JPS63317079A - ルシフェラ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ルシフェラーゼの製造法に関し、さらに詳し
くは、形質転換したサツカロマイセス属に属する微生物
を使用したルシフェラーゼの製造法に関する。

〔従来の技術〕

従来、ホタルの１種であるフォティナス・ピラリス（Ｐ
ｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラー
ゼは、例えば、微生物を用いて該ルシフェラーゼを製造
する場合、プラスミドｐＫ　Ｊ　Ｂ８２４．１７Ｄ　Ｎ
　Ａに、フォティナス・ピラリスのｃ−ＤＮＡを組み込
んで得られた組み換え体プラスミドｐＫＷ１０１　ＤＮ
Ａを用いて大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｔ　Ｂ　１を形質転
換して得られた形質転換株、すなわち、大腸菌（Ｅ、ｃ
ｏｌｔ）Ｔ　Ｂ　１　（ｐＫＷｌｏｌ＞を培養して得ら
れているに過ぎない〔ブロク・ナトル・アカド・サイ・
（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）、第８２巻、第７８７０〜７８７
３頁、（１９８５）　）。

上記ルシフェラーゼは、例えば、ＡＴＰの定量用酵素と
して極めて有用な酵素である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、上記ルシフェラーゼを、形質転換したサツカ
ロマイセス属に属する微生物により製造する新規なルシ
フェラーゼの製造法を提供することを目的とする。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者等は上記目的を達成するため、フォティナス・
ピラリス由来のルシフェラーゼを上記の大腸菌とは別に
酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を宿主菌として用
い、該ルシフェラーゼを発現すべく種々検討した結果、
該ルシフェラーゼをサッカロマイセス・セレビシエの菌
体中において効率良く発現させることに成功し、本発明
を完成した。

すなわち本発明は、ルシフェラーゼをコードする遺伝子
をプラスミドベクターＤＮＡに挿入した組み換え体プラ
スミドＤＮＡを含み、ルシフェラーゼ生産能を有するサ
ツカロマイセス属に属する・微生物を、培地に培養し、
培養物よりルシフェラーゼを採取することを特徴とする
ルシフェラーゼの製造法である。

以下、本発明の詳細な説明する。

先ず、ルシフェラーゼをコードする遺伝子の由来は、如
何なるものでもよく、例えば、ホタルの１種であるフォ
ティナス・ピラリス等が挙げられ、殊に、該ホタルの尾
部が好ましい。

そして、上記ホタルの尾部よりｍ−ＲＮＡを調製するに
は、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１９６頁、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇｌｌａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１
９８２）及び分子遺伝学実験法、小関治男、志村令部、
第６６〜６７頁（１９８３）記載の方法等により得るこ
とができる。

得られたｍ−ＲＮＡよりルシフェラーゼをコードするｍ
−ＲＮＡを濃縮するには、例えば、バイオメディカル・
リサーチ（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）
、第３巻、第５３４〜５４０頁（１９８２）記載の方法
により行なうことができる。

なお、この際、ルシフェラーゼに対する抗ルシフェラー
ゼ血清を使用するのであるが、該血清は、例えば、免疫
化学、山村雄−１第４３〜５０頁（１９７３）記載の方
法により得ることができる。

ルシフェラーゼをコードするｍ−ＲＮＡよりＣ−ＤＮＡ
を合成するには、例えば、モル・セル・パイオル（Ｍｏ
１．Ｃｅ１ｌ　Ｒｉｏｔ、）、第２巻、第１６１頁（１
９８２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２６３
頁（１９８３）記載の方法により行なうことができる。

次いで、このようにして得られたｃ−ＤＮＡをベクター
ＤＮＡ、例えば、プラスミドｐＭｃＥ１０ＤＮＡ　［プ
ラスミドｐＫＮ３０５（アグル・バイオム・ケム（Ａｇ
ｒ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第５０巻、第２７１頁（
１９８６）記載の大腸菌トリプトファンオペロンのプロ
モーターを有するプラスミド〕及びプラスミドｐＭＣ１
８４３（メソズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１００巻、第２
９３〜３０８頁（１９８３）記載の大腸菌β−ガラクト
シダーゼ構造遺伝子を有するプラスミド〕を用いて作製
したプラスミド］等に組み込み、種々の組み換え体プラ
スミドＤＮＡを得、該ＤＮＡを用いて例えば、大腸菌（
Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｄ　Ｈ１（Ａ　Ｔ　ＣＣ３３８４９）、
大腸菌（Ｅ、ｃｏｌ　ｉ）　ＨＢ　１０１（Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ３３６９４）等をコーエン（Ｃｏｈｅｒｌ）等の方法
〔ジェイ・バタテリオル（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ、）
、第１１９巻、第１０７２〜１０７４頁（１９７４）　
）により形質転換し、種々の形質転換株を得る。

なお、このようにして得られた形質転換株の有する組み
換え体プラスミドＤＮＡは、大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ構造遺伝子の途中にｃ−ＤＮＡが組み込まれたプラス
ミドであって、ｃ−ＤＮＡによりコードされているペプ
チドは、β−ガラクトシダーゼと融合した蛋白質として
発現するものである。

上記の種々な形質転換株よりルシフェラーゼをコードす
るｃ−ＤＮＡを検出するには、形質転換株を培養するこ
とにより、菌体蛋白質を発現させ、抗ルシフヱラーゼ血
清と交差する蛋白質が存在するか否かにより検出するこ
とができ、例えば、アゲリック・パイオル・ケム（Ａｇ
ｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、第５０巻、第２７１
頁（１９８６）及びアナル・バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ、）　、第１１２巻、第１９５頁（１９８
１）記載の方法等により行なうことができる。

次いで、不完全なルシフェラーゼのＣ−ＤＮＡヲ３２Ｐ
ｆｒ用いニックトランスレーション法〔モレキュラー・
クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）
、第１０９〜１１２Ｌコールド・スプリング・ハーバ−
・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。

（１９Ｂ２）及びジェイ・モル・パイオル（Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ）、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９
７７）によりラベルしたのち、該ｃ−ＤＮＡをプローブ
としてコロニーハイブリダイゼイション法〔蛋白質、核
酸、酵素、第２６巻、第５７５〜５７９頁（１９８１）
　）によりプラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡをベクターとし
て作成したｃ　−ＤＮＡのシーンバンクのライブラリー
より１．８ＫｂのルシフェラーゼをコードするＣ−ＤＮ
Ａを含有するプラスミドＤＮＡを得ることができる。

このようにして得たルシフェラーゼをコードするｃ−Ｄ
ＮＡ含有プラスミドＤＮＡを、制限酵素、例えばＢａｍ
ＨＩ及びＸｂａｌを温度３０〜４０℃、好ましくは、３
７℃で１〜２４時間、好ましくは２時間作用させて、該
プラスミドを切断したものに、翻訳開始部位を含むＤＮ
Ａ断片（例えば、ＡＴＧ含有ＤＮＡ等）及びＴ４ＤＮＡ
リガーゼ（宝酒造・社・製）等のＤＮＡリガーゼを添加
して常法により連結させて、組み換え体プラスミドＤＮ
Ａを得る。

次いで、該プラスミドに、例えば、ＨｉｎｄＴＩＩを常
法により作用させて、ルシフェラーゼをコードするｃ−
ＤＮＡを含有するＤＮＡを得、該ＤＮＡを、プラスミド
ベクターＤＮＡに組み込み、組み換え体プラスミドＤＮ
Ａを得る。

上記プラスミドベクターＤＮＡとしては如何なにもので
もよく、例えば、プラスミドＡＡＨ５ＤＮＡ　（ワシン
トン・リサーチ・ファウンデーションより入手）等が挙
げられる。

そして、このようにして得られた組み換え体プラスミド
を用いて、サツカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒ。

ｍｙｃｅｓ）属の酵母、例えば、サッカロマイセス・セ
レビシエ５ＨＹＩ　　（ＡＴＣＣ４４７６９）等を、ベ
ッグス（Ｂｅｇｇｓ）の方法〔ネーチュアー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、第２７５巻、第１０４〜１０９頁（１９７Ｂ）
　）により形質転換してルシフェラーゼをコードする遺
伝子をプラスミドベクターＤＮＡに挿入した組み換え体
プラスミドＤＮＡを含みルシフェラーゼ生産能を有する
サツカロマイセス属に属する微生物を得る。

次いで、上記微生物を培地に培養し、培養物よりルシフ
ェラーゼを採取するのである。

培地としては、例えば、サツカロマイセス属に属する微
生物の培養に用いられるものであれば、如何なるもので
もよく、例えば、グルコース、ポリペプトン、酵母エキ
スからなるＹＰＤ培地が挙げられる。

また、培養温度は、例えば、２５〜３５℃、好ましくは
３０℃程度で、培養時間は、例えば、４〜８時間、好ま
しくは６時間程度である。

そして、培養物より菌体を例えば、１２，０ＯＯｒ、ｐ
、ｍ。

で２分間程度の遠心分離処理により集菌し、得られた菌
体を、例えば、ガラスピーズと共に、ボルテフクスミキ
サーにより３分間程度攪拌して破砕し、粗酵素液を得る
。

そして、粗酵素液は、そのままでも使用可能であるが、
必要により硫安分画、イオン交換クロマトグラフ法、例
えば、ＤＥＡＥ−バイオゲルＡ等。

ゲル濾過法、例えば、クルトロゲルＡｃＡ３４等により
精製して、純化されたルシフェラーゼを得る。

このようにして得られたルシフェラーゼの理化学的性質
は、モレキュラー・アンド・セルラー、バイオロジー（
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇい、第７巻、第７２５〜７３７頁（１９８７）
に記載されたものと全く同様である。

〔発明の効果〕

本発明によれば、形質転換したサツカロマイセス属に属
する微生物を使用して、ルシフェラーゼを効率よく製造
することができるので、本発明は産業上極めて有用であ
る。

以下、本発明を実施例を挙げて更に詳細に説明する。

実施例 １、ｍ−ＲＮＡの調製 ホタルの１種であるフォティナス・ピラリス（Ｐｈｏｔ
ｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓ）の乾燥尾部（シグマ・社・
製）１ｇを乳鉢及び乳棒を用いて充分破砕したものに、
溶解緩衝液５　ａｄ　（２０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，４）／　１０ｍＭ　ＮａＣ１／　３　ｍＭ酢
酸マグネシウム１５％（Ｗ／Ｖ）シａ　糖／　１．２　
％（Ｖ／Ｖ）　　）リド７　Ｘ　−１００／　１０ｍＭ
バナジルヌクレオシド錯体°にューイングランド　バイ
オラボ・社・製）〕を添加し、更に、上記と同様に破砕
してフォティナス・ピラリス尾部破砕物含有溶液を得た
。

このようにして得た溶液５−を、カップ型ブレンダー（
日本精機製作所・社・製）に入れ、５．００Ｏｒ、ｐ、
＋ｓ、で５分間処理したものに、１２ｍ１のグアニジン
イソチオシアネート溶液（６Ｍグアニジンイソチオシア
ネート／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０
）１０．７５％（Ｗ／Ｖ）　Ｎ−ラウロイルザルコシン
ナＩ−１７ウム１０．１５Ｍβ−メルカプトエタノール
）を添加し、更に、上記ブレンダーを用い３，０ＯＯｒ
、ｐ、ｍ、で１０分間処理して得た溶液を、３重のガー
ゼを用いて濾過し、濾液を得、超遠心分離機用チューブ
（日立１機・社・製）４本に、予め１．２−の５．７Ｍ
の塩化セシウム溶液を夫々重層し、その上に、上記濾液
を重層するように夫々分注し、超遠心分離機（日立１機
・社・製、５ＣＰ５５Ｈ）を用いて温度１５℃、３０．
００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１６時間遠心分離して沈澱物を得
た。

得られた沈澱物を、冷７０％（Ｖ／Ｖ）エタノールを用
いて洗浄したものを、１０１１１Ｍトリス緩衝液（１０
ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）１５ｍＭＥＤＴ
Ａ／１％ドデシル硫酸ナトリウム）４ｍｆに懸濁したも
のに、同量のｎ−ブタノール及びクロロフォルムを４対
１　（容量比）となる如く混合したものを添加して抽出
し、常法により３．０００ｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心
分離し、水層及び有機溶媒層に分離し、この有機溶媒層
に上記１０＋＋＋Ｍ　）　’）ス緩衝液４−を添加し、
上記抽出及び分離操作を行なう操作を２回繰り返して得
られた水層に、１７１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐ　
Ｈ５，２）及び２倍量の冷エタノールを添加したものを
温度−２０℃で２時間放置したのち、常法により８＋０
０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で２０分間遠心分離し、ＲＮＡを沈澱
させ、得られたＲＮＡを４艷の水に溶解し、上記エタノ
ール沈澱操作を行なったのち、得られたＲＮＡを１ｗｌ
の水に溶解し、３．７５ｍｇのＲＮＡを得た。

そして、以上の操作を再度繰り返すことにより合計７■
のＲＮＡを調製し、このＲＮＡ中よりｍ−ＲＮＡを選択
するために、７■のＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−セルロ
ース　にューイングランドバイオラボ・社・製）カラム
クロマトグラムにかけた。

カラムとして２．５　ｒｎｌテルモシリンジ（テルモ・
社・製）を用い、樹脂０．５ｇは、溶出緩衝液（１０１
ＩＩＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）／１ｍＭＤＥ
ＴＡ１０．１％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム
）で膨潤させたのち、カラムに充填し、結合緩衝液〔１
０ＩＩＩＭトリスー塩酸（ｐＨ７，６）／　１　ｍＭＥ
　Ｄ　Ｔ　Ａ／　０．４Ｍ　ＮａＣｌ１０．１％ドデシ
ル硫酸ナトリウム〕で平衡化したものである。

７■のＲＮＡに、同量の緩衝液（１０ｍＭ　）リス−塩
酸（ｐＨ７，６）／　１ｍＭＥ　ＤＴＡ／　０．８Ｍ　
ＮａＣ１／　０．１％ドデシル硫酸ナトリウム〕を添加
し、温度６５℃で１０分間加熱処理し、水中で急冷した
のち、オリゴ（ｄＴ）−セルロースカラムにかけたのち
、結合緩衝液で樹脂を洗浄し、未結合のｒ−ＲＮＡ及び
ｔ−ＲＮＡを完全に洗浄し、更に、溶出緩衝液でｍ　−
ＲＮ　Ａを溶出し、４０μｇのｍ　−ＲＮ　Ａを得た。

２、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの濃縮 衣に、シー！ＩＩ！密度勾配遠心分離法によりルシフェ
ラーゼｍ　−ＲＮ　Ａを濃縮した。

１０〜２５％（Ｗ／Ｖ）　（７）　’ｉ　＝ＩＦ密度勾
配は、ベックマン・社・製のローターＳ　Ｗ４１用ポリ
アロマチューブに４０％（Ｗ／Ｖ）　ショ糖液（５０ｍ
Ｍ　）リス−塩酸（ｐＨ７，５）　／２０ａ＋Ｍ　Ｎａ
Ｃ１／　ｌ　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　／４０％（ｔ４／Ｖ
）シ＊糖）０．５ｔｎｌを入れ、その上に２．４−ずつ
２５％（Ｗハ）、２０％（Ｗ／Ｖ）　、１５％（Ｗ／Ｖ
）及び１０％（Ｗ／Ｖ）　（７）ショ糖液を重層し、温
度４℃で２４時間放置することにより作製した。このシ
ｇ糖密度勾配に、ｍ　−ＲＮＡ３０μｇを重層し、ベッ
クマン・社・製の５Ｗ４１０−ターを用い、常法により
３０．００Ｏｒ、ｐ、ｍｏ、温度１８℃で１８時間遠心
分離を行なった。遠心分離操作ののち、０．５−ずつ分
画し、エタノール沈澱法によりｍ−ＲＮＡを回収し、１
０μｌの水に溶解した。

次に、ｍ−ＲＮＡにコードされている蛋白質を調べるこ
とにより、ルシフェラーゼのｍ−ＲＮＡが濃縮されてい
る両分の同定を行なった。分画したＲＮＡＩμｌ、ウサ
ギ網状赤血球ライセード（アマジャム・社・製）９μｌ
及び（”　Ｓ　）メチオニン１μ！（アマジャム・社・
製）を混合し、温度３０℃で３０分間反応させたものに
、１５０μｌのＮＥＴ緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣ１／
　５　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　／　０．０２％（Ｗ／Ｖ
）ＮａＮ：＋　／　２０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，４）１０．０５％（Ｗ／Ｖ）ノニデットＰ−４０
（ベセスダリサーチラボラトリー・社・製、界面活性剤
）〕を添加し、更に、１μｌの抗ルシフェラーゼ血清（
後述のようにして調製したもの。）を添加し、温度４℃
で１８時間放置したものに、１０■のプロティンＡセフ
ァロース（ファルマシア・社・製）　ヲ添加し、温度２
０℃で３０分間放置したものを、常法により１２．００
０ｒ、ｐ、ｍ、で１分間遠心分離処理し、樹脂を回収し
た。

回収した樹脂を、２００μｌのＮＥＴ緩衝液で３回洗浄
し、この樹脂に、４０ｔｔｌの５ＤＳ−ＰＡＧＥ用サン
プル緩衝液（６２，５ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　
Ｈ６，８）　／１０％（Ｖ／Ｖ）グ’Ｊセロール／２％
（Ｗ／Ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム１５％（ν／Ｖ）メ
ルカプトエタノール１０．０２％（Ｗ／Ｖ）ブロムフェ
ノールブルー〕を添加し、温度１００℃で３分間煮沸し
、常法により１２．００Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１分間遠心分
離処理し、上清を回収し、全量を７．５％（Ｗ／Ｖ）　
　ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルに
乗せた。

ゲル電気泳動は、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の方法〔
ネーチュアー（Ｎａ　ｔｕｒｅ）、第２２７真、第６８
０頁（１９７０）　）で行ない、泳動したのちのゲルは
、１０％（Ｖ／Ｖ）の酢酸に３０分間浸漬し、蛋白質を
固定したのち、水に３０分間浸漬し、更に、１Ｍサリチ
ル酸ナトリウム溶液に３０分間浸漬し、乾燥して乾燥ゲ
ルを得、Ｘ線フィルム（フジ写真フィルム・社・製、Ｒ
Ｘ）を用いてフルオログラフィーを行なった。

以上の操作により、ルシフェラーゼｍ−ＲＮＡの存在す
る両分のＲＮＡを用いた場合にのみ、ルシフェラーゼ蛋
白質のバンドがＸ線フィルム上に認められ、ルシフェラ
ーゼｍ−ＲＮＡの濃縮されている両分が同定できた。

３、抗血清の調製 精製ルシフェラーゼに対するウサギの抗ルシフェラーゼ
血清は、以下の方法により調製した。

３．２■／　ｄ　？Ｈ度のルシフェラーゼ溶液〔シグマ
・社・製ルシフェラーゼを０．５　Ｍグリシルグリシン
溶１（ｐＨ７，８）に溶解したもの）０．７ｍｆを、等
量のフレンド（Ｆｒｅｕｎｄ）完全アジユバントで懸濁
したちの２．２４■を、抗原として体重２　ｋｇの日本
内色種ウサギの指掌部に投与し、飼育２週間経過したの
ち、初回と同量の抗原を背部皮肉へ投与し、更に、飼育
１週間経過したのち、同様の操作を行ない、また更に、
飼育１週間後全採血を行なった。

そして、得られた血液を、温度４℃で１８時間放置した
ものを、常法により３．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で１５分間
遠心分離し、上清として抗ルシフェラーゼ血清を得た。

４、ｃ−ＤＮＡの合成 ｃ−ＤＮＡの合成は、アマジャム・社・製キットを用い
て行なったものである。

上述の如くして得られたｍ−ＲＮＡ２μｇを用いてアマ
ジャム社の指示するモル・セル・パイオル・（Ｍｏ１．
Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、第２巻、第１６１頁（１９８
２）及びジーン（Ｇｅｎｅ）、第２５巻、第２６３頁（
１９８３）記載の方法に従い行なった結果、３００ｎｇ
の２本積ｃ　−ＤＮＡが得られた。

このｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ１５０ｎｇを、１ｐｌのＴＥ１１
衝液〔１０ｔｔｌＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）
／　１　ｍＭＥ　Ｄ　ＴＡ〕に溶解したものに、１１μ
ｌの混液（２８０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ６，
８）／６０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ６，８）
　／　２　ｍＭ塩化コバルト〕及び３．８μｌのティリ
ング混液（１０ｍＭジチオスレイトール７、５１１１　
／　１０ｎｇ／　ｔｒｉポリ　（ｐｏｌｙ）　　Ａ　１
　ｕ　ｌ　／　５　ｍＭｄＣＴＰ２μｌ／水１１０μｌ
）を夫水添１０μｌに、２９ユニツトのターミナルトラ
ンスフェラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・社・製）
を添加し、温度３０℃で１０分間反応させたのち、２．
４μｌのｏ、２５Ｍ　ＥＤＴＡ及び２．４　μｌ　（７
）１０％　（Ｗ／Ｖ）　　トチシフＬ’ＴＪＦＬ酸ナト
リウムを夫々添加して反応を停止させた。

反応停止液に２５μｌの水飽和フェノールを用いて除蛋
白処理を行なったのち、回収した水層に、２５μｌの４
Ｍ酢酸アンモニウム及び１００μｌの冷エタノールを夫
々添加し、温度−７０℃で１５分間放置し、１２，０Ｏ
Ｏｒ、ｐ、ｍ、で１０分間遠心分離してｃ−ＤＮＡを回
収し、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、Ｃ−ＤＮＡ溶解
液を得た。

以上の如くしてデオキシシチジンのテイルの付いたｃ　
−Ｄ　Ｎ　Ａｌｏｏｎｇを得た。

５、ベクターに使用する組み換え体プラスミドｐＭ　Ｃ
ＥＩＯＤ　Ｎ　Ａの調製 プラスミドｐＭ　Ｃ１４０３−３Ｄ　Ｎ　Ａ　（特開昭
６１−２７４６８３号公報記載）、大腸菌Ｗ３１１０株
（ＡＴＣＣ２７３２５）、プラスミドｐＢ　Ｒ３２５（
Ｂ　ＲＬ・社・製）及びプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡ
（宝酒造・社・製）を用いてティー・マスダ等（Ｔ、Ｍ
ａｓｕｄａ　ｅｔ、ａｌ、）アグリカルチュラル・バイ
オロジカル・ケミストリー　（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａ
ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第
５０巻、第２７１〜２７９頁（１９８６）記載の方法を
用いて作製したプラスミドｐＫＮ３０５　ＤＮＡ夫々１
μｇを、１０μｌの混液（５０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，５）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣＩｚ／　１０
抛Ｍ　ＮａＣ１／　１　ｍＭジチオスレイトール〕に添
加し、更に、これに、ＨｉｎｄｌＩ［及び５ａｉｌ（い
ずれも宝酒造・社・製、以下、同社製のものを使用）を
夫々２ユニツトずつ添加し、温度３７℃で１時間反応さ
せて切断処理し、常法によるフェノール抽出及びエタノ
ール沈澱処理を行ない沈澱物を得た。この沈澱物を、１
０μｌのライゲーション緩衝液（２０ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ
／６６ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，６）　／
　１　ｍＭ　Ａ　Ｔ　Ｐ　／　１５ｍＭジチオスレイト
ール〕に溶解し、溶液を得、更に、１ユニツトの７４Ｄ
ＮＡリガーゼ〔宝酒造・社・製、以下同社製のものを使
用〕を添加し、温度２０℃で４時間連結反応を行なった
。次いで、この反応液を用い、ジェイ・バクテリオロジ
ー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ。

第１１９巻、第１０７２頁〜第１０７４頁（１９７４年
）〕記載の形質転換法により、大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ（Ａ
　Ｔ　ＣＣ３３８７６）株を形質転換し、薬剤耐性（ア
ンピシリン耐性及びテトラサイクリン感受性）及びβ−
ガラクトシダーゼ活性を検討し、形質転換株を得、その
株の含有する組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＭＣＥＩ
Ｏと命名した。この組み換え体プラスミドｐＭＣＥＩＯ
ＤＮＡを含有する大腸菌３Ｍ１０１株を、トリプトン１
％（Ｗ／Ｖ）　、酵母エキ７！、　０．５％（Ｗ／Ｖ）
、及びＮａＣ１Ｏ，５％（Ｗ／Ｖ）からなる培地１１に
、該培地を用い温度３７℃で１６〜２４時間前培養して
得た大腸菌Ｊ　ＭＩＯＩ　（ｐＭ　ＣＥＩＯ）の培養液
２０−を接種し、温度３７℃で３時間振盪培養したのち
、０．２ｇのクロラムフェニコールを添加し、更に同一
温度で２０時時間項養を行ない、培養液を得た。

次いで、この培養液を、常法により１．０ＯＯｒ、ｐ、
ｍ。

で１０分間遠心分離して湿潤菌体２ｇを得、これを２０
ｍ／　（７）２５％（Ｗ／Ｖ）　’ｉ　ａ　糖を含有す
る３５０ｍＭ　　）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０）に
懸濁したのち、更に、これに、リゾチーム１０■、０．
２５Ｍ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８，０）　８　ｒｒｔ及び
２０％（Ｗ／Ｖ）　　ドデシル硫酸ナトリウム溶液８−
を夫々添加し、温度６０℃で３０分間保温して溶菌し、
溶菌液を得た。

この溶菌液に、５ＭＮａＣ１溶液１３ｒｎｌを添加し、
温度４℃で１６時間処理したものを常法により１５．０
０Ｏｒ、ｐ、ｍ、で３０分間遠心分離して抽出液を得、
常法によりフェノール抽出処理及びエタノール沈澱処理
を行ない沈澱物を得た。

次いで、この沈澱物を、通常の減圧乾燥処理したものを
、１ｍＭＥＤＴＡを含有するｌ１０ｆｆ１トリス−塩酸
緩衝液６　ｍｌ　（ｐ　Ｈ７，５）に溶解し、更に、こ
れに、塩化セシウム６ｇ及びエチジウムブロマイド溶液
（１０ｍｇ／ｍり　０．２　ｄを添加しタモノヲ、常法
ニヨリ３９．０ＯＯｒ、ｐ、ｍ、で４２時間超遠心分離
機を用いて平衡密度勾配遠心処理を行ない、組み換え体
プラスミドｐＭ　ＣＥＩＯＤ　Ｎ　Ａを単離し、また更
に、ｎ−ブタノールを使用してエチジウムブロマイドを
除去したのち、１ｍＭＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ　）
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に対して透析を行ない
純化された組み換え体プラスミドｐＭ　ＣＥＩＯＤ　Ｎ
　Ａ３００μｇを得た・ ６、ベクターＤＮＡの調製 以上の様にして得られた組み換え体プラスミドｐＭｃＥ
１０ＤＮＡ１５μｇを、９０μｌの前記ＴＥ緩衝液に溶
解し、１０μｌのＭｅｄ緩衝液（１０ｍＭ　Ｉ−リス−
塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，５）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣｈ
／　１　ｍＭジチオスレイトール１５０ｍＭ　ＮａＣ１
）を添加したのち３０ユニットの制限酵素Ａｃｃｒ（宝
酒造・社・製）を更に加え、温度３７°Ｃで１時間切断
処理を行ない切断処理物を得た。この切断処理物に、１
００μｌの水飽和フェノールを加え除蛋白操作を行なっ
たのち、水層を回収し、これに、１／１０最の３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ７，５）及び２倍量の冷エタノールを
加え、温度−７０℃で１５分間放置したのち、１２，０
ＯＯｒ、ｐ、ｍ。

で１０分間遠心分離し、ＤＮＡを回収した。

このＤＮＡを、１０μｌのＴＥＩＩ衝液に溶かし、１５
μｌの混液（２８０ｎ＋Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ
６，８）　／　６０ｍＭ　トリス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ
６，８）　／　２　ｍＭ塩化コバルト〕を加えたのち、
更に、５μｅのティリング混液（項目４記載）（５ｍＭ
ｄＧＴＰを用いた）を加え、また更に、５ユニツトのタ
ーミナルトランスフェラーゼ（宝酒造・社・製）を添加
し、温度３７℃で１５分間反応させた。項＠４記載のＣ
−ＤＮＡティリング反応と同様の後処理を行なうことに
より組み換え体プラスミドｐＭ　ＣＥＩＯＤ　Ｎ　Ａの
ＡｃｃＩサイトにデオキシグアノシンのテイルが付いた
ＤＮＡを調製した。

一方、プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡのＰｓｔｌサイトに
デオキシグアノシンのテイルが付いたＤＮＡの調製も同
時に行なった。

プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡ　（宝酒造・社・製）３０
μｇを、３５０μｌのＴＥ緩衝液に溶解したものに、４
０μｌのＭｅｄ緩衝液及び制限酵素Ｐｓｔｌ　　（宝酒
造・社・製）１２０ユニツトを夫々添加し、温度３７℃
で１時間切断処理したのち、常法によりフェノールによ
る除蛋白処理及びエタノール沈澱処理によりＤＮＡを回
収した。

得られたＤＮＡを、３５μｌのＴＥ緩衝液に溶解したも
のに、５０μｌの混液（２８ＯｍＭカコジル酸（ｐＨ６
、８）　／　６０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ　Ｈ６
，８）　／　１　ｍＭ塩化コバルト〕、１９μｌの項目
４記載のティリング混液（ｄＧＴＰ含有）並びに６０ユ
ニツトのターミナルトランスフェラーゼ（宝酒造・社・
製）を夫々添加し、温度３７℃で１０分間反応させたの
ち、常法によりフェノール処理及びエタノール沈澱を行
なうことによりＤＮＡを回収した。

７．７二−リング及び形質転換 合成したｃ　−Ｄ　Ｎ　Ａ１５ｎｇ及びベクターＤＮＡ
２００ｎｇを、３５ｔｔｌのアニール緩衝液〔１０１１
１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）／　１００ｍＭ
　ＮａＣ１／　１　ｍＭＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ）に溶解し、温
度６５℃で２分間、温度４６℃で２時間、温度３７℃で
１時間及び温度２０℃で１８時間放置する操作によりｃ
−ＤＮＡとベクターＤＮＡをアニールした。

アニールしたＤＮＡを用いて、ハナハン（Ｈａｎａｈａ
ｎ）の方法〔ディーエヌエイ　クローニング（ＤＮ　Ａ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、第１巻、第１０９〜１３５頁（１
９８５）　）により大腸菌ＤＨＩ株　（Ａ　Ｔ　ＣＣ３
３８４９）を形質転換し、プラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡ
及び組み換え体プラスミドＩ）ＭＣＥＩＯＤＮＡをベク
ターとしたｃ−ＤＮＡバンクを夫々作製した。

８、ルシフエラーゼｃ−ＤＮＡの検索 組み換え体プラスミドｐＭ　ＣＥＩＯＤ　Ｎ　ＡのＡｃ
ｃ１部位は、大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコー
ドする部位にあるので、この部位に組み込まれたｃ−Ｄ
ＮＡはβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質を作る。ま
た組み換え体プラスミドｐＭＣＥＩＯのβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子のプロモーターは前述した様に大腸菌トリ
プトファン遺伝子のプロモーターに変換しである。

組み換え体プラスミドｐＭＣＥＩＯＤＮＡを、ベクター
とするＣ−ＤＮＡバンクのコロニー９６個を１０−０Ｍ
９カザミノ酸培地〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第４４０〜４４
１頁、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−
（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ）（１９８２）　）にチアミン（１０μｇ／
／）を加えた培地を用い温度３７℃で１０時間振盪培養
し、常法により集菌したのち、２００μｌの５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ用サンプル緩衝液に懸濁し、温度１００℃で５分
間煮沸した。

この懸濁液４０μｌを、７．５％（Ｗ／Ｖ）ポリアクリ
ルアミドゲルを用いて、常法により電気泳動を行なった
。泳動終了後、ゲルに展開した蛋白質を、ウェスタンプ
ロット法〔アナル・バイオケム・（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｍ、）、第１１２巻、第１９５頁（１９８１）　）に
よりニトロセルロースのフィルターに転写し、このニト
ロセルロースフィルターをイミューンブロソトアソセイ
キット　（バイオラッド・社・製）を用いて抗ルシフェ
ラーゼ血清で染色した。方法は、バイオランド社の操作
法に従った。

即ちニトロセルロースのフィルターを、１００ｍｒのブ
ロッキング溶液［ＴＢＳ緩衝液（２０ｍＭ　）リス−塩
酸緩衝液１５００ｍＭ　ＮａＣ１（ｐＨ７，５））に３
％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを溶かした溶液］中温度２５℃
で、３０分間振盪した。次に、このニトロセルロースフ
ィルターを２５−の−次抗体溶液〔ルシフェラーゼ抗血
清を１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンをＴＢＳ緩衝液に溶かし
た溶液で２５倍（Ｖ／Ｖ）に希釈した溶液〕に移し、温
度２５℃で９０分間振盪したものを、１００−のツイー
ン（Ｔｗｅｅｎ）　　２０洗液（ＴＢＳ緩衝液に０．０
５％（−／Ｖ）のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　　２０を溶
かした溶液〕中に移し、温度２５℃で１０分間振盪する
操作を２回行なった。次いで、このようにして得たニト
ロセルロースフィルターを６０−の二次抗体溶液〔西洋
ワサビペルオキシダーゼで標識した抗ウサギ抗体（バイ
オ・ランド社製）を１％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンをＴＢＳ
緩衝液に溶かした溶液で３０００倍（Ｖ／Ｖ）に希釈し
た溶液〕中に移し、温度２５℃で６０分間振盪したのち
、１００ｍｊのツイーン（Ｔｗｅｅｎ）　　−２０洗液
でニトロセルロースフィルターを洗う上記操作を２回繰
り返し、このようにして得たニトロセルロースフィルタ
ーを、１２０−の発色液（６０■の４−クロロ−１−ナ
フトロールを２０１！７の冷メタノールに溶解した溶液
及び６０μｌの３０％（Ｖ／Ｖ）過酸化水素水を１００
−のＴＢＳ緩衝液に添加した溶液を混合した溶液〕中に
移し、温度２５度で１０分間発色させた。

この様にして９６個のコロニーを１グループとして４グ
ループについて同様の方法を行なったところ、２つのグ
ループでルシフェラーゼ抗血清で染まる蛋白質バンドが
認められた。次に、この２つのグループに属する９６個
のコロニーを１２個のコロニーずつ８グループに分は同
様の操作を行なったところ夫々ｌグループに抗ルシフェ
ラーゼ血清と反応する蛍白質が認められた。最後に、こ
のグループに含まれる１２個のコロニーを、１個のコロ
ニーずつ温度３７℃で１０時間振盪培養し、同様の操作
を行ないルシフェラーゼ抗血清と反応する蛋白質を作る
コロニーを同定した。以上の操作によりルシフェラーゼ
ｃ−ＤＮＡをもつ２個のコロニーが得られた。この２個
のコロニーより項目５記載の方法でプラスミドＤＮＡを
調製した。得られた組み換え体プラスミドＤＮＡは、ｐ
ＡＬｆ２Ｂ８及びｐＡｒ−ｆ３Ａ６と夫々命名した。

９、大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−ＤＮＡの
プローブの作製 組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３Ａ６ＤＮＡ１００μｇ
を、３３０μｌのＴＥ緩衝液に溶解し、これに４０μｌ
のＬｏ−緩衝液（１０ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液（ｐ）
Ｉ７．５）　／　１０ｍＭ　ＭｇＣｈ／　１　ｍＭジチ
オスレイトール〕、１３０ユニツトのＰｓｔｌ（宝酒造
・社・製）及び１２０ユニツトの５ａｃｌ（ベーリンガ
ー・マンハイム・社・製）を添加し、温度３７℃で１．
５時間切断した。

このＤＮＡ全量を０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲルを
用いた電気泳動で分離した。アガロースゲル電気泳動は
ティー・マニアテス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ）等の方法
〔モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃ１゜ｎｉｎｇ）　、第１５６〜１６１頁、コールド・
スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　ＨａｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（１９
８４）　）に従って行なった。ルシフェラーゼｃ−ＤＮ
Ａを含むＤＮＡバンドを切り出し、透析チューブに入れ
、２−のＴＥ緩衝液を加えたのち、透析チューブをシー
ルし、電気泳動により、ゲル中より緩衝液中にＤＮＡを
溶出した。

この溶液に等容量の水飽和フェノールを加え、攪拌した
のち、水層を回収し、常法に従いエタノール沈澱により
ＤＮＡを回収した。

得られたＤＮＡフラグメン）１０μｇを、１２６μｌの
ＴＥ緩衝液に溶かし、１６μのＭｅｄ緩衝液及び６４ユ
ニツトの５ａｕ３ＡＩ（宝酒造・社・製）を加え、温度
３７℃で２時間反応させたのち、全量を５％（Ｗハ）ポ
リアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により、ＤＮＡ
断片の分離を行なった。ポリアクリルアミドゲル電気泳
動は、エイ・マクサム（Ａ、Ｍａｘａｍ）の方法〔メン
ズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６５巻、第５０６頁（１９８
０）　）に従って行なった。１９０ｂｐのＤＮＡフラグ
メントを前述と同様の方法で単離し、１μｇの５ａｕ３
ＡＩルシフェラーゼｃ−ＤＮＡフラグメントが得られた
。

この１μｇのルシフェラーゼｃ−ＤＮＡを、Ｃａ−”Ｐ
）ｄＣＴＰ　＜７マシヤＬ−社・製）ヲ用いてニックト
ランスレーション法により標識した。二ツクトランスレ
ーションは宝酒造社製のキットを用い、宝酒造社の指示
するジェイ・モル・パイオル・（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ
、）　、第１１３巻、第２３７〜２５１頁（１９７７）
及びモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、第１０９〜１１２頁、コールド
・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（１９
８２）記載の方法に従、って行なった。

１０、大きなルシフェラーゼｃ−ＤＮＡの検索−コロニ
ーハイブリダイゼーション 前述の方法で調製した３２ｐで標識したルシフェラーゼ
ｃ−ＤＮＡ断片を、プローブとして用い、組み換え体プ
ラスミドｐＵｃ１９ＤＮＡをベクターとするフォティナ
ス・ピラリス尾部ｃ−ＤＮＡバンクを、コロニーハイブ
リダイゼーション法（蛋白質・核酸・酵素、第２６巻、
第５７５〜５７９頁（１９８１）で検索し、ルシフェラ
ーゼｃ−ＤＮＡを有するコロニーを得た。そのうちの１
個のコロニーの有する組み換え体プラスミドＤＮＡをｐ
ＡＬｆ３と命名し、項目５記載の方法でプラスミドＤＮ
Ａを調製した。

そして、上記組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡを
、Ｘｂａｌ、Ｈｉｎｄ　ｍ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ及
びＰｓｔｌ　　（いずれも宝酒造・社・製）を用い、単
−消化及び２重消化して得られたＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動法により移動度パターンを分析し、得ら
れた移動度パターンとλＤＮＡ（宝酒造・社・製）をＨ
ｉｎｄｌ［Ｉにより消化して得られたＤＮＡ断片の標準
移動度パターンと対比することにより得られた分子量は
、１　、７００ｂｐであり、上記プラスミドの制限酵素
地図は、第１図に示すとおりであった。

１１、組み換え体プラスミドｐＡＬ　ｆ２０１　ＤＮＡ
の構築 組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡ３．８μｇを、
８７μのＴｌ１ｊｌｌ街液に溶かしたものに、１０μｌ
のＨｉｇｈ緩衝液（１０ｎ＋Ｍ　）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ７，５）／　１０ｎ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｇ／　１　ｍＭ
フジチオスレイトール１００ｍＭＮａＣ１）　、４５ニ
ー’−７トのＢａｗＨＩ及び６５ユニツトのＸｂａｌ（
いずれも宝酒造・社・製）を添加し、温度３７℃で２時
間反応させたのち、フェノールによる除蛋白操作を行な
い、更に、エタノールにより沈澱操作を行ない、ＤＮＡ
沈澱を得た。

一方、２種の合成オリゴヌクレオチドである５′ＧＡＴ
ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧ”及び”　ＣＴＡＧＣＡＴＡＡ
ＧＣＴＴＧ３′をベックマン社製ＤＮＡ合成機を用いて
合成した。

Ｘｂａｌ及びＢａｍ）１１で切断した組み換え体プラス
ミドｐＡＬ　ｆ　３　ＤＮＡ　０．３μｇ、上記２種の
合成オリゴヌクレオチド夫々ｌ１１ｇ及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ１ユニット（ベーリンガー・マンハイム・社・製
）を、１０μ２の混液（６６ｍＭ　）リス−塩酸緩衝液
（ｐＨ７，６）／　１　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ　／　１　ｍＭ
スペルミジン／　１０ｍＭ　ＭｇＣｈ／　１５ｎ＋Ｍジ
チオスレイトール／　０．２　ｍｇ／−生血清アルプミ
ン〕中で温度４℃で１８時間反応させ、ＤＮＡの結合を
行なった。

得られたＤＮＡを用いて形質転換法（前述のコーエン等
の方法）により、大腸菌Ｈ８１０１株（ＡＴ　ＣＣ３３
６９４）を形質転換した。得られた組み換え体プラスミ
ドは、ｐＡ　Ｌ　ｆ　１０１　と命名し、前述の方法で
組み換え体プラスミドＤＮＡを調製した。

組み換え体プラスミドｐＡＬｆｌｏＩＤＮＡ２μｇを、
８５ｔｔｌのＴＥ緩衝液に溶かし、１０ｔｔｌのＭｅｄ
緩衝液及び５０ユニツトのＨｉｎｄ　ｍ　（宝酒造・社
・製）を添加し、温度３７℃で２時間切断した。得られ
た切断物を、０．７％（Ｗ／Ｖ）アガロースゲル電気泳
動により分離し、１．７Ｋｂのフラグメントを前述の方
法を、用いてゲルより溶出して溶出物を得、フェノール
抽出及びエタノール沈澱処理してＤＮＡ断片０．４μｇ
を得た。

次に、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ由来のプロモー
ターベクターＡＡＨ５ＤＮＡ　（ワシントン・リサーチ
・ファウンデーションより入手）２μｇを、１８μｌの
ＴＥ緩衝液に溶かし、２μｌのＭｅｄ緩衝液及び１０ユ
ニツトのＨｉｎｄ　ｍ　（宝酒造・社・製）を添加し、
温度３７℃で１時間切断したのち、常法に従ってフェノ
ール抽出及びエタノール沈澱処理してＤＮＡを沈澱させ
た。

Ｈ４ｎｄＩＩＩ切断プラスミドＡＡＨ５ＤＮＡ７５ｎｇ
。

組み換え体プラスミドｐＡＬ　ｆ　１０１　ＤＮＡ由来
の１．７　Ｋｂ　ＤＮＡ断片４０ｎｇ及びＴ４ＤＮＡリ
ガーゼ０．５ユニツト　（ベーリンガー・マンハイム・
社・製）を１０μｌの混液（６５ｍＭ　）リス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７，４）／１３ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ／６５ｍＭ
ジチオスレイトール／　１．３　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ　）中
に添加し、連結反応を行なったのち、前述のコーエン等
の形質転換法により大腸菌ＨＢ　１０１　（Ａ　Ｔ　Ｃ
Ｃ３３６９４）株を形質転換し、アンピシリン耐性とな
った形質転換株を選択した。

得られたアンシピリン耐性形質転換株を１％（Ｗ／Ｖ）
ト’Ｊ　７’　ドア　／　０．５９’ｌｉ　（Ｗ／Ｖ）
酵母エスキ１０．５％（−／Ｖ）　ＮａＣ１培地３−中
温度３７℃で１８時間振盪培養したのち、ティー・マニ
アテス（Ｔ、　Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉｓ）等の方法〔
モレキュラー・クローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ）、第３６６〜３６７頁、コールド・スプリ
ング・／’ｔ−バー・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｓｒｙ）　（１９
８４）　）により少量の組み換え体プラスミドＤＮＡを
調製し、Ｈｉｎｄ　ｍ　（宝酒造・社・製）による単独
切断ＤＮＡパターン及びＢａｍＨｌ、　　Ｅ、ｃｏＲＩ
　　（ともに宝酒造・社・製）の二重切断ＤＮＡパター
ンをアガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。以上
の分析によりアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター
の下流に正しくルシフェラーゼｃ−ＤＮＡが組み込まれ
た組み換え体プラスミドＤＮＡを選択した。

プラスミドＡＡＨ５ＤＮＡのアルコールデヒドロゲナー
ゼプロモーターに対して順方向にルシフェラーゼｃ−Ｄ
ＮＡが組み込まれた組み換え体プラスミドＤＮＡをｐＡ
Ｌｆ２０１　と命名し、前述の方法により組み換え体プ
ラスミドｐＡＬｆ２０１ＤＮＡを調製した。

１２、組み換え体プラスミドｐＡＬ　ｆ２０１　ＤＮＡ
による酵母の形質転換 組み換え体プラスミドｐＡＬ　ｆ２０１　ＤＮＡを用い
・サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ
ｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｓ　ＨＹ　１株（Ａ
　Ｔ　ＣＣ４４７６９）を、ベッグス（Ｂｅｇｇｓ）の
方法〔ネイチュアー（Ｎａｔｕｒｅ）、第２７５巻、第
１０４頁（１９７Ｂ）　）により形質転換し、形質転ｍ
　株、サッカロマイセス・セレビシエＳＨＹ　１　（ｐ
Ａ　Ｌ　ｆ　２０１）を得た。

１３、形質転換株、サッカロマイセス・セレビシエＳＨ
Ｙ　１　（ｐＡＬ　ｆ２０１）によるルシフェラーゼの
生産 形質転換株、サッカロマイセス・セレビシエＳＨＹ　１
　（ｐＡＬ　ｆ２０１）を、ＹＰＤ培地（グルコース２
０　ｇ　／　ｌ、ポリペプトン２０ｇ／ｊ！及び酵母エ
キス１０ｇ／β）３＠ｌに接種し、温度３０℃で、６時
間振盪培養し、得られた培養菌体を、ルシフェラーゼア
ッセイ用緩衝液（０，１Ｍに１ｌＺＰ０４．（＋）Ｈ７
，８）／２１１Ｍ　ＥＤＴＡ／１ｍＭジチオスレイトー
ル１０．２　ｍｇ／＠ｌプロタミン・サルフエ−ト）　
０．３　ｒｎｌに懸濁し、懸濁液を得、これに、ガラス
ピーズを懸濁液の１７２量となる如く添加し、ミキサー
（サイエンティフィック・インダストリー・社・製）を
用いて３分間破砕処理を行なったのち、１．２００ｒ、
ｐ、ｍ、で５分間遠心分離し、上清として粗酵素液０．
２　＋ｎＺを得た。

このようにして得られた粗酵素液中のルシフェラーゼ活
性の測定は、クリツカ（Ｋｒｉｃｋａ）等の方法〔アチ
ーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフ
イズイクス（＾ｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）　、第２１
７巻、第６７４頁（１９８２）　：１に従って生成する
フォトン数を計測することにより行なった。

すなわち、２６０μｌの２５ｍＭグリシルグリシン緩衝
液（ｐＨ７，８）、１６μｌの０．１　Ｍ硫酸マグネシ
ウム、２４μｌの１ｍＭルシフェリン（シグマ・社・製
）及び１０μｌの粗酵素液を混合したのち、１００μｌ
の２０ｍＭＡＴＰを添加し、発生するフォトン数を２０
秒間積算した値を下表に示した。

なお、比較のため、発現用プラスミドＡＡＨ５ＤＮＡベ
クターを有する酵母サツカロミセス・セレビシェ５ＨＹ
Ｉ株（Ａ　Ｔ　ＣＣ４４７６９）を用いる以外は上記と
同様に計測した値を下表に示した。

（本頁以下余白） 上表より明らかな如く、本発明は、対照に比し、フォト
ン数が増加しているため、本発明の酵母菌体中にルシフ
ェラーゼが生産されていることが判明した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組み換え体プラスミドｐＡＬｆ３ＤＮＡの制
限酵素による切断地図を示す図である。 特許出願人　キッコーマン株式会社 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 −ｐＵｃ１９ ０＝コ　ｃ−ＤＮＡ

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ルシフェラーゼをコードする遺伝子をプラスミド
   ベクターＤＮＡに挿入した組み換え体プラスミドＤＮＡ
   を含み、ルシフェラーゼ生産能を有するサッカロマイセ
   ス属に属する微生物を、培地に培養し、培養物よりルシ
   フェラーゼを採取することを特徴とするルシフェラーゼ
   の製造法。
2. （２）ルシフェラーゼをコードする遺伝子が、フォティ
   ナス・ピラリス由来のＤＮＡである特許請求の範囲第１
   項記載のルシフェラーゼの製造法。
3. （３）プラスミドベクターＤＮＡが、プラスミドＡＡＨ
   ５ＤＮＡである特許請求の範囲第１項記載のルシフェラ
   ーゼの製造法。
4. （４）サッカロマイセス属の微生物が、サッカロマイセ
   ス・セレビシエである特許請求の範囲第１項記載のルシ
   フェラーゼの製造法。