JPH05501862A - 生物発光タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク 本発明は生物発光タンパク質類に関し、特に、それは、例えば化学的手段によっ てまたは遺伝子工学によって修飾された生物発光タンパク質類に関する。このよ うな修飾された生物発光タンパク質類は以下で“レインボウタンパク質類”とい われ、細胞、細菌・ウィルスおよび原生動物のような微生物類、および基質類・ 代謝物類・細胞内および細胞外シグナル類・酵素類・抗原類・抗体類および核酸 類のような生物学的に関心が寄せられる物質類の検出および定量に使用できる。

生物発光は、酸素またはその代謝物類のひとつによる有機分子である“ルシフェ リン”の酸化であり、光を発光する。

本反応は、ルシフェリンが前記ルシフェラーゼに緊密にまたは共有結合で結合し その結果それが周囲の液体中に拡散しない時、“ルシフェラーゼまたは“発光タ ンパク質”として通常知られているタンパク質によって触媒される。

０２＋ルシフエリン＋ルシフエラーゼ→オキジルシフエリン十光（またはｏ２− または８２０２）　（または発光タンパク質）光を発するためまたはその色を変 化させるため、３種までの他の物質類が同様に存在することが必要となることが あり、そしてそれらは下記のようである；（ａ）　Ｈ”　、　Ｃａ２°　ｙｇ２ −のようなカチオン、またはＣｕ”／Ｃｕ”。

Ｆｅ”　”／Ｆｅ’°のような遷移金属。

（ｂ）　ＮＡＤＨ，ＦＭＮ、またはＡＴＰのような補因子。

（Ｃ）エネルギートランスファーアクセプターとしてのフルオアー。

これまでに５種の化学属のルシフェリンが同定されてきた（付属図面の図１参照 ）： （ａ）アルデヒド類（細菌、淡水リンベット之二ヱ１（い１棟）およびみみず中 に見られる）。

（ｂ）イミダゾロピラジン類（有毛根足類、刺胞動物、有節動物、一部の節足動 物、一部の軟体動物、一部のを索動物）。

（ｃ）ベンゾチアゾール（ホタル類およびツチボタル類のような甲虫類に見られ る）。

（ｄｌ直鎖テトラビロール類（双鞭毛藻類、オキアミ、一部の魚類に見られる） 。

（ｅ）フラビン類（細菌、真菌、多毛類および一部の軟体動物に見られろ）。

これらのルシフェリン類を伴う反応の結果、紫、胃、青緑、緑、黄または赤色光 および時には紫外線または赤外線（ＩＲ）の発光をおこし、このような発光は、 直線にまたは円に偏光されてもよい。生物発光反応についてのこれ以上の記載に ついては、Ａ、　Ｋ、　Ｃｈａｍｐｂｅｌｌ、　１９８８年発行、Ｈｏｒｗｏｏ ｄ／ＶＣ）ＩＣｈｉｃｈｅｓｔｅｒ　ＷｅｉｎｈｅｉｍのＣｈｅｍｉｌｕｍｉｎ ｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉ ｎ　ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（化学発光原理および生物お よび医学における応用）を参考のこと。

さて、修飾された生物発光または“レインボウ”タンパク質を伴う生物発光反応 から発光した光が強度、色または偏光度が変化することが判明した。このような 変化を次に用いて、細胞、微生物および生体分子類の検出、局在化および測定の ためのさまざまなアッセイに使用できる。

本例では、前記細胞または物質は、遺伝子工学で産生されたルシフェラーゼのよ うなレインボウタンパク質への物理的またはリン酸化のような化学的変化を引き 起こし、発光の強度、色または偏光に変化をもたらす。前記生物発光反応は、例 えば、ルシフェリンを添加することによって惹起され、そして、測定すべき細胞 または物質による前記ルシフェラーゼの修飾は、短波長または長波長で光を発光 する反応を引き起こす。これによって、生細胞中において、さらに、有機体内部 または形質膜の内または外表面において、それらを切断開裂する必要もなくまた 結合および非結合分画類を分離する必要もなく、特定反応を検出し定量化できる 。

本発明の１側面によれば、異なる物理的、化学的、生化学的または生物学的条件 下において改変された特徴の光または放射線を生成する生物発光反応に関与でき る生物発光タンパク質が提供される。

このレインボウタンパク質は、前記ルシフェラーゼまたは発光タンパク質の末端 からまたはその内部の１個以上のアミノ鮫類を改変させるか、置換するか、添加 するかまたは除去することによって産生できる。その結果、オキジルシフェリン からの発光は、前記物理的または化学的条件類に応じて異なる色または異なる状 態の偏光となることができる。別の部分のレインボウスペクトルへの色の変化は 、（ａｌ　）（、Ｃａ、Ｍｇのようなカチオン濃度の変化または遷移金属、（ｂ ）　Ｃ１−またはリン酸のようなアニオン濃度の変化、（Ｃ）　リン酸化または 脱リン酸化反応（セリン／スレオニン、ヒスチジン、およびチロシンキナーゼ類 およびホスファターゼ類を含む）、トランスグルタミネーション、タンパク質分 解反応、ＡＤＰリボシル化、グリ−またはグルコシル化、ハロゲン化、酸化、メ チル化およびミリスチン化を起こす酵素類による前記新規タンパク質の共有結合 修飾、 （ｄｌ抗原、サイクリックＡＭＰのような細胞内シグナル類、サイクリックＧＭ Ｐ、Ｉｐ３．Ｉｐ４．ジアシルグリセロール、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰ、ＧＴＰ 全てのオキシ−またはデオキシリボヌクレオシド、基質、薬物、核酸、遺伝子制 御タンパク質のレインボウタンパク質への結合、 （ｅ）生細胞内部でのその核酸の発現、および細胞内部におけるプロモータ類、 エンハンサ−類または癌遺伝子類のような遺伝子発現によるそれの修飾または制 御、によって誘発することもできる。

単一または複数突然変異および欠失は、前記°°レインボウタンパク質”をＤＮ Ａの１末端に連結させることによっておよびエネルギートランスファーアクセプ ターまたはクエンチャ−を他の１末端に連結することによって、ＤＮＡ片（例Ｐ ＣＲ生成物）中で検出できる。前記突然変異におけるヌクレアーゼ攻撃は、前記 レインボウタンパク質を前記アクセプターまたはクエンチャ−から分離させ、そ れによって、発光の強度、色または偏光の変化を生ずる。

１種以上のアミノ酸類のこのような改変、置換、添加または除去は、化学的手段 によって達成できる。酸の変化には、アルキル化（例　メチル化）、リン酸化お よび本文に概略した種類のさまざまな他の共有結合修飾が含まれる。また、ルシ フェラーゼまたは発光タンパク質をコードする核酸は、結果として生成したタン パク質がカチオン類、アニオン類、細胞内シグナル、共有結合修飾、測定すべき タンパク質類または核酸に相互作用する部位を獲得するかまたは喪失するように １種以上のヌクレオチド類を修飾すること、置換すること、挿入することまたは 欠失することによって、変化させることができる。ヌクレオチド類の前記挿入ま たは欠失は、通常、部位特異的突然変異によって、または、前記遺伝子を特異的 制限酵素で切断開裂し、選択したヌクレオチド配列を挿入または欠失させること および次に前記遺伝子を再度つなぎ合わせることまたはポリメラーゼチェーン反 応で特異的プライマー類を使用することによって、通常、産生される。この核酸 は次にｍＲＮＡに転写され、これはその後翻訳されて、細菌または真核生物細胞 の内部のいずれかでレインボウタンパク質を生成するか、例えばウサギ網状赤血 球溶解物を用いてインビトロで形成する。この新規核酸は、Ｔ７　ＳＰ６のよう なＲＮＡポリメラーゼプロモータ、または、アクチン、ミオシン、ミニリンタン パク質類、ＭＭＴ−Ｖ、ＳＶ４０、抗体、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼのようなは乳 類プロモータ類を含有し、そして、前記ポリメラーゼチェーン反応を用いてイン ビトロで増幅させることができる。この結果、前記レインボウタンパク質は、癌 細胞のような生細胞中で、または、インビトロ酵素反応を用いて細胞なしで産生 できることになる。組織特異的プロモータまたはエンハンサ−配列を、前記未改 変または改変生物発光タンパク質をコードするＤＮＡの５°または３′末端へ添 加すると、それがレボータ遺伝子として使用されるようにでき、そして、特定の 細胞または組織において特異的に発現されることを可能とし、前記発現は、光強 度、色または偏光度の変化の出現によって検出可能であレインボウタンパク質の ためのＤＮＡ作製の別の方法は、前記生物発光タンパク質のための元来のＤＮＡ を２つの半分に分離することである。次に、１半分を５°末端に他の半分を３° 末端に結合することによって、ＤＮＡまたは遺伝子片を前記２つの半分の間に挿 入する。これとは別に、前記レインボウタンパク質ＤＮＡはポリメラーゼチェー ン反応を用いて産生ずることができ、前記センスプライマーは５゛末端に結合し たレインボウタンパク質ＤＮＡの１部分を有し、およびアンチセンスプライマー は３′末端に結合した他の部分（すなわちアンチセンス）を有する。中間の問題 のＤＮＡまたは遺伝子片類は、２つの別々の遺伝子類から由来することができる 。例えば、ひとつがエネルギートランスファータンパク質を、他が生物発光タン パク質をコードすることができる。前記２つがペプチド（ＤＮＡ／ＲＮＡ由来） を介して連結されるときにのみ前記レインボウタンパク質が産生され、そして、 色のシフトが起こる。エネルギートランスファータンパク質は、前記タンパク質 に共有または非共有結合で結合したいかなるフルオアーであることもでき、例え ば、オワンクラゲ、ヤクチクラゲ、ウスカワミジンコまたは他の刺胞動物類由来 の緑色蛍光タンパク質、または発光性細菌類由来の青または黄色蛍光タンパク質 、またはフラボプロティン、またはフィオビロプロテイン（ｐｈｙｏｂｉｌｏｐ ｒｏｔｅｉｎ）であることができる。前記タンパク質全体またはその蛍光領域の みが使用できる。前記生物発光タンパク質は、例λば、細菌、ホタル、フラボタ ル、またはカイアシ、または、例えばエクオリン、オペリン、サラシコリンのよ うなラジオラリンのためのいかなる発光タンパク質であってもよい。

前記タンパク質またはそのＤＮＡまたはＲＮＡは、ウィルス、プラスミド、リン 酸カルシウム移入、電気泳動、リボゾーム融合、または膜孔形成性タンパク質類 を用いて、生細菌または真核細胞中に取り込むことができる。いったん内部に入 ると、適当な生化学を有する生細胞のみが前記“レインボウ”効果をもたらすで あろう。前記“レインボウタンパク質”遺伝子を胚、卵母細胞、精子、種子また は実生に取り込むことによって、トランスジェニック動物または植物が産生され 、前記“レインボウ効果”を用いて遺伝子発現、細胞制御、薬物作用または細胞 障害がそれぞれの器官中において局在できしかも測定できるようになる。これら の新規有機体は、また、家庭用水槽中、飛行機滑走路上で、海における安全灯と しておよび家庭用植物として使用できる。

前記レインボウタンパク質は、また、化学的手段によってまたは前記タンパク質 を遺伝子工学処理してそれを形質膜の内または外表面または特定の細胞内小器官 （例　パーオキシシーム、ミトコンドリア、ソロロブラスト、小胞体、ゴルジ、 分泌小胞、核またはエンドシーム内部に局在化するように含有させることによっ て、前記細胞の異なる部分に取り込ませることができる。

化学的または遺伝子工学によってシグナルペプチドを添加することによって、前 記正常または改変ルシフェラーゼまたは発光タンパク質を細胞内部または形質膜 の内または外表面上にターゲットさせることができる。例えば、Ｎ末端の配列Ｍ ＬＳＲＬＳＬＲＬＬＳＲＹＬＬは前記生物発光タンパク質をミトコンドリア内に 局在させ、そして、Ｎ末端のＫＫＳＡＬＬＡＬＭＹＶＣＰＧＫＡＤＫＥは前記タ ンパク質を小胞体ヘタ−ゲットさせ、Ｃ末端のＫＤＥＬ配列は、それをそこに保 持する。

元来のルシフェラーゼまたは発光タンパク質またはその遺伝子は、生物発光で公 知の化学（図１参照）のいずれかから、または少なくとも１６個の門を代表する ７００以上の属由来の広い範囲の未解析発光有機体から、由来することができる 。前記ルシフェリンは化学的に合成され、そして、前記生体反応または細胞に添 加され光を発する。これとは別に、ルシフェリン生成を担っている酵素類をコー ドする遺伝子は、前記“レインボウタンパク質”遺伝子と結合され、その結果、 人工オペロンすなわち融合遺伝子が、アミノ酸のような正常細胞構成体からレイ ンボウタンパク質を発現させそして生細胞中でルシフェリンを生成する。

本発明の第２の側面によれば、化学的手段または前記タンパク質をコードする核 酸の遺伝子工学的手段によって、前記タンパク質に対する１個以上のアミノ酸を 改変させること、置換させること、添加することまたは欠失させることにょって 、生物発光タンパク質を作製する方法を提供する。

本発明のさらに別の側面によれば、先に定義のような生物発光タンパク質をコー ドする核酸が提供される。

前記レインボウタンパク質またはそれをコードする核酸は、 （ａ）微生物類（原生動物、細菌、ウィルス類）の検出、局在および測定、 （ｂ）癌細胞の検出および局在、 （ｃ）細胞または体液中における酵素類、細胞内シグナル類およびその他の回転 反応測定、 （ｄｌＤＮＡおよびＲＮＡ結合アッセイ、（ｅ）イムノアッセイおよびその他の タンパク質結合アッセイのような生物研究領域で使用できる。

前記レインボウタンパク質およびそれらの親核酸類は、また、トランスジェニッ ク動物類、植物類および微生物類の開発においておよび水耕栽培においても使用 できる。

本発明のさらに別の面によれば、微生物類、細胞類または生体分子類またはその 中での反応のような生物学上関心を寄せられる物質類の検出、局在または測定の ために、前記レインボウタンパク質またはこのレインボウタンパク質をコードす る核酸の用途が提供される。

この面において、生物学上問題の反応または物質類は、レインボウタンパク質ま たはその親核酸と相互作用させられる。このような相互作用には、非共有結合ま たは共有結合のような直接的または間接的結合、およびエネルギー移行過程が含 まれる。

本発明を上述してきたが、それが、上記に述べたかまたは下記に記載の特徴のい かなる発明の組み合わせも含むことを理解すべきである。

本発明はさまざまな方法で実施することができ、また、下記の１実施例を参照に してさらに説明されるであろう・罠五丞ニ レインボウタンパク　のリン　の ケンブチドとして公知のペプチドｌｅｕ　ａｒｇ　ａｒｇ　ｓｅｒ　ｌｅｕｇｌ ｙまたはマランチドとして公知（７）　ＲＴＫＲ３ＧＳＶＹＥＰＬＫＴは、ジサ クシルスペラートを用いてｐＨ３でホタルルシフェラーゼに共有結合させた。プ ロティンキナーゼＡ１２巴て前記ケンブチドをリン酸化させ、それによってルシ フェラーゼに結合させた。三波長ケミルミノメータにおける比率として測定した ｐＨ７．８における黄緑色から赤色への色の変化またはｐＨ６．５における赤色 から黄緑色への色のシフトによって、前記キナーゼによるタンパク質リン酸化の 割合をアッセイし、ホスファターゼによって誘発された脱リン酸化を次に前記比 率の反転によってアッセイした。

五立且ｌ ホタルルシフェラーゼの　“ ホタルルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡは、５゛センスプライマー類とＴ７ 　ＲＮＡポリメラーゼプロモータおよび下記の３°アンチセンスプライマー類を 用いるポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）を用いて増幅させたニプライマーコ ードはカッコ中： ５°センスプライマー （１０５）　ＣＡＣＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧ ＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣ（１０７）　ＡＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＣＣＧＣ ＡＧＡＴＴＣＴＣＧＣＡ（１１０）　ＡＴＧＣＴＧＴＣＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣＣ ＴＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧ丁ＣＣＣＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＣＧＣＣＡＡ ＡＡＡＣ （１１１ン　ＣＡＣＣＴＡＡ丁ＡＣＧＡＣＴＣＡＣ丁Ａ丁ＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧ ＣＴＧＴ（：ＣＣＧＧＣＴＧＴＣＣ３°アンチセンスプライマー （ｌ［ｌＱＩ　ＴＣＴＣＧＣＴＧＡＡＴＡＣＡＧＴＴＡＣ（１０６１　ＣＣＣＣ ＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＣＴＣＴＣＴＧＡＴＴＴ丁ＴＣＴＴＧＣＧ丁（１０８１　 ＴＧＣＧＡＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＣＡＧにＣＡＧＴＴ（１：Ｔ下記のホタルルシ フェラーゼｃＤＮＡ類は、カッコ内のプライマー類を用いて構築された： （ａｌ全長（１０５＋１００） （ｂ）−３６ｂｐ（すなわち、パーオキシソマルシグナルペプチド欠失（１０５ ＋１０６） （Ｃ）タンパク質中間のプロティンキナーゼ八部位（　ＲＲＸＳ）（段階Ｌ　： 　１０５＋１０８１３よび１０７＋１００；段階２：段階１からの半分２個＋１ ０５＋１００）（ｄ）　Ｎ末端のミトコンドリアシグナル（段階１　：　１１０ 　＋１００：段階２：段階１試料＋１　１　１＋１００）。

５０ｕｌ中におけるＰＣＲ反応は、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ８、３　、　０． ０１％ゼラチン、０．４　Ｕ　Ｔａｑ　ポリメラーゼ、２ｍＭＭｇＣ１２．　０ ．２　ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ．ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，０．５μＭの各プラ イマー、１μｍのＤＮＡ　（およそ１−１−１Ｏ０ｎを含有していた。本反応は 、５０μｍの鉱物油でカバーされ、パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ ｒ　）サーフルサイクラ−中で２５サイクル：９４℃１分、５５℃１分、７２℃ ２分十各サイクルの５秒延長でインキュベートし、さらに、ＩＵのＥ、ｃｏｌｉ 　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ（フレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ　）断片）とともに３７℃ で３０分間インキュベートした。

ＰＣＲの成功は、アガロースゲル電気泳動のバンドによって確認した。ｃＤＮＡ はセントリコンによって精製し、プライマー類を除去し、そして、緩衝フェノー ル：　ＣＨＣｌ３：　２級アミルアルコール（２５・２４：１）で抽出後、７ｏ ％エタノール、０．７ｍＭ　ＮＨ，酢酸中で沈澱させた。前記ＤＮＡ（１０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ　０．１または１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ７，４−７，５中に溶解した ０、５−５−１ｕは、３７℃で４時間まで（最適には１−２時間）　、　４０ｍ Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７，４−７，５゜５．６　ｍＭ　ＭｇＣ１−１１０ｍＭ　ジ チオスレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍＭ　スパーミジ ン、０．５ｍＭの各ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ、０．１　ｍＭのＧＴＰ、０．５ｍ Ｍのｃａｐｍ７Ｇ（５°）　１）１）ｐ（５’　）　Ｇ、　１００ＯＵのＲＮ　 Ａ　ｓｉｎ／ｍｌ、８００ＵのＴ７　ＲＮＡ　ポリメラーゼ＋−２μＣｊ２Ｐ− ＵＴＰを含有する緩衝液中で、前記のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ中に転写した。本 反応は、水冷フェノール：　ＣＨＣｌ３　：　２級アミルアルコール（２５：　 ２４　：　１）中で終止させ、そして、前記ＲＮＡを７０％エタノール＋０．７ ＭＮＨ４ＡＣで沈澱させ、−２０℃で保存した。

前記ＲＮＡは遠心分離し、２０μｍの７０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１ｍ　Ｍ　ＥＤＴＡ 　ｐＨ７，４７，５中に溶解させ、そして、１μｍを５−　］、　Ｏｕ　１のウ サギ網状赤血球溶解物とともに３０℃で１時間インキュベートして、ルシフェラ ーゼを合成した。

１／１００希釈後のルシフェラーゼを、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

１０ｍＭ　ＭｇＡＣｚ　、　０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０．１−０ ．２ｍＭルシフェリン、０．５−５ｍＭ、ｐＨ７，８のＡＴＰ中で直接発光をア ッセイするかまたは等電点泳動によって単離する。突然変異体（ＲＲＸＳ）ルシ フェラーゼは、およそ７１または６．８のｐＩを有し、そして、正常のルシフェ ラーゼは、およそ６８のｐｒを有している。ミトコンドリアシグナルを有するル シフェラーゼは、また、正常ルシフェラーゼから分離された。この改変ルシフェ ラーゼ含有ウサギ網状赤血球溶解物を添加すると、それは、遠心分離およびミト コンドリアおよびルシフェラーゼからの発光によっても示されるように添加され たミトコンドリアによって取り込まれた。

プロティンキナーゼＡ、サイクリックＡＭＰ（０，２ｍＭ）。

ＡＴＰ　（０，１−１ｍＭ）ｐＨ７とともにルシフェラーゼを含有するＲＲＸＳ のリン酸化によって、ルシフェラーゼのｐＩを再度６．８に戻すように変化させ その色をシフトさせた。

ＲＲＸＳルシフェラーゼは、干渉フィルター付二波長ケミルミノメータを用いて 検出した時に未改変ルシフェラーゼよりも強い緑色の発光を有していた（最大透 過率およそ５４５および６０３　ｍＭ）。

ケンブチドヌクレオチドセンスまたはアンチセンス配列（ＬＲＲＡＳＬＧ　’） 　またはマランチドＲＴＫＲ３ＧＳＶＹＥＰＬＫＩを含有するプライマー類は、 同様に、１または２段階のＰＣＲ反応を用いてＮまたはＣ末端のいずれかに添加 された。これらは、また、リン酸化されることができるルシフェラーゼを産生し 、それによって、その強度および色を変化させた。

及血！旦 工１　されたエクオリンの；　。

ｃＤＮＡすなわちＣａ”十活性化発光タンパク質のゲノムコードは、ホタルルシ フェラーゼのそれと同様の方法でＰＣＲされた。ｌまたは２段階ＰＣＲを用いて 、プロティンキナーゼＡ認識ベブチドケンブチド（ＬＲＲＬＡＬＧ　）またはマ ランチド（実施例２に同じ）をＮ末端に添加した。突然変異エクオリンは、異な るキネティック特性を有しており、改変エクオリン（上記）をリン酸化すること によってプロティンキナーゼＡを検出可能とした。

正常エクオリンプライマー類＝５°センスＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ ＧＧＧＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＡＧＡ（：ＴＴＣＧ ＡＣであり、３′　アンチセンスはＧＡＡＴＴＣＴＴＡＧＧＧＧＡＣＡＧＣＴＣ ：（：ＡＣ：Ｃ：ＧＴＡであった。Ｎ末端へのケンブチド挿入のために、ＬＲＲ ＡＳＬＧと等しいヌクレオチド配列をエクオリン５°末端の最初の１５塩基（Ａ ＴＧを含む）に結合させた。段階２において、前記Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプ ロモータを添加して、インビトロリン酸化のためにケンブチドーエクオリンをイ ンビトロで形成した。ゲノムエクオリンＤＮＡ　（ＰＣＲによって作製）は、逆 転写酵素ＰＣＲによってｍＲＮＡから製造されたそれと少な（とも同じくらい活 性であった。

Ｋ立生Ａ ユもｉ藍ユニ種上 血液試料（１ｍｌ）を図１のベンゾチアゾール反応３を触媒するレインボウタン パク質類をコードするｍ　ＲＮ　Ａ含有リボゾーム類の懸濁液と混合する。この ｍＲＮＡは、下記のようにして産生された： ホタルルシフェラーゼコード遺伝子は、最初に、ｐＣＤＶ１プラスミドブライマ ー＋ＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼプロモータ含有ホンジョー（Ｈｏｎｊｏ）リン カ−を用いてＥ、ｃｏｌｉ中のＣＤ　Ｎ　Ａライブラリから単離した。ｍｙｃ癌 遺伝子のチロシンキナーゼ活性のためのリン酸化部位を示すヌクレオチド配列 ＧＣＴＣＧＴＣＴＴＡＴＴＧＡＡＧＡＴＡＡＴＧＡＡＴＡＴＡＣＴＧＣＴＣＧＴ ＴＴＴＧＧＴを、５°末端のＡＴＧから３０塩基対下流のＥｃｏＲＩ制限部位に 挿入した。前記ＤＮＡを再び連結し、再クローン化し、そして、前記プラスミド 挿入物はインビトロでＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼによって転写され、レインボ ウタンパク質のためのｍＲＮＡを産生じた。前記元来のタンパク質は黄緑光を生 成したが、しかし、レインボウタンパク質は細胞中でリン酸化されたときに赤色 光を生成する。したがって、癌細胞の存在は、三波長ケミルミノメータ中で赤色 （６０３ｎｍ）に対する黄緑色（５４５０ｍ）の光の比率を測定することによっ て、白血病患者由来血液試料中で検出される。

Ｋ五奥互 サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　のＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼプロモータ 含有実施例４のレインボウタンパク質のｃＤＮＡを、サルモネラｆｓａ１ｍｏｎ ｅｌｌａ）ファージ中に挿入した。このファージをサルモネラ（Ｓａｌｍｏ−ｎ ｅｌｌａ　）に添加すると、レインボウタンパク質を発現させおよび赤色光も生 成させ、２０ｍ１当たり１個しかない細菌も検出できた。

夫血■亙 ＨＩｖ　ＲＮＡの ＡＩＤＳ患者の血液試料（１ｍｌ）を４Ｍグアニジウムインチオシアナートによ って抽出し、そして、前記核酸をエタノール／ＮＨ酢酸によって沈澱させた。前 記発光タンパク質オペリンから産生じたレインボウタンパク質で標識したオリゴ ヌクレオチド（１０μｍ、１μＭ）を、１００μｍの再溶解ＲＮＡに５０℃で添 加して、この混合物を０℃で１０分間冷却した。このオリゴヌクレオチドは、Ｈ ＩＶコートタンパク質中の配列に特異的であった。これをＨＩＶ　ＲＮＡに結合 して、レインボウタンパク質の発光を淡青（４７５ｎｍ）から青（４４０ｎ＋ｍ ）にシフトさせた。これは、二重光電子増倍管ケミルミノメータ中におけるこれ ら三波長における発光の比率のシフトとして検出された。

及施■ユ テストステロンの１ テストステロンカルボキシオキシムを、発光タンパク質オペリン由来レインボウ タンパク質と反応させ、テストステロンレインボウタンパク質結合物を形成させ る。ｉ　ｎ＋ｎｏｌ含有これの５μｍを、テストステロン（５０μｍ）ｐＨ７， ４に対するフルオロセイン標識抗体溶液とともにさまざまな濃度の標準テストス テロンの存在下または非存在下にインキュベートした。前記生物発光反応は、Ｃ ａ添加によって惹起され、そして、４７５ｎｍの光の５３０ｎｍの光に対する比 率を測定した。標準テストステロン濃度を増加することによって、４７５１５３ ０比率が増大した。本操作は、遊離抗原から結合抗原を分離する必要もなく実行 することができた。

１五土１ ±ムニュヱΩ旦」 疑いのある食品試料を沸騰させ、ＤＮＡを抽出する。特異的リステリア遺伝子ま たはオペリンｃＤＮＡに共有結合で結合した領域に対するセンスプライマー＋５ Ｐ６　ＲＮＡポリメラーゼプロモータおよびアンチセンス緑色蛍光タンパク質（ ＧＦＰ）ｃＤＮＡに共有結合で結合したアンチセンスプライマーを用いて、ポリ メラーゼチェーン反応を用いてニスニー去１−工Ｌｉ５ｔｅｒｉ釦−遺伝子を増 幅させる。この結果、新規レインボウタンパク質をコードしかつＳＰ６　ＲＮＡ ポリメラーゼによって転写可能なりＮＡとなる。

オペリン　リステリア　ＧＦＰ １　＝’−＝４・・・・　・・１・・・・・・・１・・・・・　１・・・・　・ １プロモータ　ｃＤＮＡ　遺伝子　ｃＤＮＡこのＤＮＡは転写され、そして、ｍ ＲＮＡは、ウサギ網状赤血球溶解物を用いて翻訳される。コエレンテラジンを添 加しオペリンを再活性化する。５．１０／４７５ｎｍにおけるレインボウタンパ ク質対オペリン単独の光の比率は、食品試料中に最初から存在するリステリアＤ ＮＡの量に直接比例する。リステリアが全（存在しないとき、比率の割合は１で ある。

夫血±ユ ゛による　ハイブリダイゼーションのｌｉＸ実施例６に記載の反応を実施したが 、しかし、光発光は、偏向板を互いに９０°として偏向フィルター付き２光電子 増倍管ケミルミノメークで検出した。上記２個の光電子増倍管の割合は、存在す るＨＩＶ　ＲＮＡの量に関連していた。

Ｋ五医土ユ サイクリックＡＭＰまたはＩ　３の渭 実施例２または３に記載の２段階ＰＣＲ反応を用いて、前記細菌憔ＣＡ　Ｐタン パク質または小胞体受容体のＩｐ３結合領域からのサイクリックＡＭＰ結合領域 を、前記ＮまたはＣ末端にまたはホタルルシフェラーゼまたはエクオリンに添加 した。前記改変タンパク質類は、実施例２または３に記載のようにしてＰＣＲＤ ＮＡ生成物からインビトロで作製され、そして、発光サイクリックＡＭＰまたは 工ｐ３の活性および色によって特性解析した。強度および色の両方の変化によっ て、細胞抽出物または生細胞中でＣＡＭＰまたはＩ９３が測定可能となった。イ メージインテンシファイア−を用いて、ＣＡＭＰまたはＩｐ３“クラウド”は、 この１個の細胞で可視化できた。同様に、エクオリンまたはルシフェラーゼは、 もしそれが最初にそのＣ末端で結合したＥＲまたはミトコンドリアシグナルで作 製されたならば、ＥＲまたはミトコンドリア内部で見ることができた。

生物発光タンパク質が、有機体によって産生されたタンパク質の修飾による代わ りに、アミノ酸からまたはＤＮＡまたはＲＮＡ合成技術を用いて合成できること が理解されるであろう。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平＄４年１月２２暇

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．生物発光反応に関与できる生物発光タンパク質で、異なる、物理的、化学的 、生化学的または生物学的条件下で改変された特徴の光または放射線を生成する 生物発光タンパク質。
2. ２．前記改変された特徴として、色、偏光状態、強度の１種以上を含むことを特 徴とする請求の範囲第１項に記載の生物発光タンパク質。
3. ３．生物発光タンパク質前駆体の修飾によって産生されることを特徴とする請求 の範囲第１項または第２項に記載の生物発光タンパク質。
4. ４．前記修飾として、ＮまたはＣ末端または前記タンパク質内部の１個以上のア ミノ酸の改変、置換、添加または除去を含むことを特徴とする請求の範囲第３項 に記載の生物発光タンパク質。
5. ５．前記タンパク質の問題物質との結合または会合に応答性で、前記生物発光反 応が開始されたときに改変された特徴の光または放射線を生成することを特徴と する先行請求の範囲のいずれかに記載の生物発光タンパク質。
6. ６．前記タンパク質の共有結合または他の修飾に応答性で、前記生物発光反応が 開始されたときに改変された特徴の光または放射線を生成することを特徴とする 請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の生物発光タンパク質。
7. ７．前記細胞性反応のキネテック生成物に応答性で、前記生物発光反応が開始さ れたときに改変された特徴の光または放射線を生成することを特徴とする請求の 範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の生物発光タンパク質。
8. ８．細胞内部または外部の特定部位に前記タンパク質を標的させるシグナルペプ チドまたは結合部位を含むことを特徴とする先行請求の範囲のいずれかに記載の 生物発光タンパク質。
9. ９．前記修飾が化学的手段によることを特徴とする請求の範囲第３項乃至第８項 のいずれかに記載の生物発光タンパク質。
10. １０．遺伝子工学によって修飾されかつインビトロ転写／翻訳によってインビト ロで作製されたかまたは細菌またはアルキバクテリア（古細菌）、シアノバクテ リア、青緑藻類、原生動物、真菌類、酵母、むせきつい動物またはほ乳類または 植物細胞中で作製され、次にプラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、ＤＮ Ａ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのような適切なベクター中で形質転換されるかま たは移入されたことを特徴とする請求の範囲第３項乃至第８項のいずれかに記載 の生物発光タンパク質。
11. １１．化学的手段によってまたは前記タンパク質またはその改変型をコードする 核酸を遺伝子工学処理することによって、前記タンパク質に対して１個以上のア ミノ酸類を改変させるか、置換させるか、添加させるかまたは欠失させることを 特徴とする先行請求の範囲に記載の生物発光タンパク質を作製する方法。
12. １２．請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載の生物発光タンパク質ま たは機能的に等価のその改変型をコードする核酸。
13. １３．問題の組織または物質に特異的なプロモータまたはエンハンサー配列を含 み、それによって、前記配列がレポータ遺伝子として作用することを特徴とする 請求の範囲第１２項に記載の生物発光タンパク質。
14. １４．光または放射線を発光可能なルシフェリンまたは類似の分子を産生するた めの１種以上の物質類をコードする配列を含むことを特徴とする請求の範囲第１ ２項または第１４項に記載の生物発光タンパク質。
15. １５．微生物類、組織全体、有機体全体、細胞または生体分子類内部または外部 の物質類の検出、局在、測定または可視化のための請求の範囲第１項乃至第１０ 項のいずれかに記載の生物発光タンパク質の用途。
16. １６．請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載の生物発光タンパク質を 前記配列の１末端に結合することおよびエネルギートランスファーアクセブター またはクエンチャーを他端に結合することを含むＤＮＡ配列中における突然変異 または欠失を検出する方法。