JP3375337B2 - 生物発光タンパク質 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生物発光タンパク質類に関し、特に、それ
は、例えば化学的手段によってまたは遺伝子工学によっ
て修飾された生物発光タンパク質類に関する。このよう
な修飾された生物発光タンパク質類は以下で“レインボ
ウタンパク質類”と呼び、細胞、細菌・ウイルスおよび
原生動物のような微生物類、および基質類・代謝物類・
細胞内および細胞外シグナル類・酵素類・抗原類・抗体
類および核酸類のような生物学的に重要な物質類の検出
および定量に使用できる。
は、例えば化学的手段によってまたは遺伝子工学によっ
て修飾された生物発光タンパク質類に関する。このよう
な修飾された生物発光タンパク質類は以下で“レインボ
ウタンパク質類”と呼び、細胞、細菌・ウイルスおよび
原生動物のような微生物類、および基質類・代謝物類・
細胞内および細胞外シグナル類・酵素類・抗原類・抗体
類および核酸類のような生物学的に重要な物質類の検出
および定量に使用できる。
生物発光は、有機分子である“ルシフェリン”の、酸
素またはその代謝物類のひとつによる酸化による発光で
ある。この反応は、ルシフェリンが、“ルシフェラー
ゼ”または“発光タンパク質”として通常知られている
タンパク質に非常に緊密に、または共有結合で結合して
それが周囲の液体中に拡散しない時、そのタンパク質に
よって触媒される。
素またはその代謝物類のひとつによる酸化による発光で
ある。この反応は、ルシフェリンが、“ルシフェラー
ゼ”または“発光タンパク質”として通常知られている
タンパク質に非常に緊密に、または共有結合で結合して
それが周囲の液体中に拡散しない時、そのタンパク質に
よって触媒される。
O2（またはO2 -またはH2O2）＋ルシフェリン＋ルシフ
ェラーゼ（または発光タンパク質）→オキシルシフェリ
ン＋光 光を発するためまたはその色を変化させるため、３種
までの他の物質類が同様に存在することが必要となるこ
とがあり、そしてそれらは下記のとおりである： （ａ）H+,Ca2+,Mg2+のようなカチオン、またはCu+/C
u2+,Fe2+/Fe3+のような遷移金属。
ェラーゼ（または発光タンパク質）→オキシルシフェリ
ン＋光 光を発するためまたはその色を変化させるため、３種
までの他の物質類が同様に存在することが必要となるこ
とがあり、そしてそれらは下記のとおりである： （ａ）H+,Ca2+,Mg2+のようなカチオン、またはCu+/C
u2+,Fe2+/Fe3+のような遷移金属。
（ｂ）NADH,FMN,またはATPのような補因子。
（ｃ）エネルギー転移受容体としてのフルオアー（fluo
r）。
r）。
これまでに５種の化学属のルシフェリンが同定されて
いる。（付属図面の図１参照）： （ａ）アルデヒド類（細菌、淡水リンペットラティア
（Latia）およびミミズ中に見られる）。
いる。（付属図面の図１参照）： （ａ）アルデヒド類（細菌、淡水リンペットラティア
（Latia）およびミミズ中に見られる）。
（ｂ）イミダゾロピラジン類（有毛根足類、刺胞動物、
有櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊
索動物）。
有櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊
索動物）。
（ｃ）ベンゾチアゾール（ホタル類およびツチボタル類
のような甲虫類に見られる）。
のような甲虫類に見られる）。
（ｄ）直鎖テトラピロール類（双鞭毛藻類、オキアミ、
一部の魚類に見られる）。
一部の魚類に見られる）。
（ｅ）フラビン類（細菌、真菌、多毛類および一部の軟
体動物に見られる）。
体動物に見られる）。
これらのルシフェリン類が関与する反応の結果、紫、
青、青緑、緑、黄または赤色光および時には紫外線また
は赤外線（IR）の発光が起り、このような発光は、直線
にまたは円に偏光されることもある。生物発光反応につ
いてのこれ以上の説明については、A.K.Champbell著、C
hemiluminescence principles and applications in bi
ology and medicine（化学発光の原理および生物および
医学における応用）（1988年、Horwood/VCH Chichester
Weinheim発行）を参考のこと。
青、青緑、緑、黄または赤色光および時には紫外線また
は赤外線（IR）の発光が起り、このような発光は、直線
にまたは円に偏光されることもある。生物発光反応につ
いてのこれ以上の説明については、A.K.Champbell著、C
hemiluminescence principles and applications in bi
ology and medicine（化学発光の原理および生物および
医学における応用）（1988年、Horwood/VCH Chichester
Weinheim発行）を参考のこと。
さて、修飾された生物発光性または“レインボウ”タ
ンパク質を伴う生物発光反応によって発生した光が強
度、色または偏光度が変化する可能性があることが判明
した。したがってこのような変化を細胞、微生物および
生体分子類の検出、位置特定および測定のためのさまざ
まなアッセイに使用できる。
ンパク質を伴う生物発光反応によって発生した光が強
度、色または偏光度が変化する可能性があることが判明
した。したがってこのような変化を細胞、微生物および
生体分子類の検出、位置特定および測定のためのさまざ
まなアッセイに使用できる。
この例では、前記細胞または物質は、遺伝子工学で産
生されたルシフェラーゼのようなレインボウタンパク質
に物理的またはリン酸化のような化学的変化を引き起こ
し、発光の強度、色または偏光に変化をもたらす。前記
生物発光反応は、例えば、ルシフェリンを添加すること
によって惹起され、そして、測定すべき細胞または物質
によって前記ルシフェラーゼが修飾されると、より短波
長またはより長波長の光を発光する反応を引き起こす。
これによって、生細胞中において、細胞小器官内部また
は形質膜の内または外表面において、それらを切断開裂
する必要もなくまた結合フラクションおよび非結合フラ
クションを分離する必要もなく、特異的反応を検出し定
量化できる。
生されたルシフェラーゼのようなレインボウタンパク質
に物理的またはリン酸化のような化学的変化を引き起こ
し、発光の強度、色または偏光に変化をもたらす。前記
生物発光反応は、例えば、ルシフェリンを添加すること
によって惹起され、そして、測定すべき細胞または物質
によって前記ルシフェラーゼが修飾されると、より短波
長またはより長波長の光を発光する反応を引き起こす。
これによって、生細胞中において、細胞小器官内部また
は形質膜の内または外表面において、それらを切断開裂
する必要もなくまた結合フラクションおよび非結合フラ
クションを分離する必要もなく、特異的反応を検出し定
量化できる。
本発明の１つの態様においては、異なる物理的、化学
的、生化学的または生物学的条件下において改変された
特徴をもつ光または放射線を生成する生物発光反応に関
与できる生物発光タンパク質が提供される。
的、生化学的または生物学的条件下において改変された
特徴をもつ光または放射線を生成する生物発光反応に関
与できる生物発光タンパク質が提供される。
このレインボウタンパク質は、前記ルシフェラーゼま
たは発光タンパク質の末端からまたはその内部において
１個以上のアミノ酸（類）を改変、置換、添加または除
去することによって生成される。その結果、オキシルシ
フェリンからの発光は、物理的または化学的条件に応じ
て異なる色または異なる状態の偏光となることができ
る。レインボウスペクトルの別の部分への色の変化は、
以下のものによって誘発できる。
たは発光タンパク質の末端からまたはその内部において
１個以上のアミノ酸（類）を改変、置換、添加または除
去することによって生成される。その結果、オキシルシ
フェリンからの発光は、物理的または化学的条件に応じ
て異なる色または異なる状態の偏光となることができ
る。レインボウスペクトルの別の部分への色の変化は、
以下のものによって誘発できる。
（ａ）H,Ca,Mgまたは遷移金属などのカチオン濃度の変
化、 （ｂ）Cl-またはリン酸基のようなアニオンの濃度の変
化、 （ｃ）リン酸化または脱リン酸化反応（セリン／スレオ
ニン、ヒスチジン、およびチロシンキナーゼ類およびホ
スファターゼ類を含む）、トランスグルタミネーショ
ン、タンパク質分解反応、ADPリボシル化、グリーまた
はグルコシル化、ハロゲン化、酸化、メチル化およびミ
リスチン化を起こす酵素類による前記新規タンパク質の
共有結合修飾、 （ｄ）抗原、サイクリックAMPのような細胞内シグナ
ル、サイクリックGMP,Ip3,Ip4,ジアシルグリセロール、
ATP,ADP,AMP,GTP全てのオキシ，またはデオキシリボヌ
クレオシドまたはヌクレオチド、基質、薬物、核酸、遺
伝子調節タンパク質のレインボウタンパク質への結合、 （ｅ）生細胞内部でのその核酸の発現、および細胞内部
におけるプロモータ類、エンハンサー類または癌遺伝子
類のような遺伝子発現によるそれの修飾または調節。
化、 （ｂ）Cl-またはリン酸基のようなアニオンの濃度の変
化、 （ｃ）リン酸化または脱リン酸化反応（セリン／スレオ
ニン、ヒスチジン、およびチロシンキナーゼ類およびホ
スファターゼ類を含む）、トランスグルタミネーショ
ン、タンパク質分解反応、ADPリボシル化、グリーまた
はグルコシル化、ハロゲン化、酸化、メチル化およびミ
リスチン化を起こす酵素類による前記新規タンパク質の
共有結合修飾、 （ｄ）抗原、サイクリックAMPのような細胞内シグナ
ル、サイクリックGMP,Ip3,Ip4,ジアシルグリセロール、
ATP,ADP,AMP,GTP全てのオキシ，またはデオキシリボヌ
クレオシドまたはヌクレオチド、基質、薬物、核酸、遺
伝子調節タンパク質のレインボウタンパク質への結合、 （ｅ）生細胞内部でのその核酸の発現、および細胞内部
におけるプロモータ類、エンハンサー類または癌遺伝子
類のような遺伝子発現によるそれの修飾または調節。
DNA片（例PCR生成物）中の単一または多重の突然変異
および欠失は、前記“レインボウタンパク質”をDNAを
１末端に連結させ、さらにエネルギー・トランスファー
・アクセプターまたはクエンチャーを他の末端に連結す
ることによって検出できる。突然変異におけるヌクレア
ーゼの攻撃によって、前記レインボウタンパク質は前記
アクセプターまたはクエンチャーから分離され、それに
よって、発光の強度、色または偏光状態の変化を生ず
る。
および欠失は、前記“レインボウタンパク質”をDNAを
１末端に連結させ、さらにエネルギー・トランスファー
・アクセプターまたはクエンチャーを他の末端に連結す
ることによって検出できる。突然変異におけるヌクレア
ーゼの攻撃によって、前記レインボウタンパク質は前記
アクセプターまたはクエンチャーから分離され、それに
よって、発光の強度、色または偏光状態の変化を生ず
る。
１種以上のアミノ酸（類）のこのような改変、置換、
添加または除去は、化学的手段によって達成できる。酸
の改変には、アルキル化（例 メチル化）、リン酸化お
よび本文に概略した種類のさまざまな他の共有結合的修
飾が含まれる。あるいは、ルシフェラーゼまたは発光タ
ンパク質のコードを指定する核酸は、結果として生成し
たタンパク質がカチオン類、アニオン類、細胞内シグナ
ル、共有結合的修飾；測定すべきタンパク質類または核
酸に相互作用する部位を獲得するかまたは喪失するよう
に、１種以上のヌクレオチド類を修飾、置換、挿入また
は欠失することによって改変することができる。ヌクレ
オチド類の前記挿入または欠失は、通常、部位特異的突
然変異誘発によって、または、前記遺伝子を特異的制限
酵素で切断開裂し、選択したヌクレオチド配列を挿入ま
たは欠失させ次に前記遺伝子を再度つなぎ合わせるこ
と、またはポリメラーゼチェーン反応で特異的プライマ
ー類を使用することによって、通常、ひきおこされる。
この核酸は次にmRNAに転写され、これはその後翻訳され
て、細菌または真核生物細胞の内部のいずれかであるい
はインビトロで例えばウサギ網状赤血球溶解液を用いレ
インボウタンパク質を生成する。この新規の核酸は、T7
SP6のようなRNAポリメラーゼプロモータ、または、ア
クチン、ミオシン、ミエリンタンパク質類、MMT−Ｖ、S
V40、抗体、G6Pデヒドロゲナーゼのような哺乳類プロモ
ータ類を含有してもよく、そして、前記ポリメラーゼチ
ェーン反応によってインビトロで増幅させることができ
る。この結果、前記レインボウタンパク質は、癌細胞の
ような生細胞中で、または、インビトロで酵素反応を用
いて細胞なしで産生できる。前記未改変または改変生物
発光タンパク質をコードするDNAの5'または3'末端へ組
織特異的プロモータまたはエンハンサー配列を付加する
と、それがレポータ遺伝子として使用可能になり、そし
て、特定の細胞または組織において特異的に発現される
ことが可能となり、その発現は、光強度、色または偏光
度の変化の出現によって検出できる。
添加または除去は、化学的手段によって達成できる。酸
の改変には、アルキル化（例 メチル化）、リン酸化お
よび本文に概略した種類のさまざまな他の共有結合的修
飾が含まれる。あるいは、ルシフェラーゼまたは発光タ
ンパク質のコードを指定する核酸は、結果として生成し
たタンパク質がカチオン類、アニオン類、細胞内シグナ
ル、共有結合的修飾；測定すべきタンパク質類または核
酸に相互作用する部位を獲得するかまたは喪失するよう
に、１種以上のヌクレオチド類を修飾、置換、挿入また
は欠失することによって改変することができる。ヌクレ
オチド類の前記挿入または欠失は、通常、部位特異的突
然変異誘発によって、または、前記遺伝子を特異的制限
酵素で切断開裂し、選択したヌクレオチド配列を挿入ま
たは欠失させ次に前記遺伝子を再度つなぎ合わせるこ
と、またはポリメラーゼチェーン反応で特異的プライマ
ー類を使用することによって、通常、ひきおこされる。
この核酸は次にmRNAに転写され、これはその後翻訳され
て、細菌または真核生物細胞の内部のいずれかであるい
はインビトロで例えばウサギ網状赤血球溶解液を用いレ
インボウタンパク質を生成する。この新規の核酸は、T7
SP6のようなRNAポリメラーゼプロモータ、または、ア
クチン、ミオシン、ミエリンタンパク質類、MMT−Ｖ、S
V40、抗体、G6Pデヒドロゲナーゼのような哺乳類プロモ
ータ類を含有してもよく、そして、前記ポリメラーゼチ
ェーン反応によってインビトロで増幅させることができ
る。この結果、前記レインボウタンパク質は、癌細胞の
ような生細胞中で、または、インビトロで酵素反応を用
いて細胞なしで産生できる。前記未改変または改変生物
発光タンパク質をコードするDNAの5'または3'末端へ組
織特異的プロモータまたはエンハンサー配列を付加する
と、それがレポータ遺伝子として使用可能になり、そし
て、特定の細胞または組織において特異的に発現される
ことが可能となり、その発現は、光強度、色または偏光
度の変化の出現によって検出できる。
レインボウタンパク質のためのDNA調製の別の方法
は、前記生物発光タンパク質のための元来のDNAを２つ
の半分に分離することである。次に、DNAまたは遺伝子
の5'末端に１つの半分をその3'末端に他の半分を結合す
ることによって、DNAまたは遺伝子の１片を前記２つの
半分の間に挿入する。さらに別の方法として、前記レイ
ンボウタンパク質DNAはポリメラーゼチェーン反応によ
って産生することができ、そのときセンスプライマーは
レインボウタンパク質DNAの5'末端に結合した１部分を
有し、およびアンチセンスプライマーはおよび他の部分
は3'末端に結合（すなわちアンチセンス）している。中
間にある、問題のDNAまたは遺伝子片類は、２つの別々
の遺伝子類から由来することができる。例えば、ひとつ
がエネルギー転移タンパク質を、他が生物発光タンパク
質をコードすることができる。前記２つがペプチド（DN
A/RNA由来）を介して連結されるときにのみ、前記レイ
ンボウタンパク質が産生されて色のシフトが起こる。エ
ネルギー転移タンパク質は、前記タンパク質に共有結合
または非共有結合で結合したいかなるフルオアーである
こともでき、例えば、オワンクラゲ、ヤクチクラゲ、ウ
スカワミジンコまたは他の刺胞動物類由来の緑色蛍光タ
ンパク質、または発光性細菌類由来の青または黄色蛍光
タンパク質、またはフラビンタンパク質（flavoprotei
n）またはフィオビロプロテイン（phyobiloprotein）で
あることができる。前記タンパク質全体としてでもまた
はその蛍光領域のみでも使用できる。前記生物発光タン
パク質は、例えば、細菌、ホタル、ツチボタル、または
カイアシなどのルシフェリンでもよく、または、例えば
エクオリン、オベリン、サラシコリンのようなラジオラ
リンのためのいかなる発光タンパク質であってもよい。
は、前記生物発光タンパク質のための元来のDNAを２つ
の半分に分離することである。次に、DNAまたは遺伝子
の5'末端に１つの半分をその3'末端に他の半分を結合す
ることによって、DNAまたは遺伝子の１片を前記２つの
半分の間に挿入する。さらに別の方法として、前記レイ
ンボウタンパク質DNAはポリメラーゼチェーン反応によ
って産生することができ、そのときセンスプライマーは
レインボウタンパク質DNAの5'末端に結合した１部分を
有し、およびアンチセンスプライマーはおよび他の部分
は3'末端に結合（すなわちアンチセンス）している。中
間にある、問題のDNAまたは遺伝子片類は、２つの別々
の遺伝子類から由来することができる。例えば、ひとつ
がエネルギー転移タンパク質を、他が生物発光タンパク
質をコードすることができる。前記２つがペプチド（DN
A/RNA由来）を介して連結されるときにのみ、前記レイ
ンボウタンパク質が産生されて色のシフトが起こる。エ
ネルギー転移タンパク質は、前記タンパク質に共有結合
または非共有結合で結合したいかなるフルオアーである
こともでき、例えば、オワンクラゲ、ヤクチクラゲ、ウ
スカワミジンコまたは他の刺胞動物類由来の緑色蛍光タ
ンパク質、または発光性細菌類由来の青または黄色蛍光
タンパク質、またはフラビンタンパク質（flavoprotei
n）またはフィオビロプロテイン（phyobiloprotein）で
あることができる。前記タンパク質全体としてでもまた
はその蛍光領域のみでも使用できる。前記生物発光タン
パク質は、例えば、細菌、ホタル、ツチボタル、または
カイアシなどのルシフェリンでもよく、または、例えば
エクオリン、オベリン、サラシコリンのようなラジオラ
リンのためのいかなる発光タンパク質であってもよい。
前記タンパク質またはそのDNAまたはRNAは、ウイル
ス、プラスミド、リン酸カルシウム・トランスフェクシ
ョン、電気穿孔法、リポゾーム融合、または膜孔形成性
タンパク質類を用いて、生細菌または真核細胞中に取り
込むことができる。いったん内部に入ると、適当な生化
学性質を有する生細胞のみが前記“レインボウ”効果を
もたらす。前記“レインボウタンパク質”遺伝子を胚、
卵母細胞、精子、種子または実生に取り込むことによっ
て、トランスジェニック動物または植物が産生され、前
記“レインボウ効果”を用いて遺伝子発現、細胞制御、
薬物作用または細胞障害がそれぞれの器官中において位
置特定できしかも測定できるようになる。これらの新規
有機体は、家庭用飼育水槽中で、飛行機滑走路上で、海
上の安全灯として、および室内鉢植え草花用などにも使
用できる。
ス、プラスミド、リン酸カルシウム・トランスフェクシ
ョン、電気穿孔法、リポゾーム融合、または膜孔形成性
タンパク質類を用いて、生細菌または真核細胞中に取り
込むことができる。いったん内部に入ると、適当な生化
学性質を有する生細胞のみが前記“レインボウ”効果を
もたらす。前記“レインボウタンパク質”遺伝子を胚、
卵母細胞、精子、種子または実生に取り込むことによっ
て、トランスジェニック動物または植物が産生され、前
記“レインボウ効果”を用いて遺伝子発現、細胞制御、
薬物作用または細胞障害がそれぞれの器官中において位
置特定できしかも測定できるようになる。これらの新規
有機体は、家庭用飼育水槽中で、飛行機滑走路上で、海
上の安全灯として、および室内鉢植え草花用などにも使
用できる。
前記レインボウタンパク質は、また、化学的手段によ
ってまたは前記タンパク質を遺伝子工学処理によって形
質膜の内または外表面または特定の細胞内小器官（例
パーオキシゾーム、ミトコンドリア、クロロプラスト、
小胞体、ゴルジ、分泌小胞、核またはエンドゾーム）内
部に位置するようにシグナルペプチドを含有させること
によって、細胞の種々の部分に取り込ませることもでき
る。
ってまたは前記タンパク質を遺伝子工学処理によって形
質膜の内または外表面または特定の細胞内小器官（例
パーオキシゾーム、ミトコンドリア、クロロプラスト、
小胞体、ゴルジ、分泌小胞、核またはエンドゾーム）内
部に位置するようにシグナルペプチドを含有させること
によって、細胞の種々の部分に取り込ませることもでき
る。
化学的にまたは遺伝子工学によってシグナルペプチド
を添加することによって、前記正常または改変ルシフェ
ラーゼまたは発光タンパク質を細胞内部の特定の細胞小
器官または形質膜の内または外表面上にターゲットさせ
ることができる。例えば、Ｎ末端の配列MLSRLSLRLLSRYL
Lは前記生物発光タンパク質をミトコンドリア内に位置
させ、そして、Ｎ末端のKKSALLALMYVCPGKADKEは前記タ
ンパク質を小胞体へターゲットさせ、Ｃ末端のKDEL配列
は、それをそこに保持する。
を添加することによって、前記正常または改変ルシフェ
ラーゼまたは発光タンパク質を細胞内部の特定の細胞小
器官または形質膜の内または外表面上にターゲットさせ
ることができる。例えば、Ｎ末端の配列MLSRLSLRLLSRYL
Lは前記生物発光タンパク質をミトコンドリア内に位置
させ、そして、Ｎ末端のKKSALLALMYVCPGKADKEは前記タ
ンパク質を小胞体へターゲットさせ、Ｃ末端のKDEL配列
は、それをそこに保持する。
元来のルシフェラーゼまたは発光タンパク質またはそ
の遺伝子は、生物発光で公知の化学（図１参照）のいず
れかから、または少なくとも16個の門を代表する700以
上の属から由来する広い範囲の未解析の発光性有機体か
ら、由来することができる。前記ルシフェリンは化学的
に合成されてもよく、そして、前記生体反応または細胞
に添加されて光を発することもできる。あるいは、ルシ
フェリン生成を担っている酵素類をコードする遺伝子
は、前記“レインボウタンパク質”遺伝子と結合され、
その結果、人工オペロンまたは融合遺伝子が、アミノ酸
のような正常な細胞成分からレインボウタンパク質を発
現させそして生細胞中でルシフェリンを生成する。
の遺伝子は、生物発光で公知の化学（図１参照）のいず
れかから、または少なくとも16個の門を代表する700以
上の属から由来する広い範囲の未解析の発光性有機体か
ら、由来することができる。前記ルシフェリンは化学的
に合成されてもよく、そして、前記生体反応または細胞
に添加されて光を発することもできる。あるいは、ルシ
フェリン生成を担っている酵素類をコードする遺伝子
は、前記“レインボウタンパク質”遺伝子と結合され、
その結果、人工オペロンまたは融合遺伝子が、アミノ酸
のような正常な細胞成分からレインボウタンパク質を発
現させそして生細胞中でルシフェリンを生成する。
本発明の第２の実施態様によれば、化学的手段または
前記タンパク質をコードする核酸の遺伝子工学的手段に
よって、前記タンパク質に対する１個以上のアミノ酸を
改変、置換、添加または欠失させることによって、生物
発光タンパク質を調製する方法を提供する。
前記タンパク質をコードする核酸の遺伝子工学的手段に
よって、前記タンパク質に対する１個以上のアミノ酸を
改変、置換、添加または欠失させることによって、生物
発光タンパク質を調製する方法を提供する。
本発明のさらに別の実施態様によれば、先に定義され
た生物発光タンパク質をコードする核酸が提供される。
た生物発光タンパク質をコードする核酸が提供される。
前記レインボウタンパク質またはそれをコードする核
酸は、 （ａ）微生物類（原生動物、細菌、位置特定類）の検
出、位置特定および測定、 （ｂ）癌細胞の検出および位置特定、 （ｃ）細胞または体液中における酵素類、細胞内シグナ
ル伝達およびその他の代謝回転反応測定、 （ｄ）DNAおよびRNA結合アッセイ、 （ｅ）イムノアッセイおよびその他のタンパク質結合ア
ッセイのような生物研究領域で使用できる。
酸は、 （ａ）微生物類（原生動物、細菌、位置特定類）の検
出、位置特定および測定、 （ｂ）癌細胞の検出および位置特定、 （ｃ）細胞または体液中における酵素類、細胞内シグナ
ル伝達およびその他の代謝回転反応測定、 （ｄ）DNAおよびRNA結合アッセイ、 （ｅ）イムノアッセイおよびその他のタンパク質結合ア
ッセイのような生物研究領域で使用できる。
前記レインボウタンパク質およびそれらの元の核酸類
は、また、遺伝子工学においてトランスジェニック動物
類、植物類および微生物類の開発、および園芸において
も使用できる。
は、また、遺伝子工学においてトランスジェニック動物
類、植物類および微生物類の開発、および園芸において
も使用できる。
本発明のさらに別の実施態様によれば、微生物類、細
胞類または生体分子類またはその中での反応のような生
物学上関心を寄せられる物質類の検出、位置特定または
測定のための、前記レインボウタンパク質またはこのレ
インボウタンパク質をコードする核酸の用途が提供され
る。
胞類または生体分子類またはその中での反応のような生
物学上関心を寄せられる物質類の検出、位置特定または
測定のための、前記レインボウタンパク質またはこのレ
インボウタンパク質をコードする核酸の用途が提供され
る。
この実施態様において、生物学上重要な反応または物
質類は、レインボウタンパク質またはその元の核酸と相
互作用させられる。このような相互作用には、非共有結
合または共有結合のような直接的または間接的結合、お
よびエネルギー転移過程が含まれる。
質類は、レインボウタンパク質またはその元の核酸と相
互作用させられる。このような相互作用には、非共有結
合または共有結合のような直接的または間接的結合、お
よびエネルギー転移過程が含まれる。
本発明を上述してきたが、それが、上記に述べたかま
たは下記に記載の特徴のいかなる発明の組み合わせも含
むことを理解すべきである。
たは下記に記載の特徴のいかなる発明の組み合わせも含
むことを理解すべきである。
本発明はさまざまな方法で実施することができ、ま
た、下記の１実施例を参照にしてさらに説明されるであ
ろう： 実施例１ レインボウタンパク質のリン酸化の検出 ケンプチドとしての公知のペプチドleu arg arg ala
ser leu glyまたはマランチドとして公知のRTKRSGSVYEP
LKTを、ジサクシニル・スベラートを用いてpH3でホタル
のルシフェラーゼに共有結合させた。プロテインキナー
ゼA125μｌ＋サイクリックAMP（200μＭ）＋125μＭ A
TPを添加して前記ケンプチドをリン酸化させ、それによ
ってルシフェラーゼに結合させた。pH7.8における黄緑
色から赤色への色のシフト、またはpH6.5における赤色
から黄緑色への色のシフトを二波長ケミルミノメータに
おける比率として測定し、前記キナーゼによるタンパク
質リン酸化の割合をアッセイし、ホスファターゼによっ
て誘発された脱リン酸化を前記比率の逆数によってアッ
セイした。
た、下記の１実施例を参照にしてさらに説明されるであ
ろう： 実施例１ レインボウタンパク質のリン酸化の検出 ケンプチドとしての公知のペプチドleu arg arg ala
ser leu glyまたはマランチドとして公知のRTKRSGSVYEP
LKTを、ジサクシニル・スベラートを用いてpH3でホタル
のルシフェラーゼに共有結合させた。プロテインキナー
ゼA125μｌ＋サイクリックAMP（200μＭ）＋125μＭ A
TPを添加して前記ケンプチドをリン酸化させ、それによ
ってルシフェラーゼに結合させた。pH7.8における黄緑
色から赤色への色のシフト、またはpH6.5における赤色
から黄緑色への色のシフトを二波長ケミルミノメータに
おける比率として測定し、前記キナーゼによるタンパク
質リン酸化の割合をアッセイし、ホスファターゼによっ
て誘発された脱リン酸化を前記比率の逆数によってアッ
セイした。
実施例２
ホタル・ルシフェラーゼの操作
ホタル・ルシフェラーゼをコードするcDNAは、５′セ
ンスプライマー類とT7 RNAポリメラーゼプロモータお
よび下記の3'アンチセンスプライマー類を用いるポリメ
ラーゼチェーン反応（PCR）によって増幅させた：プラ
イマーコードをカッコ中に示す。
ンスプライマー類とT7 RNAポリメラーゼプロモータお
よび下記の3'アンチセンスプライマー類を用いるポリメ
ラーゼチェーン反応（PCR）によって増幅させた：プラ
イマーコードをカッコ中に示す。
下記のホタル・ルシフェラーゼcDNA類は、カッコ内の
プライマー類を用いて構築された： （ａ）全長（105＋100） （ｂ）−36bpすなわち、パーオキシソマルシグナルペプ
チド欠失（105＋106） （ｃ）タンパク質中央部のプロテインキナーゼＡ部位
（RRXS）（段階1:105＋108および107＋100;段階2:段階
１から半分２個＋105＋100） （ｄ）Ｎ末端のミトコンドリア・シグナル（段階1:110
＋100;段階2;段階１の試料＋111＋100）。
プライマー類を用いて構築された： （ａ）全長（105＋100） （ｂ）−36bpすなわち、パーオキシソマルシグナルペプ
チド欠失（105＋106） （ｃ）タンパク質中央部のプロテインキナーゼＡ部位
（RRXS）（段階1:105＋108および107＋100;段階2:段階
１から半分２個＋105＋100） （ｄ）Ｎ末端のミトコンドリア・シグナル（段階1:110
＋100;段階2;段階１の試料＋111＋100）。
50μｌにおけるPCR反応は、10mM Tris pH8.3,0.01
％ゼラチン、0.4U Taqポリメラーゼ、2mM MgCl2、各0.2
mMのdATP,dGTP,dTTP,dCTP,0.5μＭの各プライマー、１
μｌのDNA（およそ１−100ng）を含有していた。本反応
は、50μｌの鉱物油でカバーされ、パーキンエルマー
（Perkin−Elmer）サーマルサイクラー中で25サイクル:
94℃１分、55℃１分、72℃２分＋各サイクルの５秒延長
でインキュベートし、さらに、1UのE.coli DNAポリメ
ラーゼ（クレノウ（Klenow）断片）とともに37℃で30分
間インキュベートした。
％ゼラチン、0.4U Taqポリメラーゼ、2mM MgCl2、各0.2
mMのdATP,dGTP,dTTP,dCTP,0.5μＭの各プライマー、１
μｌのDNA（およそ１−100ng）を含有していた。本反応
は、50μｌの鉱物油でカバーされ、パーキンエルマー
（Perkin−Elmer）サーマルサイクラー中で25サイクル:
94℃１分、55℃１分、72℃２分＋各サイクルの５秒延長
でインキュベートし、さらに、1UのE.coli DNAポリメ
ラーゼ（クレノウ（Klenow）断片）とともに37℃で30分
間インキュベートした。
PCRの成功は、アガロースゲル電気泳動のバンドによ
って確認した。cDNAはセントリコンによって精製し、プ
ライマー類を除去し、そして、緩衝フェノール:CHCl3:2
級アミルアルコール（25:24:1）で抽出後、70％エタノ
ール、0.7mM酢酸アンモニウム中で沈澱させた。前記DNA
（10mM Tris 0.1または1mM EDTA pH7.4−7.5中に溶
解した0.5−１μｇ）は、37℃で４時間まで（最適には
１−２時間）、40mM Tris,pH7.4−7.5,5.6mM MgCl2、
10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mlウシ血清アルブミ
ン、2mM スパーミジン、各0.5mMのATP,CTP,UTP,0,1mM
のGTP,0.5mMのcap m7 Ｇ（5'）ppp（5'）G,1000UのRNA
sin/ml、800UのT7 RNA ポリメラーゼ±２μ、C32P−U
TPを含有する緩衝液中で、前記のT7 RNAポリメラーゼ
中に転写した。本反応は、氷冷フェノール:CHCl3:2級ア
ミルアルコール（25:24:1）中で停止させ、そして、前
記RNAを70％エタノール＋0.7M NH4Acで沈澱させ、−20
℃で保存した。
って確認した。cDNAはセントリコンによって精製し、プ
ライマー類を除去し、そして、緩衝フェノール:CHCl3:2
級アミルアルコール（25:24:1）で抽出後、70％エタノ
ール、0.7mM酢酸アンモニウム中で沈澱させた。前記DNA
（10mM Tris 0.1または1mM EDTA pH7.4−7.5中に溶
解した0.5−１μｇ）は、37℃で４時間まで（最適には
１−２時間）、40mM Tris,pH7.4−7.5,5.6mM MgCl2、
10mM ジチオスレイトール、0.1mg/mlウシ血清アルブミ
ン、2mM スパーミジン、各0.5mMのATP,CTP,UTP,0,1mM
のGTP,0.5mMのcap m7 Ｇ（5'）ppp（5'）G,1000UのRNA
sin/ml、800UのT7 RNA ポリメラーゼ±２μ、C32P−U
TPを含有する緩衝液中で、前記のT7 RNAポリメラーゼ
中に転写した。本反応は、氷冷フェノール:CHCl3:2級ア
ミルアルコール（25:24:1）中で停止させ、そして、前
記RNAを70％エタノール＋0.7M NH4Acで沈澱させ、−20
℃で保存した。
前記RNAは遠心分離し、20μｌの70mM Tris、1mM ED
TA pH7.4−7.5中に再溶解させ、そして、１μｌを５−
10μｌのウサギ網状赤血球溶解液とともに30℃で１時間
インキュベートして、ルシフェラーゼを合成した。1/10
0希釈後のルシフェラーゼを、50mM Tris,10mM MgAc2,
0.1mg/mlウシ血清アルブミン、0.1−0.2mMルシフェリ
ン、0.5−5mM ATP中pH7.8で直接発光をアッセイするか
または等電点電気泳動によって単離する。突然変異体
（RRXS）ルシフェラーゼは、およそ7.1または6.8のpIを
有し、そして、正常のルシフェラーゼは、およそ6.8のp
Iを有している。ミトコンドリア・シグナルを有するル
シフェラーゼは、また、正常ルシフェラーゼから分離さ
れた。この改変ルシフェラーゼを含有するウサギ網状赤
血球溶解液を添加すると、それは、遠心分離およびミト
コンドリアおよびルシフェラーゼからの発光によっても
示されるように、添加されたミトコンドリアによって取
り込まれた。
TA pH7.4−7.5中に再溶解させ、そして、１μｌを５−
10μｌのウサギ網状赤血球溶解液とともに30℃で１時間
インキュベートして、ルシフェラーゼを合成した。1/10
0希釈後のルシフェラーゼを、50mM Tris,10mM MgAc2,
0.1mg/mlウシ血清アルブミン、0.1−0.2mMルシフェリ
ン、0.5−5mM ATP中pH7.8で直接発光をアッセイするか
または等電点電気泳動によって単離する。突然変異体
（RRXS）ルシフェラーゼは、およそ7.1または6.8のpIを
有し、そして、正常のルシフェラーゼは、およそ6.8のp
Iを有している。ミトコンドリア・シグナルを有するル
シフェラーゼは、また、正常ルシフェラーゼから分離さ
れた。この改変ルシフェラーゼを含有するウサギ網状赤
血球溶解液を添加すると、それは、遠心分離およびミト
コンドリアおよびルシフェラーゼからの発光によっても
示されるように、添加されたミトコンドリアによって取
り込まれた。
プロテインキナーゼＡ、サイクリックAMP（0.2mM）,A
TP（0.1−1mM）pH7とともにRRXSを含むルシフェラーゼ
のリン酸化によって、ルシフェラーゼのpIを再度6.8に
戻すように変化させその色をシフトさせた。RRXSルシフ
ェラーゼは、干渉フィルター付二波長ケミルミノメータ
を用いて検出した時に未改変ルシフェラーゼよりも強い
緑色の発光を有していた（最大透過率および545および6
03mM）。
TP（0.1−1mM）pH7とともにRRXSを含むルシフェラーゼ
のリン酸化によって、ルシフェラーゼのpIを再度6.8に
戻すように変化させその色をシフトさせた。RRXSルシフ
ェラーゼは、干渉フィルター付二波長ケミルミノメータ
を用いて検出した時に未改変ルシフェラーゼよりも強い
緑色の発光を有していた（最大透過率および545および6
03mM）。
ケンプチドヌクレオチドセンスまたはアンチセンス配
列（LRRASLG）またはマランチドRTKRSGSVYEPLKIを含有
するプライマー類は、同様に、１または２段階のPCR反
応を用いてＮまたはＣ末端のいずれかに添加された。こ
れらは、また、リン酸化されることができるルシフェラ
ーゼを産生し、それによって、その強度および色を変化
させた。
列（LRRASLG）またはマランチドRTKRSGSVYEPLKIを含有
するプライマー類は、同様に、１または２段階のPCR反
応を用いてＮまたはＣ末端のいずれかに添加された。こ
れらは、また、リン酸化されることができるルシフェラ
ーゼを産生し、それによって、その強度および色を変化
させた。
実施例３
工学処理されたエクオリンの調製
cDNAすなわちCa2+活性化発光タンパク質のゲノムコー
ドは、ホタル・ルシフェラーゼのそれと同様の方法でPC
Rされた。１または２段階PCRを用いて、プロテインキナ
ーゼＡ認識ペプチド・ケンプチド（LRRLALG）またはマ
ランチド（実施例２に同じ）をＮ末端に添加した。突然
変異エクオリンは、異なるキネティック特性を有してお
り、改変エクオリン（上記）をリン酸化することによっ
てプロテイン・キナーゼＡを検出可能とした。
ドは、ホタル・ルシフェラーゼのそれと同様の方法でPC
Rされた。１または２段階PCRを用いて、プロテインキナ
ーゼＡ認識ペプチド・ケンプチド（LRRLALG）またはマ
ランチド（実施例２に同じ）をＮ末端に添加した。突然
変異エクオリンは、異なるキネティック特性を有してお
り、改変エクオリン（上記）をリン酸化することによっ
てプロテイン・キナーゼＡを検出可能とした。
正常エクオリン・プライマー類＝5'センスTAATACGACT
CACTATAGGGGAGAGAATGGTCAAGCTTTACATCAGACTTCGACであ
り、3'アンチセンスはGAATTCTTAGGGGACAGCTCCACCGTAで
あった。Ｎ末端へのケンプチド挿入のために、LRRASLG
と同様のヌクレオチド配列をエクオリン5'末端の最初の
15塩基（ATGを含む）に結合させた。段階２において、
前記T7 RNAポリメラーゼ・プロモータを添加して、イ
ンビトロリン酸化のためにケンプチド−エクオリンをイ
ンビトロで形成した。ゲノム・エクオリンDNA（PCRによ
って作製）は、逆転写酵素PCRによってmRNAから製造さ
れたそれと少なくとも同じくらい活性であった。
CACTATAGGGGAGAGAATGGTCAAGCTTTACATCAGACTTCGACであ
り、3'アンチセンスはGAATTCTTAGGGGACAGCTCCACCGTAで
あった。Ｎ末端へのケンプチド挿入のために、LRRASLG
と同様のヌクレオチド配列をエクオリン5'末端の最初の
15塩基（ATGを含む）に結合させた。段階２において、
前記T7 RNAポリメラーゼ・プロモータを添加して、イ
ンビトロリン酸化のためにケンプチド−エクオリンをイ
ンビトロで形成した。ゲノム・エクオリンDNA（PCRによ
って作製）は、逆転写酵素PCRによってmRNAから製造さ
れたそれと少なくとも同じくらい活性であった。
実施例４
血中癌細胞の検出
血液試料（1ml）を図１のベンゾチアゾール反応３を
触媒するレインボウタンパク質類をコードするmRNA含有
リポゾーム類の懸濁液と混合する。このmRNAは、下記の
ようにして産生された： ホタル・ルシフェラーゼコード遺伝子は、最初に、
（pCDV1プラスミドプライマー）＋（SP6 RNAポリメラ
ーゼプロモータ含有ホンジョー（Honjo）リンカー）を
用いてE.coli中のcDNAライブラリから単離した。myc癌
遺伝子のチロシンキナーゼ活性のためのリン酸化部位を
示すヌクレオチド配列 を、5'末端のATGから30塩基対下流のEcoR I制限部位に
挿入した。前記DNAを再び連結し、再クローン化し、そ
して、前記プラスミド挿入物はインビトロでSP6 RNAポ
リメラーゼによって転写され、レインボウタンパク質の
ためのmRNAを産生した。前記元のタンパク質は黄緑光を
発生したが、しかし、レインボウタンパク質は細胞中で
リン酸化されたときに赤色光を発生する。したがって、
癌細胞の存在は、二波長ケミルミノメータ中で赤色（60
3nm）に対する黄緑色（545nm）の光の比率を測定するこ
とによって、白血病患者の血液試料中で検出される。
触媒するレインボウタンパク質類をコードするmRNA含有
リポゾーム類の懸濁液と混合する。このmRNAは、下記の
ようにして産生された： ホタル・ルシフェラーゼコード遺伝子は、最初に、
（pCDV1プラスミドプライマー）＋（SP6 RNAポリメラ
ーゼプロモータ含有ホンジョー（Honjo）リンカー）を
用いてE.coli中のcDNAライブラリから単離した。myc癌
遺伝子のチロシンキナーゼ活性のためのリン酸化部位を
示すヌクレオチド配列 を、5'末端のATGから30塩基対下流のEcoR I制限部位に
挿入した。前記DNAを再び連結し、再クローン化し、そ
して、前記プラスミド挿入物はインビトロでSP6 RNAポ
リメラーゼによって転写され、レインボウタンパク質の
ためのmRNAを産生した。前記元のタンパク質は黄緑光を
発生したが、しかし、レインボウタンパク質は細胞中で
リン酸化されたときに赤色光を発生する。したがって、
癌細胞の存在は、二波長ケミルミノメータ中で赤色（60
3nm）に対する黄緑色（545nm）の光の比率を測定するこ
とによって、白血病患者の血液試料中で検出される。
実施例５
サルモネラ（Salmonella）の検出
SP6 RNAポリメラーゼプロモータを含有する実施例４
のレインボウタンパク質のcDNAを、サルモネラ（Salmon
ella）ファージ中に挿入した。このファージをサルモネ
ラ（Salmonella）に添加すると、レインボウタンパク質
を発現させおよび赤色光も発生させ、20ml当たり１個し
かない細菌も検出できた。
のレインボウタンパク質のcDNAを、サルモネラ（Salmon
ella）ファージ中に挿入した。このファージをサルモネ
ラ（Salmonella）に添加すると、レインボウタンパク質
を発現させおよび赤色光も発生させ、20ml当たり１個し
かない細菌も検出できた。
実施例６
HIV RNAの検出
AIDS患者の血液試料（1ml）を4Mグアニジウムイソチ
オシアナートによって抽出し、そして、前記核酸をエタ
ノール/NH酢酸によって沈澱させた。前記発光タンパク
質オベリンから産生したレインボウタンパク質で標識し
たオリゴヌクレオチド（10μl,1μＭ）を、100μｌの再
溶解RNAに50℃で添加して、この混合物を０℃で10分間
冷却した。このオリゴヌクレオチドは、HIVコートタン
パク質中の配列に特異的であった。これをHIV RNAに結
合して、レインボウタンパク質の発光を淡青（475nm）
から青（440nm）にシフトさせた。これは、二重光電子
増倍管ケミルミノメータ中におけるこれら二波長におけ
る発光の比率のシフトとして検出された。
オシアナートによって抽出し、そして、前記核酸をエタ
ノール/NH酢酸によって沈澱させた。前記発光タンパク
質オベリンから産生したレインボウタンパク質で標識し
たオリゴヌクレオチド（10μl,1μＭ）を、100μｌの再
溶解RNAに50℃で添加して、この混合物を０℃で10分間
冷却した。このオリゴヌクレオチドは、HIVコートタン
パク質中の配列に特異的であった。これをHIV RNAに結
合して、レインボウタンパク質の発光を淡青（475nm）
から青（440nm）にシフトさせた。これは、二重光電子
増倍管ケミルミノメータ中におけるこれら二波長におけ
る発光の比率のシフトとして検出された。
実施例７
血液中テストステロンの測定
テストステロン・カルボキシオキシムを、発光タンパ
ク質オベリン由来レインボウタンパク質と反応させ、テ
ストステロンレインボウタンパク質結合物（cojugate）
を形成させる。この1nmolを含有する５μｌを、テスト
ステロン（50μｌ）pH7.4に対するフルオロセイン標識
抗体溶液とともにさまざまな濃度の標準テストステロン
の存在下または非存在下に30分間インキュベートした。
生物発光反応は、Caの添加によって惹起され、そして、
475nmの光の530nmの光に対する比率を測定した。標準テ
ストステロン濃度を増加することによって、475/530比
率が増大した。本操作は、遊離抗原から結合抗原を分離
する必要もなく実行することができた。
ク質オベリン由来レインボウタンパク質と反応させ、テ
ストステロンレインボウタンパク質結合物（cojugate）
を形成させる。この1nmolを含有する５μｌを、テスト
ステロン（50μｌ）pH7.4に対するフルオロセイン標識
抗体溶液とともにさまざまな濃度の標準テストステロン
の存在下または非存在下に30分間インキュベートした。
生物発光反応は、Caの添加によって惹起され、そして、
475nmの光の530nmの光に対する比率を測定した。標準テ
ストステロン濃度を増加することによって、475/530比
率が増大した。本操作は、遊離抗原から結合抗原を分離
する必要もなく実行することができた。
実施例８
リステリアの検出
疑いのある食品試料を沸騰させ、DNAを抽出する。特
異的リステリア遺伝子またはオベリンcDNAに共有結合で
結合した領域に対するセンスプライマー＋5P6 RNAポリ
メラーゼプロモータおよびアンチセンス緑色蛍光タンパ
ク質（GFP）cDNAに共有結合で結合したアンチセンスプ
ライマーを用いて、ポリメラーゼチェーン反応を用いて
リステリア（Listeria）遺伝子を増幅させる。この結
果、新規レインボウタンパク質をコードしかつSP6 RNA
ポリメラーゼによって転写可能なDNAとなる。
異的リステリア遺伝子またはオベリンcDNAに共有結合で
結合した領域に対するセンスプライマー＋5P6 RNAポリ
メラーゼプロモータおよびアンチセンス緑色蛍光タンパ
ク質（GFP）cDNAに共有結合で結合したアンチセンスプ
ライマーを用いて、ポリメラーゼチェーン反応を用いて
リステリア（Listeria）遺伝子を増幅させる。この結
果、新規レインボウタンパク質をコードしかつSP6 RNA
ポリメラーゼによって転写可能なDNAとなる。
このDNAは転写され、そして、mRNAは、ウサギ網状赤
血球溶解液を用いて翻訳される。コエレンテラジンを添
加しオベリンを再活性化する。510/475nmにおけるレイ
ンボウタンパク質対オベリン単独の光の比率は、食品試
料中に最初から存在するリステリアDNAの量に直接比例
する。リステリアが全く存在しないとき、比率の割合は
１である。
血球溶解液を用いて翻訳される。コエレンテラジンを添
加しオベリンを再活性化する。510/475nmにおけるレイ
ンボウタンパク質対オベリン単独の光の比率は、食品試
料中に最初から存在するリステリアDNAの量に直接比例
する。リステリアが全く存在しないとき、比率の割合は
１である。
実施例９
偏光による核酸ハイブリダイゼーションの測定
実施例６に記載の反応を実施したが、しかし、光発光
は、偏向板を互いに90゜として偏向フイルター付き２光
電子増倍管ケミルミノメータで検出した。上記２個の光
電子増倍管の比は、存在するHIV RNAの量に関連してい
た。
は、偏向板を互いに90゜として偏向フイルター付き２光
電子増倍管ケミルミノメータで検出した。上記２個の光
電子増倍管の比は、存在するHIV RNAの量に関連してい
た。
実施例10
サイクリックAMPまたはIp3の測定
実施例２または３に記載の２段階PCR反応を用いて、
前記細菌性CAPタンパク質または小胞体受容体のIp3結合
領域からのサイクリックAMP結合領域を、前記Ｎまたは
Ｃ末端にまたはホタルルシフェラーゼまたはエクオリン
に添加した。前記改変タンパク質類は、実施例２または
３に記載のようにしてPCR DNA生成物からインビトロで
作製され、そして、発光サイクリックAMPまたはIp3の活
性および色によって特性解析した。強度および色の両方
の変化によって、細胞抽出物または生細胞中でCAMPまた
はIp3が測定可能となった。イメージインテンシファイ
アーを用いて、CAMPまたはIp3“クラウド”は、この１
個の細胞で可視化できた。同様に、エクオリンまたはル
シフェラーゼは、もしそれが最初にその（＋KDEL）Ｃ末
端で結合したERまたはミトコンドリアシグナルで調製さ
れたならば、ERまたはミトコンドリオン内部で見ること
ができた。
前記細菌性CAPタンパク質または小胞体受容体のIp3結合
領域からのサイクリックAMP結合領域を、前記Ｎまたは
Ｃ末端にまたはホタルルシフェラーゼまたはエクオリン
に添加した。前記改変タンパク質類は、実施例２または
３に記載のようにしてPCR DNA生成物からインビトロで
作製され、そして、発光サイクリックAMPまたはIp3の活
性および色によって特性解析した。強度および色の両方
の変化によって、細胞抽出物または生細胞中でCAMPまた
はIp3が測定可能となった。イメージインテンシファイ
アーを用いて、CAMPまたはIp3“クラウド”は、この１
個の細胞で可視化できた。同様に、エクオリンまたはル
シフェラーゼは、もしそれが最初にその（＋KDEL）Ｃ末
端で結合したERまたはミトコンドリアシグナルで調製さ
れたならば、ERまたはミトコンドリオン内部で見ること
ができた。
生物発光タンパク質が、有機体によって産生されたタ
ンパク質の修飾による代わりに、アミノ酸配列から、ま
たはDNAまたはRNA合成技術を用いて合成できることが理
解されるであろう。
ンパク質の修飾による代わりに、アミノ酸配列から、ま
たはDNAまたはRNA合成技術を用いて合成できることが理
解されるであろう。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 33/532 Ｂ
33/532 33/58 Ａ
33/58 Ｚ
Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ
Claims (15)
- 【請求項１】ホタル・ルシフェラーゼ、エクオリン又は
オベリンを含む群から選択され、ある選択された分析物
に対する認識部位が生物発光タンパク質のＮまたはＣ末
端または内部に含有されるように修飾された生物発光タ
ンパク質であって、上記の認識部位はケンプチド、マラ
ンチド及びRRXSリン酸化部位を包含する群から選択され
たものであって修飾されていないタンパク質には存在し
ていないものであり、上記の分析物は上記の認識部位と
相互作用が可能であり、修飾された生物発光タンパク質
は生成する生物発光反応において活性であって光または
他の放射を生成し、上記の光または他の放射は、分析物
が上記の認識部位と相互作用しているときには第一の特
徴の物理特性を持って生成され、上記の分析物が上記の
認識部位と相互作用していないときには上記の物理的特
性とは異なった第二の特徴を持って生成される、ことを
特徴とする上記の生物発光タンパク質。 - 【請求項２】ホタル・ルシフェラーゼ、エクオリン又は
オベリンを包含する群から選択され、周辺条件に応答す
る認識部位を生物発光タンパク質のＮまたはＣ末端また
は内部に含有するように修飾された生物発光タンパク質
であって、上記の認識部位はケンプチド、マランチド及
びRRXSリン酸化部位を包含する群から選択されたもので
あって修飾されていないタンパク質には存在していない
ものであり、修飾された生物発光タンパク質は生物発光
反応において活性であって光または他の放射を生成し、
上記の生成された光または他の放射は、認識部位が第一
の条件に曝されているときには第一の特徴の物理特性を
持ち、認識部位が第二の条件に曝されているときには異
なった第二の特徴を持つ、ことを特徴とする上記の生物
発光タンパク質。 - 【請求項３】前記の第一及び第二の特徴が少なくとも色
相、偏光状態および強度の内の一つを含む、ことを特徴
とする請求項１または２に記載の生物発光タンパク質。 - 【請求項４】ホタル・ルシフェラーゼ、エクオリン又は
オベリンを包含する群から選択され、対象とする物質の
濃度に応答する認識部位を生物発光タンパク質のＮまた
はＣ末端または内部に含有するように修飾された生物発
光タンパク質であって、上記の部位はケンプチド、マラ
ンチド及びRRXSリン酸化部位を包含する群から選択され
たものであって修飾されていないタンパク質には存在し
ないものであり、上記の修飾された生物発光タンパク質
は、生物発光反応において活性であり、上記のタンパク
質を含む生物発光反応において放射される光または他の
放射は、上記の対象とする物質の濃度に応じて物理的特
徴を変化して生成される、ことを特徴とする上記の生物
発光タンパク質。 - 【請求項５】前記の生物発光タンパク質が予め選択され
た細胞内の細胞小器官または部位をターゲットするため
の信号ペプチドを含むことを特徴とする、請求項１から
４までの何れか１つに記載の生物発光タンパク質。 - 【請求項６】ＮまたはＣ末端と共有結合したケンプチド
を含むように修飾されたホタル・ルシフェラーゼを包含
することを特徴とした、請求項１から５までの何れか１
つに記載した生物発光タンパク質。 - 【請求項７】ＮまたはＣ末端に共有結合したマランチド
を含むように修飾されたホタル・ルシフェラーゼを包含
することを特徴とした、請求項１から５までの何れか１
つに記載した生物発光タンパク質。 - 【請求項８】ＮまたはＣ末端の間にRRXSリン酸化部位を
含むように修飾されたホタル・ルシフェラーゼを包含す
ることを特徴とした、請求項１から５までの何れか１一
つに記載した生物発光タンパク質。 - 【請求項９】Ｎ末端に共有結合したケンプチドを含むよ
うに修飾されたエクオリンを包含することを特徴とし
た、請求項１から５までの何れか１つに記載した生物発
光タンパク質。 - 【請求項１０】Ｎ末端に共有結合したマランチドを含む
ように修飾されたエクオリンを含むことを特徴とした、
請求項１から５までの何れか１つに記載した生物発光タ
ンパク質。 - 【請求項１１】対象とする物質を検出し、位置決めし又
は測定する方法であって、当該方法が、 （ａ）対象とする分析物質を含む反応システム中に、請
求項１から10までの何れか１つに記載の生物発光タンパ
ク質を準備し、 （ｂ）上記の生物発光タンパク質を生物発光反応に関与
させ、 （ｃ）生成される光または他の放射の特徴を分析し、そ
して、 （ｄ）上記の特徴に基づいて、上記の分析物を検出し、
位置決めし又は測定する、 ことを含むことを特徴とする上記の方法。 - 【請求項１２】物理的、化学的、生物的または生物学的
条件の変化を検出する方法であって、当該方法が、 （ａ）反応システム中に請求項１から10までの何れか１
つに記載の生物発光タンパク質を準備し （ｂ）上記の生物発光タンパク質を生物発光反応に関与
させ、そして、 （ｃ）第一及び／又は第二の特徴をもった光または他の
放射の何れが生成されたかを観察し、そして、 （ｄ）上記の第一または第二の特徴の光または放射の生
成に基づく変化を検出する、 ことを包含することを特徴とする上記の方法。 - 【請求項１３】細胞内の対象とする物質を検出し、位置
決めしまたは測定し、または、細胞内の物理的、化学
的、生物的または生物学的条件の少なくとも一つを監視
する方法であって、上記の方法が、 （ａ）請求項１から10までの何れか１つに記載の生物発
光タンパクのコードを指定する核酸を上記の細胞中に導
入し、 （ｂ）上記の生物発光タンパク質を発現させ、そして、 （ｃ）上記の修飾した生物発光タンパク質を生物発光反
応に関与させ、そして、 （ｄ）生成される光又は他の放射の特徴を分析する ことを包含することを特徴とする上記の方法。 - 【請求項１４】請求項１から10の何れか１つに記載の生
物発光タンパク質をコードする核酸。 - 【請求項１５】対象とする細胞組織または興味物質に特
異なプロモーター又はエンハンサーの塩基配列を含むこ
とを特徴とする、請求項14に記載の核酸。
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