JP2003102491A5 - - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物発光タンパク質類に関し、特に、例えば化学的手段によって又は遺伝子工学によって修飾された生物発光タンパク質類に関する。
【0002】
【従来の技術】
このような修飾された生物発光タンパク質類は、以下で“レインボウタンパク質類”と呼び、細胞とか、細菌・ウイルスおよび原生動物のような微生物類、および基質類・代謝物類・細胞内および細胞外シグナル類・酵素類・抗原類・抗体類および核酸類のような生物学的に重要な物質類、の検出および定量に使用することができる。
【0003】
生物発光は、有機分子である“ルシフェリン”の酸素またはその代謝物類のひとつによる酸化であり、光を発するものである。この反応は、ルシフェリンが周囲の液体中に拡散しないルシフェラーゼと非常に緊密にまたは共有結合で結合しているとき、通常“ルシフェラーゼ”または“発光タンパク質”として知られているタンパク質によって触媒される。
【0004】
O2(またはO2 − または H2O2)+ルシフェリン+ルシフェラーゼ(または発光タンパク質)→オキシルシフェリン+光
【0005】
光を発するためまたはその色を変化させるため、3種までの他の物質類が同様に存在することが必要となることがあり、それらは下記のとおりである:
(a)H+、Ca2+、Mg2+のようなカチオン、またはCu+/Cu2+、Fe2+/Fe3+ のような遷移金属。
(b)NADH,FMN,またはATPのような補因子。
(c)エネルギー転移受容体としてのフルオアー(fluor) 。
【0006】
これまでに5種の化学属のルシフェリンが確認されている。(付属図面の図1参照):
(a)アルデヒド類(細菌、淡水リンペット・ラティア(Latia) およびミミズ中に見られる)。
(b)イミダゾロピラジン類(有毛根足類、刺胞動物、有櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊索動物)。
(c)ベンゾチアゾール(ホタル類およびツチボタル類のような甲虫類に見られる)。
(d)直鎖テトラピロール類(双鞭毛藻類、オキアミ、一部の魚類に見られる)。
(e)フラビン類(細菌、真菌、多毛類および一部の軟体動物に見られる)。
【0007】
これらのルシフェリン類が関与する反応の結果、紫、青、青緑、緑、黄または赤色光および時には紫外線または赤外線(IR)の発光が起り、このような発光は、直線にまたは円に偏光されることもある。生物発光反応についてのこれ以上の説明については、A.K.Champbell 著、Chemiluminescence principles and applications in biology and medicine(化学発光の原理および生物および医学における応用)(1988年、Horwood/VCH Chichester Weinheim 発行)を参考のこと。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
さて、修飾された生物発光性または“レインボウ”タンパク質が関与する生物発光反応によって発生した光の強度、色または偏光度が変化する可能性があることが知られている。したがってこのような変化を細胞、微生物および生体分子類の検出、位置特定および測定のためのさまざまなアッセイに使用できる。
【0009】
【課題を解決するための手段】
この例では、前記細胞または物質は、遺伝子工学で産生されたルシフェラーゼのようなレインボウタンパク質に物理的またはリン酸化のような化学的変化を引き起こし、発光の強度、色または偏光に変化をもたらす。前記生物発光反応は、例えば、ルシフェリンを添加することによって惹起され、そして、測定すべき細胞または物質によって前記ルシフェラーゼが修飾されると、より短波長またはより長波長の光を発光する反応を引き起こす。
【0010】
これによって、生細胞中において、細胞小器官内部または形質膜の内または外表面において、それらを切断開裂する必要もなくまた結合フラクションおよび非結合フラクションを分離する必要もなく、特異的反応を検出し定量化できる。
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明の1つの態様においては、異なる物理的、化学的、生化学的または生物学的条件下において改変された特徴をもつ光または放射線を生成する生物発光反応に関与できる生物発光タンパク質が提供される。
【0012】
このレインボウタンパク質は、前記ルシフェラーゼまたは発光タンパク質の末端からまたはその内部において1個以上のアミノ酸(類)を改変、置換、添加または除去することによって生成される。その結果、オキシルシフェリンからの発光は、物理的または化学的条件に応じて異なる色または異なる状態の偏光となることができる。レインボウスペクトルの別の部分への色の変化は、以下のものによって誘発できる。
【0013】
(a)H、Ca、Mgまたは遷移金属などのカチオン濃度の変化、
(b)Cl− またはリン酸基のようなアニオンの濃度の変化、
(d)リン酸化または脱リン酸化反応(セリン/スレオニン、ヒスチジン、およびチロシンキナーゼ類およびホスファターゼ類を含む)、トランスグルタミネーション、タンパク質分解反応、ADPリボシル化、グリーまたはグルコシル化、ハロゲン化、酸化、メチル化およびミリスチン化を起こす酵素類による前記新規タンパク質の共有結合修飾、
【0014】
(d)抗原、サイクリックAMPのような細胞内シグナル、サイクリックGMP,Ip3,Ip4,ジアシルグリセロール、ATP,ADP,AMP,GTP全てのオキシ,またはデオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオチド、基質、薬物、核酸、遺伝子調節タンパク質のレインボウタンパク質への結合、
(e)生細胞内部でのその核酸の発現、および細胞内部におけるプロモータ類、エンハンサー類または癌遺伝子類のような遺伝子発現によるそれの修飾または調節。
【0015】
DNA片(例、PCR生成物)中にある単一または多重の突然変異および欠失は、前記“レインボウタンパク質”を上記のDNAの1末端に連結させ、さらにエネルギー転移受容体またはクエンチャーを他の末端に連結することによって検出できる。突然変異におけるヌクレアーゼの攻撃によって、前記レインボウタンパク質は上記受容体またはクエンチャーと区分され、それによって、発光の強度、色または偏光状態の変化が生ずる。
【0016】
1種以上のアミノ酸(類)のこのような改変、置換、添加または除去は、化学的手段によって達成できる。
酸の改変には、アルキル化(例 メチル化)、リン酸化および本文に概略した種類のさまざまな他の共有結合的修飾が含まれる。あるいは、ルシフェラーゼまたは発光タンパク質のコードを指定する核酸は、結果として生成されるタンパク質がカチオン類、アニオン類、細胞内シグナル、測定すべきタンパク質類または核酸の共有結合的修飾と、相互作用する部位を獲得するかまたは喪失するように、1種以上のヌクレオチド類を修飾、置換、挿入または欠失することによって改変することができる。
【0017】
ヌクレオチド類の前記挿入または欠失は、通常、部位特異的突然変異誘発によって、または、前記遺伝子を特異的制限酵素で切断開裂し、選択したヌクレオチド配列を挿入または欠失させ次に前記遺伝子を再度つなぎ合わせ、またはポリメラーゼ連鎖反応で特異的プライマー類を使用して、引き起こされる。この核酸は、次にmRNAに転写され、次いで翻訳されて細菌または真核生物細胞の内部でか、あるいはインビトロで例えばウサギ網状赤血球溶解液を用いるか、のいずれかでレインボウタンパク質を産生する。
【0018】
この新規の核酸は、T7、SP6のようなRNAポリメラーゼプロモータ、または、アクチン、ミオシン、ミエリンタンパク質類、MMT−V、SV40、抗体、G6Pデヒドロゲナーゼのような哺乳類プロモータ類を含有してもよく、そして、前記ポリメラーゼ連鎖反応によってインビトロで増幅させることができる。この結果、前記レインボウタンパク質は、癌細胞のような生細胞中で、または、インビトロで酵素反応を用いて細胞なしで産生できる。
【0019】
前記未改変または改変生物発光タンパク質をコードするDNAの5’または3’末端へ組織特異的プロモータまたはエンハンサー配列を付加すると、それがレポータ遺伝子として使用可能になり、そして、特定の細胞または組織において特異的に発現されることが可能となり、その発現は、光強度、色または偏光度の変化の出現によって検出できる。
【0020】
レインボウタンパク質のためのDNA調製の別の方法は、前記生物発光タンパク質のための元のDNAを2つの半分に分離することである。そして、DNAまたは遺伝子一片は、その5’末端に上記の1つの半分を結合し、そしてその3’末端に上記の他の半分を結合することによって、前記2つの半分の間に挿入される。
【0021】
さらに別の方法として、前記レインボウタンパク質DNAはポリメラーゼ連鎖反応によって産生することができ、その際、センスプライマーは5’末端に結合したレインボウタンパク質DNAの1部分を有し、アンチセンスプライマーは3’末端に結合した他の部分(すなわちアンチセンス)を有している。
【0022】
中間にある対象とするDNAまたは遺伝子の片類は、2つの別々の遺伝子類から由来することができる。例えば、ひとつがエネルギー転移タンパク質を、他が生物発光タンパク質をコードすることができる。上記2つがペプチド(DNA/RNA由来)を介して連結されるときにのみ、前記レインボウタンパク質が産生されて色のシフトが起こる。
【0023】
エネルギー転移タンパク質は、前記タンパク質と共有結合または非共有結合で結合したいかなるフルオアーであることもでき、例えば、オワンクラゲ、ヤクチクラゲ、ウスカワミジンコまたは他の刺胞動物類由来の緑色蛍光タンパク質、または発光性細菌類由来の青または黄色蛍光タンパク質、またはフラビンタンパク質(flavoprotein)またはフィオビロプロテイン(phyobiloprotein) であることができる。
【0024】
前記タンパク質全体としてでもまたはその蛍光領域のみでも使用できる。前記生物発光タンパク質は、例えば、細菌、ホタル、ツチボタル、またはカイアシなどのルシフェラーゼでもよく、または、例えばエクオリン、オベリン、サラシコリンのようなラジオラリンのためのいかなる発光タンパク質であってもよい。
【0025】
前記タンパク質またはそのDNAまたはRNAは、ウイルス、プラスミド、リン酸カルシウム・トランスフェクション、電気穿孔法、リポゾーム融合、または膜孔形成性タンパク質類を用いて、生細菌または真核細胞中に取り込むことができる。いったん内部に入ると、適当な生化学性質を有する生細胞のみが前記“レインボウ”効果をもたらす。
【0026】
前記“レインボウタンパク質”遺伝子を胚、卵母細胞、精子、種子または実生に取り込むことによって、トランスジェニック動物または植物が産生され、前記“レインボウ効果”を用いて遺伝子発現、細胞制御、薬物作用または細胞障害のそれぞれの器官中における位置特定できしかも測定できるようになる。これらの新規有機体は、家庭用飼育水槽中で、飛行機滑走路上で、海上の安全灯として、および室内鉢植え草花用などにも使用できる。
【0027】
前記レインボウタンパク質は、また、化学的手段によってまたは前記タンパク質を遺伝子工学処理によって形質膜の内または外表面または特定の細胞内小器官(例 パーオキシゾーム、ミトコンドリア、クロロプラスト、小胞体、ゴルジ、分泌小胞、核またはエンドゾーム)内部に位置するようにシグナルペプチドを含有させることによって、細胞の種々の部分に取り込ませることもできる。
【0028】
化学的にまたは遺伝子工学によってシグナルペプチドを添加することによって、前記正常または改変ルシフェラーゼまたは発光タンパク質を細胞内部の特定の細胞小器官または形質膜の内または外表面上にターゲットさせることができる。例えば、N末端の配列MLSRLSLRLLSRYLL は前記生物発光タンパク質をミトコンドリア内に位置させ、そして、N末端のKKSALLALMYVCPGKADKE は前記タンパク質を小胞体へターゲットさせ、C末端のKDEL配列は、それをそこに保持する。
【0029】
元のルシフェラーゼまたは発光タンパク質またはその遺伝子は、生物発光で公知の化学物質(図1参照)のいずれかから、または少なくとも16個の門を代表する700以上の属から由来する広い範囲の未解析の発光性有機体から、由来することができる。前記ルシフェリンは化学的に合成されてもよく、そして、前記生体反応または細胞に添加されて光を発することもできる。
【0030】
あるいは、ルシフェリン生成を担っている酵素類をコードする遺伝子は、前記“レインボウタンパク質”遺伝子と結合され、その結果、人工オペロンまたは融合遺伝子が発現して、生細胞中でアミノ酸のような正常な細胞成分からレインボウタンパク質およびルシフェリンを生成する。
【0031】
本発明の第2の実施態様によれば、化学的手段または前記タンパク質をコードする核酸の遺伝子工学的手段によって、前記タンパク質に対する1個以上のアミノ酸を改変、置換、添加または欠失させることによって、生物発光タンパク質を調製する方法を提供する。
【0032】
本発明のさらに別の実施態様によれば、先に定義された生物発光タンパク質をコードする核酸が提供される。
前記レインボウタンパク質またはそれをコードする核酸は、
(a)微生物類(原生動物、細菌、位置特定類)の検出、位置特定および測定、(b)癌細胞の検出および位置特定、
(c)細胞または体液中における酵素類、細胞内シグナル伝達およびその他の代謝回転反応測定、
(d)DNAおよびRNA結合アッセイ、
(e)イムノアッセイおよびその他のタンパク質結合アッセイのような生物研究領域で使用できる。
【0033】
前記レインボウタンパク質およびそれらの元の核酸類は、また、遺伝子工学においてトランスジェニック動物類、植物類および微生物類の開発、および園芸においても使用できる。
【0034】
本発明のさらに別の実施態様によれば、微生物類、細胞類または生体分子類またはその中での反応のような生物学上関心を寄せられる物質類の検出、位置特定または測定のための、前記レインボウタンパク質またはこのレインボウタンパク質をコードする核酸の用途が提供される。
【0035】
この実施態様において、生物学上重要な反応または物質類は、レインボウタンパク質またはその元の核酸と相互作用させられる。このような相互作用には、非共有結合または共有結合のような直接的または間接的結合、およびエネルギー転移過程が含まれる。
【0036】
【実施例】
本発明を上述してきたが、それが、上記に述べたかまたは下記に記載の特徴のいかなる発明の組み合わせも含むことを理解すべきである。
本発明はさまざまな方法で実施することができ、また、下記のいくつかの実施例を参照にしてさらに説明する:
【0037】
実施例1
レインボウタンパク質のリン酸化の検出
ケンプチドとして公知のペプチドleu arg arg ala ser leu glyまたはマランチドとして公知のRTKRSGSVYEPLKTを、ジサクシニル・スベラートを用いてpH3でホタルのルシフェラーゼに共有結合させた。プロテインキナーゼA125μl+サイクリックAMP(200μM)+125μMATPを添加して前記ケンプチドをリン酸化させ、それによってルシフェラーゼに結合させた。
【0038】
pH7.8 における黄緑色から赤色への色のシフト、またはpH6.5 における赤色から黄緑色への色のシフトを二波長ケミ・ルミノメータにおける比率として測定し、前記キナーゼによるタンパク質リン酸化の割合をアッセイし、ホスファターゼによって誘発された脱リン酸化を前記比率の逆数によってアッセイした。
【0039】
実施例2
人工ホタル・ルシフェラーゼ
ホタル・ルシフェラーゼをコードするcDNAは、T7 RNAポリメラーゼプロモータと共に用いられる下記の5’センスプライマー類と、3’アンチセンスプライマー類、を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅させた:プライマーコードを以下に示す。
【0040】
5’センス・プライマー類
(105)CACCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGAAGACGCCAAAAAC
(107)AGAACTGCCTGCCGCAGATTCTCGCA
(110)ATGCTGTCCCGGCTGTCCCTGCGGCTGCTGTCCCGGTACCTGCTGAAGACGCCAAAAAC
(111)CACCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCTGTCCCGGCTGTCC
【0041】
3’アンチセンス・プライマー類
(100)TCTCGCTGAATACAGTTAC
(106)CCCCAAGCTTAGATCTCTCTGATTTTTCTTGCGT
(108)TGCGAGAATCTGCGGCAGGCAGTTCT
【0042】
下記のホタル・ルシフェラーゼcDNA類は、以下のプライマー類を用いて構築された:
(a)全長(105+100)
(b)−36bpすなわち、パーオキシソマル・シグナルペプチド欠失(105+106)
(c)タンパク質中央部のプロテインキナーゼA部位(RRXS)
(段階1:105+108および107+100; 段階2:段階1からの半分2個+105+100)
(d)N末端のミトコンドリア・シグナル
(段階1:110 +100 ; 段階2:段階1の試料+111+100)。
【0043】
50μl中におけるPCR反応は、10mM Tris pH8.3、0.01%ゼラチン、0.4U Taqポリメラーゼ、2mM MgCl2 、各0.2mMのdATP,dGTP,dTTP,dCTP,0.5μMの各プライマー、1μlのDNA(およそ1−100ng)を含有していた。
【0044】
本反応は、50μlの鉱物油でカバーされ、パーキンエルマー(Perkin−Elmer )サーマルサイクラー中で25サイクル、即ち、94℃−1分、55℃−1分、72℃−2分+各サイクルの5秒延長、でインキュベートし、さらに、1UのE.coli DNAポリメラーゼ(クレノウ(Klenow )断片)とともに37℃で30分間、インキュベートした。
【0045】
PCRの成功は、アガロースゲル電気泳動のバンドによって確認した。cDNAはセントリコンによって精製し、プライマー類を除去し、そして、緩衝フェノール:CHCl3 :2級アミルアルコール(25:24:1)で抽出後、70%エタノール、0.7mM 酢酸アンモニウム中で沈澱させた。
【0046】
前記DNA(10mM Tris 0.1 または1mM EDTA pH7.4 〜7.5 中に溶解した0.5〜1μg)は、37℃で4時間まで(最適には1〜2時間)、40mM Tris, pH7.4 〜7.5, 5.6mM MgCl2 、10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mlウシ血清アルブミン、2mM スパーミジン、各0.5mMのATP,CTP,UTP,0.1mMのGTP,0.5mMのcap m7 G(5’)ppp(5’)G,1000UのRNA sin/ml、800UのT7 RNA ポリメラーゼ±2μ、C32P−UTPを含有する緩衝液中で、前記のT7 RNAポリメラーゼ中に転写した。
【0047】
本反応は、氷冷フェノール:CHCl3:2級アミルアルコール(25:24:1)中で停止させ、そして、前記RNAを70%エタノール+0.7M NH4Acで沈澱させ、−20℃で保存した。
【0048】
前記RNAを遠心分離し、20μlの70mM Tris、1mM EDTApH7.4〜7.5中に再溶解させ、そして、1μlを5〜10μlのウサギ網状赤血球溶解液とともに30℃で1時間インキュベートして、ルシフェラーゼを合成した。1/100希釈後のルシフェラーゼを、50mM Tris10mM MgCl2、0.1mg/mlウシ血清アルブミン、0.1〜0.2mMルシフェリン、0.5〜5mM ATP中pH7.8 で直接発光をアッセイするかまたは等電点電気泳動によって単離する。
【0049】
突然変異体(RRXS)ルシフェラーゼは、およそ7.1または6.8のpIを有し、そして、正常のルシフェラーゼは、およそ6.8のpIを有している。ミトコンドリア・シグナルを有するルシフェラーゼは、また、正常ルシフェラーゼから分離された。この改変ルシフェラーゼを含有するウサギ網状赤血球溶解液を添加すると、それは、遠心分離およびミトコンドリアおよびルシフェラーゼからの発光によっても示されるように、添加されたミトコンドリアによって取り込まれた。
【0050】
プロテインキナーゼA、サイクリックAMP(0.2mM), ATP(0.1−1mM)pH7とともにRRXSを含むルシフェラーゼのリン酸化によって、ルシフェラーゼのpIを再度6.8に戻すように変化させその色をシフトさせた。RRXSルシフェラーゼは、干渉フィルター付二波長ケミルミノメータを用いて検出した時に未改変ルシフェラーゼよりも強い緑色の発光を有していた(最大透過率およそ545および603mM)。
【0051】
ケンプチドヌクレオチドセンスまたはアンチセンス配列(LRRASLG )またはマランチド RTKRSGSVYEPLKI を含有するプライマー類は、同様に、1または2段階のPCR反応を用いてNまたはC末端のいずれかに添加された。これらは、また、リン酸化されることができるルシフェラーゼを産生し、それによって、その強度および色を変化させた。
【0052】
実施例3
工学処理されたエクオリンの調製
cDNAすなわちCa2+活性化発光タンパク質のゲノムコードは、ホタル・ルシフェラーゼのそれと同様の方法でPCRされた。1または2段階PCRを用いて、プロテインキナーゼA認識ペプチド・ケンプチド(LRRLALG )またはマランチド(実施例2に同じ)をN末端に添加した。突然変異エクオリンは、異なるキネティック特性を有しており、改変エクオリン(上記)をリン酸化することによってプロテイン・キナーゼAを検出可能とした。
【0053】
正常エクオリン・プライマー類=5’センス TAATACGACTCACTATAGGGGAGAGAATGGTCAAGCTTTACATCAGACTTCGAC と、3’アンチセンス GAATTCTTAGGGGACAGCTCCACCGTA であった。N末端へのケンプチド挿入のために、LRRASLG と等価のヌクレオチド配列をエクオリンの5’末端から最初の15塩基(ATGを含む)に結合させた。
【0054】
段階2において、前記T7 RNAポリメラーゼ・プロモータを添加して、インビトロ・リン酸化のためにケンプチド−エクオリンをインビトロで形成した。ゲノム・エクオリンDNA(PCRによって作製)は、逆転写酵素PCRによってmRNAから製造されたそれと少なくとも同じくらい活性であった。
【0055】
実施例4
血中の癌細胞の検出
血液試料(1ml)を図1のベンゾチアゾール反応3を触媒するレインボウタンパク質類をコードするmRNA含有リポゾーム類の懸濁液に混合する。このmRNAは、下記のようにして産生された:
【0056】
ホタル・ルシフェラーゼをコードする遺伝子は、最初に、(pCDV1プラスミドプライマー)+(SP6 RNAポリメラーゼプロモータ含有ホンジョー(Honjo)リンカー)を用いて、E.coli中のcDNAライブラリから単離した。myc癌遺伝子のチロシンキナーゼ活性のためのリン酸化部位を示すヌクレオチド配列
GCTCGTCTTATTGAAGATAATGAATATACTGCTCGTTTTGGT
を、5’末端のATGから30塩基対下流のEcoRI制限部位に挿入した。
【0057】
前記DNAを再び連結し、再クローン化し、そして、前記プラスミド挿入物はインビトロでSP6 RNAポリメラーゼによって転写されてレインボウタンパク質のためのmRNAを産生した。前記の元のタンパク質は黄緑光を発生したが、しかし、レインボウタンパク質は細胞中でリン酸化されたときに赤色光を発生した。したがって、癌細胞の存在は、二波長ケミルミノメータ中で赤色(603nm)に対する黄緑色(545nm)の光の比率を測定することによって、白血病患者の血液試料中で検出された。
【0058】
実施例5
サルモネラ(Salmonella)の検出
SP6 RNAポリメラーゼプロモータを含有する実施例4のレインボウタンパク質のためのcDNAを、サルモネラ(Salmonella)ファージ中に挿入した。このファージをサルモネラ(Salmonella)に添加すると、レインボウタンパク質を発現させおよび赤色光を発生させ、20ml当たり1個しかない細菌も検出できた。
【0059】
実施例6
HIV RNAの検出
AIDS患者の血液試料(1ml)を4Mグアニジウムイソチオシアナートによって抽出し、そして、前記核酸をエタノール/NH酢酸によって沈澱させた。前記発光タンパク質オベリンから産生したレインボウタンパク質で標識したオリゴヌクレオチド(10μl,1μM)を、100μlの再溶解RNAに50℃で添加して、この混合物を0℃で10分間冷却した。
【0060】
このオリゴヌクレオチドは、HIVコートタンパク質中の配列に特異的であった。これをHIV RNAに結合して、レインボウタンパク質の発光を淡青(475nm)から青(440nm)にシフトさせた。これは、二重光電子増倍管ケミルミノメータ中におけるこれら二波長における発光の比率のシフトとして検出された。
【0061】
実施例7
血液中テストステロンの測定
テストステロン・カルボキシオキシムを、発光タンパク質オベリン由来レインボウタンパク質と反応させ、テストステロン・レインボウタンパク質結合物(conjugate) を形成させる。この1nmolを含有する5μlを、さまざまな濃度の標準テストステロンの存在下または非存在下に、テストステロン(50μl)pH7.4 に対してフルオロセイン標識した抗体溶液とともに、30分間インキュベートした。
【0062】
生物発光反応は、Caの添加によって惹起され、そして、475nmの光の530nmの光に対する比率を測定した。標準テストステロン濃度を増加するとともに、475/530比率が増大した。本操作は、遊離抗原から結合抗原を分離する必要もなく実行することができた。
【0063】
実施例8
リステリア菌の検出
疑いのある食品試料を沸騰させ、DNAを抽出する。特異的リステリア菌遺伝子またはオベリンcDNA+5P6RNAポリメラーゼプロモーターに共有結合で結合した領域に対するセンスプライマ、およびアンチセンス緑色蛍光タンパク質(GFP)cDNAに共有結合で結合したアンチセンスプライマー、を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてリステリア菌(Listeria)遺伝子を増幅させる。この結果、新規レインボウタンパク質のコードを指定し且つSP6 RNAポリメラーゼによって転写可能なDNAとなる。
【0064】
【0065】
このDNAは転写され、そして、mRNAは、ウサギ網状赤血球溶解液を用いて翻訳される。コエレンテラジンを添加しオベリンを再活性化する。オベリン単独に対するレインボウタンパク質に対応する510/475nmにおける光の比率は、食品試料中に最初から存在するリステリア菌DNAの量に直接比例する。リステリア菌が全く存在しないとき、比率の割合は1である。
【0066】
実施例9
偏光による核酸ハイブリダイゼーションの測定
実施例6に記載の反応を実施したが、光発光は、偏向板を互いに90°として偏向フイルター付き2光電子増倍管ケミルミノメータで検出した。上記2個の光電子増倍管の比は、存在するHIV RNAの量に関連していた。
【0067】
実施例10
サイクリックAMPまたはIp3の測定
実施例2または3に記載の2段階PCR反応を用いて、前記細菌性CAPタンパク質または小胞体受容体のIp3結合領域からのサイクリックAMP結合領域を、前記NまたはC末端にまたはホタル・ルシフェラーゼまたはエクオリンに添加した。前記改変タンパク質類は、実施例2または3に記載のようにしてPCRDNA生成物からインビトロで作製され、そして、発光サイクリックAMPまたはIp3の活性および発光色によって特性解析した。
【0068】
強度および色の両方の変化によって、細胞抽出物または生細胞中でCAMPまたはIp3が測定可能となった。イメージ・インテンシファイアーを用いて、CAMPまたはIp3“クラウド”は、この1個の細胞の中で可視化できた。同様に、エクオリンまたはルシフェラーゼは、もしそれが最初にそれ(+KDEL)とC末端で結合したERまたはミトコンドリ・アシグナルで調製されたならば、ERまたはミトコンドリオン内部で見ることができた。
【0069】
生物発光タンパク質が、生物によって産生されたタンパク質の修飾による代わりに、アミノ酸配列から、またはDNAまたはRNA合成技術を用いて合成できることが理解されるであろう。
【0070】
【配列表】
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物発光タンパク質類に関し、特に、例えば化学的手段によって又は遺伝子工学によって修飾された生物発光タンパク質類に関する。
【0002】
【従来の技術】
このような修飾された生物発光タンパク質類は、以下で“レインボウタンパク質類”と呼び、細胞とか、細菌・ウイルスおよび原生動物のような微生物類、および基質類・代謝物類・細胞内および細胞外シグナル類・酵素類・抗原類・抗体類および核酸類のような生物学的に重要な物質類、の検出および定量に使用することができる。
【0003】
生物発光は、有機分子である“ルシフェリン”の酸素またはその代謝物類のひとつによる酸化であり、光を発するものである。この反応は、ルシフェリンが周囲の液体中に拡散しないルシフェラーゼと非常に緊密にまたは共有結合で結合しているとき、通常“ルシフェラーゼ”または“発光タンパク質”として知られているタンパク質によって触媒される。
【0004】
O2(またはO2 − または H2O2)+ルシフェリン+ルシフェラーゼ(または発光タンパク質)→オキシルシフェリン+光
【0005】
光を発するためまたはその色を変化させるため、3種までの他の物質類が同様に存在することが必要となることがあり、それらは下記のとおりである:
(a)H+、Ca2+、Mg2+のようなカチオン、またはCu+/Cu2+、Fe2+/Fe3+ のような遷移金属。
(b)NADH,FMN,またはATPのような補因子。
(c)エネルギー転移受容体としてのフルオアー(fluor) 。
【0006】
これまでに5種の化学属のルシフェリンが確認されている。(付属図面の図1参照):
(a)アルデヒド類(細菌、淡水リンペット・ラティア(Latia) およびミミズ中に見られる)。
(b)イミダゾロピラジン類(有毛根足類、刺胞動物、有櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊索動物)。
(c)ベンゾチアゾール(ホタル類およびツチボタル類のような甲虫類に見られる)。
(d)直鎖テトラピロール類(双鞭毛藻類、オキアミ、一部の魚類に見られる)。
(e)フラビン類(細菌、真菌、多毛類および一部の軟体動物に見られる)。
【0007】
これらのルシフェリン類が関与する反応の結果、紫、青、青緑、緑、黄または赤色光および時には紫外線または赤外線(IR)の発光が起り、このような発光は、直線にまたは円に偏光されることもある。生物発光反応についてのこれ以上の説明については、A.K.Champbell 著、Chemiluminescence principles and applications in biology and medicine(化学発光の原理および生物および医学における応用)(1988年、Horwood/VCH Chichester Weinheim 発行)を参考のこと。
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
さて、修飾された生物発光性または“レインボウ”タンパク質が関与する生物発光反応によって発生した光の強度、色または偏光度が変化する可能性があることが知られている。したがってこのような変化を細胞、微生物および生体分子類の検出、位置特定および測定のためのさまざまなアッセイに使用できる。
【0009】
【課題を解決するための手段】
この例では、前記細胞または物質は、遺伝子工学で産生されたルシフェラーゼのようなレインボウタンパク質に物理的またはリン酸化のような化学的変化を引き起こし、発光の強度、色または偏光に変化をもたらす。前記生物発光反応は、例えば、ルシフェリンを添加することによって惹起され、そして、測定すべき細胞または物質によって前記ルシフェラーゼが修飾されると、より短波長またはより長波長の光を発光する反応を引き起こす。
【0010】
これによって、生細胞中において、細胞小器官内部または形質膜の内または外表面において、それらを切断開裂する必要もなくまた結合フラクションおよび非結合フラクションを分離する必要もなく、特異的反応を検出し定量化できる。
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明の1つの態様においては、異なる物理的、化学的、生化学的または生物学的条件下において改変された特徴をもつ光または放射線を生成する生物発光反応に関与できる生物発光タンパク質が提供される。
【0012】
このレインボウタンパク質は、前記ルシフェラーゼまたは発光タンパク質の末端からまたはその内部において1個以上のアミノ酸(類)を改変、置換、添加または除去することによって生成される。その結果、オキシルシフェリンからの発光は、物理的または化学的条件に応じて異なる色または異なる状態の偏光となることができる。レインボウスペクトルの別の部分への色の変化は、以下のものによって誘発できる。
【0013】
(a)H、Ca、Mgまたは遷移金属などのカチオン濃度の変化、
(b)Cl− またはリン酸基のようなアニオンの濃度の変化、
(d)リン酸化または脱リン酸化反応(セリン/スレオニン、ヒスチジン、およびチロシンキナーゼ類およびホスファターゼ類を含む)、トランスグルタミネーション、タンパク質分解反応、ADPリボシル化、グリーまたはグルコシル化、ハロゲン化、酸化、メチル化およびミリスチン化を起こす酵素類による前記新規タンパク質の共有結合修飾、
【0014】
(d)抗原、サイクリックAMPのような細胞内シグナル、サイクリックGMP,Ip3,Ip4,ジアシルグリセロール、ATP,ADP,AMP,GTP全てのオキシ,またはデオキシリボヌクレオシドまたはヌクレオチド、基質、薬物、核酸、遺伝子調節タンパク質のレインボウタンパク質への結合、
(e)生細胞内部でのその核酸の発現、および細胞内部におけるプロモータ類、エンハンサー類または癌遺伝子類のような遺伝子発現によるそれの修飾または調節。
【0015】
DNA片(例、PCR生成物)中にある単一または多重の突然変異および欠失は、前記“レインボウタンパク質”を上記のDNAの1末端に連結させ、さらにエネルギー転移受容体またはクエンチャーを他の末端に連結することによって検出できる。突然変異におけるヌクレアーゼの攻撃によって、前記レインボウタンパク質は上記受容体またはクエンチャーと区分され、それによって、発光の強度、色または偏光状態の変化が生ずる。
【0016】
1種以上のアミノ酸(類)のこのような改変、置換、添加または除去は、化学的手段によって達成できる。
酸の改変には、アルキル化(例 メチル化)、リン酸化および本文に概略した種類のさまざまな他の共有結合的修飾が含まれる。あるいは、ルシフェラーゼまたは発光タンパク質のコードを指定する核酸は、結果として生成されるタンパク質がカチオン類、アニオン類、細胞内シグナル、測定すべきタンパク質類または核酸の共有結合的修飾と、相互作用する部位を獲得するかまたは喪失するように、1種以上のヌクレオチド類を修飾、置換、挿入または欠失することによって改変することができる。
【0017】
ヌクレオチド類の前記挿入または欠失は、通常、部位特異的突然変異誘発によって、または、前記遺伝子を特異的制限酵素で切断開裂し、選択したヌクレオチド配列を挿入または欠失させ次に前記遺伝子を再度つなぎ合わせ、またはポリメラーゼ連鎖反応で特異的プライマー類を使用して、引き起こされる。この核酸は、次にmRNAに転写され、次いで翻訳されて細菌または真核生物細胞の内部でか、あるいはインビトロで例えばウサギ網状赤血球溶解液を用いるか、のいずれかでレインボウタンパク質を産生する。
【0018】
この新規の核酸は、T7、SP6のようなRNAポリメラーゼプロモータ、または、アクチン、ミオシン、ミエリンタンパク質類、MMT−V、SV40、抗体、G6Pデヒドロゲナーゼのような哺乳類プロモータ類を含有してもよく、そして、前記ポリメラーゼ連鎖反応によってインビトロで増幅させることができる。この結果、前記レインボウタンパク質は、癌細胞のような生細胞中で、または、インビトロで酵素反応を用いて細胞なしで産生できる。
【0019】
前記未改変または改変生物発光タンパク質をコードするDNAの5’または3’末端へ組織特異的プロモータまたはエンハンサー配列を付加すると、それがレポータ遺伝子として使用可能になり、そして、特定の細胞または組織において特異的に発現されることが可能となり、その発現は、光強度、色または偏光度の変化の出現によって検出できる。
【0020】
レインボウタンパク質のためのDNA調製の別の方法は、前記生物発光タンパク質のための元のDNAを2つの半分に分離することである。そして、DNAまたは遺伝子一片は、その5’末端に上記の1つの半分を結合し、そしてその3’末端に上記の他の半分を結合することによって、前記2つの半分の間に挿入される。
【0021】
さらに別の方法として、前記レインボウタンパク質DNAはポリメラーゼ連鎖反応によって産生することができ、その際、センスプライマーは5’末端に結合したレインボウタンパク質DNAの1部分を有し、アンチセンスプライマーは3’末端に結合した他の部分(すなわちアンチセンス)を有している。
【0022】
中間にある対象とするDNAまたは遺伝子の片類は、2つの別々の遺伝子類から由来することができる。例えば、ひとつがエネルギー転移タンパク質を、他が生物発光タンパク質をコードすることができる。上記2つがペプチド(DNA/RNA由来)を介して連結されるときにのみ、前記レインボウタンパク質が産生されて色のシフトが起こる。
【0023】
エネルギー転移タンパク質は、前記タンパク質と共有結合または非共有結合で結合したいかなるフルオアーであることもでき、例えば、オワンクラゲ、ヤクチクラゲ、ウスカワミジンコまたは他の刺胞動物類由来の緑色蛍光タンパク質、または発光性細菌類由来の青または黄色蛍光タンパク質、またはフラビンタンパク質(flavoprotein)またはフィオビロプロテイン(phyobiloprotein) であることができる。
【0024】
前記タンパク質全体としてでもまたはその蛍光領域のみでも使用できる。前記生物発光タンパク質は、例えば、細菌、ホタル、ツチボタル、またはカイアシなどのルシフェラーゼでもよく、または、例えばエクオリン、オベリン、サラシコリンのようなラジオラリンのためのいかなる発光タンパク質であってもよい。
【0025】
前記タンパク質またはそのDNAまたはRNAは、ウイルス、プラスミド、リン酸カルシウム・トランスフェクション、電気穿孔法、リポゾーム融合、または膜孔形成性タンパク質類を用いて、生細菌または真核細胞中に取り込むことができる。いったん内部に入ると、適当な生化学性質を有する生細胞のみが前記“レインボウ”効果をもたらす。
【0026】
前記“レインボウタンパク質”遺伝子を胚、卵母細胞、精子、種子または実生に取り込むことによって、トランスジェニック動物または植物が産生され、前記“レインボウ効果”を用いて遺伝子発現、細胞制御、薬物作用または細胞障害のそれぞれの器官中における位置特定できしかも測定できるようになる。これらの新規有機体は、家庭用飼育水槽中で、飛行機滑走路上で、海上の安全灯として、および室内鉢植え草花用などにも使用できる。
【0027】
前記レインボウタンパク質は、また、化学的手段によってまたは前記タンパク質を遺伝子工学処理によって形質膜の内または外表面または特定の細胞内小器官(例 パーオキシゾーム、ミトコンドリア、クロロプラスト、小胞体、ゴルジ、分泌小胞、核またはエンドゾーム)内部に位置するようにシグナルペプチドを含有させることによって、細胞の種々の部分に取り込ませることもできる。
【0028】
化学的にまたは遺伝子工学によってシグナルペプチドを添加することによって、前記正常または改変ルシフェラーゼまたは発光タンパク質を細胞内部の特定の細胞小器官または形質膜の内または外表面上にターゲットさせることができる。例えば、N末端の配列MLSRLSLRLLSRYLL は前記生物発光タンパク質をミトコンドリア内に位置させ、そして、N末端のKKSALLALMYVCPGKADKE は前記タンパク質を小胞体へターゲットさせ、C末端のKDEL配列は、それをそこに保持する。
【0029】
元のルシフェラーゼまたは発光タンパク質またはその遺伝子は、生物発光で公知の化学物質(図1参照)のいずれかから、または少なくとも16個の門を代表する700以上の属から由来する広い範囲の未解析の発光性有機体から、由来することができる。前記ルシフェリンは化学的に合成されてもよく、そして、前記生体反応または細胞に添加されて光を発することもできる。
【0030】
あるいは、ルシフェリン生成を担っている酵素類をコードする遺伝子は、前記“レインボウタンパク質”遺伝子と結合され、その結果、人工オペロンまたは融合遺伝子が発現して、生細胞中でアミノ酸のような正常な細胞成分からレインボウタンパク質およびルシフェリンを生成する。
【0031】
本発明の第2の実施態様によれば、化学的手段または前記タンパク質をコードする核酸の遺伝子工学的手段によって、前記タンパク質に対する1個以上のアミノ酸を改変、置換、添加または欠失させることによって、生物発光タンパク質を調製する方法を提供する。
【0032】
本発明のさらに別の実施態様によれば、先に定義された生物発光タンパク質をコードする核酸が提供される。
前記レインボウタンパク質またはそれをコードする核酸は、
(a)微生物類(原生動物、細菌、位置特定類)の検出、位置特定および測定、(b)癌細胞の検出および位置特定、
(c)細胞または体液中における酵素類、細胞内シグナル伝達およびその他の代謝回転反応測定、
(d)DNAおよびRNA結合アッセイ、
(e)イムノアッセイおよびその他のタンパク質結合アッセイのような生物研究領域で使用できる。
【0033】
前記レインボウタンパク質およびそれらの元の核酸類は、また、遺伝子工学においてトランスジェニック動物類、植物類および微生物類の開発、および園芸においても使用できる。
【0034】
本発明のさらに別の実施態様によれば、微生物類、細胞類または生体分子類またはその中での反応のような生物学上関心を寄せられる物質類の検出、位置特定または測定のための、前記レインボウタンパク質またはこのレインボウタンパク質をコードする核酸の用途が提供される。
【0035】
この実施態様において、生物学上重要な反応または物質類は、レインボウタンパク質またはその元の核酸と相互作用させられる。このような相互作用には、非共有結合または共有結合のような直接的または間接的結合、およびエネルギー転移過程が含まれる。
【0036】
【実施例】
本発明を上述してきたが、それが、上記に述べたかまたは下記に記載の特徴のいかなる発明の組み合わせも含むことを理解すべきである。
本発明はさまざまな方法で実施することができ、また、下記のいくつかの実施例を参照にしてさらに説明する:
【0037】
実施例1
レインボウタンパク質のリン酸化の検出
ケンプチドとして公知のペプチドleu arg arg ala ser leu glyまたはマランチドとして公知のRTKRSGSVYEPLKTを、ジサクシニル・スベラートを用いてpH3でホタルのルシフェラーゼに共有結合させた。プロテインキナーゼA125μl+サイクリックAMP(200μM)+125μMATPを添加して前記ケンプチドをリン酸化させ、それによってルシフェラーゼに結合させた。
【0038】
pH7.8 における黄緑色から赤色への色のシフト、またはpH6.5 における赤色から黄緑色への色のシフトを二波長ケミ・ルミノメータにおける比率として測定し、前記キナーゼによるタンパク質リン酸化の割合をアッセイし、ホスファターゼによって誘発された脱リン酸化を前記比率の逆数によってアッセイした。
【0039】
実施例2
人工ホタル・ルシフェラーゼ
ホタル・ルシフェラーゼをコードするcDNAは、T7 RNAポリメラーゼプロモータと共に用いられる下記の5’センスプライマー類と、3’アンチセンスプライマー類、を用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅させた:プライマーコードを以下に示す。
【0040】
5’センス・プライマー類
(105)CACCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGAAGACGCCAAAAAC
(107)AGAACTGCCTGCCGCAGATTCTCGCA
(110)ATGCTGTCCCGGCTGTCCCTGCGGCTGCTGTCCCGGTACCTGCTGAAGACGCCAAAAAC
(111)CACCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCTGTCCCGGCTGTCC
【0041】
3’アンチセンス・プライマー類
(100)TCTCGCTGAATACAGTTAC
(106)CCCCAAGCTTAGATCTCTCTGATTTTTCTTGCGT
(108)TGCGAGAATCTGCGGCAGGCAGTTCT
【0042】
下記のホタル・ルシフェラーゼcDNA類は、以下のプライマー類を用いて構築された:
(a)全長(105+100)
(b)−36bpすなわち、パーオキシソマル・シグナルペプチド欠失(105+106)
(c)タンパク質中央部のプロテインキナーゼA部位(RRXS)
(段階1:105+108および107+100; 段階2:段階1からの半分2個+105+100)
(d)N末端のミトコンドリア・シグナル
(段階1:110 +100 ; 段階2:段階1の試料+111+100)。
【0043】
50μl中におけるPCR反応は、10mM Tris pH8.3、0.01%ゼラチン、0.4U Taqポリメラーゼ、2mM MgCl2 、各0.2mMのdATP,dGTP,dTTP,dCTP,0.5μMの各プライマー、1μlのDNA(およそ1−100ng)を含有していた。
【0044】
本反応は、50μlの鉱物油でカバーされ、パーキンエルマー(Perkin−Elmer )サーマルサイクラー中で25サイクル、即ち、94℃−1分、55℃−1分、72℃−2分+各サイクルの5秒延長、でインキュベートし、さらに、1UのE.coli DNAポリメラーゼ(クレノウ(Klenow )断片)とともに37℃で30分間、インキュベートした。
【0045】
PCRの成功は、アガロースゲル電気泳動のバンドによって確認した。cDNAはセントリコンによって精製し、プライマー類を除去し、そして、緩衝フェノール:CHCl3 :2級アミルアルコール(25:24:1)で抽出後、70%エタノール、0.7mM 酢酸アンモニウム中で沈澱させた。
【0046】
前記DNA(10mM Tris 0.1 または1mM EDTA pH7.4 〜7.5 中に溶解した0.5〜1μg)は、37℃で4時間まで(最適には1〜2時間)、40mM Tris, pH7.4 〜7.5, 5.6mM MgCl2 、10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mlウシ血清アルブミン、2mM スパーミジン、各0.5mMのATP,CTP,UTP,0.1mMのGTP,0.5mMのcap m7 G(5’)ppp(5’)G,1000UのRNA sin/ml、800UのT7 RNA ポリメラーゼ±2μ、C32P−UTPを含有する緩衝液中で、前記のT7 RNAポリメラーゼ中に転写した。
【0047】
本反応は、氷冷フェノール:CHCl3:2級アミルアルコール(25:24:1)中で停止させ、そして、前記RNAを70%エタノール+0.7M NH4Acで沈澱させ、−20℃で保存した。
【0048】
前記RNAを遠心分離し、20μlの70mM Tris、1mM EDTApH7.4〜7.5中に再溶解させ、そして、1μlを5〜10μlのウサギ網状赤血球溶解液とともに30℃で1時間インキュベートして、ルシフェラーゼを合成した。1/100希釈後のルシフェラーゼを、50mM Tris10mM MgCl2、0.1mg/mlウシ血清アルブミン、0.1〜0.2mMルシフェリン、0.5〜5mM ATP中pH7.8 で直接発光をアッセイするかまたは等電点電気泳動によって単離する。
【0049】
突然変異体(RRXS)ルシフェラーゼは、およそ7.1または6.8のpIを有し、そして、正常のルシフェラーゼは、およそ6.8のpIを有している。ミトコンドリア・シグナルを有するルシフェラーゼは、また、正常ルシフェラーゼから分離された。この改変ルシフェラーゼを含有するウサギ網状赤血球溶解液を添加すると、それは、遠心分離およびミトコンドリアおよびルシフェラーゼからの発光によっても示されるように、添加されたミトコンドリアによって取り込まれた。
【0050】
プロテインキナーゼA、サイクリックAMP(0.2mM), ATP(0.1−1mM)pH7とともにRRXSを含むルシフェラーゼのリン酸化によって、ルシフェラーゼのpIを再度6.8に戻すように変化させその色をシフトさせた。RRXSルシフェラーゼは、干渉フィルター付二波長ケミルミノメータを用いて検出した時に未改変ルシフェラーゼよりも強い緑色の発光を有していた(最大透過率およそ545および603mM)。
【0051】
ケンプチドヌクレオチドセンスまたはアンチセンス配列(LRRASLG )またはマランチド RTKRSGSVYEPLKI を含有するプライマー類は、同様に、1または2段階のPCR反応を用いてNまたはC末端のいずれかに添加された。これらは、また、リン酸化されることができるルシフェラーゼを産生し、それによって、その強度および色を変化させた。
【0052】
実施例3
工学処理されたエクオリンの調製
cDNAすなわちCa2+活性化発光タンパク質のゲノムコードは、ホタル・ルシフェラーゼのそれと同様の方法でPCRされた。1または2段階PCRを用いて、プロテインキナーゼA認識ペプチド・ケンプチド(LRRLALG )またはマランチド(実施例2に同じ)をN末端に添加した。突然変異エクオリンは、異なるキネティック特性を有しており、改変エクオリン(上記)をリン酸化することによってプロテイン・キナーゼAを検出可能とした。
【0053】
正常エクオリン・プライマー類=5’センス TAATACGACTCACTATAGGGGAGAGAATGGTCAAGCTTTACATCAGACTTCGAC と、3’アンチセンス GAATTCTTAGGGGACAGCTCCACCGTA であった。N末端へのケンプチド挿入のために、LRRASLG と等価のヌクレオチド配列をエクオリンの5’末端から最初の15塩基(ATGを含む)に結合させた。
【0054】
段階2において、前記T7 RNAポリメラーゼ・プロモータを添加して、インビトロ・リン酸化のためにケンプチド−エクオリンをインビトロで形成した。ゲノム・エクオリンDNA(PCRによって作製)は、逆転写酵素PCRによってmRNAから製造されたそれと少なくとも同じくらい活性であった。
【0055】
実施例4
血中の癌細胞の検出
血液試料(1ml)を図1のベンゾチアゾール反応3を触媒するレインボウタンパク質類をコードするmRNA含有リポゾーム類の懸濁液に混合する。このmRNAは、下記のようにして産生された:
【0056】
ホタル・ルシフェラーゼをコードする遺伝子は、最初に、(pCDV1プラスミドプライマー)+(SP6 RNAポリメラーゼプロモータ含有ホンジョー(Honjo)リンカー)を用いて、E.coli中のcDNAライブラリから単離した。myc癌遺伝子のチロシンキナーゼ活性のためのリン酸化部位を示すヌクレオチド配列
GCTCGTCTTATTGAAGATAATGAATATACTGCTCGTTTTGGT
を、5’末端のATGから30塩基対下流のEcoRI制限部位に挿入した。
【0057】
前記DNAを再び連結し、再クローン化し、そして、前記プラスミド挿入物はインビトロでSP6 RNAポリメラーゼによって転写されてレインボウタンパク質のためのmRNAを産生した。前記の元のタンパク質は黄緑光を発生したが、しかし、レインボウタンパク質は細胞中でリン酸化されたときに赤色光を発生した。したがって、癌細胞の存在は、二波長ケミルミノメータ中で赤色(603nm)に対する黄緑色(545nm)の光の比率を測定することによって、白血病患者の血液試料中で検出された。
【0058】
実施例5
サルモネラ(Salmonella)の検出
SP6 RNAポリメラーゼプロモータを含有する実施例4のレインボウタンパク質のためのcDNAを、サルモネラ(Salmonella)ファージ中に挿入した。このファージをサルモネラ(Salmonella)に添加すると、レインボウタンパク質を発現させおよび赤色光を発生させ、20ml当たり1個しかない細菌も検出できた。
【0059】
実施例6
HIV RNAの検出
AIDS患者の血液試料(1ml)を4Mグアニジウムイソチオシアナートによって抽出し、そして、前記核酸をエタノール/NH酢酸によって沈澱させた。前記発光タンパク質オベリンから産生したレインボウタンパク質で標識したオリゴヌクレオチド(10μl,1μM)を、100μlの再溶解RNAに50℃で添加して、この混合物を0℃で10分間冷却した。
【0060】
このオリゴヌクレオチドは、HIVコートタンパク質中の配列に特異的であった。これをHIV RNAに結合して、レインボウタンパク質の発光を淡青(475nm)から青(440nm)にシフトさせた。これは、二重光電子増倍管ケミルミノメータ中におけるこれら二波長における発光の比率のシフトとして検出された。
【0061】
実施例7
血液中テストステロンの測定
テストステロン・カルボキシオキシムを、発光タンパク質オベリン由来レインボウタンパク質と反応させ、テストステロン・レインボウタンパク質結合物(conjugate) を形成させる。この1nmolを含有する5μlを、さまざまな濃度の標準テストステロンの存在下または非存在下に、テストステロン(50μl)pH7.4 に対してフルオロセイン標識した抗体溶液とともに、30分間インキュベートした。
【0062】
生物発光反応は、Caの添加によって惹起され、そして、475nmの光の530nmの光に対する比率を測定した。標準テストステロン濃度を増加するとともに、475/530比率が増大した。本操作は、遊離抗原から結合抗原を分離する必要もなく実行することができた。
【0063】
実施例8
リステリア菌の検出
疑いのある食品試料を沸騰させ、DNAを抽出する。特異的リステリア菌遺伝子またはオベリンcDNA+5P6RNAポリメラーゼプロモーターに共有結合で結合した領域に対するセンスプライマ、およびアンチセンス緑色蛍光タンパク質(GFP)cDNAに共有結合で結合したアンチセンスプライマー、を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を用いてリステリア菌(Listeria)遺伝子を増幅させる。この結果、新規レインボウタンパク質のコードを指定し且つSP6 RNAポリメラーゼによって転写可能なDNAとなる。
【0064】
【0065】
このDNAは転写され、そして、mRNAは、ウサギ網状赤血球溶解液を用いて翻訳される。コエレンテラジンを添加しオベリンを再活性化する。オベリン単独に対するレインボウタンパク質に対応する510/475nmにおける光の比率は、食品試料中に最初から存在するリステリア菌DNAの量に直接比例する。リステリア菌が全く存在しないとき、比率の割合は1である。
【0066】
実施例9
偏光による核酸ハイブリダイゼーションの測定
実施例6に記載の反応を実施したが、光発光は、偏向板を互いに90°として偏向フイルター付き2光電子増倍管ケミルミノメータで検出した。上記2個の光電子増倍管の比は、存在するHIV RNAの量に関連していた。
【0067】
実施例10
サイクリックAMPまたはIp3の測定
実施例2または3に記載の2段階PCR反応を用いて、前記細菌性CAPタンパク質または小胞体受容体のIp3結合領域からのサイクリックAMP結合領域を、前記NまたはC末端にまたはホタル・ルシフェラーゼまたはエクオリンに添加した。前記改変タンパク質類は、実施例2または3に記載のようにしてPCRDNA生成物からインビトロで作製され、そして、発光サイクリックAMPまたはIp3の活性および発光色によって特性解析した。
【0068】
強度および色の両方の変化によって、細胞抽出物または生細胞中でCAMPまたはIp3が測定可能となった。イメージ・インテンシファイアーを用いて、CAMPまたはIp3“クラウド”は、この1個の細胞の中で可視化できた。同様に、エクオリンまたはルシフェラーゼは、もしそれが最初にそれ(+KDEL)とC末端で結合したERまたはミトコンドリ・アシグナルで調製されたならば、ERまたはミトコンドリオン内部で見ることができた。
【0069】
生物発光タンパク質が、生物によって産生されたタンパク質の修飾による代わりに、アミノ酸配列から、またはDNAまたはRNA合成技術を用いて合成できることが理解されるであろう。
【0070】
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