JPS6143998A - 環境中微生物の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の分野〕 本発明は、試験試料中のバクテリアの存在を検出する分
析法、試験手段、組成物、およびその調製法に関する。

とくに、本発明は、傭康に関する分野、例えば、人間の
分泌物または体液（す表わち、尿、血液、糞便）を診断
の促進を目的として分析する分野および食品中のバクテ
リアの汚染を検出する分野に関する。これらの分野およ
び他の分野において、特定のバクテリアを急速に、精確
にかつ経済的に検出することが重要である。

〔先行技術の説明〕

バクテリアの存在を決定しかつそれらの型を同定する多
くの試験が存在する。それらのほとんどは、未同定のバ
クテリアを含有する試料材料から単離されたバクテリア
培養物を生長させることに基づく。次いで選択した培地
上で増殖するバクテリアの１または２以上の種を単離し
、そして顕微鏡検査、生理学的試験、抗生物質に対する
感受性、種々の着色物質の吸収、血清学々どにより分類
する。多くの生物学的物質、例えば、血液または皮膚は
多種類のバクテリアを含有する。はとんどのこのような
有機体は、試験の目的（例えば、毒素の生産、病原など
）に関して主要な関心をもたれていない。したがって、
はとんどの試験において、できるだけ選択的であ夛かつ
存在を決定すべきバクテリアを生長させる培地が用いら
れると同時に、重要ではない種類のバクテリアのできる
だけ多くの生長を防止することが試みられる。このよう
な濃縮培地の例は、腸内バクテリアのためのマクコンキ
ー（Ｍａ＋ｃＣｏｎｋ＠ｙ）および嫌気的有機体のため
のチオグリコレート液状培地である。

それらの性質のため、これらの試験は関連する有機体を
単離した後はじめて、その有機体を同定しかつその抗生
物質に対する感受性を検査できるので、時間を要する。

これらの工程は数日間程度に長い期間を要することがあ
シ、そしてこの期間は人間および動物のバクテリアによ
る病気に関して重大であることがある。

微生物の計数および同定ならびに抗生物質に対するそれ
らの感受性の決定は、診断的医学的微生物学の主要な目
標である。これらの目標を達成するために、多数の技術
、試験および培地が開発されてきている。しかしながら
、現在適用されている試験はいずれもこれらの仕事を短
かい期間（すなわち、数分または数時間）の手順による
実行を可能としない。バクテリアの合計の生存しうるも
のの計数は、現在の技術状態の方法を用いると１８〜２
４時間を要する。アデノシントリホヌ７ェー）　（ＡＴ
Ｐ）含量の決定による微生物の生物量の推定は、特異的
ではなく、モして１０　／＊ｌｘｂ少ないバクテリアの
決定を可能としない、特定の種のバクテリアの計数は、
通常選択的培地および長い期間のインキュページ曹ンを
必要とする。単離されたコロニーの最終の同定およびそ
れらの抗生物質の感受性の決定は、しばしば生長の他の
サイクルおよび追加の試験を必要とする。こうして、バ
クテリアの計数、同定および抗生物質の感受性の決定の
ための完全な手順は通常数日を要する。

対照的に、現在有効な時間を要する手順に対して、感染
を引き起こすバクテリアの存在の決定および同定ならび
に異る抗生物質に対するそれらの感受性についての情報
を数分または数時間で提供できる急速な診断器具が現代
の医学において長い間探求されてきている。

従来の培養のアプローチの多数の欠点を克服する方法を
案出する連続的な試みにおいて、広範な種類の代替の技
術が研究されかつ開発されてきている。光学顕微鏡が臨
査的標本中のバクテリアが検出するために使用されてお
夛、そしてバクテリアの主要な群を弁別するために使用
できる。しかし表から、との技術は死んだバクテリアと
生きているバクテリアとを識別することはできず、そし
て検出の限界は通常１０’細旭／１ｔｘ１以上である。

免疫学的方法は特異的抗体結合により区別可能である表
面抗原を有する特別の種および属を検出するために首尾
よく開発されたが、このような手順は比較的高い濃度の
バクテリアおよび株に特異性の抗体を必要とする。

バクテリアの代謝生成物、例えば、亜硝数基、ヌクレオ
チド、例えば、アデノシントリホヌフェート、　ｃ＠繊
基質から解放された　ＣＯ２、および特異的酵素の検出
に基づく他の試験が開発された。これらの技術の欠点は
多数存在し、そして次のものを包含する：　ＡＴＰは試
験試料中の酵素により分解されることかあｆｉ、ＡＴＰ
はバクテリアでない源、例えば、宿主の組織から由来す
ることがあシ、放射物質は生物学的危険物質であり、そ
して同様な活性をもつ酵素が宿主から生ずることがある
。

粒子を計数する計測がバクテリアの検出にまた応用され
た。このよう表計測は、細いオリフィスを通して流れる
流体中の粒子の存在により生ずる前記オリフィスを横切
る電流の摂動を測定する。

この方法は、複雑な高価な装置の使用を必要とするほか
に、高度に非特異的であり、そして高い水準の注意を要
する粒子不合条件を必要とする。

他の型の計測は、特別の液状媒質中のバクテリアの生長
を測定する。これに含まれる計器は、生長するバクテリ
アを示す濁９度の増加の周期的濁シ度測定を行う。こと
でまた、この方法は非特異的であり、そして高濃度（≧
１０７細胞／ゴ）の問題のバクテリア管必要とする。

従来の微生物学のいくつかの要求および眼界の上の要約
に照して、問題の環境中で生きているバクテリアを特異
的に定量する急速外、感受性の、精確なかつ経済的な技
術および手順が長い間絶えず要求されてきた。放射線免
疫検定、分光分析、螢光分析、微量熱量測定および電気
化学的技術により代表されるような、密接に関係する分
野における分析技術の急速な進歩Ｋかかわらず、細菌学
的試験において用いられる主な技術は平板培養にとどま
っている。今日、この技術は、パスツールおよび２０世
紀の他の早期の微生物学者に使用されたのと同一の材料
および方法の多くをなお含む。

生物学的系のなかでも、遺伝子組み換えは通常有機体の
無関係の種間では起こらない。しかしながら、新規な組
み換えＤＮＡ技術は、関係するあるいは無関係の有機体
間の遺伝子の転移を今回可能とする。遺伝子構造の遺伝
的変更の可能性は、工業的および医学的微生物学の分野
において特定の用途を有する。現在様々な遺伝情報を種
々原核生物および真核生物の源からＤＮＡ断片の形で生
体外で集め、そしてクローニングベクターとして知られ
ている自己複製性遺伝的半分（ｇｅｎ＠ｔｉｃ　ｍｏｉ
＠ｔｉ＠ｓ）中に導入することができる。あるいは、Ｄ
ＮＡ断片を、または完全な遺伝子さえを、合成化学的手
段により構成して所望の理論的または既知の遺伝配列に
対応させ、次いで選択されたベクター中に導入すること
ができる。バクテリアのｆ’）スミドまたはバクテリオ
７アージは普通に使用されているクローニングベクター
である。グラスミドは、はとんどのバクテリアおよびあ
る真核生物において見出される、ＤＮＡの円形鎖から成
る自律的な染色体外の遺伝単位である。バクテリオ７ア
ージは、バクテリアのみに寄生するＤＮＡウィルスであ
る。

次いで雑種遺伝ベクターを選択された微生物宿主中に導
入することができ、次いでこの宿主は大量のクローニン
グされたＤＮＡの生産のための潜在的工場の役目をする
。

形質転換された微生物は、クローニングベクター中に存
在する異質の遺伝情報をしばしば発現しない。このよう
な不発現性クローニングベクターは、異質ゲノムの発現
が宿主有機体に対して有害な生産物を生産しうる場合に
おいて望ましい。不発現性であるかあるいは低発現性の
クローニングベクターは、異質遺伝物質はすぐに使用で
きるベクターであり、次いでこれを単離し、順次に適当
な発現ベクター（すなわち、特別Ｋ１１ｌ製しあるいは
選択したグラスミド）中に導入することができる。この
分野において知られている技術を用いることＫよシ、異
質ＤＮＡを発現ベクター中の適当な位置に配置し、ここ
で異質遺伝情報は転写され（すなわち、ｍＲＮＡが異質
ＤＮＡから生産され）そして所望の生産物は得られるＤ
ＮＡ中に解読（ｃｏｄ・）される。このような発現ベク
ターを含有する形質転換された微生物は、異質ＤＮＡ生
産物を製造する工場の役目をする。

ＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼとして知られている
あるクラスの酵素の使用により、適当な転移ベクター中
へのそう人のために調製において特定の位置において生
体外で切断することができる。

制限エンドヌクレアーゼは部位特異的エンドヌクレアー
ゼであり、主として二本鎖ＤＮＡを切シ離すが、ある場
合において一本鎖ＤＮＡを切シ離す。例えば、クラス■
制限エンドヌクレアーゼは特別の配列で切夛離す。これ
に対して、クラス１制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡを
不規則的に切シ離し、そして不均質生成物を生成するよ
うに思われる。

種々の制限エンドヌクレアーゼは異なる長さおよび型の
ＤＮＡを生成する。例えば、ある制限エンドヌクレアー
ゼは両方のＤＮＡ鎖を同じ点で切シ離し、そしていわゆ
る「プラント末端（ｂｌｕｎｔ・ｎｄ）ＪのＤＮＡ断片
を生成する。これに対して、他の制限エンドヌクレアー
ぜは一方のＤＮＡ鎖をいくつかのヌクレオチドに１相補
的鎖上の切フ離しから離れたところで、切り離し、そし
て［結合端（ｃｏｈｓｓｉｖ・ｅｎｄ）ＪのＤＮＡ断片
を生成する。結局、組み換えＤＮＡの熟達した実施者は
、主題のＤＮＡの処理のためにエンドヌクレアーゼを独
創的に選択することにより、所望のＤＮＡ断片を得るこ
とができ、次いでこれをＤＮＡ　リガーゼの作用により
ー緒に接合することができる。結合の目的で、ヌクレオ
チドを切断されたＤＮＡ断片の末端へ付加し、セして相
補的デオキシリ？ヌクレオチドをクローニングベクトル
の末端へ付加することが望ましい（すなわち、ホモ？リ
マーのティリング（ｔａ口ｌｎｇ）　　として知られて
いる方法で）。所望のＤＮＡ融合生成物を得る他の一般
的方法は、クローニングすべきりｐ−二ングベクターま
たはＤＮＡ断片の一方または両方の末端へ「ア〆デター
（ａｄａｐｔｓ月または「リンカ−断片（ｌｉｎｋ・ｒ
　ｆｒａｇｍ＋５ｎｔ）Ｊを付加することである。

リンカ−断片は、制限エンドヌクレアーゼのための１ま
たは２以上の認識配列を含有するＤＮＡの小さい区画で
ある。こうして、遺伝情報を含有するＤＮＡの切断およ
び切シ継ぎ（ａｐｌｉｃｉｎｇ）が達成される。クロー
ニングされそして宿主微生物中にそう入された異質ＤＮ
Ａの正確な配列は、ＤＮＡシークエンシンサ（ｓ＠ｑｕ
ｅｎａ１ｎｇ）手順により決定することができる。

異質ＤＮＡはいくつかの方法で転移ベクター中にそう人
することができる。例えば、親の源から直接得られるＤ
ＮＡ断片を、適当なベクター中へそう任できる。他の方
法は親糸中の活性合成位置からｍＲＮＡを得、　次いで
単離されたｍＲＮＡから一本鎖の相補的ＤＮＡ鎖を酵素
的に合成する〔逆トランスクリックーゼ（ｒｅｖｅｒｔ
ｓ　ｔｒａｎａｅｒｉｐｔａｓｅ）　）ことである。

次いで二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖の鋳型から合成する。

仁の方式で得られる二本鎖ＤＮＡは相補的ＤＮＡ（ｅ　
ＤＮＡ　）として知られている。いったん所望のＤＮＡ
配列が知られると、遺伝子を微生物、組織または細胞培
養系中のクローニング／発現の目的に化学的に生体外で
合成することもできる。

再近数年間に、組み換えＤＮＡ技術の出現のために、分
子生物学の領域におい゛て著しい進歩が見られた。これ
らの努力のいくつかは診断試験に向けられた。種々の遺
伝疾患を、例えば、人間の胚において検出することがで
き、そして疾患自体を示さない患者において制限エンド
ヌクレアーゼおよび核酸の交雑技術を使用するととＫよ
り、保菌の状態さえを発見することができる。ＤＮＡま
たはＲＮＡの特異的グロー２または核酸の交雑技術を用
いる、バクテリアの所定の型の存在の確認も発展段階に
ある。新規な遺伝構造体、ことに人工的手段（生体外）
により部分的にまたは完全につくられたものを使用して
、特定の有機体の存在を検出することは、報告されてお
らず、そして本発明の基鍵である。本発明の好ましい実
′ＭＡＷＡ様は、ビルビオ−７（シェリ（Ｖｉｒｂｌｏ
　ｆｉｓａｋ＠ｒ１）からのルミネセンス系（ｌｕｍｉ
ｎ＠５ｃｅｎｔ　ｓｇｔ＊ｍ）を用いる・われわれが開
発した技術は、その系にいかなる方法においても限定さ
れない。その存在または不存在を決定すべき宿主バクテ
リア中で発現の著しい増加を示す、外因性の遺伝的に導
入された系を使用することもできる。生物発光および化
学発光に関する文献の例は、次の通〕である：バイオル
ミネセンス・イン争アクシｌン（Ｂｌｏｌｕｍｌｎｅｓ
ｅｅｎｅａ　ｉｎ　Ａｃｔｉｏｎ）Ｐ、Ｊ、ヘリング（
Ｈ＠ｒｒｉｎｇ）編、アカデば、り・ブレス（Ａａａｄ
＠ｍｉｅ　Ｐｒ＠ｍｓ）、二眞−ヨーク、ＮＹ１９８３
：生物発光および化学発光（Ｂｌｏｌｕｍｉｎｓ＋５ｅ
ａｎｅｅ　ａｎｄＣｂｓｍｌ　ｌｕｍｌｎａｓｅｅｎｏ
ｅ）、Ｍ、Ａ＋デ・ルカ（ｄｏ　Ｌｕｅｍ）およびＷ、
Ｄ、マクエルｏイ（ＭｃＥｌｒｏｙ）編、　アカデミ。

り・ブレス（Ａｃａｄ＠ｍｉｃ　Ｐｒｎ５ｓ）　、二Ｊ
Ｌ　−ｗ−り、野、１９８１、米国特許第３，９５８，
９３８号、同第３．４７０，３７３号、同第３，５６７
，５８１号、同第３．９５９，０８１号、同第３，５６
７，５８６号および同第４，１４４，１３４号は、リン
光および化学発光に関する。

遺伝子工学の種々の面、とに組み換えＤＮＡを取り扱う
文献は急速に出現している。ベクター、組み換え組成物
、方法論および微生物に関する領域において種々の特許
が発行されている。このような特許の例は、次の番号の
米国特許である：４．０８２，６１３　：４，１８４，
９１７　：４，１９０，４９５　：４．１９５，１２５
　：４，２３７，２２４　：４，４８８，４６４　：４
．２５９，４４４　：４，２６２，０９０　：４，２６
２，７３１　？４．２７３，８７４　：４，２５９，４
４４　：４，２６２，０９０　：４．２６２，７３１　
：４．２７３．８７４　：４，３２１，３６５　：４．
３９９，２１６　：４，３４０．６７４　：４，５０６
，０１３　：４．５０３，１５１：および４，５０４，
５８４゜米国特許第３，９３０，９５６号は、原料のバ
クテリアＤＮＡの栄養要求変異種への転移を含む、バク
テリアの７アージ誘導溶解は、米国特許第４．１０４，
１２６号に記載されている。

エングプレヒト（Ｅｎｇ＠ｂｒｅｏｈｔ）、Ｋ、ネアル
ノン（Ｎｅｔｌｓｏｎ）およびＭ、シルバーマン（ｇｊ
ｌｖ＊ｍａｎ）１９８３、バクテリアの生物発行：ビブ
リオ・フィシエリからの単離および機能の遺伝分析（Ｂ
ａａｔ＠ｒｉｍｌ’　Ｂｉｏｌｕｍｉｎｓｓｃｅｎｏｅ
：ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｇ＠ｎ＠ｔｉｅ　ａｎ
ａｌｙｓｌ＠ｏｆ　ｆｕｎｅｔｌｏｎｓ　ｆｒｏｍ　Ｖ
ｉｂｒｌｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｌ）、　　細胞（Ｃｅｌｌ
）赳ニア７３−７８１には、ビブリオ・フィシエリ（Ｖ
ｉｂｒｉｏ　ｆ　Ｉ＊ｅｈ＠ｒｌ　）　（ＭＪ−１）　
ＤＮＡのＢａｍＨｌ　制限断片をプラスミドｐＡＣＹＣ
１８４で結合することＫよ多構成された種々の組み換え
プラスミドを記載している。これらの組み換えプラスミ
ドはＥ、　Ｃｏ１１中に導入され、ここでそれらは発現
し、ビブリオ・フィシエリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈ
ｅｒｌ）のそれに匹敵するレベルでルミネセンスを生成
した。バクテリアのルミネセンスに関する追加の刊行物
は次のものを包含する：ベラス（Ｂ＠１ａｓ）、Ｒ，ら
、サイエンス（Ｓａｔ１）２１８ニア９ｌ−３（１９８
２）；エバンス（Ｅｖａｎｓ）、Ｊ、Ｆ、ら、エシェリ
ヒア・コリ系におけるバクテリアのルシフェラーゼのサ
ブユニ、トの生体外合成（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｓｙｎｔ
ｈｓｓｌｍ　ｏｆ　５ｕｂｕｎｉｔｓ　ｏｆ　ｂａｃｔ
ａｒｉａｌ　１ｕｅｉ−ｆ＠ｒａｓｓ　Ｉｎ　ａｎ　Ｅ
ｓａｈ＠ｒ１ｃｈｌａ　ｃｏ旦ｓｙｓｔｅｍ１）、　　
ゾヤーナ／Ｉ／−オｆ−バクテリオロゾー（Ｊ　Ｂａｃ
ｔ＠ｒｉｏ１．　ｔｓａ：５４３−５４５　　（１９８
３）：エングッレヒト（Ｅｎｇ＊ｂｒ＊−ａｈｔ）、Ｊ
、およびＭ、シルパーマ：ｙ　（Ｓ　ｉ　１ｖ＊ｒｍａ
ｎ）、バクテリアのルミネセンスに必要な遺伝子および
遺伝子生産物の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅａｔｌｏｎ　
ｏｆ　ｇｓｎ＋ｓｓ　ａｎｄｇ＠ｎ＠ｐｒｏｄｕｃｔｓ
　ｎ＠ｃｅｓｓａｒｙ　ｆｏｒ　ｂａａｔ＠ｒｉａｌ　
ｂｌｏｌｕｍｌｎｅｇ−ｅ＠ｎａ・）、プルシーディン
グ・オブｅナシ璽ナル中アカデミ−・オプサイエンス（
Ｐｒｏａ、　Ｎａｔｌ、　Ａｏａｄ。

Ｓｅｔ１）ＵＳＡ、８ユニ４１５４−４１５８（１９８
４）：エングブレヒ）（Ｅ■・ｂｒ＠ｃｈｔ）、Ｊ、ら
、　光を用いる遺伝子の発現の測定（Ｍｅａｓｕｒｉｎ
ｇ　ｇｏｎｅ　＊ｒｐｒ＠５ｍ１ｏｎ　ｗｉｔｈｌｌｇ
ｈｔ）、サイエンス（８ｅ１．）、２２’７：１３４５
−４７（１９８５）。ルシフェラーゼを含まないルミネ
センス系は知られている〔デソール（Ｄｏｓｏｌｅ）、
Ｐ。

ら、ジャーナル・オツ・クリニカル豐アンド・ラボラト
リ−・オートメーシ璽ン（Ｊ、　ＣｌＩｎ、　Ｌ鼻す。

Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）　３：３９１−４００（１９８
３））、　　これらの刊行物において、この技術をバク
テリアの決定に使用することは述べられていない。また
、発明者らが最も知るかぎゃ、バクテリアまたは他の微
生物の決定に発光する遺伝要素を使用することはいかな
る他の刊行物において示唆されてい表い。

本発明の目的は、バクテリアの特別の同定を可能とする
短期間の試験を提供することである０本発明のほかの目
的は、低い濃度のバクテリアを検出しかつ同定できる高
度に感受性の試験を提供することである。さらに本発明
の他の目的は、決定されたバクテリアの定量的推定を可
能とする試験を提供することである。本発明のなお他の
目的は、抗生物質に対するバクテリアの感受性を決定す
る試験を提供することである。これらの目的およびそれ
以上の目的は、以下の詳細な説明から明らかとなるであ
ろう。

〔発明の一般的背景〕

種々の植物および動物は、化学ルミネセンスを示す。生
物ルミネセンスは微生物〔すなわち、バクテリア（大部
分海洋の形態、例、Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈ−＠ｒｉ
）、菌類（ｆｕｎｇｉ　）、および渦鞭毛虫〕、昆瓜（
例、ホタル、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｄｉｍ）　、
甲殻綱の動物（すなわち、Ｃｙｐｒｌｄｉｎ＠ｈｉ１ｇ
＠ｎｄｏｒｆｌ）、フラグ、端虫（ｗｏｒｍ）および他
の無を推動においておよび哺乳動物においてさえ見出さ
れる。ルミネセンスの生化学的機構は変化することが知
られている（すなわち、バクテリア中に見出されるルミ
ネセンス系はホタルおよび渦鞭毛虫において見出される
ものと異る）が、生きている有機体における光の生成は
最も頻繁に酵素のルシフェラーゼにより触媒される。バ
クテリアのルシフェラーゼは、各々がはｔ！４０．００
０ダルトンの分子量をもつ２つの異るサブユニット（ｓ
ｕｂｕｎｉｔ）から成る混合機能オキシダーゼである。

バクテリアのビブリオ・フィシエリ（Ｖｌｂｒｉ。

ｆｉｓｃｈｅｒｌ）において、ルミネセンス系に参加す
る酵素の合成は自己誘導体（ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ）
と名付けられる小さい知覚分子（ｓｅｎｓｏｒｙ　ｍｏ
ｌ＠ｃｕｌｅ）により調節される。生長の間、自己誘導
体は生長媒質中に蓄積される。自己誘導体が臨界濃度に
到達すると、ルミネセンス系の誘導が起こシ、光生成が
ほぼ１０００倍増加する。

新しい試験の好ましい要素は、ルミネセンスのバクテリ
ア、通常海洋ノ々クチリア、例えば、ビブリオ響フィシ
エリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｃｈｅｒｌ）、のルミネセ
ンス系を有するＤＮＡの断片である。

ルミネセンス遺伝子を有する細胞外ＤＮＡ断片はもちろ
ん、発光しないが、それを形質導入または形質転換によ
り適当麿生きている宿主へ転移させると、宿主の遺伝的
および合成的機構はＤＮＡ断片を利用することができ、
これにより光を放射させる。試験有機体において、細亀
内遺伝子セグメントが発現される程度に劣るかあるいは
発現されない場合、前記遺伝子セグメントをまた使用す
ることができ、そして前記遺伝子セグメントは、存在ま
たは不存在を決定すべき有機態に外因性ＤＮＡが多少遺
伝的に転移された後、はじめて発現されるようになる。

後者の方法は接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｌｏｎ）すなわち
交配（ｍａｔｉｎｇ）および１つの細胞から他の細胞へ
の遺伝的転移（ｇ＠ｎ＠ｔｉｃ　ｔｒａｎｓｆ＠ｒ）を
用いる。

バクテリオファージの感染〔形質導入（ｔｒａｎｓ−ｄ
ｕｃｔｉｏｎ））により、形質転換によりｓるいは接合
により、ＤＮＡをバクテリア中胞中に導入することは、
通常供与体源に関して限定される：　ＤＮＡの転移は同
一種の株の群の間であるいは密接に関係する種の間で起
こる。このよ５表転移を制限するように作用するいくつ
かの因子は、次のものを包含する：多くのバクテリア種
および／またはそれらの株におけるＤＮＡ制限−修飾系
の存在、導入されたＤＮＡの複製のための宿主因子への
依存性およびバクテリオファージがその上へ吸着し、こ
れによりそれらの遺伝物質を宿主中へ適切に導入できる
バクテリア壁中の適当カバクテリオファージの受容体。

接合および形質転換はとくに株特異性ではない。

あるプラスミドは同一種ばかシでなく、関連する本のへ
も接合により転移されうる。遠縁の種に接合によ〕転移
されうるいくつかのグラスミドさえ存在する。形質転換
は、広い範囲のバクテリアが細胞外ＤＮＡを取り上げる
ので、接合よシも潜在的になお広い。現在そのよう忙す
ることが知られていないものの、大部分でないにしても
、多くは特定の条件下で事実形質転換されうるであろう
。例えば、Ｅ、　ｃｏｉｌは通常ＤＮＡを効率的に取り
上けない。しかしながら、カルシウムで衝撃した後、こ
のバクテリアは高い水準の効率でそのようにすることを
誘発されうる。形質転換の使用を制限する因子は、異質
ＤＮＡの発現し、複製し、あるいはその遺伝情報を宿主
ゲノム中に組み込む能力である。

形質転換および接合と！Ａシ、形質導入は非常に株また
はｆｆ特異性である。あるバクテリオファージは通常密
接に関係するバクテリアのいくつかの種を感染する。大
部分は単一種の株の特定のサプセｙ　）　（ｓｕｂｓｅ
ｔ）をのみ感染する。サプセ、トを感染する異る種類の
種のバクテリオファージを使用することにより、バクテ
リアの種の株を分類体系に配列できる。これをファージ
分類（ｐｈａｇｓ　ｔｙｐｌｎｇ）と呼ぶ。

組み換えＤＮＡ技術および分子遺伝学は、生成物が検定
容易である遺伝子の導入を可能とする。こうして、エシ
ェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ＠ｒｌｅｈｉａ　ａｏｌｉ）
の１ａａｚのような遺伝子のバクテリア中への導入は、
導入された遺伝子の発現に導びく。例えｄ１バクテリオ
ファージは遺伝子の導入に使用する場合、引き続く感染
の過程はペーターガラクトシ〆−ゼの形成程度を分析す
ることにより測定できる。バクテリアの細胞自体がこの
酵素のための遺伝子を有する場合でさえ、この測定を実
施できる。なぜなら、内因性のレベルは適当な媒質によ
り抑制されることができ、そしてバクテリオファージの
遺伝物質の伸長（ｐｒｏｐａｇａｔｌｏｎ）は遺伝子の
多数のコピーに導くからである。

多数の外因性遺伝系を本発明において利用できるが、ビ
ブリオ拳フィシエリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｌｓａｈｓｒｉ
）のルミネセンス系は、とくに有用であシかつ所定のバ
クテリア種の存在または不存在を確証するための本発明
の方法の例示である。はんのわずかのバクテリア種のみ
が、化学的エネルギーを光に変換することができる遺伝
子を含有する。バクテリア種のほとんど大部分は、この
よう表糸を含有せず、暗い。光を生成するための遺伝子
がとのような能力のない壁中に導入されかつその中で発
現されると、光の放射が生ずるであろう。このような系
におけるパックグラウンドの干渉はきわめて低い（化学
的ルミネセンス）。非常に低いレベルの光を検出しかつ
測定できるので、この方法に基づく試験は感受性であシ
かつ定量的であろう。

〔発明の要約〕

本発明によれば、おる環境における・櫂クチリアの特定
の型または群の決定に有用な方法および組成物が提供さ
れ、ここで適当な供与体有機体ｄ−ら誘導されるルミネ
センス系または他の遺伝系を含有する外因性ＤＮＡは、
内因性ＤＮＡに欠ける〃１あるいは比較的低いレベルで
それを含有する宿主有機体へ、形質転換、形質導入また
は接合（遺伝手段）により転移される。決定しようとす
る有機体中に供与体遺伝物質が入ると、導入された系や
；発現される。このような遺伝子の発現は、このような
有機体の存在および数の検出を可能とする。さらに、入
る時間に抗生物質が添加されると、宿主有機体のその抗
生物質に対する感受性を決定できる。本発明の好ましい
実施態様は、ルミネセンス・ｆクチリア（または他の源
）から誘導されるルミネセンス系またはその部分の非ル
ミネセンス宿主有機体中への転移を含み、前記ルミネセ
ンスバクテリア（または他の源）はこの系の転移の源と
して使用され、引１！続いて宿主においてルシフェラー
ゼまたは他の系は発現され、そして同時に光または他の
遺伝標識が生成される。また、本発明は、試験試料中の
抗生物質を検出し、微生物を抗生物質の感受性について
検定し、あるいは組成物を抗生物質の活性について検定
するために用いることができる。

あるいは、存在を確認しようとするバクテリア中に入る
まで、存在しないかあるいは発現される程度に劣る他の
遺伝系を用いることができる。９１えば、発現を酵素的
検定または免疫検定により監視できる酵１ｇまたはタン
ノヤク質（例、Ｌ　ｃｏｉｌのペーターガラクトシダー
ヤまたはニワトリからの卵アルプミンタンノヤク質）を
解読する（ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ）遺伝子の導入を用い
ることができる。これらの測定は、次のものに基づくこ
とができる：ｐ）（変化またはＨ＋以外の種についてイ
オン濃度の変化；特定の分子（例、アミノ酸、塩基、脂
質など）の生成また社特定の分子の減成また紘消失；気
体の生成（Ｅ、　ｃｏｉｌによるＨ２）：色の形成また
は消失（例、アルカリ性ホスファターゼによるｐ−ニト
ロフェニルホスフェートからのｐ−ニトロフェノール）
または所定の波長において特定の光吸収性質をもつ分子
または放射能標識分子；主生成物に依存性の二次分子の
生成または消失。

ルミネセンスバクテリアは主として海洋性でおシ、典渥
的な例はビブリオ・フィシエリ（Ｖｉｂｒｉ。

ｆ１ｓａｈ＠ｒｌ）である。ルミネセンスバクテリア、
ホタル〜渦鞭毛央またはルミネセンス菌類（ｆｕｎｇｌ
　）などから誘導されるルミネセンス系を含有するＤＮ
Ａは自然であることができ、この場合それはそれ自体ル
ミネセンス有機体から誘導される。あるいは、ルミネセ
ンスバクテリアまたは他の源から誘導されるルミネセン
ス系またはその部分を含有するＤＮＡ　Ｕ人工組み換え
または合成されたＤＮＡであることができ、ルミネセン
ス系またはその部分はルミネセンス源から誘導される。

バクテリアのルミネセンス系を含む場合、媒質中に、ル
ミネセンス系またはその部分が誘導されるルミネセンス
バクテリアの自己誘導体をある量で含み、これによりそ
うでなければ宿主有機体の内側に自己誘導体を形成する
ために要求される長いインキエペーシ璽ン時間を回避す
ることが望ましいであろう。必要に応じて、環境に脂肪
族アルデヒドを加えて、ルミネセンスバクテリアから誘
導されるルミネセンス系またはその部分の発現を促進ま
たは増加することがまた可能である。ルミネセンス系以
外の異質遺伝ｗｉｔ系を適当な宿主中に導入する場合、
中間体、前駆動質、酵素基質または他の成分を導入して
、遺伝標識の遺伝系の発現または発現の検出を促進また
は増強することが有利であることがおる。

宿主有機体において、ルミネセンスバクテリアまたは他
の源から誘導されるルミネセンス系またはその部分を含
有するＤＮＡ　ｆｔＲＮＡ　／リメラーゼにより転写し
てｍＲＮＡを形成し、次いで後者はルミネセンス系のタ
ンパク質に翻訳できる。単一のノ９クチリアさえのルミ
ネセンスのレベルを、例えば、シンチレーシ冒ンカウン
ターの助けにより検出できる。

こうして、理解されるように、本発１１によれば、ルミ
ネセンスは２種類の非ルミネセンス成分、すなわち、決
定すべき有機体およびルミネセンスバクテリアまたは他
の源から誘導されるルミネセンス系またはその部分を含
有する前記ＤＮＡ　、の間の相互作用時に生成される。

結局、化学ルミネセンスのパックグランドのレベルを越
えるルミネセンスの不存在は宿主有機体の不存在を示す
。このような技術は従来法して示唆されていない。

本発明によれば、例えば、ルミネセンスまたは他の発現
された系と問題のバクテリアの濃度との間の相関関係を
示す標準曲線を構成することが可能である。このような
曲線を用いると、環境中のバクテリアの量を厳密に概算
することができる。

適当な供与体から誘導されるルミネセンスまたは他の遺
＠ａｉ識系またはその部分を含有するＤＮＡの宿主有機
体への転移は、形質転換、形質導入または接合により仲
介されることができる。多数の微生物の属は、バクテリ
オファージのための宿主の役目をしかつプラスミドの保
持または受容する。

このような属の例は、次の通シである：エシェリヒア（
Ｅｇａｈ＊ｒｉｅｈ１ｍ）、アエロバクチル（Ａ＠ｒｏ
ｂａｅｔ＠ｒ）、サルそネ’）　（Ｓｍ１ｍｏｎ＠ｌ１
ｍ）　、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシェラ（
Ｋ１＠ｂｓｉ＠ｌ１ｍ）、グロテウヌ（Ｐｒｏｔｅｕａ
）、シェードモナス（Ｐａ＠ｕｄｏｍｏｎａｓ）為ヌタ
フイロコッカス（Ｓｔｉｐｈｙｌｏａｏｃｃｕｓ）、　
：Ｘトレグトコッカス（Ｓｔｒ＠ｐｔｏａｏｅａｕｓ）
、チラミジア（Ｃｈｌｍｍｙｄｉａ）、マイコブ２ズマ
（Ｍｙｅｏｐｌａｓｍａ）、二二一モコッカヌ（Ｐｎ＠
ｕｍｏｃｏｅｃｕｓ）、ネイセリア（Ｎ＠１ｍｓ＊ｒｌ
ａ）、クロストリゾクム（Ｃｌｏｍｔｒｉｄｌｕｍ）、
バシルス（Ｂａｅｌｌｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム
（Ｃｏｒｙｎ＠ｂａｃｔ＠ｒｌｕｍ）　、ｖイコパクテ
リウム（Ｍｙａｏｂａｅｔ＠ｒ１ｕｍ）、カンフイパク
テル（Ｃａｍｐｈｙｂａｃｔ＠ｒ）　、ビブリオ（Ｖｉ
ｂｒｉｏ）、セラチア（Ｓｍｒｒａｔｉｍ）、エンテロ
バクチル（Ｅｎｔ＠ｒｏｂａｅｔｅｒ）　。

グロビデンシア（Ｐｒｏｖ１ｄ＠ｎｅ１ｍ）　、クロモ
バクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔ＠ｒｌｕｍ）　Ｓ
プルセラ（Ｂｒｕｅｌｌｍ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉ
ｎｉｍ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕａ）、
およびボルデテラ（Ｂｏｒｄ＠ｔ＠ｌ１ｍ）。

形質導入のため、決定すべきバクテリアに対して特異的
であるバクテリオファージを構成する。

必要に応じて、各々異るバクテリオファージを用い一系
列の試験を順次にあるいは同時に実施できる。

あるバクテリオファージは、ルミネセンスバクテリアま
たは他の適当な源から誘導されたルミネセンス系または
その部分または他の供与体遺伝標識系を含有するＤＮＡ
を適切なバクテリオ７アージのカプシド中に包むことに
より、構成できる。あるいは、バクテリオファージは組
み換えＤＮＡ技術により制限エンドヌクレアーゼを使用
して構成することができ、引き続いて包むかあるいは包
まないことができる。あるいは、ルミネセンスまたは他
の系の全部または部分を含有するバクテリオファージを
、自然に生ずる遺伝的組み換え機構によ〕構成できる。

これは、また、人工的組み換えおよび自然の組み換えの
両者の使用を包含することができる。

接合のため、本発明は転移可能なレグリコン中にルミネ
センス系またはその部分を含有するバクテリアの株を提
供する。ルミネセンス系またはその部分はバクテリオフ
ァージによりあるいは自然または人工の遺伝的組み換え
により導入することができ、このようにしてルミネセン
ス遺伝子は転移された遺伝物質へ共有結合される。ある
いは、前述のように一次的または二次的生成物を測定で
きる他の遺伝系を同様な方式で使用できる。例示の目的
で、ルミネセンスを本発明の下に横たわるよシ一般的な
原理の関連する特定の例として与える。

例えば、本発明に従う接合のために、Ｈｆｒ−（接合の
高い頻度ｈ１ｇｈ　ｆｒ＠ｑｕｅｎｃｙ　ｏｆ　ａｏｎ
ｊｕｇａｔｉｏｎ　）であるバクテリアの株、およびル
ミネセンス系を有する鋳製バクテリオファージに対して
溶原性であるバクテリアの株を使用できる。明らかなよ
うに、他のＨｆｒまたは供与体を、自然または人工の遺
伝的組み換えにより、あるいは遺伝物質の付加によりつ
くることができ、こうしてＨｆｒまたは供与体がルミネ
センス系またはその部分を有するようにすることができ
る。

ここに記載する本発明による試験の実施において、宿主
はルミネセンス系または他の供与体系の形成において含
まれる代謝的活動を行う：これはタン・ｆり質の合成お
よび還元力を発生するプロセスを含む。これらのプロセ
スを行うかあるいは細胞の完全性を変更する抗微生物剤
は、供与体遺伝系の形成（すなわち、ルミネセンスなど
）を壊滅または減少する。結局、本発明によれば、種々
の抗バクテリア剤、例えば、抗生物質に対するバクテリ
アの感受性を決定できる。この目的に１試験すべきバク
テリアの特定のｍまたは群を所定の抗バクテリア剤の存
在下に特定したようにＤＮＡ転移に付し、次いで宿主バ
クテリアのタンパク質合成能力および全体的代謝の関数
である、発現された供与体遺伝系（すなわち、ルミネセ
ンス）の動力学を決定する。好ましくは同時に試験を実
施し、それらの１つは抗微生物剤の不存在下に実施し、
そしていくつかの代のものは各々特定の抗微生物剤の存
在下に実施する。このような試験の結果を比較すること
により、試験した抗バクテリア剤のいずれかに対する試
験したバクテリアの感受性について結論を導き出すこと
ができる。

特定の実施態様の説明 １、材料および方決 ■、生長培地 Ａ、ＬＢ（レノックス液体培地（Ｌ＠ｎｎｏｘｂｒｏｔ
ｈ）ｏ　　Ｃレノ、クス、Ｅ、５１９５５．バクテリオ
ファーゾによる宿主の結合遺伝特性の形質導入（Ｔｒａ
ｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｌｎｋｅｄ　ｇｅｎｅｔ
ｌａｅｈａｒａｏｔｅｒ＠ｏｆ　ｔｈｅ　ｈｏｉｔ　ｂ
ｙ　ｂａａｔｅｒｉｏｐｈａｇａ）Ｐｌ、パイロロジー
（Ｖｌｒｏｌｏｇｙ）　１：１９０−２０６））。

〔１０Ｉのトリｆドア７ンＨ５ｇのＮａＣｔ：　５１の
酵母エキス；１ｔの蒸留）Ｉ２０　：　４ｍｌのＩＮの
ＮａＯＨ）１、−ｅ）す皿に：　１５　Ｉｔの寒天を加
える。

２．１２１℃において１５分間オートクレーブ処理する
。

３、必要な場合添加する：（ａ）アンぎシリン３０１ｖ
／ｚ：（ｂ）クロランフェニコール３０１　／　ｔ　：
　（ｃ）テトラサイクリン１５ダ／１゜ Ｂ、ＦＴ（１０ＩＩのトリジトン；５Ｉ！のＮａＣ４：
２Ｉのマルトース；１０ゴの１モルのＭｇ８０４：　１
ｔの蒸留Ｈ２０〕 １１２１℃で１５分間オートクレーブ処理する。

２、必要に応じて添加する： （凰）アンピシリン３０Ｍ９／ｌ： （ｂ）クロランフェニコール３０ダ／ｌ；（ｃ）テトラ
サイクリン１５１１９／ｌ。

Ｃ，Ｔバクテリオファージについて（１０，Ｆのトリプ
トン；５ＩのＮａＣｔ：　１０　Ｊ’の寒天；１ｔのＨ
２Ｏ３ １，１２１’Ｃで１５分間オートクレーブ処理する。

Ｄ、ＴＡ［上部の寒天（Ｔｏｐ　Ａｇａｒ　）　〔１０
１のトリブト７：５１のＮａＣ１：　６．５１の寒天；
１ｔのＨ２Ｏ３ １，１２１℃で１５分間オートクレーブ処理する。

Ｅ、複合（ｃｏｍｐｌ＋ｓｘ　）液状培地（ＡＳＷＲＰ
）および複合固体培地は、ウリトズール（Ｕｌｌｔｊｕ
ｒ）、Ｓ、。

ライザー（Ｗ・ｊｅｅｒ）　、　Ｉ　、およびＳ、ヤン
ナイ（Ｙａｎｎａｉ）　：突然変異誘発性化合物の新し
い、感受性の簡単な生物ルミネセンス試験（Ａ　ｎｅｗ
。

５ｅｎｓｌｔｌｖｅ　ａｎｄ　５１ｒｏｐｌｅ　ｂｌｏ
ｌｕｍｌｎｓａｃｅｎｅａｔ＊ｓｔｌムユテイション・
リサーチ（ＭｕｔａｔｉｏｎＲ・６．）ひ：１１３−１
２４）に記載されている。

■、菌株およびＤＮＡ Ａ、バクテリアの株 １、　　ＭＭ２９４　Ｅ、　ｃｏｉｌ　Ｋ１２　ｅｎｄ
Ａ　ｔ）す巴狂赳〔パックマン（Ｂａｃｋｍａｎ、に、
　＋７’タシユン（Ｐｔａｓｈｎｅ）、ＭおよびＷ、ギ
ルパー）　（Ｇｉｌｂｓ＋ｒｔ）。

１９７６　：バクテリオファージのＣＩ遺伝子を有する
グラスミドの構成（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｌｏｎ　ｏｆｐ
ｌａａｍｉｄｓ　ｅａｒｒｙｌｎｇ　ｔｂｅｃＩ　ｇｅ
ｎｅ　ｏｆｂａｅｔ＠ｒｌｏｐｈａｇｅ）、ノロシーデ
ィング・オブ・ナシ、ナル・アカデミ−・オプ・サイニ
ス（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ１）　ＵＳＡ　７３：４１
７４−４１７＆：］。

ΔＭ１５〔ピエイラ（Ｖｉｓｉｒａ）、Ｊ、およびＪ、
メッシング（Ｍｓｓｓｌｎｇ）、１９８２：　合成万能
ブライマーを用いるそう人突然変異誘発およびシークエ
ンシングのためのｐＵＣグラスミド、Ｍｌ　３ｍｐ　７
誘導系（Ｔｈａ　ｐＵＣｐｌａｓｍｉｄ＠、ａｎ　Ｍ１
３ｍｐ７−ｄ＠ｒｉｖｅｄｓｙｓｔ＠ｍ　ｆｏｒ　１ｎ
ｓｓｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅａｌｓ　ａｎｄｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｌｔｈ　５ｙｎｔｈｅｔｌｅ　ｕ
ｎｉｖｅｒｓａｌｐｒｉｍ＠ｒｓ）、遺伝子（Ｇ＠ｌｌ
＠）　１９：２５９−２６８）。

３、　　Ｗ３１１０　Ｅ、　ｃａｌｌ　Ｋ１２　Ｆ−野
生Ｗ（−？／７７スキー（Ｙａｎｏｆｓｋｙ）、Ｃ，ｌ
ホーン（Ｈｏｒｎ）＋Ｖ−１ボンナー（Ｂｏｎｎｓｒ）
　、　ＭおよびＳ、スタジオウスキー　（Ｓｔａｓｌｏ
ｗｋｌ　）　、　１９７１　：エシェリヒア・コリのト
リブトファンオペロンの最初の３つの遺伝子の突然肇異
体における極性および酵素の機能（Ｐｏｌａｒｉｔｙ　
ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｉｎｍｕ
ｔａｎｔｓ　ｏｆ　ｔｈ＠ｆｉｒｓｔ　ｔｈｒｅ＠ｇｅ
ｎｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｏｐ＊ｒ
ｏｎ　ｏｆ　Ｅｓｅｂ＠ｒ１ｅｈｉａ　ｃｏｉｌ）。

遺伝学（Ｇ＠ｎ＠ｔ１ｅｓ）　６９：４０９−４３３，
１゜４、　　ＡＴ２４４８　Ｅ、　ｅｏｌｉ　Ｋ１２　
ＨｆｒＨｔｈｌ　ｍｅｔ　。

５、　　　Ｃ３ＨＩ　　Ｅｓｃｈ＠ｒｌｅｈｉａ　　ｃ
ｏｉｌ　　Ｋ１２　１ａｅ　　ｔｒｐ■堕〔シラー（Ｍ
ｉｌｌｅｒ）　、　Ｊ、Ｈ，１９７２：分子遺伝学にお
ける実験（Ｅｘｐ＠ｒｉｍｅｎｔｓ　１ｎ　Ｍｏ１ｅａ
ｕｌａｒＧｅｎ＠ｔｉｃｍ）コールド・スゲリング・ハ
ーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。

コールド・スゲリングＨハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ
ｎｇＨａｒｂｏｒ）、　＝、−ヨーク〕。

６、グロテウス・プルがリス（Ｐｒｏｔ＠ｕｓＶｕ１ｇ
ａｒｉｇ）。

７、スタフィロコッカス・アルプス（Ｓｔａｐｈｙｌｏ
−ｅｏｃｅｕｓ　ａｌｂｕｍ）。

８、　７エロハクテル・アエロｃネス （Ａｓｒｏｂａｅｔ＠ｒ　ａｓｒｏｇｅｎｅｍ）　６２
−１　（ギプソン（Ｇ１ｂｓｏｔ＋）、Ｆ、１９６８：
コリスミン酸（Ｃｈｏｒｌｓｒｎｉｃａｃｉｄ）、Ｐ、
　９４−９７．　Ｗ、Ｅ、Ｍ、ランド（Ｌａｎｄ）編、
バイオケミカル・プレノｆレイシ、ンズ（Ｂｌｏｃｈｓ
ｍｉｅａｌｐｒｅｐａｒａｔｌｏｎｓ）、ｖｏｌ、１２
．−／　、ンーウイリーーアンド・リング・インコーＩ
レーテッｒ、ニューヨーク〕。

Ｂ、バクテリオファージの株 １、　λｅＩ＋野生型。

２、　λチャーラン（Ｃｈａｒｓｏｎ）　３０　（マニ
アチス（Ｍａｎｌａｔｉｍ）＊Ｔ、　ｒフリッタ−（Ｆ
ｒｌｔｍｅｈ）、Ｅ、Ｆ、およびＪ、サムプＡ／２り（
Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、１９８２：分子クローニング（Ｍ
ｏｌｅｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、コールド・ハー
バ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スゲリング
・ハーバ−・ニューヨーク〕。

３、　λｃＩ−ｂ２゜ ４、　λｃＩ８５７８７　ｐｌａｅ５（Ｍｌｌｌ＠ｒ、
ｏｐ、ｃｉｔ１）。

Ｃ０！ラスミドおよびＤＮＡ １、　　ｐＢＲ３２２４，３６Ｋｂ、アンピシリンおよ
びテトラサイクリンに対して抵抗性の遺伝子を含有する
〔ポリパー（Ｂｏｌ量マ＆　ｒ　）　ｒ　Ｆ　＊　＋　
ロドリグエズ（Ｒｏｄｒｉｇｕａｚ）、Ｒ，Ｌ、グリー
ン（Ｇｒ＠ｅｎ）、Ｐ、Ｊ、＋ペトラチ（Ｂ＠ｔｌａｅ
ｈ）、Ｍ、Ｃ，、ヘイネ、カー（Ｈ＠ｙｎ＠ｃｋｅｒ）
。

Ｈ，Ｌ、　、ボイアー（Ｂｏｙ＠ｒ）、　Ｈ，Ｗ、　、
クロサ（Ｃｒｏｓａ）。

Ｊ、Ｈ，、および７オーコウ（Ｆａｌｋｏｗ）、Ｓ、　
、１９７７　：新しいクローニング・ビヒクルの構成お
よび特性づけ（Ｃｏｎｍｔｒｕｃｔｌｏｎ　　ａｎｄ　
　ｅｈａｒａｅｔ＠ｒｌｚａｔｌｏｎ　　ｏｆｎ＠ｗ　
ｃｌｏｎｉｔｉｇ　ｖ＊ｈｉｏｌ＊ｓ）、ＩＩ　ｅ多目
的クローニング系（Ａｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｔ＠ａｌｏ
ｎｉｍｇ　ｓｙｓｔｅｍ）、遺伝子（Ｇ＠ｎｅ）２：９
５−１１３）。形質転換後、これらの抵抗性雌グラスミ
ドの存在の検出またはそれらの組み換えに便利である。

２、テトラサイクリンおよびクロランフェニコールに対
して抵抗性の遺伝子を含有する４　、　３ｋｂのｐＡＣ
Ｙ（ｊ８４　Ａ７’ラスミド〔チャンク（Ｃｈａｎｇ）
。

Ａ、Ｃ，Ｙ、　、およびコヘン（Ｃｏｈｅｎ）、　Ｓ、
Ｎ、、　　１９７８：Ｐ１５Ａクリ！チック・グラスミ
ドから誘導される増Ｉｌｌ　可能ｔｘマルチコヒー　Ｄ
ＮＡクローニング・ビヒクルの構成および特性づけ（Ｃ
ｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉ
ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｐＨｆｌａｂｌ＠ｍｕｌｔｌ
−ｃｏｐｙ　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｌｎｇ　ｖ＠ｈｉｃｌｅ
ｓ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍｔｈ＠Ｐ１５Ａ　ｃｒｙ
ｐｔｉａ　ｍＩｎｊｐｌａｓｍｌｄ）、ジャーナル・オ
プ・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１）　
１３４：１１４１−１１５６）。

［１，／？クテリオファージの技術 上として、ミラー（Ｍｉｌｌ＠ｒ）　（１ｏｅ、ｃｌユ
１）が記載する技術を用いたが、ただしにトリ皿の培地
はＴであり、そして液体培地はＦＴであった。

■、バクテリアＤＮＡのｌＩｇ！製 マルマー（Ｍａ　ｒｍｕ　ｒ　）の方法ヲ用いり〔マル
マー（Ｍａｒｍｕｒ）、Ｊ、　　１９６１：微生物から
のｒオキシリボ核酸の単離のための手順（Ａ　ｐｒｏｃ
ｓｄｕｒｅ　ｆｏｒｔｈｅ　　１ｓｏｌａｔｌｏｎ　　
ｏｆ　　ｄｅｏｘｙｒｌｂｏｎｕｅｌ＠ｉｅ　　ａｅｉ
ｄｆｒｏｍ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｌｍｍ）、ジャーナ
ル拳オグΦデ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ
１ｅｃ　、Ｂｌｏｌ　、　）旦：２０８−２１８）。

Ｖ、　　制限エンドヌクレアーゼの使用および源制限エ
ンドヌクレアーゼｉｌ−，ＢＲＬ、ニュー・イングラン
ド・バイオラボラトリーズ（ＮａＷ　ＥｎｇｌａｎｄＢ
ｉｏｌｍｂｍ）、ペーリンが−（Ｂｏ＠ｈｒｉｎｇｅｒ
）およびア−ｒ　−ジャム（Ａｍ・ｒｓｈａｍ）から購
入した。このような酵素によるＤＮＡの消化はニュー・
エングランド・バイオツボラドリーズのカタログ（１９
８２）の示唆に従りたが、ただし１００μＩ〜のゼラチ
ンをすべての場合においてウシ血清アルブミンの代わ夛
に使用した。ＤＮＡ濃度は２μＩ／２０μｔを越えなか
った。

Ａ、アゴロース・グル １、２Ｉのアがロース〔シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍｍ　）の
カタログＩ６Ａ　６０１３）。

２．２００ｍ／のＴＡＩＣ緩衝液（Ｉ　Ｘ　）　：　Ｔ
ＡＥ緩衝液１０Ｘ：（ａ）４８．４ＩＩのシダｆｆ７−
９）リス（Ｔｒｉｍ）（ヒドロキシメチルアミノメタン
）カタログＡＴ１３７８（）リスＨＣ４）　：　（ｂ）
　２７．２　Ｆの酢酸ナトリウム：（ｃ）１０．５ＪＰ
のＮａＣｔ：　（ｄ）　７．５　ｊ’のジナトリウムエ
チレンジアミノ四酢酸；（・）１７！／の濃ＨＣ１；（
ｒ）ｃ＋　２５１／のＨ２０蒸留：　（ｇ）ｐＨ８，２
％２５℃；中ＤＮＡの各試料（１〜２０ｔ）に、グリセ
ロール中のブロモフェノールの４μｔを加えた。

（１１）とのグルを緩衝液のもとに４０〜２５０　ｍＡ
において、色素が適当な距離走行するまで、展開させた
。

３、必要に応じて、λａ１８５７　Ｓ７　ＤＮＡを制限
エンドヌクレアーゼ現μｍはたは狗ヱＲＩで切断し。

そして分子サイズの標準として使用した。退行（ｒｅｇ
ｒｅｓｓｉｏｎ）の分析を用いて１分子の長さのｌｏｇ
と移動距離の間の関係を確立した。相関関係の係数がγ
＝０．９９よシ大きいとき、標準は許容されうると考え
た。

４、ゲルをグラスチックのトレーに入れ、十分な水でそ
れらをおおうことによって、グルを着色させた。１０　
ｑ／ｍの濃度で臭化エチジウム（シグマＥ８７５１　）
の７滴を加え、そしてノ母ンをおだやかに傾斜させるこ
とによって分散させた。１５分後、過剰の色素を吸引に
より除去し、グルを水ですすぎ１色素を含まない水で再
びおおった。

１５分後、水を除去し、モしてグルを長波長のＵＶ先光
ボックス上置くことによってＤＮＡを可視化した。コダ
ックのトライＸパン・！ロフェッシ１ナルフィルムで写
真撮影する。

■　結合 制限エンドヌクレアーゼによジ消化されたＤＮＡを、０
，１体積の３Ｎの酢酸ナトリウムおよび２．２体積の蒸
留した９６チエタノールの添加により沈殿させた。ドラ
イアイス−エタノール浴中に一７０℃で凍結させた後、
エラ被ンドル７′Ｗヲエッベンドルフ遠心機により工０
分間遠心し、上澄みを注意して取り出し、廃棄し、沈殿
物を１００μｔの７０チのエタノールで洗浄し、３分間
遠心し、上澄みを取り出し、廃棄し、そして沈殿物を１
０分間デシケータ−内で真空乾燥した。乾燥したベンツ
トを水中に再懸濁させた。

結合は４μｔの５倍濃度のキナーゼ−リンカ−（ｌｉｎ
ｋｓｒ）緩衝液（Ｍａｎｌａｔｉｓ　ｅｔ旦、Ａｏｅ、
ｃｉｔ−）および１μｔのＤＮＡりが−ゼにニュー・イ
ングランド・バイオラボラトリーズ・、カタログｌ６２
０２：４００単位／Ｉ！／）を含有する２０１中で２５
℃において１２〜１６時間実施した。このＤＮＡ濃度は
通常０．５〜１．０μみ今Ｏμを反応であった。

■、グラスミドＤＮＡの調製 Ａ、小さい体積からの粗製グラスミドＤＮＡの調製 １、　　グラスきドを含有するバクテリアの株を、抗生
物質を含有するＬＢ媒媒中中３７℃において一夜生長さ
せ、この抗生物質に対する抵抗を！ラスミドが与えるの
で、特定の！ラスミドをもつ・寸クチリアのみが再生産
される。

２．１１Ｌ／の細胞懸濁液を工、−ｅンドルフ遠心機に
より２０分間遠心する。

３、上澄みを廃棄し、そして細胞の沈殿物を５０　ｐｌ
のｓ’ｒｇ’ｒ緩衝液（８チのスクロース、５チのトリ
トン−１００，５０ミリモルのニナトリウムエチレンジ
アξン西酢酸、５０ミリモルのトリス（ヒドロキシメチ
ルアミノメタン）　−ＨＣｌ。

ｐＨ８，（１）中に再懸濁させる。

４．４ｐＬの１０Ｍｖ／Ｍｌノリソチーム（シグマ・カ
タログＡＬ６８７６）を加える。

５、　この懸濁液を沸とう水中に４０秒間沈める。

６　この懸濁液をエッベンドルフ遠心機５４１２型で２
０分間直ちに遠心する。

７、上澄みを注意して新しい管Ｋ］＠！ｌ）出し、沈殿
物を廃棄する。

８、５０μｔのイソゾロツクノールを加え、内容物を混
合する。管を一７０℃において１０分間エタノール−ド
ライアイス浴中に入れる。

９、　この管をエッペンドルフ遠心機で１０分間遠心す
る。

１０　　上澄みを取り出し、廃棄する。沈殿物を５分間
真空乾燥する。

１１、沈殿物を５０μｔの０．３モルの酢酸ナトリウム
で再懸濁する。

１２．１５０μｔの蒸留エタノールを加え、内容物を混
合し、そしてこの管を一７０℃においてエタノール−ド
ライアイス浴中に１０分間入れる。

１３、この管を１０分間遠心し、上澄みを注意して取り
出し、廃棄する。

１４、　沈殿物を２００μｔの冷（−２０℃）の７０チ
エタノールの添加により沈殿を乱さないようにして洗浄
する。

１５、この管を２分間遠心し、上澄みを取り出し。

廃棄し、そして沈殿物を１０分間真空乾燥する。

１６、沈殿物を２０μｔのＨ２Ｏで再懸濁する。

１７、ホとんどのグラスばドについて、約１μｍの純粋
なプラスミドＤＮＡが回収される。

Ｂ、塩化セシウム−臭化エチノウム平衡密度勾配遠心に
よる、高度に純粋なプラスミドＤＮＡの調製 １、適当な抗生物質を含むＬＢ媒地中で１ｔの培讐物音
１２〜１６時間生長させ、これにより特定のプラスミド
を含有するバクテリアのみを増殖させる。

２．４本の２５０ｄの遠心びん中で冷却しかつＯＣにお
いて１０分間５ｏｏｏｘｙで遠心する。

上澄みを廃棄する。

３、沈殿物を１ミリモルのエチレン・シアミン四酢酸（
ＥＤＴＡ　）を含有する２ｏｄのトリス−ＨＣｔ緩衝液
ｐＨ７，９，２５ミリモルで洗浄する。

４、５０ミリモルのトリス−ＨＣｊｐＨ８，０中で構成
した２５％のスクロースの７，３ｄ中に各沈殿物を再懸
濁させ、そして各沈殿物を４０−のポリエチレン管〔オ
ーク・リッジ（Ｏａｋ　Ｒｌｄｇ・）型〕へ移す。

ｓ、　　１．　ｓ　ｘｉのりソチーム（シグマのカタロ
グＡＬ６８７６）を加える。このリソチームを新しく５
１１９／Ｒ１で０．２５モルのトリス−ＨＣｌ、ＰＩ−
１８，０でつくる。混合し、０℃において５分間保持す
る。

ａａｍ／の０．２５モルのＮａ　ＥＤＴＡＳｐ　８．０
を加える。混合し、０℃に５分間保持する。

７、室温に加温し、ＩＩＩ／のラウリル硫酸ナトリウム
（ＳＯ８）溶液（５０ミリモルのトリス−ＨＣｔ、ＰＨ
８，（１）を加える。倒立によりおだやかに混合し、１
５分間保持する。

８．０℃に冷却し、２．５−の５モルのＮａＣＬを加え
る。倒立によりおだやかに混合し、０℃に３０分間保持
する。

９、　４３，０００＃（ソーパル（Ｓｏｒｖａｌ）ＳＳ
−３４０−ター内で１９．００Ｏｒｐｍ）で−４℃にお
いて４５分間遠心する。

１０．４つの上澄み（各々約１２１Ｌ／）を４０１／の
ポリゾロピレン管中にデカンテーションする。沈殿物を
廃棄する。等体積の水で希釈する。

１１、　　ＤＮＡａｓａ活性をＴＬ緩衝液中で８０℃に
２０分間加熱することによ勺不活性化した後、各５０μ
ｔのＲＮＡａ　ｓ　ｅＡ　１０１ｎｆ／／ＩＩ／（シグ
マのカタログ４Ｒ５５０３）を各管に加える。ＴＬ緩衝
液は次の通りである：１０１０モルのＭｇＳＯ４，０，
５ミリモルのＣａ　Ｃ１２，０，１チのゼラチン、６ミ
リモルのトリス−ＨＣｌ、　ＰＨ８−０１１３７℃に１
時間保持する。

１２、冷却し、そしてＳＴＥ緩衝液で飽和させたフェノ
ールの４ｍ／を加える。８ＴＥ緩衝液は１０ミリモルの
トリス−ＨＣ１％ｐｉ（７，９，１０ミリモルの穐Ｕ１
ミリモルのＥＤＴＡである。よく混合し、１６．０００
ｇで０℃において１５分間遠心する。

１３、各管から上層（水相）を注意して単一の２５０ｄ
容の遠心びんに入れる。４分の１体積の５ミリモルのＮ
ｈＣ！、を加え、混合する。混合物の合計の体積の２倍
の量のエタノールを加える。混合する。−２０℃に少な
くとも１２時間保持する。

１４、　９００　Ｏｒｐｍで４５分間遠心する。上澄み
を取り出し、廃棄する。５０′ＩＬｌの７０％エタノー
ルを加え、沈殿をおだやかに洗浄する。９０００ｒｐｒ
ｎで２０分間回転する。上澄みを取り出し、廃棄する。

沈殿物を排出し、次いでそれを１５分間真空乾燥する。

沈殿物を５ｍ／のＳＴＥ緩衝液中に再懸濁させる。

１５、　　このＤＮＡ含有溶液をＳＴＥで４６．２１Ｌ
Ｌ／にする。

４５ＩのＣ５Ｃｔを加える。ｌ、ｇ＋ａ／の臭化エチジ
ウム（シグマ、カタログ扁Ｅ８７５１）を１　ｒ）ｒｎ
ｇ／ｍｌで５ＴＩＣ緩衝液の溶液として加える。この溶
液をその屈折率ｒ、が１．３８７０〜１．３８８０（ρ
＝１．５６５〜１．５７６）の間にあるように調節する
。

１６、この混合物の１０１Ｌｌを６本の７．６２鋸×４
、７６　ｃｍ　（３Ｘ　５／８インチ）の４リアロマー
管中へ−にットで入れる。管にふたをし、ノｆラフイン
油を満たし、Ｔｉ５０ｅｌ−ター内で３８．００　Ｏｒ
ｐｍで１５℃において４８時間遠心する。

１７．２．５４備（１インチ）の２０ゲーゾの針および
３ｄの注射器を用いて、下の帯（ＵＶラングで見る）を
取り出す。臭化エチジウムを畔体積のイソ！口／ぐノー
ルで４回抽出する（　ＣｓＣ１飽和ＳＴＥ緩衝液状に原
液を保持する）。

１８、別の水溶液を４体積の水で希釈し、２回合計の体
積の２倍量のエタノール（９６％）を加える。遠心を４
０１７のポリグロピレン管中で１９．００Ｏｒｐｍおよ
び一４０℃において１時間行う。上澄みをデカンテーシ
ョンし、廃棄する。管を排出し、次いで１５分間真空乾
燥する。このＤＮＡをｌｉｔ／のＳＴＥ緩衝液中に再懸
濁させる。

■、形質転換〔Ｍ、マンデル（Ｍａｎｄｅｌ）およびＡ
。

ヒガ（Ｈｌｇｍ）、１９７０：カルシウム依存性バクテ
リオファージＤＮＡの感染（Ｃａｌｃｉｕｍ　ｄｅｐｅ
ｎｄ＠ｎｔｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　ＤＮＡ　１ｎ
ｆｅｃｔｉｏｎ）、ジャーナル砿オプ・ｉレキュラー・
バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ。

Ｂｉｏｌ１）５３：１５９−１６２）。

形質転換すべきバクテリアの株をＬＢ媒地中で３７℃に
おいて一夜生長させる。それを１：２００に新しいＬＢ
中に希釈し、６００　ｎＭｌｃおけるその吸収人が０．
５であるまで３７℃において通気しながら生長させる。

培養物（もとの体積）を氷で冷却し、ベックマン遠心機
内で７００　Ｏｒｐｍおよび０℃において７分間ＪＡ２
０ローター中で遠心する。細胞を同じ体積の水冷０．１
モルのＭｇＣｌ２中に再懸濁させ、そして前のように遠
心する。細胞の沈殿物をもとの体積の半分の０．１モル
のＣ＊　Ｃ１−２中に再懸濁させ、氷上に３０分間保持
する。この懸濁液を前のように遠心し、もとの体積の１
０分の１の０．１モルのＣａ　Ｃ６２中に再懸濁させる
。これらの細胞は形質転換について受容能力をもつ（Ｃ
ｏｍｐ＠ｔ＠ｎｔ）。

これらの濃Ｃａ　Ｃ１２処理細胞の０．２コの部分を、
０．１〜２μＩのＤＮＡを含有する１〜１００μｔの溶
液と混合する。この混合物を０℃に３０分間保持し、４
２℃に３分間水浴中で加熱し、再び氷上にさらに２０分
間配置する。次いで０．８　ｍ／のＬＢ培地を加え、そ
してこの培養物を３７℃に１時間本質的に抗生物質抵抗
性の発現をさせ、ここで細胞はカルシウム衝撃から回収
されて以来分割をしていない。培養物の一部をＬ　Ｂ　
ｎ　トＩＪ皿（適当な抗生物質を含有する）上に置く、
対照は未形質転換であるがＣｕ”＋処理された細胞と、
既知量の切シ離しされないグラスミドで形質転換された
細胞から成る。

ＩＸ、　　ｐＢＴＫ５の構成およびＭＭ　２９４　Ｅ、
ａｏｌｌへの形質転換ビブリオ・フィシエリ（ＶＩｂｒ
ｉＯｆｉｓｃｈｅｒｌ）株ＭＪＩからのＤＮＡ　（８Ａ
ｌ　）を、３０単位の制限エンドヌクレアーゼシリ１で
３７℃において３時間切シ離した。ＤＮＡ（６μｇ）の
グラスはドｐＢＲ３２２を同様に消化する。試料をアが
ロースダルの電気泳動によす検査して、消化がはｔ丁完
全になされたことを検査した。切り離されたＤＮＡを酢
酸ナトリウム−エタノールで沈殿させ、そして乾燥した
沈殿物をＨ２Ｏ中に再懸濁させた。２μＩのＶ、　ｆｓ
ｅｈｅｒｉのＤＮＡを０．５１のｐＢＲ３２２のＤＮＡ
Ｋ４００単位のＤＮＡリガーゼを用いて結合させた。

反応を２００μｔのＨ２Ｏおよび４０μｔのｓ’ｒｇ飽
和−フェノールの添加により停止させた。この混合物を
攪拌し、遠心分離した。上澄みを酢酸ナトリウム−エタ
ノールで沈殿させ、そして結合されたＤＮＡの沈殿物を
４０μｔのＨ２Ｏ中に再懸濁させた。

株ＭＭ２９４を生長させ、そして形質転換のために調製
した。対照は１　ｔｔｌのＰＢＲ３２２ＤＮＡ（１ｏ　
ｃ　。

ａｌｔ）を含有した。形質転換後、細胞をアン−シリン
を含有するＬＢペトリ皿上で平板培養した。

ＤＮＡを加えない細胞はコロニーを与えなかった。

２．６４Ｘ１０形質転換体／μ、Ｐ　ｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａが対照の形質転換において得られた。結合した混合物
紘３．２Ｘ１０’形質転換コロニ一／μｇバクテリアＤ
ＮＡを与え、そして６×１０　の合計の形質転換体が得
られた。テトラサイクリン抵抗性遺伝子のそう人工活性
化（旦り１部位がこの遺伝子中に存在するので、異質Ｄ
ＮＡのそう入はこの遺伝子を不活性化する）Ｋついて検
査することにより、これらの形質転換体の約５チはＶ、
　ｆｌｓｃｈａｒｌのＤＮＡのインサー　ト（ｉｎｓｅ
ｒｔ）を含有することがわかった。こうして、約３００
０のインサートが得られた。コロニーのり７つは発光性
であった。

これらの７コロニーが含有するＤＮＡを分析した後、は
ぼ８Ｋｂの単一のインサートおよび２つのＳａｌ　Ｉ部
位を有する！ラスミド（ｐＢＴＫ５）を含有する１つの
株を選択した。これらの結果はエンダブレヒト（Ｅｎｇ
ｅｂｒ＊ｅｈｔ）ら（１ｏｃ、ｅｉｔ１）が前に記載し
たものと一致する。

Ｘ、　　ｐＡＣｈｖ−１の構成およびＭＭ　２９４　Ｅ
−Ｃｏ口への形質転換 上の■に従って得られたこの！ラスミドを含有するＭＭ
２９４株からのＣ暮ＣＬ−臭化エチジウム精製グラスき
ドを、制限エンドヌクレアーゼ炙り■で消化し、そして
一部分を７がロースダルの電気泳動により検査した。同
様に調製したｐＡｃＹｃ１８４グラスミドＤＮＡを、上
のように且りＩＫよシ切シ離し、分析した。結合および
ＭＭ２９４Ｅ、ｃｏｌｉ細胞への形質転換後、クロラン
フェニコールに対する抵抗性（ＰＡＣＹＣ１８４）をも
ちかつ光を与える（３０℃）コロニーを標準法により分
析した。

ｐＡｃＹｃ１８４の主鎖を有しかつｐＡｃＹｃ１８４の
Ｓａｌ　Ｉ部位中にそう入された８Ｋｂの光生成セグメ
ントを有する！ラスミド（ｐＡＣｈｖ−１）を含有する
株を保持し、そして永久の受託物に配置した（ＡＴＣＣ
５３１３３）。

Ｘ、λＬｌ、λＬ４．λＬ５．λＬ２８．λＬ３２゜λ
Ｌ３５およびλＬ４０の構成 マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｍ）（１ｏｅ、ｃｉｔ）Ｉ
ｃ記載されるようにして精製したバクテリオファーソλ
チャｏ　ｙ　（Ｃｈａｒｏｎ）３０　ＤＮＡ（０，３，
Ｊ’）を制限エンドヌクレアーゼ見りＩで切夛離し、上
の■に従って得られたｐＢＴＫ　５　ＤＮＡ　（０，５
μＩＩ）へ結合した。結合後、ＤＮＡを酢酸ナトリウム
−エタノールにより沈殿させ、沈殿物を乾燥させ、５μ
ｔのＨ２Ｏ中に再懸濁させ九。

ＤＮＡを包む（ｐａｃｋａｇ・）混合物を、マニアテス
（Ｍａｗｒｉａｔｌｍ）（１ｏｃ、ａｌｔ）中に記載さ
れるＢ、ホーン（Ｈｏ　ｈ　ｎ　）の方法により調製し
た。結合されたＤＮＡの包みを−ｒニアチス（Ｍａｎｉ
ａｔｌｇ）（１ｏａ、ｅｉｔ１）のグロトコール（ｐｒ
ｏｔｏｃｏｌ）に従い実施し、そしてＦＴ媒地中で静止
相に生長したＭＭ２９４とともに平板培養した。！ラー
ジを１１１ＬｌｏＦＴ媒地、ＦＴ媒地上で生長させた０
、１−のＭＭ２９４を含有するシンチレーション・バイ
アルに移すことにより、グラークを光の生成について検
査した。個個のゾラークはツクスツール・ビペッ）　テ
１１１／（７）１０４９モルのＭｇＳＯ４に移してあっ
た。この０．１ゴをバイアルに移した。

光を与えるファージを２回ノラーク精製し、ペトリ皿の
リゼートをつくシ、そしてファージの調製物を数滴のク
ロロホルムの存在下に針鼠した。

次いでこれらのファージを％２７℃においてＦＴ培地中
で生長する株ＭＭ２９４の感染の間、光の生成について
特性づけた。自己誘導体を反復実験のバイアルに加えた
〔ネアルソン（Ｎ・ａｌｍｏｎ）、Ｋ。

Ｈ，、ｆう、　）　（ｐｔａｔｔ）、’ｒ、およびハス
チング（Ｈａｇｔｉｎｇｓ）、Ｊ、Ｗ、１９７０　＋バ
クテリアのルミネセンス系の合成の細胞制御および活性
（Ｃｅｌｌｕｌａｒｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈ＠５ｙ
ｎｔｈｅａ１ｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｌｔｙｏｆ　ｔｈ
＠ｂａａｔｓｒ１ａｌ　１ｕｍｌｎｅｍｅ＊ｎｔ　５ｙ
ｓｔ＠ｍ）　。

ジャ、−ナル・オツ・バクテリオロジー（Ｊ。

Ｂａｅｔｓｒｉｏｌ　、　）　１０４：３１３−３２２
　）。λＬ１．λＬ３５およびλＬ４０は他のものよ）
もかなシ遅くに時々光を生成し、生成される光は比較的
わずかであシ。

そして放射される光の量は、バクテリオファーソの感染
が自己誘導体の存在下に起こるとき、大きく増加する。

ファージ株λＬ４．λＬ５．λＬ２８およびλＬ３２は
感染後１５〜２０分以内に光を生成し、そして光射され
る光の量は時間とともに増加し、そして約１時間後に最
大に到達した。これらのファージにより生成される光の
量への自己誘導体の有意の影響は存在しなかった。

光遺伝子を含有する断片は制限エンドヌクレア−セ５Ｏ
ＩＩの消化物からクローニングされているので、同じ酵
素で消化されたλチャロン（Ｃｈａｒｏｎ）３０中への
この断片のそう人は２つの異る配向で起こシうる。１つ
の配向において、ルシフェラーゼおよびアルデヒド遺伝
子（Ｅｎｇｖｂｒ＊ｅｈｔ　ｏｐ、ｅｌｔ１）紘λのＮ
遺伝子に近接し、一方ル、クス・オペロン（ｌｕｘ　ｏ
ｐ＠ｒｏｎ）の調節遺伝子はλのＪ遺伝子に近接する。

この配向において、転写の方向はλのＰ、ブロモ−ター
のそれに対して反対であるので、アルデヒドおよびルシ
フェラーゼ遺伝子の転写はルックス・ブロモ−ターのみ
からの転写に依存するであろう。この場合において、自
己誘導体は光の生成を刺激し、事実刺激する。λＬｌ、
λＬ３５およびλＬ４０は、それらの光の放射が自己誘
導体により大きく刺激されるので、この配向のインサー
トをもつファージである可能性が最も強い。

第２の可能な配向け、λのＮ遺伝子付近にル。

クス・オペロンの調節遺伝子をもつかつＪ遺伝子付近に
アルデヒドおよびルシフェラーゼの遺伝子を有する。ア
ルデヒドおよびルシフェラーゼの遺伝子の転写方向はλ
のＰＬゾロモーターのそれと同一であるので、これらの
遺伝子はそれら自身のブロモ−ターからげかりでなく、
またＰＬからさえそのように転写されるであろう。こう
して、これらの種類のファージにより感染されたバクテ
リアの培養物への自己誘導体の添加は、光の生成にほと
んどまたはまりたく影響を及ぼすことはなく、事実そう
であろう。

これらのファージの２つλＬ４およびλＬ２８を特性づ
け、そしてそれらのインサートの配向け、上の生理学的
観察および理論的考察に基づいて期待されるものである
ことがわかった。λＬ４およびλＬ２８からのファージ
ＤＮＡをマニアチス（Ｍａｎｌａｔｉｍ）　（ｃｐ、　
　ｃｌｔ）に記載されるようＫして、ＣｓＣ１勾配精製
フアーノをＤＮＡ源として用いて調製し九。

制限エンドヌクレアーゼＳ魯ＩＩによるこれらのＤＮＡ
の消化社、アガロースゲル中の電気泳動後。

３つの大きい断片を明らかＫした。２つの大きい帯はフ
ァージの伸長（ｐｒ−ｏｐａｇｍｔｉｏｎ）に必要であ
るλチャ党ン（Ｃｈａｒｏｌｌ）　３０のアームである
。約８．８キロ塩基の最小の帯性、同−酵素で切断した
ｐＢＴＫ５からの帯と同一である。ζつして、両者の７
アージ中のそう人されたＤＮＡ片は、ビブリオ・フィシ
エリ（ＶＩＭｉｏ　ｆｉｇｅｈ＊ｒｌ）から本来クロー
ニングされた片と同一であるように思われるＯλＬ４お
よびλＬ２８中のインサートの配向は、ＰｍｔＩを用い
る制限エンドヌクレアーゼにより示された。

λチャロン（Ｃｈａｒｏｍ）　３０は雌ぼ塩基対２３６
１６まで正常の入配列を有し〔ヘンドリツクス（Ｈａｎ
ｄｒｉｘ）　Ｒ，Ｗ、、ロパーツ（Ｒｏｂ＠ｒｔｓ）、
　ｔｒ、ｗ、１スタール（Ｓｔａｈｌ）　、　Ｆ、Ｗ、
およびウエスノ櫂−グ（Ｗｓｌｓｂｅｒｇ）、Ｒ，Ａ、
　ｌ　９８３　ニラムダ（Ｌａｍｂｄａ）１１、コール
ド・スゲリング・ノー−パーラボラトリー（Ｃｏｌｄ　
Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ′ａｂｏｒａｔｏｒｙ
）　＊コールド・スゲリング・ノ１−パー、二、−ヨー
ｐ：付録■、５１９−６７６−１’−ジ〕次いでほは塩
基対２３６１６〜２８３１２から伸びる欠失ｂ１００７
を有する。塩基２８３１２から塩基３４４４９まで。

配列を再び正常である。塩基３４４９において、初めの
配列はそれ自体反復し、そしてこの反復は塩基対２２３
４６で開始する。この反復社塩基対２３６１６１で続き
、次いで塩基対２８３１２まで欠失する（ｂ１００７）
。この塩基対で開始し、正常の配列はほぼ塩基対３５３
８４まで続き、この点で第２の異子型の欠失ＫＨ５４が
開始し、そして塩基対３７９２５までＤＮＡを除去する
。次いで正常の配列けはぼ塩基対４０５０２まで続き、
この点において第３種類の欠失（ｔ＋１ｎ５）は塩基対
４３３０７までＤＮＡを除去する。この塩基対の後の配
列は塩基対４８５０２におけるＤＮＡ末端まで正常であ
る（これらの番号は正常のバクテリオファージλの正常
の塩基対の配位として与えである；第９図参照）こうし
てλチャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　３０は１複製および４
欠失、それらの２つは同一である、を含む。λチャロン
（Ｃｈａｒｏｎ）　３０における種々の制限エンドヌク
レアーゼ切シ離し部位についての配位（第１０図参照）
はベンドリックス（Ｈｅｎｄｒｌｘ）（ｃｐ、ｃｌｔ１
）の付録ｍに記載されている。それらけファージスチャ
ロン（Ｃｈａｒｏｎ）　３０が４６７５７塩基対である
ことを推定する。刊行されたデータから、このファージ
は４６３３１塩基対であると思われる。本発明の目的に
対して、この相違は重要ではない。

以下舎内 λチャロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　３０におけるうり■の
切シ離から得られる制限酵素の断片のＩ４ターンは。

上に提供されたそのＤＮＡの散開から計算できる。

内部の５ａｌｌ断片を除去しかつルックス・オペロン句
り■断片をそう人し九後、このノ苧ターけもちろん変更
される。塩基対２２４２５１でのＰａｔ　１部位は正常
のλおよびλチャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　３０と同一で
ある。４８８８塩基対のλチャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　
３０中において２２４２５および３２００９における部
位の間のセグメントにより発生された断片が存在するで
あろう（４６９６塩基対を除去する欠失ｂ１００７を含
有する）。この断片はまたここに記載する「ルミネセン
ス」７アージにおいて生ずるであろう。しかしながら。

ＤＮＡインサートは塩基対２２４２５と末端との間のＩ
４ターンを変更するであろう（正常のλ配位）。

λチャロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　３０から内部のシ１■
断片を除去した後、塩基対３７００５におけるｂｌ■部
位がλチャロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　３０においてＫＨ
５４欠失によ〕欠失されているので、塩基対３２２５６
（残る最末端のｔす■部位）およびこのファージの末端
からのλＤＮム中ＫＰ＋す１部位ハ存在しないであろう
、ルックス・オペロンを含有するりすＩ断片中に１つの
Ｐａｔ　１部位が存在し、そしてそれは１つの端（末端
から約２００ｂｐ）に非常に接近してかつオペロンの調
節区域に位置する。

こうして、ルックス・オペロンのＰａｔ　ＩＩＢ位カλ
中に最後の乙り■部位に近接して存在するとき、Ｐｓｔ
　Ｉの切り離しは約７００塩基対の小さい断片と約１８
〜１９中口塩基の大きい断片とを生成するであろう。こ
れはλＬｌ、λＬ３５およびλ４０について期待される
切夛離しの／ｆ！−ンであろう。逆に、ルックス断片の
Ｐｓｔ　１部位がλの末端に向いている場合、はぼ等し
い大きさく約９および１１キロ塩基）の２つの断片が生
ずるであろう。λＬ４およびλＬ　２８　ＤＮＡの切シ
離しは後者のノやターンを与た。これは、ルックス・オ
ペロンのルシフェラーゼおよびアルデヒドの遺伝子がλ
の近接端に向いて位置しかつＰＬプロモーターからの転
写と同じ転写配向を有するという本発明における仮説と
一致する。

λＬ４およびλＬ２ｇの構造について生ずる最後の問題
は、ファージとインサー）　ＤＮＡとの間のそれらの８
ａｌ　１機能を取り扱わなくてはならない。

λチャロン（Ｃｈａｒｏｍ）　３０は４つのシリ１部位
を有する０部位の各対の内において、部位はわずかに４
９９塩基対により分離されているが、対間の距離は７０
００塩基対に近い。λチャロン（Ｃｈａｒｏｅ　）　３
０をベクターとして使用しかつ８ａｌ　Ｉ制限エンドヌ
クレアーぜで切り離してλＬ４およびλＬ２８ｔ−発生
させると、対間の断片はルックス・オーｅｃ！ン断片に
よ多置換されるであろう。

それほど明瞭ないことは、組み換えファージが２゜３ま
たは４つの８ａｌ　Ｉ部位を含有するかどうかである。

２つのみが存在する場合、ルックス・オペロンとλＤＮ
Ａとの間の接合はλの最も近接しかつ命も末端のＳａｔ
　Ｉ部位であった。４つの８ａｌ　１部位が存在すると
、ルックス断片はλチャロン（Ｃｈｍｒｏｍ　）　３０
０２つの最内部の呵１部位へ接合される。３つの吃り１
部位は、１対のＳａｌ　１部位がη「おインサートの一
方の端に存在しかっｌのす１部が他方の端に存在するこ
とを示す。

λチａ（ロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　３０の７ｋｂ（キロ
塩基）の内部の断片は常に存在しなくてはならない。

なぜなら、存在しない場合、ルックス・オペロンの付加
はノリケージ（ｐａｅｋａｇ・）するためには長過ぎる
ファージＤＮＡ分子に導びくであろうからである。

３または４つのＳａｌ　１部位が残るとき生成される小
さい（４９９塩基対）断片はグル上に見ることができる
が、各対は同じ大きさの断片を与えるので、３または４
つの部位のいずれが存在するがを決定することができな
い。この問題の解決は、制限エンドヌクレアーゼ５ｃａ
ｌＫよる切）離しＫよ）提供される。なぜなら、Ｓｅａ
　ＩけλＤＮＡを１対の２つの８Ｌ１１部位の間で切シ
離すからである。こうして、シ堕１部位の一方または双
方が消失するとき１組み換えλ中には対は存在しないか
あるいは１対が残る。ルックス・オペロン中ＫＢｅ＠　
ｌけ存在しなり、シ３■の野性型λを部位１６４２０．
１８６８３．２５６８４．２７２６２および３２８０１
塩基対において切〕離す。λチャロン（Ｃｈａｒｏｍ　
）　３０　において、１６４２０および１８６８３１Ｃ
おける部位は存在するが、２５６８４および２７２６２
における部位は欠失されている。

３２８０１部位はλチャロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　３０
において２回生ずる。なぜなら、λ野性型中には単一対
よシはむしろ２対のシ」！部位が存在するからである。

λチャロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　３０　において、１６
４２０および１８６８３におけるものに加えて、塩基対
２８３９１および塩基対３５８１９にＳｅａ　１部位が
存在する。λチャロン（Ｃｈａｒｏｍ）３０け、−■消
化後１６４２０，２２６３．９７０８．７４２８および
１０９３８塩基対の断片を与える。ルックス・オペロン
および残留する２つのみのＳｅａ　ｒ部位を有する組み
換えファージけ、引１■消化後％１６４２０．２２６３
および１つの約２８０００塩基対の断片を与えるであろ
う０．３つの８ａｌ　ｌの存在は、なお残留する８ａｌ
　ｌの対がそれぞれ近接するかあるいは末端に存在する
かどうかに依存して、Ｓａｔ　Ｉ消化後、１６４２０　
。

２２６３．９７０８およびほげ１９０００塩基対Ｑ）　
ｔ４．７１−ｙ、あるいＦｉ１６４２０．２２６３．は
ぼ１８５００および１０９３８塩基対（Ｄｔ４１−ｙを
与えるてあろう。両方の対のむユ■の存在は、引ツ夏切
〕離し後、１６４２０．２２６３゜９７０８％はぼ９３
００および１０９３８塩基対の断片を生ずるであろう。

１ｔａｆエンドヌクレアー−ｋ”による分析の結果は、
λＬ４が４つの自己！部位を含有し、一方λＬ２８が３
つを含有することを示す１．λＬ２８は近接対ノ８ａ１
１部位およびλチャｏ　７　（Ｃｈａｒｏｎ　）　３０
から濃も末端の」０１部位を保持する。λ野性型、λチ
ャロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　３０　、λＬ４およびλ２
８のこの構造は、それぞれ第９図　第１０図訃よび第１
２図に線図的に示されている。

罵、ルミネセンスを転移できるＨｆｒの構成Ｈｆｒであ
るエシェリヒアコリ（Ｅｓａｈ＊ｒｌｔｈｌａｅｏ１１
）Ｋ１２株ＡＴ２４４６を、ルミネセンスのバクテリオ
ファージλＬ２８に対して洛原性（ｌｙｇｏｇｅｎｌａ
）とした。これはＡＴ２４４６ｔ−λＬ２８およびλａ
ｌ＋で同時に感染させることによって達成した。後者の
ファージは組み込み（ｌｎｔ＠ｇｒａｔｌｏｎ　）ａｔ
能５組み込みのためのλａｔｔ部位、および溶原化を許
する活性受容体遺伝子を提供す、るために必要である：
これらの３つのすべてけλＬ２８中において欠けている
。非溶原性細胞は、それ自体１原化できずかつ非番原体
を殺すλｅ　Ｉｂ２と前記細胞を引き続いて対抗（ａｈ
ａｌｌ＠ｎｇ・）させることによって排除した。

光を発し、四元による誘導後ファージを生産し。

そしてルミネセンス遺伝子を有する生存体（ａｕｒｖｌ
マｏｒｅ　）が単離された。

■、生物ルミネセンスの決定 シンチレーシ欝ン・バイアル中に入れ九アリコートの生
体外ルミネセンスを光増幅７オトメーーターｆｃよシ測
定した。このフォトメーターは１次の文献に記載される
ものに類似する：ミッチェル（Ｍｌｔｅｈ＠ｌｌ　）　
、　Ｇ、Ｗ、およびハスチングス（Ｈａ−口ｎｇａ）　
、　Ｊ、Ｗ、、ｌ　９７１　：安定な安価なソリッド・
ステート光増幅フォトメーター（Ａ　５ｔａｂｌｅ　１
ｎｅｘｐ＠ｎ５１ｖ＊　５ｏｌｉｄ　５ｔａｔ＠。

ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐＨ＊ｒ　ｐｈｏｔｏｍｅｔｖｒ
　）　、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａ
ｌ、Ｂｌｏａｈ＠ｍ１）３９：２４３−２５０．ルミネ
センスの強さが１０’　ｑｕａｎｔａ／ｓｅｅよシ低い
とき、２５℃における５Ｈ股定で一致しないで作動する
シンチレーシーンカウンター（）ｆツカード２００１型
）を使用した。ルミネセンスはハスチンゲスおよびウェ
ーバ−Ｃ＋＄４　（Ｈａｇｔｌｎｇｓ、Ｊ、Ｗ、、およ
びＱ、Ｗ畿り＠ｒ。

１９６３　：　Ｔｏｔａｌ　ｑｕａｎｔｕｎｘ　ｆｌｕ
ｘ　ｏｆ　ｌｓｏｔｏｐｌｅｍｏｕｒｃｖｓ、Ｊ、Ｏｐ
ｔ、Ａｍ費ｒ、５３：１４１０−１４１５）　ｔ−用い
ることＫよｌ）　ｑｕａｎｔａ／ｓｅｅで表わした。

ＸＰ／、　Ｖ、ｊｉｓｅｈ＊ｒｌ　ＭＪ−１からの自己
誘導体の［１１自己誘導体を含有する細胞不含条件的培
地を調装するために、　Ｖ、ｆｌｓｅｈ＠ｒｌ　Ｍ　Ｊ
　−１＃１１！を２２℃において振とうさせなからムｓ
ｗＲＰ液状培地中で生長させた。高度にルミネセンスで
ある後の対数相培養物〔８０〜１００クレツト（ｋｌ＊
ｔｔ　）単位、フィルター６６〕を１００００９および
４℃において１５分間遠心した。上澄み流体を、０．２
２μｍの孔サイズの膜フイルタ−（Ｍｌｌｌｌｐｏｒ・
Ｃｏｒｐ、Ｂ＠ｄｆｏｒｄ、Ｍａｉｍ　、　）の通過に
より滅菌した。

これらの調羨物を４℃において３０日間まで活性を損失
させないで、針鼠した。

Ｖ、ｆｌｓｅｈ＠ｒｌ自己誘導体についての検定は１次
の文献に記載される方法に従い実施した〔ネアルンン（
Ｎ＊ａ１ｍｏｎ　）　Ｋ、Ｈ，プラット（Ｐｌａｔｔ　
）＠Ｔ−＋およびハスチンゲス（Ｈａｇｔｌｎｇｉ　）
　、Ｊ、Ｗ、１９７０：バクテリアのルミネセンス系の
合成および活性の細胞の制御（Ｃ＠１ｌｕｌａｒ　ａｏ
ｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅｍｙｎｔｈ＊ｇｌｓ　ａｎｄ
　ａｅｔｌｖｌｔｙ　ｏｆ　ｔｈ＠ｂａａｔ＊ｒ１ｍ１
１ｕｍｌａ＠ｓａ＠ｎｔ　５ｙｓｔ＠ｍ　）ジャーナル
０オプ”パクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｅｔ＠ｒｌｏｌ　
）　１０４　：　３１３３２２Ｌ Ｘｖ、ベーターがラクトシダーゼの検定この検定けきラ
ー（Ｍ１１１＊ｒ　）（ｃｐ、ｅｆｔ１）　Ｋ従いクロ
ロホルムおよびＳＯＳ　（ラウリ４けトリウム）を用い
て実施して、細胞ｆｏ−二トロフェニルガラクトシド（
０ＮＰＧ　）　Ｋ対して透過性とした・■、寄託 必要なとき、本発明の構成体（すなわち、プラスミドお
よびバクテリオファージ）をアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクシ嘗ン（Ａｍ＠ｒｉｃａｎＴｙｐ＠Ｃｕ
１ｔｕｒ＠Ｃｏ１１＠ｅｔｌｏｎ　）　（ＡＴＣＣ）（
Ｒｏ＊ｋｖｉｌｌ＊　、　ＭＤ　２０８５２　、　Ｕ、
８．＾１）Ｋおける永久的寄託物に加えた。

３、特定の実施例 次の実施例により本発明をさらに説明する。これらの実
施例は、ここに詳述した発明の一般的な広い原理を明ら
かにすることのみを目的としたモデルとして考えるべき
であ）、そして本発明をいかなる方法においても限定す
るものではない。

実施例１ ファージλＬ２８を用いる形質導入によるエシェリヒア
・コリ（Ｅａｅｈ＠ｒｌｅｈｌａ　ｔｏｌｌ　）株Ｗ３
１１０の決定 Ｅ、１１６１１　Ｗ３１１０細胞を液状ＦＴ培地中で３
０℃の初期の対数生長相に生長させた。この培養物を１
０倍に希釈し、そして重複（ｄｕｐｌｉｅａｔ＊）１ｄ
の試料を無菌バイアルに移した。各バイアルに２５μノ
のλＬ２８．５　Ｘ　ｌ　ＯＰＦ’Ｕ／４／　（ＰＦＵ
−プラーク形成単位）を加えた。このλＬ２８（ＡＴＣ
ＣＡ４０１８３）は、Ｘ部の材料および方法において上
で説明したようにｐ４製した。バイアルｔ−２５℃にお
いてシンチレーシ冒ン・カウンター内でインキ轟ベージ
璽ンし、セしてルミネセンスを部ＸＩＩＩの材料および
方法において前述したように時間の関数として決定した
。第１図は、シｃｏｉｌ濃度の関数として６０分および
１２０分のイン中為ベージ璽ン後のルミネセンスｔ　示
ｆ。

実施例２ ファージλＬ４を用いる形質導入によるエシェリヒアψ
コリ（Ｅｓｅｈ＠ｒ１ｈｌａ　ｅｏｌｉ　）株Ｗ３１１
０の決定 Ｊ、ｅｏｌｉ細胞を液状ＦＴ培地中で生長させた。

培養物を生理的食塩水（１０９ｓｌ）中で希釈して、１
０１．１０’、１０’　ｊ？！　ヒ１０’　ｍＭＡ／１
ｌｆ）１１８８度にした。各試料の１００ｊｌ＋ｌ！を
０．４５ミクロンのミリＩア・フィルターでＰｌ過し、
そしてフィルターを面を上にして無菌のシンチレーシジ
ン・バイアルに入れた。各バイアルにλＬ４を７　Ｘ　
１０’ｐｐ’ｔｒ／ｓｌで含有する液状培地のｌ′ＩＬ
ｌを加え、このλＬ４けＸ部の材料および方法において
前述したように調製した。バイプルのルンネセンスを、
Ｘ１１部の材料および方法におりて前述し次ようにして
、２２℃において４０．６０および１００分間イン中エ
ベーシコンした後決定する。第２図は光の放射（ＣＰＭ
　）とＬｃｏｌｌ　＃ｌ胞との間の関係を示す。

実施例３ λａＩ　８５７ｐｌａｅ　５を用いるエシェリヒア・コ
リ（Ｅ＊＊ｈ＠ｒ１ｏｈ１ａ　ｅｏｌｌ　）株Ｃｌ８Ｈ
１の決定Ｅ、ｅｏｌ１株Ｃ３Ｈ１ｔｌＰＴ培地中で３７
℃において振とうさせながら生長させた。３７℃で２０
時間インキ１ベーシヨンした後％ＬＢベトリ皿上の生存
しうるものの計数により、１ｄあた夛の細胞の数を決定
する。対数生長する細胞ｔ−ＦＴ滅菌培地で２倍に希釈
した（２の希釈）、各バイアルＫ。

インプロピルチオガラクトシド（シグマのカメログ番号
１５５０２）を１００ミリモルの最終濃度に加え危、λ
ａｌ　８５７　　Ｓ　７　ｐｌａｅ　５バクテリオフア
ージを、１０　　デラクーク形成単位／−の最終濃度に
希釈し九。バイプルを３７℃において４５分子ｌＪ５イ
ンキ慕ベージ璽ンした０次いで２４のｚ緩衝液（Ｍｌｌ
ｌ＠ｒ、ｏｐ、ａｌｔ　）　ｆ加え、次いで０．１Ｒ１
のりｏｏホルＡおよび０．０５　ｄノＳＤＢ　（０，１
１）を加えた。バイアルの内容物ｆｄ？ルテックス（Ｖ
ｏｒｔ・ｘ）ミキサーの助けにより混合しく３０秒）、
次いで０．８ＭＪの０ＮＰＧ　（８〜／ｌｌ）を各パイ
フルに加え友。０ＮＰＧは０．１モルのリン酸ナトリウ
ム緩衝液中において構成した。バイアルを３７℃でわず
かに振動させながら６０分間インキ為ベージ雪ンし、そ
して２−のＮｍ２ＣＯａ　（１モル）の添加により停止
させた。発現された色をパウシａ　（Ｂａｔ＋ｓｈ　）
およびロム（Ｌｏｍｂ　）のスペクトセニツク（８ｐ＠
ｏｔｒｏｎｉａ　）　２０で４２０　ｎｍ　（ａ　−二
トロフェノールについて）そして細胞状物質により引き
起こされた濁〕度について５５０　ｎｍ　Ｋよシて決定
した。

第８図は、細Ｊｌｌ濃度の関数として酵素の検定により
決定した。ベーターガラクトシダーヤの形成量を示す。

実施例４ ｐＢＴＫ５　′に用いる形質転換によるエシェリヒア・
コリ（Ｅｍｅｈ＠ｒｌｈｌａ　ａｏｌｉ　）　Ｋ株ＭＭ
２９４の決定 ＴＸ部の材料および方法において前述したようく、ビブ
リオ・フィシエリ（Ｖｌｂｒｌｏ　ｆ１＊ｈ＠ｒｉ　）
のルミネセンス系断片訃よびプラスミドｐＢ８３２２か
ら組み換えＤＮＡ　ｐＢＴＫ　５をＩＩＩＩした。１μ
ノのｐＢＴＫ　５　ＤＮＡを用いて、０．２１１１のＣ
ａ　Ｃ１ｚ中において異る濃度のＥ、ｅｏｌＩ　Ｋ株Ｍ
Ｍ２９４を形質転換し友。形質転換後、ＸＦ／部の材料
および方法に従い調製した自己誘導体を含有する０、２
ｄのＬＢ培地およびＱ、８１ＪのＬＢＩ含有するシンチ
レーシ璽ン・バイアルに前記細胞を入れた。異るバイア
ル中の細胞濃度は１０　　、　１０　　、　１０　　お
よび１０　　細胞／ｄであった。第３図は４２１６１の
異る鎖度の！、セユ１細胞について光放射の動力学を示
し、そして第４図はこれらの実験における細胞濃度と光
放射の開始との間の関係を示す。パックグラウンドの光
放射は１０００　ｅｐｍであった・ 実施例５ 程々の抗生物質の存在下のエシェリヒア・コリ（Ｅｓａ
ｈ＠ｒｌｈｌａ　ｅｏｌｉ　）の決定形質転換を実施例
３におけるように実施し、そして形質転換されたバクテ
リアを引き続いて種々の抗生物質の存在下にインキ具ベ
ージ冒ンした。

アンピシリン（ＡＭＰ　）、３０μＰ　／ｍ　：クロラ
ンフェニコール（ｃａｐ）、１０．＃νＵ：カナマイシ
ン（ＫＡＮ　）、３０　ｔｔｆ７＊ｌ　訃よびテトラテ
ィクリン（Ｔ訂）、１０μｔ／ｗｃ、第５図は抗生物質
の存在下および不存在下のルンネセンスの動力学を示す
、パックグラウンドのカウント放射は１０００＠ｐｍで
あったＯ 実施例６ ｐＢＴＫ５　ＤＮＡ　ｆ用いる種々のバクテリアの形質
転換 実施例３におけるようにして、受容体として工シェリヒ
ア・コリ（Ｅｓｅｈ＠ｒ１ｅｈｌａ　ｏｏｌｌ　）ａＭ
Ｍ２９４、アエロバクチル・アエログネス（＾＊ｒｏｂ
ａｅｔ俊ｒ　ａ＠ｒｏｇ＊ｎｓｓ　）株６２−１．デロ
テウｘ−ブルガリス（Ｐｒｏｔ＠ｔｌｓ　ｖｕｌｇａｒ
ｌｍ　）およびスタフィロコックス・アルプス （８ｔａｐｈｙｌｏｅｏａｅｕｍ　ａｌｂｔ＋ｓ　）　
ｔ−用いて、形質転換を実施した。第６図は時間の関数
として放射された光のレベル（−ｐｍ　）を示し、この
図がら理解すｔＬ６！５に、　Ｅ、■旦のみが形質転換
されたが、残シの３ｍは影ＩＰを受けないままである。

実施例７ 接合によるエシェリヒア・コリ（Ｅ■ａｈ＠ｒｌａｈｌ
ａｅｏｌｉ　）株Ｗ３１１０の決定 ルミネセンス遺伝子を含有するＨｆｒＨ（高ｈｓ度の接
合）株を、Ｍ（材料および方法）Ｋ記載されるようにし
て構成した。この株をストレプトマイシン（２，５μ洟
）を含有するＬＢ培地中で３７℃において２時間生長さ
せた。細胞を１回洗浄し、ＬＢ培地中に希釈して１Ｉｋ
Ｎの細砲の密度を１０′細胞／ｍｌにした。この培養物
の１−のアワ；−トに、異る濃度の（非ルオセンス）　
Ｌａｏｌｉ株Ｗ３１１０細胞管加えた。この混合培養物
を振とうせずに３０分間イン中島ベージロンし、次いで
培ＩＩ　物ｔ　ＩＩＩ　りてシンチレーシーン争カウン
ターにより２４℃においてルミネセンスを決定した。第
７図は、異る濃度のＥ、ｅｏｌｌ　Ｗ　３１１０受容体
細胞の存在下に発生したルミネセンスを時間（時間ゼロ
から）の関数として示す。

実施例８ 外因性遺伝子の単離、クローニングおよび微生物宿主有
機体中への転移、および導入された供与体遺伝系の発現
を用いる受容体宿主の検出前述のように、ルシフェラー
ゼおよびβ−がラクトシダーゼに加えて別の酵素および
他の系を、本発明に従い検出の目的で宿主有機体に導入
することができる。この系または酵素は、その存在を容
易に決定できるもので、あるいはそれが独特でありかつ
確認すべき有機体中に存在しないためＫ。

選択することができる。前述のルシフェラーゼ系は両方
のこれらの価値を有し、そして本発明の好ましい実施ｇ
ａ！である。存在をある波長の光の吸収によ〕（例、ヘ
モグロビン）あるいは便利に決定される酵素（ＫＬＩ８
Ａ　）にまたは他の化合物、例えば、ビオチンに結合さ
れているかあるいは放射線標識されている特異的抗体に
より、直接検出できるタンノダク質を暗号化する（　ｅ
ｎａｏｄｌｎｌ　）遺伝子を、ルシフェラーゼの検出に
類似する方法で微生物の検出に使用できる。他の場合に
おいて、１種または２ｓＩ以上の生産物を直接にあるい
は間接的に測定できるか、あるｈは基質の１つの消失を
同様に測定できる酵素を暗号化する遺伝子はいつそう適
当であることがある。このような酵素の例は、下のいく
つかの実施例において記載されている。測定は気体の発
生または溶解された気体の濃度の減少％Ｆ１４％生成物
または基質の変化に基づくことができ、それらは分光分
析またはクロマトグラフィーにより直接朔定することが
でき、あるいは結合された反応によりある−は二次的複
合体（例えば、ビオチンーア１シン）の抗体検出により
あるいは放射ａｌｌｌｌ金化合物用することＫよって間
接的に測定することができる。同定を目的とするこのよ
うな測定は単なる例示であシ１本発明の範囲を限定する
ことを意図するものでなく、本発明の方法と共に使用で
きる系の型を示している。代表的な酵素、タンパク質′
を次は酵素系１−。

関連する遺伝檎造が組み立てられた後、微生物の検出に
利用できる。このようなアセンブリーは自然の組み換え
事象または生体外組み換えＤＮＡ技術または両者を包含
することができる。本発明と合致する多数の可能性およ
びカテゴリーが存在する。

異質遺伝子を包含する種々の単離、クローニングおよび
転移の手順および宿主有機体への導入を本発明において
有利に用いることができる。例えば、供与体有機体（す
なわち、バクテリア、酵母菌など）のＤＮＡ　ｔ−巣離
し、制限エンドヌクレアーゼ、に！Ｌ３＾で部分的に消
化して、供与体ゲノム全体を＊ｂ囲む重複断片の組を生
成することができる。特定の大きさの断片１．グリセロ
ールまたはスクロース勾配を用いる遠心により、あるい
Ｆｉ７．ｆｃＩ−スグルの電気泳動により１１製できる
。これらの断片は構造５’ＧＡＴＣ−二本鎖ＤＮＡをも
つ突起する５′一本鎖端を含有し、それゆえ、酵素（シ
ミＨ１、Ｂｇｌ　Ｍ、シリ■、シ」３Ａ）で切断され、
適当な適合性の一本鎖端をつくった適当なベクター分子
へ、Ｔ４ＤＮａリガーゼにより結合することができる。

このようなベクターの例は、制限エンドヌクレアーゼＢ
ａｍ　ＨＩで切断されたλチャロン（Ｃｈａｒｏｎ　）
　２８　（Ｍａｎｉａｔｌａ　ａｔ　ａｌ、。

ｏｐ、ｅｉｔ１）である。次すで結合されたＤＮＡを、
必１ｌｌＫ応じてパッケージング（ｐａｅｈａｇｌｎｇ
　）　Ｌ７を後、適当な宿主（制限系に欠ける）中に形
質転換することができる。所望の外因性系または酵素の
ための配列を含有する生存しうるＤＮＡは、酵素的活性
、免疫学的技術により、あるいは合成または自然のＤＮ
Ａプローブおよび核酵の交雑により検出することができ
る。上のクローニングおよび検出の技術の多くＦｉ、マ
ニアチル（Ｍａｎｔａｔｉｍ）：（ｃｐ。

ｓｉｔ１）中に詳述されている。結局、供与体遺伝系會
サブクローニングし、次いで強力なバクテリアのプロモ
ーター（ｐｒｏｍｏｔ＠ｒ　）　（例えば、Ｅｓｅｈｓ
ｒｌｈｉａ　ｃｏｉｌのｐｌａｃまたはバクテリオファ
ージλのＰｌ）へ接続される０次いで、このプロモータ
ー−遺伝子セグメントを、自然、生体外または両者の組
み換により、接合性（ａｏｎｊｕｇａｔｌマ・）プラス
ミド（例えば、Ｆ因子またはＲＰ４）、形質転換可能な
賛素（例えば、プラスミドｐＢＲ３２２）へ、あるいけ
適当なバクテリオファージ（例えは、λまたはＴ４）へ
転移させることができる。

次いで５このように受容性宿主微生物に転移された、発
現された供与体遺伝子または遺伝子系を用いて、宿主有
機体を検出することができる。宿主有機体中の供与体遺
伝系の活性の監視に適当な手段を選択する（すなわち、
ルシフェラーゼを用いる光の生成；酵素反応の最終生産
物または中間体など）。こうして、異質遺伝子の供与体
有機体からの単離、クローニングおよび受容性宿主微生
物中への転移、および内部に含有された異質遺伝子の発
現を監視することによる宿主微生物の同定が実施される
。

以下金白 実施例９ 宿主検出のために異質供与体から得られかつ受容性宿主
微生物へ転移されたアルコールデヒドロゲナーゼまたは
他のＤＮＡオキシドレダクターゼ遺伝子系の使用法 アルコールデヒドロゲナーゼ（Ｅ、Ｃ，１，１，１，１
：アルコール：　ＮＡＤオキシドレダクタ−ぜ）ｉ、多
くの種、例えば、酵母菌、ヒトおよびバシルス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　）により形成される酵素である。この酵素
を解読する１または２以上の遺伝子を却み換え技術によ
り単離することができる。実施例８の方法に従い、供与
体有機体として酵母菌のＤＮＡを単離し、制限エンドヌ
クレアーゼで処理し、クローニングし、有効なバクテリ
アのゾロモーターへ接続し、そして適当なベクター、好
ましくはバクテリオファージにより、受容性宿主有機体
へ転移する。

次いで、このＡＤＨ遺伝子を、バクテリアのルシフェラ
ーゼおよびベーターガラクトシダーゼについて前述した
ものに類似する技術および方法により、使用して特定の
微生物の存在全検出できる。

ＡＤｆ（の場合において、光の生成は直接監視されない
であろう；むしろＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの転化が測定さ
れるであろう。エタノールおよびＮＡＤ　　の存在にお
いて、ＡＤＨは生成物がＮＡＤＨ％Ｃおよびアセトアル
デヒドである反応を触媒する。　ＮＡＤＨの存在および
濃度は％３４０　ｎｍにおける光の吸収により、あるい
け適当なアルデヒド（例えば。

Ｃアルデヒド）の存在下のバクテリアのルシフェラーゼ
によ〕決定することができる〔スタンレ（８ｔａｎｌｅ
ｙ　）ｔＰ、Ｅ＊＠酵素学における方法（Ｍ＋５ｔｈｏ
ｄｓ　ＩＫＩ　Ｅｎｉｙｍｏｌｏｇｙ　）、Ｍｏｌ　Ｌ
■・Ｍ・＾・デル力（−、Ｄ・１ｕｃａ　）ｍｉ、アカ
デミツク・プレス（Ａｅａｄ＠ｍ１ａ　Ｐｒ＠ｍｓ　）
　１９７８、二瓢−ヨーク、サンフランシスコ、ロンド
ン、２１５−２２２ページ〕。

宿主微生物の同定においてＡＤＨとして適当な多数の他
のＮＡＤオキシドレダクターゼが存在する（　Ｅ、Ｃ，
クラス１．１．１．１，２，１．１，３，１，１，４，
１．１．５．１および１，８．１）。例えに、Ｌ−７ラ
ニンデヒドロゲナーゼ（Ｅ、Ｃ，１，４，１，ｌ、　、
　Ｌ−アラニン：　ＮＡＤオキシドレダクターゼ）もＮ
ＡＤ　　からＮＡＤＨを生成する。さらに、この酵素は
Ｌ−７ラニングがピルベートに転化されるときそれがら
ＮＨ，を遊離し、そしてＮＨ３ＦｉＮＡＤＨよシはむし
ろ測定される生成物であることができる。他のオ午シト
レダクターゼＦｉＮＡＤ＋の代わシに電子供与体として
０２　　を使用しく　Ｅ、Ｃ，クラス１．１．３．１．
２．３．１．３．３および！、４．３　）そして溶解酸
素の消失を、例えば、酸素電極により追跡できる。

実施例１Ｏ 宿主の検出のため異質供与体から得られかつ受容性宿主
微生物九転移されたトランスフェラーゼを解読する遺伝
系の使用法 トランスフェラーゼ酵素系を、ここに記載する本発明と
共に、使用して微生物を同定することもできる。実施例
８の方法に従い、選択した１または２以上のトランスフ
ェラーゼ遺伝子を含有する適当な供与体有機能のＤＮＡ
ｔｌ−単離し、制限エンドヌクレアーゼで処理し、クロ
ーニングし、有効なバクテリアのプロモーターに接続し
、そして適当なベクター（好ましくはバクテリオファー
ジ）により受容性宿主微生物へ転移する。例えば、Ｌ−
千ロシン：２−オキングルメレートアミノトランスフェ
ラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，６，１，５）は２−オ午ングルタ
レートの存在下ＫＬ−チロシンからｐ−ヒドロキ゛ジフ
ェニルピルベートを生成し、セしてｐ−ヒドロキシフェ
ニルピルベートのＦＢ’ｌＬ￥ｒ　３３０　ｎｍにおい
て分光光度測定法により監視できる〔ハーグ−（）ｒａ
ｄｉｒ）、Ｒ１スロニム（Ｓｌｏｎｌｍ　）　＋　Ａ、
。

およびクーン（Ｋｕｈｎ　）　、Ｊ、、　ｌ　９７６　
：エシエリヒア・コリによるＤ−）リデトファンの利用
におけるＤ−）リプトファンオキシダーぜの役割（Ｒｏ
ｌｅ　ｏｆ　Ｄ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　ｏｘｌｄａｓ
ｖ　Ｉｎ　Ｄ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ　　ｕｎｔｌｌｉ
ｉａｔｌｏｎ　　ｂｙ　　Ｅｓｅｈｅｒｌｅｈｌａｅｏ
ｌｌ　）　ｅジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ
、Ｂａａｔ＠ｒｌｏ１．）　１２５　：１０９６−１１
０４　）＠トランスフェラーゼの第２の例は、ガラクト
キナーゼである（　ＡＴＰニーＤ−ｒクトースーｌ−ホ
スホトランスフエラーぜ：　ＬＣ０２，７，１，６）そ
の活性はＡＴＰの油出またけβ−り一がラクトース−１
−ホスフェートの出現により追跡できる。他の検出モー
ドを特定の選択したトランスフェラーゼに容易に応用で
きる。

実施例１１ 宿主の検出のために異質供与体から得られかつ受容性宿
主微生物へ転移されたヒドロラーゼ、リアーゼまたはイ
ソメラーゼの遺伝系の使用法 前述の酵素系に加えて、ヒドロラーゼ、リアーゼおよび
イソメラーゼの酵素系を１本発明に関連して、使用して
微生物全同定することができる。

実施例８の方法に従い１選択した酵素（ヒドロラーゼ、
リアーゼ、またはイソメラーゼ）を含有する適当な供与
体有機体のＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼで
処理し、クローニングし、有効なバクテリアのプロモー
ターへ接続し、そして適当なベクター（好ましくはバク
テリオファージ）により受容性宿主微生物へ転移する０
例えば、アルカリ性ホスファターゼ（Ｅ、Ｃ３，２，３
，１、オクトリン酸モノエステルホスホヒドロラーゼ）
活性を多くの方法で検出することができ、そのうちの１
つけｐ−ニトロフェニルホスフェートカラのｐ−二トロ
フェノールの解放による。ｐ−ニトロフェノールの濃度
は、β−ガラクトシダー−ｋ”（Ｅ、Ｃ。

３．２．１．２３）活性の検出Ｋｏ−ニトロフェノール
を使用したのと同一の方法で、アルカリ性−において４
２０　ｎｍで分光光度測定的に決定することができる。

リアーゼ、例えば、アスノぐルテートー１−デカル？キ
シラーゼ（Ｅ、Ｃ，４，１，１，１１）、Ｌ−アスパル
テート−１−カルボキシラーゼ）およびオルニチンデカ
ル〆キシラーゼ（Ｅ、Ｃ，４，１゜１７、Ｌ−オルニチ
ンカルがキシラー−に＃）は、Ｃ０２（Ｈ２Ｃ０２とし
て）の遊離を−の変化として決定できるので、等しく適
する。イソメラーゼ１例えば、グルメメートラセマーゼ
（Ｅ、Ｃ，５，１，１，３）を使用することもできる。

グルメメトラセ？　−ゼの場合において、Ｄ−グルメメ
ートのＬ−グルメメートへの転化は、この系を従来のプ
ロト；−ｋＫ従’）Ｌ−グルタメートオキシダーゼに結
合させることにより追跡できる。

実施例１２ 宿主の検出のために異質供与体力ら得られかつ受容性宿
主微生物へ転移されたオキシダーゼ遺伝系の使用法 酸素活性が低いかあるいけ存在しない目標宿主額生物中
への、前記酵素活性の導入。実施例８の方法に従い、選
択した酵素（すなわち、オキシダーゼ）を含有する適当
な有機体のＤＮＡを単離し、制限酵素で処理し、クロー
ニングし、有効なバクテリアのプロモーターに接続し、
そして適当なベクター（好ましくはバクテリオファーノ
付与選択性）によ〕受容性宿主微生物に転移する。

本発明のための１つの可能な使用は、例えば、エシェリ
ヒア・コリ（ハリ＊ｒ１ｅｈＩｍυ打リエ）中にほとん
ど存在しないＤ−トリプトファンオキシダー−ｋ”（Ｒ
ａｄａｒ　＠ｔ　ｍｌ、、　ｏｐ　ｅｌｔ　１）　”ｋ
含む。

この酵素活性の高いレベルに導びく突然変異体遺伝子の
導入Ｆｉ、　Ｄ−トリプトファンからのイトールピリビ
ン酸の生成により検出できる。強いプロモーターへ接合
され友Ｅ、ｏｏｌｉのｂｌｏ　Ｂ遺伝子を含有する同棟
なｉ！！素は、デチオビオチンをビオチンに急速に転化
させ、このビオチンはそれに対するアビジンの高い親和
性に基づく方法により検出できる。

４、結果 ４、形質導入 バクテリオファージは、それらのＤＮＡの吸着および引
き続く適当なバクテリア宿主中への注入により、それら
自体増殖する。自然において、バクテリオファージは時
にはバクテリアの遺伝子へ置換および／または付加によ
り結合するようＫなる。

場合によっては、あるバクテリオファージはバクテリオ
ファージ以外の他の源から来るＤＮＡを偶然包み込む（
・ｎマ・１ａｐｓ　）　（すなわち、染色体、シラスミ
ドまたは他のバクテリオファージの糧で）。

前者は特殊化された形質導入と呼ばれ、後者は一般化さ
れた形質導入と呼ばれる。これらの現像の両者け、１つ
のバクテリアから他のバクテリアへの転移に導び〈。特
殊化された形質尋人性ファージを生成するためのよル現
代的方法は、Ｉ＆み換えＤＮＡ技術による。所望の遺伝
子を有しかつ本質的にバクテリオファージの遺伝子が失
なわれたファージを構成できる。このようなファージは
、適当な宿主が存在すると、これらのクローニングされ
た遺伝子を効率よく導入するであろう。そわらの発現の
ための要素が存在するとき、これらの遺伝子は高度に発
現されるであろう。なぜなら、バクテリオファージの染
色体の多くのコピーがファージの生長の間につくられる
からである。

本発明の好ましい実施態様に従えば、Ｖ、ムぶ五Ｕ」の
ルミネセンス遺伝子を有するＤＮＡ断片をシラスミドｐ
ＢＴＫ５からのＥｓｃｂ＠ｒｉｈｉａ　ｃｉＬｌ−バク
テリオファージλへ転移された。他の供与体遺伝系の転
Ｓｔ−適轟な構成により同様に実施できる。

感染すると、７アージは宿主として作用できる特定のバ
クテリアへ吸着することができ、そしてファージの頭部
のカプセル化されたＤＮＡはバクテリアの細胞の中へ注
入される。ＤＮＡがいったんバクテリアの内部へ入ると
、それは宿主の機能金利用することができ、そしてそれ
は転写されかつ翻訳されてルミネセンス酵素（ルシフェ
ラーゼおよびアルデヒドの合成に必要なもの）または他
の導入された酵素系を生産する。

ルミネセンス系の使用は本発明の好ましい実施態様であ
る。ファージまたはバクテリアのいずれもそれら自身で
光を放射しないので、感染に引き続く光のレベルを用い
てバクテリアの存在を検出することができ、そして放射
される光の量はファージ−バクテリア複合体の数を反映
する。過剰のファージが存在すると、光の量はバクテリ
アの濃度を反映する。この技術を用いると、１０２満よ
シ少ないＥｇａｈｓｒｉｅｈｌａ　ｃａｌｌの細胞を１
時間以内で検出できる。バクテリアを含有する試料がミ
リＩア（Ｍｌ　１１１ｐｏｒｅ　）　ＨＡ　０．４５ミ
クロンのフィルターを通す濾過により濃縮されたとき、
１０ｍ１ｌｌ／Ｋｌ程度に少ない濃度を検出できるであ
ろう。

宿主細胞が感受性である抗生物質が存在すると、感染性
ファージはその溶解サイクルを完結する仁とができず、
そして放射される光の量は減少するか、あるいけ光は放
射されない。ＤＮＡ　、　ＲＮＡまたはタンパク質の合
成を連断する抗生物質を試験し。

そしてそれは光の出力を低下することが示された。

細胞壁の合成または膜の完全性に影響を及埋す抗生物質
は同様な結果を与え友。こうして、所定の型のバクテリ
アをルミネセンス遺伝子を有する７アージの感染により
検出する場合、抗生物質へのバクテリア宿主の感受性を
光放射への抗生物質の作用を検査するととＫより急速に
決定できる。

バクテリアの存在は、また、第３図に示す形質導入を用
いる酵素手段により検出することができる。十分なバク
テリア細胞が存在しかつベーターガラクトシダーゼを解
読する遺伝子を有するバクテリア細胞が前記バクテリア
細胞に感染すると、ベーターがラクトシダーゼが新たＫ
　（ｄ＠ｎｏｖｏ　）合成され、そしてその存在および
活性は酵素の検定により決定できる。感染された複合体
の数が大きくなればなる＃１ど、形成される酵素の量は
多くなる。

トリプトファナーゼの遺伝子を有するλバクテリオファ
ージおよびこの活性に欠けるバクテリア株を用いて、同
様な実験を実施した。再び、これらの存在は、比較的高
い濃度の細胞（１０細胞／ＩＬｌ）ＶＣもかかわらず、
酵素の形成に導びいた。

バクテリオファージは、バクテリアの所定の単一槽内の
ある株ｔ＆はすべての株についてのみ生長することがで
きる。場合に応じて、所定の盤のバクテリオファージは
いくつかのＳｔ感染することができるが、これらはほと
んど常に密接に関連することがわかった。適当なバクテ
リオファージのｍを選択することにより、バクテリアの
試験についての試験を所望なよ５に’ｌ？異的とするこ
とができる。このことはこの試験においてバクテリアの
存在を検出できるはかシではなく、かつまた特定の型の
バクテリアの存在または不存在を容易に決定できること
を意味する０例えば、Ｅ■ｈ・ｒｌ−ｅｈｌａ　ｃａｌ
ｌの検出を望む場合、その宿主の範囲がこの種のすべて
の既知の株を含みかクルミネセンス遺伝子を有するファ
ージの混合物は、この種の急速な特別の検出を可能とす
るであるり・Ｂ、形質転換 とねらの実Ｍは、生物ルミネセンスまたは他の供与体遺
伝子を含有する適合性ＤＮＡで７４クチリアを形質転換
することにより、前記ツマクチリアを検出できることを
明らかにする。ツマクチリアの存在、それらの分類学的
位置および抗生物質に対するそれらの感受性をこの技術
により決定できる。

’Ｉｉ：ｓａｈ＠ｒｌｅｈ１ａ　ｅｏ１１株ＪＭＩＯＩ
およびＭＭ２９４を、それぞれＩＸ部およびＸｓの材料
および方法に従い得られるｐＢＴＫ５訃よびｐＡＣｈｕ
−１で形質転換したとき、数時間以内実証的な光が放射
された。ＤＮＡモ添加しない細胞またはＤＮＡ単独は完
全に暗かりた。放射される光はノ櫂ツクグラウンドレベ
ルの数１０００倍であった。

別の実験において、添加されるＤＮＡが一定（１μ？）
であるときおよび細胞の数を変化させたとき、放射され
る光の量を測定した。結果を第３図に示す、これから明
らかなように、放射の開始時間は細胞濃度に負の相関関
係にある。これは第４図に明瞭に示されており、ここで
光放射の時間は細胞濃度に対してプロットされている。

得られるはとんと直線の関係は、この方法を細胞濃度の
概算にｔ＆使用できることを立証している。

光生成遺伝子を用いる形質転換の他の用途は、抗生物質
に対するバクテリアの感受性の決定においてである。使
用したプラスミドはｐＢＴＫ５　（１μ？）であり、そ
して株はＭＭ　２９４であった。

形質転換後°、抗生物質を添加し、そして抗生物質の光
放射への作用を決定した。実験の対照はＣａＣ４処理し
かつプラスミドＤＮＡを添加しない細胞、および形質転
換しかつ抗生物質を添加しない細胞であった。

第５図は得られた実験結果を示す。カナマイシン（３０
μｙ７ｈｔ　）およびクロランフェニコール（３０μｆ
７１ｄ　）は光の生成を完全に妨害した。テトラサイク
リン（１０μμ）Ｆｉ、抗生物質を加えない対照のそれ
に対して９０係の減少を起こした。７ンピシリン（３０
μｍ７ｋｌ　）は光の生成を実際に刺激する。アンピシ
リンが光の放射を阻害しないかあるいけわずかに阻害す
るということは、ｐＢＴＫ５がアンピシリン抗抵性のた
めの決定因子を有するという理由で、予測された。予期
されない刺激は、入るプラスミドの複製が増加するよ５
に選択したためであるか、あるいはｂ１ｍ遺伝子（アン
ピシリン抵抗性）プロモーターを経る光遺伝子の転写が
増大したためであろう。こうして抗生物質（これらの実
験においてクロランフェニコール、テトラサイクリンお
よびカナライシン）Ｋ対するバクテリアの集団の感受性
は、生物ルミネセンス遺伝子を用いる形質転換により急
速に決定されうる。抵抗（アンピシリン）も急速に検出
される。

さらに、抗生物質の活性はその濃度の関数（テトラサイ
クリン対クロランフェニコールおよびカナマイシン）と
して急速く確認されうる。それ１１ど最適ではない濃度
または部分的抵抗もこの試肢により検出される（テトラ
サイクリン）。

形質転換の追加の特徴はその特異性である。上に示した
ように、Ｅｍｅｈ＠ｒｌｅｈｉａ　ａｏｌｌの２つ株は
容易に検出された。Ｅｇｈ＠ｒｉ＠ｈ１ａ　ｔｏｌｌ　
。

およびＡ＊ｒｏｂａｅｔａｒ　ａｓｒｏｇｅｎｅｓ　ｔ
　ｐＢＴＫ５で形質のみが光を放射した（第６図）。Ａ
ｅｒｏ　ｂａｅｔ＠ｒおよびＰｒｏｔｓｕｍけＥｍｈｓ
　ｒｌｃｈｉａ　ｅｏｌｌと密接に関係するので、この
ことはこの試験が大きい特異性を有することを示す。

Ｃ０接合 ある種のバクテリアはそれらのＤＮＡを他の細胞（受容
体）Ｋ供与する能力を有する。このプロセスは、接合（
ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）として知られておシ、その存
在が細胞健康に対して余分である循環ＤＮＡ分子である
プラスミドにより仲介される。すべてのシラスミドが接
合を促進できるわけではない。

転移遺伝子を有するもののみが可能である。シラスミド
が自由の組み込まれない分子として存在するとき、それ
は通常それ自身の供与体から受容体への転移を仲介し、
そして時ため他のプラスミドまたはノ４クチリアの染色
体の転移を仲介するだけである。

しかしながら、接合性プラスミドが染色体中へ組み込ま
れるとき、それは主として染色体を転移させ、そしてそ
れ自体の転移にまれに成功するだけである。可能な受容
体の範囲は、接合性プラスミド自体に依存する。例えば
、！ラスミドＲＰ４はそれ自体非常圧遠縁のダラム陰性
バクテリアの間でそれ自身転移することができるが、戸
はそれ自体非常にわずかの密接に関係する型に転移でき
るだけである。

ＨｆｒであるＥｓｅｈａｒｉｈｉａ　ｃａｌｔ　Ｋ１２
株ＡＴ２４４６を、刈部の材料および方法に！Ｃ１する
ようＫして、２倍に溶原性とした。ＡＴ２４４２けＨｆ
ｒＨであり、それゆえそのＤＮＡを０分から出発して受
容体へ転移する。供与体ＤＮＡけ時計回シにｔｈｒで転
移され〔バッチマン（Ｂａｃｈｍａｎｎ）　＊　Ｂ、Ｊ
＋およびに、Ｂ。

ロウ（Ｌｏｗ）　、　１９８０　：ｘシエリヒア・コリ
に１２の結合地図（Ｌｌｎｋａｇｅ　ｍａｐ　ｏｆ　Ｅ
ｓａｈ、ｅ　ｒｌｃｈｉａｅｏｌｉ　Ｋ１２　）　、６
版−ミクロバイオロジカル・レビ、　　（Ｍｉｅｒｏｂ
ｉａｌ　Ｒｅｖ１）　４４　：　１−５６　）最初のバ
クテリアの染色体の遺伝標識およびｍａｌＢは９１分で
ほぼ最後である。バクテリオファージλの取り付は部位
は１７分であるので、Ｉｆ　ｒＨは溶原性ウィルス（こ
の場合複数のウィルス）をかなり早くかつ高い効率で転
移するであろう。

λの非溶原性株への転移が起こるとき、接合誘発が起こ
るであろう。この現象けλのリプレッサーを久く細胞質
にウィルスのゲノムが入る結果である。リプレッサー遺
伝が存在しないと、遺伝子はそれら自身発現し、ファー
ジはそれ自身をバクテリアの染色体から切除し、そして
溶解サイクルは進行する。これはほぼ３００／細胞のゲ
ノムを生成し、そして光遺伝子は高いレベルで発現され
るであろう。なぜなら、それらの投与量（量）が増加し
かつそれらはまた前に抑制されたλプロモーターＬによ
り高度に転写されるであろうからである。

ルミネセンス遺伝子はそれら自身のプロモーターから発
現されるので、ある程度のパックグラウンドの光放射は
起こるであろう。致死量より少ない濃度のストレプトマ
イシンとともに供与体株を生長させることにより、バッ
ググラウンドの光を大きく抑制できることを、われわれ
は発見した。

ストレプトマイシンはルミネセンス系の誘導を大きく明
害し、同時に生長速度にほとんど影響を及ぼさないこと
がわかっ九。

接合およびルミネセンスの使用を例証する実験は、実施
例６に記載されておシかつ第７図に示されオフ、そして
光の放射量は所定の供与体濃度において受容体細胞の濃
度に直接関係づけられる。

放射される光間の関係が受容体濃度に直接的に関係する
ということけ、第７図のそう入園に例示されている。ク
ロランフェニコール（１０μｍ１７ｍ１）およびストレ
プトマイシン（１００μＩＩＩ’）のような抗生物質は
、交配（ｍａｔｉｎ＋ｒ）の開に含められたとき、放射
される光の増加を完全に阻止した。

この技術を用いると、ある試料中のバクテリアの存在、
数および抗生物質への感受性を決定することができる。

接合けＨｌｒまたは溶原性バクテリオ７丁−ジに限定さ
れない。転移可能なレプリコンにおいて、宿主有機体中
に存在しないかあるいけその中で発現される程度に劣る
、ルミネセンス系、またはその部分、または他の供与体
遺伝系を含有するいかな株を使用することもできる。こ
のレプリコンはバクテリアの染色体またはプラスミドで
あることができる。ルミネセンス系またはその部分、ま
たは他の遺伝系はバグテリオファージにより、あるいは
自然または人工の遺伝組み換えＫよシ導入されることが
でき、ここでルミネセンスまたは他の遺伝子は転移され
た遺伝物質へ共有結合される。こうして接合は前述の光
結合形質導入および形質転換の使用に類仰する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ファージλＬ２８を用いる形質導入によるｇ
、　ａｏｌｉ株Ｗ３１１０の決定である。 第２図は、フγ−ゾλＬ４を用いる形質導入によるＥ　
Ｔ　ｃ　ｏ　１　ｆ株Ｗ３１１０の決定である２第３図
は、１μＩＩｐＥＴＫ５　ＤＮＡを用いる形質転換によ
る異る濃度におけるｙよｃｏｌｌ　ｔｃ株ＭＭ２９４の
決定である。 第４図は、１μｇのｐＢＴＫ５　ＤＮＡを用いる形質転
換によるＥ、　ｅｏｌ１株ＭＭ２９４の決定くおける細
胞濃度と光放射の開始との間の関係である。 第５図は１種々の抗生物質の存在下のｌμＩのｐＢＴＫ
５　ＤＮＡを用いるＥ、　ｃｏｌ１株鹿２９４の形質転
換におけるルミネセンスの動力学である。 第６図は、１μＩのｐＢＴＫ５　ＤＮＡを用いるＥ。 ｃｏ１１株ＭＭ２９４の形質転換における特異性である
。 第７図は、接合によるＥ、　ｃｏｉ１株Ｗ３１１０の決
定である。 第８図は、λｃＩ８５７８７　ｐｌａｃ５を用いる形質
導入によるエシェリヒア・コリ（ＥｓｅｈｅｒＪｃｈｌ
ｍｃａｌｌ）株Ｃ３ＨＩの決定である。 第９図は、関連する制限エンドヌクレアーゼ切シ離し部
位のλ野生形地図である。 第１０図は、関連する制限エンドヌクレアーゼ切り離し
部位のλチャロン（Ｃｈａｒｏｎ）　３０の地図である
。 第１１図は、関連する制限エンドヌクレアーゼ切り離し
部位１）ｙｌｅロギー的特徴、ルックス・プロモーター
からの転写およびＰＬからの１写のλＬ４地図である。 第１２図は、関連する制限エンドヌレアーゼ切り離し部
位、トＩコギー的特徴、ルックス・プロモータからの転
写およびＰ、からの転写のλＬ２８の地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、工程 （１）真核生物または原核生物の供与体源に由来する、
   遺伝系またはその機能的部分をコードする生物学的に機
   能的な自然のまたは組み換ＤＮＡを、受容性微生物宿主
   中へ遺伝的手段により転移され、ここで前記導入される
   供与体遺伝系は常態で存在しないかあるいは前記宿主に
   より発現される程度が少なく、そして （ｂ）前記宿主微生物による前記供与体遺伝系の発現を
   物理的、化学的または生物学的手段により検出し、これ
   により （ｃ）前記宿主の存在を検出することを含んで成る、あ
   る環境における微生物の特定の型または群を検出する方
   法。 ２、前記供与される貴伝系は、ルシフェラーゼまたは他
   のルミネセンス系、ベーターガラクトシダーゼ、アルコ
   ールデヒドロゲナーゼまたは他のＮＡＤオキシドレダク
   ターゼ、トランスフェラーゼ、アルカリ性ホスファター
   ゼまたは他のヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、
   またはＤ−トリプトファンオキシダーゼまたは他のオキ
   シダーゼを発現する自然または組み換えＤＮＡであり、
   そして供与体遺伝系は接合、形質転換または形質導入に
   より転移され、そして前記宿主微生物はエシェリヒア（
   Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）、アエロバクテル（Ａｅｒｏｂ
   ａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａｉｍｏｎｅｌｌａ）、
   シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、クレブシェラ（Ｋｌｅｂ
   ｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュ
   ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコ
   ッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプト
   コッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏ−ｃｏｃｃｕｓ）、キラミジ
   ア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏ
   ｐｌａｓｍａ）、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏ
   ｃｃｕｓ）、ネイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、クロ
   ストリジウム（Ｃｌｏｓｔ−ｒｉｄｉｕｍ）、バシルス
   （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙ
   ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム（Ｍｙ
   ｃｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンフィバクテル（Ｃａ
   ｍｐｈｙｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、
   セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エンテロバクテル（Ｅ
   ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロビデンシア（Ｐｒｏｖ
   ｉｄｅｎｃｉａ）、クロモバクテリウム（Ｃｈｒｏｍｏ
   ｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ
   ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、ヘモフィルス（
   Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびボルデテラ（Ｂｏｒｄ
   ｅｔｅｌｌａ）から成る属から選択される特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３、前記供与体遺伝系は生物学的源から誘導されるルシ
   フェラーゼまたは他のルミネセンス系、またはそれらの
   機能的部分からなり、前記宿主はバクテリアであり、そ
   して前記ルミネセンス供与体系は前記宿主バクテリアに
   おいて光の放射により検出され、そして前記遺伝系はプ
   ラスミドまたはバクテリオファージのベクターを用いる
   転質転換または形質導入により転移される特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 ４、前記ルミネセンス系はビブリオ・フィシェリ（Ｖｉ
   ｂｒｉｏ　ｆｉｓｅｈｅｒｉ）または他の微生物源から
   誘導されるルシフェラーゼ系である特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ５、前記ルミネセンス系は前記宿主バクテリア中で前記
   ルミネセンス系を発現することができる発現制御配列へ
   取り付けられた組み換えＤＮＡからなる特許請求の範囲
   第４項記載の方法。 ６、前記ルミネセンス系の転移は形質導入を含み、そし
   て前記ベクターはカプシド内に包まれた組み換えＤＮＡ
   からなるバクテリオファージからなり、そして前記バク
   テリオファージは前記宿主バクテリアまたはその株また
   はそれに関係する同様なバクテリア群を認識する特許請
   求の範囲第５項記載の方法。 ７、前記バクテリオファージＬ２８（ＡＴＴＣＣ　Ｎｏ
   ．４０１８３）またはλＬ４またはそれらの機能的突然
   変異体である特許請求の範囲第５項記載の方法。 ９、前記転移ベクターはｐＢＴＫ５またはｐＡＣｈｖ−
   １である特許請求の範囲第８項記載の方法。 １０、前記ＤＮＡの転移はルミネセンス系またはその機
   能的部分の自己誘導体の存在下に行われる特許請求の範
   囲第３、４、５、６、８または９項記載の方法。 １１、前記ＤＮＡの転移が行われる環境ヘアルデヒドを
   添加する特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、トランスポゾンを使用して、ルミネセンス系のす
   べてまたは部分を含有するバクテリオファージを構成す
   る特許請求の範囲第５項記載の方法。 １３、前記供与体ＤＮムの転移はバクテリア株による接
   合により実施し、前記バクテリア株はバクテリアの染色
   体またはプラスミドである転移可能なレプリコン中に供
   与体遺伝系またはその機能的部分を含有する特許請求の
   範囲第２項記載の方法。 １４、供与体ＤＮＡ系またはその機能的部分を前記バク
   テリア株中にバクテリオファージにより導入する特許請
   求の範囲第１３項記載の方法。 １５、前記供与体系は自然または人工の遺伝子組み換え
   により前記バクテリア中へ導入されるルミネセンス系ま
   たはその機能的部分である特許請求の範囲第１３項記載
   の方法。 １６、供与体ＤＮＡ系を有する鋳型バクテリオファージ
   により溶原化されるＨｆｒであるバクテリア株を使用す
   る特許請求の範囲第１３項記載の方法。 １７、前記ＤＮＡの転移を抗バクテリア剤の存在下に実
   施して、前記バクテリア剤への宿主有機体の感受性を決
   定する特許請求の範囲第１〜１６項のいづれかに記載の
   方法。 １８、工程 （ａ）エシェリヒア（Ｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アエロ
   バクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓａ
   ｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ク
   レブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐ
   ｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
   ａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
   ｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
   ｃｕｓ）、チラミジア（Ｃｈｙｌａ−ｍｙｄｉａ）、マ
   イコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ニューモコッ
   カス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ネイセリア（Ｎｅ
   ｉｓｓｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉ
   ｄｉｕｍ）、バシリス（Ｂａｃｉｌ−ｌｕｓ）、コリネ
   バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マ
   イコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カ
   ンフィバクテル（Ｃａｍｐｈｙｂａｃｔｅｒ）、ビブリ
   オ（Ｖｉｂｒｉｏ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、
   エンテロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロ
   ビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、クロモバクテ
   リウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ
   （Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ
   ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）およびボ
   ルデテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）の群から宿主微生物
   またはそれらの組み合わせを選択し、 （ｂ）上の工程（ａ）において選択された宿主に対して
   特異性である本質的に生物学的に純粋なバクテリオファ
   ージを得、 （ｃ）選択された宿主微生物中に存在しないかあるいは
   発現される程度が劣る自然のまたは組み換えＤＮＡ遺伝
   系を真核生物または原核生物の供与体源から選択し、 （ｄ）選択された宿主微生物中で前記供与体系を発現す
   ることができる発現制御配列を前記供与体ＤＮＡ系に取
   り付け、そして （ｅ）パッケージの存在または不存在下に、工程（ｄ）
   において調製された前記生物学的に機能的なＤＮＡを形
   質締換して、組み換え遺伝系を含有する上の工程（ｂ）
   において選択されたようなバクテリオファージを生成さ
   せる、 ことにより調製された特許請求の範囲第１項記載の方法
   と共に使用するための組み換えバクテリオファージ転移
   ベクター。 １９、前記供与体ＤＮＡ系は、ルシフェラーゼまたは他
   のルミネセンス系、ベーターガラクトシダーゼ、アルコ
   ールデヒドロゲナーゼまたは他のＤＮＡオキシドレダク
   タターゼ、トランスフェラーゼ、アルカリ性ホスファタ
   ーゼまたは他のヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ
   、またはＤ−トリプトファンオキシダーゼまたは他のオ
   キシダーゼを発現する特許請求の範囲第１８項記載の組
   み換えバクテリオファージ。 ２０、前記供与体ＤＮＡ系はルシフェラーゼまたは他の
   ルミネセンス系である特許請求の範囲第１９項記載の組
   み換えバクテリオファージ。 ２１、ビブリオ・フィシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｆｉｓｈ
   ｅｒｉ）から誘導されわつエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃ
   ｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）をその宿主として有しかつ
   ＡＴＣＣ　４０１８３の同定特性を有する特許請求の範
   囲第２０項記載の組み換えバクテリオファージλ２８の
   生物学的に純粋な培養物。 ２２、工程 （ａ）ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを真核生物
   または原核生物の供与体から抽出し、 （ｂ）前記供与体から得られたルシフェラーゼをコード
   するｍＲＮＡを単離および精製し、 （ｃ）逆トランスクリプターゼを使用して、前記単離さ
   れたｍＲＮＡのヌクレオチド配列に対して相補的なヌク
   レオチド配列を有する一本鎖とＤＮＡを合成し、 （ｄ）ＤＮＡポリメラーゼを使用して、上で合成された
   一本鎖ｃＤＮＡに対して相補的である第２鎖を有する二
   本鎖ｃＤＮＡを合成し、 （ｅ）前記二本鎖ｃＤＡを酵素的に処理して、前記ｃＤ
   ＮＡをＤＮＡクローニングベクター中へそう入するため
   に適する末端形成し、 （ｆ）ある転移ベクターを線状化し、前記ｃＤＮＡを前
   記ベクター中にそう入し、そして前記ベクターを結合し
   て組み換えクローニングベクターを形成し、 （ｇ）ある微生物を前記組み換えプラスミドクローニン
   グベクターで形質転換し、 （ｈ）ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡ配列を含有
   する前記組み合えクローニングベクターを含有する前記
   形質転換された微生物の株を単離し、（１）あるＤＮＡ
   発現ベクター中へのそう入に適するルシフェラーゼまた
   はその部分をコードするＤＮＡ断片を形成するために、
   前記クローニングベクターを酵素的に酵素処理し、 （ｊ）ルシフェラーゼをコードする前記ＤＮＡ断片を発
   現ベクター中にそう入し、前記発現ベクターは原核生物
   または真核生物の細胞およびそれらのウィルスの遺伝子
   を発現させる発現制御基により特徴づけられ、 （ｋ）前記発現ベクターを宿主微生物中に転移させ、そ
   の結果前記宿主は前記ｃＤＮＡを発現し、これにより生
   物学的に機能的なルシフェラーゼを複製する、 ことからなることを特徴とする微生物系においてルシフ
   ェラーゼの転写および翻訳のためＤＮＡ配列によりコー
   ドされた生物学的に機能的なタンパク質を製造する方法
   。 ２３、前記発現ベクターはｃＤＮＡを発現し、これによ
   りルシフェラーゼを合成し、そして引き続く光の放射を
   用いて、前記宿主微生物を検出しかつ抗生物質に対する
   前記微生物の感受性を決定する特許請求の範囲第２２項
   記載の方法。 ２４、前記組み換え発現ベクターはプラスミドである特
   許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２５、前記組み換え発現ベクターはバクテリオファージ
   である特許請求の範囲第２２項記載の方法。 ２６、工程 （１）エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アエ
   ロバクテル（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、サルモネラ（Ｓ
   ａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、
   クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（
   Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
   ｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
   ｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ
   ｃｃｕｓ）、チラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、マイ
   コプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ニューモコッカ
   ス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、ネイセリア（Ｎｅｉ
   ｓｓｅｒｉａ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ
   ｉｕｍ）、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバク
   テリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコ
   バクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンフ
   ィバクテル（Ｃａｍｐｈｙｂａｃｔｅｒ）、ビブリオ（
   Ｖｉｂｒｉｏ）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エン
   テロバクテル（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、プロビデ
   ンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、クロモバクテリウ
   ム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブルセラ（Ｂ
   ｒｕｃｅｌｌａ）、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、
   ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびボル
   デテラ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）から成る群から宿主微
   生物またはそれらの組み合わせを選択し、（ｂ）真核生
   物または原核生物の供与体源から誘導される、供与体遺
   伝系またはその機能的部分をコードする自然または組み
   換えＤＮＡを選択し、そして前記供与体遺伝系は常態で
   存在しないか、あるいは前記宿主微生物により発現され
   る程度に劣り、 （ｃ）前記供与体ＤＮＡを酵素処理して、前記ＤＮＡを
   クローニングベクター中へそう入するために適する末端
   基を形成し、 （ｄ）前記選択した宿主微生物と適合性のプラスミドベ
   クターを選択し、 （ｅ）前記ベクターを線状化し、 （ｆ）前記ベクターを前記プラスミドベクター中にそう
   入し、前記ベクターを結合して組み換えクローニングベ
   クターを形成し、 （ｇ）前記宿主微生物を前記組み換えクローニングベク
   ターで形質転換し、 （ｈ）前記組み換えクローニングベクターを含有する形
   質転換体を単離し、 （ｉ）前記宿主微生物と適合性のＤＮＡプラスミド発現
   ベクトル中へのそう入に適する、前記供与体遺伝系また
   はその部分を暗号化するＤＮＡ断片を形成するために、
   前記クローニングベクターを酵素処理し、 （ｊ）前記処理されたＤＮＡ断片を、前記供与体遺伝系
   の発現を行う発現制御基により特徴づけられるプラスミ
   ド発現ベクター中にそう入し、これにより所望のプラス
   ミド転移ベクターを得る、により調製された特許請求の
   範囲第１項記載の方法と共に使用するための組み換えプ
   ラスミド転移ベクター。 ２７、前記遺伝系またはその部分は、ルシフェラーゼま
   たは他のルミネセンス系、ベーターガラクトシダーゼ、
   アルコールデヒドロゲナーゼまたは他のＤＮＡオキシド
   レダクターゼ、トランスフェラーゼ、アルカリ性ホスフ
   ァターゼまたは他のヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラ
   ーゼ、またはＤ−トリプトファンオキシダーゼまたは他
   のオキシダーゼを発現する自然または組み換えＤＮＡで
   ある特許請求の範囲第２６項記載のプラスミド転移ベク
   ター。 ２８、前記供与体遺伝系はルシフェラーゼまたは他のル
   ミネセンス系である特許請求の範囲第２７項記載のプラ
   スミド転移ベクター。 ２９、ここに記載するルミネセンス遺伝系を有しかつＥ
   ．￥ｃｏｌｉ￥　ＭＭ２９４／ｐＡＣｈｖ−１（ＡＴＣ
   Ｃ　５３１３３）の生物学的に純粋な培養物中に存在す
   るような特許請求の範囲第２８項記載の組み換えプラス
   ミドｐＡＣｈｖ−１。 ３０、工程 （ａ）有効濃度の抗生物質感受性検定バクテリアを環境
   中に導入し、前記検定バクテリアは、真核生物または原
   核生物の供与体源から誘導される、遺伝系またはその操
   作的部分をコードする自然のまたは組み換えＤＮＡから
   なり、そして前記生物学的に機能的な検定系は、前記導
   入前に前記検定系に欠けるかあるいはその発現の程度に
   劣る前記検定バクテリアへ遺伝手段により導入されてお
   り、（ｂ）前記検定バクテリアを前記環境中においてあ
   る期間インキュベーションし、 （ｃ）前記検定系の発現を前記検定バクテリアにより前
   記環境中で物理的、化学的または生物学的手段により検
   出し、そして （ｄ）前記検定系の前記測定された発現を、抗生物質に
   対する前記検定バクテリアの既知の応答と比較し、これ
   により （ｅ）前記環境中の抗生物質または抗生物質の混合物お
   よび濃度を同定する、 からなることを特徴とするある環境における特定の抗生
   物質またはそれらの混合物の存在および濃度を決定する
   方法。 ３１、前記導入される遺伝系は、ルシフェラーゼ系、ベ
   ーターガラクトシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ
   または他のＤＮＡオキシドレダクターゼ、トランスフェ
   ラーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたは他のヒドロラ
   ーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはＤ−トリプトフ
   ァンオキシダーゼまたは他のオキシダーゼを発現する自
   然または組み換えＤＮＡであり、そして導入される遺伝
   系は前記検定系バクテリアへ接合、形質転換または形質
   導入により転移される特許請求の範囲第３０項記載の方
   法。 ３２、前記検定バクテリアはエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
   ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であり、前記導入され
   る遺伝系はルシフェラーゼまたはベーターガラクトシダ
   ーゼ系であり、そして前記抗生物質はペニシリン、アン
   ピシリンまたは細胞の良好な合成を阻害する他の薬物；
   ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン
   、ネオマイシン、ゲンタマイシンまたは他のアミノグリ
   コシド；イソニアジド；テトラサイクリン、クロランフ
   ェミカルまたは他の広いスペクトルの抗生物質；ポリミ
   キシン；スルホン；およびスルホンアミド、またはそれ
   らの混合物の群から選択される特許請求の範囲第３１項
   記載の方法。 ３３、前記遺伝系はルシフェラーゼ系であり、そしてそ
   の発現は光の測定により検出される特許請求の範囲第３
   ２項記載の方法。 ３４、工程 （ａ）ルシフェラーゼまたは他のルミネセンス系を暗号
   化するＤＮＡを、適当な真核生物または原核生物の供与
   体から抽出し、 （ｂ）前記供与体から得られたＤＮＡを単離および精製
   し、 （ｃ）前記供与体ＤＮＡを酵素的に処理して、クローニ
   ングベクター中へ前記ＤＮＡをそう入するために適した
   末端基を形成し、 （ｄ）前記供与体ＤＮＡをクローニングベクター中へそ
   う入し、そして前記ベクターを結合して組み換えクロー
   ニングベクターを形成し、 （ｅ）ある微生物を前記組み換えクローニングベクター
   で形質転換し、 （ｆ）あるＤＮＡ発現ベクター中へのそう入に適するル
   シフェラーゼまたはその部分または他のルミネセンス系
   をコードするＤＮＡ断片を形成するために、前記クロー
   ニングベクターを酵素的に処理し、（ｇ）前記ＤＮＡ断
   片を発現ベクター中へそう入し、前記ベクターは原核生
   物または真核生物およびそれらのウィルスの遺伝子の発
   現を行う発現制御基により特徴づけられ、そして （ｈ）前記発現ベクターを、常態で前記供与体ルミネン
   ス系に欠けるかあるいはその発現の程度に劣る宿主微生
   物中に転移させ、その結果前記微生物の宿主は生物学的
   に機能的なルシフェラーゼまたは他のルミネセンス系を
   複製する、 からなることを特徴とするルシフェラーゼまたはその部
   分または他のルミネセンス系のためのＤＮＡ配列により
   暗号化された生物学的に機能的なタンパク質をある微生
   物宿主系において複製する方法。 ３５、前記発現ベクターは前記ＤＮＡを発現し、これに
   よりルシフェラーゼを合成し、そして引き続く光の放射
   を用いて、前記宿主微生物を検出しかつ抗生物質に対す
   る前記微生物の感受性を決定する特許請求の範囲第３４
   項記載の方法。 ３６、前記組み換え発現ベクターはプラスミドまたはバ
   クテリオファージである特許請求の範囲第３４項記載の
   方法。 ３７、工程 （ａ）有効濃度の抗生物質感受性検定バクテリアを環境
   中に導入し、前記検定バクテリアは、真核生物または原
   核生物の供与体源から誘導される、遺伝系またはその機
   能的部分をコードする自然または組み換えＤＮＡからな
   り、そして前記生物学的に機能的な検定系は、前記導入
   前に前記検定系に欠けるかあるいはその発現の程度に劣
   る前記検定バクテリアに、遺伝手段により導入されてお
   り、（ｂ）前記検定バクテリアを前記環境においてある
   期間インキュベーションし、 （ｃ）前記検定系の発現を前記検定バクテリアにより前
   記環境中において物理的、化学的または生物学的手段に
   より検出し、そして （ｄ）前記検定系の前記測定された発現を、抗生物質に
   対する前記検定バクテリアの既知の応答および対照と比
   較し、そしてこれにより （ｅ）前記環境中の抗生物質および抗生物質の混合物の
   存在および濃度を同定する、 からなることを特徴とするある環境中の抗生物質の活性
   について組成物またはそれらの混合物を検定する方法。 ３８、前記導入される遺伝系は、ルシフェラーゼ系、ベ
   ーターガラクトシダーゼ、アルコールヒドロゲナーゼま
   たは他のＮＡＤオキシドレダクターゼ、トランスフェラ
   ーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたは他のヒドロラー
   ゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、またはＤ−トリプトファ
   ンオキシダーゼまたは他のオキシダーゼを発現する天然
   または組み換えＤＮＡであり、そして導入される遺伝系
   は前記バクテリアへ接合、形質転換または形質導入によ
   り転移される特許請求の範囲第３７項記載の方法。 ３９、前記検定バクテリアはエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
   ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）であり、そして前記抗
   生物質は、ペニシリン、アンピシリン、または細胞の良
   好の合成を阻害する他の薬物；ストレプトマイシン、エ
   リスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ゲンタ
   マイシンまたは他のアミノグリコシド；イソニアジド；
   テトラサイクリン、クロアンフェミカルまたは他の広い
   スペクトルの抗生物質；ポリミキシン；スルホン；およ
   びスルホンアミド、またはそれらの混合物の群から選択
   される特許請求の範囲第３８項記載の方法。 ４０、前記遺伝系はルシフェラーゼ系であり、そしてそ
   の前記発現は光の測定により検出される特許請求の範囲
   第３９項記載の方法。