WO2000031276A1 - GENE CODANT POUR UNE α-AGARASE ET SON UTILISATION POUR LA PRODUCTION D'ENZYMES DE BIODEGRADATION DES AGARS - Google Patents

GENE CODANT POUR UNE α-AGARASE ET SON UTILISATION POUR LA PRODUCTION D'ENZYMES DE BIODEGRADATION DES AGARS Download PDF

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WO2000031276A1
WO2000031276A1 PCT/FR1999/002935 FR9902935W WO0031276A1 WO 2000031276 A1 WO2000031276 A1 WO 2000031276A1 FR 9902935 W FR9902935 W FR 9902935W WO 0031276 A1 WO0031276 A1 WO 0031276A1
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agarase
protein
dna
agaa
fragments
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PCT/FR1999/002935
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Didier Flament
Tristan Barbeyron
Philippe Potin
Jean-Claude Yvin
Bernard Kloareg
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Laboratoires Goemar S.A.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01158—Alpha-agarase (3.2.1.158)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)

Definitions

  • the present invention relates to a new gene, coding for an ⁇ -agarase, and its use for the production of enzymes for biodegradation of agars.
  • Rhodophyceae such as agars and carrageenans
  • agars and carrageenans represent the major polysaccharides of Rhodophyceae and are very widely used as gelling agents or thickeners in various branches of activity, in particular the food industry.
  • About 6,000 tonnes of agars and 22,000 tonnes of carrageenans are extracted from marine red algae annually for this purpose.
  • Agars are produced industrially from red algae of the genera Gelidium and Gracilaria.
  • Carrageenans are largely extracted from the genera Chondrus, Gigartina and Eucheuma.
  • Agaro-colloids are polysaccharide complexes composed of agars and agaroids. Only agars have the property of forming thermoreversible gels. These polysaccharides are made up of chains in which molecules of D-galactose and 3,6-anhydro-L-galactose alternate regularly. These two sugars are linked together by a ⁇ -1,4 sugar link. This dimer, thus formed, is itself linked to another identical dimer by an ⁇ -1,3 osidic bond.
  • Agar is a mixture of these polysaccharides with a greater or lesser proportion (depending on the source) of sulphate, pyruvate, methyl or other radicals, which make them electrically charged polymers.
  • the term agarose is reserved for a polymer completely free of these radicals, which makes it an electrically neutral polymer.
  • Agar gel is formed when, at low temperature, the chains are organized into double helices maintained by hydrogen bonds.
  • ⁇ -agarases There are two types of enzymes capable of degrading agars: ⁇ -agarases and ⁇ -agarases.
  • the ⁇ -agarases act on the ⁇ -1,4 bond and the ⁇ -agarases on the ⁇ -1,3 bond.
  • Microorganisms producing enzymes capable of hydrolyzing agars have already been isolated. This ability to digest agar has been attributed to the genera Pseudomonas, (MORRICE et al., Eur. J. Biochem. 137, 149-154, (1983)), Streptomyces (HODGSON and CHATER, J. Gen. Microbiol. 124 , 339-348, (1981)), Cytophaga (VAN DER MEULEN and HARDER, J. Microbiol. 41, 431-447, (1975)) and Vibrio (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59, 1549- 1554, (1993)).
  • the Applicant has now isolated a gene coding for an ⁇ -agarase from the bacterium "Alteromonas agarilytica" strain GJIB deposited in the Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) on 11/05/1998 under number DSM 12513.
  • the subject of the present invention is the new agaA gene having the DNA sequence SEQ ID No. 1 which codes for an ⁇ -agarase called the AgaA protein, having the sequence SEQ ID No. 2.
  • a subject of the present invention is also the nucleic acid sequences, namely the genomic DNA sequences, the DNA or mRNA sequences which comprise or consist of a sequence of nucleotides encoding the AgaA protein or for l 'any of its peptide fragments as defined below.
  • the invention relates to all nucleic acid sequences encoding the entire AgaA protein, or one or more of its peptide fragments. These sequences are preferably represented by: a) the DNA sequence SEQ ID No. 1 coding for the AgaA protein and the DNA fragments coding for the peptide fragments of said protein; b) DNA sequences hybridizing under specific stringency conditions with the above sequence or one of its fragments; c) DNA sequences which, due to the degeneracy of the genetic code, derive from one of the sequences a) and b) above and encode the AgaA protein or fragments thereof; and d) the corresponding mRNA sequences.
  • the nucleic acids according to the invention can be prepared by chemical synthesis or genetic engineering using techniques well known to those skilled in the art and described for example in SAMBROOK et al. ("Molecular Cloning: a Laboratory Manual” Ed. Cold Spring Harbor Press, NY, 1989).
  • the synthesis of the DNA sequences according to the invention can be carried out by amplification of the GJIB "Alteromonas agarilytica" genes using the PCR (Polymerase Chain Reaction) method, as described for example by GOBLET et al. (Nucleic Acid Research, 17, 2144, (1989)) using synthetic oligonucleotides as primers, defined from the DNA sequence SEQ ID No. 1.
  • the nucleic acid fragment thus amplified can then be cloned into an expression vector according to the techniques described in MANIATIS et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, NEW YORK (1982)).
  • the invention also relates to prokaryotic cells and eukaryotic cells transformed using an expression vector containing a nucleic acid sequence according to the invention.
  • This expression vector which may for example be in the form of a plasmid, must comprise, in addition to the nucleic acid sequence of the invention, the means necessary for its expression, such as in particular a promoter, a terminator of transcription, an origin of replication and preferably a selection marker.
  • prokaryotic cells and eukaryotic cells are a technique well known to those skilled in the art who can easily determine, depending on the microorganism to be transformed, the means necessary for the expression of the DNA sequence according to the invention.
  • the prokaryotic microorganisms preferred for the purposes of the invention are
  • eukaryotic cells which are suitable for the purposes of the invention, there may be mentioned in particular the cells of Aspergillus niger, Trichoderma viridae or Pichia pastoris.
  • the present invention also relates to the new AgaA protein from "A. agarilytica” which comprises the amino acid sequence SEQ ID No. 2.
  • the new AgaA protein is made up of 1429 amino acids and has a theoretical molecular mass of 154.67 kDa. After elimination of the signal peptide, this protein has a calculated molecular mass of 151.91 kDa.
  • the present invention also relates to the peptide fragments of the AgaA protein resulting from the addition, deletion and / or replacement of one or more amino acids, said peptide fragments having retained the ⁇ -agarase activity.
  • proteins and peptide fragments according to the invention can be obtained by genetic engineering techniques which comprises the steps of: culture of prokaryotic cells or of eukaryotic cells transformed with an expression vector having a nucleic acid sequence according to the invention and
  • FIGS. 1 to 4 The description below will be better understood with the aid of FIGS. 1 to 4 in which:
  • FIG. 1 is a photograph of an SDS-PAGE electrophoresis gel of the positive ⁇ -agarase fractions of "A. agarilytica” from affinity and ion exchange chromatographies.
  • FIG. 2 shows the physical map of the nucleotide probe used to identify the ⁇ -agarase positive clones in the genomic library of "ag. agarilytica” and that of a genomic clone of "A agarilytica” exhibiting agarase activity ;
  • Figure 3 gives the nucleotide sequence and the amino acid sequence deduced from the ⁇ -agarase gene from "A. agarilytica";
  • FIG. 4 shows the elution profile of the hydrolysis products of agarose by ⁇ -agarase from the strain "A. agarilytica” according to the invention.
  • Example 1 isolation, culture of the strain "Alteromonas agarilytica" DSM 12513 and extraction of its DNA
  • GJIB DSM 12513 was isolated from Great Bay seawater -
  • the bacterium is Gram-negative, aerobic and has the shape of a rod mobile by a polar flagellum.
  • the GJIB strain has morphological, biochemical and physiological characteristics similar to those of the Vibrio agarlyticus strain (CATALDI, Rev.
  • the culture of the strain was carried out at 22 ° C on the modified BSM medium
  • the bacteria were centrifuged at 3000 g for 15 minutes, then washed in sterile sea water. The cells underwent a final centrifugation, identical to the previous one, and were treated immediately or frozen at -20 ° C.
  • the DNA was immediately protected by the addition of 100 mM ethylenediaminetetraacetic acid (final concentration) and the incubation was continued in ice for another 10 minutes.
  • the lysis was completely completed by the addition of 2% sodium dodecyl sulphate (final concentration) and 25 ml of lysis solution (Tris-HCl, pH 8, 50 mM; ethylenediaminetetraacetic acid 100 mM; sodium chloride 100 mM ).
  • the proteins were fully denatured by a 1 hour incubation at 50 ° C. in the presence of 40 mg of proteinase K. At the end of this incubation, 1 M (final concentration) of sodium perchlorate was added so that the DNA bonds -proteins are broken.
  • the solution was deproteinized with stirring in the presence of 0.5 volumes of saturated phenol for 5 minutes.
  • the agitation was done manually and had to be sufficiently energetic, without being so energetic as not to tear the DNA, to form an emulsion (without which there could be no extraction).
  • the deproteinization was continued for a further 5 minutes after adding 0.5 volumes of chloroform / isoamyl alcohol (24/1).
  • the proteins were concentrated at the interface between the aqueous phase and the organic phase, by centrifugation for 15 minutes at 10,000 g at room temperature.
  • the aqueous phase containing the nucleic acids was transferred to a clean tube with a pipette whose tip was enlarged so as not to tear the DNA.
  • the deproteinization was continued and the traces of phenol were extracted from the aqueous phase, by stirring the solution for 5 minutes in the presence of 1 volume of chloroform / isoamyl alcohol (24/1).
  • the aqueous phase was removed with the same precautions as above, and the nucleic acids were precipitated by gently pouring 0.6 volumes of isopropanol (so as to form two phases ).
  • the high molecular weight DNA was collected with a glass rod, washed in 70% ethanol, dried in absolute ethanol and air dried.
  • the DNA composition expressed as a molar percentage of guanine + cytosine (mol% G + C), was determined by the spectroscopic method of ULITZUR (Biochem. Biophys. Acta 272, 1-11, (1972)) and the cesium chloride gradient process in the presence of 2 '- [4-hydroxyphenyl] -5- [4-methyl-1-piperazinyl] - 2,5'-bi-1H-benzimidazole (Hoechst 33258 / Sigma) (KARLOVSKY and DE COCK, Anal. Biochem. 194, 192-197, (1991)). In the first case, it is 47% ⁇ 2 (average of 2 manipulations) and in the second case of 37.5% ⁇ 1.5. This molar percentage G + C was calculated using DNA from E. coli as standard reference.
  • the agarase activity of the strain was induced in a modified BSM medium supplemented with 2.5 g / l of agar.
  • a strain is considered to exhibit agarase activity when it digests the agar on which it grows.
  • the agarase strain was grown in 2.5 L of the above medium at 22 ° C. The culture was centrifuged at 1000 xg for 20 minutes. The culture supernatant was recovered and concentrated to 100 ml by tangential ultrafiltration (cutoff threshold: 10 kDa), followed by precipitation with ammonium sulfate (70% saturation). The protein pellet was resuspended in 10 ml of buffer A (Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM, 25 mM CaCl 2). After removing the insoluble material, 1 ml of balanced CL6B Sepharose was added in buffer A in order to carry out affinity chromatography. The ⁇ -agarase activity was fixed at Sepharose for 30 minutes at 4 ° C with gentle stirring.
  • buffer A Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM, 25 mM CaCl 2
  • the Sepharose beads were then centrifuged at 200 g for 5 minutes, taken up in 5 ml of buffer A and poured into a glass column. After several washes in buffer A, the ⁇ -agarase activity was eluted from the column by passing through it a solution of oligoagars at pH 7.2 obtained by digesting an agar solution at 5 g / 1 with unpurified ⁇ -agarase from "A. agarilytica" (the pellet obtained in 70% ammonium sulfate). The positive ⁇ -agarase fractions (24 ml) were subjected to ion exchange chromatography (Mono Q) in buffer B (Tris-HCl, pH 7.2, 10 mM, CaCl 2 5 mM). After washing, the activity was eluted with a sodium chloride gradient (0 to 500 mM NaCl) in buffer B (1 ml min). The ⁇ -agarase activity was eluted at an NaCl concentration of 350 mM.
  • the agarase activity of the different fractions from the two chromatographies was tested by depositing aliquots of these fractions on an agarose gel and by an assay of the reducing sugars according to the technique of KJDBY & DAVIDSON (Annal. Biochem., Vol. 55, 321-325 (1973)). However, this test was most often found to be negative after the last step of ion exchange chromatography and was advantageously replaced by a viscosimetric test.
  • Electrophoresis on SDS-PAGE was carried out with the fraction eluted from the second column. This presented a main strip with a mass of around 180 kDa ( Figure 1). This protein has been microsequenced.
  • the sequence obtained from the NH -terminal peptide is ETLELQAESFANSGG and that of the internal peptide is
  • Agarose was placed in the presence of ⁇ -agarase at the rate of 0.2U / mg of polysaccharide for 15 hours (1 enzymatic unit U is the quantity of enzyme which produces an increase in absorbance of 0.1 unit optical density at 237 nm during the test of reducing sugars).
  • the hydrolyzate was cooled in ice and centrifuged at 15,000 g for 20 minutes.
  • the supernatant was concentrated and fractionated by exclusion chromatography on a column of Bio-Gel P2. Distilled water was used as the mobile phase and detection was carried out by recording the refractive index.
  • the chromatogram of the final products of hydrolysis of agarose by purified ⁇ -agarase is represented in FIG. 4.
  • the major peak n ° 1 was identified as being agarotetraose on the basis of the results obtained by NMR of the l3 C (Nuclear Magnetic Resonance of carbon 13).
  • Minor peaks 2 and 3 were identified as C 6 methylated agarotetraose and agarohexaose respectively.
  • the presence of the methylated oligosaccharide comes from the source of agarose used which is an agarose abnormally contaminated with methylated agar.
  • agarilytica is specific for the ⁇ -1,3 binding in agarose and in certain agars.
  • ⁇ -agarase of "A. agarilytica” was incapable of degrading agarotetraose, agarohexaose, K-carrageenan, i-carrageenan, ⁇ -carrageenan or agar extracted from l red alga Gracilaria Vietnameseoides (C 2 methylated agar of the 3,6-anhydro-L-galactose residue and C 4 sulfated of the D-galactose residue).
  • EXAMPLE 4 Cloning of the ⁇ -agarase Gene
  • a genomic DNA library of the strain of "A. agarilytica” was prepared.
  • the recombinant clones (approximately 6000) of the DH5 ⁇ strain of E. coli (SAMBROOK et al., supra) were independently inoculated on microtiter plates in LBA medium (Luria-Bertani medium (MANIATIS et al., supra) supplemented with ampicillin at a concentration of 50 ⁇ g / ml). After incubation overnight at 37 ° C, these clones were subcultured on N + N nylon membranes deposited on LB medium (Luria-Bertani medium) in the presence of 50 ⁇ g / ml, then returned to 37 ° C overnight. The membranes were recovered and the colonies which appeared on their surface were lysed.
  • the membranes were hybridized with a radioactive probe specific for the ⁇ -agarase gene.
  • This probe was obtained by PCR with degenerate synthetic oligonucleotides, the sequences of which were determined from the microsequencing of the NH -terminal fragment and of an internal fragment of the purified AgaA protein (cf. example 2); this PCR fragment was cloned. Two positive clones have been identified. These clones were subcultured at 22 ° C.
  • FIG. 2 The maps of the probe and of the plasmid pAA1 corresponding to one of the two colonies are shown in FIG. 2, in which:
  • the plasmid pAA1 was used to determine, on the two strands, the nucleotide sequence of the structural gene for ⁇ -agarase.
  • the insert pAA1 was sequenced on 4651 bp (FIG. 3). It contains a single open reading frame (ORF) of 4287 bp. This gene called agaA has SEQ ID No. 1.
  • the nucleic acid sequence obtained is illustrated in FIG. 3.
  • Two hexamers, here called TTGAtc and TAcAca, compatible with the consensus promoters "-35" and "-10" of E. coli, the capital letters corresponding to the consensus promoter of E coli (ROSENBERG & COURT, Ann. Rev. 13, 319-353, (1979)), and separated by 16 nucleotides, are found 25 nucleotides upstream of the putative initiation codon for the translation of the agaA gene.
  • Six bp before this initiator codon is a putative Shine-Dalgarno sequence (SHINE & DALGARNO, Proc. Nat.
  • the Chargaff coefficient (GC%) of the ⁇ -agarase gene is 42%, which is in agreement with that of the genus Alteromonas.
  • Example 6 Analysis of the amino acid sequence deduced from the ⁇ -agarase gene
  • the agaA gene translation product is a protein of 1429 amino acids with a theoretical molecular mass of 154.67 kDa.
  • the deduced amino acid sequence, SEQ ID No. 2 comprises the NH 2 -terminal peptide and the internal peptide determined from the microsequencing of the purified ⁇ -agarase (underlined in FIG. 3).
  • the hydropathy profile KYTE and DOOLITLE, J. Mol. Biol., 157, 105-132, (1982 ”the N-terminal part of the protein corresponds to a very hydrophobic domain, which suggests that this domain is the signal peptide (VON HEUNE, Eur. J. Biochem. 133, 17-21, (1983); J. Mol. Biol. 184, 99-105, (1985)).
  • the clipping site on most likely signal peptide by signal peptidase is assigned between Ala 26 and Glu 27 .
  • the molecular mass of the AgaA protein calculated after elimination of the signal peptide is 151.91 kDa, which corresponds approximately to the molecular mass initially determined by electrophoresis on SDS-PAGE, which is 180 kDa (see FIG. 1).

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Abstract

L'invention concerne le gène agaA codant pour une α-agarase et ayant la SEQ ID N° 1, ledit gène codant pour une α-agarase de Alteromonas agarilytica DSM 12513, ainsi que la protéine AgaA de A. agarilytica DSM 12513 ayant la SEQ ID N° 2. Application: biodégradation des agars.

Description

Gène codant pour une α-agarase et son utilisation pour la production d'enzymes de biodégradation des agars
La présente invention concerne un nouveau gène, codant pour une α-agarase, et son utilisation pour la production d'enzymes de biodégradation des agars.
Les galactanes sulfatés des Rhodophycées, tels que les agars et les carraghénanes, représentent les polysaccharides majeurs des Rhodophycées et sont très largement utilisés en tant qu'agents gélifiants ou épaississants dans diverses branches d'activité, notamment l'agro-alimentaire. Environ 6000 tonnes d'agars et 22 000 tonnes de carraghénanes sont extraits annuellement des algues rouges marines à cet effet. Les agars sont produits industriellement à partir des algues rouges des genres Gelidium et Gracilaria. Les carraghénanes sont quant à eux largement extraits des genres Chondrus, Gigartina et Eucheuma.
Les agaro-colloïdes sont des complexes polysaccharidiques composés des agars et des agaroïdes. Seuls les agars ont la propriété de former des gels thermoréversibles. Ces polysaccharides sont constitués de chaînes où alternent régulièrement des molécules de D-galactose et de 3,6-anhydro-L-galactose. Ces deux sucres sont liés entre eux par une liaison osidique β-1,4. Ce dimère, ainsi constitué, est lui-même lié à un autre dimère identique par une liaison osidique α-1,3.
On appelle agar un mélange de ces polysaccharides présentant une proportion plus ou moins importante (selon la source) de radicaux sulfate, pyruvate, méthyle ou autres, ce qui en font des polymères électriquement chargés. Le terme agarose est réservé à un polymère totalement exempt de ces radicaux, ce qui en fait un polymère électriquement neutre. Le gel d'agar se forme lorsque, à basse température, les chaînes s'organisent en doubles hélices maintenues par des liaisons hydrogène.
Il existe deux types d'enzymes capables de dégrader les agars : les α-agarases et les β-agarases. Les β-agarases agissent sur la liaison β-1,4 et les α-agarases sur la liaison α-1,3.
Des micro-organismes produisant des enzymes capables d'hydrolyser les agars ont déjà été isolés. Cette capacité à digérer l'agar a été attribuée aux genres Pseudomonas, (MORRICE et al., Eur. J. Biochem. 137, 149-154, (1983)), Streptomyces (HODGSON et CHATER, J. Gen. Microbiol. 124, 339-348, (1981)), Cytophaga (VAN DER MEULEN et HARDER, J. Microbiol. 41, 431-447, (1975)) et Vibrio (SUGANO et al., Appl. Environ. Microbiol. 59, 1549-1554, (1993)). Plusieurs gènes de β-agarase ont déjà été isolés. Ainsi, BELAS et al. ont isolé le gène d'une β-agarase chez Pseudomonas atlantica (Appl. Environ. Microbiol. 54, 30-37, (1988)). BUTTNER et al. ont isolé une β-agarase chez Streptomyces coelicolor et séquence le gène correspondant (Mol. Gen. Genêt. 209, 101-109, (1987)). SUGANO et al. ont clone et séquence deux gènes différents de β-agarase chez Vibrio sp. JT0107, qu'ils ont appelé agaA (Appl. Environ. Microbiol. 59, 3750-3756, (1993)) et agaB (Biochimica et Biophysica Acta 1 218, 105-108, (1994)). A ce jour, aucun gène d'α-agarase n'est décrit dans la littérature.
La demanderesse a maintenant isolé un gène codant pour une α-agarase à partir de la bactérie "Alteromonas agarilytica" souche GJIB déposée à la Collection DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) le 5/11/1998 sous le numéro DSM 12513.
Cette souche GJIB a été décrite dans la thèse de P. Potin ("Recherche, production, purification et caractérisation de galactane-hydrolases pour la préparation d'oligosaccharides des parois d'algues rouges", février 1992) où il est indiqué qu'elle a une activité α-agarase. Toutefois, aucune mention n'est faite sur le ou les gènes responsables de cette activité.
Ainsi, la présente invention a pour objet le nouveau gène agaA ayant la séquence d'ADN SEQ ID N° 1 qui code pour une α-agarase dénommée protéine AgaA, ayant la séquence SEQ ID N° 2.
La présente invention a également pour objet les séquences d'acides nucléiques, à savoir les séquences d'ADN génomique, les séquences d'ADN ou d'ARNm qui comprennent ou sont constituées par un enchaînement de nucléotides codant pour la protéine AgaA ou pour l'un quelconque de ses fragments peptidiques tels que définis ci-après.
L'invention concerne toutes les séquences d'acides nucléiques codant pour la protéine AgaA dans son entier, ou pour un ou plusieurs de ses fragments peptidiques. Ces séquences sont représentées de préférence par : a) la séquence d'ADN SEQ ID N°l codant pour la protéine AgaA et les fragments d'ADN codant pour les fragments peptidiques de ladite protéine ; b) les séquences d'ADN hybridant en conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments ; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour la protéine AgaA ou les fragments de celle-ci ; et d) les séquences d'ARNm correspondantes.
Les acides nucléiques selon l'invention peuvent être préparés par synthèse chimique ou génie génétique en utilisant les techniques bien connues de l'homme du métier et décrites par exemple dans SAMBROOK et al. ("Molecular Cloning : a Laboratory Manual" Ed. Cold Spring Harbor Press, N.Y., 1989). Par exemple, la synthèse des séquences d'ADN selon l'invention peut être effectuée par amplification des gènes de "Alteromonas agarilytica" GJIB à l'aide de la méthode PCR (Polymerase Chain Reaction), comme décrit par exemple par GOBLET et al. (Nucleic Acid Research, 17, 2144, (1989)) en utilisant des oligonucléotides synthétiques comme amorces, définis à partir de la séquence d'ADN SEQ ID N° 1.
Le fragment d'acides nucléiques ainsi amplifié peut ensuite être clone dans un vecteur d'expression selon les techniques décrites dans MANIATIS et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, NEW YORK (1982)). L'invention a également pour objet les cellules procaryotes et les cellules eucaryotes transformés à l'aide d'un vecteur d'expression contenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Ce vecteur d'expression, qui peut être par exemple sous la forme d'un plasmide, doit comporter, outre la séquence d'acides nucléiques de l'invention, les moyens nécessaires à son expression, tels que notamment un promoteur, un terminateur de transcription, une origine de réplication et de préférence un marqueur de sélection. La transformation des cellules procaryotes et des cellules eucaryotes est une technique bien connue de l'homme du métier qui pourra aisément déterminer, en fonction du micro-organisme à transformer, les moyens nécessaires à l'expression de la séquence d'ADN selon l'invention. Les micro-organismes procaryotes préférés aux fins de l'invention sont
Escherichia coli et Bacillus subtilis.
A titre d'exemples de cellules eucaryotes qui conviennent aux fins de l'invention, on peut citer notamment les cellules de Aspergillus niger, Trichoderma viridae ou Pichia pastoris. La présente invention a également pour objet la nouvelle protéine AgaA de "A. agarilytica" qui comprend la séquence d'acides aminés SEQ ID N° 2.
La nouvelle protéine AgaA est composée de 1429 acides aminés et a une masse moléculaire théorique de 154,67 kDa. Après élimination du peptide signal, cette protéine a une masse moléculaire calculée de 151,91 kDa. La présente invention concerne également les fragments peptidiques de la protéine AgaA résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité α-agarase.
Les protéines et fragments peptidiques selon l'invention peuvent être obtenus par les techniques de génie génétique qui comprend les étapes de : - culture de cellules procaryotes ou de cellules eucaryotes transformées par un vecteur d'expression possédant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention et
- récupération de la protéine ou du fragment peptidique produit par lesdites cellules.
Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. Pour plus de détails les concernant, on pourra se référer à l'ouvrage ci-après : Recombinant DNA Technology I, Editors Aies Prokop, Raskesh K Bajpai ; Annals of the New- York Academy of Sciences, volume 646, 1991. Les fragments peptidiques peuvent également être préparés par synthèse peptidique chimique classique bien connue de l'homme du métier.
L'invention va maintenant être décrite en détail à l'aide de l'exposé expérimental ci-après.
Une grande partie des techniques bien connues de l'homme du métier, décrite dans ces exemples, est exposée en détail dans l'ouvrage de SAMBROOK et al. (supra) ou dans l'ouvrage de MANIATIS et al. (supra).
La description ci-après sera mieux comprise à l'aide des figures 1 à 4 sur lesquelles :
- la figure 1 est la photographie d'un gel d'électrophorèse SDS-PAGE des fractions α-agarase positives de "A. agarilytica" issue des chromatographies d'affinité et d'échange d'ion.
- la figure 2 représente la carte physique de la sonde nucléotidique ayant servi à identifier les clones α-agarases positifs dans la banque génomique d'"Λ. agarilytica" et celle d'un clone génomique d'"A agarilytica" présentant une activité agarase;
- la figure 3 donne la séquence nucléotidique et la séquence d'acides aminés déduite du gène de l'α-agarase provenant de "A. agarilytica";
- la figure 4 représente le profil d'élution des produits d'hydrolyse de l'agarose par l'α-agarase provenant de la souche "A. agarilytica " selon l'invention.
Exemple 1 : isolement, culture de la souche "Alteromonas agarilytica" DSM 12513 et extraction de son ADN
La souche GJIB DSM 12513 a été isolée à partir d'eau de mer de Great Bay-
Little Bay estuarine complex du New Hampshire aux USA (YOUNG et al., Carbohydr. Res. 66, 207-212, (1978)). La recherche taxono ique de la souche GJIB, réalisée par des techniques bien connues de l'homme du métier, a montré qu'elle appartient au genre Alteromonas.
Elle pousse en faisant des cratères dans l'agar, sous forme de colonies non pigmentées présentes sur les bords de ces cratères, alors que le fond du cratère se retrouve dépourvu d'agar ; l'agar du reste de la boîte est ensuite liquéfié. La bactérie est à Gram-négatif, aérobie et a une forme de bâtonnet mobile par un flagelle polaire.
Elle possède un métabolisme oxydatif. Elle est capable d'assimiler diverses sources carbonées telles que le glucose, l'arabinose, la N-acétylglucosamine, le mannitol, le galactose, le maltose, le gluconate, le saccharose et le fructose. Elle possède les activités nitrate reductase, catalase, β-glucosidase et β-galactosidase. Elle est capable de dégrader plusieurs types de macromolécules, telles que l'agar, l'amidon. Les valeurs en pourcentage de la composition en guanine et cytosine de l'ADN de la souche ont été établies entre 39 et 45%.
La souche GJIB présente des caractéristiques morphologiques, biochimiques et physiologiques similaires à celles de la souche Vibrio agarlyticus (CATALDI, Rev.
Inst. Bacteriolôgico 9, 366-377, (1940)). Elle a donc été appelée "Alteromonas agarilytica " (Cataldi) comb. nov.
La culture de la souche a été réalisée à 22°C sur le milieu BSM modifié
(milieu Basai Sait Médium) (POTIN et al., Eur. J. Biochem. 214, 599-607, (1993)). Le protocole employé pour extraire l'ADN de la souche "Alteromonas agarilytica" DSM 12513 est dérivé de celui de Marmur (MARMUR, J. Mol. Biol. 3,
208-218, (1961) ; BARBEYRON, Thèse d'université Pierre et Marie Curie-Paris VI,
(1993)) et est décrit en détail ci-après.
Après culture, les bactéries ont été centrifugées à 3000 g durant 15 minutes, puis lavées dans de l'eau de mer stérile. Les cellules ont subi une dernière centrifugation, identique à la précédente, et ont été traitées immédiatement ou congelées à -20°C.
5 à 10 g de cellules selon la concentration cellulaire (poids humide après centrifugation) ont été repris dans 25 ml de tampon Sph (Tris-HCl, pH 8, 50 mM ; saccharose 25%), puis par 5 ml de tampon TES (Tris-HCl, pH 8, 50 mM ; acide éthylènediaminetétraacétique 5 mM ; chlorure de sodium 50 mM), et 50 mg de lysosyme ont été ajoutés. Des sphéroplastes sont apparus après une incubation de
15 minutes à température ambiante.
L'ADN a été aussitôt protégé par l'ajout de 100 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (concentration finale) et l'incubation a été poursuivie dans la glace pendant encore 10 minutes. La lyse a été totalement achevée par l'addition de 2% de dodécylsulfate de sodium (concentration finale) et de 25 ml de solution de lyse (Tris-HCl, pH 8, 50 mM ; acide éthylènediaminetétraacétique 100 mM ; chlorure de sodium 100 mM). Les protéines ont été pleinement dénaturées par une incubation de 1 heure à 50°C en présence de 40 mg de protéinase K. A la fin de cette incubation, 1 M (concentration finale) de perchlorate de sodium a été ajouté pour que les liaisons ADN-protéines soient rompues.
La solution a été déprotéinisée en l'agitant en présence de 0,5 volume de phénol saturé pendant 5 minutes. L'agitation a été faite manuellement et a dû être suffisamment énergique, sans l'être trop pour ne pas déchirer l'ADN, pour former une émulsion (sans laquelle il ne pourrait y avoir d'extraction). La déprotéinisation a été poursuivie pendant encore 5 minutes après ajout de 0,5 volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1). Les protéines ont été concentrées à l'interface entre la phase aqueuse et la phase organique, par une centrifugation de 15 minutes à 10000 g à température ambiante.
La phase aqueuse contenant les acides nucléiques a été transvasée dans un tube propre avec une pipette dont l'embout a été agrandi pour ne pas déchirer l'ADN. La déprotéinisation a été poursuivie et les traces de phénol ont été extraites de la phase aqueuse, par agitation de la solution pendant 5 minutes en présence de 1 volume de chloroforme/alcool isoamylique (24/1).
Après une centrifugation de 5 minutes à 10000 g à température ambiante, la phase aqueuse a été prélevée avec les mêmes précautions que précédemment, et les acides nucléiques ont été précipités en versant délicatement 0,6 volume d'isopropanol (de façon à former deux phases). L'ADN de haut poids moléculaire a été récupéré avec une baguette de verre, lavé dans de l'éthanol à 70%, déshydraté dans de l'éthanol absolu et séché à l'air.
Après séchage, l'ADN a été dissous dans 20 ml de tampon TE (Tris-HCl, pH 8,
10 mM, acide éthylènediaminetétraacétique 1 mM). La dissolution a nécessité environ 12 heures et elle a pu être facilitée par un chauffage à 50°C. La solution obtenue est opalescente, signe d'une contamination importante en protéines. Ces dernières sont efficacement éliminées en passant une fraction de l'ADN sur un gradient de chlorure de césium en présence de bromure d'éthydium. Après ce passage sur gradient et élimination du bromure d'éthydium, l'ADN ainsi obtenu est quantifié.
11 a pu être conservé à 4°C ou congelé à -20°C. La composition d'ADN, exprimée en pourcentage molaire de guanine + cytosine (mol% G+C), a été déterminée par la méthode spectroscopique de ULITZUR (Biochem. Biophys. Acta 272, 1-11, (1972)) et le procédé de gradient en chlorure de césium en présence de 2'-[4-hydroxyphényl]-5-[4-méthyl-l-pipérazinyl]- 2,5'-bi-lH-benzimidazole (Hoechst 33258/Sigma) (KARLOVSKY et DE COCK, Anal. Biochem. 194, 192-197, (1991)). Dans le premier cas, il est de 47% ± 2 (moyenne de 2 manipulations) et dans le deuxième cas de 37,5% ± 1,5. Ce pourcentage molaire G+C a été calculé en utilisant l'ADN d'E. coli comme référence standard.
Exemple 2 : mise en évidence et purification de l'activité agarase dans la souche "Alteromonas asarilvtica " DSM 12513
L'activité agarase de la souche a été induite dans un milieu BSM modifié supplémenté par 2,5 g/1 d'agar. On considère qu'une souche présente une activité agarase lorsqu'elle digère l'agar sur lequel elle se développe.
On a cultivé la souche à activité agarase dans 2,5 1 du milieu ci-dessus à 22°C. On a centrifugé la culture à 1000 g pendant 20 minutes. On a récupéré le surnageant de culture et on l'a concentré jusqu'à 100 ml par ultrafiltration tangentielle (seuil de coupure : 10 kDa), opération suivie d'une précipitation au sulfate d'ammonium (70 % de saturation). Le culot de protéines a été remis en suspension dans 10 ml de tampon A (Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM, CaC12 25 mM). Après retrait du matériel insoluble, on a ajouté 1 ml de Sépharose CL6B équilibré dans le tampon A afin de réaliser une chromatographie par affinité. L'activité α-agarase s'est fixée au Sépharose pendant 30 minutes à 4°C sous agitation douce. On a ensuite centrifugé les billes de Sépharose à 200 g pendant 5 minutes, on les a reprises dans 5 ml de tampon A et coulées dans une colonne de verre. Après plusieurs lavages en tampon A, on a élue l'activité α-agarase de la colonne en faisant passer au travers de celle-ci une solution d'oligoagars à pH 7,2 obtenue en digérant une solution d'agar à 5 g/1 par de l'α- agarase non purifiée de "A. agarilytica " (le culot obtenu en 70% sulfate d'ammonium). On a soumis les fractions α-agarase positives (24 ml) à une chromatographie d'échange d'ions (Mono Q) en tampon B(Tris-HCl, pH 7,2, 10 mM, CaCl2 5 mM). Après lavages, on a élue l'activité par un gradient de chlorure de sodium (0 à 500 mM NaCl) en tampon B (1 ml mn). L'activité α-agarase a été éluée à une concentration en NaCl de 350 mM.
On a testé l'activité agarase des différentes fractions issues des deux chromatographies en déposant des quantité aliquotes de ces fractions sur un gel d'agarose et par un dosage des sucres réducteurs selon la technique de KJDBY & DAVIDSON (Annal. Biochem., Vol. 55, 321-325 (1973)). Cependant ce test s'est avéré le plus souvent négatif après la dernière étape de chromatographie d'échange d'ions et a été avantageusement remplacé par un test viscosimétrique.
On a mis en oeuvre une électrophorèse sur SDS-PAGE avec la fraction éluée de la seconde colonne. Celle-ci a présenté une bande principale avec une masse d'environ 180 kDa (figure 1). Cette protéine a été microséquencée. La séquence obtenue du peptide NH -terminal est ETLELQAESFANSGG et celle du peptide interne est
QPRVYNPNEHIVAEIQGPAT .
Exemple 3 : produits de dégradation de l'α-agarase Les spécificités de substrat de l' -agarase de l'invention ont été étudiées en analysant les produits de dégradation de l'agarose par l'α-agarase partiellement purifiée (après colonne d'échange d'ions).
On a mis l'agarose en présence de l' α-agarase à raison de 0,2U/mg de polysaccharide durant 15 heures (1 unité enzymatique U est la quantité d'enzyme qui produit une augmentation d'absorbance de 0,1 unité de densité optique à 237 nm au cours du test des sucres réducteurs). On a refroidi l'hydrolysat dans la glace et on l'a centrifugé à 15000 g pendant 20 minutes. On a concentré le surnageant et on l'a fractionné par chromatographie d'exclusion sur une colonne de Bio-Gel P2. On a utilisé de l'eau distillée en tant que phase mobile et on a réalisé la détection par un enregistrement de l'indice de réfraction.
Le chromatogramme des produits finaux d'hydrolyse de l'agarose par l'α-agarase purifiée est représenté sur la figure 4. Le pic majeur n° 1 a été identifié comme étant de l'agarotétraose sur la base des résultats obtenus par RMN du l3C (Résonance Magnétique Nucléaire du carbone 13). Les pics mineurs n° 2 et 3 ont été identifiés comme étant de l'agarotétraose méthylé en C6 et de l'agarohexaose respectivement. La présence de l'oligosaccharide méthylé provient de la source d'agarose employée qui est un agarose anormalement contaminé par de l'agar méthylé. Ces résultats confirment que l'α-agarase de la souche GJIB d'"A. agarilytica" est spécifique de la liaison α-1,3 dans l'agarose et dans certains agars. Des expériences ont montré que l'α-agarase d'"A. agarilytica" était incapable de dégrader l'agarotétraose, l'agarohexaose, le K-carraghénane, le i-carraghénane, le λ-carraghénane ou l'agar extrait de l'algue rouge Gracilaria eucheumoides (agar méthylé en C2 du résidu 3,6-anhydro-L-galactose et sulfaté en C4 du résidu D- galactose). Exemple 4 : clonage du gène de l'α-agarase
On a préparé une banque d'ADN génomique de la souche de "A. agarilytica".
Des fragments de 4 à 12 kb, provenant de la digestion partielle par Sα«3AI de l'ADN chromosomique, ont été fractionnés sur un gradient de saccharose. Ces fragments ont été insérés dans le site BamHl du plasmide pAT153 (TWIGG et SHERRATT,
Nature, 283, 216, (1980)).
Les clones recombinants (environ 6000) de la souche DH5α d'E. coli (SAMBROOK et al., supra) ont été inoculés indépendamment sur des plaques de microtitration dans le milieu LBA (milieu Luria-Bertani (MANIATIS et al., supra) supplementé en ampicilline à une concentration de 50 μg/ml). Après incubation, toute la nuit à 37°C, ces clones ont été repiqués sur des membranes de Nylon N+ déposées sur milieu LB (milieu Luria-Bertani) en présence de 50 μg/ml, puis remis à 37°C la nuit. Les membranes ont été récupérées et les colonies apparues sur leur surface ont été lysées. Enfin, les membranes ont été hybridées avec une sonde radioactive spécifique du gène de l' α-agarase. Cette sonde a été obtenue par PCR avec des oligonucléotides synthétiques dégénérés dont les séquences ont été déterminées à partir du microséquençage du fragment NH -terminal et d'un fragment interne de la protéine AgaA purifiée (cf exemple 2); ce fragment de PCR a été clone. Deux clones positifs ont été identifiés. Ces clones ont été repiqués à 22°C sur du milieu Zd (5 mg/1 de bactotryptone, 1 mg/1 d'extrait de levure, 10 mg/1 de NaCl, pH 7,2) supplementé à 50 μg/ml d'ampicilline pour observer la production d'agarase (trou dans la gélose lorsqu'il y a production d'agarase).
En moins de huit jours de culture à 22°C, les deux colonies indépendantes, appelées pAAl à pAA2, ont creusé le substrat. Les cartes de la sonde et du plasmide pAAl correspondant à une des deux colonies sont représentées sur la figure 2, sur lesquelles :
- les lignes fines représentent les régions de l'ADN vecteur, le segment en gras représente l'insert de "A. agarilytica" et les rectangles blancs représentent tout ou partie du gène d'α-agarase; - les différentes abréviations sont les sites de reconnaissance des endonucléases de restriction et ont les significations ci-après : B/S : site de clonage BamHl-Sau3A A: Accl E: EcoRI P: Pstl La cartographie de ces ADN montre la présence d'un fragment ayant un profil de restriction commun entre la sonde et le plasmide pAAl (délimité par les lignes en pointillés sur la figure 2), ce qui permet de situer, sur l'insert d'ADN génomique, cette sonde et donc de localiser le début du gène sur le plasmide pAAl.
Exemple 5 : analyse de la séquence nucléotidique du gène d'α-agarase
Le plasmide pAAl a été utilisé pour déterminer, sur les deux brins, la séquence nucléotidique du gène de structure de l' α-agarase.
Ce séquençage a été réalisé par une technique bien connue de l'homme du métier, à savoir la méthode de Sanger (SANGER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5463-5467, (1977)) également appelée méthode aux didéoxynucléotides.
L'insert pAAl a été séquence sur 4651 pb (figure 3). Il contient un unique cadre ouvert de lecture (ORF) de 4287 pb. Ce gène appelé agaA a la SEQ ID N° 1.
La séquence d'acides nucléiques obtenue est illustrée sur la figure 3. Deux hexamères, appelés ici TTGAtc et TAcAca, compatibles avec les promoteurs consensus "-35" et "-10" de E. coli, les majuscules correspondant au promoteur consensus de E. coli (ROSENBERG & COURT, Ann. Rev. 13, 319-353, (1979)), et séparés par 16 nucléotides, sont trouvés à 25 nucléotides en amont du codon initiateur putatif de la traduction du gène agaA. Six pb avant ce codon initiateur se trouve une séquence de Shine-Dalgarno putative (SHINE & DALGARNO, Proc. Nat.
Acad. Sci. USA 71, 1342-1346, (1974)) qui est le site de fixation des ribosomes
(notée S.D. sur la figure 3). Dans la région 3' non traduite, une boucle d'arrêt de transcription est trouvée en aval du codon stop TAA, suivi de trois résidus thymidine.
Le coefficient de Chargaff (GC%) du gène de l'α-agarase est de 42%, ce qui est en accord avec celui du genre Alteromonas.
Exemple 6 : analyse de la séquence d'acides aminés déduite du gène d'α-agarase
Le produit de traduction du gène agaA est une protéine de 1429 acides aminés présentant une masse moléculaire théorique de 154,67 kDa. La séquence d'acides aminés déduite, SEQ ID N° 2, comprend le peptide NH2-terminal et le peptide interne déterminés à partir du microséquençage de l'α-agarase purifiée (soulignés sur la figure 3). Comme indiqué par l'analyse du profil d'hydropathie (KYTE et DOOLITLE, J. Mol. Biol., 157, 105-132, (1982» la partie N-terminale de la protéine correspond à un domaine très hydrophobe, ce qui suggère que ce domaine est le peptide signal (VON HEUNE, Eur. J. Biochem. 133, 17-21, (1983) ; J. Mol. Biol. 184, 99-105, (1985)). Selon la règle "(-3,-1)" de Von Heijne, le site de coupure le plus probable du peptide signal par la signal-peptidase est attribué entre Ala26 et Glu27.
La masse moléculaire de la protéine AgaA calculée après élimination du peptide signal, est de 151,91 kDa, ce qui correspond approximativement à la masse moléculaire déterminée initialement par electrophorese sur SDS-PAGE, qui est de 180 kDa (voir figure 1).

Claims

REVENDICATIONS
1. Gène agaA codant pour une α-agarase, caractérisé en ce qu'il a la SEQ ID N° 1.
2. Gène selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour une α-agarase de "Alteromonas agarilytica " DSM 12513.
3. Protéine AgaA de "Alteromonas agarilytica" DSM 12513, caractérisée en ce qu'elle a la SEQ ID N° 2.
4. Fragments peptidiques de la protéine selon la revendication 3 résultant de l'addition, la suppression et/ou le remplacement d'un ou plusieurs acides aminés, lesdits fragments peptidiques ayant conservé l'activité α-agarase.
5. Séquence d'acide nucléique codant pour la protéine selon la revendication 3 et pour les fragments peptidiques selon la revendication 4.
6. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est constituée par : a) la séquence d'ADN SEQ ID N°l codant pour la protéine AgaA et les fragments d'ADN codant pour les fragments peptidiques de ladite protéine ; b) les séquences d'ADN hybridant dans des conditions de stringence spécifiques avec la séquence ci-dessus ou un de ses fragments ; c) les séquences d'ADN qui, en raison de la dégénérescence du code génétique, dérivent de l'une des séquences a) et b) ci-dessus et codent pour la protéine AgaA ou les fragments de celle-ci ; ou d) les séquences d'ARNm correspondantes.
7. Vecteur d'expression caractérisé en ce qu'il comprend une séquence d'acides nucléiques selon l'une des revendications 5 ou 6 et les moyens nécessaires à son expression.
8. Micro-organismes ou cellules hôtes transformés par un vecteur d'expression selon la revendication 7.
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