CN103108950A

CN103108950A - 新的细胞外分泌型核酸酶

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Publication number: CN103108950A
Application number: CN2011800449123A
Authority: CN
Inventors: 森梢; 大田优佳莉; 秦田勇二; 中村信之; 宫崎征行
Original assignee: INDEPENDENT ADMINISTRATIVE INS
Current assignee: INDEPENDENT ADMINISTRATIVE INS
Priority date: 2010-09-16
Filing date: 2011-09-15
Publication date: 2013-05-15
Anticipated expiration: 2031-09-15
Also published as: WO2012036241A1; EP2617824B1; EP2617824A4; US20130189760A1; JPWO2012036241A1; JP5757580B2; EP2617824A1; EP2982748A1; CN104877976A; CN103108950B; EP2982748B1; CN104877976B; US9217139B2

Abstract

本发明的目的在于提供由天然的非病原性微生物分泌到细胞外且比活性比现有核酸酶的比活性高、在工业性规模的核酸分解中有用的核酸酶。上述目的通过一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶来实现，其以双链DNA、单链DNA和RNA为底物，并且纯化后在含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟时的比活性与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性。

Description

新的细胞外分泌型核酸酶

相关申请的相互参考

本申请要求2010年9月16日提出的日本特愿2010-207598号的优先权，将其全部记载作为公开的内容特别援引于本说明书中。

技术领域

本发明涉及新的细胞外分泌型核酸酶、其制造方法及该制造方法中使用的新的链霉菌属细菌。另外，本发明涉及使用该细胞外分泌型核酸酶的分解核酸的方法。

背景技术

核酸酶(Nuclease)是特异性地分解核酸的核酸分解酶的总称。使核酸酶作用于脱氧核糖核酸或核糖核酸等核酸时，核酸中的糖与磷酸之间的磷酸二酯键水解而生成核苷酸。

核酸酶被分类为EC编号(Enzyme Commission numbers，酶学委员会编号)为EC.3.1的酯水解酶的一种。另外，核酸酶除了分类为分解RNA的核糖核酸酶和分解DNA的脱氧核糖核酸酶以外，还可以根据分解的方式进行分类。

用于催化从序列中间的内部(endo-)将核酸切断的反应的酶称为核酸内切酶。作为代表性的核酸内切酶，可以列举各种限制性内切酶。与此相对，用于催化以从核酸序列的外侧(exo-)朝向内部、从核酸的5’端或3’端进行切削的方式将核酸切断的反应的酶称为核酸外切酶。作为代表性的核酸外切酶，已知核酸外切酶III等。

目前，核酸酶在从研究室规模至工业规模的多种多样的场合中使用。例如，使用核酸酶时，可以利用其核酸分解活性使细胞提取液的粘性降低。因此，分离和纯化细胞提取液中的蛋白质及其他目标物质时，如果使用核酸酶，则可以期待缩短工艺时间、提高目标物质的收量、改善利用离心分离法的分级(颗粒与上清的分离性)、使溶液的过滤(特别是超滤)顺畅、提高层析工艺的效率等。另外，如果在分离和纯化核酸所非特异性吸附的病毒或包涵体等时使用核酸酶，则可以期待使它们的收率提高。此外，如果在用于分析生物试样的ELISA、层析、2D-PAGE或足迹分析等样品制备中使用核酸酶，则能够避免不期望的由核酸引起的测定误差。

作为这样的能够在各种规模和场合下使用的核酸酶，已知来源于沙雷氏菌(Serratia spp.)的核酸内切酶(分别参考作为专利文献1和2的日本专利第2604365号说明书和美国专利第5173418号说明书，专利文献1和2的记载作为公开的内容特别援引于此)。沙雷氏菌属微生物中，有作为机会感染菌而具有病原性的微生物。因此，专利文献1中记载的核酸内切酶利用基因重组技术使用大肠杆菌以分泌到细胞外的细胞外分泌型酶的形式制造。另外，专利文献1中记载的来源于沙雷氏菌的核酸内切酶以ベンゾナーゼ(注册商标)的商品名市售(参考作为非专利文献1的“ベンゾナーゼユニークなエンドヌクレアーゼ(ベンゾナーゼ独特的核酸内切酶)”、[online]、2008年1月1日、メルク株式会社、[2010年7月30日检索]、互联网<URL:http://www2.merck.co.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Benzonase_16p.pdf>，非专利文献1的记载作为公开的内容特别援引于此)。

作为非病原性微生物来源的核酸酶，已知放线菌的一种链霉菌属细菌(Streptomyces spp.)产生的核酸酶(分别参考作为非专利文献2～7的Biochem.J.1995 306,93-100；Biochem.J.1992 281,231-237；ApplMicrobiol Biotechnol.1995Nov;43(6):1056-1060；Biochimica etBiophysica Acta(BBA)-General Subjects,Volume1721,Issues1-3,18January2005,116-123；FEMS Microbiology Letters,Volume237,Issue2,15August2004,273-278和Process Biochemistry Volume40,Issues3-4,March2005,1271-1278，非专利文献2～7的记载作为公开的内容特别援引于此)。非专利文献2和3中记载的核酸酶以细胞内蓄积型酶的形式生产。与此相对，非专利文献4～7中记载的核酸酶为分泌到细胞外的细胞外分泌型酶。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利第2604365号说明书

专利文献2：美国专利第5173418号说明书

非专利文献

非专利文献1：“ベンゾナーゼユニークなエンドヌクレアーゼ”、[online]、2008年1月1日、メルク株式会社、[2010年7月30日检索]、互联网<URL:http://www2.merck.co.jp/japan/chemical/pdf/info_pdf/071225_Benzonase_16p.pdf>

非专利文献2：Santiago CAL,Jesus F.APARICIO,Clara G.DE LOSREYES-GAVILAN,Rebeca G.NICIEZA and Jesus SANCHEZ,Biochem.J.1995 306,93-100

非专利文献3：Jesus F.APARICIO,Carlos HARDISSON and JesusSANCHEZ,Biochem.J.1992 281,231-237

非专利文献4：Vukelic B,Ritonja A,Vitale L.,ApplMicrobiolBiotechnol.1995年11月;43(6):1056-1060.

非专利文献5：Zuzana Brnakova,Andrej Godany and JozefTimko,Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-General Subjects,Volume1721,Issues1-3,2005年1月18日,116-123

非专利文献6：Sumedha S.Deshmukh and Vepatu Shankar,FEMSMicrobiology Letters,Volume237,Issue2,2004年8月15日,273-278页

非专利文献7：Nitin S.Patil,Sumedha S.Deshmukh andVepatuShankar,Process Biochemistry Volume40,Issues3-4,2005年3月,1271-1278页

发明内容

发明所要解决的问题

专利文献1和2中记载的核酸酶以及非专利文献1中记载的ベンゾナーゼ是使用非病原性微生物制造的核酸酶。但是，由于这些核酸酶利用基因重组大肠杆菌进行生产，因此，生产率低于来源微生物的生产率。因此，为了得到工业性规模的核酸酶，需要重复或延长生产步骤等，操作方面、经济方面和时间上的负担的增大成为问题。因此，作为核酸酶的生产方法，期望不使用基因重组技术而使用天然的非病原性微生物进行生产。

非专利文献2和3中记载的核酸酶是蓄积在非病原性微生物体内的细胞内蓄积型酶。因此，为了得到这些核酸酶，必须将蓄积有核酸酶的微生物体破碎、接着从得到的微生物破碎物中分离纯化核酸酶。因此，得到非专利文献2和3中记载的核酸酶的工艺复杂，并且存在混入杂质的可能性高的问题。

与此相对，非专利文献4～7中记载的核酸酶是分泌到非病原性微生物的体外的细胞外分泌型酶，不会引起制造上述的专利文献1和2以及非专利文献1～3中记载的核酸酶时产生的问题。

但是，非专利文献4～7中记载的核酸酶存在活性非常低这一共同的问题。如果将非专利文献4～7中记载的核酸酶的比活性换算成非专利文献1中记载的单位，则分别为3.5×10⁵U/mg蛋白、9.7×10³U/mg蛋白、1.3×10⁴U/mg蛋白和3.2×10⁴U/mg蛋白，活性比非专利文献1中记载的核酸酶低约3倍～约100倍。

另外，非专利文献4和5中记载的核酸酶容易因NaCl而使酶活性受到抑制。非专利文献4中记载的核酸酶在10mM NaCl存在下的比活性与在非专利文献4中记载的标准活性条件下的比活性相比为32%。非专利文献5中记载的核酸酶在100mM NaCl存在下的比活性与在非专利文献5中记载的标准活性条件下的比活性相比为40～50%。因此，将非专利文献4和5中记载的核酸酶进行稀释等时，不能使用一般广泛使用的PBS等含有NaCl的缓冲液。另外，在借助微生物的培养而进行的产业性的制造工艺中，为了提高菌体浊度，一般使用含有100mM以上的一价金属盐的高营养的培养基来培养微生物。通过这样的培养得到的培养液中的核酸可能在盐浓度高的条件下实施分解。

非专利文献6和7中记载的核酸酶在以纯化酶的形式利用EDTA进行透析时，完全丧失活性。为了恢复其活性，需要使用Mn²⁺，不能使用Mg²⁺等其他二价金属离子来代替。锰盐非常昂贵，且存在残留毒性的危险。

因此，由于比活性低、容易因NaCl而使酶活性受到抑制、酶活性所需的二价金属离子限定于Mn²⁺等问题，非专利文献4～7中记载的核酸酶未在工业性规模的核酸分解时使用。

因此，本发明所要解决的第一问题在于提供由天然的非病原性微生物分泌到细胞外且比活性比现有核酸酶的比活性高、在工业性规模的核酸分解中有用的核酸酶。另外，本发明所要解决的第二问题在于提供由天然的非病原性微生物分泌到细胞外、NaCl对酶活性的影响小、并且在酶活性方面需要比锰廉价且毒性小的二价金属离子、在工业性规模的核酸分解中有用的核酸酶。此外，本发明所要解决的另一问题在于提供制造上述核酸酶的方法及能够供于该方法的非病原性微生物。

用于解决问题的手段

本发明人反复进行了深入研究，结果成功地从深海中分离出在培养液中分泌比活性高的核酸酶的微生物。接着对该微生物进行了鉴定，结果获知其是作为放线菌之一的非病原性的链霉菌属细菌，本发明人将该微生物命名为链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174。

从链霉菌MBE174的培养液中分离和纯化显示核酸酶活性的蛋白质级分，结果得到了以双链DNA、单链DNA和RNA为底物且比活性比非专利文献1中记载的ベンゾナーゼ的比活性高的核酸酶(NucS)以及以双链DNA和单链DNA为底物、能够在高浓度的Na+存在下维持比活性、并且能够需要比锰廉价且毒性小的镁的核酸酶(NucL)这两种核酸酶。

上述NucS和NucL是随着链霉菌MBE174的增殖在维持核酸酶活性的情况下分泌到培养液中的核酸酶。因此，链霉菌MBE174的培养液、该培养液的干燥物及简单纯化物能够作为含有NucS和NucL这两种核酸酶的粗酶而供于工业性规模的核酸分解，有用性高。

本发明是基于上述发现而完成的发明。

因此，根据本发明，提供一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶作为本发明的第一方式的核酸酶，其以双链DNA、单链DNA和RNA为底物，并且纯化后在含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟时的比活性与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性。

优选利用SDS-PAGE法测定的分子量为17000～21000。

优选需要Mg²⁺或Mn²⁺作为二价金属离子。

优选链霉菌属细菌为链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)。

根据本发明的另一方面，提供一种核酸酶作为本发明的第二方式的核酸酶，其中，包含：

(1)序列表的序列号1中记载的氨基酸序列、

(2)序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列、或

(3)与序列表的序列号1中记载的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，提供一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶作为本发明的第三方式的核酸酶，其以双链DNA和单链DNA为底物，并且在100mM Na⁺存在下的比活性为未添加Na⁺时的比活性的60%以上。

优选利用SDS-PAGE法测定的分子量为约66500。

优选需要Mg²⁺作为二价金属离子。

优选链霉菌属细菌为链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)。

根据本发明的另一方面，提供一种核酸酶作为本发明的第四方式的核酸酶，其中，包含：

(a)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列、

(b)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列、或

(c)与序列表的序列号2中记载的氨基酸序列具有85%以上的同源性的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，提供一种粗酶，其中，含有本发明的第一或第二方式的核酸酶和/或本发明的第三或第四方式的核酸酶作为核酸酶活性成分。

根据本发明的另一方面，提供一种细胞外分泌型核酸酶的制造方法，其中，包括对链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)进行培养而得到至少一种细胞外分泌型核酸酶的步骤。

根据本发明的另一方面，提供一种细胞外分泌型核酸酶或其粗酶，其通过本发明的制造方法得到。

根据本发明的另一方面，提供链霉菌MBE174(保藏编号：FERMP-21987)。

根据本发明的另一方面，提供一种分解核酸的方法，其中，包括将本发明的第一或第二方式的核酸酶和/或本发明的第三或第四方式的核酸酶供于含有核酸的试样而使所述核酸分解的步骤。

优选所述核酸为DNA。

发明效果

本发明的核酸酶是由一种作为天然的非病原性微生物的链霉菌属细菌分泌到细胞外的核酸酶，因此，生产本发明的核酸酶的链霉菌属细菌的培养液、该培养液的干燥物或粗纯化物能够作为粗酶使用。另外，本发明的核酸酶具有比活性比现有核酸酶的比活性高或即使在高盐浓度存在下也会维持活性、并且所需的二价金属离子为镁的特征，因此，能够供于工业性规模的核酸分解。

本发明的两种核酸酶可以根据例如盐浓度而分开使用。具体而言，在低盐浓度的环境下，可以利用比活性大的一种酶(例如NucS)使DNA和RNA迅速分解，在高盐浓度的环境下，可以期待利用另一种酶(例如NucL)进行DNA分解和RNA的蓄积。因此，如果准备含有本发明的两种核酸酶的混合物，则能够通过改变盐浓度而实现期望的核酸的分解和蓄积。

另外，本发明的在高盐浓度的环境下维持活性的酶(例如NucL)能够分解DNA而不分解RNA。发挥这种不分解RNA的特性，能够将例如本发明的酶用于特异性制备RNA的方法。

在使用本发明的核酸酶分离和纯化细胞提取液中的蛋白质及其他目标物质的情况下，能够期待缩短工艺时间、提高目标物质的收量、改善利用离心分离法的分级(颗粒与上清的分离性)、使溶液的过滤(特别是超滤)顺畅、提高层析工艺的效率、提高病毒或包涵体等的收率、避免ELISA、层析、2D-PAGE、足迹分析等的测定误差等。

附图说明

图1是表示部分纯化NucS的SDS-PAGE和活性染色的图。

图2是表示纯化NucL的SDS-PAGE和活性染色的图。

图3是表示NucS的pH与活性的相关性的图。

图4是表示NucL的pH与活性的相关性的图。

图5是表示NucS和NucL的温度与活性的相关性的图。

图6是表示NucS和NucL的热稳定性试验的结果的图。

图7是表示一价盐(NaCl)对NucL的酶活性的影响的图。

图8是表示一价盐(KCl)对NucL的酶活性的影响的图。

图9是表示二价金属盐(MgCl₂)对NucS和NucL的酶活性的影响的图。

图10是表示二价金属盐(MnCl₂)对NucS和NucL的酶活性的影响的图。

图11是表示磷酸盐对NucL的酶活性的影响的图。

图12是表示NucS、NucL和ベンゾナーゼ使环状质粒DNA分解的模式的分析结果的图。

图13是表示利用NucL得到的环状质粒DNA的分解结果的图。

图14是表示利用NucS对环状质粒DNA进行的分解反应初期的反应结果的图。

图15是表示利用NucL对环状质粒DNA进行的分解反应初期的反应结果的图。

图16是表示利用NucS得到的直链双链DNA的分解结果的图。

图17是表示利用NucL得到的直链双链DNA的分解结果的图。

具体实施方式

以下，对本发明的详细内容进行说明。

本发明的核酸酶涉及链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶。本发明的核酸酶根据其性质、功能和结构分类为两个酶组。以下，使用“核酸酶A”和“核酸酶B”的名称对本发明的核酸酶进行说明。

[1]本发明的核酸酶A

本发明的核酸酶A涉及以双链DNA例如超螺旋型和松弛型等的双链DNA、单链DNA和RNA为底物的核酸酶。本发明的核酸酶A具有如下特征：纯化后在含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟时的比活性与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性。

本说明书中的“ベンゾナーゼ(注册商标)”是指非专利文献1中以“生物技术用ベンゾナーゼI级(99%)250U/μL”的产品名记载的、市售的核酸酶。后述的实施例所示的在含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟时的ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为9.4×10⁵U/mg蛋白。

关于本说明书中的“与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度”，只要是与ベンゾナーゼ的比活性近似的值则没有特别限制，例如为ベンゾナーゼ的比活性的±10%以内，优选为±5%以内，更优选为±2%以内。关于本说明书中的“高于ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性”，只要高于ベンゾナーゼ的比活性则没有特别限制，例如为ベンゾナーゼ的比活性的1.1倍以上，优选为1.5倍以上，更优选为2.0倍以上，进一步优选为2.5倍以上，更优选为3.0倍以上。

与ベンゾナーゼ的比活性进行比较时，本发明的核酸酶A使用纯化后的核酸酶A。本发明的核酸酶A的纯化使用阴离子交换(SuperQ)、羟磷灰石、阳离子交换(CM琼脂糖)、肝素亲和层析和凝胶过滤层析进行纯化。对于在作为本发明的优选方式的后述的实施例中记载的NucS而言，纯化后的比活性为3.6×10⁶U/mg蛋白。与此相对，ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为9.4×10⁵U/mg蛋白。因此，纯化后的本发明的核酸酶A的比活性优选为ベンゾナーゼ的比活性的约3.8倍。

本发明的核酸酶A的底物特异性通过如下方法测定：以双链DNA、单链DNA、RNA等各种核酸为底物，在含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供给30分钟来考察这些底物的分解活性。

本发明的核酸酶A只要是底物和比活性如上所述的核酸酶则没有特别限制，优选利用SDS-PAGE法测定的分子量为17000～21000，并且/或者需要Mg²⁺或Mn²⁺作为二价金属离子。

本发明的核酸酶A除了可以以上述的底物催化活性和比活性作为指标以外，还可以以分子量和二价金属需要性等作为指标通过考察对链霉菌属细菌、例如生存在深海(水面下200m以下的海)中的链霉菌属细菌进行培养而得到的培养上清中的核酸酶活性的筛选法来分离。作为生存在深海中的链霉菌属细菌，优选为链霉菌MBE174。另外，该链霉菌MBE174在2010年7月27日以FERM P-21987的保藏编号保藏于独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心(邮政编码305-8566，茨城县筑波市东1-1-1筑波中心中央第6)。

本发明的核酸酶A的具体方式为包含下述氨基酸序列的核酸酶：(1)序列表的序列号1中记载的氨基酸序列、(2)序列表的序列号1中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列或(3)与序列表的序列号1中记载的氨基酸序列具有90%以上的同源性的氨基酸序列。

包含上述(1)序列表的序列号1中记载的氨基酸序列的核酸酶是利用SDS-PAGE法测定的分子量为17000～21000的酶组，具有ALPTPVSAATAR(序列表的序列号27)作为共有序列。序列表的序列号1是指以共有氨基酸序列ALPTPVSAATAR为N末端的起点、计算为17kDa的共有氨基酸序列(157个氨基酸)。本发明的核酸酶A的更具体的方式为后述的实施例中记载的NucS，其为由214个氨基酸(序列表的序列号3)构成的核酸酶。

关于上述(2)的氨基酸序列的“缺失、取代或添加一个至数个氨基酸”中的“一个至数个”的范围，只要包含上述(2)的氨基酸序列的核酸酶的纯化后的比活性在含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟的条件下与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性的范围则没有特别限定，例如表示约1个至约20个，优选为约1个至约10个，更优选为约1个至约7个，进一步优选为约1个至约5个，特别优选为约1个至约3个。另外，“氨基酸的缺失”表示序列中的氨基酸残基欠缺或消失，“氨基酸的取代”表示序列中的氨基酸残基被取代成其他氨基酸残基，“氨基酸的添加”表示序列中添加有新的氨基酸残基。

作为“缺失、取代或添加一个至数个氨基酸”的具体方式，有将一个至数个氨基酸利用在化学方面类似的其他氨基酸来取代的方式。例如，可以列举：将某疏水性氨基酸取代成其他疏水性氨基酸的情况、将某极性氨基酸取代成具有相同电荷的其他极性氨基酸情况等。这种化学性质类似的氨基酸对于每种氨基酸而言在该技术领域中是已知的。如果列举具体例，则作为非极性(疏水性)氨基酸，可以列举丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以列举甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带有正电荷的(碱性)氨基酸，可以列举精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。另外，作为带有负电荷的(酸性)氨基酸，可以列举天冬氨酸、谷氨酸等。

上述(3)的氨基酸序列中的“同源性”是指包含上述(3)的氨基酸序列的核酸酶的纯化后的比活性在含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟的条件下与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或者为高于ベンゾナーゼ的比活性的范围即90%以上，优选为93%以上，更优选为95%以上，进一步优选为97%以上，更进一步优选为99%以上。

获取本发明的核酸酶A的方法没有限制，除了上述的筛选法以外，可以参考例如序列表的序列号1和3的记载通过物理化学方法来合成，也可以通过基因工程方法由编码序列表的序列号1和3中记载的氨基酸序列的核酸来制作。

[2]本发明的核酸酶B

本发明的核酸酶B涉及以双链DNA例如超螺旋型和松弛型等的双链DNA和单链DNA为底物且实质上不以RNA为底物的核酸酶。

本发明的核酸酶B具有如下特征：在100mM Na⁺存在下的比活性为未添加Na⁺时的比活性的60%以上，优选为70%以上，更优选为80%以上，进一步优选为90%以上。

Na⁺对本发明的核酸酶B的比活性的影响可以通过如下方法来考察：在含有1mM MgCl₂和0～100mM NaCl、pH为8.5的10mM Tris/HCl中，以0.4mg/mL来自于鲑鱼精的脱氧核糖核酸钠盐(西格玛奥德里奇公司制造，目录号D1626-1G)为底物，在25℃下测定各NaCl浓度的核酸分解活性。

本发明的核酸酶B的底物特异性可以与本发明的核酸酶A的底物特异性同样地进行考察。

本发明的核酸酶B只要是底物和对Na⁺的稳定性如上所述的核酸酶则没有特别限制，优选利用SDS-PAGE法测定的分子量为约66500并且/或者需要Mg²⁺作为二价金属离子。

本发明的核酸酶B除了可以以上述的底物催化活性和对Na⁺的稳定性作为指标以外，还可以以分子量和二价金属需要性等作为指标通过考察对链霉菌属细菌、例如生存在深海(水面下200m以下的海)中的链霉菌属细菌进行培养而得到的培养上清中的核酸酶活性的筛选法来分离。作为生存在深海中的链霉菌属细菌，优选为链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)。

本发明的核酸酶B的具体方式为包含下述序列的核酸酶：(a)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列、(b)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列中缺失、取代或添加一个至数个氨基酸后得到的氨基酸序列或(c)与序列表的序列号2中记载的氨基酸序列具有85%以上的同源性的氨基酸序列。

包含上述(a)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列的核酸酶是利用SDS-PAGE法测定的分子量为66500且N末端部不含信号肽的成熟蛋白质(575个氨基酸)。本发明的核酸酶B的更具体的方式为后述的实施例中记载的NucL，其由607个氨基酸(序列表的序列号4)构成，且N末端不含信号肽。

关于上述(b)的氨基酸序列的“缺失、取代或添加一个至数个氨基酸”中的“一个至数个”的范围，只要包含上述(b)的氨基酸序列的核酸酶在100mM Na⁺存在下的比活性为未添加Na⁺时的比活性的60%以上的范围则没有特别限定，例如表示约1个至约20个，优选为约1个至约10个，更优选为约1个至约7个，进一步优选为约1个至约5个，特别优选为约1个至约3个。另外，上述(b)的氨基酸序列中的“氨基酸的缺失”、“氨基酸的取代”和“氨基酸的添加”的含义以及“缺失、取代或添加一个至数个氨基酸”的具体方式与在作为本发明的核酸酶A的具体方式的(2)的氨基酸序列中说明过的同样。

上述(c)的氨基酸序列中的“同源性”是指包含上述(c)的氨基酸序列的核酸酶在100mM Na⁺存在下的比活性为未添加Na⁺时的比活性的60%以上的范围即85%以上，优选为88%以上，更优选为90%以上，进一步优选为95%以上，更进一步优选为99%以上。

获取本发明的核酸酶B的方法没有限制，除了上述的筛选法以外，例如可以参考序列表的序列号2和4的记载通过物理化学方法来合成，也可以通过基因工程方法由编码序列表的序列号2和4中记载的氨基酸序列的核酸来制作。

[3]本发明的粗酶

本发明的粗酶含有本发明的核酸酶A、本发明的核酸酶B或这两种核酸酶作为核酸酶活性成分。本发明的粗酶中，本发明的核酸酶A和核酸酶B的存在比没有特别限制，可以根据作为底物的核酸的种类或浓度、给这些核酸酶的活性带来影响的物质的种类或浓度等适当选择。

本发明的粗酶显示出所含有的本发明的核酸酶A和/或核酸酶B的性质。根据本发明的粗酶，例如，在低盐浓度的环境下，可以期待利用比活性大的本发明的核酸酶A使DNA和RNA迅速分解，在高盐浓度的环境下，可以期待利用本发明的核酸酶B进行DNA分解和RNA的蓄积。因此，根据本发明的粗酶，可以通过改变盐浓度而实现期望的核酸的分解和蓄积。

本发明的粗酶可以以对生产本发明的核酸酶A和核酸酶B的链霉菌属细菌、优选链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)进行培养而得到的培养物的形式来制造。

[4]本发明的制造方法

本发明的制造方法为包括对链霉菌MBE174(保藏编号：FERMP-21987)进行培养而得到至少一种细胞外分泌型核酸酶的步骤的细胞外分泌型核酸酶的制造方法。具体而言，本发明的制造方法为根据常规方法将链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)接种到适当的培养基中后在适当的条件下培养、并从所得到的培养物中采集细胞外分泌型核酸酶的细胞外分泌型核酸酶的制造方法。作为细胞外分泌型核酸酶，优选本发明的核酸酶A和/或本发明的核酸酶B。

本发明的制造方法大致包括：(a)对链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)进行培养而得到含有细胞外分泌型核酸酶的培养物的步骤和(b)从该培养物中得到细胞外分泌型核酸酶的步骤这两个步骤。

作为链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)的培养中使用的营养培养基，可以广泛使用作为链霉菌属细菌用的培养基而已知的培养基，例如，除了可以使用YMA(酵母提取物-麦芽提取物琼脂)培养基(酵母提取物4.0g/l、麦芽提取物10.0g/l、葡萄糖4.0g/l、琼脂18.0g/l；pH7.3)或白蛋白培养基(卵白蛋白0.25g/l、葡萄糖1.0g/l、K₂HPO₄ 0.5g/l、MgSO₄·7H₂O0.2g/l、Fe₂(SO₄)₃1%溶液1ml、琼脂18.0g/l；pH6.8-7.0)等合成培养基以外，还可以使用天然培养基，可以优选使用酵母提取物4.0g/l、麦芽提取物10.0g/l、葡萄糖30.0g/l、多聚蛋白胨S50.0g/l、碳酸钙6.0g/l；未调节pH。但是，在直接将培养物作为粗酶使用的情况下，在培养基制备中要注意pH、一价盐、二价金属盐、磷酸盐以及其他影响酶活性的化合物的浓度。优选根据期望的核酸酶活性来增减它们的浓度。

作为培养法，优选液体培养法(振荡培养法或通气搅拌培养法)，工业上优选通气搅拌培养法。链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)的培养通常在选自温度20～45℃、优选25～40℃、pH5～9、优选6～8的条件下以需氧方式实施。培养时间只要是使链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)开始增殖的时间以上的时间即可，优选为8～120小时，进一步优选为直到使期望的核酸酶活性达到最大值为止的时间。确认菌体增殖的方法没有特别限制，例如，可以采集培养物并利用显微镜来观察，也可以利用吸光度来观察。另外，培养液的溶解氧浓度没有特别限制，通常优选为0.5～20ppm。因此，可以调节通气量、进行搅拌或在通气中追加氧气。培养方式可以是分批培养、流加培养、连续培养或灌流培养中的任何一种方式。

从以上述方式培养得到的培养物中采集细胞外分泌型核酸酶。细胞外分泌型核酸酶的采集法可以根据一般的酶采集方法来进行。例如，可以在通过固液分离等通常已知的方法除去细胞后，将培养上清作为粗酶使用。固液分离可以没有限制地使用通常已知的方法，例如，采用直接将培养物本身进行离心分离的方法、通过向培养物中添加过滤助剂或利用预涂有过滤助剂的预涂过滤器等进行过滤分离的方法、使用平膜、中空丝膜等进行膜过滤分离的方法等。

粗酶可以直接使用，也可以纯化后使用。例如，不限于在此列举的方法，可以通过将热处理等利用耐热性的差的方法；透析、超滤、树脂柱、凝胶过滤、凝胶过滤层析和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量的差的方法；盐沉淀、硫酸铵沉淀、醇沉淀及其他溶剂沉淀等利用溶解性的差的方法；使用DEAE-TOYOPEARL树脂等的离子交换层析等利用电荷的差的方法；亲和层析等利用特异性亲和性的方法；使用丁基-TOYOPEARL树脂等的疏水层析和反相层析等利用疏水性的差的方法；吸附层析等利用物理化学上的吸附性的差的方法；等电点电泳和等电点层析等利用等电点的差的方法等通常已知的方法单独或组合供于所得到的粗酶来制备工业用途的纯化酶。

也可以将粗酶及纯化酶固定化。例如，可以采用与离子交换体结合的结合法、与树脂和膜等的共价结合-吸附法、使用高分子物质的包埋法等。

利用本发明的制造方法得到的细胞外分泌型核酸酶或其粗酶作为本发明的另一方式提供。另外，本发明的制造方法中使用的链霉菌属细菌即链霉菌MBE174(保藏编号：FERM P-21987)也作为本发明的另一方式提供。

作为本发明的制造方法的另一方式，提供一种制造细胞外分泌型核酸酶的方法，其中，包括如下步骤：参考编码本发明的核酸酶A的DNA的碱基序列例如序列表的序列号5中记载的碱基序列或编码本发明的核酸酶B的DNA的碱基序列例如序列表的序列号6中记载的碱基序列，利用物理化学方法或基因工程方法合成编码本发明的核酸酶A和核酸酶B的DNA片段，接着将合成的DNA片段重组到载体中，接着将重组有DNA片段的重组载体插入宿主细胞中而制作转化体，并对该转化体进行培养，由此得到细胞外分泌型核酸酶。

[5]本发明的方法

本发明的方法涉及一种分解核酸的方法，其中，包括向含有核酸的试样中供给本发明的核酸酶A、本发明的核酸酶B或这两种核酸酶而使所述核酸分解的步骤。

本发明的核酸酶A和核酸酶B可以以固态或液态的粗酶和纯化酶的形式使用。本发明的核酸酶A和核酸酶B也可以以利用通常已知的方法固定化的固定化酶的形式使用。

作为含有核酸的试样中的水性介质，只要不妨碍核酸分解反应则没有特别限制，可以列举例如水、缓冲液等。作为缓冲液，采用例如醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、琥珀酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液等，由于本发明的核酸酶A存在因磷酸离子或钠离子而产生活性抑制的可能性，因此优选不含这些物质的Tris盐酸缓冲液等。

本发明的核酸酶A和核酸酶B的使用量没有特别限制，从核酸分解的效率和经济性的观点出发，例如，本发明的核酸酶A的使用量相对于10μg核酸为1×10^-6～50U(单位)，优选为1×10^-5～10U，更优选为1×10^-4～1U，进一步优选为1×10^-3～1×10^-1U；本发明的核酸酶B的使用量相对于10μg核酸为1×10^-4～50U，优选为1×10^-3～20U，更优选为1×10^-2～10U，进一步优选为1×10^-1～1U。核酸的浓度只要是能溶解于溶液的范围则没有特别限定。

核酸分解反应优选在本发明的核酸酶A和核酸酶B具有活性且稳定地维持活性的温度附近、例如在25～35℃下实施。对于pH而言，优选在本发明的核酸酶A和核酸酶B具有活性且稳定地维持活性的条件下进行，例如在7.5～9.5下进行是适当的。在上述条件下观察到充分的核酸分解的时刻结束反应，通常在1～100小时结束反应。

核酸分解反应结束后，在含有核酸的试样中含有目标物质的情况下，对目标物质进行分离纯化，分别回收本发明的核酸酶A和核酸酶B。根据目标物质和含有核酸的试样的性质，可以将反应液加热至60～135℃、优选65～100℃而使酶失活或者利用降低pH(添加盐酸等酸)等适当的方法使酶失活而停止反应。

作为含有核酸的试样，可以假定为含有双链DNA、单链DNA、RNA等的试样，优选为含有能够成为本发明的核酸酶A和核酸酶B中的任何一种酶的底物的双链DNA和单链DNA等DNA的试样。

以下，利用实施例更详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。

实施例

1.培养上清中存在的核酸分解酶的利用活性染色的检测

通过以对质粒DNA的核酸分解活性为指标的筛选，分离出在培养上清中分泌高产核酸分解酶的深海来源的链霉菌MBE174(以下也称为MBE174)。通过SDS-PAGE和以来自于鲑鱼精的脱氧核糖核酸钠盐(西格玛奥德里奇公司制造，目录号D1626-1G)为底物的活性染色，可知本菌株在培养上清中生产的核酸分解酶为分子量约66.5kDa和在17～21kDa的低分子区域具有分布的多个蛋白质。

2.MBE174的分类学位置

对MBE174的16S rRNA基因序列(1483个碱基对)进行了分析，结果与秋吉链霉菌(Streptomyces akiyoshiensis)NBRC12434^T(AB184095)、产绿色链霉菌(S.viridochromogenes)NBRC3113^T(AB184728)、稀奇链霉菌(S.paradoxus)NBRC14887^T(AB184628)、山丘链霉菌(S.collinus)NBRC12759^T(AB184123)、灰黄链霉菌(S.griseoflavus)LMG19344^T(AJ781322)有99%一致。由此判断本菌株为链霉菌属细菌。种水平上的鉴定需要进一步的分类学分析。

3.低分子核酸分解酶核酸酶S的纯化

使用阴离子交换(SuperQ)、羟磷灰石、阳离子交换(CM琼脂糖)、肝素亲和层析(参考图1)、凝胶过滤层析对分子量约17～21kDa的低分子核酸分解酶(命名为核酸酶S，以下省略为NucS)进行纯化。纯化的概要示于表1中。

[表1]

对于NucS，在含有1mM MgCl₂、1mM CaCl₂、pH为8.5的20mMTris/HCl中测定37℃下的比活性(以下，也将该条件下的测定法称为标准比活性测定法)，结果为3.6×10⁶U/mg蛋白，显示出非常高的比活性。在此，1U表示在以1mg/mL鲑鱼精子DNA(英杰公司制，目录号15632-011)为底物使酶作用的情况下，在30分钟时使260nm的吸光度升高1时的酶量。作为参照，对于NucS，使用同一底物对在目录中记载为比活性最高的市售的核酸分解酶ベンゾナーゼ(Benzonase)(注册商标)的比活性在目录记载的条件(37℃)下进行测定，结果为9.4×10⁵U/mg蛋白。由该结果可知，NucS具有ベンゾナーゼ比活性的约3.8倍高的比活性。

通过使用Superdex G75(通用电气医疗集团制造)的凝胶过滤层析测定分子量，结果以分子量约16kDa的洗脱位置为峰顶从柱上洗脱。该值与在SDS-PAGE上产出的酶的分子量(约17kDa～约21kDa)非常一致，因此，判断NucS以单体形式存在。使用Novex(注册商标)IEF pH3-10凝胶(英杰公司制造)测定等电点，结果pI为10。

按分子量切出SDS-PAGE后的酶蛋白质，进行胰蛋白酶消化后，供于LC-MS/MS分析，结果在切出的所有蛋白质中检测到具有共有的氨基酸序列的肽ALPTPVSAATAR(序列表的序列号27)。使用美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、BLASTP程序2.2.24+(参考引用文献：Stephen F.Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,andDavid J.Lipman(1997),Nucleic Acids Res.25:3389-3402；本文献的记载作为公开的内容特别援引于此)对非冗余蛋白质序列数据库进行了同源性检索。结果，该氨基酸序列与数据库中登记的分子量23kDa的分泌蛋白(secreted protein)(来源于疮痂病链霉菌(S.scabiei)87.22、来源于灰黄链霉菌(S.griseoflavus)Tu4000等)的一部分一致。另外，该氨基酸序列与迄今为止已揭晓了生化学性质的龟裂链霉菌(S.rimosus)来源的核酸分解酶的N末端序列APPTPPDTATAR也显示出同源性(8/12个氨基酸)。由这些结果判断，MBE174生产的17～21kDa的低分子量的核酸分解酶组是由同一基因转录翻译后在酶蛋白质C末端部分被蛋白酶等低分子化而得到的产物。

使用该氨基酸序列的、利用上述BLASTP程序2.2.24+的同源性检索的结果是，除了与上述的分泌蛋白[来源于灰黄链霉菌Tu4000](登记号ZP_05541504)的一部分所含的氨基酸序列完全一致以外，该氨基酸序列还与分泌蛋白[来源于阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)MA-4680](登记号NP_827004)、分泌蛋白[来源于天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)](登记号NP_626595.1)等的一部分所含的氨基酸序列完全一致。接着，由NCBI数据库获取编码这些氨基酸序列的碱基序列及其上游1000个碱基对、下游1000个碱基对的碱基序列，使用GENETYX(注册商标)-MAC12.1.0版软件进行比对。基于该比对碱基序列，设计出由正向引物和反向引物构成的引物组A(序列表的序列号7和8)和B(序列表的序列号9和10)。引物组A的正向引物和反向引物也分别表示为引物组AF和引物组AR，后述的任何一个引物组中使用的引物也基于此进行表示。以MBE174的总DNA为模板，通过使用引物组A的PCR得到约0.3kb的扩增DNA片段，通过使用引物组B的PCR得到约0.5kb的扩增DNA片段。PCR反应使用TaKaRa LA Taq(注册商标)聚合酶(宝生物公司制造)和产品附带的缓冲液，使用将由97℃下热变性20秒、55-63℃下退火1分钟、72℃下延伸反应1.5分钟构成的循环重复30次的方法。接着，进行该扩增片段的碱基序列的分析。基于所得到的碱基序列制作引物组C(序列表的序列号11和12)。以MBE174的总DNA为模板，通过使用引物组C的PCR获取约0.3kb的扩增DNA片段，分析该片段的碱基序列。基于由上述比对碱基序列和NucS的碱基序列分析得到的碱基序列制作引物组D(序列表的序列号13和14)。以MBE174的总DNA为模板，通过使用引物组D的PCR获取约0.3kb的扩增DNA片段，分析该片段的碱基序列，得到nucS基因的5’末端序列。另一方面，使用限制性内切酶PstI消化MBE174的总DNA，并连接TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(宝生物公司制造，目录号RR015)中含有的PstI盒。以该DNA混合物为模板，使用引物组E(序列表的序列号15和16)进行PCR反应。以所得到的PCR反应产物为模板，再使用引物组F(序列表的序列号17和18)，获取约1.2kb的扩增片段，分析nucS基因的3’末端碱基序列。对通过使用上述引物组A～F的PCR得到的DNA扩增片段的全部碱基序列进行拼接，明确了nucS基因全长的碱基序列(序列表的序列号5)。该酶的基因序列与作为最相近的基因序列的、天蓝色链霉菌A3(2)基因组序列上的编码假定分泌蛋白的区域有88%(552/626个碱基)一致，与阿维链霉菌MA-4680基因组序列上的编码假定分泌蛋白的区域有85%(533/623个碱基)一致，与疮痂病链霉菌87.22基因组序列上的编码假定分泌蛋白的区域有85%(533/624个碱基)一致。另外，该基因所编码的氨基酸序列(序列表的序列号3)与作为最相近的氨基酸序列的、天蓝色链霉菌A3(2)的分泌蛋白有83%(178/214个氨基酸)一致，与产绿色链霉菌DSM40736和灰黄链霉菌Tu4000的分泌蛋白有82%(177/214个氨基酸)一致。通过以登记在数据库中的所有基因和蛋白质为对象的检索，检测到了与该基因及其氨基酸序列显示出同源性的碱基序列，但均不存在具有经过分离纯化/功能性酶化学分析的报道例的蛋白质。因此，推测NucS蛋白质和nucS基因是迄今未报道过的新的蛋白质和基因。

如上所述，分子量为约17kDa～约21kDa的NucS(将SDS-PAGE后的其分子区域中含有的所有蛋白质按分子量切出，胰蛋白酶消化后，供于LC-MS/MS分析而得到的结果)在所有蛋白质中存在具有共有氨基酸序列的肽ALPTPVSAATAR。根据SDS-PAGE法，NucS的分子量在分子量最小的情况下为约17kDa，因此，将NucS的氨基酸序列(214个氨基酸)中以共有氨基酸序列ALPTPVSAATAR为N末端的起点计算为17kDa的共有氨基酸序列(157个氨基酸)作为NucS的核心序列(序列表的序列号1)。通过与数据库中登记的序列比较，NucS的核心序列与灰黄链霉菌Tu4000的分泌蛋白或含S层蛋白结构域的蛋白有86%(136/157个氨基酸)一致，与天蓝色链霉菌A3(2)的分泌蛋白和变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24的分泌蛋白等有85%(135/157个氨基酸)一致。

4.66.5kDa的核酸分解酶核酸酶L的纯化

使用疏水性(丁基-TOYOPEARL和苯基琼脂糖)肝素亲和层析对分子量约66.5kDa的核酸分解酶(命名为核酸酶L，以下省略为NucL)进行纯化，直到电泳成为单一条带(参考图2)。纯化的概要示于表2中。

[表2]

关于NucL，在含有1mM MgCl₂、1mM CaCl₂、pH为8.5的20mMTris/HCl中、在37℃下的比活性为5.6×10⁴U/mg蛋白。使用Novex(注册商标)IEF pH3-10凝胶(英杰公司制造)测定等电点，结果pI为7.0。接着，确定纯化酶的N末端氨基酸序列，可知为DSVRIHDIQGTTR。该序列与由疮痂病链霉菌(Streptomyces scabiei)87.22的基因组编码的假定蛋白质(putative secreted hydrolase，假定分泌水解酶)、由阿维链霉菌MA-4680的基因组编码的假定蛋白质(大分泌蛋白)分别有12/13个氨基酸一致。

在SDS-PAGE后，将纯化酶进一步进行胰蛋白酶消化，并供于LC-MS/MS分析，结果检测到总计8处与由阿维链霉菌MA-4680、灰黄链霉菌Tu4000的基因组序列编码的两个假定蛋白质大分泌蛋白[来源于灰黄链霉菌Tu4000](登记号ZP_05541988)、大分泌蛋白[来源于阿维链霉菌MA-4680](登记号NP_827523)的氨基酸序列一致的短氨基酸序列(6-21个氨基酸)。接着，使用大分泌蛋白[来源于阿维链霉菌MA-4680](登记号NP_827523)的氨基酸序列进行利用BLASTP程序的同源性检索，结果，与大分泌蛋白[嗜酸链霉菌(Streptomycessviceus)ATCC29083](登记号ZP_06916237)、大分泌蛋白[来源于产绿色链霉菌DSM40736](登记号ZP_05530648)、假定水解酶[来源于疮痂病链霉菌87.22](登记号YP_003492557)、大分泌蛋白[来源于天蓝色链霉菌A3(2)](登记号NP_626174)、大分泌蛋白[来源于加纳链霉菌(Streptomyces ghanaensis)ATCC14672](登记号ZP_04688952)、大分泌蛋白[来源于灰黄链霉菌Tu4000](登记号ZP_05541988)显示出约80%的同源性。通过NCBI数据库获取这些蛋白质的氨基酸序列，使用GENETYX(注册商标)-MAC12.1.0版软件进行比对。基于该比对氨基酸序列，选择保守性高的区域，制作引物组G(序列表的序列号19和20)。以MBE174的总DNA为模板，通过使用引物组G的PCR获取约1.6kb的扩增DNA片段序列，并进行碱基序列的分析。基于所得到的碱基序列设计引物组HR(序列表的序列号21)。另外，另一方面，通过NCBI数据库获取存在于编码大分泌蛋白[来源于灰黄链霉菌Tu4000](登记号ZP_05541988)的碱基序列的上游的1000个碱基对的碱基序列和存在于编码大分泌蛋白[来源于天蓝色链霉菌A3(2)](登记号NP_626174)的碱基序列的上游的1000个碱基对的碱基序列，基于上述碱基序列中保守的序列，制作引物组HF(序列表的序列号22)。以MBE174的总DNA为模板，通过使用由引物组HR、引物组HF的组合构成的引物组H的PCR获取约0.5kb的扩增DNA片段，并进行碱基序列的分析，得到nucL基因5’末端序列。另外，使用限制性内切酶PstI消化MBE174的总DNA，并连接TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒(宝生物公司制造，目录号RR015)中所含的PstI盒，以DNA混合物为模板，使用引物组I(序列表的序列号23和24)进行PCR反应。以所得到的PCR反应产物为模板，再使用引物组J(序列表的序列号25和26)，获取约1.3kb的扩增片段，分析nucL基因的3’末端碱基序列。对通过使用上述引物组G～J的PCR得到的DNA扩增片段的全部碱基序列进行拼接，明确了nucL基因全长的碱基序列(序列表的序列号6)。该酶的基因序列与作为最相近的基因序列的、天蓝色链霉菌A3(2)的基因组序列的编码假定大分泌蛋白的区域有84%(1587/1872个碱基)一致，与阿维链霉菌MA-4680基因组上的编码假定大分泌蛋白的区域有81%(1508/1859个碱基)一致。另外，该基因所编码的氨基酸序列(序列表的序列号4)与作为最相近的氨基酸序列的、由天蓝色链霉菌A3(2)的基因组编码的假定大分泌蛋白有80%(491/613个氨基酸)一致，与由加纳链霉菌ATCC14672的基因组编码的大分泌蛋白有80%(488/609个氨基酸)一致。通过以登记在数据库中的所有基因和蛋白质为对象的检索，检测到了与该基因显示出同源性的碱基序列，但均不存在具有经过分离纯化/功能性酶化学分析的报道例的蛋白质。因此，推测NucL蛋白质和nucL基因是迄今未报道过的新的蛋白质和基因。

将切掉nucL所编码的全长氨基酸序列(607个氨基酸)中N末端的信号肽后得到的序列作为NucL成熟蛋白质(575个氨基酸)(序列表的序列号2)。对于该NucL成熟蛋白质，使用美国国家生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、BLASTP程序2.2.24+对非冗余蛋白质序列数据库进行了同源性检索，结果，与天蓝色链霉菌A3(2)、变铅青链霉菌TK24的(假定)大分泌蛋白有81%(465/574个氨基酸)一致，与加纳链霉菌ATCC14672的大分泌蛋白有80%(467/577个氨基酸)一致。

5.NucS和NucL的生化学性质

NucS和NucL的生化学性质的试验结果如下所示。

(1)pH对酶活性的影响

对于各pH下的核酸分解活性，在含有1mM MgCl₂、1mM CaCl₂的20mM2-吗啉乙磺酸一水合物/NaOH(MES，pH5.5～7.0)、3-吗啉丙磺酸/NaOH(MOPS，pH7～8)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸/NaOH(TAPS，pH8～9)、N-环己基-2-氨基乙磺酸/NaOH(CHES，pH9～9.5)或N-环己基-3-氨基丙磺酸/NaOH(CAPS，9.5～10)中，以0.4mg/mL来自于鲑鱼精的脱氧核糖核酸钠盐(西格玛奥德里奇公司制造，目录号D1626-1G)为底物，在25℃下进行15分钟测定。可知NucS的最适反应pH为pH8.5附近，NucL的最适反应pH为pH8.8附近(参考图3和图4)。

(2)温度对酶活性的影响

在含有1mM MgCl₂、1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中，对各温度条件下的核酸分解活性进行15分钟测定，可知NucS的最适反应温度为55℃附近，NucL的最适反应温度为45℃附近(参考图5)。

(3)热稳定性试验

在含有1mM MgCl₂、1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中，测定在各温度下进行30分钟热处理后的残留活性(参考图6)。将保存在冰浴中的酶的活性设为100%。结果，NucS在45℃以下稳定，NucL在35℃以下稳定。

(4)一价盐对酶活性的影响

对NucS和NucL考察一价盐的影响。在含有1mM MgCl₂和0～1000mM NaCl、pH为8.5的10mM Tris/HCl中，以0.4mg/mL来自于鲑鱼精的脱氧核糖核酸钠盐(西格玛奥德里奇公司制造，目录号D1626-1G)为底物，在25℃下对各NaCl浓度的核酸分解活性进行15分钟测定。可知：NucS在NaCl浓度低的情况下活性高；NucL即使在存在浓度为1000mM以下的NaCl的条件下也维持活性(参考图7)。使用KCl时也得到基本同样的结果(参考图8)。

(5)二价金属盐对酶活性的影响

对NucS和NucL考察二价金属盐的影响。在含有1mM CaCl₂和0～20mM MgCl₂或MnCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中，向加入有作为底物的0.4mg/mL来自于鲑鱼精的脱氧核糖核酸钠盐(西格玛奥德里奇公司制造，目录号D1626-1G)的反应液中添加NucS或NucL，在冰中孵育30分钟后，在25℃下对核酸分解活性进行15分钟测定。NucS、NucL的活性需要二价的金属盐。NucS、NucL在0.25～5mM MgCl₂存在下显示出高活性(参考图9)。另外，NucS在1～2mM MnCl₂存在下显示出与MgCl₂存在下基本同等的活性(参考图10)。另外，本试验中，为了提高酶稳定性，向所有反应液中添加了1mM CaCl₂。

(6)磷酸盐对酶活性的影响

对NucS和NucL考察磷酸盐的影响。在含有1mM MgCl₂、1mMCaCl₂、pH为8.5的0～40mM磷酸钾缓冲液中，以0.4mg/mL来自于鲑鱼精的脱氧核糖核酸钠盐(西格玛奥德里奇公司制造，目录号D1626-1G)为底物，在25℃下对核酸分解活性进行15分钟测定。NucS受到磷酸盐的强烈抑制，在0.5mM以上的磷酸盐存在下丧失活性。另一方面，与NucS相比，NucL对磷酸盐显示出优良的耐性，即使在10mM的磷酸钾存在下也能够保持50%的活性(参考图11)。

(7)各种化学物质对酶活性的影响

在冰浴上与表3中的化合物接触1小时后，利用标准比活性测定方法测定酶活性(参考表3)。如表3所示，NucS和NucL受到ZnCl₂、CuCl₂、EDTA的强烈抑制。另外，NucS对二甲亚砜、二甲基甲酰胺显示出高耐性，NucL对SDS显示出高耐性。另外，难溶于水的化合物在溶解于二甲亚砜后，添加至酶液中。添加后的二甲亚砜的终浓度设定为5%，将5%二甲亚砜存在下的活性设为100%。

[表3]

6.NucS和NucL引起的核酸分解的模式和底物特异性

(1)NucS和NucL对环状质粒DNA的分解模式的分析

以使用质粒纯化试剂盒(HiSpeed(注册商标)质粒中量提取试剂盒；凯杰公司制造，目录号12643)纯化的环状质粒DNA(pUC18)为底物，分析NucS和NucL各自的核酸分解模式。向利用标准比活性测定方法得到的质粒溶液(约2μg～约10μg)中分别添加下表所示的不同酶量的酶液，在25℃下进行15分钟核酸分解反应。将分解后的反应液供于1%琼脂糖凝胶电泳，分析其分解得到的DNA的分解模式。改变酶浓度来进行分解时的情形(25℃的反应)示于图12中。作为参照，将使用ベンゾナーゼ(相同单位数)时的试验结果也一并示于图12中。另外，各泳道的说明示于表4中。

[表4]

接着，将NucL的酶量提高至0.5U，试验是否能够将质粒完全分解(参考图13)。由这些结果可知，无论环状质粒DNA为超螺旋型还是松弛型的形状，NucS和NucL均能够以单一酶将质粒完全分解。

(2)NucS和NucL对环状DNA的分解反应初期的反应模式的分析

分析利用标准比活性测定方法得到的NucS和NucL对环状DNA(pUC18质粒)的分解反应初期的反应模式(参考图14和图15)。由该结果推测，NucS具有内切型模式的分解活性。另外，NucL显示出与由Desai 和Shankar(参考Eur. J. Biochem.267, 5123-5135, 2000；本文献的记载作为公开的内容特别援引于此)提出报道例的单链特异性内切型核酸分解酶类似的反应模式。认为由单链的内切型切割的蓄积所致的低分子化会促进单链特异性核酸分解酶引起的环状质粒DNA的分解。

(3)双链直链DNA的分解模式

使用利用限制性核酸酶BamHI(产生5’-突出末端)、SacI(产生3’-突出末端)、SmaI(产生平滑末端)使利用标准比活性测定方法得到的环状DNA(pUC18质粒)成为直链状而得到的底物，进行使用NucS和NucL的分解反应(参考图16和图17)。另外，各泳道的说明示于表5中。

[表5]

由该结果可知，无论DNA链末端为何种结构，NucS和NucL均能够以单一酶将直链状双链DNA分解。另外，由图12与图16和图17的比较可知，NucS以同样的效率分解环状DNA和直链状双链DNA。另一方面，与环状DNA相比，NucL更高效地分解直链状双链DNA。另外，对于反应过程中观察到的不进行分解的DNA的最大大小而言，在NucS的情况下从反应开始一直保持恒定(图16的泳道5～8的主要条带)，相对于此，在NucL的情况下发生大小的减小(将图17的泳道3与泳道4～8的主要条带进行比较)。这暗示：与随机的位置相比在末端部分更高效地发生由NucL引起的DNA分解，即进行了外切型分解反应。由以上的结果推测，NucL具有称为内切-外切型的反应模式。

(4)对单链DNA和双链DNA以及RNA的反应性试验

试验各酶对利用15分钟的标准比活性测定方法得到的在低温下溶解的鲑鱼DNA(双链DNA)和95℃下进行10分钟热变性后的该DNA(单链DNA)的反应性。结果可知，NucS以同等程度的效率分解未变性DNA和热变性DNA，NucL以与未变性DNA相比约5倍高的效率分解热变性后DNA。即，可以说NucL为高效地作用于单链DNA的酶。另外，测定了对RNA(酵母来源的mRNA)的分解活性，结果，NucS显示出RNA分解活性，而NucL未显示出RNA分解活性。

(5)磷酸二酯酶、磷酸酶活性试验

以双(对硝基苯基)磷酸酯、对硝基苯基磷酸酯为底物，按照Tomoyeda等人(参考Archives of biochemistry and biophysics.131(1),191-202,1969；本文献的记载作为公开的内容特别援引于此)的方法，在含有1mM MgCl₂、1mM CaCl₂和1%甘油、pH为8.5的100mMTris/HCl中，使用含有0.2%上述底物的反应液在25℃下测定两种酶的磷酸二酯酶活性、磷酸酶活性。结果可知，NucS既不具有磷酸二酯酶活性也不具有磷酸酶活性，而NucL具有磷酸二酯酶活性和磷酸酶活性这两种活性。

7.总结

NucS与市售核酸分解酶相比具有格外高的比活性，在低盐浓度条件下高效地以内切型的方式分解各种核酸(单链和双链的直链和环状DNA、RNA)。NucL在较宽的盐浓度条件下以内切-外切型的方式分解DNA(单链和双链的直链和环状DNA)。因此，通过并用NucS和NucL，可以期待在广泛的条件下得到优良的核酸分解活性。另外，两酶不需要添加Mn²⁺，在低浓度(1mM)的Mg²⁺和Ca²⁺存在下显示出高活性，并且该酶的生产菌为容易培养且认为安全性高的链霉菌属细菌，因此，认为有望作为食品、药品制造时的核酸分解工业用酶。通过培养核酸分解酶高产放线菌链霉菌MBE174，并且使用编码该酶的新基因，认为能够廉价地提供核酸分解酶。

序列表中记载的序列如下所示：

No.1NucS的核心序列

ALPTPVSAATARGYLASLKVAPENRTGYKRDLFPHWITQSGTCNTRETVLKRDGTNVVTDAACAATSGSWYSPFDGATWTAASDVDIDHLVPLAEAWDSGASAWTTAQRQAFANDLTRPQLLAVTDTVNQSKGDKDPAEWMPPRAAYHCTYVRAWVQ；

No.2NucL成熟蛋白质

DSVRIHDIQGTTRISPYAGRQVADVPGVVTGVRDHGSSRGFWFQDPRPDDDPATSEGVFVFTGSAPGVEAGDAVTVSGTVSEFVPGGTASGNQSLTEITRPTVTVVSRGNPVPDPVVVSARSVPHAYAPAGDAAANGSVNALPLRPDRYALDYYESLEGMNVQVADARVVGATDPYTELWVTVKPGENASPRGGTVYGSRDAQNTGRLQIQTLGVPAGFPAADVGDTLAGATTGPLDYNQFGGYTLVARSLGTLTAGGLARETTREQHRDELSVATYNVENLDPSDGTFAAHAEAIVRNLRSPDIVSLEEIQDDNGATDDGTVTAGVTVGKLIDAVVAAGGPRYDWRSVDPVDKADGGQPGGNIRQVFLFDPRRVSFADRPGGDAVTATGVVKVRGKAALTHSPGRVDPANPAWLNSRKPLAGEFSFRGRTVFVIANHFASKGGDQGLTSQYQPPARSSETQRHLQATAVNTFVKQILAVQKNADVIALGDINDFEFSGTTERLEAGGALWSAVRSLPPGERYSYVYQGNSQVLDQILVSPSIRRGHLSYDSVHINAEFHDQISDHDPQVLRYRP；

No.3NucS

MPKLYARRRFAVLAALTGLIASAGLFHGPAASAALPTPVSAATARGYLASLKVAPENRTGYKRDLFPHWITQSGTCNTRETVLKRDGTNVVTDAACAATSGSWYSPFDGATWTAASDVDIDHLVPLAEAWDSGASAWTTAQRQAFANDLTRPQLLAVTDTVNQSKGDKDPAEWMPPRAAYHCTYVRAWVQVKYYYGLSVDTAEKTALTNRLAGC；

No.4NucL

MASQSVTRLAALTVAATCSAASVVVLGPPAHADSVRIHDIQGTTRISPYAGRQVADVPGVVTGVRDHGSSRGFWFQDPRPDDDPATSEGVFVFTGSAPGVEAGDAVTVSGTVSEFVPGGTASGNQSLTEITRPTVTVVSRGNPVPDPVVVSARSVPHAYAPAGDAAANGSVNALPLRPDRYALDYYESLEGMNVQVADARVVGATDPYTELWVTVKPGENASPRGGTVYGSRDAQNTGRLQIQTLGVPAGFPAADVGDTLAGATTGPLDYNQFGGYTLVARSLGTLTAGGLARETTREQHRDELSVATYNVENLDPSDGTFAAHAEAIVRNLRSPDIVSLEEIQDDNGATDDGTVTAGVTVGKLIDAVVAAGGPRYDWRSVDPVDKADGGQPGGNIRQVFLFDPRRVSFADRPGGDAVTATGVVKVRGKAALTHSPGRVDPANPAWLNSRKPLAGEFSFRGRTVFVIANHFASKGGDQGLTSQYQPPARSSETQRHLQATAVNTFVKQILAVQKNADVIALGDINDFEFSGTTERLEAGGALWSAVRSLPPGERYSYVYQGNSQVLDQILVSPSIRRGHLSYDSVHINAEFHDQISDHDPQVLRYRP；

No.5nucS基因

ATGCCGAAGCTCTACGCGCGTCGACGGTTCGCCGTCCTCGCCGCGCTCACCGGACTCATAGCCTCCGCCGGGCTCTTCCACGGTCCGGCCGCCTCCGCCGCCCTCCCCACGCCGGTCAGCGCCGCCACCGCCCGCGGCTACCTCGCCTCCCTGAAGGTGGCCCCCGAGAACCGCACCGGCTACAAGCGCGACCTCTTCCCCCACTGGATCACGCAGTCCGGCACCTGCAACACCCGCGAGACCGTCCTCAAACGCGACGGCACCAACGTCGTCACCGACGCCGCCTGCGCCGCCACCAGCGGCAGTTGGTACTCGCCCTTCGACGGGGCCACCTGGACCGCCGCCTCCGACGTCGACATCGACCACCTCGTCCCGCTGGCCGAGGCGTGGGACTCCGGCGCGAGCGCCTGGACCACGGCCCAGCGCCAGGCGTTCGCCAACGACCTGACACGTCCTCAGCTCCTCGCCGTCACCGACACCGTGAACCAGTCCAAGGGCGACAAGGACCCGGCCGAGTGGATGCCGCCCCGGGCCGCCTACCACTGCACCTACGTACGCGCCTGGGTGCAGGTGAAGTACTACTACGGCCTCTCGGTCGACACCGCCGAGAAGACGGCGCTCACGAACCGGCTCGCCGGCTGCTGA；

No.6nucL基因

TTGGCCAGCCAGTCCGTCACGCGCCTCGCCGCGCTCACCGTCGCCGCCACCTGTTCGGCGGCGTCCGTCGTCGTCCTCGGTCCGCCCGCGCACGCCGACTCCGTGCGCATCCACGACATCCAGGGCACCACCAGGATCTCCCCGTACGCCGGCCGCCAGGTCGCCGACGTGCCCGGCGTCGTCACCGGAGTCCGCGACCACGGCTCCTCCCGGGGCTTCTGGTTCCAGGACCCGCGGCCCGACGACGACCCCGCCACCAGCGAGGGAGTGTTCGTCTTCACCGGCTCGGCCCCCGGGGTCGAGGCCGGCGACGCGGTCACCGTCTCCGGCACGGTCTCGGAGTTCGTGCCCGGCGGGACCGCCTCCGGCAACCAGTCGCTCACCGAGATCACCCGGCCCACGGTCACCGTGGTCTCCCGCGGCAACCCGGTGCCGGACCCGGTCGTCGTCTCGGCCCGCTCCGTGCCGCACGCCTACGCCCCGGCGGGCGACGCCGCCGCGAACGGCTCCGTCAACGCCCTGCCCCTGCGGCCCGACCGCTACGCCCTGGACTACTACGAGTCCCTGGAGGGCATGAACGTCCAGGTGGCCGACGCCCGCGTGGTCGGCGCGACCGACCCGTACACCGAGCTGTGGGTGACGGTGAAGCCCGGCGAGAACGCGAGCCCCCGGGGCGGCACCGTCTACGGCTCCCGCGACGCGCAGAACACCGGGCGGCTGCAGATCCAGACCCTGGGCGTACCAGCCGGCTTCCCCGCCGCCGACGTGGGCGACACCCTCGCGGGCGCCACCACCGGCCCGCTCGACTACAACCAGTTCGGCGGCTACACCCTGGTCGCCCGTAGTCTCGGCACGCTCACCGCCGGCGGGCTCGCCCGCGAGACGACCCGGGAGCAGCACCGCGACGAGCTGTCGGTGGCCACGTACAACGTCGAGAACCTCGACCCCTCCGACGGCACCTTCGCCGCGCACGCGGAGGCGATCGTCCGGAACCTGCGCTCACCGGACATCGTGTCCCTGGAGGAGATCCAGGACGACAACGGCGCCACGGACGACGGCACGGTGACCGCCGGCGTGACGGTGGGCAAGCTGATCGACGCCGTCGTCGCGGCCGGCGGCCCGCGCTACGACTGGCGCTCGGTGGACCCCGTCGACAAGGCGGACGGCGGGCAGCCGGGCGGCAACATCCGCCAGGTGTTCCTCTTCGACCCGCGGCGGGTCTCCTTCGCCGACCGTCCCGGCGGGGACGCGGTCACCGCGACCGGGGTGGTGAAGGTGCGCGGCAAGGCGGCGCTGACCCACTCCCCCGGCCGGGTCGACCCCGCGAACCCCGCCTGGCTGAACAGCCGCAAGCCGCTGGCCGGCGAGTTCTCGTTCCGCGGGCGGACGGTCTTCGTGATCGCCAACCACTTCGCGTCCAAGGGCGGCGACCAGGGGCTGACCTCCCAGTACCAGCCGCCGGCGCGGAGTTCGGAGACCCAGCGCCACCTCCAGGCGACGGCGGTGAACACCTTCGTCAAGCAGATCCTGGCGGTCCAGAAGAACGCGGACGTCATCGCCCTCGGCGACATCAACGACTTCGAGTTCTCCGGCACGACGGAACGCCTGGAGGCCGGCGGCGCGCTCTGGTCGGCGGTCAGGTCGCTGCCGCCGGGCGAGCGCTACTCGTACGTCTACCAGGGCAACAGCCAGGTGCTCGACCAGATCCTGGTGAGCCCGTCGATCCGGCGCGGGCACCTGTCCTACGACAGCGTGCACATCAACGCCGAGTTCCACGACCAGATCAGCGACCACGACCCGCAGGTGCTGCGGTACCGCCCCTGA；

No.7引物组AF

CGCATG(C/T)C(A/G)AAG(G/T)TCTACG；

No.8引物组AR

A(A/G)CTGCCGCTGGTGG；

No.9引物组BF

AGCGGCAG(C/T)TGGTACTC；

No.10引物组BR

ACCCGCGATCTGGAAGG；

No.11引物组CF

GCTACAAGCGCGACCTCTTC；

No.12引物组CR

TGGACTGGTTCACGGTGTC；

No.13引物组DF

AACTGCCGCTGGTGG；

No.14引物组DR

CTGAGCAGTATGTCGACGGTC；

No.15引物组EF

GCTACAAGCGCGACCTCTTC；

No.16引物组ER

GTTAGAACGCGTAATACGAC；

No.17引物组FF

CTGGGTGCAGGTGAAGTACTAC；

No.18引物组FR

GTAATACGACTCACTATAGG；

No.19引物组GF

GGCTTCTGGAT(A/G/C)CAGGACCC；

No.20引物组GR

CTGCGGGTCGTGGTCG；

No.21引物组HR

CGGTGAGCGACTGGTTG；

No.22引物组HF

CAGTACATGGC(C/T)GAAACCTTGAC；

No.23引物组IF

CGAGTTCTCGTTCCGCG；

No.24引物组IR

GTTAGAACGCGTAATACGAC；

No.25引物组JF

ATCGCCAACCACTTCGC；

No.26引物组JR

GTAATACGACTCACTATAGG；

No.27NucS的共有序列

ALPTPVSAATAR。

保藏编号

链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174FERM P-21987

Claims

1.一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶，其以双链DNA、单链DNA和RNA为底物，并且纯化后在含有1mM MgCl₂和1mM CaCl₂、pH为8.5的20mM Tris/HCl中在37℃下供于双链DNA30分钟时的比活性与ベンゾナーゼ(注册商标)的比活性为同等程度或高于ベンゾナーゼ的比活性。

2.如权利要求1所述的核酸酶，其中，利用SDS-PAGE法测定的分子量为17000～21000。

3.如权利要求1所述的核酸酶，其中，需要Mg²⁺或Mn²⁺作为二价金属离子。

4.如权利要求1所述的核酸酶，其中，链霉菌属细菌是保藏编号为FERM P-21987的链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174。

5.一种核酸酶，其中，包含：

(1)序列表的序列号1中记载的氨基酸序列、

6.一种链霉菌属细菌来源的细胞外分泌型核酸酶，其以双链DNA和单链DNA为底物，并且在100mM Na⁺存在下的比活性为未添加Na⁺时的比活性的60%以上。

7.如权利要求6所述的核酸酶，其中，利用SDS-PAGE法测定的分子量为约66500。

8.如权利要求6所述的核酸酶，其中，需要Mg²⁺作为二价金属离子。

9.如权利要求6所述的核酸酶，其中，链霉菌属细菌是保藏编号为FERM P-21987的链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174。

10.一种核酸酶，其中，包含：

(a)序列表的序列号2中记载的氨基酸序列、

11.一种粗酶，其中，含有权利要求1～5中任一项所述的核酸酶和/或权利要求6～10中任一项所述的核酸酶作为核酸酶活性成分。

12.一种细胞外分泌型核酸酶的制造方法，其中，包括对保藏编号为FERM P-21987的链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174进行培养而得到至少一种细胞外分泌型核酸酶的步骤。

13.一种细胞外分泌型核酸酶或其粗酶，其通过权利要求12所述的制造方法得到。

14.链霉菌(Streptomyces sp.)MBE174，其保藏编号为FERMP-21987。

15.一种分解核酸的方法，其中，包括将权利要求1～5中任一项所述的核酸酶和/或权利要求6～10中任一项所述的核酸酶供于含有核酸的试样而使所述核酸分解的步骤。

16.如权利要求15所述的方法，其中，所述核酸为DNA。