JP2003102491A - 生物発光タンパク質 - Google Patents
生物発光タンパク質Info
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- G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 細胞、細菌、ウイルスおよび原生動物のよう
な微生物類、および基質類・代謝物類・細胞内および細
胞外シグナル類・酵素類・抗原類・抗体類および核酸類
のような生物学的に重要な物質類などの選ばれた分析物
を、生細胞中において細胞小期間内部または形質膜の内
または外表面において、それらを切開開裂することなく
検出および定量に使用できる生物発光タンパク質類を提
供する。 【解決手段】 対象とする分析物と反応する相互作用サ
イトを包含するエネルギー転移タンパク質受容体部位に
結合された供与体としての生物発光タンパク質部位を包
含する生物発光タンパク質を調製し、当該タンパク質の
相互作用部位と上記の分析物とを相互作用させることに
より、当該分析物が上記の相互作用部位と相互作用して
いるときには第一の特徴を持った物理特性を有し、上記
の分析物が上記の相互作用サイトと反応していないとき
には上記の物性とは異なる第二の特徴を有する光を発
し、対象とする分析物の有無、位置を検出することが出
来る。
な微生物類、および基質類・代謝物類・細胞内および細
胞外シグナル類・酵素類・抗原類・抗体類および核酸類
のような生物学的に重要な物質類などの選ばれた分析物
を、生細胞中において細胞小期間内部または形質膜の内
または外表面において、それらを切開開裂することなく
検出および定量に使用できる生物発光タンパク質類を提
供する。 【解決手段】 対象とする分析物と反応する相互作用サ
イトを包含するエネルギー転移タンパク質受容体部位に
結合された供与体としての生物発光タンパク質部位を包
含する生物発光タンパク質を調製し、当該タンパク質の
相互作用部位と上記の分析物とを相互作用させることに
より、当該分析物が上記の相互作用部位と相互作用して
いるときには第一の特徴を持った物理特性を有し、上記
の分析物が上記の相互作用サイトと反応していないとき
には上記の物性とは異なる第二の特徴を有する光を発
し、対象とする分析物の有無、位置を検出することが出
来る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生物発光タンパク
質類に関し、特に、例えば化学的手段によって又は遺伝
子工学によって修飾された生物発光タンパク質類に関す
る。
質類に関し、特に、例えば化学的手段によって又は遺伝
子工学によって修飾された生物発光タンパク質類に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】このような修飾された生物発光タンパク
質類は、以下で“レインボウタンパク質類”と呼び、細
胞とか、細菌・ウイルスおよび原生動物のような微生物
類、および基質類・代謝物類・細胞内および細胞外シグ
ナル類・酵素類・抗原類・抗体類および核酸類のような
生物学的に重要な物質類、の検出および定量に使用する
ことができる。
質類は、以下で“レインボウタンパク質類”と呼び、細
胞とか、細菌・ウイルスおよび原生動物のような微生物
類、および基質類・代謝物類・細胞内および細胞外シグ
ナル類・酵素類・抗原類・抗体類および核酸類のような
生物学的に重要な物質類、の検出および定量に使用する
ことができる。
【０００３】生物発光は、有機分子である“ルシフェリ
ン”の酸素またはその代謝物類のひとつによる酸化であ
り、光を発するものである。この反応は、ルシフェリン
が周囲の液体中に拡散しないルシフェラーゼと非常に緊
密にまたは共有結合で結合しているとき、通常“ルシフ
ェラーゼ”または“発光タンパク質”として知られてい
るタンパク質によって触媒される。
ン”の酸素またはその代謝物類のひとつによる酸化であ
り、光を発するものである。この反応は、ルシフェリン
が周囲の液体中に拡散しないルシフェラーゼと非常に緊
密にまたは共有結合で結合しているとき、通常“ルシフ
ェラーゼ”または“発光タンパク質”として知られてい
るタンパク質によって触媒される。
【０００４】Ｏ2（またはＯ2 - または H2O2)＋ルシフ
ェリン＋ルシフェラーゼ（または発光タンパク質）→
オキシルシフェリン＋光
ェリン＋ルシフェラーゼ（または発光タンパク質）→
オキシルシフェリン＋光
【０００５】光を発するためまたはその色を変化させる
ため、３種までの他の物質類が同様に存在することが必
要となることがあり、それらは下記のとおりである： （ａ）Ｈ+、Ca2+、Mg2+のようなカチオン、またはCu+／
Cu2+、Fe2+／Fe3+ のような遷移金属。 （ｂ）NADH，ＦＭＮ，またはＡＴＰのような補因子。 （ｃ）エネルギー転移受容体としてのフルオアー(fluo
r) 。
ため、３種までの他の物質類が同様に存在することが必
要となることがあり、それらは下記のとおりである： （ａ）Ｈ+、Ca2+、Mg2+のようなカチオン、またはCu+／
Cu2+、Fe2+／Fe3+ のような遷移金属。 （ｂ）NADH，ＦＭＮ，またはＡＴＰのような補因子。 （ｃ）エネルギー転移受容体としてのフルオアー(fluo
r) 。
【０００６】これまでに５種の化学属のルシフェリンが
確認されている。（付属図面の図１参照）： （ａ）アルデヒド類（細菌、淡水リンペット・ラティア
(Latia) およびミミズ中に見られる）。 （ｂ）イミダゾロピラジン類（有毛根足類、刺胞動物、
有櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊
索動物）。 （ｃ）ベンゾチアゾール（ホタル類およびツチボタル類
のような甲虫類に見られる）。 （ｄ）直鎖テトラピロール類（双鞭毛藻類、オキアミ、
一部の魚類に見られる）。 （ｅ）フラビン類（細菌、真菌、多毛類および一部の軟
体動物に見られる）。
確認されている。（付属図面の図１参照）： （ａ）アルデヒド類（細菌、淡水リンペット・ラティア
(Latia) およびミミズ中に見られる）。 （ｂ）イミダゾロピラジン類（有毛根足類、刺胞動物、
有櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊
索動物）。 （ｃ）ベンゾチアゾール（ホタル類およびツチボタル類
のような甲虫類に見られる）。 （ｄ）直鎖テトラピロール類（双鞭毛藻類、オキアミ、
一部の魚類に見られる）。 （ｅ）フラビン類（細菌、真菌、多毛類および一部の軟
体動物に見られる）。
【０００７】これらのルシフェリン類が関与する反応の
結果、紫、青、青緑、緑、黄または赤色光および時には
紫外線または赤外線（ＩＲ）の発光が起り、このような
発光は、直線にまたは円に偏光されることもある。生物
発光反応についてのこれ以上の説明については、A.K.Ch
ampbell 著、Chemiluminescence principles and appli
cations in biology and medicine（化学発光の原理お
よび生物および医学における応用）（1988年、Horwood
／VCH Chichester Weinheim 発行）を参考のこと。
結果、紫、青、青緑、緑、黄または赤色光および時には
紫外線または赤外線（ＩＲ）の発光が起り、このような
発光は、直線にまたは円に偏光されることもある。生物
発光反応についてのこれ以上の説明については、A.K.Ch
ampbell 著、Chemiluminescence principles and appli
cations in biology and medicine（化学発光の原理お
よび生物および医学における応用）（1988年、Horwood
／VCH Chichester Weinheim 発行）を参考のこと。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】さて、修飾された生物
発光性または“レインボウ”タンパク質が関与する生物
発光反応によって発生した光の強度、色または偏光度が
変化する可能性があることが知られている。したがって
このような変化を細胞、微生物および生体分子類の検
出、位置特定および測定のためのさまざまなアッセイに
使用できる。
発光性または“レインボウ”タンパク質が関与する生物
発光反応によって発生した光の強度、色または偏光度が
変化する可能性があることが知られている。したがって
このような変化を細胞、微生物および生体分子類の検
出、位置特定および測定のためのさまざまなアッセイに
使用できる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】この例では、前記細胞ま
たは物質は、遺伝子工学で産生されたルシフェラーゼの
ようなレインボウタンパク質に物理的またはリン酸化の
ような化学的変化を引き起こし、発光の強度、色または
偏光に変化をもたらす。前記生物発光反応は、例えば、
ルシフェリンを添加することによって惹起され、そし
て、測定すべき細胞または物質によって前記ルシフェラ
ーゼが修飾されると、より短波長またはより長波長の光
を発光する反応を引き起こす。
たは物質は、遺伝子工学で産生されたルシフェラーゼの
ようなレインボウタンパク質に物理的またはリン酸化の
ような化学的変化を引き起こし、発光の強度、色または
偏光に変化をもたらす。前記生物発光反応は、例えば、
ルシフェリンを添加することによって惹起され、そし
て、測定すべき細胞または物質によって前記ルシフェラ
ーゼが修飾されると、より短波長またはより長波長の光
を発光する反応を引き起こす。
【００１０】これによって、生細胞中において、細胞小
器官内部または形質膜の内または外表面において、それ
らを切断開裂する必要もなくまた結合フラクションおよ
び非結合フラクションを分離する必要もなく、特異的反
応を検出し定量化できる。
器官内部または形質膜の内または外表面において、それ
らを切断開裂する必要もなくまた結合フラクションおよ
び非結合フラクションを分離する必要もなく、特異的反
応を検出し定量化できる。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明の１つの態様においては、
異なる物理的、化学的、生化学的または生物学的条件下
において改変された特徴をもつ光または放射線を生成す
る生物発光反応に関与できる生物発光タンパク質が提供
される。
異なる物理的、化学的、生化学的または生物学的条件下
において改変された特徴をもつ光または放射線を生成す
る生物発光反応に関与できる生物発光タンパク質が提供
される。
【００１２】このレインボウタンパク質は、前記ルシフ
ェラーゼまたは発光タンパク質の末端からまたはその内
部において１個以上のアミノ酸（類）を改変、置換、添
加または除去することによって生成される。その結果、
オキシルシフェリンからの発光は、物理的または化学的
条件に応じて異なる色または異なる状態の偏光となるこ
とができる。レインボウスペクトルの別の部分への色の
変化は、以下のものによって誘発できる。
ェラーゼまたは発光タンパク質の末端からまたはその内
部において１個以上のアミノ酸（類）を改変、置換、添
加または除去することによって生成される。その結果、
オキシルシフェリンからの発光は、物理的または化学的
条件に応じて異なる色または異なる状態の偏光となるこ
とができる。レインボウスペクトルの別の部分への色の
変化は、以下のものによって誘発できる。
【００１３】（ａ）Ｈ、Ca、Mgまたは遷移金属などのカ
チオン濃度の変化、（ｂ）Cｌ− またはリン酸基のよう
なアニオンの濃度の変化、（ｄ）リン酸化または脱リン
酸化反応（セリン／スレオニン、ヒスチジン、およびチ
ロシンキナーゼ類およびホスファターゼ類を含む）、ト
ランスグルタミネーション、タンパク質分解反応、ＡＤ
Ｐリボシル化、グリーまたはグルコシル化、ハロゲン
化、酸化、メチル化およびミリスチン化を起こす酵素類
による前記新規タンパク質の共有結合修飾、
チオン濃度の変化、（ｂ）Cｌ− またはリン酸基のよう
なアニオンの濃度の変化、（ｄ）リン酸化または脱リン
酸化反応（セリン／スレオニン、ヒスチジン、およびチ
ロシンキナーゼ類およびホスファターゼ類を含む）、ト
ランスグルタミネーション、タンパク質分解反応、ＡＤ
Ｐリボシル化、グリーまたはグルコシル化、ハロゲン
化、酸化、メチル化およびミリスチン化を起こす酵素類
による前記新規タンパク質の共有結合修飾、
【００１４】（ｄ）抗原、サイクリックＡＭＰのような
細胞内シグナル、サイクリックＧＭＰ，Ｉｐ３，Ｉｐ
４，ジアシルグリセロール、ＡＴＰ，ＡＤＰ，ＡＭＰ，
ＧＴＰ全てのオキシ，またはデオキシリボヌクレオシド
またはヌクレオチド、基質、薬物、核酸、遺伝子調節タ
ンパク質のレインボウタンパク質への結合、（ｅ）生細
胞内部でのその核酸の発現、および細胞内部におけるプ
ロモータ類、エンハンサー類または癌遺伝子類のような
遺伝子発現によるそれの修飾または調節。
細胞内シグナル、サイクリックＧＭＰ，Ｉｐ３，Ｉｐ
４，ジアシルグリセロール、ＡＴＰ，ＡＤＰ，ＡＭＰ，
ＧＴＰ全てのオキシ，またはデオキシリボヌクレオシド
またはヌクレオチド、基質、薬物、核酸、遺伝子調節タ
ンパク質のレインボウタンパク質への結合、（ｅ）生細
胞内部でのその核酸の発現、および細胞内部におけるプ
ロモータ類、エンハンサー類または癌遺伝子類のような
遺伝子発現によるそれの修飾または調節。
【００１５】ＤＮＡ片（例、ＰＣＲ生成物）中にある単
一または多重の突然変異および欠失は、前記“レインボ
ウタンパク質”を上記のＤＮＡの１末端に連結させ、さ
らにエネルギー転移受容体またはクエンチャーを他の末
端に連結することによって検出できる。突然変異におけ
るヌクレアーゼの攻撃によって、前記レインボウタンパ
ク質は上記受容体またはクエンチャーと区分され、それ
によって、発光の強度、色または偏光状態の変化が生ず
る。
一または多重の突然変異および欠失は、前記“レインボ
ウタンパク質”を上記のＤＮＡの１末端に連結させ、さ
らにエネルギー転移受容体またはクエンチャーを他の末
端に連結することによって検出できる。突然変異におけ
るヌクレアーゼの攻撃によって、前記レインボウタンパ
ク質は上記受容体またはクエンチャーと区分され、それ
によって、発光の強度、色または偏光状態の変化が生ず
る。
【００１６】１種以上のアミノ酸（類）のこのような改
変、置換、添加または除去は、化学的手段によって達成
できる。酸の改変には、アルキル化（例 メチル化）、
リン酸化および本文に概略した種類のさまざまな他の共
有結合的修飾が含まれる。あるいは、ルシフェラーゼま
たは発光タンパク質のコードを指定する核酸は、結果と
して生成されるタンパク質がカチオン類、アニオン類、
細胞内シグナル、測定すべきタンパク質類または核酸の
共有結合的修飾と、相互作用する部位を獲得するかまた
は喪失するように、１種以上のヌクレオチド類を修飾、
置換、挿入または欠失することによって改変することが
できる。
変、置換、添加または除去は、化学的手段によって達成
できる。酸の改変には、アルキル化（例 メチル化）、
リン酸化および本文に概略した種類のさまざまな他の共
有結合的修飾が含まれる。あるいは、ルシフェラーゼま
たは発光タンパク質のコードを指定する核酸は、結果と
して生成されるタンパク質がカチオン類、アニオン類、
細胞内シグナル、測定すべきタンパク質類または核酸の
共有結合的修飾と、相互作用する部位を獲得するかまた
は喪失するように、１種以上のヌクレオチド類を修飾、
置換、挿入または欠失することによって改変することが
できる。
【００１７】ヌクレオチド類の前記挿入または欠失は、
通常、部位特異的突然変異誘発によって、または、前記
遺伝子を特異的制限酵素で切断開裂し、選択したヌクレ
オチド配列を挿入または欠失させ次に前記遺伝子を再度
つなぎ合わせ、またはポリメラーゼ連鎖反応で特異的プ
ライマー類を使用して、引き起こされる。この核酸は、
次にｍＲＮＡに転写され、次いで翻訳されて細菌または
真核生物細胞の内部でか、あるいはインビトロで例えば
ウサギ網状赤血球溶解液を用いるか、のいずれかでレイ
ンボウタンパク質を産生する。
通常、部位特異的突然変異誘発によって、または、前記
遺伝子を特異的制限酵素で切断開裂し、選択したヌクレ
オチド配列を挿入または欠失させ次に前記遺伝子を再度
つなぎ合わせ、またはポリメラーゼ連鎖反応で特異的プ
ライマー類を使用して、引き起こされる。この核酸は、
次にｍＲＮＡに転写され、次いで翻訳されて細菌または
真核生物細胞の内部でか、あるいはインビトロで例えば
ウサギ網状赤血球溶解液を用いるか、のいずれかでレイ
ンボウタンパク質を産生する。
【００１８】この新規の核酸は、Ｔ７、ＳＰ６のような
ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、または、アクチン、ミ
オシン、ミエリンタンパク質類、ＭＭＴ−Ｖ、ＳＶ４
０、抗体、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼのような哺乳類プロ
モータ類を含有してもよく、そして、前記ポリメラーゼ
連鎖反応によってインビトロで増幅させることができ
る。この結果、前記レインボウタンパク質は、癌細胞の
ような生細胞中で、または、インビトロで酵素反応を用
いて細胞なしで産生できる。
ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、または、アクチン、ミ
オシン、ミエリンタンパク質類、ＭＭＴ−Ｖ、ＳＶ４
０、抗体、Ｇ６Ｐデヒドロゲナーゼのような哺乳類プロ
モータ類を含有してもよく、そして、前記ポリメラーゼ
連鎖反応によってインビトロで増幅させることができ
る。この結果、前記レインボウタンパク質は、癌細胞の
ような生細胞中で、または、インビトロで酵素反応を用
いて細胞なしで産生できる。
【００１９】前記未改変または改変生物発光タンパク質
をコードするＤＮＡの５’または３’末端へ組織特異的
プロモータまたはエンハンサー配列を付加すると、それ
がレポータ遺伝子として使用可能になり、そして、特定
の細胞または組織において特異的に発現されることが可
能となり、その発現は、光強度、色または偏光度の変化
の出現によって検出できる。
をコードするＤＮＡの５’または３’末端へ組織特異的
プロモータまたはエンハンサー配列を付加すると、それ
がレポータ遺伝子として使用可能になり、そして、特定
の細胞または組織において特異的に発現されることが可
能となり、その発現は、光強度、色または偏光度の変化
の出現によって検出できる。
【００２０】レインボウタンパク質のためのＤＮＡ調製
の別の方法は、前記生物発光タンパク質のための元のＤ
ＮＡを２つの半分に分離することである。そして、ＤＮ
Ａまたは遺伝子一片は、その５’末端に上記の１つの半
分を結合し、そしてその３’末端に上記の他の半分を結
合することによって、前記２つの半分の間に挿入され
る。
の別の方法は、前記生物発光タンパク質のための元のＤ
ＮＡを２つの半分に分離することである。そして、ＤＮ
Ａまたは遺伝子一片は、その５’末端に上記の１つの半
分を結合し、そしてその３’末端に上記の他の半分を結
合することによって、前記２つの半分の間に挿入され
る。
【００２１】さらに別の方法として、前記レインボウタ
ンパク質ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応によって産生す
ることができ、その際、センスプライマーは５’末端に
結合したレインボウタンパク質ＤＮＡの１部分を有し、
アンチセンスプライマーは３’末端に結合した他の部分
（すなわちアンチセンス）を有している。
ンパク質ＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応によって産生す
ることができ、その際、センスプライマーは５’末端に
結合したレインボウタンパク質ＤＮＡの１部分を有し、
アンチセンスプライマーは３’末端に結合した他の部分
（すなわちアンチセンス）を有している。
【００２２】中間にある対象とするＤＮＡまたは遺伝子
の片類は、２つの別々の遺伝子類から由来することがで
きる。例えば、ひとつがエネルギー転移タンパク質を、
他が生物発光タンパク質をコードすることができる。上
記２つがペプチド（ＤＮＡ／ＲＮＡ由来）を介して連結
されるときにのみ、前記レインボウタンパク質が産生さ
れて色のシフトが起こる。
の片類は、２つの別々の遺伝子類から由来することがで
きる。例えば、ひとつがエネルギー転移タンパク質を、
他が生物発光タンパク質をコードすることができる。上
記２つがペプチド（ＤＮＡ／ＲＮＡ由来）を介して連結
されるときにのみ、前記レインボウタンパク質が産生さ
れて色のシフトが起こる。
【００２３】エネルギー転移タンパク質は、前記タンパ
ク質と共有結合または非共有結合で結合したいかなるフ
ルオアーであることもでき、例えば、オワンクラゲ、ヤ
クチクラゲ、ウスカワミジンコまたは他の刺胞動物類由
来の緑色蛍光タンパク質、または発光性細菌類由来の青
または黄色蛍光タンパク質、またはフラビンタンパク質
(flavoprotein)またはフィオビロプロテイン(phyobilop
rotein) であることができる。
ク質と共有結合または非共有結合で結合したいかなるフ
ルオアーであることもでき、例えば、オワンクラゲ、ヤ
クチクラゲ、ウスカワミジンコまたは他の刺胞動物類由
来の緑色蛍光タンパク質、または発光性細菌類由来の青
または黄色蛍光タンパク質、またはフラビンタンパク質
(flavoprotein)またはフィオビロプロテイン(phyobilop
rotein) であることができる。
【００２４】前記タンパク質全体としてでもまたはその
蛍光領域のみでも使用できる。前記生物発光タンパク質
は、例えば、細菌、ホタル、ツチボタル、またはカイア
シなどのルシフェラーゼでもよく、または、例えばエク
オリン、オベリン、サラシコリンのようなラジオラリン
のためのいかなる発光タンパク質であってもよい。
蛍光領域のみでも使用できる。前記生物発光タンパク質
は、例えば、細菌、ホタル、ツチボタル、またはカイア
シなどのルシフェラーゼでもよく、または、例えばエク
オリン、オベリン、サラシコリンのようなラジオラリン
のためのいかなる発光タンパク質であってもよい。
【００２５】前記タンパク質またはそのＤＮＡまたはＲ
ＮＡは、ウイルス、プラスミド、リン酸カルシウム・ト
ランスフェクション、電気穿孔法、リポゾーム融合、ま
たは膜孔形成性タンパク質類を用いて、生細菌または真
核細胞中に取り込むことができる。いったん内部に入る
と、適当な生化学性質を有する生細胞のみが前記“レイ
ンボウ”効果をもたらす。
ＮＡは、ウイルス、プラスミド、リン酸カルシウム・ト
ランスフェクション、電気穿孔法、リポゾーム融合、ま
たは膜孔形成性タンパク質類を用いて、生細菌または真
核細胞中に取り込むことができる。いったん内部に入る
と、適当な生化学性質を有する生細胞のみが前記“レイ
ンボウ”効果をもたらす。
【００２６】前記“レインボウタンパク質”遺伝子を
胚、卵母細胞、精子、種子または実生に取り込むことに
よって、トランスジェニック動物または植物が産生さ
れ、前記“レインボウ効果”を用いて遺伝子発現、細胞
制御、薬物作用または細胞障害のそれぞれの器官中にお
ける位置特定できしかも測定できるようになる。これら
の新規有機体は、家庭用飼育水槽中で、飛行機滑走路上
で、海上の安全灯として、および室内鉢植え草花用など
にも使用できる。
胚、卵母細胞、精子、種子または実生に取り込むことに
よって、トランスジェニック動物または植物が産生さ
れ、前記“レインボウ効果”を用いて遺伝子発現、細胞
制御、薬物作用または細胞障害のそれぞれの器官中にお
ける位置特定できしかも測定できるようになる。これら
の新規有機体は、家庭用飼育水槽中で、飛行機滑走路上
で、海上の安全灯として、および室内鉢植え草花用など
にも使用できる。
【００２７】前記レインボウタンパク質は、また、化学
的手段によってまたは前記タンパク質を遺伝子工学処理
によって形質膜の内または外表面または特定の細胞内小
器官（例 パーオキシゾーム、ミトコンドリア、クロロ
プラスト、小胞体、ゴルジ、分泌小胞、核またはエンド
ゾーム）内部に位置するようにシグナルペプチドを含有
させることによって、細胞の種々の部分に取り込ませる
こともできる。
的手段によってまたは前記タンパク質を遺伝子工学処理
によって形質膜の内または外表面または特定の細胞内小
器官（例 パーオキシゾーム、ミトコンドリア、クロロ
プラスト、小胞体、ゴルジ、分泌小胞、核またはエンド
ゾーム）内部に位置するようにシグナルペプチドを含有
させることによって、細胞の種々の部分に取り込ませる
こともできる。
【００２８】化学的にまたは遺伝子工学によってシグナ
ルペプチドを添加することによって、前記正常または改
変ルシフェラーゼまたは発光タンパク質を細胞内部の特
定の細胞小器官または形質膜の内または外表面上にター
ゲットさせることができる。例えば、Ｎ末端の配列MLSR
LSLRLLSRYLL は前記生物発光タンパク質をミトコンドリ
ア内に位置させ、そして、Ｎ末端のKKSALLALMYVCPGKADK
E は前記タンパク質を小胞体へターゲットさせ、Ｃ末端
のKDEL配列は、それをそこに保持する。
ルペプチドを添加することによって、前記正常または改
変ルシフェラーゼまたは発光タンパク質を細胞内部の特
定の細胞小器官または形質膜の内または外表面上にター
ゲットさせることができる。例えば、Ｎ末端の配列MLSR
LSLRLLSRYLL は前記生物発光タンパク質をミトコンドリ
ア内に位置させ、そして、Ｎ末端のKKSALLALMYVCPGKADK
E は前記タンパク質を小胞体へターゲットさせ、Ｃ末端
のKDEL配列は、それをそこに保持する。
【００２９】元のルシフェラーゼまたは発光タンパク質
またはその遺伝子は、生物発光で公知の化学物質（図１
参照）のいずれかから、または少なくとも１６個の門を
代表する７００以上の属から由来する広い範囲の未解析
の発光性有機体から、由来することができる。前記ルシ
フェリンは化学的に合成されてもよく、そして、前記生
体反応または細胞に添加されて光を発することもでき
る。
またはその遺伝子は、生物発光で公知の化学物質（図１
参照）のいずれかから、または少なくとも１６個の門を
代表する７００以上の属から由来する広い範囲の未解析
の発光性有機体から、由来することができる。前記ルシ
フェリンは化学的に合成されてもよく、そして、前記生
体反応または細胞に添加されて光を発することもでき
る。
【００３０】あるいは、ルシフェリン生成を担っている
酵素類をコードする遺伝子は、前記“レインボウタンパ
ク質”遺伝子と結合され、その結果、人工オペロンまた
は融合遺伝子が発現して、生細胞中でアミノ酸のような
正常な細胞成分からレインボウタンパク質およびルシフ
ェリンを生成する。
酵素類をコードする遺伝子は、前記“レインボウタンパ
ク質”遺伝子と結合され、その結果、人工オペロンまた
は融合遺伝子が発現して、生細胞中でアミノ酸のような
正常な細胞成分からレインボウタンパク質およびルシフ
ェリンを生成する。
【００３１】本発明の第２の実施態様によれば、化学的
手段または前記タンパク質をコードする核酸の遺伝子工
学的手段によって、前記タンパク質に対する１個以上の
アミノ酸を改変、置換、添加または欠失させることによ
って、生物発光タンパク質を調製する方法を提供する。
手段または前記タンパク質をコードする核酸の遺伝子工
学的手段によって、前記タンパク質に対する１個以上の
アミノ酸を改変、置換、添加または欠失させることによ
って、生物発光タンパク質を調製する方法を提供する。
【００３２】本発明のさらに別の実施態様によれば、先
に定義された生物発光タンパク質をコードする核酸が提
供される。前記レインボウタンパク質またはそれをコー
ドする核酸は、（ａ）微生物類（原生動物、細菌、位置
特定類）の検出、位置特定および測定、（ｂ）癌細胞の
検出および位置特定、（ｃ）細胞または体液中における
酵素類、細胞内シグナル伝達およびその他の代謝回転反
応測定、（ｄ）ＤＮＡおよびＲＮＡ結合アッセイ、
（ｅ）イムノアッセイおよびその他のタンパク質結合ア
ッセイのような生物研究領域で使用できる。
に定義された生物発光タンパク質をコードする核酸が提
供される。前記レインボウタンパク質またはそれをコー
ドする核酸は、（ａ）微生物類（原生動物、細菌、位置
特定類）の検出、位置特定および測定、（ｂ）癌細胞の
検出および位置特定、（ｃ）細胞または体液中における
酵素類、細胞内シグナル伝達およびその他の代謝回転反
応測定、（ｄ）ＤＮＡおよびＲＮＡ結合アッセイ、
（ｅ）イムノアッセイおよびその他のタンパク質結合ア
ッセイのような生物研究領域で使用できる。
【００３３】前記レインボウタンパク質およびそれらの
元の核酸類は、また、遺伝子工学においてトランスジェ
ニック動物類、植物類および微生物類の開発、および園
芸においても使用できる。
元の核酸類は、また、遺伝子工学においてトランスジェ
ニック動物類、植物類および微生物類の開発、および園
芸においても使用できる。
【００３４】本発明のさらに別の実施態様によれば、微
生物類、細胞類または生体分子類またはその中での反応
のような生物学上関心を寄せられる物質類の検出、位置
特定または測定のための、前記レインボウタンパク質ま
たはこのレインボウタンパク質をコードする核酸の用途
が提供される。
生物類、細胞類または生体分子類またはその中での反応
のような生物学上関心を寄せられる物質類の検出、位置
特定または測定のための、前記レインボウタンパク質ま
たはこのレインボウタンパク質をコードする核酸の用途
が提供される。
【００３５】この実施態様において、生物学上重要な反
応または物質類は、レインボウタンパク質またはその元
の核酸と相互作用させられる。このような相互作用に
は、非共有結合または共有結合のような直接的または間
接的結合、およびエネルギー転移過程が含まれる。
応または物質類は、レインボウタンパク質またはその元
の核酸と相互作用させられる。このような相互作用に
は、非共有結合または共有結合のような直接的または間
接的結合、およびエネルギー転移過程が含まれる。
【００３６】
【実施例】本発明を上述してきたが、それが、上記に述
べたかまたは下記に記載の特徴のいかなる発明の組み合
わせも含むことを理解すべきである。本発明はさまざま
な方法で実施することができ、また、下記のいくつかの
実施例を参照にしてさらに説明する：
べたかまたは下記に記載の特徴のいかなる発明の組み合
わせも含むことを理解すべきである。本発明はさまざま
な方法で実施することができ、また、下記のいくつかの
実施例を参照にしてさらに説明する：
【００３７】実施例１
レインボウタンパク質のリン酸化の検出
ケンプチドとして公知のペプチドｌｅｕ ａｒｇ ａｒ
ｇ ａｌａ ｓｅｒｌｅｕ ｇｌｙまたはマランチドと
して公知のRTKRSGSVYEPLKTを、ジサクシニル・スベラー
トを用いてｐＨ３でホタルのルシフェラーゼに共有結合
させた。プロテインキナーゼＡ１２５μｌ＋サイクリッ
クＡＭＰ（２００μＭ）＋１２５μＭＡＴＰを添加して
前記ケンプチドをリン酸化させ、それによってルシフェ
ラーゼに結合させた。
ｇ ａｌａ ｓｅｒｌｅｕ ｇｌｙまたはマランチドと
して公知のRTKRSGSVYEPLKTを、ジサクシニル・スベラー
トを用いてｐＨ３でホタルのルシフェラーゼに共有結合
させた。プロテインキナーゼＡ１２５μｌ＋サイクリッ
クＡＭＰ（２００μＭ）＋１２５μＭＡＴＰを添加して
前記ケンプチドをリン酸化させ、それによってルシフェ
ラーゼに結合させた。
【００３８】ｐＨ７．８ における黄緑色から赤色への
色のシフト、またはｐＨ６．５ における赤色から黄緑
色への色のシフトを二波長ケミ・ルミノメータにおける
比率として測定し、前記キナーゼによるタンパク質リン
酸化の割合をアッセイし、ホスファターゼによって誘発
された脱リン酸化を前記比率の逆数によってアッセイし
た。
色のシフト、またはｐＨ６．５ における赤色から黄緑
色への色のシフトを二波長ケミ・ルミノメータにおける
比率として測定し、前記キナーゼによるタンパク質リン
酸化の割合をアッセイし、ホスファターゼによって誘発
された脱リン酸化を前記比率の逆数によってアッセイし
た。
【００３９】実施例２
人工ホタル・ルシフェラーゼ
ホタル・ルシフェラーゼをコードするｃＤＮＡは、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼプロモータと共に用いられる下記
の５’センスプライマー類と、３’アンチセンスプライ
マー類、を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
って増幅させた：プライマーコードを以下に示す。
ＲＮＡポリメラーゼプロモータと共に用いられる下記
の５’センスプライマー類と、３’アンチセンスプライ
マー類、を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によ
って増幅させた：プライマーコードを以下に示す。
【００４０】５’センス・プライマー類
（１０５）CACCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGGAAGACGCCA
AAAAC （１０７）AGAACTGCCTGCCGCAGATTCTCGCA （１１０）ATGCTGTCCCGGCTGTCCCTGCGGCTGCTGTCCCGGTACC
TGCTGAAGACGCCAAAAAC （１１１）CACCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCTGTCCCGGC
TGTCC
AAAAC （１０７）AGAACTGCCTGCCGCAGATTCTCGCA （１１０）ATGCTGTCCCGGCTGTCCCTGCGGCTGCTGTCCCGGTACC
TGCTGAAGACGCCAAAAAC （１１１）CACCTAATACGACTCACTATAGGGAGAATGCTGTCCCGGC
TGTCC
【００４１】３’アンチセンス・プライマー類
（１００）TCTCGCTGAATACAGTTAC
（１０６）CCCCAAGCTTAGATCTCTCTGATTTTTCTTGCGT
（１０８）TGCGAGAATCTGCGGCAGGCAGTTCT
【００４２】下記のホタル・ルシフェラーゼｃＤＮＡ類
は、以下のプライマー類を用いて構築された： （ａ）全長（１０５＋１００） （ｂ）−３６ｂｐすなわち、パーオキシソマル・シグナ
ルペプチド欠失（１０５＋１０６） （ｃ）タンパク質中央部のプロテインキナーゼＡ部位
（RRXS）（段階１：１０５＋１０８および１０７＋１０
０； 段階２：段階１からの半分２個＋１０５＋１０
０） （ｄ）Ｎ末端のミトコンドリア・シグナル（段階１：１
１０ ＋１００ ； 段階２：段階１の試料＋１１１＋１
００）。
は、以下のプライマー類を用いて構築された： （ａ）全長（１０５＋１００） （ｂ）−３６ｂｐすなわち、パーオキシソマル・シグナ
ルペプチド欠失（１０５＋１０６） （ｃ）タンパク質中央部のプロテインキナーゼＡ部位
（RRXS）（段階１：１０５＋１０８および１０７＋１０
０； 段階２：段階１からの半分２個＋１０５＋１０
０） （ｄ）Ｎ末端のミトコンドリア・シグナル（段階１：１
１０ ＋１００ ； 段階２：段階１の試料＋１１１＋１
００）。
【００４３】５０μｌ中におけるＰＣＲ反応は、１０ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、０．０１％ゼラチン、０．
４Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、各
０．２ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，０．５μＭの各プライマー、１μｌのＤＮＡ（およ
そ１−１００ng）を含有していた。
Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．３、０．０１％ゼラチン、０．
４Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ、２ｍＭ ＭｇＣｌ2 、各
０．２ｍＭのｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，０．５μＭの各プライマー、１μｌのＤＮＡ（およ
そ１−１００ng）を含有していた。
【００４４】本反応は、５０μｌの鉱物油でカバーさ
れ、パーキンエルマー（Perkin−Elmer ）サーマルサイ
クラー中で２５サイクル、即ち、９４℃−１分、５５℃
−１分、７２℃−２分＋各サイクルの５秒延長、でイン
キュベートし、さらに、１ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポ
リメラーゼ（クレノウ(Klenow )断片）とともに３７℃
で３０分間、インキュベートした。
れ、パーキンエルマー（Perkin−Elmer ）サーマルサイ
クラー中で２５サイクル、即ち、９４℃−１分、５５℃
−１分、７２℃−２分＋各サイクルの５秒延長、でイン
キュベートし、さらに、１ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポ
リメラーゼ（クレノウ(Klenow )断片）とともに３７℃
で３０分間、インキュベートした。
【００４５】ＰＣＲの成功は、アガロースゲル電気泳動
のバンドによって確認した。ｃＤＮＡはセントリコンに
よって精製し、プライマー類を除去し、そして、緩衝フ
ェノール：ＣＨＣｌ3 ：２級アミルアルコール（２５：
２４：１）で抽出後、７０％エタノール、０．７ｍＭ
酢酸アンモニウム中で沈澱させた。
のバンドによって確認した。ｃＤＮＡはセントリコンに
よって精製し、プライマー類を除去し、そして、緩衝フ
ェノール：ＣＨＣｌ3 ：２級アミルアルコール（２５：
２４：１）で抽出後、７０％エタノール、０．７ｍＭ
酢酸アンモニウム中で沈澱させた。
【００４６】前記ＤＮＡ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ０．１
または１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４ 〜７．５ 中に溶
解した０．５〜１μｇ）は、３７℃で４時間まで（最適
には１〜２時間）、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ, ｐＨ７．４
〜７．５, ５．６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ジチ
オスレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミ
ン、２ｍＭ スパーミジン、各０．５ｍＭのＡＴＰ，Ｃ
ＴＰ，ＵＴＰ，０．１ｍＭのＧＴＰ，０．５ｍＭのｃａ
ｐ ｍ７ Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ，１０００Ｕの
ＲＮＡ ｓｉｎ／ｍｌ、８００ＵのＴ７ ＲＮＡ ポリ
メラーゼ±２μ、Ｃ 32Ｐ−ＵＴＰを含有する緩衝液中
で、前記のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ中に転写した。
または１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．４ 〜７．５ 中に溶
解した０．５〜１μｇ）は、３７℃で４時間まで（最適
には１〜２時間）、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ, ｐＨ７．４
〜７．５, ５．６ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１０ｍＭ ジチ
オスレイトール、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミ
ン、２ｍＭ スパーミジン、各０．５ｍＭのＡＴＰ，Ｃ
ＴＰ，ＵＴＰ，０．１ｍＭのＧＴＰ，０．５ｍＭのｃａ
ｐ ｍ７ Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ，１０００Ｕの
ＲＮＡ ｓｉｎ／ｍｌ、８００ＵのＴ７ ＲＮＡ ポリ
メラーゼ±２μ、Ｃ 32Ｐ−ＵＴＰを含有する緩衝液中
で、前記のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ中に転写した。
【００４７】本反応は、氷冷フェノール：ＣＨＣｌ3：
２級アミルアルコール（２５：２４：１）中で停止さ
せ、そして、前記ＲＮＡを７０％エタノール＋０．７Ｍ
NH4Ａｃで沈澱させ、−２０℃で保存した。
２級アミルアルコール（２５：２４：１）中で停止さ
せ、そして、前記ＲＮＡを７０％エタノール＋０．７Ｍ
NH4Ａｃで沈澱させ、−２０℃で保存した。
【００４８】前記ＲＮＡを遠心分離し、２０μｌの７０
ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ７．４〜７．５
中に再溶解させ、そして、１μｌを５〜１０μｌのウサ
ギ網状赤血球溶解液とともに３０℃で１時間インキュベ
ートして、ルシフェラーゼを合成した。１／１００希釈
後のルシフェラーゼを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、
０．１〜０．２ｍＭルシフェリン、０．５〜５ｍＭ Ａ
ＴＰ中ｐＨ７．８ で直接発光をアッセイするかまたは
等電点電気泳動によって単離する。
ｍＭ Ｔｒｉｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡｐＨ７．４〜７．５
中に再溶解させ、そして、１μｌを５〜１０μｌのウサ
ギ網状赤血球溶解液とともに３０℃で１時間インキュベ
ートして、ルシフェラーゼを合成した。１／１００希釈
後のルシフェラーゼを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、
０．１〜０．２ｍＭルシフェリン、０．５〜５ｍＭ Ａ
ＴＰ中ｐＨ７．８ で直接発光をアッセイするかまたは
等電点電気泳動によって単離する。
【００４９】突然変異体（ＲＲＸＳ）ルシフェラーゼ
は、およそ７．１または６．８のｐＩを有し、そして、
正常のルシフェラーゼは、およそ６．８のｐＩを有して
いる。ミトコンドリア・シグナルを有するルシフェラー
ゼは、また、正常ルシフェラーゼから分離された。この
改変ルシフェラーゼを含有するウサギ網状赤血球溶解液
を添加すると、それは、遠心分離およびミトコンドリア
およびルシフェラーゼからの発光によっても示されるよ
うに、添加されたミトコンドリアによって取り込まれ
た。
は、およそ７．１または６．８のｐＩを有し、そして、
正常のルシフェラーゼは、およそ６．８のｐＩを有して
いる。ミトコンドリア・シグナルを有するルシフェラー
ゼは、また、正常ルシフェラーゼから分離された。この
改変ルシフェラーゼを含有するウサギ網状赤血球溶解液
を添加すると、それは、遠心分離およびミトコンドリア
およびルシフェラーゼからの発光によっても示されるよ
うに、添加されたミトコンドリアによって取り込まれ
た。
【００５０】プロテインキナーゼＡ、サイクリックＡＭ
Ｐ(０．２ｍＭ）, ＡＴＰ（０．１−１ｍＭ）ｐＨ７と
ともにＲＲＸＳを含むルシフェラーゼのリン酸化によっ
て、ルシフェラーゼのｐＩを再度６．８に戻すように変
化させその色をシフトさせた。ＲＲＸＳルシフェラーゼ
は、干渉フィルター付二波長ケミルミノメータを用いて
検出した時に未改変ルシフェラーゼよりも強い緑色の発
光を有していた（最大透過率およそ５４５および６０３
ｍＭ）。
Ｐ(０．２ｍＭ）, ＡＴＰ（０．１−１ｍＭ）ｐＨ７と
ともにＲＲＸＳを含むルシフェラーゼのリン酸化によっ
て、ルシフェラーゼのｐＩを再度６．８に戻すように変
化させその色をシフトさせた。ＲＲＸＳルシフェラーゼ
は、干渉フィルター付二波長ケミルミノメータを用いて
検出した時に未改変ルシフェラーゼよりも強い緑色の発
光を有していた（最大透過率およそ５４５および６０３
ｍＭ）。
【００５１】ケンプチドヌクレオチドセンスまたはアン
チセンス配列（LRRASLG ）またはマランチド RTKRSGSV
YEPLKI を含有するプライマー類は、同様に、１または
２段階のＰＣＲ反応を用いてＮまたはＣ末端のいずれか
に添加された。これらは、また、リン酸化されることが
できるルシフェラーゼを産生し、それによって、その強
度および色を変化させた。
チセンス配列（LRRASLG ）またはマランチド RTKRSGSV
YEPLKI を含有するプライマー類は、同様に、１または
２段階のＰＣＲ反応を用いてＮまたはＣ末端のいずれか
に添加された。これらは、また、リン酸化されることが
できるルシフェラーゼを産生し、それによって、その強
度および色を変化させた。
【００５２】実施例３
工学処理されたエクオリンの調製
ｃＤＮＡすなわちＣａ2+活性化発光タンパク質のゲノム
コードは、ホタル・ルシフェラーゼのそれと同様の方法
でＰＣＲされた。１または２段階ＰＣＲを用いて、プロ
テインキナーゼＡ認識ペプチド・ケンプチド（LRRLALG
）またはマランチド（実施例２に同じ）をＮ末端に添
加した。突然変異エクオリンは、異なるキネティック特
性を有しており、改変エクオリン（上記）をリン酸化す
ることによってプロテイン・キナーゼＡを検出可能とし
た。
コードは、ホタル・ルシフェラーゼのそれと同様の方法
でＰＣＲされた。１または２段階ＰＣＲを用いて、プロ
テインキナーゼＡ認識ペプチド・ケンプチド（LRRLALG
）またはマランチド（実施例２に同じ）をＮ末端に添
加した。突然変異エクオリンは、異なるキネティック特
性を有しており、改変エクオリン（上記）をリン酸化す
ることによってプロテイン・キナーゼＡを検出可能とし
た。
【００５３】正常エクオリン・プライマー類＝５’セン
ス TAATACGACTCACTATAGGGGAGAGAATGGTCAAGCTTTACATCAG
ACTTCGAC と、３’アンチセンス GAATTCTTAGGGGACAGC
TCCACCGTA であった。Ｎ末端へのケンプチド挿入のた
めに、LRRASLG と等価のヌクレオチド配列をエクオリン
の５’末端から最初の１５塩基（ＡＴＧを含む）に結合
させた。
ス TAATACGACTCACTATAGGGGAGAGAATGGTCAAGCTTTACATCAG
ACTTCGAC と、３’アンチセンス GAATTCTTAGGGGACAGC
TCCACCGTA であった。Ｎ末端へのケンプチド挿入のた
めに、LRRASLG と等価のヌクレオチド配列をエクオリン
の５’末端から最初の１５塩基（ＡＴＧを含む）に結合
させた。
【００５４】段階２において、前記Ｔ７ ＲＮＡポリメ
ラーゼ・プロモータを添加して、インビトロ・リン酸化
のためにケンプチド−エクオリンをインビトロで形成し
た。ゲノム・エクオリンＤＮＡ（ＰＣＲによって作製）
は、逆転写酵素ＰＣＲによってｍＲＮＡから製造された
それと少なくとも同じくらい活性であった。
ラーゼ・プロモータを添加して、インビトロ・リン酸化
のためにケンプチド−エクオリンをインビトロで形成し
た。ゲノム・エクオリンＤＮＡ（ＰＣＲによって作製）
は、逆転写酵素ＰＣＲによってｍＲＮＡから製造された
それと少なくとも同じくらい活性であった。
【００５５】実施例４
血中の癌細胞の検出
血液試料（１ml）を図１のベンゾチアゾール反応３を触
媒するレインボウタンパク質類をコードするｍＲＮＡ含
有リポゾーム類の懸濁液に混合する。このｍＲＮＡは、
下記のようにして産生された：
媒するレインボウタンパク質類をコードするｍＲＮＡ含
有リポゾーム類の懸濁液に混合する。このｍＲＮＡは、
下記のようにして産生された：
【００５６】ホタル・ルシフェラーゼをコードする遺伝
子は、最初に、（ｐＣＤＶ１プラスミドプライマー）＋
（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ含有ホンジョ
ー（Honjo）リンカー）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｃ
ＤＮＡライブラリから単離した。ｍｙｃ癌遺伝子のチロ
シンキナーゼ活性のためのリン酸化部位を示すヌクレオ
チド配列 GCTCGTCTTATTGAAGATAATGAATATACTGCTCGTTTTGGT を、５’末端のＡＴＧから３０塩基対下流のＥｃｏＲＩ
制限部位に挿入した。
子は、最初に、（ｐＣＤＶ１プラスミドプライマー）＋
（ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモータ含有ホンジョ
ー（Honjo）リンカー）を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ中のｃ
ＤＮＡライブラリから単離した。ｍｙｃ癌遺伝子のチロ
シンキナーゼ活性のためのリン酸化部位を示すヌクレオ
チド配列 GCTCGTCTTATTGAAGATAATGAATATACTGCTCGTTTTGGT を、５’末端のＡＴＧから３０塩基対下流のＥｃｏＲＩ
制限部位に挿入した。
【００５７】前記ＤＮＡを再び連結し、再クローン化
し、そして、前記プラスミド挿入物はインビトロでＳＰ
６ ＲＮＡポリメラーゼによって転写されてレインボウ
タンパク質のためのｍＲＮＡを産生した。前記の元のタ
ンパク質は黄緑光を発生したが、しかし、レインボウタ
ンパク質は細胞中でリン酸化されたときに赤色光を発生
した。したがって、癌細胞の存在は、二波長ケミルミノ
メータ中で赤色（６０３ｎｍ）に対する黄緑色（５４５
ｎｍ）の光の比率を測定することによって、白血病患者
の血液試料中で検出された。
し、そして、前記プラスミド挿入物はインビトロでＳＰ
６ ＲＮＡポリメラーゼによって転写されてレインボウ
タンパク質のためのｍＲＮＡを産生した。前記の元のタ
ンパク質は黄緑光を発生したが、しかし、レインボウタ
ンパク質は細胞中でリン酸化されたときに赤色光を発生
した。したがって、癌細胞の存在は、二波長ケミルミノ
メータ中で赤色（６０３ｎｍ）に対する黄緑色（５４５
ｎｍ）の光の比率を測定することによって、白血病患者
の血液試料中で検出された。
【００５８】実施例５
サルモネラ（Salmonella）の検出
ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含有する実施
例４のレインボウタンパク質のためのｃＤＮＡを、サル
モネラ(Salmonella)ファージ中に挿入した。このファー
ジをサルモネラ(Salmonella)に添加すると、レインボウ
タンパク質を発現させおよび赤色光を発生させ、２０ｍ
ｌ当たり１個しかない細菌も検出できた。
例４のレインボウタンパク質のためのｃＤＮＡを、サル
モネラ(Salmonella)ファージ中に挿入した。このファー
ジをサルモネラ(Salmonella)に添加すると、レインボウ
タンパク質を発現させおよび赤色光を発生させ、２０ｍ
ｌ当たり１個しかない細菌も検出できた。
【００５９】実施例６
ＨＩＶ ＲＮＡの検出
ＡＩＤＳ患者の血液試料（１ｍｌ）を４Ｍグアニジウム
イソチオシアナートによって抽出し、そして、前記核酸
をエタノール／ＮＨ酢酸によって沈澱させた。前記発光
タンパク質オベリンから産生したレインボウタンパク質
で標識したオリゴヌクレオチド（１０μｌ，１μＭ）
を、１００μｌの再溶解ＲＮＡに５０℃で添加して、こ
の混合物を０℃で１０分間冷却した。
イソチオシアナートによって抽出し、そして、前記核酸
をエタノール／ＮＨ酢酸によって沈澱させた。前記発光
タンパク質オベリンから産生したレインボウタンパク質
で標識したオリゴヌクレオチド（１０μｌ，１μＭ）
を、１００μｌの再溶解ＲＮＡに５０℃で添加して、こ
の混合物を０℃で１０分間冷却した。
【００６０】このオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶコート
タンパク質中の配列に特異的であった。これをＨＩＶ
ＲＮＡに結合して、レインボウタンパク質の発光を淡青
（４７５ｎｍ）から青（４４０ｎｍ）にシフトさせた。
これは、二重光電子増倍管ケミルミノメータ中における
これら二波長における発光の比率のシフトとして検出さ
れた。
タンパク質中の配列に特異的であった。これをＨＩＶ
ＲＮＡに結合して、レインボウタンパク質の発光を淡青
（４７５ｎｍ）から青（４４０ｎｍ）にシフトさせた。
これは、二重光電子増倍管ケミルミノメータ中における
これら二波長における発光の比率のシフトとして検出さ
れた。
【００６１】実施例７
血液中テストステロンの測定
テストステロン・カルボキシオキシムを、発光タンパク
質オベリン由来レインボウタンパク質と反応させ、テス
トステロン・レインボウタンパク質結合物(conjugate)
を形成させる。この１ｎｍｏｌを含有する５μｌを、さ
まざまな濃度の標準テストステロンの存在下または非存
在下に、テストステロン（５０μｌ）ｐＨ7.4 に対して
フルオロセイン標識した抗体溶液とともに、３０分間イ
ンキュベートした。
質オベリン由来レインボウタンパク質と反応させ、テス
トステロン・レインボウタンパク質結合物(conjugate)
を形成させる。この１ｎｍｏｌを含有する５μｌを、さ
まざまな濃度の標準テストステロンの存在下または非存
在下に、テストステロン（５０μｌ）ｐＨ7.4 に対して
フルオロセイン標識した抗体溶液とともに、３０分間イ
ンキュベートした。
【００６２】生物発光反応は、Caの添加によって惹起さ
れ、そして、４７５ｎｍの光の５３０ｎｍの光に対する
比率を測定した。標準テストステロン濃度を増加すると
ともに、４７５／５３０比率が増大した。本操作は、遊
離抗原から結合抗原を分離する必要もなく実行すること
ができた。
れ、そして、４７５ｎｍの光の５３０ｎｍの光に対する
比率を測定した。標準テストステロン濃度を増加すると
ともに、４７５／５３０比率が増大した。本操作は、遊
離抗原から結合抗原を分離する必要もなく実行すること
ができた。
【００６３】実施例８
リステリア菌の検出
疑いのある食品試料を沸騰させ、ＤＮＡを抽出する。特
異的リステリア菌遺伝子またはオベリンｃＤＮＡ＋５Ｐ
６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに共有結合で結合し
た領域に対するセンスプライマ、およびアンチセンス緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡに共有結合で結合
したアンチセンスプライマー、を用いて、ポリメラーゼ
連鎖反応を用いてリステリア菌（Listeria）遺伝子を増
幅させる。この結果、新規レインボウタンパク質のコー
ドを指定し且つＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって転
写可能なＤＮＡとなる。
異的リステリア菌遺伝子またはオベリンｃＤＮＡ＋５Ｐ
６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに共有結合で結合し
た領域に対するセンスプライマ、およびアンチセンス緑
色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡに共有結合で結合
したアンチセンスプライマー、を用いて、ポリメラーゼ
連鎖反応を用いてリステリア菌（Listeria）遺伝子を増
幅させる。この結果、新規レインボウタンパク質のコー
ドを指定し且つＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼによって転
写可能なＤＮＡとなる。
【００６４】
【００６５】このＤＮＡは転写され、そして、ｍＲＮＡ
は、ウサギ網状赤血球溶解液を用いて翻訳される。コエ
レンテラジンを添加しオベリンを再活性化する。オベリ
ン単独に対するレインボウタンパク質に対応する５１０
／４７５ｎｍにおける光の比率は、食品試料中に最初か
ら存在するリステリア菌ＤＮＡの量に直接比例する。リ
ステリア菌が全く存在しないとき、比率の割合は１であ
る。
は、ウサギ網状赤血球溶解液を用いて翻訳される。コエ
レンテラジンを添加しオベリンを再活性化する。オベリ
ン単独に対するレインボウタンパク質に対応する５１０
／４７５ｎｍにおける光の比率は、食品試料中に最初か
ら存在するリステリア菌ＤＮＡの量に直接比例する。リ
ステリア菌が全く存在しないとき、比率の割合は１であ
る。
【００６６】実施例９
偏光による核酸ハイブリダイゼーションの測定
実施例６に記載の反応を実施したが、光発光は、偏向板
を互いに９０°として偏向フイルター付き２光電子増倍
管ケミルミノメータで検出した。上記２個の光電子増倍
管の比は、存在するＨＩＶ ＲＮＡの量に関連してい
た。
を互いに９０°として偏向フイルター付き２光電子増倍
管ケミルミノメータで検出した。上記２個の光電子増倍
管の比は、存在するＨＩＶ ＲＮＡの量に関連してい
た。
【００６７】実施例１０
サイクリックＡＭＰまたはＩｐ３の測定
実施例２または３に記載の２段階ＰＣＲ反応を用いて、
前記細菌性ＣＡＰタンパク質または小胞体受容体のＩｐ
３結合領域からのサイクリックＡＭＰ結合領域を、前記
ＮまたはＣ末端にまたはホタル・ルシフェラーゼまたは
エクオリンに添加した。前記改変タンパク質類は、実施
例２または３に記載のようにしてＰＣＲＤＮＡ生成物か
らインビトロで作製され、そして、発光サイクリックＡ
ＭＰまたはＩｐ３の活性および発光色によって特性解析
した。
前記細菌性ＣＡＰタンパク質または小胞体受容体のＩｐ
３結合領域からのサイクリックＡＭＰ結合領域を、前記
ＮまたはＣ末端にまたはホタル・ルシフェラーゼまたは
エクオリンに添加した。前記改変タンパク質類は、実施
例２または３に記載のようにしてＰＣＲＤＮＡ生成物か
らインビトロで作製され、そして、発光サイクリックＡ
ＭＰまたはＩｐ３の活性および発光色によって特性解析
した。
【００６８】強度および色の両方の変化によって、細胞
抽出物または生細胞中でＣＡＭＰまたはＩｐ３が測定可
能となった。イメージ・インテンシファイアーを用い
て、ＣＡＭＰまたはＩｐ３“クラウド”は、この１個の
細胞の中で可視化できた。同様に、エクオリンまたはル
シフェラーゼは、もしそれが最初にそれ（＋ＫＤＥＬ）
とＣ末端で結合したＥＲまたはミトコンドリ・アシグナ
ルで調製されたならば、ＥＲまたはミトコンドリオン内
部で見ることができた。
抽出物または生細胞中でＣＡＭＰまたはＩｐ３が測定可
能となった。イメージ・インテンシファイアーを用い
て、ＣＡＭＰまたはＩｐ３“クラウド”は、この１個の
細胞の中で可視化できた。同様に、エクオリンまたはル
シフェラーゼは、もしそれが最初にそれ（＋ＫＤＥＬ）
とＣ末端で結合したＥＲまたはミトコンドリ・アシグナ
ルで調製されたならば、ＥＲまたはミトコンドリオン内
部で見ることができた。
【００６９】生物発光タンパク質が、生物によって産生
されたタンパク質の修飾による代わりに、アミノ酸配列
から、またはＤＮＡまたはＲＮＡ合成技術を用いて合成
できることが理解されるであろう。
されたタンパク質の修飾による代わりに、アミノ酸配列
から、またはＤＮＡまたはＲＮＡ合成技術を用いて合成
できることが理解されるであろう。
【図１】ルシフェリンが同定されている５種の化学属を
示す図である。
示す図である。
１ アルデヒド類（細菌、淡水リンペット・ラティア
（Latia）およびミミズ中に見られる）。 ２ イミダゾロピラジン類（有毛根足類、刺胞動物、有
櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊索
動物）。 ３ ベンゾチアゾール（ホタル類およびツチボタル類の
ような甲虫類に見られる）。 ４ 直鎖テトラピロール類（双鞭毛藻類、オキアミ、一
部の魚類に見られる）。 ５ フラビン類（細菌、真菌、多毛類および一部の軟体
動物に見られる）。
（Latia）およびミミズ中に見られる）。 ２ イミダゾロピラジン類（有毛根足類、刺胞動物、有
櫛動物、一部の節足動物、一部の軟体動物、一部の脊索
動物）。 ３ ベンゾチアゾール（ホタル類およびツチボタル類の
ような甲虫類に見られる）。 ４ 直鎖テトラピロール類（双鞭毛藻類、オキアミ、一
部の魚類に見られる）。 ５ フラビン類（細菌、真菌、多毛類および一部の軟体
動物に見られる）。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｇ０１Ｎ 33/483 Ｃ
33/483 33/53 Ｄ
33/53 Ｍ
33/566
33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Ｆターム(参考） 2G054 AA08 CA22 CA23 EA02 GA04
4B024 AA11 AA12 BA08 BA80 CA01
CA07 HA12
4B050 CC03 DD02 DD07 LL03
4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ13 QQ43
QQ44 QR08 QR42 QR56 QS02
QS25 QS34 QX02
4H045 AA10 AA30 CA11 CA50 CA51
EA50 FA72
Claims (16)
- 【請求項１】 結合部位によって受容体としてのエネル
ギー転移タンパク質部位に結合された供与体としての生
物発光タンパク質部位を包含する生物発光タンパク質で
あって、当該結合部位は選ばれた分析物との相互作用サ
イトを包含し、当該分析物は上記の相互作用サイトと反
応し、上記の生物発光タンパク質は生物発光反応におい
て反応性であって光を発し、その結果、上記の光は、上
記の分析物が上記の相互作用部位と相互作用していると
きには第一の特徴の物理特性を有し、上記の分析物が上
記の相互作用サイトと反応していないときには上記の物
性とは異なる第二の特徴を有する、様に発せられる、こ
とを特徴とする上記の生物発光タンパク質。 - 【請求項２】 前記エネルギー転移タンパク質部位と前
記生物発光タンパク質部位とが前記結合部位を介して共
有結合されている、ことを特徴とする請求項１に記載の
生物発光タンパク質。 - 【請求項３】 前記エネルギー転移タンパク質部位と前
記生物発光タンパク質部位とが前記結合部位を介して非
共有結合されている、ことを特徴とする請求項１に記載
の生物発光タンパク質。 - 【請求項４】 前記エネルギー転移タンパク質部位が緑
色蛍光蛋白質またはその蛍光発色領域を包含する、こと
を特徴とする請求項１に記載の生物発光タンパク質。 - 【請求項５】 前記エネルギー転移タンパク質部位が青
色、黄色またはより高い波長の色で蛍光発色するタンパ
ク質またはその蛍光領域を包含する、ことを特徴とする
請求項１に記載の生物発光タンパク質。 - 【請求項６】 前記結合部位が核酸分子を包含する群か
ら選択される、ことを特徴とする請求項１に記載の生物
発光タンパク質。 - 【請求項７】 請求項１に記載の生物発光タンパク質の
コードを指定する核酸。 - 【請求項８】 一つの基質とその基質が曝される相手の
物質との間の相互作用をモニターする方法であって、そ
の方法が（ａ）生物発光反応に関与可能な生物発光タン
パク質部位を上記の基質の第一の部位にカプリングさ
せ、（ｂ）エネルギー転移タンパク質部位を上記の基質
の第二の部位にカプリングさせ、それによって上記の生
物発光タンパク質部位と前記のエネルギー転移タンパク
質部位とがエネルギー転移関係にあり、（ｃ）上記の基
質を上記の物質に曝し、（ｄ）前記生物発光反応を開始
させ、そして、（ｅ）上記の生物発光タンパク質部位に
より直接放射される光の量と、上記の生物発光タンパク
質部と上記のエネルギー転移タンパク質部位との間にお
けるエネルギー転移に基づく上記のエネルギー転移タン
パク質部位によって放射される光の量との、少なくとも
一方をモニターする、ことを包含することを特徴とする
上記のモニターする方法。 - 【請求項９】 前記の基質が１つまたは２つ以上の突然
変異または欠失を含む核酸フラグメントを包含し、そし
て、前記の基質が、上記の１つまたは２つ以上の突然変
異または欠失に応答して上記の核酸フラグメントを切断
するような核酸分解酵素を包含する、ことを特徴とする
請求項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 試料中の物質をモニター又は検出する
方法であって、当該方法が、当該試料を（ａ）１つの生
物発光反応に関与可能な生物発光タンパク質部位を含み
且つ上記の物質の第一の領域に特異的に結合可能な第一
の結合部位にカプリングされた、第一の試薬と、（ｂ）
上記の物質の第二の領域に特異的に結合可能な第二の結
合部位に結合されたエネルギー転移タンパク質部位を包
含する、第二の試薬と、に曝し、上記の結合により、
（ｃ）上記の生物発光反応を開始させることと、（ｄ）
上記の生物発光タンパク質部位によって直接放射される
光の量と、上記の生物発光タンパク質部位と上記のエネ
ルギー転移タンパク質部位との間におけるエネルギー転
移に基づいて上記のエネルギー転移タンパク質部位によ
って放射される光の量、との少なくとも一方をモニター
することとを起こさせる、ことを特徴とする上記の方
法。 - 【請求項１１】 １つの物質をモニター又は検出するの
に使用するためのキットであって、当該キットが、
（ａ）上記の物質の第一の領域と結合可能な第一の特異
な結合部位と結合した生物発光反応に関与可能な生物発
光タンパク質部位を含む第一の試薬と、（ｂ）上記の物
質の第二の領域と結合可能な第二の特異な結合部位と結
合したエネルギー転移タンパク質部位を含む第二の試薬
とを、包含することを特徴とする上記のキット。 - 【請求項１２】 一つの物質をモニター又は検出するの
に使用するキットであって、当該キットが（ａ）上記の
物質の第一の領域に結合可能な第一の特異な結合部位と
結合した生物発光タンパク質部位を包含する第一の試薬
のコードを指定する核酸と、（ｂ）上記の物質の第二の
領域に結合可能な第二の特異な結合部位と結合したエネ
ルギー転移タンパク質部位を包含する第二の試薬のコー
ドを指定する核酸とを、包含することを特徴とする上記
のキット。 - 【請求項１３】 対象とする核酸フラグメントの存在に
ついて試料をモニターする方法であって、当該方法が、
（ａ）生物発光タンパク質のコードを指定する核酸を結
合した第一の核酸増幅プライマーと、エネルギー転移タ
ンパク質またはその蛍光発光領域のコードを指定する核
酸を結合した第二の核酸増幅プライマーを上記の試料の
中に導入し、（ｂ）上記の核酸増幅プロセスを開始し、
（ｃ）上記の核酸増幅プロセスの産生物を発現させて１
つ又は２つ以上の生物発光タンパク質を得、そして、
（ｄ）上記の１つ又は２つ以上の生物発光タンパク質を
含む１つ又は２つ以上の生物発光反応を開始し、そし
て、上記の生物発光反応の間に放射される光の特徴をモ
ニターする、ことを包含することを特徴とする対象とす
る上記のモニターする方法。 - 【請求項１４】 試料の中の物質をモニター又は検出す
る方法であって、当該方法が上記の試料を、（ａ）結合
部位によって受容体としてのエネルギー転移タンパク質
部位に結合された供与体としての生物発光タンパク質部
位を包含する生物発光タンパク質であって、当該結合部
位は上記の物質との相互作用部位を包含し、当該物質は
上記の相互作用部位と反応し、上記の生物発光タンパク
質は生物発光反応において反応性であって光を発し、そ
の結果、上記の光は、上記の物質が上記の相互作用部位
と相互作用しているときには第一の特徴を有する物理特
性を有するように発せられ、上記の物質が上記の相互作
用部位と反応していないときには上記の特徴とは異なる
第二の特徴を有する様に発せられる、ような上記の生物
発光タンパク質、に曝し、（ｂ）上記の生物発光反応を
開始し、そして（ｃ）上記の生物発光タンパク質部位に
よって直接放射される光と、上記の生物発光タンパク質
部位と上記のエネルギー転移タンパク質部位との間のエ
ネルギー転移に基づいて上記のエネルギー転移タンパク
質部位によって放射される光、とのうちの少なくとも一
つをモニターする、ことを包含することを特徴とする上
記の検出する方法。 - 【請求項１５】 対象とする物質を検出するのに使用す
るためのキットであって、当該キットが、（ａ）生物発
光タンパク質部位のコードを指定する核酸の第一の断片
を包含している第１の薬剤であって、当該第１の断片は
上記核酸試料とハイブリダイズするための第一の核酸増
幅プライマーに結合している、上記の第一の薬剤と、
（ｂ）エネルギー転移タンパク質のコードを指定する第
二の核酸断片を包含している第二の薬剤であって、当該
第二の核酸断片は上記の核酸試料の第二の領域とハイブ
リダイズすることが可能な第二の核酸増幅プライマーに
結合している、上記の第二の試薬と、を包含することを
特徴とする上記のキット。 - 【請求項１６】 一つの基質と当該基質が曝される相手
の物質との間の相互作用をモニターする方法であって、
その方法が、（ａ）上記の基質の第一の部位に、生物発
光反応に関与可能な生物発光タンパク質部位を結合し、
（ｂ）上記の基質の第二の部位にエネルギー転移タンパ
ク質部位を結合し、このとき上記の生物発光タンパク質
部位と上記のエネルギー転移タンパク質部位とはエネル
ギー転移関係にあり、（ｃ）上記の基質を上記の物質に
曝し、（ｄ）上記の生物発光反応を開始させ、そして
（ｅ）上記の生物発光タンパク質部位によって直接放射
される光の量と、上記の生物発光部位と上記のエネルギ
ー転移タンパク質部位との間のエネルギー転移に基づい
て上記のエネルギー転移タンパク質部位によって放射さ
れる光の量と、の少なくとも一方をモニターし、その
際、上記の基質が１つまたは２つ以上の突然変異または
欠失を含む核酸断片を含み、そして、前記の物質が１つ
または２つ以上の突然変異または欠失に応答して上記の
核酸断片を切断するような核酸分解酵素を包含する、こ
とを包含することを特徴とする上記のモニターする方
法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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| GB8916806.6 | 1989-07-22 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51042490A Division JP3375337B2 (ja) | 1989-07-22 | 1990-07-23 | 生物発光タンパク質 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51042490A Expired - Fee Related JP3375337B2 (ja) | 1989-07-22 | 1990-07-23 | 生物発光タンパク質 |
| JP2002253527A Pending JP2003102491A (ja) | 1989-07-22 | 2002-08-30 | 生物発光タンパク質 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51042490A Expired - Fee Related JP3375337B2 (ja) | 1989-07-22 | 1990-07-23 | 生物発光タンパク質 |
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| AU (1) | AU6054590A (ja) |
| CA (1) | CA2064766A1 (ja) |
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