JP4662320B2 - 変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼｂ型サブユニットタンパク質 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、ＮＡＤ+を水素受容体として乳酸を脱水素してピルビン酸を生じる酵素であって、解糖系でピルビン酸から乳酸を生成することに働く酵素として、動物諸組織、微生物に広く存在する。
【０００３】
特に動物のＬＤＨにはＡ型（Ｍ型または骨格筋型）、Ｂ型（Ｈ型または心筋型）といった２種類のサブユニットが存在することが知られ、その酵素学的な性質もＬＤＨアイソザイム間で異なっている。サブユニットは同種同士または異種間で四量体を形成し、陽極側への電気移動度の高いものからＬＤＨ1（Ｂ4）、ＬＤＨ2（Ａ1Ｂ3）、ＬＤＨ3（Ａ2Ｂ2）、ＬＤＨ4（Ａ3Ｂ1）、ＬＤＨ5（Ａ4）と呼ばれるアイソザイムが存在する。体内における各アイソザイムの分布は偏っており、心筋、赤血球および腎にはＬＤＨ−Ｂ4が、骨格筋および肝にはＬＤＨ−Ａ4が多く含まれている。また、前立腺、結腸、甲状腺、肺の各組織にはＬＤＨ−Ａ2Ｂ2が多い。さらに近年、新たにＣ型およびＤ型サブユニットの存在も確認されており、精巣および精子中からＬＤＨ−Ｘ（Ｃ4）が、絨毛癌（ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）とその転移巣からＬＤＨ−Ｚ（Ｄ4）が見い出されている。
【０００４】
ＬＤＨは特に臨床検査薬の分野において、１）生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）等の種々のアミノトランスフェラーゼの酵素活性を測定する場合や、２）尿素等の種々の基質をピルビン酸に変換し、生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、また、３）検体中の内因性ピルビン酸の消去にも利用されている。特に、１）のアミノトランスフェラーゼは肝臓、心臓、腎臓などに強い活性を示す酵素であり、各種疾患時に血清中に著しく増大するため、ＬＤＨを使用した生体試料（血清、血漿などの体液）中のアミノトランスフェラーゼ活性の測定は、臨床検査の一項目として広く行われている。
【０００５】
臨床検査用試薬として使用するには、簡便性の観点から粉末状態のものよりも液体状態で安定なものが好ましい。アミノトランスフェラーゼ活性測定のための臨床検査用試薬としては大量に入手できるという観点から一般にブタ由来のＬＤＨ−Ｂ4が使用されてきたが、これは液体状態では長期間に渡って安定した状態で保存することが困難であるという欠点があった。
【０００６】
近年、鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ4が補酵素（ＮＡＤＨ）の溶液安定性を考慮したｐＨ領域、例えばｐＨ約９−１０の範囲においても、著しい耐熱溶液安定性を示すことがわかった。鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ4の酵素的性質は、従来のブタＬＤＨ−Ｂ4とほとんどかわらず、トランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）活性測定試薬として本酵素を使用した場合も、測定感度において特に問題はない。従って、鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ4は、溶液安定性および酵素的性質からして、臨床検査用酵素として充分有用性があると期待される（「トランスアミナーゼ測定試薬」特開平８−２８９）および「液状ＡＬＴ測定試薬に好適な耐熱型乳酸脱水素酵素」 臨床化学 第２３巻補冊２号 １９９４年 １４１ｂ）。
【０００７】
しかしながら、天然のＬＤＨ−Ｂ4タンパク質を鳥類から調製する場合極少量しか得られないため、臨床検査用酵素として例えば、ニワトリ臓器より取得し実用化を図ることは数量面で困難である。また、天然源から調製されたＬＤＨ−Ｂ4タンパク質の場合、精製を充分に行っても混在するＮＡＤＨ分解酵素を完全に除けないことが知られている。これは、ＬＤＨの酵素反応はＮＡＤＨを補酵素として利用するため問題となる。従って、鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的手法によりＬＤＨ−Ｂ4タンパク質を大量かつ簡便に発現させることが重要である。
【０００８】
この点、内田らの特開平９−２６２０８９号は、ニワトリ心臓由来乳酸デヒドロゲナーゼＢサブユニットの遺伝子をクローニングし、ニワトリＬＤＨ−Ｂ4組換えタンパク質の発現に成功したことを開示している。得られた組換えニワトリＬＤＨ−Ｂ4タンパク質の熱安定性について、特開平９−２６２０８９号は天然のニワトリＬＤＨ−Ｂ4と同等であると記載している。
【０００９】
しかしながら、本発明者らがより詳細に熱安定性を検討した結果、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質はタンパク質濃度に依存して熱安定性が大きく変化することが見出された。具体的には、トランスアミナーゼ活性を測定するための構成成分として使用されるＬＤＨ量は通常１−１０Ｕ／ｍＬ程度の範囲である。よって、組換えＬＤＨ−Ｂ4比活性（１３６Ｕ／ｍｇタンパク質）より、熱安定性および溶液安定性はＬＤＨタンパク質濃度として０．００７−０．０７ｍｇ／ｍＬの範囲で測定すべきであると換算される。ところが、後述の参考例１に記載したように、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質は、このような低濃度では熱に不安定であることがわかった。よって、当該組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質は、熱安定性および溶液安定性を有するトランスアミナーゼ活性測定試薬を提供するには未だ充分でない可能性がある。
【００１０】
よって、簡便で大量に遺伝子工学的手法によって得ることができ、かつ充分な熱安定性および溶液安定性を保持する乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質の提供が希求される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、耐熱性および溶液安定性を示し、ＮＡＤＨ分解酵素を含まない、変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を提供することを目的とする。本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであることを特徴とする。本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明はまた、前記変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質をコードする核酸を提供することを目的とする。本発明の核酸は、好ましくは配列番号２に記載の塩基配列を有する。
【００１３】
本発明はさらに、前記変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を発現するためのベクター、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明はさらにまた、前記宿主細胞を培養して、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、前記変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を構成成分とするニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型タンパク質を含む、トランスアミナーゼ測定用試薬を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題解決のため鋭意研究を重ねた結果、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤ−Ｂ4タンパク質に変異を導入し、その生化学的活性の熱安定性および溶液安定性（ｐＨ安定性）、ならびにＮＡＤＨ分解活性を検討することにより、低濃度でも熱安定性および溶液安定性（ｐＨ安定性）を保持する変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットを見出し、本発明を想到した。
【００１６】
以下、本発明を詳述する。
変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質
本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであることを特徴とする。そして、生学的的な特徴としては、補酵素ＮＡＤＨの存在下でピルビン酸を乳酸に変換する活性を有し、そしてゲル濾過クロマトグラフィーで４量体の状態で分子量が約１５０，０００であり、特に以下の性質：
１）０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で失活せず；そして
２）ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない
を有することを特徴とする。上記１）および２）の性質は公知のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質にはない特有の性質である。
【００１７】
本発明者らは先ずニワトリ心臓ｃＤＮＡライブラリーの作製し、特開平９−２６２０８９号に記載のＬＤ−Ｂ遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列を取得した。ｃＤＮＡライブラリーの作製は慣用技術、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）に詳述されている方法に従った。特開平９−２６２０８９号に記載の方法に従がい、作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりＬＤ−Ｂ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを取得した。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、本明細書で後述する配列表の配列番号５に記載した。さらに、配列番号５の塩基配列より推定されるアミノ酸配列は配列番号４に記載した。これらは、特開平９−２６２０８９号に開示された塩基配列及びアミノ酸配列（各々、特開平９−２６２０８９号の配列番号３及び１）と同一であることが確認された。
【００１８】
一方、ニワトリ心臓より精製された天然のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列が Ｔｓｏｉ，Ｓ．Ｃ．Ｍ．， Ｌｉ，Ｊ．Ｙ．，Ｍａｎｎｅｎ，Ｈ． ａｎｄ Ｌｉ，Ｓ．Ｓ．Ｌ． Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ （０３−ＪＵＮ−１９９８）： ＧＩ “３３４２４０３” ［ＧｅｎＢａｎｋ］に開示されている（配列番号３）。
【００１９】
特開平９−２６２０８９号の組換えニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列（配列番号４）とＴｓｏｉらの天然ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列（配列番号３）を比較したところ、２カ所のアミノ酸残基が相違した。具体的には、配列番号３および４において１０番目のアミノ酸残基が前者（配列番号３）はスレオニン、後者（配列番号４）はアラニンであり、そして２０７番目のアミノ酸残基が前者ではアラニン、後者はバリンであった。
【００２０】
上記特開平９−２６２０８９号の組換えニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットとＴｓｏｉらの天然ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列に基づき、これら公知のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットに変異を施すことによって、本発明者らは熱安定性および溶液安定性（ｐＨ安定性）に優れ、かつＮＡＤＨ分解活性を有しない優れた生化学的性質を有する変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットを得ることに成功し、本発明を想到した。具体的には、本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、配列番号１（または配列番号３または４）のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであることを特徴とする。
【００２１】
本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、公知の上記特開平９−２６２０８９号の組換えニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットとＴｓｏｉらの天然ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのいずれとも相違し、新規なタンパク質である。以下、本明細書中、簡便のため必要に応じ、本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットを（１０Ａ、２０７Ａ）ＬＤＨ−Ｂ、上記特開平９−２６２０８９号の組換え型のものを（１０Ａ、２０７Ｖ）ＬＤＨ−Ｂ、そして天然由来のものを（１０Ｔ、２０７Ａ）ＬＤＨ−Ｂと略称する。
【００２２】
本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂは好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列１−３３３を有するが、これらに限定されない。天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。さらに、一般に生理活性を有するペプチドのアミノ酸配列が多少変更された場合、即ち、該アミノ酸配列の中の１又は複数のアミノ酸が置換され若しくは欠失し、または１又は複数のアミノ酸が付加された場合でも該ペプチドの生理活性が維持される場合があることは周知の事実である。
【００２３】
よって、本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１−３３３において、１０番目のアラニン残基および２０７番目のアラニン残基以外の部分において１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する（生物学的に活性な、酵素的に活性な）タンパク質も含む。本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質が「乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、Ｂ型同士またはＡ型等の異なる型のサブユニットと四量体を形成して、ＮＡＤ+を水素受容体として乳酸を脱水素してピルビン酸を生じる活性を有することを意味する。
【００２４】
本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明の変異ニワトリＬＤＨ−Ｂ酵素は、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。
【００２５】
配列番号１に示された本発明のＬＤＨ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、ニワトリＬＤＨのＡ型サブユニットタンパク質のアミノ酸配列と７３．３％の相同性を有する。また、ニワトリＬＤＨ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列と、対応するヒト、ブタおよびマウスＢ型サブユニットタンパク質のアミノ酸配列との相同性は、それぞれ８９．５％、８８．９％および８８．３％である。よって、限定されるわけではないが、本発明の変異ニワトリＬＤＨ−Ｂ酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本明細書において、相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００２７】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２８】
その他の例として、Ｃｙｓ残基が欠失するまたは他のアミノ酸で置き換えられる原因となる様に、Ｃｙｓ残基をコードする配列を変化させ、再生時の不適当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなる基より選択され、最も好ましくは、アミノ酸はトリプトファンである。
【００２９】
同様に、生物活性への欠失または挿入による潜在的効果を考慮することにより、アミノ酸配列を欠失または付加することが可能である。例えば、酵母の発現系を用いると均一の炭水化物が減少した類似体が発現されるが、Ｎ−グリコシル化部位を修飾してグルコシル化を排除することができる。真核生物のポリペプチド内のグリコシル化部位は、アミノ酸のトリプレット、Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（式中，ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適当な修飾は、Ａｓｎ側鎖の炭水化物残基の結合を防ぐ置換、付加または欠失を結果として生ずるであろう。あるいは、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系での発現を強化するために、二塩基性のアミノ酸残基をコードする配列を修飾することも可能である。
【００３０】
変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットの生化学的性質
ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットが、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、Ｂ型同士またはＡ型等の異なる型のサブユニットと四量体を形成して、ＮＡＤ+を水素受容体として乳酸を脱水素してピルビン酸を生じる活性を有することを意味する。即ち、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ四量体タンパク質は、以下の酵素反応を可逆的に促進する。
【００３１】
【化１】
酵素反応： ピルビン酸＋ＮＡＤＨ⇔Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ+
また、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、ゲル濾過クロマトグラフィーで４量体の状態で分子量が約１５０，０００である。本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、特に以下の生化学性質：
１）０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で失活せず；そして
２）ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない
を有することを特徴とする。上記１）および２）の性質は公知のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質にはない特有の性質である。
【００３２】
本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットが耐熱性であり、熱処理で失活しない、とは、本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4（以下、単に「本発明のＬＤＨ−Ｂ4」という）が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９３％以上のＬＤＨ活性の残存活性率を有することを意味する。本発明のＬＤＨ−Ｂ4はより低濃度、即ち、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度でも、例えば、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９３％以上残存活性率を有する。
【００３３】
ＬＤＨ活性は例えば、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−０．８ｍＭ ピリビン酸ナトリウム−０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基質混合液として用い、測定温度２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ+生成量を１単位とすることができる。ＮＡＤ+生成量は、例えば、ＮＡＤＨの分子吸光係数（例えば、波長３４０ｎｍで１ｃｍ光路幅のキュベットセルを用いた場合に、ＮＡＤ+の１ミリモル濃度あたり６．３０となる）を用いる。基質反応混合液に試料を添加し、その後１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度減少量を測定し、次式に従い試料中のＬＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）を換算することができる。
【００３４】
【化２】
Ｖ： キュベット中の最終反応液量（ｍｌ）
ｖ： 試料液量（ｍｌ）
６．３０： ＮＡＤＨ分子吸光係数（ＮＡＤ+の１ミリモル濃度あたり）
上記分光光度計によるＬＤＨ活性測定方法については例えば、オリエンタル酵母工業株式会社製品カタログ（２０００年版）の第６６頁−第６７頁に、ＮＡＤＨ分子吸光係数の説明とともに詳述されている。例えば、限定されるわけではないが、配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4は、後述する実施例３で０．００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で約９３％の残存活性率を示した（図１）。
【００３５】
本発明のＬＤＨ−Ｂ4はまた、溶液ｐＨ安定性にも優れており、好ましくはｐＨ５−９の範囲で安定である。限定されるわけではないが、好ましくは０．００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９、５５℃、３０分間の熱処理でも失活しない。例えば、限定されるわけではないが、配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4は、後述する実施例３でｐＨ９．０の条件下、０．００３ｍｇ／ｍｌ、５５℃、３０分間の熱処理で９８％、６５℃の熱処理で９５％の残存活性率を示した（図１）。
【００３６】
本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4はさらに、ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない。ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まないとは、例えば、ＬＤＨ−Ｂ4を４５℃で２日間保存した後に、ＮＡＤＨ残存率が好ましくは８９％以上、より好ましくは９２％以上保持することを意味する。
【００３７】
本発明においてＬＤＨタンパク質とともに添加混合したＮＡＤＨの残存率は、例えばＮＡＤＨの有する吸収スペクトルに基づき、３４０ｎｍの吸光度を分光学的に測定して求めることができる。例えば、本明細書において後述する実施例３では、ＮＡＤＨをＬＤＨタンパク質と混合して試薬Ｒ−１を調製した直後の初期吸光度に対する保存経過後の吸光後の割合として試算した。
【００３８】
【化３】
ＮＡＤＨ残存率＝（保存経過後の吸光後）／（試薬調製直後）
さらに、限定されるわけではないが、本発明のＬＤＨ−Ｂ4は好ましくは、補酵素ＮＡＤＨに対する高い特異性、を有する。さらには、補酵素アナログに対する反応性については、補酵素アナログとの組合せにより測定方法ならびに測定試薬の特徴付けをし得ることが望ましい。例えば、ＮＡＤＨの補酵素アナログＡＰＡＤＨはＮＡＤＨに比べて溶液安定性が高い。本発明のＬＤＨを補酵素ＡＰＡＤＨともに利用して、例えば生体試料中のピルビン酸を基質あるいは生成物質とする酵素活性を測定するための液状試薬を構築することが可能である。その場合、ＬＤＨの有するＡＰＡＤＨに対する交差反応性が問題となる。例えば、本明細書中の実施例１において、配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4は、ＮＡＤＨへの反応性１００％とした時、ＡＰＡＤＨに対して１０％程度の交差反応性を有した（実施例１）。
【００３９】
なお、上述したように、本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、アミノ酸配列が好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンである。しかしながら、上記生化学的性質を有するニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは本発明によって初めて得られたものである。よって、本発明の新規なニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、上記生化学的性質を有するものであればそのアミノ酸配列は特に限定されない。
【００４０】
変異型ニワトリＬＤＨ−Ｂ型サブユニット（ＬＤＨ−Ｂ）遺伝子
本発明のＬＤＨ−Ｂタンパク質は、例えば後述の実施例に記載するように、ＬＤＨ−Ｂタンパク質遺伝子を用いて遺伝子工学的に発現させることができる。当業者は本明細書の記載および慣用された遺伝子工学技術を用いて、本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子を容易に得ることが可能である。
【００４１】
よって、本発明は変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質をコードする核酸を提供する。本明細書において、「核酸」または「遺伝子」とは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ又はＲＮＡ、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ、化学合成ＤＮＡまたはＲＮＡの何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローン、ｍＲＮＡ等、いずれの核酸でもよい。
【００４２】
１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在するので、コードされるアミノ酸配列が同じであれば、どのような塩基配列の核酸も本発明の範囲に含まれる。従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするいずれの核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂの遺伝子は、配列番号５に記載の塩基配列を有する野生型ＬＤＨ−Ｂ遺伝子に由来するものに限定されるわけではなく、上述した本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂの生化学的性質を有するポリペプチドをコードする全ての遺伝子を包含する。
【００４４】
本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子の好ましい態様は、配列番号２に記載の塩基配列を有するものである。配列番号２の塩基配列を有する本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子を有する発現プラスミドで形質転換された大腸菌形質転換細胞は、平成１３年１月１６日に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４３１で、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に微生物の国際寄託に関するブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００４５】
本発明の変異型はまた、まず野生型のＬＤＨ−Ｂ遺伝子を得て、それに変異を施すことにより得ることも可能である。例えば配列番号５に記載の塩基配列を有する野生型のＬＤＨ−Ｂ遺伝子は、特開平９−２６２０８９に記載されているように、平成７年１１月１３日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（当時）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９２で国際寄託されている酵母宿主細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＹＲｐ１Ｇ−ｃＬＤ−Ｂ）から得ることができる。また、必要に応じ特開平９−２６２０８９に記載されているように、ニワトリ心臓ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから、例えばプラークハイブリダイゼーション法を利用して得ることもできるし、あるいはまた本発明により決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ニワトリ心臓ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ法により、又はニワトリ心臓ｍＲＮＡを出発物質とするＲＴ−ＰＣＲ法により容易に調製することもできる。このように調製したＬＤＨ−Ｂ ｃＤＮＡを利用して後述する方法により変異体を調製することもできる。
【００４６】
あるいはまた、本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂ遺伝子であって、配列番号２に記載された塩基配列を有するもの、さらに配列番号２以外の塩基配列を有するものも、本明細書中の配列番号１に記載された変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列、またはそれらの一部に基づいて、例えば、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて得ることが可能である。これらの遺伝子工学的手法を用いてさらに同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することも可能である。
【００４７】
遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、２×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、４５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは５５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または４５℃ないし５５℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子も本発明の変異ＬＤＨ−Ｂを製造するために用いられ得る。
【００４８】
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇｅｎｅ ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，ｐ．１８０９−１９３）および転写に基づく増幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，ｐ．１１７３−１１７７）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，ｐ．３９２−３９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，ｐ．１８７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００４９】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に対して少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００５０】
ニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子の塩基配列に基づいて、ニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子を得るための核酸増幅反応に用いる増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作製できる。より詳細には、オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；および
３）各領域間の距離が約１００−約１０００塩基であること
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造することを含む方法により製造することが可能である。当該オリゴヌクレオチド用いて、例えば本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂ遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、適当な２種をプライマー対として用いたＰＣＲ等の増幅反応、あるいは変異を導入する部分を含む適当な相補的なプライマー対を用いた部位特異的突然変異導入するための温度循環反応に用いることが可能である。
【００５１】
本発明の変異ＬＤＨ−Ｂ遺伝子は、上述のように得られた野生型のＬＤＨ−ＢをコードするＤＮＡ配列、またはそれらの一部を利用して、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２）を施すことによって得ることもできる。また、市販の部位突然変異誘発用キット（例えば、Ｓｔａｒａｇａｇｅｎ社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅTM Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ Ｋｉｔ）を利用することもできる。なお、本明細書において「１または複数個のアミノ酸残基」とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【００５２】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき、例えばファージ等の一本鎖ＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて上記一本鎖ＤＮＡに相補的な鎖を合成させ、得られた二本鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された宿主細胞の培養物を寒天にプレートし、上記ＤＮＡを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。すると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するＤＮＡを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、不一致のもの、即ち元の配列を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをラジオアイソトープ等で標識された合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプローブを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００５３】
尚、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１又は複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加または置換し、次いで連結する方法もある。尚、上記した本発明の核酸の両端、即ち翻訳開始暗号および翻訳停止暗号は、それぞれ任意の核酸断片と結合することができる。この核酸断片の塩基配列のサイズは重要ではなく、バクテリア等の有する核外遺伝子と連結するための適当な核酸断片であればよい。
【００５４】
さらに、組換えタンパク質の発現量を高める、回収を容易にする等の目的ための変異を行うことは、当該技術分野において通常行われている改変であり、このようなこのも当然本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
組換え変異型ニワトリＬＤＨのＢ型サブユニットポリペプチドの製造
さらに、本発明は変異型ＬＤＨ−Ｂ をコードする核酸を含む発現ベクター、及びこれら発現ベクターを含有する宿主細胞を変異型ＬＤＨ−Ｂポリペプチドの発現に適する条件下で培養して、その発現された変異型ＬＤＨ−Ｂを回収することにより組換え変異型ＬＤＨ−Ｂポリペプチドを製造する方法も提供する。
【００５６】
本発明の組換え変異型ＬＤＨ−Ｂ（以下、場合により「ＬＤＨ−Ｂ」と略称する）ポリペプチドを製造するためには、使用する宿主細胞に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子等から誘導された、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に連結した変異型ＬＤＨ−Ｂ ＤＮＡ配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適切な配列が挙げられる。加えて、ＬＤＨ−Ｂ遺伝子に本来存在しない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に組み込んでもよい。
【００５７】
変異型ＬＤＨ−Ｂポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８５） に記載されている。
【００５８】
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。特に好ましい宿主細胞は大腸菌、より好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（ＪＭ１０９のコンピテントセルは宝酒造等より市販されている）である。
【００５９】
好ましい宿主細胞は原核細胞である。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌又は枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞内では、ｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドは、原核細胞内でも組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ末端Ｍｅｔは、公知の方法により発現後に組換えｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドから切り離すことができる。宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、ＬＤＨ−Ｂ酵素タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００６０】
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか又は独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例には、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販のプラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが簡単である。適切なプロモーターおよびｃＬＤＨ−Ｂ ＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＴＲＰ（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．ら，１９９５ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ． Ｖｏｌ．２３７（１−２），ｐｐ．４３−５８）、ｐＫＫ２２３−３（スェーデン、ウプサラの Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びｐＧＥＭ１（米国、ウィスコンシン州、マジソンの ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ）が含まれる。
【００６１】
原核宿主細胞用の発現ベクターに普通に用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター（Ｃｈａｎｇ ら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５， １９７８；及び Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４， １９７９）等が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰLプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰLプロモーターの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＰ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）が含まれる。
【００６２】
好ましい宿主細胞の他の例は酵母細胞である。好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ）を用いるが、ピキア （Ｐｉｃｈｉａ） 又はクルイベロミセス （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ） の如き他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多い。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７３， １９８０）又は他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９， １９６８；及び Ｈｏｌｌａｎｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７：４９００， １９７８）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎ， ＥＰＡ−７３，６５７に更に記載されている。もう１つの代用物は、Ｒｕｓｓｅｌｌ ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４， １９８２）及び Ｂｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４， １９８２）により記載されたグルコース被抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。大腸菌内での選択及び複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子及び複製の起点）を上記の酵母ベクター内に挿入することにより、酵母及び大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築することができる。
【００６３】
酵母α因子リーダー配列を用いて、ｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドの分泌を行わせることができる。このα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、Ｋｕｒｊａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３， １９８２；Ｂｉｔｔｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：５３３０， １９８４；米国特許第４，５４６，０８２号；及びＥＰ３２４，２７４を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られている。リーダー配列は、１又は２以上の制限部位を含有するようにその３’末端の近くで修飾されていてもよい。これは、そのリーダー配列の構造遺伝子への連結を容易にするであろう。
【００６４】
酵母の形質転換手順は公知である。かかる手順の１つは、Ｈｉｎｎｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１９２９， １９７８ に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらの手順は、選択培地中でＴｒｐ+形質転換体を選択するものであって、その選択培地は、０．６７％酵母窒素原基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００６５】
発現を誘発するために、ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を“リッチ”培地中で生育させてもよい。リッチ培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなる培地である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消費され尽くした時に起こる。
【００６６】
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドを発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができる。普通に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２等から誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるための発現ベクターは、例えば Ｏｋａｙａｍａ 及び Ｂｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０，
１９８３）の方法で構築することができる。
【００６７】
ｃＬＤＨ−Ｂタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ｃＬＤＨ−Ｂタンパク質が発現する条件下で培養することによって組換えｃＬＤＨ−Ｂタンパク質を産生できる。産生された組換えｃＬＤＨ−Ｂサブユニットは、四量体を形成してｃＬＤＨ−Ｂ4アイソザイムとなる。次いで、用いた発現系に依存して、組換えｃＬＤＨ−Ｂタンパク質を培養培地又は細胞抽出液から回収する。ｃＬＤＨ−Ｂタンパク質を精製する操作は、用いた宿主細胞の型及びｃＬＤＨ−Ｂタンパク質が培養培地中に分泌されるかどうかといった要因に応じて適宜決定してもよい。
【００６８】
細菌宿主で産生した組換えｃＬＤＨ−Ｂタンパク質は、通常宿主細胞内に存在するので、まず細胞を崩壊し、細胞沈殿物または上澄み液を遠心分離や濾過等で分離した後、濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ精製又はゲル濾過精製の適当な組み合わせにより単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもよい。微生物細胞宿主の破壊は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤の使用を含む適当な慣用的方法により行うことができる。
【００６９】
形質転換酵母宿主を用いるときは、好ましくはｃＬＤＨ−Ｂ4を分泌ポリペプチドとして発現させることができる。これにより精製が簡単になる。酵母宿主細胞発酵上清に分泌された組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌ ら（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ２９６：１７１， １９８４）により開示された方法と類似の方法により精製することができる。 Ｕｒｄａｌらは、組換えｃＬＤＨ−Ｂ4の精製のための分取ＨＰＬＣカラムでの２連続逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。
【００７０】
得られた組換え変異型ＬＤＨ−Ｂ4タンパク質は、例えば臨床検査薬の分野において、１）生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）等の種々のアミノトランスフェラーゼの酵素活性を測定する場合や、２）尿素等の種々の基質をピルビン酸に変換し、生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、また、３）検体中の内因性ピルビン酸の消去等に使用することができる。特に、１）のＬＤＨを使用したアミノトランスフェラーゼ活性の測定は、臨床検査の一つとして広く行われており、本発明により大量に得られた組換えｃＬＤＨ−Ｂ4タンパク質を使用することが可能となった。
【００７１】
本発明の組換えｃＬＤＨ−Ｂ4を使用したトランスアミナーゼの酵素活性の測定およびＡＬＴ活性の算出は、前述の特開平８−２８９、臨床検査提要 第３１版」 １９９８年 金原出版株式会社 ｐｐ．６４３−６４９等に記載の原理に従った公知の方法によって行うことができる（例えば、実施例３に記載の方法）。
参考文献
１． 特開平８−２８９
２．「液状ＡＬＴ測定試薬に好適な耐熱型乳酸脱水素酵素」 臨床化学 第２３巻補冊２号 １９９４年 １４１ｂ）
３． 特開平９−２６２０８９
４． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２
５． 臨床検査提要 第３１版」 １９９８年 金原出版株式会社 ｐｐ．６４３−６４９等
【００７２】
【実施例】
参考例１ ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の熱安定性
特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質および天然のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質の熱安定性、特に溶液中、低濃度の状態での耐熱性について検討した。具体的には、トランスアミナーゼ活性を測定するための構成成分として使用されるＬＤＨ量は通常１−１０Ｕ／ｍＬ程度の範囲である。よって、組換えＬＤＨ−Ｂ4比活性（１３６Ｕ／ｍｇタンパク質）より、熱安定性（および溶液安定性）はＬＤＨタンパク質濃度として０．００７−０．０７ｍｇ／ｍＬの範囲で測定すべきであると換算される。
【００７３】
よって、下記表に示した各濃度になるように、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質（１０Ａ、２０７Ｖ）Ｈ−Ｂ、および天然のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質（１０Ｔ、２０７Ａ）を５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した試料を調製した。試料調製直後と、３０分間の熱処理後におけるＬＤＨ活性を測定し、残存活性率を調べた。ＬＤＨ活性は、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−０．８ｍＭ ピリビン酸ナトリウム−０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基質混合液として用い、測定温度２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ+生成量を１単位とした。
【００７４】
【表１】
表１ ６５℃熱安定性（残存活性率）とＬＤ−Ｂ4タンパク質濃度との関係
試料中のＬＤ―Ｂ4 組換えＬＤＨ−Ｂ4 天然ＬＤＨ−Ｂ4
タンパク質濃度 （１０Ａ、２０７Ｖ） （１０Ｔ、２０７Ａ）
１ｍｇ／ｍＬ ９８％ ９０％
０．１ ２０％ ９０％
０．０１ １％ ９０％
０．００１ ＜１％ ８５％
表１に示したように、組換えＬＤＨ−Ｂ4（１０Ａ、２０７Ｖ）は１ｍｇ／ｍｌでは耐熱性を示すが、０．１ｍｇ／ｍｌ以下では残存活性率が２０％と低下し、０．００１ｍｇ／ｍｌでは１％以下と実質的にほぼ失活してしまった。
【００７５】
実施例１ アミノ酸置換による変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）の作製
ａ．Ｖ２０７Ａ発現プラスミドの構築
本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）は、前述した特開平９−２６２０８９号記載のニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子（１０Ａ、２０７Ｖ）を基に作製した。具体的には、特開平９−２６２０８９号記載のニワトリＬＤＨ−Ｂ（１０Ａ、２０７Ｖ）は、２０７番目アミノ酸残基がバリンであるので、これをアラニンに変換するように、遺伝子に突然変異を施した。
【００７６】
具体的には、特開平９−２６２０８９号のニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子（１０Ａ、２０７Ｖ）をコードするｃＤＮＡクローン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ＣＬＤＢ８−Ｅ／Ｂ）を含む環状２本鎖プラスミドを鋳型とし、先ず、当該鋳型の変異を導入したい箇所（２０７Ｖ）に対応する前後１０塩基程度からなる２重鎖のオリゴヌクレオチド対をＤＮＡ合成機により合成した。プライマーの具体的な配列は下記の通りである。
【００７７】
【化４】
前記二本鎖プラスミドを鋳型、前記オリゴヌクレオチド対をプライマーとし、市販の部位突然変異誘発用キット（例えば、Ｓｔａｒａｇａｇｅｎ社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅTM Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ Ｋｉｔ）を用いて、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ（登録商標） ＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）を用い、アニーリング反応後、温度循環反応（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｉｎｇ）を行った。温度循環反応により鋳型プラスミドが複製され、オリゴヌクレオチドプライマーに含まれる変異を有するニックプラスミドが得られた。これを、メチル化されたＤＮＡのみを切断する制限酵素酵素ＤｐｎＩで処理することにより、変異の入っていない鋳型プラスミドのみが切断された。なお、制限酵素処理後、変異が入ったプラスミドを大腸菌に形質転換すると、大腸菌内でニックが修復され、完全な環状プラスミドとして得られる。変異プラスミドの具体的な調製手順はＳｔａｒａｔａｇｅｎｅ社のキット使用説明書に従って行った。
【００７８】
次いで、得られた上記変異を含む遺伝子を含むプラスミドを用いて、市販のＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換し、変異プラスミド（「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−Ｖ２０７Ａ−Ｅ／Ｂ」と呼ぶ）を回収した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ− Ｖ２０７Ａ −Ｅ／Ｂを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、Ｖ２０７ＡをコードするＤＮＡを断片化した。ＤＮＡ断片を抽出し、ｐＴＲＰ発現プラスミド（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．ら，１９９５ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ． Ｖｏｌ．２３７（１−２），ｐｐ．４３−５８）のＥｃｏＲＩ―ＢａｍＨＩ部位に連結挿入し、発現プラスミド（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ）を作製した。市販ＪＭ１０９コンピテントセルをｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａにて形質転換し、組換えＶ２０７Ａタンパク質を発現する形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９）を得た。ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＲＰ−ｃＬＤＨとして、平成１３年１月１６日に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４３１で、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に微生物の国際寄託に関するブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【００７９】
ｂ．形質転換体の培養
大腸菌形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレート上でコロニー化し、白金耳にて単一コロニーを１００ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地が入ったフラスコにて３７℃、終夜振盪培養した。得られた菌体懸濁液より、遠心分離にて菌体を集め、さらに超音波破砕処理を行い発現した組換えタンパク質を抽出した。
【００８０】
本発明の（１０Ａ、２０７Ａ）変異型タンパク質（本明細書中、以下、簡便のため「Ｖ２０７Ａ）と呼称する）は、超音波破砕処理にて可溶性分画に回収された。培養液あたり５Ｕ／ｍＬの活性発現量であった。ＬＤＨ活性は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−０．８ｍＭ ピリビン酸ナトリウム−０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基質混合液として用い、測定温度２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ+生成量を１単位とした。
【００８１】
ｃ．Ｖ２０７Ａタンパク質の精製
上記の超音波破砕処理した遠心分離上清を出発材料とし、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー、フェニル−セファロースＣＬ４Ｂを用いた疎水クロマトグラフィー、さらにＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡＣＡ４４を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを行うことにより、Ｖ２０７Ａタンパク質を精製した。
【００８２】
具体的には、先ずイオン交換クロマトグラフィーで素通り分画に回収されたＶ２０７Ａを疎水クロマトグラフィーにて吸着溶出分画に分離精製した。硫安濃度のグラジエント溶出にて０．５−０Ｍの硫安分画にＶ２０７Ａが回収できた。次いで、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量１５０，０００のところに位置するＶ２０７Ａを回収した。
【００８３】
大腸菌形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９）より最終的に得られたＶ２０７Ａタンパク質精製標品の理化学的性質を下記の表２にまとめた。
【００８４】
【表２】
酵素反応： ピルビン酸＋ＮＡＤＨ⇔Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ+
分子量： １５０，０００（ゲルろ過、４量体）
作用ｐＨ： ｐＨ５−８（２５℃測定）
ｐＨ安定性： ｐＨ５−９（６０℃、３０分間の熱処理）
熱安定性： ６５℃まで失活しない（ｐＨ７、３０分間の熱処理）
補酵素特異性： ＮＡＤＨを１００％とした時、ＮＡＤＨアナログであるＡＰＡＤＨとの反応性は１０％程度
また、Ｖ２０７Ａは比活性３５０Ｕ／ｍｇを示し、特開平９−２６２０８９号記載のものに比べ２．５倍の高比活性型となった。
実施例２ Ｖ２０７Ａタンパク質の熱安定性
実施例１で得られたＶ２０７Ａ精製タンパク質を１Ｕ／ｍＬ（０．００３ｍｇタンパク質／ｍＬ）になるように５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃の各温度にて３０分間熱処理をおこなった。また、同様に５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて溶解したＶ２０７Ａについても同様に熱処理を行った。
【００８５】
熱処理後のＶ２０７Ａタンパク質（１０Ａ、２０７Ａ）の残存活性率（％）をニワトリ心臓から精製した天然酵素タンパク質（オリエンタル酵母製）（１０Ｔ、２０７Ａ）および特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤ−Ｂ４タンパク質（１０Ａ、２０７Ｖ）を対照品として比較した。結果を図１に示す。
【００８６】
図１より、Ｖ２０７Ａは対照品２者と比べて優れた耐熱性を示した。例えば、０．００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で９３％の残存活性率を示した。また、ｐＨ９．０の条件下でも０．００３ｍｇ／ｍｌ、５５℃、３０分間の熱処理で９８％、６５℃の熱処理で９３％の残存活性率を示した。
実施例３ Ｖ２０７Ａタンパク質を構成成分とする活性測定試薬を用いたヒトプール血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性測定
ａ．アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性測定試薬の調製
以下の液状試薬Ｒ−１及びＲ−２を調製し、以下のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性の測定に使用した。
【００８７】
【表３】
Ｒ−１試薬（ｐＨ９．２）
１０ｍＭ トリス
０．４５ｍＭ ＮＡＤＨ
３２００Ｕ／Ｌ 組換えＬＤＨ（Ｖ２０７Ａ）
１８１ｍＭ Ｌ−アラニン
１ｍＭ ＥＤＴＡ−２ナトリウム
０．１％アジ化ナトリウム
Ｒ−２試薬（ｐＨ７．２）
１６０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
４７ｍＭ ２−オキソグルタル酸
１．２Ｍ Ｌ−アラニン
３ｍＭ ＥＤＴＡ−２ナトリウム
０．１％ アジ化ナトリウム
ｂ．ＡＬＴの活性測定
ＡＬＴ活性測定方法およびＡＬＴ活性の算出方法については、「臨床検査提要第３１版」 １９９８年 金原出版株式会社 ｐｐ．６４３−６４９に記載の原理に従った。具体的には先ず、測定試料（ヒトプール血清）を１５μＬ、Ｒ−１試薬を２４０μＬ、Ｒ−２試薬を１２０μＬを混合し、以下の式で示される反応を開始した。
【００８８】
【化５】
反応開始から１分後から５分後までの３４０ｎｍにおける吸光後減少量を日立７１５０型自動分析機にてモニタリングし、１分間あたりの吸光度減少量を求めた。当該吸光度減少量を利用し、以下の式に従って、試料中のＡＬＴ活性（Ｕ／Ｌ、３７℃）を算出した。
【００８９】
【化６】
Ａ１／分： 試料を用いた場合の反応開始後の１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度減少量
Ａ２／分： 対照（生理食塩水）を用いた盲験の場合の反応開始後の１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度減少量
６．３ × １０3： ＮＡＤＨの分光吸光係数（ＮＡＤ+の１モル濃度あたり）
試料液量、Ｒ１液量およびＲ２液量の単位はμＬである。
結果を図２に示す。ＡＬＴ測定における直線性を、原点を通る直線回帰より理論値の±５％範囲と設定すると、本実施例のａで調製した液状試薬の場合は、０−２，０００Ｕ／Ｌ（３７℃）と良好な結果となった。調製試薬を４５℃で２日間虐待保存し、保存後の劣化度をＡＬＴ直線性より求めた。その結果、４５℃２日間虐待保存後でもＡＬＴ直線性は初期性能を維持していた。
【００９０】
また、液状試薬の構成成分として共存する補酵素ＮＡＤＨの保存安定性についてもその残存率を調べた。具体的にはＮＡＤＨをＬＤＨタンパク質と混合して試薬Ｒ−１を調製した直後の初期吸光度に対する保存経過後の吸光後の割合として試算した。
【００９１】
【化７】
ＮＡＤＨ残存率＝（保存経過後の吸光後）／（試薬調製直後）
その結果、本発明のＶ２０７Ａタンパク質は、天然酵素タンパク質（１０Ｔ、２０７Ａ）および特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤ−Ｂ４タンパク質（１０Ａ、２０７Ｖ）と比較して、高い成分安定性を示した。４５℃で２日間虐待保存後の、ＬＤ活性およびＮＡＤＨ残存率の結果を図３にまとめた。
【００９２】
【発明の効果】
本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、耐熱性および溶液安定性に優れている。よって、本発明のＬＤＨの産業的な量産化の達成により、より安定な組換え型乳酸デヒドロゲナーゼが供給が可能となった。特に臨床面において生体液中のトランスアミナーゼ活性を汎用的な測定を可能とした。
【００９３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）の熱安定性およびｐＨ安定性を示す。
【図２】図２は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）のＡＬＴ測定における直線性能を示す。
【図３】図３は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）の長時間高温保存後の残存活性およびＮＡＤＨ安定性に及ぼす影響を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）は、ＮＡＤ+を水素受容体として乳酸を脱水素してピルビン酸を生じる酵素であって、解糖系でピルビン酸から乳酸を生成することに働く酵素として、動物諸組織、微生物に広く存在する。
【０００３】
特に動物のＬＤＨにはＡ型（Ｍ型または骨格筋型）、Ｂ型（Ｈ型または心筋型）といった２種類のサブユニットが存在することが知られ、その酵素学的な性質もＬＤＨアイソザイム間で異なっている。サブユニットは同種同士または異種間で四量体を形成し、陽極側への電気移動度の高いものからＬＤＨ1（Ｂ4）、ＬＤＨ2（Ａ1Ｂ3）、ＬＤＨ3（Ａ2Ｂ2）、ＬＤＨ4（Ａ3Ｂ1）、ＬＤＨ5（Ａ4）と呼ばれるアイソザイムが存在する。体内における各アイソザイムの分布は偏っており、心筋、赤血球および腎にはＬＤＨ−Ｂ4が、骨格筋および肝にはＬＤＨ−Ａ4が多く含まれている。また、前立腺、結腸、甲状腺、肺の各組織にはＬＤＨ−Ａ2Ｂ2が多い。さらに近年、新たにＣ型およびＤ型サブユニットの存在も確認されており、精巣および精子中からＬＤＨ−Ｘ（Ｃ4）が、絨毛癌（ｃｈｏｒｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）とその転移巣からＬＤＨ−Ｚ（Ｄ4）が見い出されている。
【０００４】
ＬＤＨは特に臨床検査薬の分野において、１）生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）等の種々のアミノトランスフェラーゼの酵素活性を測定する場合や、２）尿素等の種々の基質をピルビン酸に変換し、生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、また、３）検体中の内因性ピルビン酸の消去にも利用されている。特に、１）のアミノトランスフェラーゼは肝臓、心臓、腎臓などに強い活性を示す酵素であり、各種疾患時に血清中に著しく増大するため、ＬＤＨを使用した生体試料（血清、血漿などの体液）中のアミノトランスフェラーゼ活性の測定は、臨床検査の一項目として広く行われている。
【０００５】
臨床検査用試薬として使用するには、簡便性の観点から粉末状態のものよりも液体状態で安定なものが好ましい。アミノトランスフェラーゼ活性測定のための臨床検査用試薬としては大量に入手できるという観点から一般にブタ由来のＬＤＨ−Ｂ4が使用されてきたが、これは液体状態では長期間に渡って安定した状態で保存することが困難であるという欠点があった。
【０００６】
近年、鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ4が補酵素（ＮＡＤＨ）の溶液安定性を考慮したｐＨ領域、例えばｐＨ約９−１０の範囲においても、著しい耐熱溶液安定性を示すことがわかった。鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ4の酵素的性質は、従来のブタＬＤＨ−Ｂ4とほとんどかわらず、トランスアミナーゼ（アミノトランスフェラーゼ）活性測定試薬として本酵素を使用した場合も、測定感度において特に問題はない。従って、鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ4は、溶液安定性および酵素的性質からして、臨床検査用酵素として充分有用性があると期待される（「トランスアミナーゼ測定試薬」特開平８−２８９）および「液状ＡＬＴ測定試薬に好適な耐熱型乳酸脱水素酵素」 臨床化学 第２３巻補冊２号 １９９４年 １４１ｂ）。
【０００７】
しかしながら、天然のＬＤＨ−Ｂ4タンパク質を鳥類から調製する場合極少量しか得られないため、臨床検査用酵素として例えば、ニワトリ臓器より取得し実用化を図ることは数量面で困難である。また、天然源から調製されたＬＤＨ−Ｂ4タンパク質の場合、精製を充分に行っても混在するＮＡＤＨ分解酵素を完全に除けないことが知られている。これは、ＬＤＨの酵素反応はＮＡＤＨを補酵素として利用するため問題となる。従って、鳥類由来のＬＤＨ−Ｂ遺伝子をクローニングし、遺伝子工学的手法によりＬＤＨ−Ｂ4タンパク質を大量かつ簡便に発現させることが重要である。
【０００８】
この点、内田らの特開平９−２６２０８９号は、ニワトリ心臓由来乳酸デヒドロゲナーゼＢサブユニットの遺伝子をクローニングし、ニワトリＬＤＨ−Ｂ4組換えタンパク質の発現に成功したことを開示している。得られた組換えニワトリＬＤＨ−Ｂ4タンパク質の熱安定性について、特開平９−２６２０８９号は天然のニワトリＬＤＨ−Ｂ4と同等であると記載している。
【０００９】
しかしながら、本発明者らがより詳細に熱安定性を検討した結果、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質はタンパク質濃度に依存して熱安定性が大きく変化することが見出された。具体的には、トランスアミナーゼ活性を測定するための構成成分として使用されるＬＤＨ量は通常１−１０Ｕ／ｍＬ程度の範囲である。よって、組換えＬＤＨ−Ｂ4比活性（１３６Ｕ／ｍｇタンパク質）より、熱安定性および溶液安定性はＬＤＨタンパク質濃度として０．００７−０．０７ｍｇ／ｍＬの範囲で測定すべきであると換算される。ところが、後述の参考例１に記載したように、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質は、このような低濃度では熱に不安定であることがわかった。よって、当該組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質は、熱安定性および溶液安定性を有するトランスアミナーゼ活性測定試薬を提供するには未だ充分でない可能性がある。
【００１０】
よって、簡便で大量に遺伝子工学的手法によって得ることができ、かつ充分な熱安定性および溶液安定性を保持する乳酸デヒドロゲナーゼタンパク質の提供が希求される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、耐熱性および溶液安定性を示し、ＮＡＤＨ分解酵素を含まない、変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を提供することを目的とする。本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであることを特徴とする。本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有する。
【００１２】
本発明はまた、前記変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質をコードする核酸を提供することを目的とする。本発明の核酸は、好ましくは配列番号２に記載の塩基配列を有する。
【００１３】
本発明はさらに、前記変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を発現するためのベクター、前記ベクターを含む宿主細胞を提供することを目的とする。
【００１４】
本発明はさらにまた、前記宿主細胞を培養して、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を製造する方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、前記変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を構成成分とするニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型タンパク質を含む、トランスアミナーゼ測定用試薬を提供することを目的とする。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題解決のため鋭意研究を重ねた結果、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤ−Ｂ4タンパク質に変異を導入し、その生化学的活性の熱安定性および溶液安定性（ｐＨ安定性）、ならびにＮＡＤＨ分解活性を検討することにより、低濃度でも熱安定性および溶液安定性（ｐＨ安定性）を保持する変異型のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットを見出し、本発明を想到した。
【００１６】
以下、本発明を詳述する。
変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質
本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであることを特徴とする。そして、生学的的な特徴としては、補酵素ＮＡＤＨの存在下でピルビン酸を乳酸に変換する活性を有し、そしてゲル濾過クロマトグラフィーで４量体の状態で分子量が約１５０，０００であり、特に以下の性質：
１）０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で失活せず；そして
２）ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない
を有することを特徴とする。上記１）および２）の性質は公知のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質にはない特有の性質である。
【００１７】
本発明者らは先ずニワトリ心臓ｃＤＮＡライブラリーの作製し、特開平９−２６２０８９号に記載のＬＤ−Ｂ遺伝子をコードするｃＤＮＡ配列を取得した。ｃＤＮＡライブラリーの作製は慣用技術、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ １９８９）に詳述されている方法に従った。特開平９−２６２０８９号に記載の方法に従がい、作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによりＬＤ−Ｂ遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを取得した。得られたｃＤＮＡクローンの塩基配列を決定し、本明細書で後述する配列表の配列番号５に記載した。さらに、配列番号５の塩基配列より推定されるアミノ酸配列は配列番号４に記載した。これらは、特開平９−２６２０８９号に開示された塩基配列及びアミノ酸配列（各々、特開平９−２６２０８９号の配列番号３及び１）と同一であることが確認された。
【００１８】
一方、ニワトリ心臓より精製された天然のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列が Ｔｓｏｉ，Ｓ．Ｃ．Ｍ．， Ｌｉ，Ｊ．Ｙ．，Ｍａｎｎｅｎ，Ｈ． ａｎｄ Ｌｉ，Ｓ．Ｓ．Ｌ． Ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ （０３−ＪＵＮ−１９９８）： ＧＩ “３３４２４０３” ［ＧｅｎＢａｎｋ］に開示されている（配列番号３）。
【００１９】
特開平９−２６２０８９号の組換えニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列（配列番号４）とＴｓｏｉらの天然ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列（配列番号３）を比較したところ、２カ所のアミノ酸残基が相違した。具体的には、配列番号３および４において１０番目のアミノ酸残基が前者（配列番号３）はスレオニン、後者（配列番号４）はアラニンであり、そして２０７番目のアミノ酸残基が前者ではアラニン、後者はバリンであった。
【００２０】
上記特開平９−２６２０８９号の組換えニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットとＴｓｏｉらの天然ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのアミノ酸配列に基づき、これら公知のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットに変異を施すことによって、本発明者らは熱安定性および溶液安定性（ｐＨ安定性）に優れ、かつＮＡＤＨ分解活性を有しない優れた生化学的性質を有する変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットを得ることに成功し、本発明を想到した。具体的には、本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、配列番号１（または配列番号３または４）のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであることを特徴とする。
【００２１】
本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、公知の上記特開平９−２６２０８９号の組換えニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットとＴｓｏｉらの天然ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットのいずれとも相違し、新規なタンパク質である。以下、本明細書中、簡便のため必要に応じ、本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットを（１０Ａ、２０７Ａ）ＬＤＨ−Ｂ、上記特開平９−２６２０８９号の組換え型のものを（１０Ａ、２０７Ｖ）ＬＤＨ−Ｂ、そして天然由来のものを（１０Ｔ、２０７Ａ）ＬＤＨ−Ｂと略称する。
【００２２】
本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂは好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列１−３３３を有するが、これらに限定されない。天然のタンパク質の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いによる遺伝子の変異、あるいはよく似たアイソザイムの存在などに起因して１から複数個のアミノ酸変異を有する変異タンパク質が存在することは周知である。さらに、一般に生理活性を有するペプチドのアミノ酸配列が多少変更された場合、即ち、該アミノ酸配列の中の１又は複数のアミノ酸が置換され若しくは欠失し、または１又は複数のアミノ酸が付加された場合でも該ペプチドの生理活性が維持される場合があることは周知の事実である。
【００２３】
よって、本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質は、配列番号１のアミノ酸残基１−３３３において、１０番目のアラニン残基および２０７番目のアラニン残基以外の部分において１またはそれ以上のアミノ酸残基の欠失、置換もしくは付加による変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する（生物学的に活性な、酵素的に活性な）タンパク質も含む。本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質が「乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、Ｂ型同士またはＡ型等の異なる型のサブユニットと四量体を形成して、ＮＡＤ+を水素受容体として乳酸を脱水素してピルビン酸を生じる活性を有することを意味する。
【００２４】
本明細書で使用する用語「アミノ酸変異」とは、１以上のアミノ酸の置換、欠失、挿入及び／又は付加などを意味する。本発明の変異ニワトリＬＤＨ−Ｂ酵素は、好ましくは配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するが、その配列を有するタンパク質のみに限定されるわけではなく、本明細書中に記載した特性を有する限り全ての相同タンパク質を含むことが意図される。
【００２５】
配列番号１に示された本発明のＬＤＨ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列は、ニワトリＬＤＨのＡ型サブユニットタンパク質のアミノ酸配列と７３．３％の相同性を有する。また、ニワトリＬＤＨ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列と、対応するヒト、ブタおよびマウスＢ型サブユニットタンパク質のアミノ酸配列との相同性は、それぞれ８９．５％、８８．９％および８８．３％である。よって、限定されるわけではないが、本発明の変異ニワトリＬＤＨ−Ｂ酵素は、配列番号１のアミノ酸配列と、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、もっとも好ましくは９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本明細書において、相同性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５．，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。ＢＬＡＳＴプログラムによる相同性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。
【００２７】
一般的に、同様の性質を有するアミノ酸同士の置換（例えば、ある疎水性アミノ酸から別の疎水性アミノ酸への置換、ある親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸への置換、ある酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸への置換、あるいはある塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸への置換）を導入した場合、得られる変異タンパク質は元のタンパク質と同様の性質を有することが多い。遺伝子組換え技術を使用して、このような所望の変異を有する組換えタンパク質を作製する手法は当業者に周知であり、このような変異タンパク質も本発明の範囲に含まれる。
【００２８】
その他の例として、Ｃｙｓ残基が欠失するまたは他のアミノ酸で置き換えられる原因となる様に、Ｃｙｓ残基をコードする配列を変化させ、再生時の不適当な分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことができる。置換されるアミノ酸は、トリプトファン、セリン、アスパラギン酸およびリジンからなる基より選択され、最も好ましくは、アミノ酸はトリプトファンである。
【００２９】
同様に、生物活性への欠失または挿入による潜在的効果を考慮することにより、アミノ酸配列を欠失または付加することが可能である。例えば、酵母の発現系を用いると均一の炭水化物が減少した類似体が発現されるが、Ｎ−グリコシル化部位を修飾してグルコシル化を排除することができる。真核生物のポリペプチド内のグリコシル化部位は、アミノ酸のトリプレット、Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（式中，ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸であり、ＹはＳｅｒまたはＴｈｒである）を特徴とする。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列の適当な修飾は、Ａｓｎ側鎖の炭水化物残基の結合を防ぐ置換、付加または欠失を結果として生ずるであろう。あるいは、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系での発現を強化するために、二塩基性のアミノ酸残基をコードする配列を修飾することも可能である。
【００３０】
変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットの生化学的性質
ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットが、「乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する」とは、Ｂ型同士またはＡ型等の異なる型のサブユニットと四量体を形成して、ＮＡＤ+を水素受容体として乳酸を脱水素してピルビン酸を生じる活性を有することを意味する。即ち、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ四量体タンパク質は、以下の酵素反応を可逆的に促進する。
【００３１】
【化１】
酵素反応： ピルビン酸＋ＮＡＤＨ⇔Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ+
また、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、ゲル濾過クロマトグラフィーで４量体の状態で分子量が約１５０，０００である。本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、特に以下の生化学性質：
１）０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で失活せず；そして
２）ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない
を有することを特徴とする。上記１）および２）の性質は公知のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質にはない特有の性質である。
【００３２】
本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットが耐熱性であり、熱処理で失活しない、とは、本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4（以下、単に「本発明のＬＤＨ−Ｂ4」という）が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９３％以上のＬＤＨ活性の残存活性率を有することを意味する。本発明のＬＤＨ−Ｂ4はより低濃度、即ち、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍｌより好ましくは０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度でも、例えば、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９３％以上残存活性率を有する。
【００３３】
ＬＤＨ活性は例えば、１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−０．８ｍＭ ピリビン酸ナトリウム−０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基質混合液として用い、測定温度２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ+生成量を１単位とすることができる。ＮＡＤ+生成量は、例えば、ＮＡＤＨの分子吸光係数（例えば、波長３４０ｎｍで１ｃｍ光路幅のキュベットセルを用いた場合に、ＮＡＤ+の１ミリモル濃度あたり６．３０となる）を用いる。基質反応混合液に試料を添加し、その後１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度減少量を測定し、次式に従い試料中のＬＤＨ活性（Ｕ／ｍｌ）を換算することができる。
【００３４】
【化２】
ｖ： 試料液量（ｍｌ）
６．３０： ＮＡＤＨ分子吸光係数（ＮＡＤ+の１ミリモル濃度あたり）
上記分光光度計によるＬＤＨ活性測定方法については例えば、オリエンタル酵母工業株式会社製品カタログ（２０００年版）の第６６頁−第６７頁に、ＮＡＤＨ分子吸光係数の説明とともに詳述されている。例えば、限定されるわけではないが、配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4は、後述する実施例３で０．００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で約９３％の残存活性率を示した（図１）。
【００３５】
本発明のＬＤＨ−Ｂ4はまた、溶液ｐＨ安定性にも優れており、好ましくはｐＨ５−９の範囲で安定である。限定されるわけではないが、好ましくは０．００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９、５５℃、３０分間の熱処理でも失活しない。例えば、限定されるわけではないが、配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4は、後述する実施例３でｐＨ９．０の条件下、０．００３ｍｇ／ｍｌ、５５℃、３０分間の熱処理で９８％、６５℃の熱処理で９５％の残存活性率を示した（図１）。
【００３６】
本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4はさらに、ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない。ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まないとは、例えば、ＬＤＨ−Ｂ4を４５℃で２日間保存した後に、ＮＡＤＨ残存率が好ましくは８９％以上、より好ましくは９２％以上保持することを意味する。
【００３７】
本発明においてＬＤＨタンパク質とともに添加混合したＮＡＤＨの残存率は、例えばＮＡＤＨの有する吸収スペクトルに基づき、３４０ｎｍの吸光度を分光学的に測定して求めることができる。例えば、本明細書において後述する実施例３では、ＮＡＤＨをＬＤＨタンパク質と混合して試薬Ｒ−１を調製した直後の初期吸光度に対する保存経過後の吸光後の割合として試算した。
【００３８】
【化３】
ＮＡＤＨ残存率＝（保存経過後の吸光後）／（試薬調製直後）
さらに、限定されるわけではないが、本発明のＬＤＨ−Ｂ4は好ましくは、補酵素ＮＡＤＨに対する高い特異性、を有する。さらには、補酵素アナログに対する反応性については、補酵素アナログとの組合せにより測定方法ならびに測定試薬の特徴付けをし得ることが望ましい。例えば、ＮＡＤＨの補酵素アナログＡＰＡＤＨはＮＡＤＨに比べて溶液安定性が高い。本発明のＬＤＨを補酵素ＡＰＡＤＨともに利用して、例えば生体試料中のピルビン酸を基質あるいは生成物質とする酵素活性を測定するための液状試薬を構築することが可能である。その場合、ＬＤＨの有するＡＰＡＤＨに対する交差反応性が問題となる。例えば、本明細書中の実施例１において、配列番号１のアミノ酸配列を有する本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットからなるＬＤＨ−Ｂ4は、ＮＡＤＨへの反応性１００％とした時、ＡＰＡＤＨに対して１０％程度の交差反応性を有した（実施例１）。
【００３９】
なお、上述したように、本発明のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、アミノ酸配列が好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基がアラニンである。しかしながら、上記生化学的性質を有するニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは本発明によって初めて得られたものである。よって、本発明の新規なニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質は、上記生化学的性質を有するものであればそのアミノ酸配列は特に限定されない。
【００４０】
変異型ニワトリＬＤＨ−Ｂ型サブユニット（ＬＤＨ−Ｂ）遺伝子
本発明のＬＤＨ−Ｂタンパク質は、例えば後述の実施例に記載するように、ＬＤＨ−Ｂタンパク質遺伝子を用いて遺伝子工学的に発現させることができる。当業者は本明細書の記載および慣用された遺伝子工学技術を用いて、本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子を容易に得ることが可能である。
【００４１】
よって、本発明は変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質をコードする核酸を提供する。本明細書において、「核酸」または「遺伝子」とは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを意味する。本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ又はＲＮＡ、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ、化学合成ＤＮＡまたはＲＮＡの何れでもよく、またゲノムＤＮＡクローン、ｃＤＮＡクローン、ｍＲＮＡ等、いずれの核酸でもよい。
【００４２】
１つのアミノ酸をコードするコドンは複数存在するので、コードされるアミノ酸配列が同じであれば、どのような塩基配列の核酸も本発明の範囲に含まれる。従って、配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするいずれの核酸も本発明の範囲に含まれる。
【００４３】
天然の遺伝子の中にはそれを生産する生物種の品種の違いや、生態系の違いに起因する少数の変異やよく似たアイソザイムの存在に起因する少数の変異が存在することは当業者に周知である。従って、本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂの遺伝子は、配列番号５に記載の塩基配列を有する野生型ＬＤＨ−Ｂ遺伝子に由来するものに限定されるわけではなく、上述した本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂの生化学的性質を有するポリペプチドをコードする全ての遺伝子を包含する。
【００４４】
本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子の好ましい態様は、配列番号２に記載の塩基配列を有するものである。配列番号２の塩基配列を有する本発明のＬＤＨ−Ｂ遺伝子を有する発現プラスミドで形質転換された大腸菌形質転換細胞は、平成１３年１月１６日に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４３１で、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に微生物の国際寄託に関するブタペスト条約に基づき国際寄託されている。
【００４５】
本発明の変異型はまた、まず野生型のＬＤＨ−Ｂ遺伝子を得て、それに変異を施すことにより得ることも可能である。例えば配列番号５に記載の塩基配列を有する野生型のＬＤＨ−Ｂ遺伝子は、特開平９−２６２０８９に記載されているように、平成７年１１月１３日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（当時）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５２９２で国際寄託されている酵母宿主細胞Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＹＲｐ１Ｇ−ｃＬＤ−Ｂ）から得ることができる。また、必要に応じ特開平９−２６２０８９に記載されているように、ニワトリ心臓ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから、例えばプラークハイブリダイゼーション法を利用して得ることもできるし、あるいはまた本発明により決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、ニワトリ心臓ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ法により、又はニワトリ心臓ｍＲＮＡを出発物質とするＲＴ−ＰＣＲ法により容易に調製することもできる。このように調製したＬＤＨ−Ｂ ｃＤＮＡを利用して後述する方法により変異体を調製することもできる。
【００４６】
あるいはまた、本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂ遺伝子であって、配列番号２に記載された塩基配列を有するもの、さらに配列番号２以外の塩基配列を有するものも、本明細書中の配列番号１に記載された変異型ＬＤＨ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列、またはそれらの一部に基づいて、例えば、ハイブリダイゼーションや核酸増幅反応等の遺伝子工学の基本的手法を用いて得ることが可能である。これらの遺伝子工学的手法を用いてさらに同様の生理活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離することも可能である。
【００４７】
遺伝子のスクリーニングのために使用するハイブリダイゼーション条件は特に限定されないが、一般的にはストリンジェントな条件が好ましく、例えば、２×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ＳＤＳ、４５℃ないし６８℃などのハイブリダイゼーション条件を使用することが考えられる。この場合、ハイブリダイゼーションの温度としては、より好ましくは５５℃ないし６８℃（ホルムアミド無し）または４５℃ないし５５℃（５０％ホルムアミド）を挙げることができる。ホルムアミド濃度、塩濃度及び温度などのハイブリダイゼーション条件を適宜設定することによりある一定の相同性以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡをクローニングできることは当業者に周知であり、このようにしてクローニングされた相同遺伝子も本発明の変異ＬＤＨ−Ｂを製造するために用いられ得る。
【００４８】
核酸増幅反応は、例えば、複製連鎖反応（ＰＣＲ）（サイキら、１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，ｐ．１３５０−１３５４）、ライゲース連鎖反応（ＬＣＲ）（ウーら、１９８９，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４，ｐ．５６０−５６９；バリンガーら、１９９０，Ｇｅｎｅ ８９，ｐ．１１７−１２２；バラニーら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，ｐ．１８０９−１９３）および転写に基づく増幅（コーら、１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，ｐ．１１７３−１１７７）等の温度循環を必要とする反応、並びに鎖置換反応（ＳＤＡ）（ウォーカーら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，ｐ．３９２−３９６；ウォーカーら、１９９２，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２０，ｐ．１６９１−１６９６）、自己保持配列複製（３ＳＲ）（グアテリら、１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，ｐ．１８７４−１８７８）およびＱβレプリカーゼシステム（リザイルディら、１９８８，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，ｐ．１１９７−１２０２）等の恒温反応を含む。また、欧州特許第０５２５８８２号に記載されている標的核酸と変異配列の競合増幅による核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）反応等も利用可能である。好ましくはＰＣＲ法である。
【００４９】
上記のようなハイブリダイゼーション、核酸増幅反応等を使用してクローニングされる相同遺伝子は、配列表の配列番号２に記載の塩基配列に対して少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する。
【００５０】
ニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子の塩基配列に基づいて、ニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子を得るための核酸増幅反応に用いる増幅用オリゴヌクレオチドプライマーを作製できる。より詳細には、オリゴヌクレオチドは、例えば、配列番号２の塩基配列から以下の条件を満たすように２つの領域を選択し：
１）各領域の長さが１５−３０塩基であること；
２）各領域中のＧ＋Ｃの割合が４０−６０％であること；および
３）各領域間の距離が約１００−約１０００塩基であること
上記領域と同じ塩基配列若しくは上記領域に相補的な塩基配列を有する一本鎖ＤＮＡを製造し、または、上記一本鎖ＤＮＡによってコードされるアミノ酸残基を変化させないように遺伝子暗号の縮重を考慮した一本鎖ＤＮＡの混合物を製造し、さらに必要であれば上記タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列に対する結合特異性を失わないように修飾した上記一本鎖ＤＮＡを製造することを含む方法により製造することが可能である。当該オリゴヌクレオチド用いて、例えば本発明の変異型ＬＤＨ−Ｂ遺伝子を検出もしくは単離するためのハイブリダイゼーション、適当な２種をプライマー対として用いたＰＣＲ等の増幅反応、あるいは変異を導入する部分を含む適当な相補的なプライマー対を用いた部位特異的突然変異導入するための温度循環反応に用いることが可能である。
【００５１】
本発明の変異ＬＤＨ−Ｂ遺伝子は、上述のように得られた野生型のＬＤＨ−ＢをコードするＤＮＡ配列、またはそれらの一部を利用して、例えば、周知技術である部位特異的変異誘発（例えば、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２）を施すことによって得ることもできる。また、市販の部位突然変異誘発用キット（例えば、Ｓｔａｒａｇａｇｅｎ社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅTM Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｉｓｉｓ Ｋｉｔ）を利用することもできる。なお、本明細書において「１または複数個のアミノ酸残基」とは、部位特異的変異誘発法により付加、欠失または置換できる程度の数のアミノ酸を意味する。
【００５２】
部位特異的変異誘発法は、例えば、所望の変異である特定の不一致の他は、変異を受けるべき、例えばファージ等の一本鎖ＤＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて次のように行うことができる。即ち、プライマーとして上記合成オリゴヌクレオチドを用いて上記一本鎖ＤＮＡに相補的な鎖を合成させ、得られた二本鎖ＤＮＡで宿主細胞を形質転換する。形質転換された宿主細胞の培養物を寒天にプレートし、上記ＤＮＡを含有する単一細胞からプラークを形成せしめる。すると、理論的には５０％の新コロニーが一本鎖として変異を有するＤＮＡを含有し、残りの５０％が元の配列を有する。上記所望の変異を有するＤＮＡと完全に一致するものとはハイブリダイズするが、不一致のもの、即ち元の配列を有するものとはハイブリダイズしない温度において、得られたプラークをラジオアイソトープ等で標識された合成プローブとハイブリダイズさせる。次に該プローブとハイブリダイズするプローブを拾い、培養しＤＮＡを回収する。
【００５３】
尚、酵素などの生物活性ペプチドのアミノ酸配列にその活性を喪失せしめない１又は複数のアミノ酸の置換、欠失または挿入を施す方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法及び遺伝子を選択的に開裂し、次に選択されたヌクレオチドを除去、付加または置換し、次いで連結する方法もある。尚、上記した本発明の核酸の両端、即ち翻訳開始暗号および翻訳停止暗号は、それぞれ任意の核酸断片と結合することができる。この核酸断片の塩基配列のサイズは重要ではなく、バクテリア等の有する核外遺伝子と連結するための適当な核酸断片であればよい。
【００５４】
さらに、組換えタンパク質の発現量を高める、回収を容易にする等の目的ための変異を行うことは、当該技術分野において通常行われている改変であり、このようなこのも当然本発明の範囲に含まれる。
【００５５】
組換え変異型ニワトリＬＤＨのＢ型サブユニットポリペプチドの製造
さらに、本発明は変異型ＬＤＨ−Ｂ をコードする核酸を含む発現ベクター、及びこれら発現ベクターを含有する宿主細胞を変異型ＬＤＨ−Ｂポリペプチドの発現に適する条件下で培養して、その発現された変異型ＬＤＨ−Ｂを回収することにより組換え変異型ＬＤＨ−Ｂポリペプチドを製造する方法も提供する。
【００５６】
本発明の組換え変異型ＬＤＨ−Ｂ（以下、場合により「ＬＤＨ−Ｂ」と略称する）ポリペプチドを製造するためには、使用する宿主細胞に応じて選ばれた発現ベクターに、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子等から誘導された、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に連結した変異型ＬＤＨ−Ｂ ＤＮＡ配列を挿入する。調節配列の例として、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適切な配列が挙げられる。加えて、ＬＤＨ−Ｂ遺伝子に本来存在しない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に組み込んでもよい。
【００５７】
変異型ＬＤＨ−Ｂポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓ ら， Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８５） に記載されている。
【００５８】
宿主細胞は、大腸菌、酵母または昆虫細胞が好ましく、具体的には、大腸菌（Ｍ１５、ＪＭ１０９、ＢＬ２１等）、酵母（ＩＮＶＳｃ１（サッカロマイセス属）、ＧＳ１１５、ＫＭ７１（以上ピキア属）など）、昆虫細胞（ＢｍＮ４、カイコ幼虫など）などが例示される。また、動物細胞としてはマウス由来、アフリカツメガエル由来、ラット由来、ハムスタ−由来、サル由来またはヒト由来の細胞若しくはそれらの細胞から樹立した培養細胞株などが例示される。特に好ましい宿主細胞は大腸菌、より好ましくは大腸菌ＪＭ１０９（ＪＭ１０９のコンピテントセルは宝酒造等より市販されている）である。
【００５９】
好ましい宿主細胞は原核細胞である。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性菌、例えば、大腸菌又は枯草菌が含まれる。大腸菌のような原核細胞内では、ｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドは、原核細胞内でも組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ末端Ｍｅｔは、公知の方法により発現後に組換えｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドから切り離すことができる。宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に発現べクターは少なくとも、プロモーター／オペレーター領域、開始コドン、ＬＤＨ−Ｂ酵素タンパク質をコードする遺伝子、終止コドン、ターミネーターおよび複製可能単位から構成される。
【００６０】
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか又は独立栄養要求性を付与する遺伝子である。原核宿主細胞に適する発現ベクターの例には、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販のプラスミドまたはそれらから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するのが簡単である。適切なプロモーターおよびｃＬＤＨ−Ｂ ＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＴＲＰ（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．ら，１９９５ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ． Ｖｏｌ．２３７（１−２），ｐｐ．４３−５８）、ｐＫＫ２２３−３（スェーデン、ウプサラの Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）及びｐＧＥＭ１（米国、ウィスコンシン州、マジソンの ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ）が含まれる。
【００６１】
原核宿主細胞用の発現ベクターに普通に用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター（Ｃｈａｎｇ ら，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５， １９７８；及び Ｇｏｅｄｄｅｌら， Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４， １９７９）等が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰLプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰLプロモーターの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＰ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）が含まれる。
【００６２】
好ましい宿主細胞の他の例は酵母細胞である。好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ）を用いるが、ピキア （Ｐｉｃｈｉａ） 又はクルイベロミセス （Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ） の如き他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多い。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：２０７３， １９８０）又は他の解糖酵素（Ｈｅｓｓら， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ． ７：１４９， １９６８；及び Ｈｏｌｌａｎｄら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７：４９００， １９７８）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、Ｈｉｔｚｅｍａｎ， ＥＰＡ−７３，６５７に更に記載されている。もう１つの代用物は、Ｒｕｓｓｅｌｌ ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４， １９８２）及び Ｂｅｉｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３００：７２４， １９８２）により記載されたグルコース被抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。大腸菌内での選択及び複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐr遺伝子及び複製の起点）を上記の酵母ベクター内に挿入することにより、酵母及び大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築することができる。
【００６３】
酵母α因子リーダー配列を用いて、ｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドの分泌を行わせることができる。このα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、Ｋｕｒｊａｎら， Ｃｅｌｌ ３０：９３３， １９８２；Ｂｉｔｔｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：５３３０， １９８４；米国特許第４，５４６，０８２号；及びＥＰ３２４，２７４を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列も知られている。リーダー配列は、１又は２以上の制限部位を含有するようにその３’末端の近くで修飾されていてもよい。これは、そのリーダー配列の構造遺伝子への連結を容易にするであろう。
【００６４】
酵母の形質転換手順は公知である。かかる手順の１つは、Ｈｉｎｎｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１９２９， １９７８ に記載されている。Ｈｉｎｎｅｎらの手順は、選択培地中でＴｒｐ+形質転換体を選択するものであって、その選択培地は、０．６７％酵母窒素原基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
【００６５】
発現を誘発するために、ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を“リッチ”培地中で生育させてもよい。リッチ培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなる培地である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消費され尽くした時に起こる。
【００６６】
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えｃＬＤＨ−Ｂポリペプチドを発現することもできる。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから得ることができる。普通に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２等から誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。哺乳動物宿主細胞内で用いるための発現ベクターは、例えば Ｏｋａｙａｍａ 及び Ｂｅｒｇ（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２８０，
１９８３）の方法で構築することができる。
【００６７】
ｃＬＤＨ−Ｂタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ｃＬＤＨ−Ｂタンパク質が発現する条件下で培養することによって組換えｃＬＤＨ−Ｂタンパク質を産生できる。産生された組換えｃＬＤＨ−Ｂサブユニットは、四量体を形成してｃＬＤＨ−Ｂ4アイソザイムとなる。次いで、用いた発現系に依存して、組換えｃＬＤＨ−Ｂタンパク質を培養培地又は細胞抽出液から回収する。ｃＬＤＨ−Ｂタンパク質を精製する操作は、用いた宿主細胞の型及びｃＬＤＨ−Ｂタンパク質が培養培地中に分泌されるかどうかといった要因に応じて適宜決定してもよい。
【００６８】
細菌宿主で産生した組換えｃＬＤＨ−Ｂタンパク質は、通常宿主細胞内に存在するので、まず細胞を崩壊し、細胞沈殿物または上澄み液を遠心分離や濾過等で分離した後、濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ精製又はゲル濾過精製の適当な組み合わせにより単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもよい。微生物細胞宿主の破壊は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤の使用を含む適当な慣用的方法により行うことができる。
【００６９】
形質転換酵母宿主を用いるときは、好ましくはｃＬＤＨ−Ｂ4を分泌ポリペプチドとして発現させることができる。これにより精製が簡単になる。酵母宿主細胞発酵上清に分泌された組換えポリペプチドは、Ｕｒｄａｌ ら（Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ． ２９６：１７１， １９８４）により開示された方法と類似の方法により精製することができる。 Ｕｒｄａｌらは、組換えｃＬＤＨ−Ｂ4の精製のための分取ＨＰＬＣカラムでの２連続逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。
【００７０】
得られた組換え変異型ＬＤＨ−Ｂ4タンパク質は、例えば臨床検査薬の分野において、１）生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）等の種々のアミノトランスフェラーゼの酵素活性を測定する場合や、２）尿素等の種々の基質をピルビン酸に変換し、生成ピルビン酸のＵＶ測定法における共役酵素として、また、３）検体中の内因性ピルビン酸の消去等に使用することができる。特に、１）のＬＤＨを使用したアミノトランスフェラーゼ活性の測定は、臨床検査の一つとして広く行われており、本発明により大量に得られた組換えｃＬＤＨ−Ｂ4タンパク質を使用することが可能となった。
【００７１】
本発明の組換えｃＬＤＨ−Ｂ4を使用したトランスアミナーゼの酵素活性の測定およびＡＬＴ活性の算出は、前述の特開平８−２８９、臨床検査提要 第３１版」 １９９８年 金原出版株式会社 ｐｐ．６４３−６４９等に記載の原理に従った公知の方法によって行うことができる（例えば、実施例３に記載の方法）。
参考文献
１． 特開平８−２８９
２．「液状ＡＬＴ測定試薬に好適な耐熱型乳酸脱水素酵素」 臨床化学 第２３巻補冊２号 １９９４年 １４１ｂ）
３． 特開平９−２６２０８９
４． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１０，Ｎｏ．２０，ｐ．６４８７−６５００，１９８２
５． 臨床検査提要 第３１版」 １９９８年 金原出版株式会社 ｐｐ．６４３−６４９等
【００７２】
【実施例】
参考例１ ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の熱安定性
特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質および天然のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質の熱安定性、特に溶液中、低濃度の状態での耐熱性について検討した。具体的には、トランスアミナーゼ活性を測定するための構成成分として使用されるＬＤＨ量は通常１−１０Ｕ／ｍＬ程度の範囲である。よって、組換えＬＤＨ−Ｂ4比活性（１３６Ｕ／ｍｇタンパク質）より、熱安定性（および溶液安定性）はＬＤＨタンパク質濃度として０．００７−０．０７ｍｇ／ｍＬの範囲で測定すべきであると換算される。
【００７３】
よって、下記表に示した各濃度になるように、特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤＨ−Ｂ4タンパク質（１０Ａ、２０７Ｖ）Ｈ−Ｂ、および天然のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質（１０Ｔ、２０７Ａ）を５０ｍＭ リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解した試料を調製した。試料調製直後と、３０分間の熱処理後におけるＬＤＨ活性を測定し、残存活性率を調べた。ＬＤＨ活性は、５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−０．８ｍＭ ピリビン酸ナトリウム−０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基質混合液として用い、測定温度２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ+生成量を１単位とした。
【００７４】
【表１】
表１ ６５℃熱安定性（残存活性率）とＬＤ−Ｂ4タンパク質濃度との関係
試料中のＬＤ―Ｂ4 組換えＬＤＨ−Ｂ4 天然ＬＤＨ−Ｂ4
タンパク質濃度 （１０Ａ、２０７Ｖ） （１０Ｔ、２０７Ａ）
１ｍｇ／ｍＬ ９８％ ９０％
０．１ ２０％ ９０％
０．０１ １％ ９０％
０．００１ ＜１％ ８５％
表１に示したように、組換えＬＤＨ−Ｂ4（１０Ａ、２０７Ｖ）は１ｍｇ／ｍｌでは耐熱性を示すが、０．１ｍｇ／ｍｌ以下では残存活性率が２０％と低下し、０．００１ｍｇ／ｍｌでは１％以下と実質的にほぼ失活してしまった。
【００７５】
実施例１ アミノ酸置換による変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）の作製
ａ．Ｖ２０７Ａ発現プラスミドの構築
本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）は、前述した特開平９−２６２０８９号記載のニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子（１０Ａ、２０７Ｖ）を基に作製した。具体的には、特開平９−２６２０８９号記載のニワトリＬＤＨ−Ｂ（１０Ａ、２０７Ｖ）は、２０７番目アミノ酸残基がバリンであるので、これをアラニンに変換するように、遺伝子に突然変異を施した。
【００７６】
具体的には、特開平９−２６２０８９号のニワトリＬＤＨ−Ｂ遺伝子（１０Ａ、２０７Ｖ）をコードするｃＤＮＡクローン（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−ＣＬＤＢ８−Ｅ／Ｂ）を含む環状２本鎖プラスミドを鋳型とし、先ず、当該鋳型の変異を導入したい箇所（２０７Ｖ）に対応する前後１０塩基程度からなる２重鎖のオリゴヌクレオチド対をＤＮＡ合成機により合成した。プライマーの具体的な配列は下記の通りである。
【００７７】
【化４】
【００７８】
次いで、得られた上記変異を含む遺伝子を含むプラスミドを用いて、市販のＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換し、変異プラスミド（「ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−Ｖ２０７Ａ−Ｅ／Ｂ」と呼ぶ）を回収した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ− Ｖ２０７Ａ −Ｅ／Ｂを制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで消化し、Ｖ２０７ＡをコードするＤＮＡを断片化した。ＤＮＡ断片を抽出し、ｐＴＲＰ発現プラスミド（Ｕｃｈｉｄａ Ｋ．ら，１９９５ Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ． Ｖｏｌ．２３７（１−２），ｐｐ．４３−５８）のＥｃｏＲＩ―ＢａｍＨＩ部位に連結挿入し、発現プラスミド（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ）を作製した。市販ＪＭ１０９コンピテントセルをｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａにて形質転換し、組換えＶ２０７Ａタンパク質を発現する形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９）を得た。ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＲＰ−ｃＬＤＨとして、平成１３年１月１６日に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７４３１で、経済産業省産業技術総合研究所生命工学工業技術研究所（〒３０５−８５６６ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に微生物の国際寄託に関するブタペスト条約に基づき国際寄託された。
【００７９】
ｂ．形質転換体の培養
大腸菌形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９）を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地プレート上でコロニー化し、白金耳にて単一コロニーを１００ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地が入ったフラスコにて３７℃、終夜振盪培養した。得られた菌体懸濁液より、遠心分離にて菌体を集め、さらに超音波破砕処理を行い発現した組換えタンパク質を抽出した。
【００８０】
本発明の（１０Ａ、２０７Ａ）変異型タンパク質（本明細書中、以下、簡便のため「Ｖ２０７Ａ）と呼称する）は、超音波破砕処理にて可溶性分画に回収された。培養液あたり５Ｕ／ｍＬの活性発現量であった。ＬＤＨ活性は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）−０．８ｍＭ ピリビン酸ナトリウム−０．３ｍＭ ＮＡＤＨを基質混合液として用い、測定温度２５℃で１分間あたり１μｍｏｌのＮＡＤ+生成量を１単位とした。
【００８１】
ｃ．Ｖ２０７Ａタンパク質の精製
上記の超音波破砕処理した遠心分離上清を出発材料とし、ＤＥＡＥ−ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅゲルを用いたイオン交換クロマトグラフィー、フェニル−セファロースＣＬ４Ｂを用いた疎水クロマトグラフィー、さらにＵｌｔｒｏｇｅｌ ＡＣＡ４４を用いたゲルろ過クロマトグラフィーを行うことにより、Ｖ２０７Ａタンパク質を精製した。
【００８２】
具体的には、先ずイオン交換クロマトグラフィーで素通り分画に回収されたＶ２０７Ａを疎水クロマトグラフィーにて吸着溶出分画に分離精製した。硫安濃度のグラジエント溶出にて０．５−０Ｍの硫安分画にＶ２０７Ａが回収できた。次いで、ゲルろ過クロマトグラフィーにより分子量１５０，０００のところに位置するＶ２０７Ａを回収した。
【００８３】
大腸菌形質転換体（ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａ／ＪＭ１０９）より最終的に得られたＶ２０７Ａタンパク質精製標品の理化学的性質を下記の表２にまとめた。
【００８４】
【表２】
酵素反応： ピルビン酸＋ＮＡＤＨ⇔Ｌ−乳酸＋ＮＡＤ+
分子量： １５０，０００（ゲルろ過、４量体）
作用ｐＨ： ｐＨ５−８（２５℃測定）
ｐＨ安定性： ｐＨ５−９（６０℃、３０分間の熱処理）
熱安定性： ６５℃まで失活しない（ｐＨ７、３０分間の熱処理）
補酵素特異性： ＮＡＤＨを１００％とした時、ＮＡＤＨアナログであるＡＰＡＤＨとの反応性は１０％程度
また、Ｖ２０７Ａは比活性３５０Ｕ／ｍｇを示し、特開平９−２６２０８９号記載のものに比べ２．５倍の高比活性型となった。
実施例２ Ｖ２０７Ａタンパク質の熱安定性
実施例１で得られたＶ２０７Ａ精製タンパク質を１Ｕ／ｍＬ（０．００３ｍｇタンパク質／ｍＬ）になるように５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、４５℃、５５℃、６５℃、７５℃の各温度にて３０分間熱処理をおこなった。また、同様に５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）にて溶解したＶ２０７Ａについても同様に熱処理を行った。
【００８５】
熱処理後のＶ２０７Ａタンパク質（１０Ａ、２０７Ａ）の残存活性率（％）をニワトリ心臓から精製した天然酵素タンパク質（オリエンタル酵母製）（１０Ｔ、２０７Ａ）および特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤ−Ｂ４タンパク質（１０Ａ、２０７Ｖ）を対照品として比較した。結果を図１に示す。
【００８６】
図１より、Ｖ２０７Ａは対照品２者と比べて優れた耐熱性を示した。例えば、０．００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で９３％の残存活性率を示した。また、ｐＨ９．０の条件下でも０．００３ｍｇ／ｍｌ、５５℃、３０分間の熱処理で９８％、６５℃の熱処理で９３％の残存活性率を示した。
実施例３ Ｖ２０７Ａタンパク質を構成成分とする活性測定試薬を用いたヒトプール血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性測定
ａ．アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性測定試薬の調製
以下の液状試薬Ｒ−１及びＲ−２を調製し、以下のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）活性の測定に使用した。
【００８７】
【表３】
Ｒ−１試薬（ｐＨ９．２）
１０ｍＭ トリス
０．４５ｍＭ ＮＡＤＨ
３２００Ｕ／Ｌ 組換えＬＤＨ（Ｖ２０７Ａ）
１８１ｍＭ Ｌ−アラニン
１ｍＭ ＥＤＴＡ−２ナトリウム
０．１％アジ化ナトリウム
Ｒ−２試薬（ｐＨ７．２）
１６０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
４７ｍＭ ２−オキソグルタル酸
１．２Ｍ Ｌ−アラニン
３ｍＭ ＥＤＴＡ−２ナトリウム
０．１％ アジ化ナトリウム
ｂ．ＡＬＴの活性測定
ＡＬＴ活性測定方法およびＡＬＴ活性の算出方法については、「臨床検査提要第３１版」 １９９８年 金原出版株式会社 ｐｐ．６４３−６４９に記載の原理に従った。具体的には先ず、測定試料（ヒトプール血清）を１５μＬ、Ｒ−１試薬を２４０μＬ、Ｒ−２試薬を１２０μＬを混合し、以下の式で示される反応を開始した。
【００８８】
【化５】
【００８９】
【化６】
Ａ２／分： 対照（生理食塩水）を用いた盲験の場合の反応開始後の１分間あたりの３４０ｎｍにおける吸光度減少量
６．３ × １０3： ＮＡＤＨの分光吸光係数（ＮＡＤ+の１モル濃度あたり）
試料液量、Ｒ１液量およびＲ２液量の単位はμＬである。
結果を図２に示す。ＡＬＴ測定における直線性を、原点を通る直線回帰より理論値の±５％範囲と設定すると、本実施例のａで調製した液状試薬の場合は、０−２，０００Ｕ／Ｌ（３７℃）と良好な結果となった。調製試薬を４５℃で２日間虐待保存し、保存後の劣化度をＡＬＴ直線性より求めた。その結果、４５℃２日間虐待保存後でもＡＬＴ直線性は初期性能を維持していた。
【００９０】
また、液状試薬の構成成分として共存する補酵素ＮＡＤＨの保存安定性についてもその残存率を調べた。具体的にはＮＡＤＨをＬＤＨタンパク質と混合して試薬Ｒ−１を調製した直後の初期吸光度に対する保存経過後の吸光後の割合として試算した。
【００９１】
【化７】
ＮＡＤＨ残存率＝（保存経過後の吸光後）／（試薬調製直後）
その結果、本発明のＶ２０７Ａタンパク質は、天然酵素タンパク質（１０Ｔ、２０７Ａ）および特開平９−２６２０８９号の組換えＬＤ−Ｂ４タンパク質（１０Ａ、２０７Ｖ）と比較して、高い成分安定性を示した。４５℃で２日間虐待保存後の、ＬＤ活性およびＮＡＤＨ残存率の結果を図３にまとめた。
【００９２】
【発明の効果】
本発明の変異型ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットは、耐熱性および溶液安定性に優れている。よって、本発明のＬＤＨの産業的な量産化の達成により、より安定な組換え型乳酸デヒドロゲナーゼが供給が可能となった。特に臨床面において生体液中のトランスアミナーゼ活性を汎用的な測定を可能とした。
【００９３】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）の熱安定性およびｐＨ安定性を示す。
【図２】図２は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）のＡＬＴ測定における直線性能を示す。
【図３】図３は、本発明の変異酵素（１０Ａ、２０７Ａ）の長時間高温保存後の残存活性およびＮＡＤＨ安定性に及ぼす影響を示す。
Claims (12)
- 配列番号１のアミノ酸配列を有するか、または、配列番号１のアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸残基が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し（ただし、配列番号１のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０に相当する位置のアミノ酸残基はアラニンであり、そして、アミノ酸番号２０７に相当する位置のアミノ酸残基はアラニンである）、かつ乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有する、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質。
- 配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質。
- 補酵素ＮＡＤＨの存在下でピルビン酸を乳酸に変換する活性を有し、そしてゲル濾過クロマトグラフィーで４量体の状態で分子量が約１５０，０００であるニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質であって、以下の性質：
１）０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７、６５℃、３０分間の熱処理で失活せず；そして
２）ＮＡＤＨ分解酵素を実質的に含まない
を有することを特徴とする、請求項１または２に記載のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質。 - さらに０．００３ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ９、５５℃、３０分間の熱処理でも失活しないという性質を有する、請求項３に記載のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質。
- 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質をコードする核酸。
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質をコードする、請求項５に記載の核酸。
- 配列番号２に記載の塩基配列を有する、請求項５または６に記載の核酸。
- 請求項５ないし７のいずれか１項に記載の核酸を含む、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を発現するためのベクター。
- ｐＴＲＰ−Ｖ２０７Ａである、請求項８に記載のベクター。
- 請求項８または９のベクターによって形質転換された宿主細胞。
- 請求項８または９のベクターによって形質転換された宿主細胞を、前記ベクターによるニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質の発現に適した条件下で培養することを含む、ニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質の製造方法。
- 請求項１ないし４のいずれか１項に記載のニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型サブユニットタンパク質を構成成分とするニワトリ乳酸デヒドロゲナーゼＢ型タンパク質を含む、トランスアミナーゼ測定用試薬。
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