 o 30 donde dicha segunda proteasa mutante se
codifica por la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO. 14.
32. Un método para el lavado de tejidos que
comprende el contacto de dicho tejido con una composición de
detergente de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a
28.
33. Un método para el lavado de tejidos de
acuerdo con la reivindicación 32 en donde dichos tejidos son
compuestos de fibras proteinogénicas.
34. Un método de acuerdo con las
reivindicaciones 32 o 33 para eliminar las manchas de la ropa que
tiene ambas manchas de sangre y huevo.
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