BE1021472B1 - Methode de modification d'une espece de sporolactbacillus par ingenieurie genetique - Google Patents

Methode de modification d'une espece de sporolactbacillus par ingenieurie genetique Download PDF

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BE1021472B1 BE2013/0188A BE201300188A BE1021472B1 BE 1021472 B1 BE1021472 B1 BE 1021472B1 BE 2013/0188 A BE2013/0188 A BE 2013/0188A BE 201300188 A BE201300188 A BE 201300188A BE 1021472 B1 BE1021472 B1 BE 1021472B1
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Wendy Glénisson
Déborah Prozzi
Pascal Hols
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Galactic S.A.
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Abstract

L'invention porte sur une méthode de modification de souches de Sporolactobacilles par génie génétique, comprenant l'introduction d'un ADN cloné dans un réplicon, à l'intérieur des cellules d'une souche de Sporolactobacilles. L'invention concerne en plus les souches génétiquement modifiées de Sporolactobacilles et les procédés utilisant les souches de Sporolactobacilles génétiquement modifiées.

Description

METHODE DE MODIFICATION D’UNE ESPECE DE SPOROLACTBACILLUSPAR INGENIEURIE GENETIQUE DOMAINE DE L’INVENTION
La présente invention se rapporte à une méthode de modification génétique des espèces de Sporolactobacilles, aux espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles et aux processus utilisant les espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles.
ETAT DE LA TECHNIQUE
La demande mondiale en acide lactique et en ses produits dérivés augmente de façon constante. Cette demande croissante est justifiée par rutilisation de l’acide lactique dans une gamme d’applications de plus en plus larges dans les domaines de la nutrition, des cosmétiques, du pharmaceutique, ainsi que dans les industries chimique et du plastique.
Les bactéries lactiques sont connues pour produire l'acide lactique comme principal produit métabolique final de la fermentation des hydrates de carbone. Les bactéries lactiques consomment principalement du glucose ou du sucrose/saccharose comme matière première pour la fermentation. Toutefois, le coût de ces matières premières augmente sans cesse et devient un inconvénient majeur dans la production d'acide lactique par fermentation.
En outre, certaines bactéries d'acide lactique ne sont pas entièrement stéréospécifiques dans la production d'acide lactique, ce qui peut aussi être un inconvénient, en particulier dans la production d'acide polylactique (PLA), puisqu'il est connu que les propriétés physiques du PLA dépendent de sa composition isomérique.
En conséquence, il serait souhaitable d'avoir des bactéries lactique qui sont capables de produire de l'acide lactique ou l’un de ses stéréoisomères à partir de matières premières abondantes et donc peu coûteuses.
RESUME DE L’INVENTION
Dans leur quête pour résoudre les problèmes susmentionnés, les présents inventeurs ont isolé une souche de Sporolactobacilles, LMG P-26831, qui, par l'analyse de son 16 RNA a été identifié comme étant phylogénétiquement proche des espèces Sporolactobacillus vineae (Chang et al., 2008, Journal International de la systématique et évolution microbiologie, 58, 2316-20). Les présents inventeurs ont trouvé, à travers des expériences et des tests approfondis, une méthode permettant de modifier la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 en introduisant un ADN cloné dans un réplicon, à l’intérieur des cellules de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831. En plus de ces constatations, les inventeurs ont observé que cette espèce de
Sporolactobacilles peut être modifiée par génie génétique, ce qui répond ainsi à un ou plusieurs des problèmes mentionnés ci-dessus de l'état de la technique.
Par conséquent, un premier aspect de la présente invention concerne un procédé de modification par génie génétique des espèces de Sporolactobacilles, comprenant l’étape d'introduction d’un ADN dans des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles. Les méthodes appliquant les principes de la présente invention permettent avantageusement d’obtenir des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles.
Par exemple, ces méthodes présentent l'avantage de fournir des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles capables de consommer des substrats facilement disponibles et peu coûteux tels que les substrats lignocellulosiques ou des substrats provenant de l'amylase. Ces substrats peuvent être une alternative économiquement très intéressante à l'utilisation du sucrose/saccharose pour des procédés de fermentation industrielle.
De plus, les inventeurs ont trouvé que les méthodes appliquant les principes de la présente invention fournissent des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles capables de produire des composés industriellement intéressants comme par exemple l'acide lactique ou un de ses stéréo-isomères.
En fait, les méthodes présentes permettent de fournir des espèces de Sporolactobacilles capables non seulement de consommer des substrats peu coûteux tels que, par exemple, du xylose et des substrats provenant de l'amylase, mais aussi de produire exclusivement de l’acide lactique L ou de l’acide lactique D. Par conséquent, les méthodes de la présente invention fournissent avantageusement des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles ayant une application industrielle améliorée.
Aucun protocole de génie génétique des espèces de Sporolactobacilles n'a été décrit jusqu'à présent.
Bien qu'il existe différentes méthodes pour la modification génétique de souches bactériennes, il est connu qu'afin d'effectuer une modification génétique réussie d'une souche de bactérie il est nécessaire d’avoir au moins trois outils : un réplicon, un marqueur de sélection et un protocole de transformation, et également que lorsque ces trois outils au moins sont efficaces pour une espèce bactérienne, il ne peut pas automatiquement être supposé que ces outils seront efficaces pour une autre espèce bactérienne. Lorsqu'une méthode de transformation ne donne pas de transformant, cela peut être causé par exemple par un réplicon inapproprié, et/ou par un marqueur de sélection inapproprié et/ou par l'utilisation d'un protocole de transformation inappropriée ou sous-optimal et/ou à d'autres facteurs. Aucun réplicon, aucun marqueur de sélection, ni aucune méthode de modification génétique spécifique n’a jusqu'à présent été décrite pour aucune souche de Sporolactobacilles.
Comme mentionné ci-dessus, les présents inventeurs ont isolé une souche de Sporolactobacilles, qui, par l'analyse de son ARN 16 s, a été identifiée comme étant phylogénétiquement liée aux espèces Sporolactobacillus vineae. Par conséquent, un deuxième aspect de ce brevet porte sur une souche Sporolactobacillus vineae caractérisée par une séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ Ш No 1 ou une souche de Sporolactobacilles ayant au moins 96 % d’identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID No 1. Une souche de Sporolactobacillus vineae comme décrite ci-dessus a été déposée sous le numéro d'accession LMG P-26831 à la Collection de bactéries BCCM-LMG le 18 janvier 2012. La souche de Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 est caractérisée par une séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID No 1.
Les présents inventeurs ont trouvé, grâce à une expérimentation intense, un procédé permettant de modifier par génie génétique la souche de Sporolactobacillus vineae LMG P-26831. Se basant sur ces constatations, les inventeurs ont observé que cette espèce de Sporolactobacilles peut être modifiée par génie génétique par les méthodes enseignées dans la présente invention. Dans certains modes de réalisation, les inventeurs ont ainsi envisagé les méthodes enseignées ici, dans le cas où les espèces de Sporolactobacilles peuvent être Sporolactobacillus vineae. Par conséquent, il est également divulgué ici un procédé de modification par génie génétique des espèces de Sporolactobacillus vineae, comprenant l'introduction d'un ADN cloné dans un réplicon, dans des cellules d'une espèce de Sporolactobacillus vineae.
En outre, il est prévu dans certains modes de réalisation, les méthodes enseignées dans la présente invention dans lesquelles les espèces de Sporolactobacilles peuvent être une souche de Sporolactobacillus vineae caractérisée par une séquence d'ARN 16 s comme donnée dans SEQ ID No 1. Il est également inclus dans certains modes de réalisation, les méthodes telle qu'enseignée dans la présente invention où les espèces de Sporolactobacilles peuvent être une souche de Sporolactobacilles ayant au moins 95 % d’identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID No 1. De plus, dans certains modes de réalisation, les espèces Sporolactobacilles peuvent être une souche de Sporolactobacillus vineae déposée sous le numéro d'accession LMG-P26831 à la Collection de bactéries BCCM-LMG.
Un autre aspect de la présente invention concerne des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles obtenues par les méthodes enseignées ici. Par conséquent, sont aussi révélées les espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles obtenus par une méthode de modification par génie génétique des espèces de Sporolactobacilles, comprenant l'introduction d'un ADN cloné dans un réplicon, à l’intérieur des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles, comme par exemple les espèces de la souche vineae ou la souche déposée comme mentionné plus haut. Ces espèces de Sporolactobacilles génétiquement modifiées permettent de produire des composés ayant une valeur commerciale dans un procédé de faible coût.
Sont aussi inclus certains modes de réalisation permettant d’obtenir des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles, selon les méthodes décrites ici, dans lesquels lesdites espèces de Sporolactobacilles telles que définies ci-dessus sont capables de produire au moins un composé choisi dans le groupe de composés suivants : 'acide lactique, acide lactique L, acide lactique D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2,3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, l'oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, glucose, fructose et pyruvate. De préférence, au moins un composé est l'acide lactique L ou l’acide lactique D. Par conséquent, sont également fournis dans certains modes de réalisation préférés, des espèces de Sporolactobacilles génétiquement modifiées obtenues par les méthodes enseignées ici, dans lesquels les espèces de Sporolactobacilles sont capables de produire de l'acide lactique L ou l’acide lactique D. Ces espèces de Sporolactobacilles permettent avantageusement la production de composés industriellement intéressants par fermentation à partir de substrats peu coûteux tels que la biomasse lignocellulosique comprenant l'arabinose et le xylose ou les substrats provenant de pomme de terre, de maïs ou de blé. Ces espèces de Sporolactobacilles permettent donc de diminuer les coûts de la fermentation.
Sont expressément divulguée dans certains modes de réalisation de la présente méthode, des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles comme définies ci-après, dans lequel les espèces de Sporolactobacilles sont une souche génétiquement modifiée de Sporolactobacillus vineae. Sont plus expressément divulguée dans certains modes de réalisation des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles comme définies ci-après, dans lequel les espèces de Sporolactobacilles sont une souche génétiquement modifiée de Sporolactobacillus vineae caractérisée par une séquence d'ARN 16 s comme donnée dans SEQ Ш No 1. Dans certains modes de réalisation spécifiques sont également présentées des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles telles que définies ci-après, dans lesquelles les espèces de Sporolactobacilles sont une souche génétiquement modifiée de Sporolactobacilles ayant au moins 95 % identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ Ш No 1. Sont fournies plus loin dans certains modes de réalisation spécifiques les espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles telles que définies ci-après, dans lesquels les espèces de Sporolactobacilles sont une souche génétiquement modifiée de Sporolactobacillus vineae déposée sous le numéro d’accession LMG P-26831 à la Collection de bactéries BCCM-LMG.
Les présents inventeurs ont trouvé grâce à l'expérimentation que les espèces de Sporolactobacilles peuvent être considérées comme des bactéries modérément thermophiles.
Par conséquent, dans certains modes de réalisation des présentes méthodes pour l'ingénierie génétique des espèces de Sporolactobacilles, le réplicon peut être un réplicon thermosensible. Un tel réplicon thermosensible peut avantageusement améliorer l'efficacité de la transformation des cellules de Sporolactobacilles. Un tel réplicon thermosensibles peut être ajouté à la souche de Sporolactobacilles à une température permissive, puis les conditions de croissance peuvent être modifiées, par exemple, à une température non permissive pour rendre le réplicon incapable de se répliquer lui-même. Cela, de préférence en combinaison avec une sélection antibiotique, pourra entraîner une pression de sélection en faveur des événements de l'intégration chromosomique causée par recombinaison homologue ou non homologue. Par conséquent, un réplicon thermosensible peut permettre l’intégration de l’ADN transformé dans le chromosome.
Dans certains modes de réalisation, le réplicon peut être un plasmide. Dans certains autres modes de réalisation, le réplicon thermosensible peut être le plasmide pNW33N. Ces plasmides peuvent améliorer l'efficacité de la transformation des cellules de Sporolactobacilles. Par exemple, comme illustré dans l'exemple 1 dans la section exemple, pNW33N a donné plus de colonies transformées par rapport aux autres plasmides. Dans certains modes de réalisation, le réplicon thermosensible dépend de la protéine RepB, un fragment fonctionnel ou une variante de celle-ci pour réaliser une réplication thermosensible.
Dans certains modes de réalisation, les méthodes de la présente invention peuvent, après l'introduction de l'ADN dans des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles, comprendre des étapes de : mise en culture des cellules sur un milieu sélectif à une température permissive pour la réplication pour sélectionner des cellules transformées capables de croître sur ledit milieu sélectif à ladite température permissive, et puis la culture des dites cellules transformées à une température non permissive pour la réplication, pour sélectionner des cellules transformées capables de croître à la dite température non permissive. Dès lors, l’invention décrit un procédé permettant de modifier par génie génétique les espèces de Sporolactobacilles, comprenant les étapes suivantes: (a) introduire un ADN cloné dans un réplicon thermosensible, dans des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles, (b) mise en culture des cellules sur un milieu sélectif à une température permissive pour la réplication pour sélectionner des cellules transformées capables de croître sur ledit milieu sélectif à ladite température permissive, et (c) culture des dites des cellules transformées à une température non permissive pour la réplication pour sélectionner des cellules transformées capables de se développer à ladite température non permissive. Ces étapes de culture peuvent permettre l'intégration de l'ADN dans le chromosome bactérien de l'espèce de Sporolactobacilles. Avantageusement, une telle intégration dans le chromosome garantit une modification stable du matériel génétique de l'espèce de Sporolactobacilles. Par exemple, une telle intégration dans le chromosome peut permettre une modification telle que l'introduction d'une fonctionnalité désirée qui puisse être transmise dans la descendance cellulaire. En outre, les méthodes enseignées ici peuvent contourner au moins en partie le besoin d'avoir une efficacité de transformation élevée.
Dans certains modes de réalisation de la méthode de la présente invention, la mise en culture à la température non permissive pour la réplication peut permettre à l'ADN d’être introduit dans le chromosome du Sporolactobacille. Une telle intégration chromosomique permet d’obtenir des espèces de Sporolactobacilles génétiquement modifiées dans lesquelles la modification peut être transmise dans la descendance de cellulaire. Dans les modes de réalisation préférés, la mise en culture à la température non permissive pour la réplication peut permettre à l'ADN d’être introduits dans le chromosome des Sporolactobacilles par recombinaison homologue.
Certains modes de réalisation fournissent en plus les méthodes telles qu’enseignées ici, dans lesquelles l'ADN peut encoder une ou plusieurs fonctionnalités désirées. Dans certains modes de réalisation, l'ADN peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire au moins un composé sélectionné dans le groupe comprenant : acide lactique, acide lactique L, acide lactique D, acétolactate, diacétyle, acétome, 2, 3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, glucose, fructose et pyruvate. Dans des modes de réalisation préférés, l'ADN peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire de l'acide lactique L ou de l’acide lactique D. Ces méthodes permettent avantageusement d'obtenir des espèces de Sporolactobacilles ayant des possibilités d'application industrielle améliorées. Par exemple, une telle méthode peut permettre d'obtenir des espèces de Sporolactobacilles capables de produire un composé industriellement intéressant par exemple à partir de substrats bon marchés provenant de pomme de terre, de maïs ou de blé.
Comme mentionné ci-dessus, la mise en culture à la température non permissive pour la réplication peut permettre à l'ADN d’être introduit dans le chromosome du Sporolactobacilles. Dans certains modes de réalisation, l’introduction de l'ADN dans le chromosome du Sporolactobacilles peut inactiver une séquence codant pour une fonctionnalité indésirable du chromosome du Sporolactobacilles. La fonctionnalité indésirable peut être la D-lactate déshydrogénase, L-lactate déshydrogénase, D-2-hydroxisocaproate déshydrogénase ou L-2-hydroxisocaproate déshydrogénase. Ces méthodes présentent l'avantage que des espèces de Sporolactobacilles peuvent être obtenue avec des propriétés industrielles améliorées. Par exemple, ces méthodes peuvent permettre d'obtenir une souche de Sporolactobacilles qui est un producteur exclusif d'acide lactique L ou d’acide lactique D.
Un autre aspect concerne un procédé de préparation d'au moins un composé sélectionné dans le groupe composé d'acide lactique, acide lactique L, acide lactique D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2,3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, glucose, fructose et pyruvate, dans lequel une espèce de Sporolactobacïlles génétiquement modifiée telle que définie est utilisée. De préférence, au moins un composé est l'acide lactique L ou l’acide lactique D. L’invention décrit également un procédé de préparation de l'acide lactique L ou de l’acide lactique D, dans lequel une espèce de Sporolactobacïlles génétiquement modifiée telle que définie ici est utilisée. Ces procédés permettent la production de composés industriellement intéressants par fermentation par exemple à partir de matières premières bon marchés. Par conséquent, ces composés intéressant industriellement peuvent être produits de manière naturelle et économique.
Les aspects ci-dessus et ci-dessous et les modes de réalisation préférés de l'invention sont décrites dans les sections suivantes et dans les revendications annexées. L'objet des revendications annexées est par la présente expressément incorporé dans cette spécification.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES
La figure 1 présente un arbre phylogénétique qui compare les séquences d'ARN 16 s de différentes espèces de Sporolactobacïlles. La souche de Sporolactobacïlles LMG P-26831 est dénommé ‘Fidel’.
La figure 2 présente une représentation schématique de la conversion métabolique du D-xylose en pyruvate.
La figure 3 présente une représentation schématique de la conversion métabolique de l'amylose ou d'amylopectine en pyruvate.
La figure 4 présente une représentation schématique de la conversion métabolique du pyruvate en acide lactique.
Les figures 5 a et 5 b présentent respectivement une représentation schématique de la conversion métabolique stéréo-spécifique du pyruvate respectivement en acide lactique L ou en acide lactique D.
La figure 6 présente un gel d'agarose illustrant (1) le plasmide pNW33N restreint par EcoRI avant la purification ; SL: Smart Ladder : marqueur de poids moléculaire commercial pour la détermination aisée de la taille de fragments d’ADN (Eurogentec, MW-1700-10).
La figure 7 présente un gel d'agarose illustrant (1) le plasmide pNW33N restreint par EcoRI après la purification ; SL: Smart Ladder : marqueur de poids moléculaire commercial pour la détermination aisée de la taille de fragments d’ADN (Eurogentec, MW-1700-10).
La figure 8 présente un gel d'agarose, illustrant des fragments internes de (1) L-LDH, (2) L-HicDH, (3) D-LDH62 et D-LDH65 (4) restreints par EcoRI.
La figure 9 présente un aperçu schématique de la stratégie pour obtenir des espèces de Sporolactobacilles génétiquement modifiées avec une suppression propre et stable d'un gène.
La figure 10 présente une boîte de Pétri colorée vapeurs de I2 DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Les termes « comprenant », « comprend » et « composé de » dans le présent document sont synonymes de « y compris », « consiste » ou « contenant », « contient » et sont inclus ou ouverts et n'excluent pas des membres supplémentaires, non-cités, des éléments ou des étapes de la méthode. Les termes englobent également « consistant en» et « consistant essentiellement en ». L’énumération de gammes de valeurs numériques par leurs points extrêmes inclut tous les nombres et les fractions subsumées dans les aires de répartition respectives, ainsi que les points extrêmes cités.
Le terme « environ » tels qu'utilisés ci-après, en se référant à une valeur mesurable comme un paramètre, un montant, une durée temporelle et d’autres choses similaires, vise à englober les variations de la valeur spécifiée, en particuliers des variations de +/-10 % ou moins, préférentiellement +/-5 % ou moins, plus préférentiellement +/-1 % ou moins et encore plus préférentiellement +/-0,1 % ou moins, dans la mesure où de telles variations sont appropriées dans l'invention divulguée ici. Il doit être entendu que la valeur à laquelle se réfère le terme « environ » est elle-même aussi précisément et de préférence, divulguée.
Considérant que le terme « un ou plusieurs », comme un ou plusieurs membres d'un groupe de membres, est évident en soi, par l’intermédiaire d’exemples, le terme englobe notamment une référence à l'un de ces membres, ou à deux ou plusieurs de ces membres, tels que, par exemple, toute >3, >4, >5, >6 ou >7 etc. de ces membres précités, et jusqu'à tous ces membres.
Tous les documents cités dans la présente spécification sont incorporées par référence dans leur intégralité.
Sauf indication contraire, tous les termes utilisés dans la divulgation de l'invention, y compris les termes techniques et scientifiques, ont le sens tel que couramment compris par quelqu'un compétent dans l'art auquel appartient cette invention. Pour de plus amples renseignements, Les définitions de certaines expressions peuvent être incluses pour mieux apprécier les enseignements de la présente invention.
Comme mentionné ci-dessus, les présents inventeurs ont trouvé, en accord avec le premier aspect de la présente invention, une méthode pour modifier par génie génétique des espèces de Sporolactobacillescomprenant l'introduction d'un ADN cloné dans un réplicon, puis à l’intérieur des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles. Par conséquent, l'invention se rapporte largement à une telle méthode pour l'ingénierie génétique des espèces de Sporolactobacilles, aux espèces de Sporolactobacilles génétiquement modifiées et aux procédés utilisant les espèces de Sporolactobacilles génétiquement modifiées.
Le terme « réplicon », dans le présent document, désigne une séquence oligonucléotide telle qu’une séquence d'ADN ou d'ARN qui se réplique à partir d'une seule origine de réplication. Par exemple, le terme réplicon peut englober un plasmide, un transposon, un bactériophage ou un chromosome procaryote. De préférence, le réplicon utilisé dans les méthodes décrites ici est un plasmide.
Le terme « ADN » de la syntaxe « présentant un ADN cloné dans un réplicon » se réfère ici à l’«ADN transformant » et se réfère à une molécule d'ADN qui doit être introduit dans les cellules d'une souche de Sporolactobacilles. L'ADN ou l'ADN transformant peut être introduit dans les cellules d'une souche de Sporolactobacilles sous la forme d’une séquence d'acide nucléique monocaténaire ou sous la forme d’une séquence d'acides nucléiques bicaténaires. L'ADN ou l'ADN transformant peut être introduit dans les cellules d'une souche de Sporolactobacilles sous une forme circulaire ou sous une forme linéaire. L'ADN ou l'ADN transformant peut être introduit dans les cellules d'une souche de Sporolactobacilles cloné dans un réplicon ou non.
Le réplicon peut comprendre l'ADN transformant qui peut être homologue au chromosome du Sporolactobacilles et/ou qui peut coder une ou plusieurs fonctionnalités souhaitées. Il est entendu par l'homme du métier que le réplicon peut comporter un ou plusieurs, tels que deux, trois, quatre ou plus, séquences d'ADN qui peuvent être homologues au chromosome du Sporolactobacilles, et/ou que le réplicon peut coder pour une ou plusieurs fonctionnalités souhaitées, ou que plus d'un réplicon comme deux, trois, quatre ou plus de réplicons peuvent être introduits dans les cellules d'une espèce de Sporolactobacilles par exemple séquentiellement, c'est-à-dire un réplicon à la fois, ou plus d'un réplicon, tels que deux, trois, quatre ou plus de réplicons en même temps.
Dans certains modes de réalisation, on peut effectuer l'étape d'introduire l'ADN cloné dans un réplicon à l’intérieur des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles par transformation ou conjugaison. La transformation peut être effectuée par électroporation ou transformation de cellules naturellement compétentes. Dans certains modes de réalisation préférés, l'introduction de l'ADN cloné dans un réplicon dans les cellules d'une espèce de Sporolactobacilles est réalisée par électroporation. L’électroporation améliore avantageusement l'efficacité de la transformation des cellules de Sporolactobacilles. La transformation de Sporolactobacilles par électroporation peut se dérouler en faisant passer une décharge électrique de tension élevée à travers une suspension de cellules comprenant un réplicon.
Le terme « transformation » désigne généralement le processus d'altération génétique d'une cellule résultant en l'entrée d'ADN exogène, provenant de son environnement, en son sein, à travers la membrane cellulaire et son incorporation. Dans le cadre de la présente invention, l'ADN exogène englobe les acides nucléiques qui sont introduits dans des Sporolactobacilles soit sous forme de simple brin, ou sous forme de double brin, sous une forme linéaire ou sous une forme circulaire, y compris l'ADN transformant cloné dans un réplicon.
Dans les méthodes d'application des principes de la présente invention, le réplicon peut-être un réplicon thermosensible. Le terme « thermosensible » dans le présent document, désigne la capacité du réplicon à se répliquer à une température permissive et l'incapacité du réplicon à se répliquer à une température non permissive. Généralement, l'origine de réplication de la réplicon thermosensible est fonctionnelle à la température permissive, mais non fonctionnelle à la température non permissive.
Dans certains modes de réalisation des présentes méthodes, le réplicon peut-être un plasmide. Des exemples de plasmides appropriés mais non limitatifs peuvent être PMSR10 (Rhee et al., 2007, Plasmid, 58(l):13-22); PMG36Cm (van de Guchte et al., 1989, Appl. Environ. Microbiol., 55(1): 224-8); PGK13 (Broadbent and Kondo, 1991, Appl. Environ. Microbiol., 57(2): 517-24); pHP13 (Haima et al., 1987, Mol Gen Genet., 209(2): 335-42); PAM401 (Ainley and Key, 1990, Plant Molecular Biology, 14(6): 949-967); pAMB22 (Zukowski and Miller, 1986, Gene, 46(2-3): 247-55); pGKV2 (Kok et al., 1985, Appl. Environ. Microbiol., 50(1): 94-101); PNZ8048 (Sanchez et al., 2008, Appl. Environ. Microbiol., 74(8): 2471-9); pBS42 (Wells et al., 1983, Nucleic Acids Res., 11(22):7911-25); pHPS9 (Haima et al., 1990, Mol Gen Genet., 223(2): 185-91); pNW33N (Kurt et al., 2005, Biotechnol. Lett., 27(15): 1117-21) and pG+host9 (Maguin et al., 1996, J. Bacteriol., 178(3): 931-935; Serror et al., 2003, Microbiology, 149: 1503-1511).
Le réplicon thermosensible peut être n'importe quel plasmide capable de se répliquer dans une souche de Sporolactobacille à une température permissive et incapable de se répliquer dans une souche de Sporolactobacilles à une température non permissive. Le réplicon thermosensible peut être par exemple pNW33N ou pG+host9. De préférence, le réplicon thermosensible est le plasmide pNW33N.
Dans certains modes de réalisation, les méthodes de la présente invention peuvent, après l'introduction de l'ADN dans des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles, comprendre les étapes de : mise en culture des cellules sur un milieu sélectif à une température permissive pour la réplication pour sélectionner des cellules transformées capables de croître sur ledit milieu sélectif à ladite température permissive, et culture des dites cellules transformées à une température non permissive pour la réplication afin de sélectionner des cellules transformées capables de croître à la dite température non permissive. Est donc divulgué ici un procédé permettant de modifier par génie génétique les espèces de Sporolactobacilles, comprenant les étapes suivantes: (a) introduction d’un ADN cloné dans un réplicon thermosensible, dans des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles, (b) mise en culture des cellules sur un milieu sélectif à une température permissive pour la réplication pour sélectionner des cellules transformées capables de croître sur ledit milieu sélectif à ladite température permissive, et (c) culture des dites cellules transformées à une température non permissive pour la réplication afin de sélectionner des cellules transformées capables de se développer à la dite température non permissive.
Dans certains modes de réalisation, la mise en culture des cellules sur un milieu sélectif et à une température permissive permet la sélection des transformants, c'est-à-dire des cellules qui ont repris le réplicon comprenant l'ADN transformant. De préférence, les colonies de cellules transformées sont isolées avant de cultiver des cellules transformées à la température non permissive. Cette isolation peut avantageusement permettre de vérifier l’introduction de l'ADN transformant.
Dans certains modes de réalisation, les cellules transformées peuvent être cultivées à la température non permissive, afin de permettre la sélection d'intégrants, c'est-à-dire des cellules qui ont intégré le réplicon ou l'ADN transformant dans leur matériel génétique. L'étape de mise en culture des cellules transformées à une température non permissive pour la réplication peut être réalisée sur un milieu sélectif. Ainsi, certains modes de réalisation fournissent une méthode de modification des espèces de Sporolactobacilles par génie génétique, comprenant les étapes suivantes: (a) introduction d’un ADN cloné dans un réplicon thermosensible, dans des cellules d'une espèce de Sporolactobacilles, (b) mise en culture des cellules sur un milieu sélectif à une température permissive pour la réplication afin de sélectionner des cellules transformées capables de croître sur le dit milieu sélectif à ladite température permissive, et (c) culture des dites cellules transformées sur un milieu sélectif à une température non permissive pour la réplication afin de sélectionner des cellules transformées capables de croître à ladite température non permissive. L'espèce de Sporolactobacilles peut être une espèce de Sporolactobacilles modérément thermophile. Donc, certains modes de réalisation fournissent une méthode pour modifier les espèces modérément thermophiles de Sporolactobacilles par génie génétique, comprenant les étapes suivantes: (a) introduction d’un ADN cloné dans un réplicon thermosensible, dans des cellules d'une espèce de Sporolactobacille modérément thermophile, (b) mise en culture des cellules sur un milieu sélectif à une température permissive pour la réplication afin de sélectionner des cellules transformées capables de croître sur un milieu sélectif à ladite température permissive, et (c) culture des dites cellules transformées à une température non permissive pour la réplication afin de sélectionner des cellules transformées capables de croître à ladite température non permissive.
La température permissive pour cultiver les cellules de Sporolactobacilles à l'étape (b) peut varier de 20° C à 40° C, préférentiellement entre 34° C et 37° C. La température permissive pour cultiver les cellules de Sporolactobacilles à l'étape (b) est préférentiellement 37° C si le réplicon thermosensible est pNW33N. La température permissive pour cultiver les cellules de Sporolactobacilles à l'étape (b) est préférentiellement 34° C si le réplicon thermosensible est pG+host9.
Les cellules de Sporolactobacilles peuvent être cultivées à une température permissive à l'étape (b) pour une période d'environ 4 jours, à environ 14 jours. Par exemple, les cellules peuvent être cultivées à l'étape (b) à une température permissive de 37° C pendant une période d'environ 4 jours à environ 8 jours, généralement environ 5 jours. Par exemple, les cellules peuvent être cultivées à l'étape (b) à une température permissive de 34° C pour une période d'environ 7 jours à 14 jours environ, habituellement environ 10 jours.
Dans un mode de réalisation, après l’étape (b) les cellules de Sporolactobacilles peuvent être cultivées une ou plusieurs fois comme une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix ou plusieurs fois dans un milieu de culture liquide ou solide. Dans un mode de réalisation préféré, à la suite de l'étape (b), la méthode comprend ainsi plusieurs cultures et sous-cultures des cellules telles que définies au point (b).
Dans un mode de réalisation, après l'étape (b) la méthode peut comporter le prélèvement de cellules transformées. Dans une autre application, après l’étape (b) la méthode peut comporter le prélèvement de cellules transformées et la vérification de l’introduction de l’ADN transformant ou du réplicon dans les cellules de Sporolactobacilles. La vérification de l'incorporation de l'ADN transformant peut être effectuée par réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction ; PCR).
La température non permissive pour cultiver les cellules de Sporolactobacilles à l'étape (c) peut varier de 30° C à 50° C. La température non permissive pour cultiver les cellules de Sporolactobacilles à l'étape (b) est préférentiellement 42 ° C si le réplicon thermosensible est pNW33N. La température non permissive pour cultiver les cellules de Sporolactobacilles à l'étape (b) est préférentiellement 37° C si le réplicon thermosensible est pG+host9.
Dans un mode de réalisation, les cellules peuvent être cultivées à l'étape en (c) jusqu'à ce que le réplicon soit intégré dans le chromosome des Sporolactobacilles préférentiellement par recombinaison homologue. Les cellules peuvent être cultivées à l'étape en (c) pour une période d'environ 1 jour à une dizaine de jours ( ?). Par exemple, les cellules peuvent être cultivées à l'étape (c) pour une période d'environ 2 jours à environ 6 jours, généralement pendant 4 jours. Dans le cas contraire, les cellules peuvent être cultivées à l'étape (c) pour environ 2 à 8 générations, par exemple, pour environ 3 à 6 générations, généralement pour environ 4 générations. La terme « génération » désigne le temps nécessaire pour le doublement de la population cellulaire et est mesurée comme un doublement de la densité optique à 600nm.
Dans un mode de réalisation, après l'étape (c) les cellules peuvent être cultivées une ou plusieurs fois comme une, deux, trois, quatre, cinq, six, sept, huit, neuf, dix ou plusieurs fois dans un milieu de culture liquide ou solide. Dans un mode de réalisation préféré, après l'étape (c), la méthode comprend ainsi les sous cultures des cellules telles que définies au point (c).
Dans un mode de réalisation, après l'étape (c) la méthode peut comporter le prélèvement des cellules transformées. Dans un autre mode de réalisation, après l’étape (c) la méthode peut comporter le prélèvement de cellules transformées et la vérification de l'incorporation de l’ADN transformant dans les chromosomes des cellules de Sporolactobacilles. La vérification de l'incorporation de l'ADN transformant peut être effectuée par réaction de polymérisation en chaîne (polymerase chain reaction ; PCR).
Les méthodes appliquant les principes de la présente invention peuvent concerner la culture (par ex., maintenir et/ou multiplier) des cellules en présence de milieux de culture, comme par exemple l'utilisation de milieux de culture liquide ou solide. De tels milieux de culture peuvent avantageusement soutenir le maintien (par exemple : survie, stabilité génotypique, phénotypique et fonctionnelle) et la multiplication des cellules.
Un milieu de culture approprié peut être le Ml7 (Merck, Biokar), ou la gélose GYP avec du СаСОз (Chang et al., 2008, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 58, 2316-20). Les milieux de culture peuvent comporterun ou plusieurs antibiotiques pour faciliter la sélection des cellules de Sporolactobacilles qui ont le réplicon parmi la majorité des cellules non transformées. Le terme « milieu sélectif », dans le présent document, désigne le milieu de culture, tel que défini ici comprenant un ou plusieurs antibiotiques.
Le réplicon peut comporter un gène de résistance à un antibiotique. Le gène de résistance à un antibiotique peut être présent sur l'ADN transformant ou sur un autre fragment du réplicon. Alternativement, le gène de résistance à un antibiotique peut être présent sur un autre réplicon. Un tel gène de résistance à un antibiotique permet de sélectionner les cellules de Sporolactobacilles qui ont pris le réplicon parmi la majorité des cellules non transformées. Dans certains modes de réalisation de la présente méthode, le réplicon comprend un gène de résistance pour un ou plusieurs des antibiotiques suivants : chloramphénicol, kanamycine, l'érythromycine et lincomycine. Dans les modes de réalisation préférés, le réplicon comprend un gène de résistance au chloramphénicol. En outre dans les modes de réalisation préférés, le réplicon comprend un gène de résistance à l'érythromycine et la lincomycine. La combinaison de l'érythromycine et la lincomycine permet de diminuer avantageusement l'apparition de faux positifs, c'est-à-dire de cellules qui se développent sur le milieu sélectif, mais qui n'ont pas repris le réplicon.
Dans certains modes de réalisation de la présente méthode, le milieu sélectif comprend le milieu de culture, tel que défini ici et un ou plusieurs antibiotiques parmi le chloramphénicol, la kanamycine, l’érythromycine et la lincomycine. Dans les modes de réalisation préférés, le milieu sélectif se compose de chloramphénicol. En outre dans les modes de réalisation préférentiels, le milieu sélectif comprend l'érythromycine et la lincomycine. Le milieu sélectif peut comporter un ou plusieurs antibiotiques tels que chloramphénicol, kanamycine, l'érythromycine et la lincomycine à des concentrations suffisantes pour tuer ou nuire à la croissance des cellules de Sporolactobacilles qui n'ont pas repris le réplicon. En général, le chloramphénicol peut être inclus dans le milieu de culture à une concentration variant de 0,1 à 100 pg/ml, préférentiellement de 5 à 25 pg/ml, par exemple, à environ 20, 15, 12.5, 10, 7,5 ou 5 pg / ml. En règle générale, la kanamycine peut être inclue dans le milieu de culture à une concentration variant de 0,1 à 100 pg/ml, par exemple entre 1 et 50 pg/ml, par exemple, à environ 45, 40, 35, 30 ou 25 pg/ml, ou environ 20 pg/ml ou moins, par exemple, à environ 15, 10 ou 7.5 pg/ml. En outre, l'érythromycine peut être inclue dans le milieu de culture à une concentration variant de 0,1 à 100 pg/ml, par exemple allant de 1 à 50 pg/ml, par exemple, à environ 45, 40, 35, 30 ou 25 pg/ml, ou environ 20 pg/ml ou moins, par exemple, à environ 15, 12.5, 10, 7.5, 5 ou 2.5 pg/ml. La lincomycine peut être inclue dans le milieu de culture à une concentration variant de 0,1 à 100 pg/ml, par exemple allant de 5 à 50 pg/ml, par exemple, à environ 45, 40, 35, 30 ou 25 pg/ml, ou environ 20 pg/ml ou moins, par exemple, à environ 12.5, 15, 10, 7.5 ou 5 pg/ml. en règle générale, l'érythromycine peut être inclus dans le milieu de culture à une concentration variant de 0,1 à 100 pg/ml, par exemple entre 1 et 50 pg/ml, par exemple à environ 30, 20, 10 ou 5 pg/ml et la lincomycine peut être inclus dans le milieu de culture à une concentration variant de 0,1 à 100 pg/ml, par exemple allant de 5 à 50 pg/ml, par exemple, à environ 20, 12.5 ou 10 pg / ml. Les dites valeurs se réfèrent aux concentrations d'antibiotiques respectifs après leur introduction dans les milieux de culture.
Certains modes de réalisations fournissent les méthodes décrites ici dans lesquelles les espèces de Sporolactobacilles peuvent être une souche de Sporolactobacilles ayant au moins 95 % identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID № 1. Par exemple, dans les méthodes appliquant les principes de la présente invention, les espèces de Sporolactobacilles pourront être une souche de Sporolactobacilles ayant au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 %, au moins 99,5 %, au moins 99,9 % d'identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID № 1.
Les termes « ARN 16 s », « ARN ribosomique 16 s » ou « l'ARNr 16 s » peuvent être utilisés indifféremment et faire référence à un composant de la petite sous-unité 30 s des ribosomes procaryotes. Généralement, les séquences d'ARN 16 s peuvent être utilisées dans la construction des phylogénies. Un arbre phylogénétique comparant les séquences d'ARN 16 s d'espèces de Sporolactobacilles est représenté dans la Figure 1.
Dans certains modes de réalisation, le réplicon thermosensible peut déprendre de la protéine RepB, d’un fragment fonctionnel ou d’une variante de celle-ci pour réaliser la réplication thermosensible. Dans certains autres modes de réalisation, le réplicon thermosensible peut contenir une séquence d'ADN codant pour un polypeptide ayant une fonctionnalité de réplication thermosensibles tels que RepB. L’origine de réplication prise en exemple RepB ou la protéine initiatrice RepB est une protéine d'initiation de la réplication en cercle roulant (ou cerlce tounant). Le RepB pris en exemple a été décrit comme provenant du plasmide ρΑΜαΙΔΙ qui n'est pas capable de se répliquer indépendamment chez Enterococcus faecalis, mais est capable de se répliquer chez Bacillus subtilis (Francia and Clewell, 2002, J. Bacteriol., 184(18), 5187-93; Perkins and Youngman, 1983, J. Bacteriol. 155(2): 607-15).
Le RepB pris en exemple comprend, sans s'y limiter, un RepB ayant la séquence primaire des acides aminés comme annoté sous les numéros d'accession Q7B6N7 ou C7WLN5 dans Uniprot/Swissprot (http://www.uniprot.org/uniprot/). La séquence protéique du RepB pris en exemple peut être aussi telle qu’annotée selon NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) au numéro d'accession NP 863351.1. La séquence protéique du RepB pris en exemple peut également être telle qu’annotée sous EMBL-Banque (http://www.ebi.ac.uk/ena/data/view/) EMBL-CDS AAN03827.1.
La référence ci-après à toute protéine, polypeptide ou peptide en tant que RepB peut également englober des fragments de celui-ci. Le terme « fragment » de protéine, polypeptide ou peptide désigne généralement une forme tronquée en N-terminal et/ou en C-terminal de ladite protéine, polypeptide ou peptide. Sans s'y limiter, un fragment d'acides nucléiques, de protéines, de polypeptide ou de peptide peut présenter au moins 5 %, ou au moins environ 10 %, par exemple, > 20 %, > 30 % ou > 40 %, comme préférentiellement > 50 %, par exemple, > 60 %, > 70 % ou > 80 %, ou encore plus préférentiellement > 90 % ou > 95 % de la séquence nucléotidique du dit acide nucléique ou de ladite séquence d'acides aminés de cette protéine, polypeptide ou peptide.
La référence ci-après à toute protéine, polypeptide ou peptide en tant que RepB peut également englober ses variantes. Le terme « variante » d'acides nucléiques, protéines, polypeptide ou peptide désigne la séquence d'acide nucléique, polypeptides, protéines ou de peptides (c'est-à-dire, la séquence de nucléotides ou la séquence d'acides aminés, respectivement) qui est sensiblement identique (c'est-à-dire, en grande partie mais pas totalement identique) à la séquence des dits acides nucléiques, protéines ou polypeptide définis, par exemple, ayant environ au moins 80 % identique ou au moins environ 85 % identique, par exemple, préférentiellement, au moins 90 % identique, préférentiellement à 91 %, 92 % identique, plus préférentiellement au moins environ 93 % identiques, par exemple, au moins 94 % identique, encore plus préférentiellement au moins environ 95 % identique, par exemple, au moins 96 % identique, encore plus préférentiellement au moins environ 97 % identique, par exemple, au moins identique à 98 % et plus préférentiellement au moins 99 % identique. De préférence, une variante peut afficher ces degrés d'identité aux acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides définis, lorsque la séquence entière des acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides définis est analysée par alignement de séquences (p. ex., identité globale de la séquence). Sont aussi inclus parmi les fragments et les variants desdits acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides, les produits de fusion des dits acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides avec un autre acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide, généralement sans lien avec les dits acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide. L’identité de séquence peut être déterminée en utilisant des algorithmes appropriés pour effectuer des alignements de séquences.. Par exemple, mais sans s’y limiter, les algorithmes qui peuvent être utilisés incluent ceux qui sont basés sur l’outil de recherche d’alignement basiques locals (Basic Local Alignment Search Tool = BLAST) initialement décrit par Altschul et al., 1990 (J Mol Biol 215 : 403-10), tel que l'algorithme "Blast 2 séquences" décrite par Tatusova et Madden 1999 (FEMS Microbiol Lett 174: 247-250), par exemple en utilisant les paramètres par défaut publiées ou autres paramètres appropriés (tels que, par exemple, pour l'algorithme BLASTN : coût pour ouvrir une brèche = 5, coût pour étendre un écart = 2, la pénalité pour une incompatibilité = -2, récompense pour un match = 1, x_dropoff d'écart = 50, valeur attendue = 10.0, taille de mot = 28 ; ou pour le BLASTP algorithme : matrice = Blosum62, coût pour ouvrir une brèche =11, coût d'étendre un écart = 1, valeur attendue = 10.0, taille de mot = 3).
Le degré d'identité entre deux séquences d'acides aminés correspond au pourcentage d'acides aminés identiques entre ces deux séquences. Le degré d'identité est déterminé en utilisant l'algorithme BLAST qui est décrite dans Altschul, et al., 1990 (J. Mol. Biol. 215: 403-10). Le logiciel qui permet de réaliser des analyses de BLAST est disponible en accès libre sur le site Web du Centre National d'information sur la biotechnologie (National Centre for Biotechnology information : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Les paramètres W, T et X de l'algorithme BLAST déterminent la sensibilité et la vitesse de l'alignement. Le programme BLAST utilisé par défaut possède les paramètres suivants: « Longueur de Mot » (W) égal à 11, matrice BLOSUM62 (voir Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)) alignement (B) de 50, attente (E) de 10, M = 5, N = 4 et une comparaison sur les deux brins.
Une variante de polypeptide, protéine ou peptide peut être un homologue (p. ex., orthologue ou paralogue) du dit polypeptide, protéine ou un peptide. Dans le présent document, le terme « homologie » désigne généralement une similarité structurelle entre deux macromolécules, particulièrement entre deux protéines ou polypeptides, de taxons identiques ou différents, dans laquelle ladite similitude est due à une ascendance partagée. Là où la présente spécification se réfère à ou englobe des fragments ou des variantes de polypeptides, protéines ou des peptides, cette préférence dénote des variantes et/ou des fragments qui sont « fonctionnels », c'est-à-dire qui retiennent au moins partiellement l'activité biologique ou la fonctionnalité prévue des protéines, peptides ou polypeptides respectifs. Par exemple et de manière non limitative, un fragment fonctionnel et/ou un variant fonctionnel de RepB doit conserver au moins en partie de l'activité biologique de RepB. Préférentiellement, un fragment fonctionnel et/ou un variante fonctionnel peut garder au moins environ 20 %, par exemple, au moins 30 %, ou au moins environ 40 % ou au moins environ 50 %, par exemple, au moins 60 %, plus préférentiellement au moins environ 70 %, par exemple, au moins 80 %, encore plus préférentiellement au moins environ 85 %, encore plus préférentiellement au moins environ 90 % et encore plus préférentiellement au moins environ 95 % ou même environ 100 % ou plus de l'activité biologique envisagée ou des fonctionnalités par rapport à la protéine, polypeptide ou peptide correspondant.
Dans certains modes de réalisation, la mise en culture à la température non permissive pour la réplication peut permettre à l'ADN d’être introduit dans le chromosome des Sporolactobacilles. L'ADN peut être introduit dans le chromosome des Sporolactobacilles par recombinaison non homologue ou par recombinaison homologue. Le terme « recombinaison homologue » désigne généralement un type de recombinaison génétique dans lequel des séquences de nucléotides sont échangées entre deux molécules identiques, similaires ou homologues d'ADN. Le terme « recombinaison non homologue » désigne généralement un type de recombinaison génétique entre des molécules d'ADN qui ne contiennent aucune homologie de séquence. Le terme recombinaison non homologue peut englober la recombinaison ectopique. La recombinaison homologue peut être préférable, car dans une situation de recombinaison homologue, il est possible de savoir où se déroulera la recombinaison. La recombinaison homologue peut également être préférée, car la recombinaison permet de supprimer une fonctionnalité, ou d’ajouter et de supprimer une fonctionnalité en même temps.
Dans certains modes de réalisation, lorsque la recombinaison homologue est souhaitée, l’ADN transformant comprend également une séquence d'ADN qui est homologue à une séquence cible présente dans le génome de la souche de Sporolactobacilles qui doit être génétiquement modifiée. L'homme du métier comprendra qu'il n'est pas nécessaire d'avoir 100 % identité afin d'obtenir la recombinaison homologue. Un pourcentage d’identité entre les acides nucléiques des séquences telles que l'ADN ou des séquences d'ARN d'environ 90 % sera suffisants. Par exemple, les séquences d'acides nucléiques peuvent être identique à au moins 91 %, par exemple identique à au moins 92 %, préférentiellement identique à au moins environ 93 %, par exemple identique à au moins 94 % , plus préférentiellement identique à au moins environ 95 %, par exemple identique à au moins 96 %, encore plus préférentiellement identique à au moins environ 97 %, par exemple, au moins identique à 98 % et encore plus préférentiellement identique à au moins 99 %. Dans certains modes de réalisation, l'ADN transformant est entouré de deux séquences homologues qui sont toutes deux d'une longueur suffisante pour permettre la recombinaison homologue. Cette longueur doit être au moins approximativement 200bp, par exemple, elle peut varier entre 200bp et 1500Pb, préférentiellement entre 200bp et lOOObp.
Dans certains modes de réalisation, l'ADN peut comporter un ou plusieurs gènes ou séquences codants pour un ou plusieurs polypeptides. Les gènes codants peuvent être utilisés avec les séquences de régulation qui sont fonctionnelles dans les cellules, par exemple leur séquences promotrices. Les séquences de régulation peuvent être des séquences qui sont nativement associés avec les séquences codantes, ou peuvent être des séquences homologues de celles-ci. Le gène codant peut être fusioné à toute séquence promotrice ou régulatrice fonctionnelle chez les espèces de Sporolactobacilles. Les séquences promotrices appropriées peuvent inclure les séquences présentes dans l'espèce de Sporolactobacilles, des promoteurs hybrides provenant de différents promoteurs indigènes des espèces de Sporolactobacilles ou des promoteurs artificiels.
Dans les méthodes d'application des principes de la présente invention, l'ADN peut coder une ou plusieurs fonctionnalités souhaitées. L'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de convertir métaboliquement ou de dégrader un substrat en glucose, en fructose ou en pyruvate. Par exemple, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides choisis dans le groupe comprenant la glucoamylase, cellulase, fructosan degradases, hemicellulase, exoglucanases, D-cellodextranases, cellobiohydrolases, a-amylase, a-glucosidase, pullulanase, pullulanase helper, glucan 1,4-a-glucosidase, glucose kinase, sucrose phosphorylase, glucokinase, endoglucanase, β-glucosidase, cellobiose phosphorolase, endochitinase, chitodextrinase, endochitinase, exochitinase, N-acetylglucosaminidase, fructose-6P-transaminase, N-acetylglucoasmine deacetylase, β-1,3(4)- endoglucanase, P-l,3-endoglucanase, p-l,6-glucosidase, P-l,3-exoglucanase, mannanase, mannosidase, pectate lyase, rhamnogalacturon lyase, rhamnogalacturon hydorlase, exopectate lyase, endoxylanase, xylosidase, a-galactosidase, a-glucoronidase, β-glucoronidase, arabinofuranosidase, arabitan endo 1,5-a arabinosidase, arabinogalactan endo 1,4-p-galactosidase, acetoxylan esterase, β-galactosidase, carboxyl esterase, endocellulase, exocellulases, processive endocellulases, cellobiohydorlases, β-xylosidases, β-D-mannanases, β-D-mannosidases, endopolygalacturonases, exopolygalacturonases, rhamnogalacturonan hydrolases, pectin lyases, pectate lyases, rhamnogalacturonan lyases, polygalacturonases, exoplygalacturonases, rhamnogalacturonases, endoxylogalacturonan hydrolases, a-D-xylosidases, arabinofuranosidases, arabinoxylan, arabinofuranohydrolases, endoarabinases, exoarabinases, inulinase, exoinulinase, endoinulinase, dextransucrase, sucrose:l,6-a-D-glucan-6-a-D-glucosyltransferase, altemansucrase, sucrose: 1,6(1,3)-a-D-glucan-6(3)-a-D-glucosyltransferase, mutan-(sucrose: 1,3-a-D-glucan-3-a-D-glucosyltransferase), reuteransucrase, sucrose: 1,4(6)-a-D-glucan-4(6)-a-D-glucosyltransferase, destransucrase, inulosucrase, sucrose:2,1 -β-D-fructan-1 -β-D-fructosyltransferase, glucosyltransferase, fructosyltransferase, glycoside hydrolase, levansucrases. Par exemple, la l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides choisis dans le groupe comprenant les invertases, ilulinases, levansucrases et fructosanes degradases. L'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides ayant la capacité de dégradation de xylose. Par exemple, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour le xylose isomérase et/ou la xylulokinase, préférentiellement des xyloses isomérases et/ou xylulokinase résistantes à la chaleur. Une représentation schématique de la conversion métabolique du D-xylose en pyruvate est illustrée à la Figure 2. L’ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides ayant la capacité de dégradation de l'amidon ou de ses dérivés partiellement hydrolysées. L’amidon est constitué de l'amylose, c'est-à-dire, un polymère de D-glucose avec des liaisons alpha-1, 4 et de l'amylopectine, c'est-à-dire, un polymère de glucose avec les liaisons alpha-1, 4 et des chaînes latérales d'alpha-1, 6. La dégradation complète de l'amidon exige l'action concertée de plusieurs enzymes : l’alpha-amylase (rupture des liaisons de l'alpha-1, 4), la pullulanase (rupture des liaisons de l'alpha-1, 6) et la glucoamylase (exoglucosidase de maltodextrines de faible poids moléculaire avec une activité maltase). Par conséquent, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides choisis dans le groupe comprenant glucoamylase, cellulase et pululanase. Par exemple, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant une ou plusieurs enzymes hydrolytiques de type glucoamylase, de préférence, une enzymes hydrolytiques de type glucoamylase résistante à la chaleur. Par exemple, l’ADN transformant peut comporter une séquence codant pour la glucoamylase du Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571/LMG2811 (Ganghofner et al., 1998, Biosci. Biotechnol. Biochem., 62(2): 302-308; Ducki et al., 1998, J. Gen. Appl. Microbiol., 44(5): 327-335). Cette exoglucosidase présente une activité maximale sur le maltoheptaose (100 %), mais dégrade aussi les substrats suivants : amidon total (79 %), amylose (88 %), pullulane (5 %), maltotetraose (85 %), maltotriose (20 %), isomaltose (2 %) et le maltose (8 %). Une représentation schématique de la conversion métabolique de l'amylose ou de l'amylopectine en pyruvate est illustrée à la Figure 3. L’ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire au moins un composé à partir de glucose, de fructose ou de pyruvate.
La syntaxe « polypeptide capable de produire un composé », tels qu'utilisés ci-après, peut englober des polypeptides qui peuvent produire ledit composé ou polypeptide impliqué dans la production du dit composé, c'est-à-dire, en produisant un composé intermédiaire dans la voie métabolique pour la production de ce composé. L’ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire des composés métaboliques primaires, secondaires ou tertiaires provenant de la glycolyse ou du cycle de Krebs (cycle de l’acide citrique). L’ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire au moins un composé choisi dans le groupe composé de l'acide lactique, acide lactique-L, acide lactique-D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2,3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, l'oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2- oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, acide succinique, acide 3- hydroxypropanoic, acide glucarique, glycérol, 1, 3-propanediol, xylitol, manitol, acide fumarique, acide aspartique, acide glutamique, acide itaconinc, acide dicarboxylique 2,5-furan, acide lévulinique, 3-hydroxybutyrolactone, sorbitol, acide glucoruonic, xylulose, a-cétoglutarate, glutamate, succinyl-CoA, malate, acide oxalique, acide acrylique, acide 3-hydroxypropanoïque, butyrique, acide malique, acide adipique, acide ascorbique, acide glutarique, acide gluconique, 1,4-diaminobutane, succindiamide, 1, 4-butanediol, n-butanol, isobutanol, succinonitrile, diméthylsuccinate, N-méthyl-pyrrolidone, γ-butyrolactone, 2-pyrrolidone, tertrahydorfuran, glucose-6-phosphate, phosphoénolpyruvate, pyruvate, menaquinol, ubiquinol, 1, 4-dicarboxylique, phosphate d'acétyle, acétyl-CoA, cis-aconitate, acétaldéhyde, 2-oxaloglutarate, acide poly lactique (Poly Lactic Acid = PLA), lactyl-CoA, inuline, inulotriose, inulotetraose, inulopentaose, bioéthanol, inulooligosaccharides, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, Méthionine,
Phénylalanine, Thréonine, Tryptophane, Valine, Alanine, Arginine, Asparagine, acide aspartique, Cystéine, acide glutamique, Glutamine, Glycine, Omithine, Proline, sélénocystéine, sérine, Taurine, Tyrosine, glucose, fructose et pyruvate.
Par exemple, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire au moins un composé choisi dans le groupe composé d'acide lactique, acide lactique-L, acide lactique-D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2, 3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, glucose, fructose et pyruvate. De préférence, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire de l'acide lactique-L ou l’acide lactique-D. Une représentation schématique de la conversion métabolique du pyruvate en acide lactique est illustrée à la Figure 4.
Dans certains modes de réalisation de la présente méthode, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences de D-lactate déshydrogénase 62 (D-LDH62) de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 donnée dans SEQ Ш no 2 et D-lactate déshydrogénase 65 (D-LDH65) de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831telle qu'elle figure dans SEQ Ш no 4( ?). Les chiffres dans les appellations D-LDH62 ou D-LDH65 désignent le contig sur lequel se trouvent ces gènes. Dans certains modes de réalisation, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences de L-lactate déshydrogénase (LDH-L) de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ Ш no 6 et de L-2-hydroxisocaproate déshydrogénase (L-HicDH) de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ Ш no 8.
Dans certains modes de réalisation des méthodes actuelles, l'introduction de l'ADN dans le chromosome de Sporolactobacillus peut inactiver une séquence codant pour une fonctionnalité indésirable du chromosome de Sporolactobacillus. L'inactivation de la séquence codant pour une fonctionnalité indésirable peut résulter de la perturbation de ladite séquence par l'ADN transformant. Par ailleurs, l'inactivation de la séquence codant pour une fonctionnalité indésirable peut résulter du remplacement de ladite séquence par l'ADN transformant.
Dans certains modes de réalisation, la fonctionnalité indésirable peut être le D-lactate déshydrogénase (LDH-D). Dans les autres modes de réalisation, la fonctionnalité indésirable peut être le L-lactate déshydrogénase (LDH-L), D-2-hydroxisocaproate déshydrogénase (D-HicDH) ou L-2-hydroxisocaproate déshydrogénase (L-HicDH). Avantageusement, ces méthodes permettent d'obtenir des espèces de Sporolactobacilles capables de produire exclusivement l'acide lactique-L ou exclusivement de l'acide lactique-D.
Une représentation schématique de la conversion métabolique stéréo-spécifique du pyruvate en acide lactique-L ou en acide lactique-D par la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 est montré dans les Figures 5A et 5B respectivement.
Dans certains modes de réalisation, la fonctionnalité indésirable peut être la D-lactate déshydrogénase 62 (D-LDH62) de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 2. Dans certains autres modes de réalisation, la fonctionnalité indésirable peut être la D-lactate déshydrogénase 65 (D-LDH65) de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 4. Dans certains modes de réalisation, la fonctionnalité indésirable peut être la L-lactate déshydrogénase (LDH-L) de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 6. Dans certains autres modes de réalisation, la fonctionnalité indésirable peut être L-2-hydroxisocaproate déshydrogénase (L-HicDH) de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 8.
Dans certains modes de réalisation des présentes méthodes, l'introduction d'ADN dans le chromosome de Sporolactobacillus peut inactiver la séquence codant pour la D-LDH62 de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 2 et l'introduction de du même ou d’un autre ADN dans le chromosome de Sporolactobacillus peut inactiver la séquence codant pour la D-LDH65 de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ Ш no 4. Dans certains autres modes de réalisation des méthodes actuelles, l'introduction de l'ADN dans le chromosome de Sporolactobacillus peut inactiver la séquence codant pour L-LDH de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 6 et l'introduction de la même ou d’une autre séquence d’ADN dans le chromosome de Sporolactobacillus peut inactiver la séquence codant pour la L-HicDH de la souche de Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 8. Ces méthodes permettent d'obtenir une souche de Sporolactobacillus LMG P-26831 capable de produire exclusivement l'acide lactique-L ou exclusivement de l'acide lactique-D.
Dans certains modes de réalisation des présentes méthodes, l'introduction de l'ADN dans le chromosome de Sporolactobacilles peut inactiver une séquence codant pour une fonctionnalité indésirable du chromosome de ces Sporolactobacilles et simultanément l'ADN peut coder pour une ou plusieurs fonctionnalités souhaitées. Avantageusement, ces méthodes permettent d'obtenir des espèces de Sporolactobacilles produisant abondamment et exclusivement de l’acide lactique-L ou de l’acide lactique-D. D’autres types de modifications génétiques pourraient également être envisagées afin de satisfaire aux autres exigences industrielles. Par exemple, l'attaque par des phages des bactéries industrielles telles que les espèces de Sporolactobacilles est un problème majeur pour l'industrie. Par conséquent, il existe un besoin pour des méthodes qui rendent les souches industrielles moins sensible aux attaques de phages. Par conséquent, dans certains modes de réalisation des méthodes actuelles, l'ADN transformant peut comporter une ou plusieurs séquences capables d'augmenter la résistance des espèces de Sporolactobacilles aux bactériophages. Par exemple, l'ADN transformant peut comporter des séquences de courtes répétitions palindromique groupées et régulièrement espacées (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats = CRISPR), des séquences associés à CRISPR (gènes Cas) et des gènes codant pour une ou plusieurs enzymes ayant une capacité de restriction ou de modification de l'ADN.
Un autre aspect concerne une souche de Sporolactobacillus vineae caractérisée par une séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID No 1. Est aussi inclue dans certains modes de réalisation une souche de Sporolactobacilles ayant au moins 96 % d’identité avec la séquence d'ARN 16s telle qu'elle figure dans SEQ ID No 1. Par exemple, une souche de Sporolactobacilles ayant au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 %, au moins 99,5, au moins 99,9 % d'identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID No 1.
Un autre aspect concerne une espèce génétiquement modifiée de Sporolactobacilles obtenue par les méthodes décrites ici. Certains modes de réalisation fournissent des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles obtenues par les méthodes de l’invention, dans lequel des espèces de Sporolactobacilles sont capables de produire au moins un composé choisi dans le groupe composés suivant : acide lactique, acide lactique-L, acide lactique-D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2,3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, l'oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, l'acide succinique, acide 3-hydroxypropanoic, acide glucarique, glycérol, 1, 3-propanediol, xylitol, manitol, acide fumarique, acide aspartique, acide glutamique, acide itaconinc, acide dicarboxylique 2,5-iuran, acide lévulinique, 3-hydroxybutyrolactone, sorbitol, acide glucoruonic, xylulose, a-cétoglutarate, glutamate, succinyl-CoA, malate, acide oxalique, acide acrylique, acide 3-hydroxypropanoïque, butyrique, acide malique, acide adipique, acide ascorbique, acide glutarique, acide gluconique, 1, 4-diaminobutane, succindiamide, 1, 4-butanediol, n-butanol, isobutanol, succinonitrile, diméthylsuccinate, N-méthyl-pyrrolidone, γ-butyrolactone, 2-pyrrolidone, tertrahydorfuran, glucose-6-phosphate, phosphoénolpyruvate, pyruvate, menaquinol, ubiquinol, 1, 4-dicarboxylique, phosphate d'acétyle, acétyl-CoA, cis-aconitate, acétaldéhyde, 2-oxaloglutarate, Poly acide lactique (PLA), lactyl-CoA, inuline, inulotriose, inulotetraose, inulopentaose, bioéthanol, inulooligosaccharides, Histidine, Isoleucine, Leucine, Lysine, méthionine, phénylalanine, thréonine, tryptophane, Valine, Alanine, Arginine, Asparagine, acide aspartique, cystéine, acide glutamique, Glutamine, Glycine, Omithine, Praline, sélénocystéine, sérine, Taurine, Tyrosine, glucose, fructose et pyruvate. De plus, certains modes de réalisation fournissent des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles obtenues par les méthodes enseignées dans les présentes, dans lequel des espèces de Sporolactobacilles sont capables de produire au moins un composé choisi dans le groupe composés suivant : acide lactique, acide lactique-L, acide lactique-D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2,3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, l'oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, glucose, fructose et pyruvate. Certains modes de réalisation préférés fournissent des espèces génétiquement modifiées de
Sporolactobacilles obtenues par les méthodes enseignées dans les présentes, dans lequel des espèces de Sporolactobacilles sont capables de produire de l’acide lactique-L ou de l’acide lactique-D.
Certains modes de réalisation fournissent des espèces génétiquement modifiées de
Sporolactobacilles obtenues par les méthodes décrites dans l’invention, dans lequel les espèces de Sporolactobacilles sont capable de produire un ou plusieurs polypeptides sélectionné parmi les suivants D-LDH62 de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ Ш no 3, D-LDH65 de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 5, L-LDH de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 7 et L-HicDH de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 9.
Certains modes de réalisation fournissent des espèces génétiquement modifiées de
Sporolactobacilles obtenues par les méthodes décrites ici, dans lesquelles une ou plusieurs séquences sélectionnées parmi la séquence codant pour la D-LDH62 de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 2 et la séquence codant pour la D-LDH65 de la souche souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ ID no 4 ont été inactivées de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 chromosome. Certains modes de réalisation plus fournissent des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles obtenues selon les méthodes de l’invention, dans lesquelles une ou plusieurs séquences sélectionnées parmi la séquence codant pour la L-LDH de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ Ш no 6 et la séquence codant pour la L-HicDH de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831 telle qu'elle figure dans SEQ Ш no 8 ont été inactivées du chromosome de la souche Sporolactobacillus LMG P-26831. Cette souche génétiquement modifiée de Sporolactobacillus LMG P-26831 peut être en mesure de produire exclusivement de l'acide lactique-L ou exclusivement de l'acide lactique-D.
Certains modes de réalisation fournissent des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles obtenues par les méthodes décrites ici, dans lesquelles les espèces de Sporolactobacilles sont capable de produire des xylose isomérase et/ou xylulokinase, de préférence, des xylose isomérase et/ou xylulokinase résistantes à la chaleur. Avantageusement, ces xylose isomérase et/ou xylulokinase résistantes à la chaleur sont fonctionnelles à un pH compatible avec les espèces de Sporolactobacillus.
Certains modes de réalisation fournissent des espèces génétiquement modifiées de
Sporolactobacilles obtenues par les méthodes de l’invention, dans lesquelles les espèces de Sporolactobacilles sont en mesure de produire des enzymes hydrolytiques de type glucoamylase, préférentiellement, des enzymes hydrolytiques de type glucoamylase résistantes à la chaleur. Certains modes de réalisation fournissent des espèces génétiquement modifiées de
Sporolactobacilles obtenues par les méthodes décrites ici, dans lesquelles les espèces de
Sporolactobacilles sont capable de produire la glucoamylase de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571/LMG2811. Avantageusement, ces enzymes hydrolytiques de type glucoamylase comme la glucoamylase de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571/LMG2811 sont fonctionnelles à un pH compatible avec l'espèce Sporolactobacillus.
Des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles, telles que définies ici, sont en outre révélés dans certains modes de réalisation, dans lesquels les espèces de Sporolactobacilles sont une souche génétiquement modifiée de Sporolactobacilles ayant au moins 95 % identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID no n°l. Par exemple, sont également décrites des espèces génétiquement modifiées de Sporolactobacilles telles que définies ici, dans lesquelles les espèces de Sporolactobacilles sont une souche génétiquement modifiée de Sporolactobacilles ayant au moins 96 %, au moins 97 %, au moins 98 %, au moins 99 %, au moins 99,5, au moins 99,9 % d’identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID no n°l.
Un autre aspect concerne un procédé de préparation d'au moins un composé sélectionné dans le groupe comprenant : l’acide lactique, l’acide lactique-L, l’acide lactique-D, l’acétolactate, le diacétyle, l’acétoïne, le 2,3 butènediol, le 1,2-propanediol, l’acétate, le formate, l’acétaldéhyde, l’éthanol, la L-alanine, l’oxaloacétate, le S-malate, le succinate, le fumarate, le 2-oxoglutarate, l’oxalosuccinate, l’isocitrate, le citrate, le glyoxylate, le glucose, le fructose et le pyruvate, dans lequel une espèce de Sporolactobacilles génétiquement modifiée telle que définie ici est utilisée. La préparation d'un composé tel que défini dansl’invention, en utilisant une espèce de Sporolactobacilles génétiquement modifiée telle que décrite, peut-être être effectuée par la fermentation de matière première.
Le procédé peut être effectué dans des conditions qui permettent la production du composé désiré. Par exemple, le procédé peut être réalisé en batch ou en mode continu. Dans certains modes de réalisation, le procédé peut être mené à des températures supérieures à 40 0 C. Dans certains autres modes de réalisation, le procédé peut être effectué à un pH inférieur à 6,0. Dans certains modes de réalisation préférés, le procédé peut être effectué à des températures supérieures à 40 ° C et à pH inférieur à 6,0.
Ces procédés permettent avantageusement de cultiver des espèces de Sporolactobacillus telles que définies dans l’invention à des températures relativement élevée, qui diminuent le risque de contamination et donc le coût de la stérilisation. En outre, ces procédés permettent de cultiver des espèces de Sporolactobacilles telles que définies ici à un pH relativement faible qui permet la production de composés acides sans utiliser de grandes quantités d'agents ayant un effet tampon. Ces procédés utilisant des espèces de Sporolactobacilles telles que définies dans l’invention peuvent garantir des rendements élevés de composés ayant une valeur commerciale et de faibles pertes en carbone.
Des espèces de Sporolactobacilles génétiquement modifiées telles que définies ici peuvent permettre une croissance vigoureuse dans des milieux de culture relativement simple aidant à garder les matières premières à leur niveau le plus bas et permettant donc un bon rapport coût-efficacité. Aussi, des espèces de Sporolactobacilles génétiquement modifiées telles que définies dans l’invention peuvent en outre aider à éviter le processus de fermentation dans des conditions strictement anaérobies ou aérobies, qui sont connues pour leurs coûts élevés en raison de la nécessité d'une dispersion de gaz.
Bien que l'invention ait été décrite conjointement avec des modes de réalisation spécifiques à celle-ci, il est évident que, à la lumière de la description qui précède, plusieurs alternatives, modifications et variantes apparaîtrontà l’homme de l’art. En conséquence, il est prévu d’inclure toutes ces alternatives, modifications et variantes qui en découlent dans l'esprit et la portée des revendications annexées.
Les aspects ci-dessus et les modes de réalisation sont étayés par les exemples non limitatifs suivants.
EXEMPLES
Les aspects ci-dessus et les modes de réalisation sont étayés par les exemples non limitatifs suivants.
Exemple 1: Plasmides pour la modification des souches de Sporolactobacilles
Plusieurs plasmides ont été testés pour la transformation par électroporation de la souche de Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 (tableau 1).
Les plasmides suivants n’ont donné aucune colonie de cellules transformantes : pMSRIO (Rhee et al., 2007, Plasmid, 58(1):13-22), pGIZ906-pldh (Lorquet et al., 2004, J. Bacteriol., 186(12) : 3749-3759).
Les plasmides suivants ont donné quelques colonies : Kana-pMSRIO (= pMSRIO voir référence ci-dessus, auquel a été ajouté un gène de résistance à la kanamycine), pMG36Cm, pGK13, pHP13, pAM401, pAMB22, pGKV2, pNZ8048, pBS42 et pHPS9.
Le plasmide pNW33N et le plasmide pNW33N comprenant le gène de résistance à l’érythromycine 5 ont donné le plus de colonies transformantes de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 comparé avec les plasmides mentionnés ci-dessus.
Tableau 1: Plasmides utilisés pour la transformation de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831
10 Exemple 2: Préparation d'un plasmide comprenant un réplicon thermosensible et un fragment interne de la L-lactate déshydrogénase (LDH-L), L-2-hydroxyisocaproate déshydrogénase (L-HicDH), D-lactate déshydrogénase 62 (D-LDH62) on D-lactate déshydrogénase 65 (D-LDII65).
Quatre plasmides ont été construits pour la modification génétique des souches de Sporolactobacillus : pNW33N comprenant un fragment interne de la L-LDH ; pNW33N comprenant un fragment interne de la L-HicDH ; pNW33N comprenant un fragment interne de la D-LDH62 et pNW33N comprenant un fragment interne de la D-LDH65.
Construction des plasmides L'amplification d'un fragment interne de la L-lactate déshydrogénase (LDH-L) de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 a été réalisée selon un protocole décrit par Platteeuw et coll. (1995, Appl.Environ. Microbiol., 61 : 3967-3971). La séquence de la L-LDH de L. lactis a été comparée à la séquence de la L-LDH de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 en utilisant les logiciels Clone Manager et Clustal. Les amorces ci-dessous ont été choisies comme indiqué dans le tableau 2.
Tableau 2: Séquences des amorces pour la L-LDH de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 (queue flottante comportant le site de restriction BamHI (souligné))
L’amplification d'un fragment interne de la L-2-hydroxyisocaproate déshydrogénase (L-HicDH) de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 repose sur la similitude des structures entre la L-HicDH et la L-LDH, et les séquences ont été alignées comme décrit ci-dessus. Les amorces ci-dessous ont été choisies comme indiqué dans le tableau 3.
Tableau 3: Séquences des amorces pour la L-HicDH de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 (queue flottante comportant le site de restriction BamHI (souligné)).
L'amplification d'un fragment interne des D-lactate déshydrogénase D-LDH62 et D-LDH65 (par référence aux contigs sur lequel ils se trouvent) de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 a été réalisée selon un protocole décrit par Bernard et coll. (1994, EUR J. Biochem., 224, 439-446). Les amorces ci-dessous ont été choisies comme indiqué dans le tableau 4.
Tableau 4: Séquences des amorces pour les D-LDH62 et D-LDH65 de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 (queue flottante comportant le site de restriction BamHI (souligné)).
Amplification par PCR
La PCR a été réalisée avec l'enzyme Phusion (haute processivité) dans le mélange réactionnel suivant: 1 μΐ d’ADN chromosomique de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 (concentration : lOng/μΙ), 1 μΐ dNTP (20 mM) ; 0,5 μΐ amorce 1 (100 μΜ) ; 0,5 μΐ amorce 2 (100 μΜ) ; 10 μΐ tampon HF Phusion (5x) ; 0,5 μΐ enzyme Phusion (Finnzymes, F - 530 L) et de l'eau jusqu'à 50 μΐ.
Pour les PCR réalisées à partir de colonies, c'est-à-dire, sans extraction de l'ADN chromosomique, 1 colonie a été récupérée avec un cure-dent et déposée dans 50 μΐ d'eau. Les conditions de la PCR ont été les suivantes: 5 μΐ d’une colonie dilluée dans l’eau, 1 μΐ dNTP (20 mM) ; 5 μΐ amorce 1 (100 μΜ) ; 0,5 μΐ amorce 2 (100 μΜ) ; 10 μΐ tampon (x 5) ; 0,5 μΐ enzyme Phusion et de l'eau jusqu'à 50 μΐ. L'appareil était le GEN PERKIN-ELMER Amp ® PCR System. Le programme comportait une dénaturation de 5 minutes à 98 ° C, 25 cycles de 30 secondes à 96 °C, 30 secondes à x ° C (température d'hybridation choisie conformément au Tm) et 30 secondes à 72 °C et un allongement final de 5 minutes à 72 °C.
Amplification des inserts Étant donné qu'il doit y avoir une grande quantité d'insert afin de réaliser un clonage dans pNW33N, les fragments PCR obtenus ont été clonés pour amplification dans pGEMTeasy (Promega #A1360), conformément aux recommandations du fournisseur.
Restrictions du vecteur pNW33N pNW33N est décrit comme étant un vecteur navette entre Escherichia coli, Bacillus subtilis et Geobacillus stearothermophilus et comprend un site multiple de clonage provenant du plasmide pUC19 ; une origine de réplication fonctionnelle chez E. coli provenant du plasmide pUC19 ; une origine de réplication en « rolling circle » dénommé RepB et provenant du plasmide pTHT15 de Geobacillus stearothermophilus ; et un gène de résistance au chloramphénicol qui est dérivé d'un plasmide de Staphylococcus aureus et qui est dénommé chloramphénicol acétyltransférase (Cat).
Une restriction avec EcoRI du vecteur pNW33N a été réalisée pendant 2 heures à 37 ° C et selon les conditions suivantes : 1,5 μΐ de pNW33N, 2 μΐ BSA 10 x, 1,5 μΐ EcoRI, 2 μΐ de tampon et 13 μΐ d'eau. L'ADN de pNW33N restreint a été déposé sur gel pour récupération dans un volume final de 50 μΐ (Figure 6, piste 1) (kit QIAquick Qiagen). Après purification (kit QIAquick PPK Qiagen), une aliquote a été déposée sur gel pour quantification (Figure 7, piste 1).
Restriction des fragments PCR des fragments internes des gènes de L-LDH, L-HicDH, D-LDH62 et D-LDH65 de la souche LMG P-26831
Les amorces utilisées pour l'amplification PCR comportent un site BamHI à leur extrémité 5' qui pouvait être utilisée pour le clonage. Toutefois, ce sont les sites de restriction EcoRI de pGEMTeasy qui ont été utilisés pour le clonage.
Le pGEMTeasy comprenant l'insert a été restreint par EcoRI pendant 2 heures à 37 ° C et selon les conditions suivantes : 1,5 μΐ de pGEMTeasy, 2 μΐ BSA 10 x, 1,5 μΐ EcoRI, 2 μΐ de tampon et 13 μΐ d’eau, puis les inserts ont été récupérés sur gel (Qiagen Qiaquick gel extraction kit Réf. 28706). Une aliquote a été déposée sur gel pour quantification. Les pistes 1, 2, 3 et 4 de la Figure 8 correspondent respectivement aux fragments internes restreints de LDH-L, L-HicDH, D-LDH62 et D-LDH65.
Ligation du vecteur pNW33N avec les fragments internes des gènes de L-LDH, D-LDH62 et D LDH65 de la souche LMG P-26831
La ligation du vecteur pNW33N restreint avec les fragments internes restreintes des gènes de la LDH-L, L-Hic-DH, D-LDH62 et D-LDH65 de la souche LMG P-26831 a été réalisée à 16 ° C pendant 16 h et dans un volume final de 12,2μ1: 5 μΐ de vecteur, 5 μΐ insert, 1,2 μΐ de tampon de ligase et 1 μΐ ligase (New England Biolabs, M0202).
Transformation
Une aliquote de 2 μΐ de chacune des 4 ligations décrites ci-dessus a été transformée par un protocole standard dans une aliquote de 50 μΐ de cellules d'Escherichia coli électrocompétentes (souche E. coli GM2173, (dam - dcm-)). La sélection s'est faite sur boîtes de gélose LB contenant 20 pg/ml chloramphénicol (Cm), correspondant au marqueur de résistance du pNW33N.
Les E. coli obtenus ont été cultivés, et leur plasmide a été extrait par la méthode de MiniPrep (PLN350-1KT, GenElute mini prep Kit, Sigma-Aldrich). Les plasmides ont été validés par des restrictions diagnostiques et par séquençage. Des midi préparations d'ADN ont été effectuées (740573.100, Plasmid DNA purification Nucleobond AX 100, Macherey-Nagel).
Dialyse des plasmides construits avant l'électroporation
Afin de retirer les sels et diminuer les risques d'avoir un arc électrique au cours de l'électroporation, 50 μΐ de midi préparation a été dialysée pendant 30 minutes sur une membrane (VSWP02500, MF-membrane filtrante 0.025 pm) contre 30 ml de l'eau désionisée stérile.
Les 4 plasmides construits étaient : pNW33N comprenant un fragment interne de L-LDH ; pNW33N comprenant un fragment interne de L-HicDH ; pNW33N comprenant un fragment interne de D-LDH62 et pNW33N comprenant un fragment interne de D-LDH65.
Exemple 3: modification génétique de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831
Préparation du matériel
Milieu de culture Ml7 : 42,5 g de M17 (Merck Ref 1.15029.0500) a été ajouté à 800 ml d'eau. Le pH a été ajusté à 5,5 par addition de HCl. Le volume a ensuite été porté à 1 L et subdivisé en autant de bouteilles que nécessaire, puis filtré sur filtre 0.2pm. Juste avant utilisation, du glucose stérile a été ajouté à une concentration finale de 2 % (= 10 ml du stock de glucose à 40 % dans 200 ml M17). СаСЬ ( 1 M): 7.351 g a été ajouté à 50 ml d'eau, le mélange a ensuite été filtré sur filtre 0.2pm.
MgCL (1 M): 10.165 g a été ajouté à 50 ml d'eau ; le mélange a ensuite été filtré sur filtre 0.2pm. PEG1000 (30 %): 60 g de PEG1000 a été porté à 200 ml avec de l'eau distillée. Le mélange est filtré et ensuite conservé à 4 ° C.
Milieu de régénération : 2,1 g de M17 (Merck Ref 1.15029.0500) a été ajouté à 8,56 g de saccharose ; 0,5 g de glucose ; 1 ml de MgCl2 (1 M) et 50 μΐ CaCl2 (1 M) dans 40 ml d'eau. Le pH du mélange a été ajusté à 5.5 et la solution a été ensuite portée à 50 ml avec de l'eau distillée. Cette solution a été ensuite aliquotée par 1,5 ml dans le nombre requis d'Eppendorfs de 2 ml et préincubée à 37 ° C.
Cellules compétentes de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831
Une pré-culture de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 a été réalisée par inoculation dans du milieu de culture contenant du CaC03 et cultivée pendant une nuit à 42 0 C.
La centrifugeuse a été refroidie à 4 °C. La densité optique de la pré-culture a été mesurée à une longueur d'onde de 600 nm (DO600) en solubilisant l’excès de CaC03 (dilution 10 x: 100 μΐ de culture dans le milieu de culture + 800μ1 du liquide physiologique (9 g/1 de NaCl dans l'eau) + 100 μΐ de HCl).
Selon la densité optique de la pré-culture, le volume d’inoculum nécessaire peut être calculé pour que la culture ait un DO entre 0,15 et 0,17. Cette quantité de pré-culture a été inoculée dans un flacon préchauffé de 500 ml de M17 à pH 5,5 contenant 2 % de glucose. La culture a été réalisée à 37 °C.
Lorsque la culture atteint une DO600 d'environ 0,25-0,35 (doublement), les cellules ont été centrifugées pendant 5 min à 4000 tr/min et 4 0 C. Le culot cellulaire a été lavé trois fois avec de l’eau avec 1 volume de la culture initiale, trois fois avec de l'eau avec 1/2 x volume de la culture initiale (réunir les tubes) et trois fois avec du PEG1000 (30 %) avec 1/4 x volume de la culture initiale.
Le culot cellulaire a été ensuite remis doucement en suspension à 4 ° C. Les cellules ont été remises en suspension dans 1-1,5 ml (pour 400 ml de milieu de culture initial) de PEG1000 froid (30 %). Environ 5.109 -1010 UFC/ml ont été obtenus. Ces cellules compétentes peuvent être utilisés immédiatement ou être conservés à-80 ° C pendant au moins un an.
Electro-transformation 75μ1 de cellules électrocompétentes ont été placées dans une cuvette d'électroporation de 1 mm maintenue sur glace. 7,5 μΐ du plasmide a été ajouté. Chacun des 4 plasmides construits (pNW33N comprenant un fragment interne de L-LDH ; pNW33N comprenant un fragment interne de L-HicDH ; pNW33N comprenant un fragment interne de D-LDH62 et pNW33N comprenant un fragment de D-LDH65) a été utilisé séparément. Les contrôles étaient : pas d'ADN + impulsion ; ADN + pas d'impulsion ; plasmide vide + impulsion. L’électroporation a été réalisée dans les conditions suivantes : 1.5KV (valeur fixe), 25pF et 400 Ω (constante de temps = 7 ou 8). Immédiatement après l'électroporation, les cellules ont été transférées dans 1,5 ml de milieu de régénération préchauffé à 37 °C et incubées à 37 ° C pendant 3 heures.
Les cellules ont été centrifugés à température ambiante (2000 tr/min/10 min), le milieu de régénération a été ôté, le culot a été resuspendu dans le milieu resté au fond du tube (environ 100 μΐ) et étalé sur une boîte de Pétri M17 contenant du chloramphénicol à 10pg/ml.
Les boîtes ont été incubées dans des jarres anaérobies à 37 ° C pendant 5 jours ou plus. Sélection et validation des transformants
Lorsque les colonies sont apparues sur les boîtes, elles ont été repiquées plusieurs fois sur une boîte contenant du chloramphénicol 10pg/ml (CmlO). Une PCR sur colonie a été ensuite réalisée avec des amorces qui s'hybrident à l'intérieur du plasmide (par exemple sur le gène conférant la résistance au chloramphénicol) pour vérifier si le plasmide se trouvait effectivement à l'intérieur des cellules. Il s'agissait d'un premier niveau de validation.
Le deuxième niveau de validation consistait en une culture liquide des transformants en milieu M17 pH5.5 avec 2 % de glucose et CmlO, suivie de l’extraction de l'ADN plasmidique (mini prep) et d’une PCR (identique à celui du premier niveau de validation).
Le troisième niveau de validation consistait en l’utilisation de l'ADN plasmidique extrait au deuxième niveau de validation pour effectuer une transformation retour dans E. coli, suivie d’une extraction d’ADN (mini prep). Cet ADN a été soumis à une restriction diagnostique afin de vérifier qu'il s’agissait en réalité du plasmide attendu.
Obtention des intégrants
Des cultures liquides des transformants ont été déplacées de 37 ° C à 42 0 C (encore une fois en présence de l'antibiotique CmlO). À 42 0 C, l'origine de réplication RepB du plasmide pNW33N n’est plus fonctionnel, et la seule façon que les plasmides puissent être maintenus dans la cellule (et donc le seul moyen pour la cellule de conserver le marqueur de résistance à l’antibiotique) est que le plasmide s’intégre dans le génome bactérien : de préférence par recombinaison homologue au site du fragment « interne » du gène cible, ou plus rarement de façon ectopique. L'intégration du plasmide dans les gènes cibles eu pour conséquence de le désactiver ou en d'autres termes, faire un Knock Out (KO) de celui-ci. Après plusieurs cycles de culture à 42 ° C, la culture liquide a été déposée sur une boîte de Pétri afin d'obtenir des colonies isolées.
Validation des intégrants
Les colonies isolées ont été soumises à une PCR sur colonie afin de vérifier, en amplifiant les fragments de bord que le plasmide s’est effectivement intégré à l'intérieur du génome bactérien et au site attendu. Les mutants obtenus sont appelés non-propres et non stables, car ils contiennent des séquences exogènes et si la sélection par antibiotique est levée, ils peuvent retourner au génotype sauvage par recombinaison homologue et ainsi perdre le plasmide.
Dans la méthode donnée en exemple, 8.Ю10 cellules (divisé en environ 25 aliquotes ; c'est-à-dire environ 3,2.109 cellules par aliquote) ont été engagés. La viabilité après toutes les étapes de préparation des cellules compétentes et électroporation a été de 3.107 (c'est-à-dire 1,2.106 cellules par aliquote). Le nombre de transformants obtenus est de l'ordre de 1 par aliquote, c'est-à-dire un taux de transformation de 1.10'6.
Ce taux de transformation est faible ; cependant, cette méthode a permis d'obtenir des transformants de façon reproductible. En outre, ces transformants ont été validés par les transformations retour dans E. coli.
Par conséquent, la méthode exemplaire a permis de transformer par électroporation des plasmides différents comprenant un fragment interne des différents gènes cibles de la souche Sporolactobacillus vineae LMG P-26831, obtenant ainsi des knock outs par recombinaison homologue de chacun de ces gènes cibles. Par conséquent, cette méthode a permis de modifier génétiquement la souche de Sporolactobacillus vineae LMG P-26831.
Exemple 4: Modification génétique de la souche de Sporolactobacillus vineae LMG P-26831 par knock-out propre et stable d'une fonctionnalité indésirable du chromosome de
Sporolactobacillus
La figure 9 représente un aperçu schématique de la stratégie mise en ouvre pour obtenir des souches Sporolactobacillus génétiquement modifiées avec une délétion propre et stable d'un gène cible.
Dans la Figure 9 a, un plasmide contenant la séquence « Amont-Cat-Aval », avec « Amont » étant la séquence de nucléotides correspondant aux 1500 pb en amont du codon start du gène cible ; avec « Cat » étant le gène de résistance au chloramphénicol sous le contrôle du promoteur P32 ; et avec « Aval » étant la séquence de nucléotides correspondant aux 1500 pb en aval du codon stop du gène cible, est introduit dans une cellule de Sporolactobacillus par électroporation. Une recombinaison homologue, par exemple dans la région en amont, permet au fragment Amont-Cat-Aval d'être intégré dans le génome bactérien (Figure 9(b)). Si une deuxième recombinaison homologue se déroule dans le même fragment, cela permet de revenir à la situation de départ (Figure 9(a)), ou si elle a lieu dans l'autre fragment (ici dans la région en aval), cela peut donner lieu à une situation dans laquelle le gène cible est sur le plasmide et le gène cat est dans le génome bactérien (Figure 9(c)). La sélection des bactéries sensibles à l’érythromycine et résistantes au chloramphénicol permet d'isoler des mutants dans laquelle le gène cible a été remplacé par le gène cat et le gène cible a été perdu avec le plasmide (Figure 9(d)).
Dans la Figure 9(e), un plasmide contenant la séquence « Amont-Aval » est introduit dans une cellule de Sporolactobacillus par électroporation et une recombinaison homologue, par exemple dans la région en amont, permet qu'il soit intégré dans le génome bactérien (Figure 9(f)). Si la deuxième la recombinaison se déroule dans la même région, cela permet de revenir à la situation de la Figure 9 (e), ou si elle a lieu dans les autres régions (ici dans la région en aval), cela donnera lieu à une situation dans laquelle le gène cat est sur le plasmide et où il n'y plus de séquence dans le génome de Sporolactobacillus où le gène cible se trouvait (Figure(g)).
Dans la Figure 9(h), la sélection des bactéries sensibles à l'érythromycine et au chloramphénicol permet d'isoler des mutants dans laquelle le gène cible a été complètement supprimé et le gène cat a été perdu avec le plasmide. Ce mutant est appelé « propre et stable ».
Un knock-out du gène de la L-HicDH du génome de Sporolactobacillus a été réalisé. Pour ce gène cible, deux plasmides ont été construits selon la procédure décrite dans l'exemple 2: (i) pNW33N comprenant comme un insert "Amont-Cat-Aval" et (ii) pNW33N comprenant un insert "Amont-Aval".
Les amorces de l'exemple 4 avec un nom qui contient le terme "lox" ont une séquence (soulignée) qui est homologue aux amorces lox utilisées pour amplifier la P32-Cat. Cette séquence a permis d'effectuer une PCR de recouvrement pour "joindre" les 3 fragments de PCR, à savoir, un fragment amont et P32-Cat et un fragment aval ensemble dans un seul grand fragment de PCR. La queue des amorces de l’Exemple 4 contenant un site de restriction pour le clonage est indiqué en caractères gras.
Table 5 : Séquences des amorces sens (Uplox66) et anti-sens (Dnlox71) utilisées pour amplifier P32-Cat
Table 6 : Séquences des amorces sens (UP1) et anti-sens (UP2_lox) utilisées pour amplifier la région en amont de L-HicDH
Table 7 : Séquences des amorces sens (DNllox) et anti-sens (DN2) utilisées pour amplifier la région en aval de L-HicDH
5 La souche de Sporolactobacillus LMG P-26831 a été transformée par électroporation avec le plasmide pNW33N « Amont-Cat-Aval » conformément à la procédure décrite dans l'exemple 3 (Figure 9(a)). Des intégrants ont été obtenus en augmentant la température de 37°C à 42°C pendant 4 générations et environ 4 joins (Figure 9 (b)). Des excisants ont été obtenus en diminuant la température de 42°C à 37°C pendant 4 à 10 générations et environ 4 à 10 jours. Le site de l'excision 10 a été vérifié par amplification PCR des fragments de bord : la recombinaison peut soit donner lieu en retour à la situation avec le plasmide pNW33N « Amont-Aval » (Figure 9 (e)) ou donner lieu à une situation où le gène cible est sur le plasmide et le gène cat est dans le génome bactérien (Figure 9(c)). Ces événements ont été choisis en sélectionnant des bactéries ayant une résistance au chloramphénicol mais étant sensibles à l'érythromycine. Cette sélection a été réalisée par 15 l’étalement de cultures liquides contenant du chloramphénicol sur des boîtes de Pétri contenant du chloramphénicol dans le but d’obtenir des colonies isolées. Ces colonies ont été réinoculées sur les boîtes de Pétri contenant du chloramphénicol, avec ou sans érythromycine pour isoler des mutants dans lesquels le gène cible a été remplacé par le gène cat et le gène cible a été perdu avec le plasmide (Figure 9(d)). Les mutants dépourvu du gène cible de la L-HicDH ont été obtenus qui 20 sont stables mais non propres car ils contiennent une séquence exogène, à savoir le gène Cat (résistance au chloramphénicol).
Des mutant stables et propres ont été alors obtenus par transformation avec le plasmide pNW33N «Amont-aval » conformément à la procédure décrite dans l'exemple 3 (Figure 9(e)). Des intégrants 25 sont obtenus en augmentant la température de 37 ° C à 42 ° C (Figure 9(f)). Des excisants sont obtenus en diminuant la température de 42 0 C à 37 ° C. Le site de l'excision a été vérifié par amplification PCR des fragments de bord : la recombinaison homologue peut soit donner lieu en retour à la situation avec le plasmide pNW33N « amont-aval » (Figure 9(e)) ou donner lieu à une situation où le gène cat est sur le plasmide et la séquence « Amont-aval » est dans le génome bactérien (Figure 9(g)). Ces événements ont été sélectionnés en sélectionnant les bactéries sensibles à l'érythromycine et au chloramphénicol. Cette sélection a été réalisée en étalant des cultures liquides sur des boîtes de Pétri avec ou sans chloramphénicol et érythromycine pour dans le but 5 d’obtenir des colonies isolées. Ces colonies ont été réinoculées sur des boîtes de Pétri avec ou sans chloramphénicol et érythromycine pour isoler des mutants dans lesquels le gène cat a été perdu en même temps que le plasmide (Figure 9(h)). Des mutants sans le gène cible de la L-fficDH ont été obtenus qui sont stables et propres car ils ne contiennent aucune séquence exogène ; la séquence entre les codons start et stop du gène cible a été supprimée et le codon stop se trouve juste derrière 10 le codon start.
Cette stratégie est répétée afin d'obtenir des souches de Sporolactobacillus avec un knock out propre et stable de la L-LDH, D-LDH62 ou D-LDH65. Pour la L-LDH, deux plasmides ont été construits avec les amorces données en Tables 5, 8 et 9. Pour la D-LDH62, deux plasmides ont été construits avec les amorces données en Tables 5, 10 et 11. Pour la D-LDH65, deux plasmides ont 15 été construits avec les amorces données en Tables 5,12 et 13.
Table 8 : Séquences des amorces sens (UP1) et anti-sens (UP2_lox) utilisées pour amplifier la région en amont de la L-LDH
20 Table 9 : Séquences des amorces sens (DNl lox) et anti-sens (DN2) utilisées pour amplifier la région en aval de la L-LDH
Table 10 : Séquences des amorces sens (UP1) et anti-sens (UP2_lox) utilisées pour amplifier la région en amont de la D-LDH62
Table 11 : Séquences des amorces sens (DNllox) et anti-sens (DN2) utilisées pour amplifier la 5 région en aval de la D-LDH62
Table 12 : Séquences des amorces sens (UP1) et anti-sens (UP2_lox) utilisées pour amplifier la région en amont de la D-LDH65
10 Table 13 : Séquences des amorces sens (DNl lox) et anti-sens (DN2) utilisées pour amplifier la région en aval de la D-LDH65
Exemple 5: Production d'acide lactique-L ou d’acide lactique-D énantiomériquement purs
Comme schématiquement illustré à la Figure 5A, afin d'obtenir des espèces de Sporolactobacïllus capable de produire du L-lactate énantiopur, les gènes de D-lactate déshydrogénases comme la D-LDH62 et D-LDH65 sont supprimés du génome de Sporolactobacïllus.
La souche Sporolactobacïllus LMG P-26831 est génétiquement modifiée en supprimant les gènes de D-LDH62 et D-LDH65 du génome de Sporolactobacïllus avec le protocole décrit dans l'exemple 4. Cette souche de Sporolactobacïllus LMG P-26831 génétiquement modifiée est utilisée dans un procédé pour la préparation de l'acide lactique-L.
Comme schématiquement illustré à la Figure 5B, afin d'obtenir des espèces de Sporolactobacïllus capable de produire du D-lactate énantiomériquement pur, les gènes de la L-lactate déshydrogénase et/ou L-2-hydroxyisocaproate déshydrogénase sont supprimées du génome de Sporolactobacïllus.
La souche Sporolactobacïllus LMG P-26831 est génétiquement modifiée en supprimant les gènes de L-LDH et L-HicDH du génome de Sporolactobacïllus avec le protocole décrit dans l'exemple 4.
Cette souche de Sporolactobacïllus LMG P-26831 génétiquement modifiée est utilisée dans un procédé pour la préparation de l'acide lactique-D.
La table 14 montre la diminution de production d’acide lactique-L par les 2 mutants delta L-HicDH, Delta-L-LDH : P32Cat 2A et 3B par rapport à la souche sauvage (WT=Wild type).
Table 14 : Diminution de production d’acide lactique-L
Exemple 6: Expression dans Sporolactobacïllus vineae d'une gluco-amylase hétérologue
Afin d'obtenir une souche de Sporolactobacïllus capable d'hydrolyser des polymères courts de glucose, l'expression d'une gluco-amylase hétérologue a été induite dans la souche LMG P-26831.
Un plasmide a été construit qui comporte pNW33N comme vecteur et a comme insert le promoteur du gène de la glucoamylase de Bacillus coagulons 36D1 + le gène de la glucoamylase de Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum.
Ce plasmide a été introduit dans la souche de Sporolactobacïllus LMG P-26831 par le protocole d'electro-transformation décrit dans l'exemple 3.
La présence du plasmide dans les transformants émergents a été vérifiée par PCR sur le plasmide. L’expression d'une glucoamylase active à partir du plasmide existant en multicopies dans le cytoplasme (aucune recombinaison homologue n’a été utilisée ici) a été vérifiée par la croissance des cellules sur des boîtes de Pétri contenant de l'amidon. Après croissance pendant plusieurs jours, l'amidon présent dans les boîtes de Pétri a été colorée par les vapeurs de I2. Comme on peut le voir sur la figure 10, il y a un anneau de dégradation autour des transformants (7,9 ; 8,6 ; 8,7 ; 8,8 ; 8,9 et contrôle positif), mais pas autour d'autres (les cinq premiers et 7,8 ; 8.2) indiquant que l’amidon a été partiellement hydrolysé.
Exemple 7: Expression dans Sporolactobacillus vineae d'une alpha-amylase hétérologue
Afin d'obtenir une souche de Sporolactobacillus capable d'hydrolyser l'amidon, l'expression d'une ALPHA-amylase hétérologue a été induite chez la souche LMG P-26831.
Deux plasmides différents ont été utilisés : -pGIT008 qui contient un promoteur de L. plantarum + le gène alpha-amylase de B. licheniformis -pGIP312.4 qui contient un promoteur d'E. faecalis + le gène alpha-amylase de B. licheniformis
Ces plasmides ont été introduits dans la souche LMG P-26831 par le protocole d'electro-transformation décrit dans l'exemple 3.
La présence d'un des plasmides chez les transformants émergents a été vérifiée par PCR sur le plasmide. L’expression d'une alpha-amylase active à partir du plasmide existant en multicopies dans le cytoplasme (aucune recombinaison homologue n’a été utilisée ici) a été vérifiée par la croissance des cellules sur des boîtes de Pétri contenant de l'amidon. Après la croissance pendant plusieurs jours, l'amidon présent dans les boîtes de Pétri a été colorée par des vapeurs de I2.
Conclusions
Ensemble, les exemples ci-dessus montrent que la méthode de la présente invention permet de modifier génétiquement des souches de Sporolactobacilles. Cette méthode permet avantageusement de construire des souches de Sporolactobacilles génétiquement modifiées espèces comme par exemple les souches de Sporolactobacilles qui sont capables de produire de l'acide lactique ou un de ses stéréoisomères à partir de matières premières abondantes et donc peu coûteuses.

Claims (21)

  1. REVENDICATIONS
    1. Méthode de modification de souches de Sporolactobacilles par génie génétique, comprenant l'introduction d'un ADN cloné dans un réplicon à l’intérieur des cellules d'une souche de Sporolactobacilles.
  2. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle le réplicon est un réplicon thermosensible.
  3. 3. Méthode selon la revendication 2, dans laquelle la méthode comprend, après l'introduction de l'ADN dans les cellules d'une espèce de Sporolactobacilles, les étapes de : - mise en culture des cellules sur un milieu sélectif à une température permissive pour la réplication afin de sélectionner des cellules transformées capables de croître sur ledit milieu sélectif à ladite température permissive, et - culture desdites cellules transformées à une température non permissive pour la réplication afin de sélectionner des cellules transformées capables de croître à ladite température non permissive.
  4. 4. Méthode selon l'ime des quelconques revendications 1 à 3, dans laquelle le réplicon est un plasmide.
  5. 5. Méthode selon l'une des quelconques revendications 1 à 4, dans laquelle la souche de Sporolactobacilles est Sporolactobacillus vineae.
  6. 6. Méthode selon l'une des quelconques revendications 1 à 5, dans laquelle la souche de Sporolactobacillus est une souche de Sporolactobacillus vineae, caractérisée par une séquence d'ARN 16 s comme indiquée dans SEQ Ш No 1 ou une souche de Sporolactobacillus ayant au moins 95 % identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID No 1.
  7. 7. Méthode selon l'une des quelconques revendications 1 à 6, dans laquelle la souche de Sporolactobacilles est une souche de Sporolactobacillus vineae déposée sous le numéro d’accession LMG P-26831 à la BCCM-LMG Bacteria Collection.
  8. 8. Méthode selon l'une des quelconques revendications 2 à 7, dans laquelle le réplicon thermosensible est le plasmide pNW33N.
  9. 9. Méthode selon l'une des quelconques revendications 2 à 8, dans laquelle la réplication thermosensible dépend de la protéine RepB, un fragment fonctionnel ou une variante de celle-ci pour la réplication thermosensible.
  10. 10. Méthode selon l’une des quelconques revendications 3 à 9, dans laquelle la culture à la température non permissive pour la réplication permet l’introduction de l'ADN dans le chromosome des Sporolactobacilles, de préférence par recombinaison homologue.
  11. 11. Méthode selon l'une des quelconques revendications 1 à 10, dans laquelle l'ADN code pour une ou plusieurs fonctions désirées.
  12. 12. Méthode selon l’une des quelconques revendications 1 à 11, où l'ADN comporte une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire au moins un composé choisi dans le groupe composé d'acide lactique, acide lactique-L, acide lactique-D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2, 3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, glucose, fructose et pyruvate, préférentiellement, où l'ADN comporte une ou plusieurs séquences codant pour un ou plusieurs polypeptides capables de produire de l'acide lactique-L ou acide lactique-D.
  13. 13. Méthode selon l'une des quelconques revendications 10 à 12, dans laquelle l'introduction de l'ADN dans le chromosome d’un Sporolactobacilles inactive une séquence codant pour une fonction indésirable du chromosome de ce Sporolactobacilles.
  14. 14. Méthode selon la revendication 13, dans laquelle la fonction indésirable est la D-lactate déshydrogénase, la L-lactate déshydrogénase, la D-2-hydroxisocaproate déshydrogénase ou la L-2-hydroxisocaproate déshydrogénase.
  15. 15. Souches de Sporolactobacilles génétiquement modifiées obtenues par une méthode selon l’une des quelconques revendications 1 à 14.
  16. 16. Souches de Sporolactobacilles génétiquement modifiées obtenues par une méthode selon l’une des quelconques revendications 12 à 14, dans lesquelles les espèces de Sporolactobacilles sont capable de produire au moins un composé choisi dans le groupe composé d'acide lactique, acide lactique-L, acide lactique-D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2, 3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, l'oxaloacétate, S-malate, succinate, fumarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, le glyoxylate, glucose, fructose et pyruvate, préférentiellement, dans lequel les souches de Sporolactobacilles sont capables de produire de l'acide lactique-L ou de l’acide lactique-D.
  17. 17. Souches de Sporolactobacilles génétiquement modifiées selon les revendications 15 ou 16, dans lesquelles les souches Sporolactobacilles sont une souche de Sporolactobacillus vineae génétiquement modifiée et de préférence une souche génétiquement modifiée de Sporolactobacillus vineae caractérisée par une séquence d'ARN 16 s, comme indiquée dans SEQ ID No 1, une souche de Sporolactobacillus génétiquement modifiée ayant au moins 95 % d’identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ ID No 1, ou une souche de Sporolactobacillus vineae génétiquement modifiée déposée sous le numéro d’accession LMG P-26831 à la BCCM-LMG Bacteria Collection.
  18. 18. Procédé de préparation d’au moins un composé choisi dans le groupe comprenant l'acide lactique, acide lactique-L, acide lactique-D, acétolactate, diacétyle, acétoïne, 2, 3-butènediol, 1, 2-propanediol, acétate, formate, acétaldéhyde, éthanol, L-alanine, oxaloacétate, S-malate, succinate, fümarate, 2-oxoglutarate, oxalosuccinate, isocitrate, citrate, glyoxylate, glucose, fructose et pyruvate, dans lequel les souches génétiquement modifiées de Sporolactobacilles des revendications 16 ou 17 sont utilisées.
  19. 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel au moins un composé est l'acide lactique-L ou l’acide lactique-D.
  20. 20. Une souche de Sporolactobacillus vineae caractérisée par une séquence d’ARN 16s comme indiquée dans SEQ Ш No 1 ou une souche de Sporolactobacilles ayant au moins 96 % d’identité avec la séquence d'ARN 16 s telle qu'elle figure dans SEQ Ш No 1.
  21. 21. La souche de Sporolactobacillus vineae selon la revendication 20, déposée sous le numéro d’accession LMG P-26831 à la BCCM-LMG Bacteria Collection.
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