JPH07203960A - アルカリセルラーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する低分
子型アルカリセルラーゼ、これをコードする遺伝子断
片、その遺伝子断片を含む組換えプラスミド、その組換
えプラスミドを保持する組換え微生物、及びその低分子
型アルカリセルラーゼの製造法。 【効果】 アルカリ領域において高い比活性を有し、且
つ広いpH領域、温度領域において安定であり、更に界面
活性剤やキレート剤の存在下においても充分な活性を有
する低分子型アルカリセルラーゼを容易に高純度、高収
率で得ることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアルカリセルラーゼに関
し、更に詳細には遺伝子工学的手法により低分子化させ
て比活性を向上せしめたアルカリセルラーゼに関する。
また、当該セルラーゼをコードする遺伝子断片及びこれ
を含有する組換えプラスミド、並びに当該セルラーゼを
生産する形質転換体微生物及び当該セルラーゼの製造法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、セルラーゼはセルロースをグルコ
ース、又はセロビオース、或いはセロオリゴ糖まで分解
する酵素反応を触媒する複雑な酵素群として理解されて
おり、その作用機構により、Ｃ₁酵素、Ｃ_X酵素とβ−グ
ルコシダーゼ、或いはエキソ−β−グルカナーゼ、エン
ド−β−グルカナーゼ、セロビアーゼなどの名称で呼ば
れる酵素を含有すると言われる。過去数十年のセルラー
ゼの研究の歴史は、バイオマス資源の有効利用、醸造業
に於ける麦芽の糖化などの観点から、例えばトリコデル
マ属、アスペルギルス属、アクレモニウム属、フミコー
ラ属、イルペックス属などの糸状菌類、或いは、クロス
トリジウム属、シュードモナス属、ルミノコッカス属、
セルロモナス属等の細菌類などにその供給源を求めてき
た（村尾澤夫ら「セルラーゼ」、講談社（１９８
７））。一方、セルラーゼの新規な産業的用途として、
衣料用洗浄剤組成物に関するものが知られており、バチ
ルス属、セルロモナス属及びストレプトマイセス属細菌
の生産するアルカリセルラーゼが注目されている（特公
昭５０−２８５１５号公報、特開昭５８−２２４６８６
号公報、Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ．，１３１巻，３３３９頁，（１９８５）、
特開昭６１−２８０２７６号公報、特開昭６３−１０９
７７１号公報、特開昭６３−２４０７８５号公報な
ど）。

【０００３】一方、近年になって、微生物由来のセルラ
ーゼ遺伝子、具体的には、トリコデルマ属、クロストリ
ジウム属、セルロモナス属、バチルス属、ストレプトマ
イセス属及びルミノコッカス属等の遺伝子が遺伝子操作
技術を用いて単離されており、その塩基配列が決定され
ている（Ｂｅｇｕｉｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，４４巻，２１９頁，（１９９０）等）。こ
うした試みは、遺伝子工学や蛋白工学の手法によるセル
ラーゼの機能及び特性の改良等を考慮した場合、極めて
意義のあることであるが、この目的の為には、酵素の立
体構造が明らかになっていることが望ましい。ところ
が、セルラーゼの立体構造に関しては知見が少なく、Ｘ
線結晶構造解析等によって立体構造が明らかにされた例
としては、僅かに、トリコデルマ リーゼ（Ｔｒｉｃｈ
ｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）由来のエキソ型セルラー
ゼ（Ｒｏｕｖｉｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９巻，３
８０頁，（１９９０））及びクロストリジウム サーモ
セラム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌ
ｌｕｍ）由来のエンド型セルラーゼ（Ｊｕｙら，Ｎａｔ
ｕｒｅ，３５７巻，８９頁，（１９９２））が知られる
のみであった。特に、作用の至適pHを９〜１０に有する
アルカリセルラーゼに関しては、立体構造に関する知見
は皆無であり、一次構造に関しても、僅かに、好アルカ
リ性バチルス属細菌由来のものが知られるのみであった
（Ｆｕｋｕｍｏｒｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１
６８巻，４７９頁，（１９８６）、Ｆｕｋｕｍｏｒｉ
ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３２巻，２
３２９頁，（１９８６）、特開平１−２８１０９０号公
報）。このため、これまでに、遺伝子工学・蛋白工学に
よるセルラーゼ、特にアルカリセルラーゼの改良に関す
る成功例は知られていなかった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は遺伝子工学的手法により改良されたアルカリセルラー
ゼを提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
好アルカリ性バチルス属細菌に由来し、９４１アミノ酸
残基から成るアルカリセルラーゼをコードする遺伝子に
着目し、種々の欠失変異体を作成して適当なベクターに
結合し、大腸菌或いは枯草菌等の宿主内に導入してアル
カリセルラーゼの生産性の解析を行った。この結果、当
該酵素の翻訳開始点のメチオニンから数えて、２２８位
のアラニンから５８４位のロイシンまでの３５７アミノ
酸のみをコードする欠失遺伝子を有する宿主菌が、高い
セルラーゼ活性を有する酵素を生産することを見出し、
更に、この培養液から低分子型アルカリセルラーゼを精
製して、その特性の解析を行ったところ、得られた低分
子型酵素が野性型酵素と比べて、より高い比活性を示す
ことを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は配列番号１に示すアミ
ノ酸配列を有するアルカリセルラーゼを提供するもので
ある。また、本発明は配列番号１に示すアミノ酸配列を
有するアルカリセルラーゼをコードする遺伝子断片を提
供するものである。また、本発明は、配列番号１に示す
アミノ酸配列を有するアルカリセルラーゼ（以下、低分
子型アルカリセルラーゼと略す）をコードする遺伝子断
片を含む組換えプラスミド、及びこの組換えプラスミド
を保持する形質転換体微生物を提供するものである。さ
らにまた、本発明はこの形質転換体微生物を培養するこ
とによるアルカリセルラーゼの製造法を提供するもので
ある。

【０００７】本発明に於いて、アルカリセルラーゼ遺伝
子の供与体となる微生物としては、特に限定するもので
はないが、例えば、好アルカリ性バチルス属細菌の一
種、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）
ＫＳＭ−６３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４８５）を用いる
ことができる。本菌株は本発明者らが、菌体外に著量の
アルカリセルラーゼを生産する菌株として栃木県芳賀郡
の土壌より分離したものであり、微工研条寄第１４８５
号として寄託されている。当該菌株の分類学的特性等に
ついては、特開昭６３−１０９７７１号公報に記載され
ている。当該供与菌株からのアルカリセルラーゼ遺伝子
のクローニング方法並びに当該遺伝子の構造に関して
も、特開平１−２８１０９０号公報に詳述されている
が、本遺伝子は、図１に示した様に約４．０kbと約２．
６kbの２つのＨｉｎｄIII断片に跨がって存在してお
り、９４１アミノ酸残基から成るアルカリセルラーゼを
コードしている。このうち、約２．６kbＨｉｎｄIII断
片内に存在して５８５位のバリンからカルボキシル末端
（９４１位）のグルタミン酸までをコードする遺伝子領
域が酵素活性発現の為には不要であることが知られてい
た。更には、約４．０kbのＨｉｎｄIII断片に於いて
も、当該酵素の１位から５８４位までをコードする領域
並びに、プロモーターや翻訳開始点領域は、約２．４kb
の領域内（図１のｐＢＣ１１２）に含まれており、この
約２．４kb断片が当該酵素の充分な発現の為に必須であ
ると考えられていた（特開昭６３−２３３７９２号公
報）。

【０００８】本発明の低分子型アルカリセルラーゼ遺伝
子は、上述のアルカリセルラーゼ遺伝子を含む約２．４
kbの断片から更に、２２７位のグルタミン酸よりもアミ
ノ末端側をコードする領域を欠失させた約１．０kbのＤ
ＮＡ断片であり、配列番号１に示したアミノ酸配列を有
する低分子型アルカリセルラーゼをコードしている。遺
伝子領域の欠失の方法としては、特に限定されるもので
はないが、例えば、以下の様な方法を用いることができ
る。即ち、約２．４kb断片を適当なベクター、例えば、
プラスミドｐＢＲ３２２等に結合した後、２２８位のア
ラニンをコードする領域よりも上流側、好適には、約１
kb以内の点に於いて、この組換えプラスミドを唯一点に
おいて切断し得る制限酵素、例えば、ＳｎａＢＩ等を用
いて切断し、更に、適当なエキソ型ヌクレアーゼ、例え
ば、ヌクレアーゼＢａｌ３１やエキソヌクレアーゼIII
等を適当な条件下で作用させて当該遺伝子上流領域の欠
失反応を行う。次いで、５８４位のロイシンをコードす
る領域の下流に切断点が存在し、且つ、当該遺伝子を切
断しない制限酵素、例えば、ＨｉｎｄIIIによる切断反
応を行った後、約１．０kbとなった低分子型アルカリセ
ルラーゼ遺伝子断片を、例えば、アガロースゲル電気泳
動等を用いて分離し、これを単離すれば良い。

【０００９】斯くして得られた約１．０kbの低分子型ア
ルカリセルラーゼ遺伝子断片（配列番号２）は、遺伝子
の発現の為に必須であるプロモーター領域や翻訳開始点
領域を欠失している為、そのままでは、例え、適当な宿
主菌に導入したとしても、低分子型アルカリセルラーゼ
の生産は望めず、通常、適当なプロモーター領域や翻訳
開始点領域を予め結合した発現ベクターを利用し、発現
ベクター上の翻訳開始コドンから続くオープン・リーデ
ィング・フレームと低分子型アルカリセルラーゼ遺伝子
断片のオープン・リーディング・フレームが一致する様
に結合することが必要である。また、本低分子型アルカ
リセルラーゼ遺伝子断片は、５８４位のロイシンのコド
ンが３’末端であり、その下流に翻訳の終止コドンを含
んでいないことから、結合したベクターの種類によって
は、この５８４位のロイシンを越えて翻訳が継続し、こ
れが生産された低分子型酵素に悪影響を与えることも考
えられる。従って、本低分子型アルカリセルラーゼ遺伝
子の下流には翻訳終止コドンを含む合成ヌクレオチド等
を結合する等の方法によって、翻訳の不要な継続を阻止
しておくことが望ましい。

【００１０】この様に、本発明の低分子型アルカリセル
ラーゼは、用いる発現ベクターの種類や結合の方法、或
いは、結合に用いた合成リンカーの配列等によって、配
列番号１に示したアミノ酸配列のアミノ末端及び／又は
カルボキシル末端に、ベクターやリンカー由来のアミノ
酸配列が付加した形で生産される場合が多いが、かかる
アミノ酸配列の付加は酵素活性の発現に影響を与えない
限り差し支えない。

【００１１】本発明に於いては、特に発現ベクターの種
類を限定するものではないが、例えば、本発明者らが構
築した発現ベクターｐＨＳＰ６４（特願平５−２５９２
５号）を用いることができる。本発明に於ける低分子型
アルカリセルラーゼ遺伝子断片を含む組換えプラスミド
の例としては、組換えプラスミドｐＷＢＣ１１５（図
４）、組換えプラスミドｐＷＢＣ１１５Ｂ（図５）或い
は組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＢＣ１１５Ｂ（図６）が
挙げられる。ｐＷＢＣ１１５及びｐＷＢＣ１１５Ｂは、
当該遺伝子断片をベクターｐＵＣ１１８に挿入したもの
であり、ベクター上のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のプ
ロモーター及び翻訳開始点領域によって、低分子型アル
カリセルラーゼの生産が行われる。また、ｐＨＳＰ−Ｂ
Ｃ１１５Ｂは、当該遺伝子断片を発現ベクターｐＨＳＰ
６４に挿入したものであり、当該酵素の生産には発現ベ
クター上の異種アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモータ
ー及び翻訳開始点領域が利用される。更に、ｐＷＢＣ１
１５Ｂ及びｐＨＳＰ−ＢＣ１１５Ｂは、当該遺伝子断片
の３’末端に終始コドン（ＴＡＡ）を含む合成ヌクレオ
チドを結合し、翻訳の不要な継続を阻止したものであ
る。

【００１２】次に、得られた組換えプラスミドを宿主菌
に導入して、低分子型アルカリセルラーゼを生産する組
換え微生物を取得するが、用いる宿主菌としては、当該
遺伝子を発現させることができ、また、組換えＤＮＡ分
子が宿主菌中で複製可能であり、組み込んだ当該遺伝子
を安定に保持できるものであれば、如何なるものも使用
することができる。例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株を宿主とするＥＫ系や枯
草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｍａｒｂ
ｕｒｇ株を宿主とするＢＳ系等が挙げられる。

【００１３】また、組換えＤＮＡ分子による宿主菌株の
形質転換の方法も特に限定されるものではなく、例え
ば、ＥＫ系宿主菌株の場合、塩化カルシウム法（Ｍａｎ
ｄｅｌとＨｉｇａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３巻，
１５９頁，（１９７０））や塩化ルビジウム法（Ｂｏｌ
ｉｖａｒとＢａｃｋｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．，６８巻，２５３頁，（１９７９））等、また
ＢＳ系宿主菌株の場合には、コンピテント・セル法（Ｃ
ｏｎｔｅｎｔｅとＤａｂｎａｕ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．，１７７巻，４５９頁，（１９７９））やプロ
トプラスト法（ＣｈａｎｇとＣｏｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８巻，１１１頁，（１９７
８））等を用いることができる。

【００１４】また、目的の組換え微生物の選択は、特に
限定するものではないが、通常のセルラーゼ遺伝子のク
ローニングに於いて用いられる方法によれば良い。例え
ば、ベクターＤＮＡ上にコードされている抗生物質耐性
等による形質転換体の一次選択の後、この集落上にカル
ボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）とリゾチーム（枯草
菌宿主の場合には不要）を含み、適当な緩衝液によって
pHを９付近に調整した約０．８％の寒天（４５℃〜５０
℃）を重層、固化させて培養後、コンゴー・レッド法
（ＴｅａｔｈｅｒとＷｏｏｄ，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３巻，７７７頁，（１９
８２））等によって集落周辺のＣＭＣを分解した菌株を
検出することによって、目的の組換え微生物を取得する
ことができる。

【００１５】斯くして得られた組換え微生物を適当な培
地に接種し、適当な条件下で培養することによって、菌
体内或いは培養液中に、低分子型アルカリセルラーゼを
生産させることができる。更に、菌体抽出液或いは培養
液中から一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて低分
子型アルカリセルラーゼを採取及び精製することができ
る。即ち、菌体抽出液或いは培養液を遠心分離、又は濾
過等によって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液から
通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、溶媒
沈澱法によって蛋白を沈澱させたり、又、限外濾過（例
えばＰＭ−１０膜、アミコン社製）により濃縮させて低
分子型アルカリセルラーゼの粗酵素液を得ることができ
る。更に、酵素を精製する場合には、粗酵素液を適当な
希薄緩衝液、例えば、１０mMリン酸緩衝液（pH７）等で
透析した後、適当な陰イオン交換クロマトグラフィー、
例えば、上記緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−バイオゲル
（バイオ・ラド社製）によるクロマトグラフィーを行う
ことによって、電気泳動的に均一な精製セルラーゼを得
ることが可能である。

【００１６】以上の様な方法によって、本発明の低分子
型アルカリセルラーゼが得られるが、次に組換えプラス
ミドｐＨＳＰ−ＢＣ１１５Ｂを含む組換え枯草菌ＩＳＷ
１２１４株が生産した当該酵素の酵素学的性質を述べ
る。尚、セルラーゼの酵素活性は以下の様にして測定し
た。

【００１７】（酵素活性測定法）２．５％ＣＭＣ（山陽
国策パルプ社製 サンローズＡ０１ＭＣ）０．４ml、
０．５Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９．
５）０．２ml、及び脱イオン水０．３mlからなる基質溶
液に酵素液０．１mlを加え、４０℃、２０分間反応し
た。反応後、３，５−ジニトロ−サリチル酸（３，５−
ｄｉｎｉｔｒｏ−ｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ（ＤＮ
Ｓ））法にて還元糖の定量を行った。即ち、反応液１．
０mlにＤＮＳ試薬１．０mlを加え、１００℃で５分間加
熱発色させ、冷却後、４．０mlの脱イオン水を加えて希
釈した。これを波長５３５nmで比色定量した。酵素力価
は、上記の条件下で１分間に１μmolのグルコースに相
当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。また、
蛋白量は、バイオ・ラド社のプロテイン・アッセイ・キ
ットを用いて牛血漿アルブミンを標準蛋白として定量し
た。

【００１８】（酵素学的性質） （１）作用 セルロース類を加水分解してセロビオース等の還元糖を
生成する。 （２）基質特異性 ＣＭＣに対する活性を主活性として有する他に、リン酸
膨潤セルロース及びアビセルに対する活性を有している
（表１）。尚、ＣＭＣに対する比活性は、約９４Ｕ／mg
である。

【００１９】

【表１】

【００２０】（３）作用pH範囲及び作用至適pH pH６．０〜１１．５以上の広い範囲で作用し、作用至適
pHは９．０〜１０．５付近に認められる（図２ａ）。 （４）安定pH領域 ５℃で２４時間放置した場合、pH５．０〜１１．０の広
い範囲で極めて安定である（図２ｂ）。 （５）作用温度範囲及び作用至適温度 ２０℃以下から６０℃の広い範囲で作用し、作用至適温
度は４５℃に認められる（図３ａ）。 （６）熱安定性 リン酸緩衝液（pH７．０）中、各温度で１０分間加熱処
理した場合、４５℃以下の温度で極めて安定である（図
３ｂ）。 （７）アミノ末端配列 菌体外に生産された当該酵素のアミノ末端配列は以下の
配列であり、下線部分が配列番号１に示した低分子型ア
ルカリセルラーゼのアミノ酸配列と一致する。これより
アミノ末端側の７残基は、ベクター由来である。 Gly-Arg-Pro-Ala-Gly-Met-Gln-Ala-Val-Lys-Ser-Pro-

【００２１】（８）分子量 上述のアミノ酸末端配列から分子量は４０２０４と算出
され、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲ
ル（１２％）電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に於いて
は、約４１，０００の分子量が与えられる。 （１０）等電点 等電点電気泳動によって求められた等電点は４．５±
０．３である。 （１１）金属による影響 酵素反応液中に各種の金属イオンを共存させた場合、Ｐ
ｄ²⁺イオン、Ｃｄ²⁺イオン（１mM）による強い酵素活性
の阻害、及びＣｕ²⁺イオン（１mM）による弱い活性阻害
が認められる（表２）。一方、酵素活性はＣｏ²⁺イオン
（１mM）によって若干活性化される。他の金属イオンは
１mM（Ｎａ⁺及びＫ⁺イオンは５０mM）の濃度で酵素活性
に殆ど影響しない（表２）。

【００２２】

【表２】

【００２３】（１２）各種界面活性剤、キレート剤の影
響 酵素反応液中に各種の界面活性剤、キレート剤を共存さ
せた場合、界面活性剤及びキレート剤は、それぞれ０．
０１％及び１mMの濃度で酵素活性に殆ど影響しない（表
３）。

【００２４】

【表３】

【００２５】以上の様な酵素学的特性が明らかになった
が、本低分子型アルカリセルラーゼの比活性は、本発明
に於ける遺伝子の供与体、バチルス エスピー ＫＳＭ
−６３５（ＦＥＲＭ ＢＰ−１４８５）株から得られた
２種類のアルカリセルラーゼＥ−Ｌ（分子量１００，０
００）及びＥ−Ｈ（分子量５００，０００）の比活性
（５９Ｕ／mg及び３４Ｕ／mg、Ｙｏｓｈｉｍａｔｓｕ
ら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３６巻，１
９７３頁，（１９９０））よりも高いものであり、遺伝
子の欠失による低分子化によって、比活性が向上したこ
とが明らかになった。

【００２６】

【発明の効果】本発明により、アルカリ性領域に於いて
高い比活性を有し、且つ、広いpH領域、温度領域に於い
て安定であり、更に、界面活性剤やキレート剤の存在下
に於いても充分な活性を有する低分子型アルカリセルラ
ーゼを容易に高純度、高収率で得ることができる。

【００２７】

【実施例】以下、実施例を挙げて具体的に本発明を説明
するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。

【００２８】実施例１ バチルス エスピー ＫＳＭ−６３５（ＦＥＲＭ ＢＰ
−１４８５）株を５００mlのＭＹＧ培地（１．０％肉エ
キス（ラブ・レムコパウダー オキソイド社製）、０．
５％酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ ＮａＣ
ｌ、０．１％ ＫＨ₂ＰＯ₄、１．０％ Ｎａ₂ＣＯ₃（別
滅菌））中で、３０℃で３０日間振盪培養して得られた
菌体から、ＳａｉｔｏとＭｉｕｒａの方法（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，７２巻，６１９
頁，（１９６３））に従って、約３００μｇの精製染色
体ＤＮＡを得た。この染色体ＤＮＡ １０μｇとベクタ
ーｐＢＲ３２２の１μｇを５０μｌの制限酵素反応液Ｍ
（１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）、１０mM Ｍ
ｇＣｌ₂、５０mM ＮａＣｌ、１mMジチオスレイトー
ル）に溶解し、これに制限酵素ＨｉｎｄIII（ベーリン
ガー マンハイム社製）１０単位を加えて３７℃で２時
間反応を行った。フェノール処理によって制限酵素を除
去した後、エタノール沈澱を行い、得られた沈澱をリガ
ーゼ反応液（２０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）、
１０mM ＭｇＣｌ₂、１０mMジチオスレイトール、１mM
ＡＴＰ）５０μｌに溶解した。これにＴ₄ＤＮＡリガ
ーゼ（ベーリンガー マンハイム社製）２単位を加え、
１６℃で１２時間反応を行った。この反応物による大腸
菌ＨＢ１０１株（Ｆ ^-ｈｓｄＳ２０ ｒｅｃＡ１３ ａ
ｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒ
ｐｓＬ２０ ｘｙｌ−５ ｍｔｌ−１ ｓｕｐＥ４４
ｌｅｕＢ６ ｔｈｉ−１）の形質転換を塩化カルシウム
法（ＭａｎｄｅｌとＨｉｇａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，５３巻，１５９頁，（１９７０））に従って行
い、これを５０μｇ／mlのアンピシリン（ナトリウム
塩、シグマ社製）を含むＬＢ寒天プレート培地（１．０
％トリプトン（ディフコ社製）、０．５％酵母エキス
（ディフコ社製）、１．０％ ＮａＣｌ、１．５％バク
ト寒天（ディフコ社製））に塗抹して３７℃で２４時間
培養した。この結果、出現した形質転換体の各集落を、
アンピシリンと２．０％ＣＭＣを含むＬＢ寒天プレート
培地に移植し、更に３７℃で４８時間培養した後、コン
ゴー・レッド法（ＴｅａｔｈｅｒとＷｏｏｄ，Ａｐｐ
ｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３巻，
７７７頁，（１９８２））によって、集落周辺のＣＭＣ
を分解した菌株の検出を行い、目的の組換え菌株を分離
した。

【００２９】実施例２ 実施例１で得られた組換え菌株のひとつを、５００mlの
Ｍ９ＣＡ培地（０．６％ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、０．３％ Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄、０．０５％ ＮａＣｌ、０．１％ＮＨ₄Ｃ
ｌ、０．２％カザミノ酸（ディフコ社製）、２mM Ｍｇ
ＳＯ₄（別滅菌）、０．１mM ＣａＣｌ₂（別滅菌）、
０．２％グルコース（別滅菌）、５０μｇ／mlアンピシ
リン（除菌））に接種し、３７℃で約５時間振盪培養し
た。クロラムフェニコール（シグマ社製）１７０mgを添
加して、３７℃で更に１５時間振盪培養後、遠心分離に
よって菌体を集め、常法（Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８
２））に従って、組換えプラスミド（ｐＢＣ１００と命
名）を調製した。ｐＢＣ１００を各種の制限酵素によっ
て切断後、アガロースゲル電気泳動による各断片の解析
を行った結果、本組換えプラスミドは、ｐＢＲ３２２の
ＨｉｎｄIII切断部位に、図１に示した約４．０kbと約
２．６kbの２つのＨｉｎｄIII断片が挿入されたもので
あることが明らかになった。更に、当該プラスミドの挿
入断片のうち、図１に於いて太線で示した約３．５kbの
領域の塩基配列を、Ｍ１３ ファージベクター（Ｍｅｓ
ｓｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１
巻，２０頁，（１９８３））の１変種であるＭ１３mp１
８及びＭ１３mp１９（ベーリンガー マンハイム社製）
を用いたサンガー法（Ｓａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，７４巻，５４６
３頁，（１９７７））によって決定した。この結果、ア
ルカリセルラーゼ遺伝子が、ｐＢＣ１００の挿入断片を
構成する２つのＨｉｎｄIII断片の両方に跨がる様に存
在し、配列番号３に示した様に９４１アミノ酸残基から
成るアルカリセルラーゼの前駆体蛋白をコードしている
ことが明らかになった。尚、Ｍ１３ファージの宿主大腸
菌としては、ＪＭ１０９株（ｒｅｃＡ１，Δｌａｃ−ｐ
ｒｏ，ｅｎｄＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ−１，ｈｓｄ
Ｒ１７，ｒｅｌＡ１，Ｆ’ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ
⁺ ，ｌａｃＩ^qＺ ΔＭ１３）を用い、また、Ｍ１３シ
ークエンシングキット（宝酒造社製）及び［α−³²Ｐ］
ｄＣＴＰ（アマシャム社製）を用いた。

【００３０】実施例３ １μｇの組換えプラスミドｐＢＣ１００を５０μｌの制
限酵素反応液Ｍに溶解し、これに制限酵素ＨｉｎｄIII
（ベーリンガー マンハイム社製）２単位を加えて３７
℃で２時間反応を行った。フェノール処理によって制限
酵素を除去した後、エタノール沈澱を行い、得られた沈
澱をリガーゼ反応液３０μｌに溶解した。これにＴ₄Ｄ
ＮＡリガーゼ１単位を加え、１６℃で１２時間反応を行
い、これを大腸菌ＨＢ１０１株に導入して、出現した形
質転換体のアルカリセルラーゼの生産性を調べた。この
結果、当該遺伝子のプロモーター領域や翻訳開始領域を
含み、当該酵素の１位のメチオニンから５８４位のロイ
シンまでをコードする約４．０kb断片（図１）のみがｐ
ＢＲ３２２と結合した組換えプラスミドｐＢＣ１０１に
よる形質転換株に当該酵素の生産性が認められ、酵素活
性の発現には５８５位のバリンよりもカルボキシル末端
側の領域が必須ではないことが明らかになった。

【００３１】実施例４ １μｇの組換えプラスミドｐＢＣ１０１を、５０μｌの
制限酵素反応液Ｌ（１０mM ＭｇＣｌ₂、１mMジチオス
レイトール、１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５））
溶解し、これに制限酵素ＫｐｎＩ（２単位、ベーリンガ
ー マンハイム社製）を添加して、３７℃で２時間反応
させた。フェノール処理及びエタノール沈澱後、沈澱を
１０mM ＭｇＳＯ₄と０．１mMジチオスレイトールを含
むトリス−塩酸緩衝液（pH７．５））に溶解し、１．２
５単位のエキソヌクレアーゼＢａｌ３１（ベーリンガー
マンハイム社製）を加えて２２℃で１５分間反応させ
た。フェノール処理による反応停止後、エタノール沈澱
によって集めた沈澱を３０μｌのリガーゼ反応液に溶解
し、ｐＢＲ３２２のＨｉｎｄIII切断物１μｇ、合成Ｈ
ｉｎｄIIIリンカー（ファルマシア社製）１μｇ、及び
１単位のＴ₄ＤＮＡリガーゼを添加して、１６℃で１２
時間の結合反応を行った。更に、余分な合成リンカーを
取り除く為に、再度、ＨｉｎｄIIIによる切断とＴ₄ＤＮ
Ａリガーゼによる結合反応を行って、これを大腸菌ＨＢ
１０１株に導入した。この結果出現したセルラーゼ生産
性の形質転換体の中から、前述の約４．０kb挿入断片か
ら当該遺伝子の発現に不要な上流側領域が欠失した約
２．４kbの断片（図１）を含む組換えプラスミドｐＢＣ
１１２が得られた。

【００３２】実施例５ ５μｇの組換えプラスミドｐＢＣ１１２を２００μｌの
制限酵素反応液Ｍに溶解し、２０単位の制限酵素Ｓｎａ
ＢＩによる切断、フェノール抽出、エタノール沈澱を行
った後、エキソヌクレアーゼIIIとマングビーン（Ｍｕ
ｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼを含むキロシークエンシ
ング用デレーションキット（宝酒造社製）を用いて、Ｓ
ｎａＢＩ切断点からの欠失反応を行った。更に、この反
応物を制限酵素反応液Ｍに溶解し、１０単位の制限酵素
ＨｉｎｄIIIを加えて、３７℃で２時間放置した後、
０．８％のアガロースゲルによる電気泳動を行って、ゲ
ルから電気溶出法（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０巻，１１９頁，（１９７７））
によって、約１kbとなったＤＮＡ断片を抽出した。本Ｄ
ＮＡ断片０．５μｇとＨｉｎｄIIIによって切断した
後、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）によっ
て末端を平滑化させたベクタープラスミドｐＵＣ１１８
（宝酒造社製）０．２μｇを３０μｌのリガーゼ反応液
に溶解し、１単位のＴ₄ＤＮＡリガーゼによる結合反応
（１６℃、１２時間）を行った。これによって大腸菌Ｈ
Ｂ１０１株の形質転換を行い、高い酵素生産性を示す形
質転換株を選択して、この菌体から組換えプラスミドを
抽出し、解析した結果、本組換えプラスミド（ｐＷＢＣ
１１５と命名）の挿入断片は、当該酵素の２２８位のア
ラニンから５８４位のロイシンまでをコードしている約
１．０kbの断片（図１）であり、プロモーター領域や翻
訳開始領域、更に、当該酵素の１位のメチオニンから２
２７位のグルタミン酸までをコードする約１．４kbの領
域が欠失したものであることが明らかになった。組換え
プラスミドｐＷＢＣ１１５の制限地図及びその挿入断片
の５’及び３’末端近傍の塩基配列を図４に示した。

【００３３】実施例６ 制限酵素ＨｉｎｄIIIによって切断した組換えプラスミ
ドｐＷＢＣ１１５ １μｇを、１μｌのＴＥ緩衝液（１
０mMトリス−塩酸緩衝液（pH８）、１mM ＥＤＴＡ）に
溶解後、ＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）に
よって、切断末端の平滑化を行った。フェノール処理と
エタノール沈澱を行った後、沈澱を１００μｌのＴＥ緩
衝液に溶解し、このうち１０μｌを３０μｌのリガーゼ
反応液と混合した。これに、ＤＮＡ合成機（３８１Ａ
型、アプライド・バイオ・システム社製）を用いて合成
し、Ｔ₄ポリヌクレチドキナーゼ（宝酒造社製）によっ
てリン酸化したオリゴヌクレオチド（ＡＴＡＡＧＧＡＴ
ＣＣＴＴＡＴ，約１μｇ）を添加して、Ｔ₄ＤＮＡリガ
ーゼによる結合反応を行い、これを大腸菌ＨＢ１０１株
に導入した。出現した形質転換株から抽出した組換えプ
ラスミドの解析を行った結果、当該遺伝子の５８４位の
ロイシンコドンの下流に合成ヌクレオチドが結合するこ
とによって５８５位のコドンが終止コドン（ＴＡＡ）と
なり、更にその下流にＢａｍＨＩ切断点を有する組換え
プラスミドｐＷＢＣ１１５Ｂが得られた（図５）。

【００３４】実施例７ 実施例６で得た組換えプラスミドｐＷＢＣ１１５Ｂ ３
０μｇを２００μｌの制限酵素反応液Ｍに溶解し、各１
０単位の制限酵素ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩを添加して、
３７℃で２時間の反応を行った。この後、実施例５と同
様にして、アガロースゲル電気泳動を行って、当該酵素
の２２８位のアラニンから５８４位のロイシンまでをコ
ードしている約１．０kbのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片約
２μｇを単離した。得られた断片約０．２μｇと発現ベ
クターｐＨＳＰ６４のＳａｌＩ及びＢａｍＨＩによる切
断物約０．２μｇを３０μｌのリガーゼ反応液に溶解
し、Ｔ₄ＤＮＡリガーゼによる結合反応を行った。これ
を大腸菌ＨＢ１０１株に導入し、当該酵素を生産する形
質転換株から、ｐＨＳＰ６４と約１．０kb断片が結合し
た組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＢＣ１１５Ｂ（図６）が
得られた。

【００３５】参考例１ （１）発現ベクターｐＨＳＰ６４は以下の様にして構築
した。バチルス エスピー ＫＳＭ−６４（ＦＥＲＭ
ＢＰ−２８８６）を、０．５％ ポリペプトン（日本製
薬社製）、０．５％ 酵母エキス（ディフコ社製）、
０．１％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．０２％ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂
Ｏ及び０．５％ Ｎａ₂ＣＯ₃から成る培地１００mlを用
い、３０℃で１２時間振盪培養した。培養終了後、遠心
分離によって集めた菌体からＳａｉｔｏとＭｉｕｒａの
方法〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７
２巻，６１９−６２９頁（１９６３）〕によって得られ
た染色体ＤＮＡ １０μg を常法、例えば〔Ｔ．Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，
Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ，（１９８２）〕に従って、制限酵素Ｈｉｎｄ
III（ベーリンガー・マンハイム社製）で切断した。次
いで、これを同じくＨｉｎｄIIIで切断したプラスミド
ｐＵＣ１９（宝酒造社製）１μg と混合して、Ｔ₄ＤＮ
Ａリガーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）による結
合反応を行った。

【００３６】この結合反応物による大腸菌ＨＢ１０１株
の形質転換処理をコンピテント・セル（宝酒造社製）を
用いて行い、処理後の菌懸濁液を５０μg ／ml アンピ
シリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プレート培地
〔１．０％ トリプトン（ディフコ社製）、０．５％
酵母エキス（ディフコ社製）、１．０％ ＮａＣｌ、
１．５％ バクト寒天（ディフコ社製）〕に塗抹し、３
７℃で１２時間培養した。出現した形質転換体の集落上
に、０．５％ ＣＭＣ、１mg／ml リゾチーム（シグマ
社製）及び、５０mMのグリシン緩衝液（pH９）を含む
１．０％寒天を重層した後、約６時間放置した。この
後、集落周辺のＣＭＣを分解した菌株をコンゴー・レッ
ド法〔Ｒ．Ｍ．ＴｅａｔｈｅｒとＰ．Ｊ．Ｗｏｏｄ，Ａ
ｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３
巻，７７７−７８０頁（１９８２）〕を用いて検出し、
目的とする組換え大腸菌を分離した。

【００３７】（２）（１）で得た組換え大腸菌の保持す
る組換えプラスミドを常法〔例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂａｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，（１９８２）〕に従って採取し、制限酵素切断点の
解析をアガロースゲル電気泳動法〔Ｊ．Ａ．Ｍｅｙｅｒ
ｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１２７巻，１５２９
−１５３７頁（１９７６）〕を用いて行った。この結
果、アルカリセルラーゼＫ−６４遺伝子が約４．４ｋｂ
のＨｉｎｄIII断片中に存在することが明らかとなり、
これを含むプラスミド（７．１ｋｂ）をｐＵＣＬ６４、
ｐＵＣＬ６４を含有する大腸菌ＨＢ１０１株をＨＢ１０
１（ｐＵＣＬ６４）株と命名した。

【００３８】この組換えプラスミド、ｐＵＣＬ６４を制
限酵素ＨｉｎｄIIIによって切断後、アガロース・ゲル
電気泳動を行い、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌらの方法〔Ｊ．Ｍ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０頁，１１９−１４６頁（１９
７７）〕によって、約４．４ｋｂのＨｉｎｄIII切断を
分離した。このうち約４．４ｋｂ ＸｈｏＩ−Ｈｉｎｄ
III領域をサンガー法〔Ｆ．Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７４
巻，５４６３−５４６７頁（１９７７）〕により決定
し、２４６６ｂｐからなるアルカリセルラーゼＫ−６４
の構造遺伝子を見出した。

【００３９】（３）（２）で得られた組換えプラスミド
ｐＵＣＬ６４を制限酵素ＢｇｌII及びＰｓｔＩによって
切断し、デレーションキット（宝酒造社製）を用いて、
アルカリセルラーゼ構造遺伝子の消化を行い、この後、
Ｔ₄ＤＮＡリガーゼを用いて自己閉環化反応を行った。
次に、上記（１）と同様にして結合反応物による大腸菌
の形質転換処理を行い、出現した形質転換体の組換えプ
ラスミドを上記（２）と同様に解析することによって、
アルカリセルラーゼＫ−６４構造遺伝子の大部分を欠失
したプラスミドベクターｐＵＳ６４を保持する組換え大
腸菌ＨＢ１０１（ｐＵＳ６４）を選択した。

【００４０】（４）実施例２と同様にして組換えプラス
ミドｐＵＳ６４を抽出、精製し、これを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳｃａＩによって切断後、アルカリセルラーゼ
Ｋ−６４上流領域の６７９ｂｐのＤＮＡ断片を単離し
た。このＤＮＡ断片と、制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断
後、末端をＤＮＡブランディングキット（宝酒造社製）
によって平滑化し、更に制限酵素ＥｃｏＲＩで切断した
シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫとを混合して、Ｔ
₄ＤＮＡリガーゼで結合した。

【００４１】両結合反応物による大腸菌の形質転換処理
を上記（１）に従って行い、１５μg ／mlのテトラサイ
クリン（シグマ社製）を含むＬＢ寒天プレート培地に塗
抹し、３７℃で１２時間培養した。出現した形質転換体
の集落を、テトラサイクリンを含む５mlのＬＢ培地に接
種し、上記（２）と同様にして得られた組換えプラスミ
ドの制限酵素切断点の解析を行って、プラスミドベクタ
ーｐＨＳＰ６４を保持する大腸菌ＨＢ１０１（ｐＨＳＰ
６４）株を選択した。

【００４２】実施例８ 実施例７で得られた組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＢＣ１
１５Ｂをプロトプラスト形質転換法（ＣｈａｎｇとＣｏ
ｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８巻，１
１１頁，（１９７８））によって枯草菌ＩＳＷ１２１４
株（ｌｅｕＡ８，ｍｅｔＢ５，ｈｓｒＭ１）に導入した
結果、２２８位のアラニンから５８４位のロイシンまで
から成る低分子型アルカリセルラーゼ遺伝子を含有する
組換え枯草菌ＩＳＷ１２１４（ｐＨＳＰ−ＢＣ１１５
Ｂ）株が得られた。本菌株を１５μｇ／mlのテトラサイ
クリン（シグマ社製）を含むＰＹ培地（２．０％ ポリ
ペプトン（日本製薬）、０．１％ 酵母エキス（ディフ
コ社製）、０．１％ ＫＨ₂ＰＯ₄、０．５％ ＮａＣ
ｌ）５mlに接種して、３０℃で１日間振盪培養後、この
１mlを１００mlの同培地に接種して、３０℃で更に３日
間振盪培養した。この結果、１６３０Ｕ／ｌの低分子型
アルカリセルラーゼが菌体外に生産された。

【００４３】配列番号：１ 配列の長さ：３５７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列

【００４４】 Ala Val Lys Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ala Leu Gln Leu Val Glu Leu 1 5 10 15 Asn Gly Gln Leu Thr Leu Ala Gly Glu Asp Gly Thr Pro Val Gln Leu 20 25 30 Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp Phe Gly Glu Ile Val Asn 35 40 45 Glu Asn Ala Phe Val Ala Leu Ser Asn Asp Trp Gly Ser Asn Met Ile 50 55 60 Arg Leu Ala Met Tyr Ile Gly Glu Asn Gly Tyr Ala Thr Asn Pro Glu 65 70 75 80 Val Lys Asp Leu Val Tyr Glu Gly Ile Glu Leu Ala Phe Glu His Asp 85 90 95 Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His Ala Pro Gly Asp Pro Arg 100 105 110 Ala Asp Val Tyr Ser Gly Ala Tyr Asp Phe Phe Glu Glu Ile Ala Asp 115 120 125 His Tyr Lys Asp His Pro Lys Asn His Tyr Ile Ile Trp Glu Leu Ala 130 135 140 Asn Glu Pro Ser Pro Asn Asn Asn Gly Gly Pro Gly Leu Thr Asn Asp 145 150 155 160 Glu Lys Gly Trp Glu Ala Val Lys Glu Tyr Ala Glu Pro Ile Val Glu 165 170 175 Met Leu Arg Glu Lys Gly Asp Asn Met Ile Leu Val Gly Asn Pro Asn 180 185 190 Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ser Ala Asp Asn Pro Ile Asp Ala Glu 195 200 205 Asn Ile Met Tyr Ser Val His Phe Tyr Thr Gly Ser His Gly Ala Ser 210 215 220 His Ile Gly Tyr Pro Glu Gly Thr Pro Ser Ser Glu Arg Ser Asn Val 225 230 235 240 Met Ala Asn Val Arg Tyr Ala Leu Asp Asn Gly Val Ala Val Phe Ala 245 250 255 Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly Asp Gly Gly Pro Tyr Phe 260 265 270 Asp Glu Ala Asp Val Trp Leu Asn Phe Leu Asn Lys His Asn Ile Ser 275 280 285 Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn Glu Ile Ser Gly Ala Phe 290 295 300 Thr Pro Phe Glu Leu Gly Arg Thr Asp Ala Thr Asp Leu Asp Pro Gly 305 310 315 320 Ala Asn Gln Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu Ser Leu Ser Gly Glu Tyr 325 330 335 Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Ile Glu Tyr Thr Pro Ile Asp Arg Thr 340 345 350 Lys Phe Thr Lys Leu 355

【００４５】配列番号：２ 配列の長さ：１０７１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列

【００４６】 GCTGTTAAAA GCCCTTCAGA AGCTGGTGCG CTTCAGTTAG TAGAACTAAA CGGACAATTA 60 ACACTAGCTG GTGAAGATGG TACTCCCGTT CAATTACGTG GAATGAGTAC ACATGGCCTA 120 CAATGGTTCG GTGAAATCGT AAACGAAAAC GCTTTCGTAG CACTATCGAA TGATTGGGGA 180 TCTAACATGA TTCGTCTCGC TATGTACATT GGCGAAAATG GATATGCAAC AAACCCTGAA 240 GTAAAAGATT TAGTTTATGA AGGAATTGAA TTAGCGTTTG AGCACGATAT GTATGTAATT 300 GTTGACTGGC ATGTACATGC TCCTGGTGAT CCTAGAGCGG ATGTATACTC AGGTGCTTAT 360 GATTTCTTCG AAGAAATTGC TGATCATTAC AAAGATCATC CGAAAAACCA TTATATCATT 420 TGGGAACTAG CAAACGAACC AAGTCCAAAT AATAACGGTG GACCTGGATT AACAAATGAT 480 GAAAAAGGTT GGGAAGCTGT AAAAGAATAT GCAGAGCCAA TCGTTGAAAT GTTGCGTGAA 540 AAAGGTGACA ACATGATTTT AGTTGGAAAT CCTAACTGGA GCCAACGTCC TGACTTATCA 600 GCTGACAACC CAATTGATGC AGAAAATATC ATGTATTCTG TTCACTTCTA CACAGGCTCA 660 CATGGCGCTT CTCACATTGG TTACCCTGAA GGAACACCAA GCTCTGAACG TTCTAATGTT 720 ATGGCTAACG TTCGTTATGC TCTAGACAAT GGCGTTGCTG TGTTTGCGAC AGAGTGGGGT 780 ACGAGTCAAG CGAATGGAGA TGGAGGACCT TATTTTGATG AAGCTGATGT TTGGCTTAAT 840 TTCTTAAACA AACATAACAT TAGCTGGGCA AACTGGTCGT TAACGAACAA AAATGAGATT 900 TCTGGAGCAT TTACACCTTT TGAGCTTGGT AGAACAGATG CTACAGATCT TGATCCAGGT 960 GCTAATCAAG TATGGGCACC CGAGGAACTA AGTTTATCTG GTGAATATGT TCGTGCTCGT 1020 ATTAAAGGAA TTGAGTATAC ACCTATCGAC CGCACAAAAT TCACAAAGCT T 1071

【００４７】配列番号：３ 配列の長さ：３５０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列

【００４８】 aagcttgGGC ACCTGAGGAA GTAGCGAATC CTGTTCTTGA TGCACATCCA TACTTAACTT 60 CTGGATTTGC CTTCATGAGT CGTGATGAAA ACGGAAGTGC ACCATTACAT GGACTGTTTG 120 CATTTAATTA TTCGGCACTG ATTAGCTGTG GCATTTCCGC TTCTGCTCTT TCTGGAATGA 180 AGTACGGGGT CCCAAGACTT GTCACTGCCA TTGCCGATCA GTTATTCCAA GATGATCGAG 240 ACGAGATTCT AAAGGACTTC TTTGAGTATG ATGAGAAGGA GTTTGTCGGA AACTGGCCTT 300 TAAACGTCTA AATGAACATA ATAGCGAAAG GGCTTAACCA AAAATATGAA TTGAACCCAC 360 ATAAATTTGT GGGTTTTTAT TAATCAAAAA AATGGTAAAT AAACCTATTT TAACAATGCT 420 TATAACCATT TTTCTATTTA TTGCATAAAA AAATCAGTAA AAAAATTCAT TTATATGTAG 480 ACGTAAATTA ACAAATATTA TATTATATAT ACGAAAGCGG TTTCGAAAAA TAGAGGAAGG 540 AGGAGAGTTT TTAGTTTTTG TTGTTTGTTT ATTGTAAGCG TTTACTATTA ATACATTTCT 600 GGGAGGTTAT T ATG AAA ATA AAG CAA ATT AAA CAA TCT TTA TCT TTG CTT 650 Met Lys Ile Lys Gln Ile Lys Gln Ser Leu Ser Leu Leu 1 5 10 TTA ATC ATC ACA CTC ATT ATG TCA CTA TTT GTT CCT ATG GCT TCA GCA 698 Leu Ile Ile Thr Leu Ile Met Ser Leu Phe Val Pro Met Ala Ser Ala 15 20 25 AAC ACA AAT GAG TCT AAG TCT AAT GCA TTT CCT TTT TCT GAT GTT AAA 746 Asn Thr Asn Glu Ser Lys Ser Asn Ala Phe Pro Phe Ser Asp Val Lys 30 35 40 45 AAA ACT TCT TGG TCT TTT CCA TAT ATA AAG GAT TTA TAT GAG CAA GAA 794 Lys Thr Ser Trp Ser Phe Pro Tyr Ile Lys Asp Leu Tyr Glu Gln Glu 50 55 60 GTT ATT ACA GGA ACA TCT GCA ACA ACG TTC TCT CCA ACA GAT TCC GTT 842 Val Ile Thr Gly Thr Ser Ala Thr Thr Phe Ser Pro Thr Asp Ser Val 65 70 75 ACT CGT GCA CAA TTT ACA GTG ATG CTT ACC CGT GGT CTT GGA CTA GAA 890 Thr Arg Ala Gln Phe Thr Val Met Leu Thr Arg Gly Leu Gly Leu Glu 80 85 90 GCA TCT TCT AAA GAT TAC CCT TTT AAA GAT CGT AAA AAC TGG GCT TAC 938 Ala Ser Ser Lys Asp Tyr Pro Phe Lys Asp Arg Lys Asn Trp Ala Tyr 95 100 105 AAA GAA ATT CAA GCT GCA TAT GAA GCT GGA ATT GTA ACT GGG AAA ACA 986 Lys Glu Ile Gln Ala Ala Tyr Glu Ala Gly Ile Val Thr Gly Lys Thr 110 115 120 125 AAC GGT GAA TTT GCA CCA AAT GAA AAC ATT ACT CGT GAA CAA ATG GCT 1034 Asn Gly Glu Phe Ala Pro Asn Glu Asn Ile Thr Arg Glu Gln Met Ala 130 135 140 GCT ATG GCC GTA CGT GCT TAT GAA TAC TTA GAA AAT GAG CTA TCT TTA 1082 Ala Met Ala Val Arg Ala Tyr Glu Tyr Leu Glu Asn Glu Leu Ser Leu 145 150 155 CCA GAA GAG CAA AGA GAA TAT AAT GAC TCT TCT TCT ATT TCA ACC TTT 1130 Pro Glu Glu Gln Arg Glu Tyr Asn Asp Ser Ser Ser Ile Ser Thr Phe 160 165 170 GCT CAA GAT GCT GTT CAA AAA GCA TAC GTA TTA GAG CTA ATG GAA GGA 1178 Ala Gln Asp Ala Val Gln Lys Ala Tyr Val Leu Glu Leu Met Glu Gly 175 180 185 AAT ACA GAT GGA TAT TTT CAA CCA AAA AGA AAC TCT ACT AGA GAA CAG 1226 Asn Thr Asp Gly Tyr Phe Gln Pro Lys Arg Asn Ser Thr Arg Glu Gln 190 195 200 205 TCT GCT AAA GTT ATC TCT ACT TTA CTT TGG AAA GTA GCT AGT CAT GAT 1274 Ser Ala Lys Val Ile Ser Thr Leu Leu Trp Lys Val Ala Ser His Asp 210 215 220 TAT TTA TAC CAT ACA GAA GCT GTT AAA AGC CCT TCA GAA GCT GGT GCG 1322 Tyr Leu Tyr His Thr Glu Ala Val Lys Ser Pro Ser Glu Ala Gly Ala 225 230 235 CTT CAG TTA GTA GAA CTA AAC GGA CAA TTA ACA CTA GCT GGT GAA GAT 1370 Leu Gln Leu Val Glu Leu Asn Gly Gln Leu Thr Leu Ala Gly Glu Asp 240 245 250 GGT ACT CCC GTT CAA TTA CGT GGA ATG AGT ACA CAT GGC CTA CAA TGG 1418 Gly Thr Pro Val Gln Leu Arg Gly Met Ser Thr His Gly Leu Gln Trp 255 260 265 TTC GGT GAA ATC GTA AAC GAA AAC GCT TTC GTA GCA CTA TCG AAT GAT 1466 Phe Gly Glu Ile Val Asn Glu Asn Ala Phe Val Ala Leu Ser Asn Asp 270 275 280 285 TGG GGA TCT AAC ATG ATT CGT CTC GCT ATG TAC ATT GGC GAA AAT GGA 1514 Trp Gly Ser Asn Met Ile Arg Leu Ala Met Tyr Ile Gly Glu Asn Gly 290 295 300 TAT GCA ACA AAC CCT GAA GTA AAA GAT TTA GTT TAT GAA GGA ATT GAA 1562 Tyr Ala Thr Asn Pro Glu Val Lys Asp Leu Val Tyr Glu Gly Ile Glu 305 310 315 TTA GCG TTT GAG CAC GAT ATG TAT GTA ATT GTT GAC TGG CAT GTA CAT 1610 Leu Ala Phe Glu His Asp Met Tyr Val Ile Val Asp Trp His Val His 320 325 330 GCT CCT GGT GAT CCT AGA GCG GAT GTA TAC TCA GGT GCT TAT GAT TTC 1658 Ala Pro Gly Asp Pro Arg Ala Asp Val Tyr Ser Gly Ala Tyr Asp Phe 335 340 345 TTC GAA GAA ATT GCT GAT CAT TAC AAA GAT CAT CCG AAA AAC CAT TAT 1706 Phe Glu Glu Ile Ala Asp His Tyr Lys Asp His Pro Lys Asn His Tyr 350 355 360 365 ATC ATT TGG GAA CTA GCA AAC GAA CCA AGT CCA AAT AAT AAC GGT GGA 1754 Ile Ile Trp Glu Leu Ala Asn Glu Pro Ser Pro Asn Asn Asn Gly Gly 370 375 380 CCT GGA TTA ACA AAT GAT GAA AAA GGT TGG GAA GCT GTA AAA GAA TAT 1802 Pro Gly Leu Thr Asn Asp Glu Lys Gly Trp Glu Ala Val Lys Glu Tyr 385 390 395 GCA GAG CCA ATC GTT GAA ATG TTG CGT GAA AAA GGT GAC AAC ATG ATT 1850 Ala Glu Pro Ile Val Glu Met Leu Arg Glu Lys Gly Asp Asn Met Ile 400 405 410 TTA GTT GGA AAT CCT AAC TGG AGC CAA CGT CCT GAC TTA TCA GCT GAC 1898 Leu Val Gly Asn Pro Asn Trp Ser Gln Arg Pro Asp Leu Ser Ala Asp 415 420 425 AAC CCA ATT GAT GCA GAA AAT ATC ATG TAT TCT GTT CAC TTC TAC ACA 1946 Asn Pro Ile Asp Ala Glu Asn Ile Met Tyr Ser Val His Phe Tyr Thr 430 435 440 445 GGC TCA CAT GGC GCT TCT CAC ATT GGT TAC CCT GAA GGA ACA CCA AGC 1994 Gly Ser His Gly Ala Ser His Ile Gly Tyr Pro Glu Gly Thr Pro Ser 450 455 460 TCT GAA CGT TCT AAT GTT ATG GCT AAC GTT CGT TAT GCT CTA GAC AAT 2042 Ser Glu Arg Ser Asn Val Met Ala Asn Val Arg Tyr Ala Leu Asp Asn 465 470 475 GGC GTT GCT GTG TTT GCG ACA GAG TGG GGT ACG AGT CAA GCG AAT GGA 2090 Gly Val Ala Val Phe Ala Thr Glu Trp Gly Thr Ser Gln Ala Asn Gly 480 485 490 GAT GGA GGA CCT TAT TTT GAT GAA GCT GAT GTT TGG CTT AAT TTC TTA 2138 Asp Gly Gly Pro Tyr Phe Asp Glu Ala Asp Val Trp Leu Asn Phe Leu 495 500 505 AAC AAA CAT AAC ATT AGC TGG GCA AAC TGG TCG TTA ACG AAC AAA AAT 2186 Asn Lys His Asn Ile Ser Trp Ala Asn Trp Ser Leu Thr Asn Lys Asn 510 515 520 525 GAG ATT TCT GGA GCA TTT ACA CCT TTT GAG CTT GGT AGA ACA GAT GCT 2234 Glu Ile Ser Gly Ala Phe Thr Pro Phe Glu Leu Gly Arg Thr Asp Ala 530 535 540 ACA GAT CTT GAT CCA GGT GCT AAT CAA GTA TGG GCA CCC GAG GAA CTA 2282 Thr Asp Leu Asp Pro Gly Ala Asn Gln Val Trp Ala Pro Glu Glu Leu 545 550 555 AGT TTA TCT GGT GAA TAT GTT CGT GCT CGT ATT AAA GGA ATT GAG TAT 2330 Ser Leu Ser Gly Glu Tyr Val Arg Ala Arg Ile Lys Gly Ile Glu Tyr 560 565 570 ACA CCT ATC GAC CGC ACA AAA TTC ACA AAG CTT GTT TGG GAT TTT AAC 2378 Thr Pro Ile Asp Arg Thr Lys Phe Thr Lys Leu Val Trp Asp Phe Asn 575 580 585 GAT GGA ACA ACA CAA GGA TTC CAA GTT AAT GGA GAC AGC CCT AAC AAA 2426 Asp Gly Thr Thr Gln Gly Phe Gln Val Asn Gly Asp Ser Pro Asn Lys 590 595 600 605 GAA AGC ATT ACT TTA AGT AAT AAT AAT GAT GCA TTA CAA ATT GAA GGA 2474 Glu Ser Ile Thr Leu Ser Asn Asn Asn Asp Ala Leu Gln Ile Glu Gly 610 615 620 TTA AAT GTA AGT AAT GAT ATT TCT GAA GGA AAC TAC TGG GAT AAT GTA 2522 Leu Asn Val Ser Asn Asp Ile Ser Glu Gly Asn Tyr Trp Asp Asn Val 625 630 635 CGC CTG TCA GCT GAT GGC TGG AGT GAA AAT GTA GAT ATT TTA GGT GCT 2570 Arg Leu Ser Ala Asp Gly Trp Ser Glu Asn Val Asp Ile Leu Gly Ala 640 645 650 ACA GAG CTT ACA ATT GAT GTT ATC GTT GAA GAA CCG ACA ACA GTT TCA 2618 Thr Glu Leu Thr Ile Asp Val Ile Val Glu Glu Pro Thr Thr Val Ser 655 660 665 ATT GCT GCT ATT CCA CAA GGA CCT GCT GCT GGC TGG GCT AAC CCG ACT 2666 Ile Ala Ala Ile Pro Gln Gly Pro Ala Ala Gly Trp Ala Asn Pro Thr 670 675 680 685 AGA GCA ATT AAA GTA ACT GAA GAC GAT TTC GAA TCT TTC GGA GAT GGA 2714 Arg Ala Ile Lys Val Thr Glu Asp Asp Phe Glu Ser Phe Gly Asp Gly 690 695 700 TAC AAA GCT CTC GTA ACT ATT ACT TCT GAA GAT TCA CCT TCA CTT GAA 2762 Tyr Lys Ala Leu Val Thr Ile Thr Ser Glu Asp Ser Pro Ser Leu Glu 705 710 715 ACC ATT GCA ACT AGT CCT GAA GAC AAT ACA ATG AGC AAT ATC ATT CTA 2810 Thr Ile Ala Thr Ser Pro Glu Asp Asn Thr Met Ser Asn Ile Ile Leu 720 725 730 TTT GTA GGT ACT GAA GAT GCA GAT GTT ATT TCT TTA GAT AAT ATC ACG 2858 Phe Val Gly Thr Glu Asp Ala Asp Val Ile Ser Leu Asp Asn Ile Thr 735 740 745 GTT TCT GGT ACT GAG ATT GAA ATT GAA GTT ATT CAC GAT GAA AAA GGA 2906 Val Ser Gly Thr Glu Ile Glu Ile Glu Val Ile His Asp Glu Lys Gly 750 755 760 765 ACA GCA ACA CTT CCT TCT ACT TTT GAA GAT GGA ACT CGC CAA GGC TGG 2954 Thr Ala Thr Leu Pro Ser Thr Phe Glu Asp Gly Thr Arg Gln Gly Trp 770 775 780 GAT TGG CAT ACA GAA TCA GGA GTT AAG ACA GCT CTT ACA ATT GAA GAA 3002 Asp Trp His Thr Glu Ser Gly Val Lys Thr Ala Leu Thr Ile Glu Glu 785 790 795 GCT AAT GGA TCT AAC GCT CTT TCA TGG GAA TAT GCG TAT CCT GAA GTA 3050 Ala Asn Gly Ser Asn Ala Leu Ser Trp Glu Tyr Ala Tyr Pro Glu Val 800 805 810 AAA CCA AGT GAT GGT TGG GCT ACT GCT CCT CGT CTA GAC TTC TGG AAA 3098 Lys Pro Ser Asp Gly Trp Ala Thr Ala Pro Arg Leu Asp Phe Trp Lys 815 820 825 GAC GAA CTA GTT CGT GGC ACA AGC GAC TAT ATT AGT TTT GAC TTT TAC 3146 Asp Glu Leu Val Arg Gly Thr Ser Asp Tyr Ile Ser Phe Asp Phe Tyr 830 835 840 845 ATC GAT GCA GTT CGT GCT TCT GAA GGT GCT ATA TCA ATT AAC GCC GTT 3154 Ile Asp Ala Val Arg Ala Ser Glu Gly Ala Ile Ser Ile Asn Ala Val 850 855 860 TTC CAA CCA CCT GCA AAC GGG TAT TGG CAA GAA GTT CCA ACT ACA TTT 3242 Phe Gln Pro Pro Ala Asn Gly Tyr Trp Gln Glu Val Pro Thr Thr Phe 865 870 875 GAA ATT GAT TTA ACA GAG CTT GAT TCT GCA ACT GTA ACT TCT GAT GAG 3290 Glu Ile Asp Leu Thr Glu Leu Asp Ser Ala Thr Val Thr Ser Asp Glu 880 885 890 TTG TAT CAT TAT GAA GTA AAA ATT AAC ATT AGA GAC ATT GAG GCT ATT 3338 Leu Tyr His Tyr Glu Val Lys Ile Asn Ile Arg Asp Ile Glu Ala Ile 895 900 905 ACA GAC GAT ACA GAG CTT CGT AAC TTA TTA CTA ATC TTT GCT GAT GAA 3386 Thr Asp Asp Thr Glu Leu Arg Asn Leu Leu Leu Ile Phe Ala Asp Glu 910 915 920 925 GAC AGT GAT TTT GCT GGT AGA GTT TTT GTT GAT AAT GTA AGA TTT GAA 3434 Asp Ser Asp Phe Ala Gly Arg Val Phe Val Asp Asn Val Arg Phe Glu 930 935 940 TAA TTTAAAAACA GTAGATAGAG AGACTCTCTA TCTACCTGTT TATTGCTTAC 3487 TATTCGTCTT CCACTTTT 3505

【図面の簡単な説明】

図中の略号は以下の意味を有する。以下同じ。 Ｂａ；ＢａｍＨＩ Ｅｃ；ＥｃｏＲ
Ｉ Ｈｉ；ＨｉｎｄIII Ｋｐ；ＫｐｎＩ Ｎｓ；ＮｓｉＩ Ｐｓ；ＰｓｔＩ Ｓａ；ＳａｃＩ Ｓｃ；ＳｃａＩ Ｓｌ；ＳａｌＩ Ｓｍ；ＳｍａＩ Ｓｎ；ＳｎａＢＩ Ｓｐ；ＳｐｈＩ Ｘｂ；ＸｂａＩ ＥＧＢ；アルカリセルラーゼ遺伝子 ＥＧＢ_L；低分子
型アルカリセルラーゼ遺伝子 ＢＬＡ；β−ラクタマーゼ遺伝子 ＴＣＲ；テトラ
サイクリン耐性遺伝子 Ｐ_LAC；β−ガラクトシダーゼ遺伝子プロモーター Ｐ_EGC；アルカリセルラーゼ遺伝子プロモーター （バチルス エスピー ＫＳＭ−６４株）

【図１】組換えプラスミドｐＢＣ１００の２つのＨｉｎ
ｄIII挿入断片の制限地図であり、太線部分は塩基配列
が決定されている領域を示している。また、制限地図の
下部には、ｐＢＣ１００のサブクローニングによって得
られた各組換えプラスミドの挿入断片を矢印で示してい
る。

【図２】低分子型アルカリセルラーゼ活性（ａ）及び安
定性（ｂ）のpHによる影響を示したものである。

【図３】低分子型アルカリセルラーゼ活性（ａ）及び安
定性（ｂ）の熱による影響を示したものである。

【図４】組換えプラスミドｐＷＢＣ１１５の制限地図と
その挿入断片の５’及び３’末端領域の塩基配列を示し
たものである。

【図５】組換えプラスミドｐＷＢＣ１１５Ｂの制限地図
とその挿入断片の５’及び３’末端領域の塩基配列を示
したものである。

【図６】組換えプラスミドｐＨＳＰ−ＢＣ１１５Ｂの制
限地図とその挿入断片の５’及び３’末端領域の塩基配
列を示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 川合 修次 栃木県河内郡河内町立伏471−199 (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441−64

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する
   アルカリセルラーゼ。
2. 【請求項２】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する
   アルカリセルラーゼをコードする遺伝子断片。
3. 【請求項３】 配列番号２に示す塩基配列を有する遺伝
   子断片。
4. 【請求項４】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有する
   アルカリセルラーゼをコードする遺伝子断片を含む組換
   えプラスミド。
5. 【請求項５】 請求項４記載の組換えプラスミドを保持
   する形質転換体微生物。
6. 【請求項６】 請求項５記載の形質転換体微生物を培養
   し、得られた培養物から採取することを特徴とする請求
   項１記載のアルカリセルラーゼの製造法。