JP2023524097A - 大腸菌を用いた全長抗体の作製方法 - Google Patents

Abstract

本開示は大腸菌において全長抗体を約２００ｍｇ／Ｌ以上の収量で生産する方法を提供する。前記大腸菌細胞は、典型的には、酸化的な細胞質を有し、これはジスルフィド結合を有するタンパク質の三次元構造及び安定性を維持する上で役立つ。いくつかの場合には、大腸菌を培養することから得られる生産されたＨＣの量とＬＣの量とのモル比は、約１：１～約１：３の範囲内（例えば、約１：１～約１：２．５、約１：１～約１：２）である。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年４月３０日に出願された米国仮出願第６３／０１８，４３６号の優先権及び利益を主張し、前記仮出願は、全ての目的のために参照によりその全体が本開示に取り込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本開示に取り込まれる。２０２１年４月２９日に作成された前記ＡＳＣＩＩのコピーは、０９１２００－１２４６０４３－００６８１０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前で、サイズは８１，３５５バイトである。

全長抗体は、様々なヒト疾患を治療する上で主要な役割を果たす。抗体治療の需要が高まるにつれて、全長抗体の増強され、かつより安価な生産のためのホスト系の開発もより重要になってきた。これまでに承認されたほとんど全ての治療用抗体は、主に哺乳動物ホストで生産されている。これらの生産方法には、高い製造コスト及び長期培養などの欠点がある。細菌及び酵母などの、代わりの生産系が検討されてきた。とはいえ、これらの系はそれら特有の限界がある。例えば、これらの系で生産されるタンパク質は、多くの場合、リフォールディング及びいくつかの生体膜を通しての分泌を必要とし、抗体の三次元形状を維持するために必須のジスルフィド結合を欠いている。また、同じ抗体の重鎖及び軽鎖を適切な比率で発現させて、全長抗体のヘテロ四量体形態を最大の収量で生産できることを確実化することも依然として目標のままである。したがって、商業的生産への需要を満たすために、全長抗体を高収率で生産する要求が依然として存在する。

本開示は、重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む全長抗体を高収率で生産する方法を提供する。前記方法は、前記ＨＣ及び前記ＬＣを生産するのに許容可能な条件下で前記ＨＣのコード配列及び前記ＬＣのコード配列を発現する大腸菌細胞を培養すること、を含み、前記全長抗体は、少なくとも２００ｍｇ／Ｌの量で生産され得る。いくつかの実施形態では、前記全長抗体は、培養物中の大腸菌細胞から生み出された湿潤細胞ペレットの重量に対して、０．０５％～２０％、０．０５％～１０％、０．０５％～５％、又は０．０５％～１％の範囲内の湿重量パーセントで生産される。いくつかの実施形態では、前記大腸菌細胞の少なくとも一部が酸化的な細胞質を含有する。いくつかの実施形態では、前記方法は、プラスミドを前記大腸菌株に形質転換することを含む。いくつかの実施形態では、前記ＨＣ及び前記ＬＣは前記大腸菌の細胞質で生産される。いくつかの実施形態では、前記方法は、生産された前記ＨＣ及び前記ＬＣを非還元的条件下でアセンブリーして、全長抗体を形成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記大腸菌からの生産された前記ＨＣと生産された前記ＬＣとのモル比が、約１：１～約１：３である。

いくつかの実施形態では、ＨＣ、ＬＣ、又はその両方の発現が、プロモーター、例えば、Ｔ７プロモーター、又はＴ７プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーター、によって制御される。いくつかの実施形態では、前記プラスミドはバイシストロン性オペロンを含み、前記バイシストロン性オペロンは、ＨＣのコード配列及びＬＣのコード配列を含む。前記バイシストロン性オペロンは、ＨＣ及びＬＣの両方の発現をドライブするプロモーターを含んでいてもよく、前記プロモーターはＴ７プロモーター、又はＴ７プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーターである。いくつかの実施形態では、前記バイシストロン性オペロンはＴ７ターミネーターを含む。いくつかの実施形態では、ＨＣ及びＬＣをコードする前記プラスミドは、ＨＣのための第１のモノシストロン性オペロン及びＬＣのための第２のモノシストロン性オペロンを含む。いくつかの実施形態では、前記第１のオペロンは配列番号１８～２０のいずれかから選択される配列を含むリボソーム結合部位を含み、また、前記第２のモノシストロン性オペロンは配列番号１７の配列を含むリボソーム結合部位を含む。いくつかの実施形態では、前記第１のモノシストロン性オペロン又は前記第２のモノシストロン性オペロンは、それぞれ独立に、Ｔ７プロモーター、又はＴ７プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーター、を含む。いくつかの実施形態では、前記第１のモノシストロン性オペロン又は前記第２のモノシストロン性オペロンは、それぞれ独立して、Ｔ５プロモーター、又はＴ５プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーター、を含む。いくつかの実施形態では、前記第１のモノシストロン性オペロン及び前記第２のモノシストロン性オペロンは、同じプロモーターを含む。いくつかの実施形態では、前記第１のモノシストロン性オペロン及び前記第２のモノシストロン性オペロンは、異なるプロモーターを含む。

大腸菌細胞は、ＨＣの翻訳のための第１のリボソーム結合部位及びＬＣの翻訳のための第２のリボソーム結合部位を含んでいてもよく、前記第１のリボソーム結合部位及び前記第２のリボソーム結合部位は、前記大腸菌から生産されるＨＣ及びＬＣのモル比が１：１～１：３の範囲内になるように選択される。いくつかの実施形態では、前記第１のリボソーム結合部位が、配列番号１７～１９からなる群から選択される配列を含み、前記第２のリボソーム結合部位は、配列番号２０～２３からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、前記第１のリボソーム結合部位が、配列番号１７又は配列番号１８の配列を含む。

いくつかの実施形態では、全長抗体のＨＣ及び／又はＬＣは、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む。例えば、前記非天然アミノ酸は、パラメチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ＡＥＫ、又はｐＡｃＦであってもよい。例えば、ＨＣのコード配列及び／又はＬＣのコード配列は、少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンを有するように改変されてもよく、ここで、前記非天然アミノ酸コドンは２０種類の天然アミノ酸のうちの１つの組み込みを生じない。前記少なくとも１つの非天然アミノ酸は、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸コドン、例えば、アンバーコドン（ＴＡＧ）に相補的なアンチコドンを含むｔＲＮＡに積ませる（charge)することによって導入されてもよい。いくつかの実施形態では、前記非天然アミノ酸のうちの少なくとも１つの３’側に隣接するコドンが、ＨＣ又はＬＣの発現を促進するためにコドン最適化されている。

ある特定の実施形態では、この方法を使用して生産することができる全長抗体は、Ｂ１０抗体、Ｈ０１抗体、７２１９抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、抗Ｔｉｍ３抗体、又は抗ＬＡＧ３抗体である。いくつかの実施形態では、前記Ｂ１０抗体のＨＣのコード配列は、配列番号１に対する変異を含み、前記変異の結果、天然アミノ酸のコドンが非天然アミノ酸コドンに置換され、置換される前記天然アミノ酸はＦ４０４、Ｙ１８０、及びＦ２４１から選択される１つ又は複数のアミノ酸である。非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸コドンに相補的なｔＲＮＡに積ませる（charge）ことにより、前記ＨＣ又は前記ＬＣに導入され得る。いくつかの実施形態では、前記Ｂ１０抗体又は前記抗ＨＥＲ２抗体のＬＣのコード配列は、配列番号２に対する変異を含み、前記変異の結果、天然アミノ酸のコドンが非天然アミノ酸コドンに置換され、ここで前記天然アミノ酸はＫ４２又はＥ１６１である。

いくつかの実施形態では、全長ＦｏｌＲａ－Ｂ１０ ＩｇＧ抗体を生産する方法は、ＦｏｌＲａ－Ｂ１０ ＩｇＧを発現するコンストラクトで大腸菌ホスト株を形質転換することを含み、ＨＣコード配列のＳ１８１コドンは、ＡＧＣ又はＡＧＴである。

いくつかの実施形態では、前記方法は、前記全長抗体の前記ＨＣ又は前記ＬＣ上の前記非天然アミノ酸にリンカーを介して弾頭部分（ｗａｒｈｅａｄ ｍｏｉｅｔｙ）を共有結合的に連結させることをさらに含む。

図１は、ＦｏＲａ Ｂ１０野生型（ＷＴ）ＩｇＧのための重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を共発現するＳｈｕｆｆｌｅ株及びＳｎｕｇｇｌｅ株からの細胞ライセートにおけるタイターの比較を示し、例えばｔｒｘＡ遺伝子の欠失及び野生型ａｈｐＣ遺伝子の存在を含め、Ｓｎｕｇｇｌｅに存在する追加の変異は高レベルのＩｇＧ合成に不可欠であることを示している。

図２は、０個、２個、又は４個のｐＡＭＦ非天然アミノ酸及び示されたＳ１８１コドンを用いて生産されたＦｏｌＲａ－Ｂ１０ ＩｇＧについての、細胞ライセートにおけるタイターの比較を示す。「ＤＡＲ０」は非天然アミノ酸を含まないＢ１０ ＩｇＧを表す。

図３は、非還元的条件下でＣａｌｉｐｅｒバイオアナライザーによって測定された、ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）による一晩の再アセンブリー後の、０個、２個、又は４個のｐＡＭＦ非天然アミノ酸を用いて生産されたＦｏｌＲａ－Ｂ１０ ＩｇＧのアセンブリーの比較を示す。

図４は、培地中に適切な非天然アミノ酸が存在する場合及び存在しない場合におけるＢ１０－Ｆ４０４ｐＡｃＦ及びＢ１０－Ｆ４０４ＡＥＫの発現を示す。非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）が存在しない場合におけるタイターが低いことは、全長ＩｇＧの生産にはアンバー・サプレッション（ａｍｂｅｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）のためのＮＮＡＡが必要であることを示している。

図５は、ＤＢＣＯ－メイタンシン薬物リンカーＳＣ２３６にコンジュゲーションされたＢ１０ Ｆ４０４ｐＡＭＦのＦｃフラグメントのデコンボリューションされたＬＣＭＳスペクトルの結果を示す。観測された主な種は、コンジュゲートの理論質量が２５２５８．０４Ｄａであるのに対して２５２５７．９７Ｄａの質量を有する。未コンジュゲーションＦｃフラグメントの理論上の質量である２３９７４．１４Ｄａ付近には種は観察されなかった。このコンジュゲートの計算されたコンジュゲーション効率は９９．９９７％である。

図６は、陽イオン化モードで実行された精製トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）ＬＣ Ｋ４２ｐＡｃＰｈｅ Ｅ１６１ｐＡｃＰｈｅのＬＣＭＳの結果を示す。２×ｐＡｃＰｈｅ ＬＣ産物について予想される質量に対応する１つのクリーンなピークがある。

図７は、陽イオン化モードで実行した、ＰＥＧ８－アルコキシアミンとのオキシムライゲーション後の精製トラスツズマブＬＣ Ｋ４２ｐＡｃＰｈｅ Ｅ１６１ｐＡｃＰｈｅのＬＣＭＳの結果を示す。コンジュゲーション効率は、２３６９２ＡＭＵ、２４０７３ＡＭＵ、及び２４４５５ＡＭＵのピークを使用して計算した。これは、それぞれ０ＰＥＧ８産物、１ＰＥＧ８産物、及び２ＰＥＧ８産物の予想質量に相当する。Ａ）にオキシムライゲーション前のＬＣを示し、Ｂ）にオキシムライゲーション後のＬＣを示す。計算されたコンジュゲーション効率は約９８％であった。

図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。 図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。 図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。 図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。 図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。 図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。 図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。 図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。 図８Ａ～図８Ｉは、本開示中に開示される方法で使用できる例示的な非天然アミノ酸を示す。

Ｉ．序論
本開示は、大腸菌細胞において抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の両方を発現させることによって全長抗体を生産する方法を提供する。本発明の方法は、全長抗体の高収量での、例えば培地１リットル当たり２００ｍｇを超えるタンパク質の濃度での生産を可能にする特徴の組み合わせを利用する。

大腸菌細胞は典型的には酸化的な細胞質を有し、該酸化的な細胞質は抗体の三次元構造及び安定性を維持するために必要なジスルフィド結合の形成を助ける。前記方法は、強力なプロモーターを使用して、ＨＣ、ＬＣ、又はその両方の転写をドライブする。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、Ｔ７プロモーター又はＴ５プロモーターである。いくつかの場合には、前記プロモーターの強度は、Ｔ７プロモーター又はＴ５プロモーターの強度と実質的に類似している。いくつかの場合には、前記方法は、最適化されたリボソーム結合部位を使用して、抗体のＨＣ及びＬＣの効率的な翻訳及び／又はアセンブリーを確実化する。

本発明者らは、重鎖（ＨＣ）と軽鎖（ＬＣ）との均整の取れた（proportional）発現、すなわち最適範囲内にあるＨＣとＬＣとの発現量の比率、を維持することで、適切にアセンブリーされた全長抗体の収量を増やすことができることを見出した。例えば、大腸菌培養物からの生産されたＨＣとＬＣとのモル比を適切な範囲内、例えば１：１～１：３、１：１～１：２．５、又は１：１～１：２で維持することが望ましい。いくつかの手法では、ＨＣ及びＬＣの発現を最適範囲比内に維持することは、ＨＣ及びＬＣの転写レベルを制御できる１つ又は２つのプロモーターを使用することによって達成される。いくつかの手法では、大腸菌培養物におけるＨＣ及びＬＣの均整の取れた発現は、改変リボソーム結合部位を使用してＨＣ及びＬＣの翻訳効率を制御することによって達成される。例示的なトランボソーマル（tranbosomal）結合配列は本開示中に与えられている。

いくつかの手法では、ＨＣコード配列及びＬＣコード配列の少なくとも１つが少なくとも１つの非天然アミノ酸コドン（例えば、アンバーコドン）を含むように改変されるが、ただしこの非天然アミノ酸コドンは２０種類の天然アミノ酸のうちの１つを組み込みを生じないものとする。これらの非天然アミノ酸は、部位特異的に１つ又は複数の生物学的に活性な付加物と結合するための潜在的（potential）な反応基として機能し得る。

本開示は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６０３４５号の内容全体を参照により取り込む。

ＩＩ．定義
別段の定義がない限り、本開示で使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Lackie, DICTIONARY OF CELL AND MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier (4th ed. 2007)、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989)、及びAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley and Sons (Hoboken, NY 1995)を参照のこと。

本開示で使用されるとき、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎｄ）」、及び「前記（ｔｈｅ）」は、そうではないことを文脈が明確に指示しない限り、複数の指示対象をも包含する。したがって、例えば、「ある（ａ）細胞」との記載は複数の当該細胞を包含し、「前記（ｔｈｅ）タンパク質」との記載は、１種又は複数種のタンパク質及び当業者に既知であるその均等物を指すことを包含する、等々である。本開示で使用される全ての技術用語及び科学用語は、そうではないことが明確に指示されていない限り、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。

「約」という用語は、参照値の－／＋１０％の範囲を示す。例えば、「約１０」は、１０－／＋１０×１０％＝９～１１を意味する。

そうではないことが特に明記されない限り、「収量」又は「タイター」という用語は、培地の体積に対する生産された抗体の量（ＨＣ及びＬＣの合計量を含む）を指す。例えば、２００ｍｇ／Ｌは、培地１リットルあたり２００ｍｇの抗体が生産されることを意味する。

「大腸菌株」という用語は、大腸菌のサブタイプを指し、その細胞（複数）はある特定の生物学的形態を持ち、ある特定の遺伝的構成を共有している。「酸化的な細胞質を有する大腸菌株」という用語は、その株に由来する細胞の一部又は全部が各々酸化的な細胞質を有することを指す。

「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸、並びに天然アミノ酸と類似のやり方で機能するアミノ酸、例えばプロリン、アミノ酸アナログ、及びアミノ酸ミメティックなどのアミノ酸を指す。

「天然アミノ酸」又は「天然にコードされるアミノ酸」という用語は、当業者に既知のタンパク質構成アミノ酸を指す。それらには、２０種類の一般的アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）並びにさほど一般的ではないがピロリジン及びセレノシステインが含まれる。天然にコードされるアミノ酸には、プレニル化アミノ酸、イソプレニル化アミノ酸、ミリストイル化アミノ酸、パルミトイル化アミノ酸、Ｎ結合グリコシル化アミノ酸、Ｏ結合グリコシル化アミノ酸、リン酸化アミノ酸、及びアシル化アミノ酸などの２２種類の天然アミノ酸の翻訳後バリアントが含まれる。

「非天然アミノ酸」という用語は、タンパク質構成アミノ酸又はその翻訳後修飾バリアントではないアミノ酸を指す。特に、この用語は、２０種類の一般的アミノ酸、ピロリジン、セレノシステイン、又はそれらの翻訳後修飾バリアントのうちの１つではないアミノ酸を指す。

「アミノアシル化」又は「アミノアシレート」という用語は、化合物にアミノアシル基を付加することの結果として、正しいアミノ酸をｔＲＮＡに積ませる（charge)完全なプロセスを指す。本発明に関する場合、アミノアシル化を受ける又はアミノアシル化されたｔＲＮＡとはアミノ酸が積まれた（charged with）ｔＲＮＡであり、アミノアシル化を受ける又はアミノアシル化されたアミノ酸とはｔＲＮＡ分子に積まれた（charged to）アミノ酸である。

「アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ」又は「ｔＲＮＡシンテターゼ」又は「シンテターゼ」又は「ａａＲＳ」又は「ＲＳ」という用語は、アミノ酸とｔＲＮＡ分子との間の共有結合的連結を触媒する酵素を指す。これにより、エステル結合を介して結合したそれぞれのアミノ酸を有するｔＲＮＡ分子であるアミノアシル化ｔＲＮＡ分子が生じる。

ｔＲＮＡの文脈における「積まれた（charged）」という用語は、アミノ酸によるｔＲＮＡのアミノアシル化を指し、該アミノ酸は天然及び非天然のどちらであってもよく、アミノアシル化は、リボソームがｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチドにアミノ酸を組み込むことを可能にする。

「生物学的に活性な付加物」という用語は、細胞又は生物において機能を果たし得る化学物質、分子、又は試薬を指す。例えば、前記機能には、細胞増殖、アポトーシス、翻訳後修飾（例えば、リン酸化）、細胞シグナル伝達活性化、細胞シグナル伝達不活性化、細胞死、又は細胞標識が含まれ得る。

タンパク質翻訳の文脈における「選択的組み込み」という用語は、特定のアミノ酸（例えば、特定の非天然アミノ酸）を、タンパク質の所望の機能を妨げることなく、タンパク質の配列内の所望の所定アミノ酸位置に含ませる又は導入することを指す。

「優先的にアミノアシル化する」という用語は、別のアミノ酸分子と比較して、所定のアミノ酸分子により特定のｔＲＮＡ分子をアミノアシル化（チャージ）するｔＲＮＡシンターゼの優先性を指す。換言すれば、ｔＲＮＡシンターゼは、天然アミノ酸よりも非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を選択的にアミノアシル化することが可能である。例えば、ｔＲＮＡシンターゼは、他の任意の又は全ての天然アミノ酸と比較して、特定のｎｎＡＡを９０％を超える頻度（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）でアミノアシル化することができる。

「天然アミノ酸」という用語は、タンパク質の前駆体であるアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｇ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（Ｖａｌ、Ｖ）などの遺伝暗号によってコードされる２０種類のアミノ酸のうちの任意のものを指す。

アミノ酸は、本開示において、一般に知られている三文字記号又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨される一文字記号で表される場合がある。同様に、ヌクレオチドは、一般に受け入れられている一文字コードによって表される場合がある。

「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ）並びに一本鎖形態若しくは二本鎖形態のそれらのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと類似のやり方で代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。別段の指定のない限り、特定の核酸配列は、明示的に示された配列だけでなく、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、アレル、オルソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列も暗示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択された（又は全ての）コドンの３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)、Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)、及びRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸又はポリヌクレオチドという用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。

「ペプチド」、「タンパク質」、及び「ポリペプチド」という用語は、本開示では互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに加えて、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学的ミメティックであるアミノ酸ポリマーにも適用される。本開示で使用される場合、前記用語は、アミノ酸残基同士が共有ペプチド結合によって連結されている任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、これには全長タンパク質及び切断型タンパク質が含まれる。

「アミノ酸位置での置換」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列の特定の位置におけるアミノ酸残基の変化を指す。例えば、用語「Ｘ２０Ｙ」は、タンパク質のアミノ酸位置２０の野生型（参照）アミノ酸Ｘのアミノ酸Ｙによる置換を指す。

「サプレッション（抑制）コドン」という用語は、所定の位置でポリヌクレオチドに導入され、終止コドン（例えば、アンバー終止コドン、オーカー終止コドン、又はオパール終止コドン）を認識できる特定のｔＲＮＡによって認識されて翻訳が該コドンをリードスルーしてタンパク質を生成することを可能とし、それによって前記終止コドンを抑制するヌクレオチドトリプレットを指す。

「抗体」という用語は、結合タンパク質として機能的に定義され、抗体を生産する動物の免疫グロブリンコード遺伝子のフレームワーク領域に由来すると当業者によって認識されるアミノ酸配列を含むものとして構造的に定義されるタンパク質を指す。抗体は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子のフラグメントによって実質的にコードされる１つ又は複数のポリペプチドからなり得る。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、並びに非常に多様な免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はカッパ又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、免疫グロブリンのクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定義する。

「全長抗体」という用語は、「全長ＩｇＧ」と互換的に使用され、四量体を含む免疫グロブリン（抗体）構造単位を指し、それぞれが２つの同一のポリペプチド鎖ペアから構成され、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤ）とを有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００～１１０又はそれ以上のアミノ酸からなる可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。

抗体は未処理の（intact）免疫グロブリンとして、又は様々なペプチダーゼを用いた消化によって生み出されるよく特徴解析された多数のフラグメントとして存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化してＦ（ａｂ）’２を生産するが、Ｆ（ａｂ）’２はそれ自体はジスルフィド結合によってＶＨ－ＣＨ１に連結された軽鎖であるＦａｂの二量体である。Ｆ（ａｂ）’２は、温和な条件下で還元され得、これはヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊し、それによって（Ｆａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の一部を伴ったＦａｂである（他の抗体フラグメントのより詳細な説明については、Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993)を参照のこと）。様々な抗体フラグメントは未処理の（intact）抗体の消化で定義されるが、当業者は、そうしたＦａｂ’フラグメントが化学的に又は組換えＤＮＡ法を利用することによってde novoで合成されてもよいことを理解するであろう。したがって、本開示で使用される場合、抗体という用語は、全抗体の改変によって生産されるか、又は組換えＤＮＡ法を使用してde novoで合成される抗体フラグメントも包含する。抗体には、単鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）、及び可変重鎖と可変軽鎖とが（直接又はペプチドリンカーを介して）結合して連続ポリペプチドが形成している単鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖ又はｓｃＦｖ）も包含される。単鎖Ｆｖ抗体は、直接連結されているか又はペプチドをコードするリンカーによって連結されているＶＨコード配列とＶＬコード配列とを含む核酸から発現されてもよい、共有結合的に連結されたＶＨ－ＶＬヘテロ二量体である。Huston, et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883。ＶＨ及びＶＬは単一のポリペプチド鎖として互いに連結されているが、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは非共有結合的に会合している。繊維状ファージの表面に発現された最初の機能的抗体分子は一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であったが、これに代わる発現戦略も成功裏なものであってきた。例えば、鎖の１つ（重鎖又は軽鎖）がｇ３キャプシドタンパク質に融合されて、もう一方（complementary）の鎖が可溶性分子としてペリプラズムにエクスポートされるならば、Ｆａｂ分子をファージ上にディスプレイできる。２つの鎖は、同じ又は異なるレプリコン上にコードできる。重要な点は、各Ｆａｂ分子の２つの抗体鎖が翻訳後にアセンブリーして、鎖のうちの一方のｇ３ｐへの結合を介して当該二量体がファージ粒子に組み込まれることである（例えば、米国特許第５７３３７４３号を参照のこと）。ｓｃＦｖ抗体、並びに、抗体のＶ領域からの、自然に集合するが化学的には別個の軽鎖ポリペプチド鎖及び重鎖ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に類似の三次元構造にフォールディングする分子に変換するその他多数の構造は、当業者に既知である（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号、及び第４，９５６，７７８号を参照のこと）。抗体には、ファージにディスプレイされたものも全て包含される（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びジスルフィド結合Ｆｖ（Reiter et al. (1995) Protein Eng. 8: 1323-1331）。抗体には、ダイアンチボディ（ｄｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、ミニ抗体（ｍｉｎｉａｎｔｉｂｏｄｙ）、及びｓｃＦｖ－Ｆｃ融合体も含まれ得る。

「レダクターゼ（還元酵素）」という用語は、チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＢ）、グルタチオン若しくはグルタチオンレダクターゼ（Ｇｏｒ）、又はチオレドキシン若しくはグルタレドキシン系の構成員を還元できるその他任意の酵素を指す。

「チオレドキシン」という用語は、Rietsch and Beckwith (1998) Ann. Rev. Genet. 32: 163に記載されるように、チオレドキシン１（ＴｒｘＡ）及びチオレドキシン２（ＴｒｘＣ）を包含する。チオレドキシンは、その活性部位にモチーフＣｙｓ－Ｘａａ－Ｘａａ－Ｃｙｓ（Ｘａａは任意のアミノ酸を表す）が存在することを特徴とする小さなタンパク質である。チオレドキシンは、（ｔｒｘＢ遺伝子によってコードされる）チオレドキシンレダクターゼ及びＮＡＤＰＨによって再還元される。ｔｒｘＢ変異体では、チオレドキシンは酸化型で蓄積する。ＴｒｘＡはｔｒｘＡ遺伝子によってコードされ、ＴｒｘＢはｔｒｘＢ遺伝子によってコードされる。

「ｇｏｒ」という用語はグルタチオン酸化還元酵素遺伝子を指し、「ＧＯＲ」という用語はグルタチオン酸化還元酵素を指す。

「ＤｓｂＣ」は、ジスルフィド結合異性化を触媒する遺伝子ｄｓｂＣによってコードされるタンパク質である。ＤｓｂＣヌル（ｎｕｌｌ）変異体は、複数のジスルフィド結合を有するタンパク質のフォールディングに欠陥を有する。

「グルタチオン」という用語は、シアノバクテリア、プロテオバクテリア、グラム陽性細菌のいくつかの株、及びミトコンドリアと葉緑体とを有する全ての真核生物を含め多くの生物に見られる高度に保存された低分子量チオールである、γ－Ｌ－グルタミル－Ｌ－システイニル－グリシン（ＧＳＨ）を指す。グルタチオンは、グルタミン酸システインリガーゼ（ｇｓｈＡ）及びグルタチオン合成酵素（ｇｓｈＢ）の２つの酵素の作用によって合成される。グルタミン酸システインリガーゼは、グルタミン酸とシステインとの間の反応を触媒してγ－グルタミルシステインを形成し、このγ－グルタミルシステインはその後グルタチオン合成酵素によってグリシンにコンジュゲーションさせられてＧＳＨを形成する。

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係となるように配置されている場合、別の核酸に「作動可能に連結」されていると言える。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に作動可能に連結されている；あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的には、「作動可能に連結」とは、連結されているＤＮＡ配列同士が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合は、連続していてかつ読み（reading）フェーズにあることを意味する。連結は、都合の良い制限酵素部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来のやり方に従って使用される。

ＡｈｐＣは、アルキルヒドロペルオキシド還元酵素ＡｈｐＣＦの２つのサブユニットのうちの１つである。ＡｈｐＣＦのもう１つのサブユニットは、フラボ酵素ＡｈｐＦである（Tarataglia et al, J. Biol. Chem., Volume 265, 10535-10540, 1990及びSmillie et al, Genbank submission NCBL gi; 216542, 1993）。これら２つのタンパク質は一緒に働く。ＡｈｐＦは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨをＡｈｐＣへの電子供与体として使用し、ＡｈｐＣはリノール酸ヒドロペルオキシドなどの生理学的過酸化脂質及びチミンヒドロペルオキシド及び非生理学的アルキルヒドロペルオキシドをそれぞれの非毒性アルコール形態に還元する。この酵素複合体（又は系）は、酸素及びその誘導体を除去する。ＡｈｐＣは、酸素ラジカルによる損傷から保護するための具体的なアルキルヒドロペルオキシド除去酵素として作用することが示されているが、反応性窒素中間体の除去も起こることが示されている。ＡｈｐＦは、ＡｈｐＣを特異的に還元するために必須の、延長された追加のＮ末端フラグメントを有するチオレドキシンレダクターゼに関連している。

タンパク質を説明するために使用される場合の「サイトゾル（の）」という用語は、タンパク質が細胞のサイトゾルに存在することを指す。

「異種タンパク質又はポリペプチド」とは、ホスト細胞内で通常生産されないタンパク質又はポリペプチドを指す。異種ポリペプチドは、ホスト細胞に導入された核酸から発現されるのならば、ホスト細胞と同じ種及びタイプに由来するものであってもよい。

「外来性ポリペプチド」とは、細胞内で自然に生産されず、細胞内に導入された後に細胞内で発現又は存在するポリペプチドを指す。

「ヌル変異」とは、非機能性遺伝子をもたらす遺伝子中の変異を指す。ヌル変異は、関連する遺伝子産物の生産の完全な欠如を生じさせるものでも、あるいは適切に機能しない産物を生じさせるものでもよい。

「タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ」という用語は、「ジスルフィドイソメラーゼ」又は「ＰＤＩ」という用語と互換的に使用され、ジスルフィド結合の形成及び異性化を触媒する酵素を指す。ＰＤＩは、インビトロデータを通じて、ジスルフィド結合の形成及び再配置の触媒作用に関与していることが示されている。（Creighton et al. (1980) J. Mol. Biol. 142:43、Feedman et al. (1989) Biochem. Soc. Symp. 5:167、及びBardwell and Beckwith (1993) Cell 74:899. Yeast mutants in PDI have been shown to have a defect in the formation of disulfide bonds in carboxypeptidase Y (LaMantia and Lennarz (1993) Cell 74:899）。ホスト細胞における異種タンパク質の発現のためのＰＤＩの使用は、国際公開第９３／２５６７６号、国際公開第９４／０８０１２号を有するＰＣＴ出願、及び欧州公開第５０９，８４１号にさらに記載されている。

「ペプチジルプロリルイソメラーゼ」又は「ＰＰｌａｓｅ」と互換的に使用される「プロリルイソメラーゼ」という用語は、アミノ酸プロリンとのペプチド結合のシス異性体及びトランス異性体を相互変換する、原核生物及び真核生物の両方に見られる酵素を指す。プロリルイソメラーゼ活性を有するタンパク質には、シクロフィリン（例えば、アクセション番号Ｑ１３４２７）、ＦＫＢＰ（例えば、アクセション番号Ｑ０２７９０）、パルブリン（例えば、アクセション番号Ｑ９Ｙ２３７）、Ｔｉｇ（例えば、アクセション番号Ｐ０Ａ８５０）、ＳｌｙＤ（例えば、アクセション番号Ｐ０Ａ９Ｋ９）、及びｙＣｐｒ６（例えば、アクセション番号Ｓ０００００４２０６）が含まれるが、これらに限定されない。

「デアグリガーゼ（ｄｅａｇｇｒｅｇａｓｅ）」という用語は、対象タンパク質の脱凝集及び／又は可溶化を助けるタンパク質シャペロンを指し、ここで前記対象タンパク質は例えば無細菌翻訳系で生産される。そのようなシャペロンは、その作用メカニズムが触媒的ではなく化学量論的であり、新しく合成されたタンパク質がフォールディングしている間において該タンパク質の疎水性パッチを安定化させることによって機能すると考えられているため、高濃度で特に有用である。デアグリガーゼの非限定的な例には、Ｓｋｐ（例えば、アクセション番号Ｐ０ＡＥＵ７）、ＧｒｏＥＬ（例えば、アクセション番号Ｐ０Ａ６Ｆ５）、ＧｒｏＥＳ（例えば、アクセション番号Ｐ０Ａ６Ｆ９）、ＤｎａＫ（例えば、アクセション番号Ｐ０Ａ６Ｙ８）、ＤｎａＪ（例えば、アクセション番号Ｐ０８６２２）、又はＧｒｐＥ（例えば、アクセション番号Ｐ０９３７２）が挙げられる。

タンパク質が「還元状態」にあると記載されている場合、それはタンパク質が自らの酸化型よりも多くの電子を有することを指す。

「酸化的な細胞質」という用語は、基質が還元されるよりも酸化されやすい細胞のサイトゾルを指す。

「チオレドキシンレダクターゼ活性」という用語は、チオレドキシン１を還元状態に維持するチオレドキシンレダクターゼ（ＴＲＸＢ）の能力を指す。

「チオレドキシン１活性」という用語は、チオレドキシン１（ＴＲＸＡ）がリボヌクレオチドレダクターゼを還元状態に維持する能力を指す。

「ペルオキシレダクターゼ活性」という用語は、生理的脂質酸化物を減少させるＡｈｐＣの能力を指す。

「グルタチオンレダクターゼ活性」という用語は、グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）のスルフヒドリル型グルタチオン（ＧＳＨ）への還元を触媒する能力を指す。例えば、グルタチオンレダクターゼ（ＧＯＲ）はグルタチオンレダクターゼ活性を有する。

「組換え」又は「組換え的に」という用語は、生体分子、例えば遺伝子又はタンパク質、であって、（１）天然環境から取り除かれている、（２）遺伝子が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部を伴っていない、（３）天然では結合していないポリヌクレオチドに作動可能に連結されているか、あるいは（４）天然に存在しないものを指す。「組換え」という用語は、クローニングしたＤＮＡ単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、又は異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、並びにそのような核酸によってコードされるタンパク質及び／又はｍＲＮＡに関して使用され得る。

「培養タイター」という用語は、培地中のタンパク質の濃度を指す。例えば、「１３６ｍｇ／Ｌ」の培養タイターは、細胞培地１リットルあたり１３６ｍｇのタンパク質を意味する。

「ライセートタイター」という用語は、細胞ライセート中のタンパク質の濃度を指す。例えば、「０．６５５ｇ／Ｌ」のライセートタイターは、細胞ライセート１リットルあたり０．６５５ｇのタンパク質を意味する。

「重量パーセント」という用語は、細胞培養物から生産されるタンパク質のタイター又は収量を表すために使用される場合、湿重量パーセント、すなわち、タンパク質が抽出される細胞ペレット（未乾燥）の重量に対するタンパク質（例えば、ＩｇＧ）の重量の比率を指す。細胞ペレットは、タンパク質を発現する細胞培養物から収集され、（例えば、実施例６に記載されるような）標準的な技術を使用して溶解されて、タンパク質を放出する。説明用の例として、１００ｇの細胞ペレットを溶解して１リットルのライセートを生成し、これが５０ｍｇのＩｇＧを含むと決定された場合、ＩｇＧの重量パーセントは５０ｍｇ／１００ｇ＝０．０５％である。

ＩＩＩ．ホスト細胞－酸化的な細胞質を有する大腸菌株
本開示における大腸菌株は、当業者に既知の任意の大腸菌株であってよい。いくつかの実施形態では、大腸菌株は、Ａ（Ｋ－１２）株、Ｂ株、Ｃ株、又はＤ株である。いくつかの実施形態において、大腸菌株の少なくともいくつかの大腸菌細胞は各々、抗体中のジスルフィド結合を形成及び維持することが可能なように、酸化的な細胞質を含む。サイトゾルの酸化状態は、典型的には、大腸菌細胞の細胞質の酸化還元電位を測定することによって評価される。細胞の酸化還元状態を測定する方法は周知であり、例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． Ｒｅｌ． Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６３：６９、Ｈｏｌｍｇｒｅｎ ａｎｄ Ｆｇｅｓｔｅｄｔ （１９８２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ６９２６、及びＨｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７： １４９６に記載されるとおりである。いくつかの場合には、大腸菌株のサイトゾルは、－４００ｍＶ～－１００ｍＶ、例えば、－３５０ｍＶ～－１５０ｍＶ、－３００ｍＶ～－２００ｍＶ、又は－２９１ｍＶ～－２５０ｍＶの範囲内の酸化還元電位を有する。

酸化的な細胞質を有する大腸菌株の遺伝子工学による作製
酸化的な細胞質を有する大腸菌株は、対応する野生型大腸菌株と比較して、少なくとも１つのレダクターゼについて低下又は消失した発現又は活性を示すものであってもよい。レダクターゼは、チオレドキシンレダクターゼ、グルタチオンレダクターゼ、及びグルタチオンからなる群から選択される１つ又は複数のレダクターゼであってもよい。いくつかの手法では、前記大腸菌株は、上記に開示したレダクターゼの少なくとも１つにヌル変異を含む。いくつかの実施形態では、前記大腸菌株は、ｔｒｘＢによってコードされるチオレドキシンレダクターゼの活性を欠いている、ｔｒｘＡによってコードされるチオレドキシン１の活性を欠いている、及び／又はｇｏｒによってコードされるグルタチオンレダクターゼの活性を欠いている。いくつかの実施形態では、前記大腸菌株は変異ＡｈｐＣタンパク質を発現し、変異ＡｈｐＣタンパク質はグルタチオンレダクターゼ活性を有する。例示的な一実施形態では、大腸菌株は、ｔｒｘＡ、ｔｒｘＢ、及びｇｏｒにヌル変異を含み、チオレドキシンレダクターゼ活性（ＴｒｘＢ）、チオレドキシン１活性（ＴｒｘＡ）、及びグルタチオンレダクターゼ活性（ＧＯＲ）を欠くＳｎｕｇｇｌｅ株である。また、前記Ｓｎｕｇｇｌｅ株は、自らのシグナル配列を欠くＤｓｂＣを過剰発現し、ペルオキシレダクターゼ活性を欠くがグルタチオンレダクターゼ活性を有する酵素をコードするａｈｐＣ遺伝子のバリアント（ａｈｐＣ^＊）を過剰発現する。これらの酵素の発現が低下していることを確認する方法は周知であり、例えば、以下に開示するとおりである。

大腸菌に変異を導入する方法
いくつかの実施形態では、遺伝子改変、例えば、ｔｒｘＡ及びｔｒｘＢのノックアウトを、部位特異的組換えによって行うことができる。部位特異的組換えは、エンドヌクレアーゼ活性及びリガーゼ活性の両方を有する酵素を使用し、この酵素はＤＮＡ配列の特定の部分を認識し、それを他の任意の対応ＤＮＡ配列に置きかえる。Yang W. and Mizuuchi K., Structure, 1997, Vol. 5, 1401-1406(9)を参照のこと。部位特異的組換え系は、当技術分野で周知であり、例えば、バクテリオλファージからのＩｎｔ／ａｔｔ系、ＰＩバクテリオファージからのＣｒｅ／ＬｏｘＰ系、及び酵母からのＦＬＰ－ＦＲＴ系である。

本開示中に開示される様々なタンパク質に部位特異的組換えを導入する方法の非限定的な例には、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換え系及びＦｌｐ／Ｆｒｔ組換え系が含まれる。両方の系は、当技術分野で周知である。例えば、細菌染色体への部位特異的組込みが報告されている（例えば、Sauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85. 5166-5170 (1988)、Fukushige et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89. 7905-7907 (1992)、Baubonis et al. , Nucleic Acids Research. 21, 2025-2029 (1993)、Hasan et al., Gene, 150. 51-56 (1994)、Golic et al., Cell. 5_9, 499-509 (1989)、Sauer, Mol. Cell. Biolo. 1_, 2087-2096 (1987)、Sauer et al., Methods: Companion to Methods in Enzymol. 4., 143-149 (1992)、Sauer et al., The New Biologist. 2., 441-449 (1990)、Sauer et al., Nucleic Acids Res.. 17. 147-161 (1989)、Qin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91. 1706-1710 (1994)、Orban et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89, 6861-6865 (1992)を参照のこと）。染色体配列の特定の欠失及び再構成並びにλベクターからのプラスミドとしての外来ＤＮＡの切り出しも既知である（例えば、Barinaga, Science. 265, 27-28 (1994)； Sauer, Methods in Enzymol. 225. 890-900 (1993)； Sauer et al., Gene, 70. 331-341 (1988)； Brunelli et al., Yeast,, 1309-1318 (1993)； Invitrogen (San Diego, CA) 1995 Catalog, 35; Clontech (Palo Alto, CA) 1995/1996 Catalog, 187-188を参照のこと）。組換えが、組換え部位間の配列の欠失又は反転によって機能的転写単位を再構成又は不活性化するように、クローニングスキームが生み出された（例えば、Odell et al., Plant Phvsiol.. 106. 447-458 (1994)、Gu et al., Cell. 73. 1155-1164 (1993)、Lakso et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. 89. 6232-6236 (1992)、Fiering et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90. 8469-8473 (1973)、O’Gorman et al., Science. 251, 1351-55 (1991)、Jung et al., Science, 259, 984-987 (1993)を参照のこと）。

Ｃｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｐリコンビナーゼをコードする遺伝子は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は発生調節プロモーターのいずれかの制御下でトランスに提供されてもよく、または精製リコンビナーゼが導入されている（例えば、Baubonis et al. , supra; Dang et al., Develop. Genet. 13, 367-375 (1992)、Chou et al., Genetics. 131. 643-653 (1992)、Morris et al., Nucleic Acids Res. 19. 5895-5900 (1991)を参照のこと）。

いくつかの実施形態では、本開示中に開示されるゲノム操作は、Kirill A. Datsenko and Barry L. Wanner Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6; 97(12): 6640-6645からの改変部位特異的組換えプロトコルを用いて行われる。一実施形態では、遺伝子、例えばｔｒｘＡ、のノックアウトは、以下のように行うことができる。２つのＦＲＴ部位、及びノックアウト対象の遺伝子の２つの末端に相同であるホモロジー伸長部（homology extension）（Ｈ１及びＨ２）が両側に隣接する抗生物質耐性遺伝子を含むＰＣＲアンプリコンを作製した。このＰＣＲ産物で細胞を形質転換した後、ノックアウト対象の遺伝子は、これらの隣接する相同領域（複数）でのＲｅｄ媒介組換えにより、前記抗生物質耐性遺伝子に置き換えられる。選択後、前記耐性遺伝子はＦＬＰリコンビナーゼを発現するヘルパープラスミドを使用して除去できる。ＦＬＰリコンビナーゼは、前記耐性遺伝子に隣接するダイレクトリピートのＦＲＴ（ＦＬＰ認識標的）部位に作用する。Ｒｅｄ及びＦＬＰヘルパープラスミドは温度感受性のレプリコンであるため、３７℃での増殖によって単純に除去（cure）することができる。ｄｓｂＣなどの遺伝子のノックインは、当業者に周知の標準的な分子クローニング技術によって行うことができる。

いくつかの実施形態では、遺伝子の不活性化、例えば欠失、は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して行われる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質を標的遺伝子中の、例えばｇｏｒ中の、配列に指向させることができる少なくとも１つから２つのリボ核酸とを使用して、前記遺伝子を除去する。遺伝子発現を無くすためにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用する方法は周知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１７０７５３号に記載されており、その開示は参照によりその全体が本開示に取り込まれる。

標的遺伝子をノックアウトするさらなる方法には、相同組換え技術、エフェクターヌクレアーゼの転写活性化（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ））技術、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの方法も当技術分野で周知である。

レダクターゼの改変された発現の確認
様々な方法を使用して、大腸菌における様々な改変遺伝子のタンパク質発現レベルを測定する、及び／又は遺伝子がノックアウト又はノックインされたかどうかを確認することができる。例えば、遺伝子の発現は、ｍＲＮＡの転写を定量化するための従来のノーザンブロッティングによって測定することができる。様々な標識を使用してもよく、最も一般的なのは放射性同位体である。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾ヌクレオチドを使用するなど、他の技術を使用してもよい。そしてビオチンは、アビジン又は抗体に結合するための部位として機能し、ここで前記アビジン又は抗体は、放射性核種、蛍光物質、酵素、等々といった多種多様な標識で標識されていてもよい。

いくつかの実施形態では、発現されたタンパク質は、ゲル電気泳動（例えばＰＡＧＥ）、ウエスタン分析、又はキャピラリー電気泳動（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ社のＬａｂＣｈｉｐ）を使用して精製及び定量化することができる。無細胞翻訳反応におけるタンパク質合成は、放射性標識アミノ酸、典型的には^３５Ｓ標識メチオニン又は^１４Ｃ標識ロイシン、の取り込みによってモニターしてもよい。放射性標識タンパク質は、電気泳動後のオートラジオグラフィーで分子サイズについて視覚化し、定量することができ、あるいは免疫沈降によって単離することができる。組み換えＨｉｓタグの組み込みは、Ｎｉ^２＋アフィニティーカラムクロマトグラフィーによる精製という別の精製手段を与える。発現系からのタンパク質生産は、可溶性タンパク質の収量として測定することができ、あるいは酵素活性若しくは結合活性のアッセイを使用して測定することができる。

いくつかの実施形態では、定量化されるタンパク質が、定義された生物学的活性、例えば酵素活性（アルカリホスファターゼなど）又は増殖阻害活性、を有する場合、着目するタンパク質の発現は、適切な基質とインキュベートして当該タンパク質の活性をアッセイすることで確認できる。

酵素活性の測定
いくつかの実施形態では、遺伝子のうち１つ又は複数、例えばｔｒｘＡ、に導入された変異は、タンパク質発現又はｍＲＮＡ発現を無効にしないが、対応する野生型タンパク質が有する活性、例えばＴｒｘＡのチオレドキシン活性、を欠くムテインが生じる。遺伝子をノックアウトすることは、その活性を完全に消失させることを必要としない場合もあり、したがって、本開示の目的上、活性を欠くことは、変異タンパク質（「ムテイン」）が対照タンパク質、例えば野生型タンパク質、の活性の８５～１００％を失うことを意味することが当業者には理解される。作製された様々なムテインを試験して、それらが野生型タンパク質の活性を欠くことを確認することができる。例えば、ムテイン（複数）のコード配列のそれぞれをホスト株中で別々に発現させることができ、以下に記載するようにして、それらムテインは精製され、有する活性について試験される。

チオレドキシンレダクターゼ活性の喪失の確認
一実施形態では、チオレドキシンレダクターゼ活性は、ＮＡＤＰＨの存在下で５，５－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を還元する上での自らが有する活性によって測定することができる。この反応は、典型的には、ＤＴＮＢをチオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＲ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、及びＮＡＤＰＨ と混合することによって開始される。４１２ｎｍでの吸光度の増加が経時的に観察される。酵素の活性は、吸光度の増加速度として定義することができる。チオレドキシンレダクターゼ活性を検出する実施形態は、米国特許第８，５９２，４６８号において開示され、この開示の関連部分は、参照により本開示に取り込まれる。

チオレドキシン活性の喪失の確認
チオレドキシン活性を測定する方法も周知である。一実施形態では、このアッセイはインスリン沈殿アッセイであり、例えばSung-Jong Jeon et al., European Journal of Biochemistry, Vol. 269, No. 22に記載されるものである。チオレドキシンは、インスリンのジスルフィド還元酵素としての活性を有することが既知であり、インスリンジスルフィド結合の減少は、遊離インスリンＢ鎖の沈殿による濁度の増加によって測定できる。説明用の一例では、標準アッセイ混合物は、組換えタンパク質の非存在下又は存在下で、０．１Ｍリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ、及び０．１３ｍＭウシインスリンを含み、１ｍＭのジチオスレイトールを添加して反応を開始した。６５０ｎｍでの吸光度の増加を３０℃でモニターした。

グルタチオンレダクターゼ活性の喪失の確認
ＡｈｐＣ^＊のグルタチオンレダクターゼ活性又はムテインＧＯＲのグルタチオンレダクターゼ活性の喪失もモニターすることができる。いくつかの実施形態では、グルタチオンレダクターゼ活性は、システインを還元する上での自らの有する活性によって測定される。例えば、補因子の存在下で、候補タンパク質、例えばＡｈｐＣ^＊又はムテインＧＯＲ、を含む還元溶液と共にシステインをインキュベートした。好ましくは、前記補因子は補酵素である。好ましくは、前記補因子は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）である。この反応により、シスチンがシステインに還元される。模式的な反応は以下のとおりである。
ＣＹＳ－ＣＹＳ＋２ＧＳＨ→２ＣＹＳ＋ＧＳＳＧ
ＧＳＳＧ＋ＮＡＤＰＨ→２ＧＳＨ＋ＮＡＤＰ＋Ｈ
前記活性は、システインの生産を測定することによって測定できる。１つの特定の例において、システインの還元についてのグルタチオンレダクターゼ活性は、国際公開第２０１８／１１４５７６号に記載されている。

ＡｈｐＣのペルオキシレダクターゼ活性の喪失の確認
ＡｈｐＣ^＊においてペルオキシレダクターゼ活性を欠くことは、ＮＡＤＨの存在下で当該タンパク質を有機ヒドロペルオキシド又は過酸化水素とインキュベートすることによって確認できる。機能的ペルオキシレダクターゼは、ＮＡＤＨ依存性メカニズムでこれらの基質を水に変換する。このような変換の証拠を欠くことは、ペルオキシレダクターゼ活性を欠くことを示している。

レダクターゼ活性の阻害による酸化的な細胞質の維持
あるいは、大腸菌細胞の細胞質の酸化還元電位は、細胞を、細胞内の１つ又は複数のレダクターゼの活性を阻害できる薬剤と接触させることによって調節することができる。細胞質の酸化還元電位は、ジスルフィド結合の形成及びタンパク質の安定性を促進できる酸化状態に調整できる。上記記載の１つ又は複数のレダクターゼを阻害することができる薬剤は周知であり、例えば、金チオグルコース、金チオリンゴ酸塩、又は硫酸銅（ＩＩ）（ＣｕＳＯ_４）である。

適切なレダクターゼ阻害剤は、インビトロ酵素アッセイで化合物のライブラリーをスクリーニングすることによっても同定できる。候補化合物の存在下又は非存在下での標的レダクターゼの活性を測定及び比較することができ、前記アッセイにおいて候補化合物がレダクターゼ活性を低下させる能力を示した場合、候補化合物をレダクターゼ阻害剤として選択することができる。

抗体収量を促進し得る大腸菌株のさらなる特性
いくつかの実施形態では、前記大腸菌株は、原核生物の細胞質ジスルフィドイソメラーゼをさらに発現し、該細胞質ジスルフィドイソメラーゼはタンパク質のフォールディングを容易化し、抗体収量をさらに改善することができる。一実施形態では、前記ジスルフィドイソメラーゼはＤｓｂＣである。一実施形態では、前記ジスルフィドイソメラーゼは、酵母タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ｙＰＤＩ）であり、例えば、Groff et al., MAbs 6(3): 671-678 (2014)に記載されているものである。いくつかの実施形態では、前記大腸菌株は、ジスルフィドオキシダーゼをさらに発現して、ジスルフィド形成を容易化するのを助け、ＩｇＧアセンブリーを増強する。一実施形態では、前記ジスルフィドオキシダーゼは、ＤｓｂＡである。一実施形態では、前記ジスルフィドレダクターゼは、Ｑｓｏｘである。いくつかの実施形態では、前記タンパク質イソメラーゼは、プロリルイソメラーゼである。適切なプロリルイソメラーゼには、ＦｋｐＡ、シクロフィリン、ＦＫＢＰ、パルブリン、又はｓｌｙＤ、デアグリガーゼ（ｄｅａｇｇｒｅｇａｓｅ）ｓｋＰ若しくはｇｒｏＥＬ／ｇｒｏＥＳ、ｄａｎＫ、ｄｎａＪ、又はｇｒｐＥが含まれ得るが、これらに限定されない。

大腸菌株のサイトゾルが酸化状態にあることの確認
大腸菌株が酸化的な細胞質を有するかどうかは、上記で開示したように、細胞質の酸化還元電位を測定することによって確認することができる。あるいは、細胞質の酸化状態は、１つ又は複数のジスルフィド結合を有する試験タンパク質、例えば野生型大腸菌株では発現が困難なＬＣ、の生物学的活性を評価することによって確認できる。好ましい試験ポリペプチド又はタンパク質は、細胞から通常分泌されるもの、又は膜タンパク質であるものである。いくつかの場合には、これらのポリペプチドは、シグナル配列の欠失又は変異によって改変され、タンパク質が細胞の細胞質の外にエクスポートされないようになっている。

説明用の一例として、Ｂ１０抗体のＬＣのコード配列（配列番号２）は、適切なプロモーターの下の発現カセットに組込み操作（engineered into）され、改変された大腸菌株に形質転換され得る。ＬＣを含む可溶性タンパク質画分が測定される。適切な大腸菌株は、少なくとも１ｍｇ／１００ｍＬのＬＣを可溶型形態で発現することができる。細菌ライセートを調製し、ライセート中のタンパク質発現量（例えば、ＬＣの発現）を測定する方法は周知である。いくつかの実施形態では、大腸菌細胞を溶解剤（lysis agent）で処理して、ライセートを製造することができる。細胞質タンパク質は、ライセートをベンゾナーゼや卵白リゾチームなどの酵素で処理することによって放出させることができる。不溶性タンパク質画分は、例えば遠心分離によって可溶性画分から分離することができる。可溶性タンパク質画分（ＬＣを含む）を収集し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析できる。次いで、可溶性タンパク質画分中のＬＣタンパク質の量を、例えばデンシトメトリーによって定量化することができる。

ＩＶ．着目する抗体
本開示で提供される方法は、大腸菌細胞において任意の全長抗体を組換え生産するために使用することができる。抗体にはジスルフィド結合が存在するため、本開示のシステムは抗体の分解を防ぎ収量を増加させるのに有益である。本開示に記載の方法を用いて、任意の抗体を、培養培地１リットル当たりのタンパク質の量で表すと、約２００ｍｇ／Ｌ以上、約２５０ｍｇ／Ｌ以上、約５００ｍｇ／Ｌ以上、約７５０ｍｇ／Ｌ以上、又は約１０００ｍｇ／Ｌ以上である収量で生産することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、Ｂ１０抗体、Ｈ０１抗体、７２１９抗体（抗ＣＤ７４抗体）、抗ＰＤ１抗体、抗Ｔｉｍ３抗体、抗ＨＥＲ２抗体（例えば、トラスツズマブ）、及び抗ＬＡＧ３抗体からなる群から選択される。Ｂ１０とＨ０１とは異なる抗体であるが、どちらも葉酸受容体を標的としている。抗体のＨＣ及びＬＣをコードするポリヌクレオチドをホスト細胞に導入して、ＨＣ及びＬＣを発現させることができ、次いでそれらをアセンブリーして全長抗体を形成することができる。抗体の非限定的な例を表１に列挙する。

Ｖ．プロモーター
ＨＣ又はＬＣの転写をドライブするために本発明の方法で使用することができるプロモーターは、大腸菌に適した任意の適切なプロモーター配列であってもよい。そのようなプロモーターは、変異プロモーター、短縮型プロモーター、及びハイブリッドプロモーターを包含してもよく、細胞にとって内因性（天然）又は異種（外来）のどちらでもよい、細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから得てもよい。本開示で使用されるプロモーターは、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであってもよい。

いくつかの実施形態では、前記プロモーターは構成的プロモーターである。前記プロモーターは、Ｔ７と実質的に同じプロモーター強度を有するもの、すなわち、プロモーターの強度がＴ７プロモーターの強度の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％であるもの、であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｔ７プロモーターは、配列番号１９の配列を含む、又は配列番号１９の配列からなる。いくつかの実施形態では、前記プロモーターは、Ｔ７プロモーターの強度の５０％～２００％、例えば８０％～１５０％又は９０％～１４０％、の範囲内の強度を示してもよい。大腸菌細胞においてＨＣ及びＬＣの転写をドライブするのに適したプロモーターの非限定的な例には、Ｔ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｐＢａｄ、ＸｙｌＡ、又はＰｈｏＡプロモーターが含まれる。

２つのプロモーターの強度は、２つのプロモーターによって転写開始（initiate）される同じ遺伝子産物の転写量を比較することによって比較できる。例えば、試験対象のプロモーターを有する発現コンストラクトを含むホスト細胞（「試験ホスト細胞」）及び（参照プロモーター、例えば、Ｔ７プロモーターを含む）対照発現コンストラクトを含む対照ホスト細胞は、複製条件で（in replicate）カルチャー中に生長させることができる。ホスト細胞及び対照の全ＲＮＡを抽出し、２６０ｎｍの吸光度で測定できる。次いで、試験ホスト細胞及び対照ホスト細胞からの等量の全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成することができる。前記プロモーターから作られた転写物に対応するｃＤＮＡを増幅するために、ＲＴ－ＰＣＲを行うことができる。例示的な方法が、De Mey et al. （“Promoter knock-in: a novel rational method for the fine tuning of genes”, BMC Biotechnol 2010 Mar 24; 10:26）に記載されている。

いくつかの実施形態では、ＨＣ及びＬＣの発現をドライブするプロモーターは同じであり、例えば、両方ともＴ７プロモーターである。いくつかの場合には、ＨＣ及びＬＣは、以下に開示するように、１つの単一プロモーター、例えばバイシストロン性オペロン内の１つの単一Ｔ７プロモーター、によって指示される。いくつかの実施形態では、ＨＣのためのプロモーター及びＬＣのためのプロモーターは異なるプロモーターである。いくつかの実施形態では、ＨＣ及びＬＣのプロモーター強度は実質的に同じである。いくつかの実施形態では、ＨＣ及びＬＣのプロモーター強度は異なる。

ＶＩ．ベクター
抗体のＬＣ及びＨＣをコードするポリヌクレオチドは、大腸菌での発現のために１つ又は２つの複製可能なベクターに挿入することができる。この目的のために多くのベクターが利用可能であり、当業者は、本開示中に開示される方法において使用するための適切なベクターを容易に選択することができる。着目する遺伝子及び該遺伝子の発現をドライブするプロモーターに加えて、前記ベクターは典型的には、シグナル配列、複製起点、又は１つ又は複数のマーカー遺伝子のうちの１つ又は複数を含む。

いくつかの実施形態では、バイシストロン性ベクターが、ＨＣコード配列及びＬＣコード配列の両方を転写するためのプロモーターを使用する。いくつかの実施形態では、ＨＣコード配列はプロモーターに近位である。いくつかの実施形態では、ＬＣコード配列はプロモーターに近位である。本開示中に開示されるプロモーターのうち任意のものを、前記バイシストロン性ベクターで使用することができる。いくつかの実施形態では、前記プロモーターはＴ７プロモーターである。いくつかの実施形態では、前記バイシストロン性ベクターは、Ｔ７ターミネーターなどの転写ターミネーターをさらに含む。ＨＣコード配列及びＬＣコード配列は互いに１５～３０ヌクレオチド、例えば２０～２４ヌクレオチド、離れていてもよく、すなわち、一方はＨＣ上にあり、他方はＬＣ上にある２つの最も近いヌクレオチド同士は１５～３０ヌクレオチド、例えば２０～２４ヌクレオチド、離れている。いくつかの実施形態では、ＨＣコード配列及びＬＣコード配列は、リボソーム結合部位をコードする配列を含むヌクレオチド配列によって隔てられる。

いくつかの実施形態では、ＨＣ及びＬＣをコードするプラスミドは、一方がＨＣ生産用であり、他方がＬＣ生産用である２つのモノシストロン性オペロンを含む。いくつかの実施形態では、前記２つのモノシストロン性オペロンは、同じプロモーター、例えばＴ７プロモーター又はＴ５プロモーター、を共に有している。いくつかの実施形態では、前記２つのモノシストロン性オペロンは、異なるプロモーターを含む。すなわち、ＬＣについてのモノシストロン性オペロンのプロモーターと、ＨＣについてのモノシストロン性オペロンのプロモーターとは、配列が異なる、及び／又は異なるプロモーター活性を有する。本開示中に開示されるプロモーターのうちの任意のものを、前記２つのモノシストロン性オペロンを含むベクターで使用することができる。いくつかの実施形態では、各モノシストロン性オペロンは、Ｔ７ターミネーターなどの転写ターミネーターをさらに含む。

いくつかの実施形態では、ＨＣの翻訳は第１のリボソーム結合部位によって調節され、ＬＣの翻訳は第２のリボソーム結合部位によって調節される。リボソーム結合部位は、ＨＣ及びＬＣの発現量が所望の比率であることを確実にするために、例えばＨＣのＬＣに対するモル比が１：１～１：３の範囲内、例えば約２．５、であることを確実にするために、独立して選択される。この手法は、大腸菌培養で生産されたＨＣ及びＬＣによって形成される全長抗体の収量を高めることができる。ＨＣのＬＣに対する比率は、大腸菌培養から得られた細胞ライセート中における生産されたＨＣ及びＬＣの量に基づいて決定できる。ＨＣ及びＬＣの量は、タンパク質の定量に適した任意の方法を使用して測定できる。例示的な一実施形態では、大腸菌培養物を回収し、溶解（lyze）して細胞ライセートを調製する。任意に（optionally）、細胞ライセートを、例えばクロマトグラフィーによって精製する。前記細胞ライセート又は精製細胞ライセートを還元剤（例えば、ＤＴＴ）で処理して、ＨＣ及びＬＣを分離する。次いで、この還元された細胞ライセート試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分析することができ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルでは、ＨＣとＬＣとが分離され、サイズによって分解（resolve）される。次いで、ＨＣ及び／又はＬＣを認識する抗体を使用して、ゲルをブロッティングする。抗体とＨＣ又はＬＣとの間の結合に伴うシグナルを定量することができる。このシグナルは、培養物中に生産されたＨＣ又はＬＣの量に比例的に関係する。

いくつかの実施形態では、前記第１のリボソーム結合部位又は前記第２のリボソーム結合部位は、配列番号２８を含む。いくつかの実施形態では、前記第２のリボソーム結合部位は、配列番号２９を含む。いくつかの実施形態では、前記第１のリボソーム結合部位は配列番号２８を含み、前記第２のリボソーム結合部位は配列番号２９を含む。いくつかの実施形態では、前記第１のリボソーム結合部位は配列番号１７～１９からなる群から選択される配列を含み、前記第２のリボソーム結合部位は配列番号２０～２３からなる群から選択される配列を含む；実施例１３、表２及び表３を参照のこと。いくつかの実施形態では、前記第１のリボソーム結合部位は配列番号２０～２２からなる群から選択される配列を含み、前記第２のリボソーム結合部位は配列番号１７～１９（例えば配列番号１７）を含む；実施例２４を参照のこと。いくつかの実施形態では、前記第２のリボソーム結合部位は配列番号２１を含む。いくつかの実施形態では、前記第２のリボソーム結合部位は配列番号２２を含む。いくつかの実施形態では、前記第１のリボソーム結合部位は配列番号１７又は配列番号１８を含む。ＨＣ及びＬＣの発現量を上記のような所望の比率に維持できる限り、第１のリボソーム結合部位について開示した任意の配列を第２のリボソーム結合部位として使用することができる。

いくつかの実施形態では、前記抗体は、ＳＰ７２１９ ＩｇＧ、Ｂ１０ ＩｇＧ、Ｈ０１ ＩｇＧ、αＰＤ１ ＩｇＧ、αＴｉｍ３ ＩｇＧ、αＬＡＧ３ ＩｇＧ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される。

ＶＩＩ．非天然アミノ酸を含む抗体
前記方法を用いて生産される抗体は、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、タンパク質中の特定の部位でＨＣ又はＬＣに組み込まれる。これらの非天然アミノ酸は、典型的には、様々な生物学的に活性な付加物とのコンジュゲーションに使用可能な生物直交性（bio-orthogonal）の反応性化学側鎖を有する。以下を参照のこと。この手法は、蛍光標識若しくは放射性標識、光活性化可能なマーカー、薬物動態を改変するＰＥＧ、又は化学療法剤などの追加的な機能性を抗体に導入することができる。

前記１つ又は複数の非天然アミノ酸は、抗体の重鎖若しくは軽鎖又はその両方における選択された部位特異的位置に位置し得る。前記部位特異的位置は、任意の可変ドメイン及び任意の定常ドメインなどの、抗体の任意のドメインに存在してよい。ＬＣ、ＨＣ、又はその両方に存在する非天然アミノ酸の数は変動してもよく、１～１０、例えば２～８、３～６、５～１０、又は３～７、の範囲でもよい。

１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む重鎖
ある特定の実施形態では、本開示で提供される抗体は、重鎖残基のＨＣ－Ｆ４０４、ＨＣ－Ｋ１２１、ＨＣ－Ｙ１８０、ＨＣ－Ｆ２４１、ＨＣ－２２１、ＨＣ－Ｓ１３６、ＨＣ－Ｓ２５、ＨＣ－Ａ４０、ＨＣ－Ｓ１１９、ＨＣ－Ｓ１９０、ＨＣ－Ｋ２２２、ＨＣ－Ｒ１９、ＨＣ－Ｙ５２、又はＨＣ－Ｓ７０からなる群から選択される位置で天然アミノ酸をそれぞれ置換する、１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む。これらの表記において、ＨＣは重鎖残基を示す。

１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む軽鎖
ある特定の実施形態では、本開示で提供される抗体は、ＬＣ－Ｋ４２、ＬＣ－Ｅ１６１、ＬＣ－Ｔ２２、ＬＣ－Ｓ７、ＬＣ－Ｎ１５２、ＬＣ－Ｋ４２、ＬＣ－Ｅ１６１、又はＬＣ－Ｄ１７０から選択される位置で天然アミノ酸をそれぞれ置換する、１つ又は複数の非天然アミノ酸を含む。これらの表記において、ＬＣは軽鎖残基を示す。

本開示中に開示される抗体はまた、ＨＣにおける上記位置及びＬＣ中における上記位置の任意の組み合わせにおいて非天然アミノ酸を含んでもよい。

非天然アミノ酸を含む例示的な抗体
例示的な一実施形態では、抗体は、配列番号１に対してＨＣ－Ｆ４０４、ＨＣ－Ｙ１８０、ＨＣ－Ｆ２４１の位置、及び配列番号５に対してＬＣ－Ｋ４２の位置から選択される１つ又は複数の変異を有するＨＣを含むＢ１０抗体である。前記変異により、これらの位置のアミノ酸コドンが１つ又は複数の非天然アミノ酸コドンに置換される。一実施形態では、非天然アミノ酸コドンはアンバーコドンである。いくつかの実施形態では、Ｂ１０抗体は、配列番号３、４、６、及び７からなる群から選択される配列を有するＨＣ及び／又は配列番号５の配列を有するＬＣを含む。別の例示的な実施形態では、前記抗体は、ＬＣ－Ｅ４２及びＬＣ－Ｅ１６１のうちの少なくとも１つが非天然アミノ酸によって置換されているＬＣを含むトラスツズマブである。

非天然アミノ酸
抗体に組み込むことができる適切な非天然アミノ酸には、例えば、その内容全体が参照により本開示に取り込まれる米国特許第１０，１７９，９０９号、米国特許第９，９３８，５１６号、米国特許第９，６８２，９３４号、米国特許第１０，５９６，２７０号、及び米国特許第１０，６１０，５７１号に記載されるものが挙げられる。

前記非天然アミノ酸は、以下に記載するように、リンカー又は生物学的に活性な付加物（別名ペイロード）への共有結合を形成するのに有用な反応基を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、反応基は、アミノ、カルボキシ、アセチル、ヒドラジノ、ヒドラジド、セミカルバジド、スルファニル、アジド、及びアルキニルからなる群から選択される。前記非天然アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、又はラセミアミノ酸であってよい。ある特定の実施形態では、本開示に記載の非天然アミノ酸には、天然アミノ酸のＤ型及び天然アミノ酸のラセミ型が含まれる。

ある特定の実施形態では、前記非天然アミノ酸は、以下の式のいずれかに係る。

上記の式において、波線は、抗体のポリペプチド鎖の残りの部分に接続する結合を示す。これらの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸が同じポリペプチド鎖に組み込まれるのと同様にして、ポリペプチド鎖に組み込むことができる。ある特定の実施形態において、前記非天然アミノ酸は、式に示されるように、アミド結合を介してポリペプチド鎖に組み込まれる。上記の式において、Ｒは、アミノ酸残基が天然のアミノ酸残基と同一でない限り、制限の無い任意の官能基を表す。ある特定の実施形態において、Ｒは、疎水性基、親水性基、極性基、酸性基、塩基性基、キレート基、反応性基、治療作用部分（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍｏｉｅｔｙ）、又は標識部分であってもよい。上記の式において、各Ｌはリンカー（例えば、二価のリンカー）を表し、これについては以下にさらに説明する。

いくつかの実施形態では、天然にコードされるものではないアミノ酸は、前記２０種類の一般的アミノ酸には見られない官能基（アジド基、ケトン基、アルデヒド基、及びアミノオキシ基を含むがこれらに限定されない）と効率的かつ選択的に反応して安定したコンジュゲートを形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含む天然にコードされるものではないアミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドは、ポリマー（ポリ（エチレングリコール）を含むがこれに限定されない）と反応させることができ、又はアルキン部分を含む第２のポリペプチドと反応させることができ、アジド官能基とアルキン官能基との選択的反応によりヒュスゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）［３＋２］環化付加生成物を形成することで安定なコンジュゲートを形成する。

本発明における使用に適し得るものであって、水溶性ポリマーとの反応に有用である、天然にコードされるものではないアミノ酸の例には、カルボニル反応基、アミノオキシ反応基、ヒドラジン反応基、ヒドラジド反応基、セミカルバジド反応基、アジド反応基、及びアルキン反応基を有するものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、天然にコードされるものではないアミノ酸は糖部分を含む。そのようなアミノ酸の例には、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ガラクトサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－スレオニン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－アスパラギン、及びＯ－マンノサミニル－Ｌ－セリンが挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、アミノ酸と糖との間の天然に存在するＮ－又はＯ－結合が、天然には一般的に見られない共有結合的連結によって置き換えられている例が挙げられ、そのような共有結合的連結としてはアルケン、オキシム、チオエーテル、アミド、等々が挙げられるがこれらに限定されない。このようなアミノ酸の例には、２－デオキシ－グルコース、２－デオキシガラクトース、等々といった、天然タンパク質には一般に見られない糖類も含まれる。

本発明における使用に適した非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ社（米国）又はＡｌｄｒｉｃｈ社（米国ウィスコンシン州ミルウォーキー）から一般的に入手可能である。市販されていないものは、本開示で指示されるとおりに、様々な刊行物において指示されるとおりに、又は当業者に既知の標準的な方法を使用して、任意に（optionally）合成される。有機合成技術については、例えば、Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon(1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)を参照のこと；また、参照により本開示に取り込まれる、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号及び第２００３／０１０８８８５号、Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)、及びAdvanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について記載しているその他の刊行物としては、例えば、「In vivo incorporation of Non-natural Amino Acids」のタイトルを有する国際公開第２００２／０８５９２３号、Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669、King, F. E. & Kidd, D. A. A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319、Friedman, O. M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752、Craig, J. C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170、Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5、Koskinen, A. M. P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Org. Chem. 54, 1859-1866、Christie, B. D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 1989:1859-1866、Barton et al., (1987) Synthesis of Novel a-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-α-Amino-Adipic Acids, L-a-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron Lett. 43:4297-4308、及びSubasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7が挙げられる。また、「Protein Arrays」のタイトルを有する２００３年１２月２２日に出願された米国特許出願第１０／７４４，８９９号及び２００２年１２月２２日に出願された米国特許出願第６０／４３５，８２１号も参照のこと。

多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニン、等々といった天然アミノ酸に基づいており、本発明における使用に適している。チロシンアナログには、パラ置換チロシン、オルト置換チロシン、及びメタ置換チロシンが挙げられるが、これらに限定されず、これら置換チロシンは、ケト基（アセチル基を含むがこれに限定されない）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６－Ｃ２０直鎖又は分枝鎖炭化水素、飽和又は不飽和炭化水素、Ｏ－メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基、又は等々を含むが、これらに限定されない。さらに、複数置換されたアリール環も想定の範囲内である。本発明における使用に適し得るグルタミンアナログには、α－ヒドロキシ誘導体、γ－置換誘導体、環状誘導体、及びアミド置換グルタミン誘導体が含まれるが、これらに限定されない。本発明における使用に適し得るフェニルアラニンアナログの例には、パラ置換フェニルアラニン、オルト置換フェニルアラニン、及びメタ置換フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されず、ここで置換基としては、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（アセチル基を含むがこれに限定されない）、ベンゾイル、アルキニル基、又は等々が挙げられるが、これらに限定されない。本発明における使用に適し得る非天然アミノ酸の具体例には、アジドエトキシカルボニルリジン（ＡＥＫ）、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃβ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、及びｐ－プロパルギルオキシ－フェニルアラニン、等々が挙げられるが、これらに限定されない。本発明における使用に適し得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「In vivo incorporation of non-natural amino acids」のタイトルを有する国際公開第２００２／０８５９２３号に提示されている。また、追加のメチオニンアナログに関しては、Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24を参照のこと。

有用な非天然アミノ酸の具体的な例には、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃ－ｂ－セリン、Ｌ－ドーパ、フッ素化フェニルアラニン， イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－メチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ヨード－フェニルアラニン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、及びｐ－プロパルギルオキシ－フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる有用な例には、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ガラクトサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－スレオニン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－アスパラギン、及びＯ－マンノサミニル－Ｌ－セリンが挙げられる。

ある特定の実施形態では、前記非天然アミノ酸は、ｐ－アセチル－フェニルアラニン、ｐ－エチニル－フェニルアラニン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－アジド－メチル－フェニルアラニン、及びｐ－アジド－フェニルアラニンから選択される。一実施形態では、前記非天然アミノ酸はｐ－アジドフェニルアラニンである。このアミノ酸残基は、例えばアルキニル基を有する化合物との、ヒュスゲン［３＋２］環化付加反応（いわゆる「クリック」ケミストリー反応）を促進することが当業者に既知である。この反応は、当業者が、非天然アミノ酸の部位特異的位置で抗体に容易かつ迅速にコンジュゲーションさせることを可能にする。

ある特定の実施形態では、第１の反応基がアルキニル部分（非天然アミノ酸ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン中における当該部分が挙げられるが、これに限定されず、ここでプロパルギル基はアセチレン部分と称される場合もある）であり、第２の反応基がアジド部分であり、［３＋２］環化付加化学を使用できる。ある特定の実施形態では、第１の反応基はアジド部分（非天然アミノ酸ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン中における当該部分が挙げられるがこれに限定されない）であり、第２の反応基はアルキニル部分である。

本開示に記載の方法及び組成物で使用される非天然アミノ酸は、以下の４つの特性のうち少なくとも１つを有する：（１）非天然アミノ酸の側鎖上の少なくとも１つの官能基が、遺伝的にコードされた、２０種類の一般的アミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン）の化学反応性に対して直交性（orthogonal）であるか、あるいは、少なくとも、前記非天然アミノ酸を含むポリペプチドに存在する天然アミノ酸の化学反応性に対して直交性（orthogonal）である、少なくとも１つの特徴及び／又は活性及び／又は反応性を有する、（２）導入された非天然アミノ酸が、遺伝的にコードされた、前記２０種類の一般的アミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である、（３）非天然アミノ酸がポリペプチドに安定に組み込むことが可能であり、好ましくは組込みは天然アミノ酸と相応する安定性を有し、又は組込みは典型的な生理学的条件下であり、さらに好ましくは、そのような組み込みはインビボ系を介して起こることが可能である、並びに（４）非天然アミノ酸は、オキシム官能基、又は試薬と反応することによってオキシム基に変換可能な官能基、を含み、好ましくは、前記変換は非天然アミノ酸を含むポリペプチドの生物学的特性を破壊しない条件下（ただし、言うまでもなく、生物学的特性の当該破壊が改変／変換の目的でない限りにおいて）でなされ、あるいは前記変換は約４～約８のｐＨの水性条件下で発生起こることが可能であり、あるいは非天然アミノ酸上の反応部位は求電子部位である。任意の数の非天然アミノ酸をポリペプチドに導入することができる。非天然アミノ酸はまた、保護された若しくはマスキングされたオキシム、又は、保護された基の脱保護又はマスキングされた基の脱マスキングの後でオキシム基に変換可能な保護された若しくはマスキングされた基も含んでもよい。非天然アミノ酸はまた、保護された又はマスキングされたカルボニル基又はジカルボニル基を含んでいてもよく、この基は、保護された基の脱保護又はマスキングされた基の脱マスキング後にカルボニル基又はジカルボニル基に変換でき、これによって、オキシム基を形成するためのヒドロキシルアミン又はオキシムとの反応に利用可能となる。

さらなる実施形態では、本開示に記載の方法及び組成物で使用され得る非天然アミノ酸としては、光活性化可能なクロスリンカーを含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的に又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、光ケージ化された（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）及び／又は光異性化可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチンアナログを含むアミノ酸、糖置換セリンなどのグリコシル化アミノ酸、その他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、アルデヒド含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はその他のポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能な及び／又は光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して伸長した側鎖を有するアミノ酸（ポリエーテル又は長鎖炭化水素（約５個を超える又は約１０個を超える炭素を含むがこれらに限定されない）が挙げられるがこれらに限定されない）、炭素で連結した糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、並びに１つ又は複数の毒性部分を含むアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は糖部分を含む。そのようなアミノ酸の例には、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－ガラクトサミニル－Ｌ－セリン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－スレオニン、Ｎ－アセチル－Ｌ－グルコサミニル－Ｌ－アスパラギン、及びＯ－マンノサミニル－Ｌ－セリンが含まれる。このようなアミノ酸の例には、アミノ酸と糖類との間の天然に存在するＮ－又はＯ－結合が、天然には一般的に見られない共有結合的連結によって置きかえられた例が含まれ、このような共有結合的連結としてはアルケン、オキシム、チオエーテル、アミド、等々が挙げられるがこれらに限定されない。このようなアミノ酸の例には、２－デオキシ－グルコース、２－デオキシガラクトース、等々といった天然タンパク質には一般的に見られない糖類も含まれる。

ある特定の実施形態では、前記非天然アミノ酸は、図８Ａ～図８Ｄに示される非天然アミノ酸の群から選択されるものである。そのような非天然アミノ酸は、塩の形態であってもよく、あるいは非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖、又はポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、任意に（optionally）翻訳後修飾されていてもよい。

いくつかの実施形態では、前記非天然アミノ酸は、パラメチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、アジドエトキシカルボニルリジン（ＡＥＫ）、又はｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）である。いくつかの実施形態では、前記非天然アミノ酸は、（Ｓ）－２－アミノ－３－（５－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イルアミノ）ピリジン－３－イル）プロパン酸である。

非天然アミノ酸の組込み
非天然アミノ酸の組み込み方法は、周知であり、例えば、その内容全体が参照により本開示に取り込まれる米国特許第１０，６１０，５７１号、米国特許第９，９８８，６１９号、及び米国特許第９，９３８，５１６号に記載されている。

１つの手法において、ＨＣ又はＬＣのコード配列は、少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンを含むように改変される。非天然アミノ酸コドンは、２０種類の天然アミノ酸のいずれの組み込みも生じないコドンである。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸コドンは、翻訳を終結させる代わりに、ｔＲＮＡシンテターゼによって非天然アミノ酸をその同族（cognate）ｔＲＮＡに積ませる（charge）のに転用されたアンバー終止コドン、オパール終止コドン、又はオーカー終止コドンである。

非天然アミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸のどれと比較しても非天然アミノ酸の方を優先的にアセチル化するｔＲＮＡシンテターゼによって、ｔＲＮＡに積ませる（charge）ことができる。このような機能を有するｔＲＮＡシンセターゼは既知であり、例えば米国特許第９，９３８，５１６号は、非天然アミノ酸であるパラメチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）を選択的に組み込むｔＲＮＡシンテターゼを開示している。他の非天然アミノ酸、例えば、アジドエトキシカルボニルリジン（ＡＥＫ）又はｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）を選択的に組み込むことができるｔＲＮＡシンテターゼも周知である；例えば、Chen et al., Angew Chem Int Ed Engl. 2009; 48(22):4052-5 (doi: 10.1002/anie.200900683)及びLi et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 2003 Jan 7;100(1):56-61を参照のこと。前記刊行物の全内容は、参照により本開示に取り込まれる。本開示中に開示される抗体に組み込むことができるさらなる例示的な非天然アミノ酸としては、アラルキル、ヘテロシクリル、及びヘテロアラルキル、並びにリジン誘導体非天然アミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、そのような非天然アミノ酸は、ピリジル、ピラジニル、ピラゾリル、トリアゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、チオフェニル、又はその他の複素環を含む。そのようなアミノ酸は、いくつかの実施形態においては、アジド、テトラジン、又は水溶性部分などのカップリングパートナーにコンジュゲーションできるその他の化学基を含む。

非天然アミノ酸を選択的に組み込むことができるｔＲＮＡシンテターゼは、野生型ｔＲＮＡシンテターゼを遺伝子改変して変異ｔＲＮＡシンテターゼを生み出すことによっても得てもよい。次いで、これらの変異ｔＲＮＡシンテターゼのそれぞれを、所望の非天然アミノ酸コドンを含むレポーター遺伝子を使用して、非天然アミノ酸を選択的に組み込むことについての変異ｔＲＮＡシンテターゼの活性について試験することができる。２０種類の一般的天然アミノ酸と比較しての、非天然アミノ酸（例えば、ｐＡＭＦ）の存在下での変異ｔＲＮＡシンテターゼバリアントの活性は、レポータータンパク質の存在又は非存在を検出することによって測定することができる。非天然アミノ酸を組み込むための変異ｔＲＮＡシンテターゼを生みだす１つの例示的な方法は、その内容全体が参照により本開示に取り込まれる、米国特許第９，９３８，５１６号に開示されている。

いくつかの実施形態では、前記非天然アミノ酸コドンは合成コドンであり、前記非天然アミノ酸は、直交性（orthogonal）シンテターゼ／ｔＲＮＡペアを使用して抗体に組み込まれる。直交性シンテターゼは、天然アミノ酸シンテターゼのいずれかを改変したシンテターゼであってもよい。例えば、直交性シンテターゼは、プロリンシンテターゼ、改変セリンシンテターゼ、改変トリプトファンシンテターゼ、又は改変ホスホセリンシンテターゼであってもよい。直交性ｔＲＮＡはまた、天然アミノ酸ｔＲＮＡのいずれかから改変されたものであってもよい。例えば、前記直交性ｔＲＮＡは、改変アラニンｔＲＮＡ、改変アルギニンｔＲＮＡ、改変アスパラギン酸ｔＲＮＡ、改変システインｔＲＮＡ、改変グルタミンｔＲＮＡ、改変グルタミン酸ｔＲＮＡ、改変アラニングリシン、改変ヒスチジンｔＲＮＡ、改変ロイシンｔＲＮＡ、改変イソロイシンｔＲＮＡ、改変リジンｔＲＮＡ、改変メチオニンｔＲＮＡ、改変フェニルアラニンｔＲＮＡ、改変プロリンｔＲＮＡ、改変セリンｔＲＮＡ、改変スレオニンｔＲＮＡ、又は改変トリプトファンｔＲＮＡであってもよい。いくつかの実施形態では、改変チロシンｔＲＮＡ、改変バリンｔＲＮＡ、又は改変ホスホセリンｔＲＮＡである。

コドン最適化
コドン最適化を使用して、最適化されていない配列を使用して生産された転写物と比較して、ＨＣ又はＬＣの翻訳速度を上げるか、あるいは長い半減期などの望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生産することができる。ＨＣコード配列又はＬＣコード配列は、大腸菌での発現効率を最大化するために最適化することができる。特に、非天然アミノ酸コドンを有するＨＣポリヌクレオチド又はＬＣポリヌクレオチドを大腸菌で発現させる場合、非天然アミノ酸コドンに近接する塩基は、リボソームのＰ部位におけるｍＲＮＡ立体構造に影響を与え、非天然アミノ酸の組み込み効率に影響を与える可能性がある。したがって、非天然アミノ酸を有する抗体の収量を最大化するために、非天然アミノ酸コドンに近接するアミノ酸のコドンを最適化することが望ましい。いくつかの実施形態では、発現を最大化するために、非天然アミノ酸コドンの３’側に隣接したコドンが最適化される。最適なコドンは、非天然アミノ酸コドンの３’側に隣接して位置する、同じアミノ酸に対する異なるコドンを有するＨＣ（又はＬＣ）コード配列を発現させることから生産されるＨＣ（又はＬＣ）の収量同士を比較し、最高収量を生じるコード配列を選択することによって選択することができる。説明用の一例では、Ｂ１０抗体のＨＣのコード配列は、１８０位にチロシン（Ｙ）コドンの代わりにアンバーコドンを有する。アンバーコドンの３’側に隣接して位置する１８１位はセリンである。その位置にセリンコドンＡＧＣ又はＡＧＴを有するＨＣコード配列は、同じ位置にセリンコドンＴＣＧを有するＨＣコード配列よりも高いタイターを生じた。実施例１１及び図２を参照のこと。

ＶＩＩＩ．方法
別段の定義がない限り、本開示で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。実施者は、当技術分野の定義及び用語について、特に、Green, M.R., and Sambrook, J., eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)及びAusubel, F. M., et al., Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 99), John Wiley & Sons, New York (2012)（これらは参照により本開示に取り込まれる）を参照されたい。標準的な方法は、Bindereif, Schon, & Westhof (2005) Handbook of RNA Biochemistry, Wiley-VCH, Weinheim, Germanyにも示されているが、この文献はＲＮＡ操作及び分析のための詳細な方法を記載しており、参照により本開示に取り込まれる。組換え核酸を生成するための適切な分子技術及び多くのクローニング演習を通して当業者に指示を与えるのに充分な説明の例は、参照により本開示に取り込まれる、Green, M.R., and Sambrook, J., （同上）、Ausubel, F. M., et al., （同上）、Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology (Volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 1987)、及びPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, San Diego, Calif. 1990)に見られる。

ＰＣＲ増幅法は当技術分野で周知であり、例えば、Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press Inc. San Diego, Calif., 1990に記載されている。増幅反応系は、典型的には、増幅対象のＤＮＡ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、２つのオリゴヌクレオチドプライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液、及びマグネシウムを含む。典型的には、望ましい熱サイクル数は１～２５である。プライマーの設計及びＰＣＲ条件の最適化の方法は、当技術分野で周知であり、Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 5^thEdition, Wiley, 2002及びInnis et al., PCR Protocols, Academic Press, 1990などの標準的な分子生物学のテキストに見出すことができる。コンピュータプログラムは、必要な特異性及び最適な増幅特性を備えたプライマーの設計に役立つ（例えば、Oligo Version 5.0(National Biosciences社））。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、ベクター内の特定の制限酵素部位への増幅されたＤＮＡフラグメントの挿入を容易化するために、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位をさらに含んでいてもよい。制限酵素部位をＰＣＲプライマーの５’末端に追加する場合、酵素によるより効率的な切断を可能にするために、余分な５’塩基を数個（例えば、２つ又は３つ）含ませることが好ましい。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーはまた、その後のインビトロ転写を可能にするためのＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位、例えばＴ７又はＳＰ６、を含んでいてもよい。インビトロ転写の方法は当業者に周知である（例えば、Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1663-1667, 1990及びEberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:3010-3014, 1992を参照のこと）。

本開示に記載された抗体が名称によって示される場合、これは、類似の機能を有し、類似のアミノ酸配列を有するＨＣ及びＬＣを有する抗体を包含することが理解される。例えば、「Ｂ１０抗体」という名称は、配列番号１の配列のＨＣ及び配列番号２の配列のＬＣを有する野生型抗体、並びに配列番号１又は配列番号２と類似のアミノ酸配列を有するＨＣ及び／又は軽鎖を有する抗体を包含する。配列類似性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であってもよい。タンパク質の配列同一性は、ＢＬＡＳＴＰプログラムを使用して、デフォルトのワード長さ３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いて測定される（Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992を参照のこと）。

形質転換
ＨＣコード配列及びＬＣコード配列を含むベクターは、標準的な技術によってホスト細胞にトランスフェクトされてもよい。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、大腸菌細胞への外来性ＤＮＡの導入に一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション、等々、を包含することを意図している。ベクターで形質転換された大腸菌細胞は、ＨＣ及びＬＣの発現を可能にする適切な増殖条件下で培養することができる。細胞を回収し、標準的な技術を使用して細胞ライセートを調製する。

ＨＣ及びＬＣのアセンブリー
大腸菌培養物から調製された細胞ライセートは、２つのＬＣ及び２つのＨＣが全長抗体の４量体型にアセンブリーすることを可能とする条件に調整することができ、これは２つの重鎖の二量体化、並びにジスルフィド結合の形成による重鎖及び軽鎖の結びつけを可能にすることを含む。典型的には、細胞ライセートを適切なｐＨ（例えば、ｐＨ８．０）に調整し、振とうにより延長された時間インキュベートして、ジスルフィド結合の形成と全長抗体のアセンブリーを可能にする。説明用の一例では、細胞ライセートは、ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ（ｍ２ｐ－ｌａｂｓ）で２５℃、６５０ｒｐｍで振とうしながら１６時間インキュベートすることにより、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌでｐＨ８．０に調整される。

全長抗体の精製
アセンブリーされたＩｇＧは、標準的なアフィニティークロマトグラフィー法を使用して細胞ライセートから精製した。タンパク質精製、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、及び結晶化のための様々な方法が、Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New Yorkに記載されている。無細胞合成の方法は、Spirin & Swartz (2008) Cell-free Protein Synthesis, Wiley-VCH, Weinheim, Germanyに記載されている。抗体におけるＨＣ及びＬＣのアセンブリーの程度は、当技術分野で周知の方法を使用して、例えば非還元的条件下でＣａｌｉｐｅｒバイオアナライザー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社、カリフォルニア州リッチモンド）によって測定することができる。

タイター／収量
アセンブリーされた全長抗体のタイターは、標準的な方法を使用して測定でき、そのような方法は例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティング、クロマトグラフィー（例えば、分析用サイズ排除クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、及びＨＰＬＣ）、免疫ベースのアッセイ、及び酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）であるがこれらに限定されない。説明用の一例を、実施例２２に示す。

いくつかの実施形態では、特に大腸菌細胞がＩｇＧ生産のために高密度で増殖される場合、例えばＯＤ_６００が５０～１５０の範囲内である場合、本開示中に開示された方法を用いて生産された全長抗体のタイター（培地１リットルあたりの抗体の量で表す）は、約２００ｍｇ／Ｌ超、約２５０ｍｇ／Ｌ超、約３００ｍｇ／Ｌ超、約３５０ｍｇ／Ｌ超、約４００ｍｇ／Ｌ超、約４５０ｍｇ／Ｌ超、約５００ｍｇ／Ｌ超、約５５０ｍｇ／Ｌ超、約６００ｍｇ／Ｌ超、約６５０ｍｇ／Ｌ超、約７００ｍｇ／Ｌ超、約７５０ｍｇ／Ｌ超、約８００ｍｇ／Ｌ超、約８５０ｍｇ／Ｌ超、約９００ｍｇ／Ｌ超、約９５０ｍｇ／Ｌ超、約１０００ｍｇ／Ｌ超、又はそれ以上である。別の実施形態では、着目するタンパク質は、約１０００ｍｇ／Ｌ超、例えば、約１１００ｍｇ／Ｌ超、約１２００ｍｇ／Ｌ超、約１３００ｍｇ／Ｌ超、約１４００ｍｇ／Ｌ超、約１５００ｍｇ／Ｌ超、約１６００ｍｇ／Ｌ超、約１７００ｍｇ／Ｌ超、約１８００ｍｇ／Ｌ超、約１９００ｍｇ／Ｌ超、約２０００ｍｇ／Ｌ超、又はそれ以上の濃度（量又はレベル）で生産される。典型的には、高密度増殖は、０．５リットル～５リットルの容量のバイオリアクターで行われ、その１つの例示を実施例６に示す。しかしながら、本開示に記載の方法はより大きなスケールで実行してもよいことが想定されており、例えば、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、２５００Ｌ以上、３０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、８０００Ｌ以上、１０，０００Ｌ以上、又はそれ以上の培養容量が挙げられる。

いくつかの実施形態では、本開示中に開示される方法を使用して生産される全長抗体のタイターは、培養物中の大腸菌細胞から生み出された湿潤細胞ペレットの重量に対して、０．０５～２０％、０．０５～１０％、０．０５％～５％、０．０５％～４％、０．０５％～３％、０．０５％～２％、０．０５％～１％、又は０．０５％～０．５％の範囲内の湿重量パーセントとなる。この範囲の下限に関しては、生産される全長抗体のタイターは、培養物中の大腸菌細胞の重量に対して少なくとも０．０５％、少なくとも０．１％、少なくとも０．２％、少なくとも０．３％、少なくとも０．４％、少なくとも０．５％、又は少なくとも０．６％の湿重量パーセントとなる。

ＩＸ．抗体薬物複合体
本開示の方法を使用して生産された抗体は、クリックケミストリーなどの化学反応を使用して生物学的に活性な付加物（別名、ペイロード）にコンジュゲーションすることができる。いくつかの場合には、この抗体は、タンパク質配列中の特定の部位に１つ又は複数の非天然アミノ酸を含み、生物学的に活性な付加物はこれらの非天然アミノ酸にコンジュゲーションすることができる。所望のアミノ酸位置に非天然アミノ酸を含む抗体を有する場合、生物学的に活性な付加物は、クリックケミストリーなどの化学反応を使用して前記非天然アミノ酸にコンジュゲーションすることができる。例えば、本開示中に開示された方法を用いて生産されたｐＡＭＦ含有抗体は、標準的な手順によって精製することができる。次に、精製されたタンパク質をクリックケミストリー反応（例えば、銅（Ｉ）に触媒されるアジド－アルキン１，３－環化付加反応又は銅を含まない触媒によるアジド－アルキン１，３－環化付加反応）に供して、生物学的に活性な付加物をｐＡＭＦ残基に直接コンジュゲーションさせる。

本発明における使用のための例示的な生物学的に活性な付加物としては、低分子、オリゴヌクレオチド、ペプチド、アミノ酸、核酸、糖、オリゴ糖、ポリマー、合成ポリマー、キレート剤、蛍光団、発色団、その他の検出可能な剤、薬物部分、細胞毒性剤、検出可能な剤、等々が挙げられるが、これらに限定されない。

生物学的に活性な付加物のコンジュゲーションのためのクリックケミストリー反応の詳細な説明は、例えば、Baskin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 2007, 104: 16793-16797、Kim et al., Curr. Opin. Chem. Biol., 2013, 14:412-419、及びBundy and Swartz, Bioconjug. Chem., 2010, 21(2):255-263に見られる。

クリックケミストリー反応では、アルキンはアジドとの［３＋２］環化付加のために活性化される。ひずみのある（strained）アルキン（例えば、シクロオクチン又はそのバリアント）を含む（例えば、該アルキンに連結された）生物学的に活性な付加物は、着目するタンパク質上の非天然アミノ酸であるパラメチルアジド－Ｌ－フェニルアラニンとひずみにより促進される（strain-promoted）アルキン－アジド環化付加を起こすことができ、これにより、前記非天然アミノ酸のアミノ酸位置において前記生物学的に活性な付加物を前記タンパク質にコンジュゲーションさせる。好ましいひずみアルキン試薬は、以下に示す試薬ＤＢＣＯである。

リンカー
ある特定の実施形態において、前記抗体は、抗体のアミノ酸（例えば、非天然アミノ酸）及び生物学的に活性な付加物と反応することができる１つ又は複数のリンカーを用いて、前記生物学的に活性な付加物に連結することができる。「リンカー」という用語は、化学反応の結果として通常形成される基又は結合を指すために使用され、典型的には共有結合的連結である。本開示で使用されるリンカーは、当業者にとって明らかな任意のリンカーであってもよい。ある特定の実施形態では、リンカーは、当業者に既知の任意の二価又は多価リンカーである。有用な二価リンカーとしては、アルキレン、置換アルキレン、ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、及び置換ヘテロアリーレンが挙げられる。ある特定の実施形態では、リンカーは、Ｃ１～１０アルキレン又はＣ１～１０ヘテロアルキレンである。適切なリンカーはまた、その全内容が参照により本開示に取り込まれる、米国特許第１０，５９６，２７０号にも開示されている。

着目するコンジュゲーションされたタンパク質は、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、当技術分野で既知の標準的な方法に従って精製することができ、それらには、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、分取用等電点電気泳動）、微分溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、又は抽出（例えば、Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。

着目するコンジュゲーションされたタンパク質は、当技術分野で既知の標準的な方法に従って定量化することができ、それらには、質量分析（例えば、ＥＳＩ－ＴＯＦ質量分析及びタンデム質量分析）、マイクロフルイディクス電気泳動、ゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、免疫測定法（例えば、ＥＬＩＳＡ）、及びコンジュゲーションされたタンパク質の活性を評価するためのその他アッセイが含まれるが、これらに限定されない。

Ｘ．使用
非天然アミノ酸を組み込んだものを含む、本発明によって生産される抗体は、以下の目的又は効果の１つ又は複数のために使用することができる：感染性因子の増殖、感染、又は機能を阻害すること、又は該感染性因子を死滅させること（該感染性因子としては、細菌、ウイルス、菌類、及びその他の寄生虫が制限無しに挙げられる）；身体的特徴に影響を与える（抑制又は増強する）こと（該身体的特徴としては、身長、体重、髪の色、眼の色、肌、脂肪対除脂肪比（fat-to-lean ratio）若しくはその他の組織の色素沈着、又は器官若しくは身体部位のサイズ若しくは形状（例えば、胸の増強又は縮小、形態又は形状の変化など）が制限無しに挙げられる）；バイオリズム又は概日周期若しくはリズムに影響を与えること；男性対象又は女性対象の生殖能力に影響を与えること；食事の脂肪、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子、又はその他の栄養因子若しくは栄養成分の代謝、異化、同化、プロセシング、利用、貯蔵、又は排出に影響を与えること；行動特性に影響を与えること（該行動特性としては、食欲、性欲、ストレス、認知（認知障害を含む）、うつ病（抑うつ障害を含む）、及び暴力的行動が制限無しに挙げられる；鎮痛効果又はその他の痛み軽減効果を与えること；造血系統以外の系統における胚性幹細胞の分化及び増殖を促進すること；ホルモン活性又は内分泌活性；酵素の場合、該酵素の欠乏を修正し、欠乏関連疾患を治療すること；過剰増殖障害（例えば、乾癬など）の治療；免疫グロブリン様活性（抗原又は補体に結合する能力など）；並びにワクチン組成物における抗原として作用し、タンパク質又は該タンパク質と交差反応する別の材料若しくは実体に対する免疫応答を引き起こす能力。

本発明によって生産される抗体は、当業者に既知の任意の目的のために使用することができる。好ましい用途には、診断用途、予防用途、及び治療用途を含め、医療用途が含まれる。例えば、前記抗体は、局所投与又は他のタイプの投与のために調製することができる。したがって、本発明によって生産されるタンパク質は、薬理学的に許容される溶液に可溶化又は懸濁されて、対象への投与のための医薬組成物を形成する。医療目的のための適切な緩衝液及び医薬組成物の投与方法は、以下にさらに記載される。医療用組成物はヒト以外の対象にも投与できること、例えば獣医学的目的で投与できること、は当業者には理解されるであろう。

本開示に記載の実施例及び実施形態は例示目的のみのものであり、それらを考慮して様々な修正又は変更が当業者に示唆されることとなり、それらは本出願の精神及び視界並びに添付の特許請求の範囲に含まれるものであることが理解される。本開示で引用される全ての刊行物、配列アクセション番号、特許、及び特許出願は、全ての目的のために参照によりその全体が本開示に取り込まれる。

実施形態
本開示は、以下の例示的な実施形態を含む。
実施形態１．
重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む全長抗体の製造方法であって、
培地中で、前記ＨＣ及び前記ＬＣを生産するのに許容可能な条件下で前記ＨＣのコード配列及び前記ＬＣのコード配列を発現する大腸菌細胞を培養すること、を含み、
前記全長抗体が、前記培地１リットルあたり少なくとも約２００ｍｇの量で生産されるか、あるいは
前記大腸菌細胞から生み出された細胞ペレットの重量に対する生産された全長抗体の重量パーセントが、０．０５％～２０％の範囲内である、
前記方法。

実施形態２．
前記大腸菌細胞の少なくとも一部が酸化的な細胞質を含む、実施形態１に記載の方法。

実施形態３．
プラスミドを前記大腸菌株に形質転換することを含む、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態４．
前記ＨＣ及び前記ＬＣは前記大腸菌の細胞質で生産される、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態５．
生産された前記ＨＣ及び前記ＬＣを非還元的条件下でアセンブリーして、全長抗体を形成することをさらに含む、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態６．
前記大腸菌からの生産された前記ＨＣと生産された前記ＬＣとのモル比が、約１：１～約１：３である、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態７．
ＨＣ、ＬＣ、又はその両方の発現がプロモーターによって制御され、
前記プロモーターが、Ｔ７プロモーター、又はＴ７プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーターであるか、あるいは、
前記プロモーターが、Ｔ５プロモーター、又はＴ５プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーターである、
請求項１～請求項６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態８．
前記プラスミドが、バイシストロン性オペロンを含み、
前記バイシストロン性オペロンが、前記ＨＣのコード配列及び前記ＬＣのコード配列を含む、あるいは
前記プラスミドが、前記ＨＣのための第１のモノシストロン性オペロン及び前記ＬＣのための第２のモノシストロン性オペロンを含む、
上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態９．
前記バイシストロン性オペロンが、前記ＨＣ及び前記ＬＣの両方の発現をドライブするプロモーターを含み、
前記プロモーターが、Ｔ７プロモーター、又はＴ７プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーターであるか、あるいは
前記第１のモノシストロン性オペロン又は前記第２のモノシストロン性オペロンが、Ｔ７プロモーターを含む、
実施形態８に記載の方法。

実施形態１０．
前記バイシストロン性オペロンが、Ｔ７ターミネーターを含むか、あるいは
前記第１のモノシストロン性オペロン又は前記第２のモノシストロン性オペロンが、Ｔ７ターミネーターを含む、
上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態１１．
前記大腸菌細胞が、前記ＨＣの翻訳のための第１のリボソーム結合部位及び前記ＬＣの翻訳のための第２のリボソーム結合部位を含み、前記第１のリボソーム結合部位及び前記第２のリボソーム結合部位が、前記大腸菌から生産されるＨＣ及びＬＣのモル比が１：１～１：３の範囲内になるように選択される、請求項１～請求項１０のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１２．
前記第１のリボソーム結合部位が、配列番号１７～１９からなる群から選択されるＤＮＡ配列から転写され、かつ前記第２のリボソーム結合配列が、配列番号２０～２３からなる群から選択されるＤＮＡ配列から転写される、実施形態１１に記載の方法。

実施形態１３．
前記第１のリボソーム結合部位が、配列番号１７又は配列番号１８の配列を有する、実施形態１１又は実施形態１２のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１４．
前記全長抗体の前記ＨＣ及び／又は前記ＬＣが、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態１５．
前記ＨＣのコード配列及び／又は前記ＬＣのコード配列が、少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンを有するように改変されており、前記非天然アミノ酸コドンが、どの天然アミノ酸の組み込みも生じない、実施形態１４に記載の方法。

実施形態１６．
前記少なくとも１つの非天然アミノ酸が、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンに相補的なアンチコドンを含むｔＲＮＡに積ませる（charge）ことによって導入される、実施形態１４に記載の方法。

実施形態１７．
前記少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンが、アンバーコドンＴＡＧである、実施形態１４～実施形態１６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１８．
前記少なくとも１つの非天然アミノ酸が、パラメチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ＡＥＫ、又はｐＡｃＦである、実施形態１４～実施形態１６のいずれか１つに記載の方法。

実施形態１９．
前記非天然アミノ酸のうちの少なくとも１つの３’側に隣接するコドンが、コドン最適化されている、請求項１５～請求項１８のいずれか１つに記載の方法。

実施形態２０．
前記全長抗体が、Ｂ１０抗体、Ｈ０１抗体、７２１９抗体、抗ＰＤ１抗体、抗Ｔｉｍ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、又は抗Ｈｅｒ２抗体である、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態２１．
前記Ｂ１０抗体のＨＣのコード配列が、配列番号１に対する変異を含み、前記変異の結果、天然アミノ酸のコドンが非天然アミノ酸コドンに置換され、
前記天然アミノ酸は、Ｆ４０４、Ｙ１８０、及びＦ２４１から選択される１つ又は複数のアミノ酸であり、そして
非天然アミノ酸が、該非天然アミノ酸コドンに相補的なｔＲＮＡに積ませる（charge）ことにより、前記ＨＣに導入される、実施形態２０に記載の方法。

実施形態２２．
前記Ｂ１０抗体の前記ＬＣのコード配列又は前記トラスツズマブの前記ＬＣのコード配列が、配列番号２に対する少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異により、天然アミノ酸のコドンが非天然アミノ酸コドンに置換され、前記天然アミノ酸が、Ｋ４２又はＥ１６１である、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態２３．
前記全長抗体の前記ＨＣ又は前記ＬＣ上の前記非天然アミノ酸にリンカーを介して弾頭部分を共有結合的に連結させることをさらに含む、上記実施形態のうちのいずれか１つに記載の方法。

実施形態２４．
前記弾頭が、ＳＣ２３６又はアミノオキシ－ＰＥＧ８－メタンである、実施形態２３に記載の方法。

以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された発明を例示するために与えられたものであって、該発明を限定するものではない。

実施例１． ＳｎｕｇｇｌｅにおけるＩｇＧ発現用プラスミドの生産
ＩｇＧの生産には、重鎖（ＨＣ）ポリペプチド及び軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドの同時合成が必要である。ＩｇＧ発現プラスミドｐＪ４１１－ＨＣ－ＬＣ Ｂ１０を作製するために、ＨＣ及びＬＣの遺伝子を、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを有する単一のバイシストロン性オペロンにクローニングした。このバイシストロン性オペロンは配列番号３５を含む。このプラスミドは高コピーｐＵＣ複製起点を有し、カナマイシンで選択可能なマーカーを含む。プラスミド配列は、クローニングで確認した。ＨＣ及びＬＣの両方とも、独立したリボソーム結合部位を有していた。ＨＣとＬＣとの比率を最適化するために、どちらかの遺伝子のリボソーム結合部位に変異を加えた。実施例において様々な発現プラスミドを作製するために使用された親プラスミドＰＪ４１１、ＰＪ４１１、ＰＪ４０１、及びＰＪ４３４は、ＡＴＵＭ社（カリフォルニア州ニューワーク）から購入した。同じ発現プラスミドｐＪ４１１－ＨＣ－ＬＣ Ｂ１０を実施例１～実施例６で使用した。

本開示及び実施例の目的のために、「αＦｏｌＲａ Ｂ１０」及び「Ｂ１０ ＷＴ」は互換的に使用される。いくつかの場合には、前記コンストラクトで使用されるプロモーターを示すためにさらなる命名法が追加される。例えば、「Ｂ１０ ＷＴ－Ｔ７ｐ」は、Ｔ７プロモーターを使用するＢ１０野生型（ＷＴ）コンストラクトを表す。

実施例２．野生型（ＷＴ）ＩｇＧ発現の振とうフラスコでの例
αＦｏｌＲ ＩｇＧ Ｂ１０を発現させるための大腸菌株は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６０３４５号に記載されるＳｎｕｇｇｌｅを、プラスミドｐＪ４１１－ＨＣ－ＬＣ Ｂ１０で形質転換することによって作製した。この株を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）中、３７℃で一晩増殖させた。午前中に、新鮮なＴＢ＋カナマイシン（Ｋａｎ）に１：５０に希釈し、ＯＤ_６００が１．５になるまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＨＣ遺伝子及びＬＣ遺伝子の発現を、０．２％の終濃度へとアラビノースを添加することによって誘導した。温度を２５℃に調整し、タンパク質発現が１６時間続いた。６０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を回収した。

実施例３． 振とうフラスコでのインビボＩｇＧ発現の分析
実施例２に記載されるようにして６０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を回収し、次いで凍結させた。解凍した細胞を、１０ｍＬ／ｇの湿細胞重量（ｗｃｗ）で改変Ｓ３０緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．２、２ｍＭ酢酸マグネシウム、６０ｍＭ酢酸カリウム、及び０．１ｍｇ／Ｌ鶏卵白リゾチーム）中で超音波処理することによって溶解（lyse）し、デブリを１９，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー法を用いて細胞ライセートからＩｇＧを精製し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法により抗体濃度を測定した。

実施例４． 酸化的な細胞質株Ｓｈｕｆｆｌｅ及びＳｎｕｇｇｌｅにおけるインビボＩｇＧ発現の比較
Ｓｎｕｇｇｌｅ株及びＳｈｕｆｆｌｅ株（ＮＥＢ社、マサチューセッツ州ケンブリッジ）をプラスミドｐＪ４１１－ＨＣ－ＬＣ Ｂ１０で形質転換した。Ｓｕｇｇｌｅ及びＳｈｕｆｆｌｅの遺伝子構成の違いは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６０３４５号に記載されている。簡潔に言えば、Ｓｈｕｆｆｌｅ株は、チオレドキシンレダクターゼ活性（ＴＲＸＢ）及びグルタチオンレダクターゼ活性（ＧＯＲ）を欠いている。また、Ｓｈｕｆｆｌｅ株は、シグナル配列のないＤｓｂＣと、ペルオキシレダクターゼ活性を欠くがグルタチオンレダクターゼ活性を有する酵素をコードするａｈｐＣ遺伝子のバリアント（ａｈｐＣ^＊）とを過剰発現する。Ｓｈｕｆｆｌｅと比較してチオレドキシン１活性（ＴｒｘＡ）も欠くように、Ｓｎｕｇｇｌｅ株は（Ｓｈｕｆｆｌｅに基づいて）さらに改変されている。その結果、Ｓｎｕｇｇｌｅ株は、ｔｒｘＡ、ｔｒｘＢ、及びｇｏｒにヌル変異を含み、したがってチオレドキシンレダクターゼ活性（ＴｒｘＢ）、チオレドキシン１活性（ＴｒｘＡ）、及びグルタチオンレダクターゼ活性（ＧＯＲ）を欠いている。また、Ｓｎｕｇｇｌｅ株は、シグナル配列のないＤｓｂＣも過剰発現し、ペルオキシレダクターゼ活性を欠くがグルタチオンレダクターゼ活性を有する酵素をコードするａｈｐＣ遺伝子のバリアント（ａｈｐＣ^＊）も過剰発現する。

両方の株からの細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）中、３７℃で一晩増殖させた。午前中に、両方の培養物を、新鮮なＴＢ＋Ｋａｎに１：５０に希釈し、両方の株が最終ＯＤ_６００１．５に達するまで３７℃で増殖させた。終濃度０．２％のアラビノースを添加することにより、ＳＢＤＧ４１９中でＩｇＧ発現を誘導した。Ｓｈｕｆｆｌｅ細胞におけるＩｇＧ発現は、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって誘導した。温度を２５℃に調整し、タンパク質発現が１６時間続いた。

図１は、ＦｏＲａ Ｂ１０野生型（ＷＴ）ＩｇＧのＨＣ及びＬＣを共発現するＳｈｕｆｆｌｅ株及びＳｎｕｇｇｌｅ株の細胞ライセートのタイターの比較を示し、Ｓｎｕｇｇｌｅに存在する上記で説明したさらなる変異は、高レベルのＩｇＧ合成に役立つことを意味している。

実施例５． 大腸菌における野生型（ＷＴ）ＩｇＧのインビボ生産のための細胞バンク株
本開示に記載の野生型（ＷＴ）ＩｇＧ株（すなわち、ｐＪ４１１－ＨＣ－ＬＣ Ｂ１０）の各々の形質転換後培養物を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢプレートにストリークし、コロニー発生のために３０℃のインキュベーターでインキュベートした。次いで、シングルコロニーを取って（pick）、１０ｍＬのＩ１７－ＳＦ振とうフラスコ培地を充填した５０ｍＬのバイオリアクターチューブに接種した（表８及び表９が、Ｉ１７－ＳＦ振とうフラスコ培地の成分を記載する）。次いで、前記チューブをオービタル直径２５ｍｍのシェーカー内で３０℃及び２５０ｒｐｍで１５～２４時間インキュベートした。培養物のＯＤ５９５ｎｍが２～４に達したら、細胞をＩ１７－ＳＦ振とうフラスコ培地で１０％～２５％（ｖ／ｖ）の播種密度で継代培養した。前記フラスコをオービタル直径２５ｍｍのシェーカー内で３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。ＯＤ５９５ｎｍが２～３に達したら、細胞を８０％の予め滅菌したグリセロールと、２０％（ｖ／ｖ）の濃度となるよう混合し、１ｍＬクライオバイアルにアリコートし、次いで液体窒素で瞬間冷凍（flash freeze）して、長期保存のために－８０℃のフリーザー中に置いた。

実施例６． 高密度発酵により大腸菌で生産された野生型（ＷＴ）ＩｇＧの発現及び細胞溶解
発酵プロセスは、細胞バンクの１ｍＬバイアルを取り、約３％（ｖ／ｖ）の播種密度で、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＩ１７－ＳＦ振とうフラスコ限定培地を収容した振とうフラスコに接種することによって開始した。ＯＤ５９５ｎｍが２～４に達したら、フラスコ培養物を、バッチ培地中の播種密度１．５％（ｖ／ｖ）で５００ｍＬバイオリアクターに対して接種するのに使用したが、該バッチ培地は、脱イオン水中における３０μｇ／ｍＬカナマイシン、０．１％（ｖ／ｖ）Ｐ２０００消泡剤、及び１．２％（ｖ／ｖ）１０×Ｉ１７培地（表５、表６、及び表７が、１０×Ｉ１７培地の成分を記載する）からなるものであった。前記バイオリアクターの温度、溶存酸素、及びｐＨの設定値は、それぞれ３７℃、３０％、及び７であった。前記細胞がバッチフェーズでＯＤ５９５ｎｍが２～５に増殖したら、０．２０ｈ^－１という指数関数的速度で１０×Ｉ１７培地を供給することで流加（fed-batch）フェーズを開始した。１０時間の流加フェーズの後、前記バイオリアクターの温度を２５℃に低下させ、指数関数的な供給速度を０．０２ｈ^－１に低下させた。１時間後、Ｌ－アラビノースを前記バイオリアクターの開始容量に基づいて４ｇ／Ｌの目標濃度になるように添加することにより、誘導フェーズを開始した。誘導フェーズは、回収前に２４～４８時間かかった。発酵の終了時点で、培養物を回収し、フロア型遠心分離機で１８，５９２×ｇ及び２℃～８℃で１５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、１６．６７％（ｗ／ｗ）の濃度でＳ３０緩衝液（表１０がＳ３０緩衝液の成分を記載する）で洗浄し、最初の回収工程で用いた条件と同じ条件で再度遠心分離した。前記洗浄後、上清を捨て、前記細胞を１６．６７％（ｗ／ｗ）の濃度で、Ｓ３０－５緩衝液（表１１がＳ３０－５緩衝液の成分を記載する）で再懸濁した。次いで、この細胞再懸濁物をＡｖｅｓｔｉｎ社のホモジナイザー（ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ－Ｃ５）に１７，０００Ｐｓｉで通して細胞を破壊し、粗ライセートを生成した。この粗ライセートを、フロア型遠心分離機で１８，０００～２０，０００×ｇ及び２℃～８℃で３０分間遠心分離することによって、さらに清澄化した。上清（清澄化したライセート）を集めてアリコートし、液体窒素で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。

実施例７． ＳｎｕｇｇｌｅにおけるｐＡＭＦ含有ＩｇＧの発現のためのプラスミドの作製
非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）を含むＩｇＧ生産には、重鎖（ＨＣ）ポリペプチドと軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドとを同時に合成する必要があり、ここで前記ＨＣ及び／又は前記ＬＣがＮＮＡＡを含む。抗体Ｂ１０ ＨＣ Ｆ４０４ ｐＡＭＦの発現のためのプラスミドｐＪ４１１－ＨＣ Ｆ４０４ＴＡＧ－ＬＣ Ｂ１０を作製するために、ＨＣの遺伝子及びＬＣの遺伝子を、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを有する単一のバイシストロン性オペロンにクローニングした。ＨＣ残基Ｆ４０４のコドンをＴＡＧに変異させて、ＮＮＡＡの位置を指定した。このプラスミドは高コピーのｐＵＣ複製起点を有し、カナマイシン耐性のための遺伝子を含んでいる。プラスミド配列は、クローニングによって確認した。ＨＣ及びＬＣの両方とも、独立したリボソーム結合部位を有していた。ＨＣとＬＣとの比率を最適化するために、いずれかの遺伝子のリボソーム結合部位に変異を加えた。ｐＪ４１１－ＨＣ Ｆ４０４ＴＡＧ－ＬＣ Ｂ１０は、Ｆ４０４コドンのＴＡＧへの変異を除いて、ｐＪ４１１－ＨＣ－ＬＣ Ｂ１０と同じである。

同時翻訳ｐＡＭＦ取り込みには、既存のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡｔＲＳ）に対して直交性（orthogonal）であるアンバーサプレッサーｔＲＮＡ、並びにアンバーサプレッサーｔＲＮＡ及びｐＡＭＦ ＮＮＡＡを特異的に認識する直交性ＡＡｔＲＳの発現も必要である。これらｐＡＭＦ ＡＡｔＲＳ及びｔＲＮＡの遺伝子を、バイシストロン性オペロンとして、誘導性Ｔ７プロモーター及び構成的プロモーターＰｃ０の下流の位置で、ベクターｐＪ４３４にクローニングした。このベクターは、ｐ１５Ａ複製起点と、カルベニシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ選択マーカーとを有する。これら複製起点及びマーカーの両方がｐＪ４１１と適合性がある。プラスミド配列は、クローニングによって確認した。

実施例８． ｐＡＭＦ ＩｇＧ発現の振とうフラスコでの例
残基４０４にｐＡＭＦを有するαＦｏｌＲ ＩｇＧの発現のための大腸菌株は、Ｓｎｕｇｇｌｅ株ＳＢＤＧ４１９をプラスミドｐＪ４１１－ＨＣ Ｆ４０４ＴＡＧ－ＬＣ Ｂ１０及びｐＪ４３４ Ｐｃ０ ｐＡＭＦ ＲＳ－ｔＲＮＡで共形質転換することによって作製した。この株を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有するテリフィックブロス（ＴＢ）中、３７℃で一晩増殖させた。午前中に、これを新鮮なＴＢ＋Ｋａｎ／カルベニシリン（Ｃａｒｂ）に１：５０に希釈し、ＯＤ_６００が１．５になるまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＨＣ遺伝子、ＬＣ遺伝子、ＡＡｔＲＳ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子のＴ７にドライブされる転写を、終濃度０．２％アラビノース及び２ｍＭのｐＡＭＦの添加によって誘導した。温度を２５℃に調整し、タンパク質発現は１６時間続いた。６０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を回収した。

実施例９． 大腸菌におけるｐＡＭＦ－ＩｇＧのインビボ生産のための細胞バンク株
実施例８に記載されるｎｎＡＡ ＩｇＧ株の形質転換後培養物を、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＬＢプレートにストリークし、コロニー発生のために３０℃のインキュベーターでインキュベートした。次いで、シングルコロニーを取って（picked）、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する１０ｍＬのＩ１７－ＳＦ振とうフラスコ培地を充填した５０ｍＬのバイオリアクターチューブに接種した（Ｉ１７－ＳＦ振とうフラスコ培地の成分については表８及び表９を参照のこと）。次いで、前記チューブを、オービタル直径２５ｍｍのシェーカー内で３０℃及び２５０ｒｐｍで１５～２４時間インキュベートした。培養物のＯＤ５９５ｎｍが２～４に達したら、細胞をＩ１７－ＳＦ振とうフラスコ培地に１０％～２５％（ｖ／ｖ）の播種密度で継代培養した。前記フラスコをオービタル直径２５ｍｍのシェーカー内で３７℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。ＯＤ５９５ｎｍが２～３に達したら、細胞を、８０％の予め滅菌したグリセロールと、２０％（ｖ／ｖ）の濃度となるように混合し、１ｍＬクライオバイアルにアリコートし、次いで液体窒素で瞬間冷凍して、長期保存のために－８０℃のフリーザー中に置いた。

実施例１０． 高密度発酵により大腸菌で生産されたｐＡＭＦ－ＩｇＧの発現及び細胞溶解
発酵プロセスは、実施例９に記載される細胞バンクの１ｍＬバイアルを取り、約３％（ｖ／ｖ）播種密度で、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有するＩ１７－ＳＦ振とうフラスコ培地を含む振とうフラスコに接種することによって開始した。ＯＤ５９５ｎｍが２～４に達したら、フラスコ培養物を、バッチ培地の播種密度１．５％（ｖ／ｖ）で５００ｍＬバイオリアクターに接種するのに使用したが、該バッチ培地は、脱イオン水中における３０μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、０．１％（ｖ／ｖ）Ｐ２０００消泡剤、及び１．２％（ｖ／ｖ）１０×Ｉ１７培地（表５、表６、及び表７が、１０×Ｉ１７培地の成分を記載する）からなるものであった。前記バイオリアクターの温度、溶存酸素、及びｐＨの設定値は、それぞれ３７℃、３０％、及び７であった。前記細胞がバッチフェーズでＯＤ５９５ｎｍが２～５に増殖したら、０．２０ｈ^－１という指数関数的速度で１０×Ｉ１７培地を供給することで流加（fed-batch）フェーズを開始した。１０時間の流加フェーズの後、前記バイオリアクターの温度を２５℃に低下させ、指数関数的な供給速度を０．０２ｈ^－１に低下させた。１時間後、ｐＡＭＦを誘導前の前記バイオリアクターの培養容量に基づいて２ｍＭの目標濃度になるように添加し、Ｌ－アラビノースを前記バイオリアクターの開始容量に基づいて４ｇ／Ｌの目標濃度になるように添加することにより、誘導フェーズを開始した。誘導フェーズは、回収前に２４～４８時間かかった。発酵の終了時点で、培養物を回収し、フロア型遠心分離機で１８，５９２×ｇ及び２℃～８℃で１５分間遠心分離した。上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、１６．６７％（ｗ／ｗ）の濃度でＳ３０緩衝液（Ｓ３０緩衝液の成分のさらなる情報については、表１０を参照のこと）で洗浄し、最初の回収工程で使用した条件と同じ条件で再度遠心分離した。前記洗浄後、上清を捨て、前記細胞を１６．６７％（ｗ／ｗ）の濃度で、Ｓ３０－５緩衝液（Ｓ３０－５緩衝液の成分に関する情報については、表１１を参照のこと）で再懸濁した。次いで、この細胞再懸濁物をＡｖｅｓｔｉｎ社のホモジナイザー（ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ－Ｃ５）に１７，０００Ｐｓｉで通して細胞を破壊し、粗ライセートを生成した。この粗ライセートは、フロア型遠心分離機で１８，０００～２０，０００×ｇ及び２℃～８℃で３０分間遠心分離することによって、さらに清澄化した。上清（清澄化したライセート）を集めてアリコートし、液体窒素で瞬間凍結し、－８０℃で保存した。

実施例１１．ＮＮＡＡ含有ＩｇＧの発現のための、ＴＡＧの３’側のコドンの最適化
Ｂ１０ Ｙ１８０ ｐＡＭＦ含有ＩｇＧの生産用にＳ１８１コドンを最適化するために、Ｓｅｒ１８１位置にＳｅｒコドンＡＧＣ又はＡＧＴを有するＨＣ Ｙ１８０ＴＡＧ遺伝子を生産した。ＨＣの遺伝子及びＬＣの遺伝子を、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを有する単一のバイシストロン性オペロンでｐＪ４１１にクローニングした。このプラスミドｐＪ４１１－ＨＣ Ｙ１８０ＴＡＧ－ＬＣ Ｂ１０は高コピーのｐＵＣ複製起点を有し、カナマイシン耐性のための遺伝子を含んでいる。プラスミド配列は、クローニングによって確認した。ＨＣ及びＬＣの両方は、それぞれ配列番号１７及び配列番号２０の配列を有する独立したリボソーム結合部位を有していた。ｐＪ４１１－ＨＣ Ｙ１８０ＴＡＧ－ＬＣ Ｂ１０は、Ｙ１８０コドンのＴＡＧへの変異を除いて、ｐＪ４１１－ＨＣ－ＬＣ Ｂ１０と同じである。

ＳＢＤＧ４１９株を、コドン最適化Ｂ１０発現プラスミド並びにｐＡＭＦ ＲＳ及びｔＲＮＡを含むｐＪ４３４で共形質転換し、ｐＡＭＦを含むＩｇＧを実施例８と同様にして発現させた。

図２は、０個、２個、又は４個のｐＡＭＦ非天然アミノ酸及び表示したＳ１８１コドンを用いて生産されたＦｏｌＲａ－Ｂ１０ ＩｇＧについての、細胞ライセートにおけるタイターの比較を示す。図２に示すように、Ｓｅｒ１８１位置にＳｅｒコドンＡＧＣ及びＡＧＴを有して作製されたＨＣ Ｙ１８０ＴＡＧ遺伝子は、同じ位置にＴＣＧを有するものよりも高いタイターを示す。このことは、３’側のＳ１８１コドンの最適化がタイターを実質的に改善できることを示している。

実施例１２． インビボで生産されたＩｇＧの再アセンブリー
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌでｐＨ８．０に調整した細胞ライセート中で、２５℃で６５０ｒｐｍで振とうしながらＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅ（ｍ２ｐ－ｌａｂｓ）中で１６時間インキュベートすることにより、ＩｇＧ再アセンブリーを行った。再アセンブリーされたＩｇＧを、標準的なアフィニティークロマトグラフィー法を使用して前記細胞ライセートから精製し、非還元的条件下でＣａｌｉｐｅｒバイオアナライザーによってアセンブリーを測定した。

図３は、非還元的条件下でＣａｌｉｐｅｒバイオアナライザーによって測定された、ＦｌｏｗｅｒＰｌａｔｅによる一晩の再アセンブリー後の、０個、２個、又は４個のｐＡＭＦ非天然アミノ酸を有して生産されたＦｏｌＲａ－Ｂ１０ ＩｇＧのアセンブリーの比較を示す。

実施例１３． 大腸菌におけるＩｇＧの最適発現のためのリボソーム結合部位バリアントのスクリーニング
ＳＰ７２１９ ＩｇＧについてのＨＣ及びＬＣの両方のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）バリアントを含むプラスミドを、ｐＪ４３４ Ｐｃ０ ｐＡＭＦ ＲＳ－ｔＲＮＡと共にＳＢＤＧ４１９に共形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）中、３７℃で一晩増殖させた。午前中に、これを新鮮なＴＢ＋Ｋａｎ／Ｃａｒｂに１：５０に希釈し、ＯＤ_６００が１．５になるまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＨＣ遺伝子、ＬＣ遺伝子、ＡＡｔＲＮＡＳ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子のＴ７にドライブされる転写を、終濃度０．２％アラビノース添加によって誘導し、２ｍＭのｐＡＭＦを培養物へ添加した。温度を２５℃に調整し、タンパク質発現は１６時間続いた。６０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を回収した。細胞を、１０ｍＬ／ｇ（湿潤細胞重量（ｗｃｗ））の改変Ｓ３０緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．２、２ｍＭ酢酸マグネシウム、及び６０ｍＭ酢酸カリウム）中での超音波処理によって溶解（lyse）し、デブリを１９，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。標準的なアフィニティークロマトグラフィー法を用いて細胞ライセートからＩｇＧを精製し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法により濃度を測定した。

重鎖の翻訳のためのリボソーム結合配列は、配列番号２８：ＡＸ_１ＧＡＧＸ_２Ｔ（Ｘ_１はＡ又はＧであるか、あるいはＸ_２はＡ又はＧである）のＤＮＡ配列から転写され得る。軽鎖の翻訳のためのリボソーム結合配列は、配列番号２９：ＡＸ_１Ｘ_２ＡＸ_３ＡＴ（Ｘ_１はＧ又はＡである、Ｘ_２はＧ又はＡであるか、あるいはＸ_３はＧ又はＴである）のＤＮＡ配列から転写され得る。

実施例１４． 大腸菌におけるｐＡｃＦ及びＡＥＫ非天然アミノ酸を含むＩｇＧの振とうフラスコ発現
ＳＢＤＧ４１９株を、ｐＪ４３４ Ｐｃ０ ｐＡｃＦ ＲＳ－ｔＲＮＡ又はｐＪ４３４ Ｐｃ０ Ｍｍ ＰｙｌＫ ＲＳ－Ｍｂ ＰｙｌＫ ｔＲＮＡと共に、Ｂ１０ Ｆ４０４ＴＡＧ ＩｇＧをコードするプラスミドで共形質転換した。アジドエトキシカルボニルリジン（ＡＥＫ）は、野生型（ＷＴ）ピロリジン合成酵素の基質である。これらの株を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）中、３７℃で一晩増殖させた。午前中に、これらを新鮮なＴＢ＋Ｋａｎ／Ｃａｒｂに１：５０に希釈し、ＯＤ_６００が１．５になるまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＨＣ遺伝子、ＬＣ遺伝子、ＡＡｔＲＮＡＳ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子の、Ｔ７にドライブされる転写を、終濃度０．２％アラビノース添加によって誘導し、２ｍＭのｐＡｃＦ又はＡＥＫを培養物へ適宜添加した。温度を２５℃に調整し、タンパク質発現は１６時間続いた。６０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を回収した。細胞を、１０ｍＬ／ｇ（ｗｃｗ）の改変Ｓ３０緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ ｐＨ８．２、２ｍＭ酢酸マグネシウム、及び６０ｍＭ酢酸カリウム）中での超音波処理によって溶解し、デブリを１９，０００×ｇで３０分間遠心分離することによって除去した。標準的なアフィニティークロマトグラフィー法を用いて細胞ライセートからＩｇＧを精製し、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法により濃度を測定した。

図４に、培地中に適切な非天然アミノ酸が存在する場合及び存在しない場合のＢ１０－Ｆ４０４ｐＡｃＦ及びＢ１０－Ｆ４０４ＡＥＫ（いずれも配列番号１７のＨＣリボソーム結合配列及び配列番号２０のＬＣリボソーム結合配列を有する）の発現を示す。ＮＮＡＡの非存在下でのタイターが低いことは、全長ＩｇＧの生産にはアンバー・サプレッションのためのＮＮＡＡが必要であることを示している。
実施例１５ 未処理の（intact）大腸菌におけるＩｇＧタイターのまとめ
表４及び表５は、上記の実施例に記載された条件下で、振とうフラスコ又はバイオリアクターにおいて大腸菌から生産されたＩｇＧのタイターの結果をまとめたものである。表４に示されたバイオリアクターの容積は０．５リットルであった。

列挙したＩｇＧをコードするプラスミド及び特定のＮＮＡＡのためのｔＲＮＡ／ＡＡｔＲＳをコードするプラスミドで共形質転換されたＳｎｕｇｇｌｅ細胞で発現したＮＮＡＡ ＩｇＧについての精製後のＡ２８０タイター。０ｍＭのｐＡＭＦの場合に発現された表中の３番目のエントリを除いて、全てのＮＮＡＡは２ｍＭで使用した。この試料のタイターが非常に低いことは、アンバー・サプレッション及び全長ＩｇＧの生産にＮＮＡＡが必要であることを示している。

列挙したＩｇＧをコードするプラスミド及び特定のＮＮＡＡのｔＲＮＡ／ＡＡｔＲＳをコードするプラスミドで共形質転換されたＳｎｕｇｇｌｅ細胞で発現したＮＮＡＡ ＩｇＧの精製後のＡ２８０タイター。ｐＡＭＦは２ｍＭで使用した。
実施例１６ 高密度大腸菌ＩｇＧ発酵のための培地及び成分

実施例１７． ｎｎＡＡ含有ｍＡｂのコンジュゲーション
非天然アミノ酸であるｐＡＭＦ、ＡＥＫ、及びｐＡｃＦを含むインビボで発現されたＢ１０－Ｆ４０４ＴＡＧ ＩｇＧに対して、クリックケミストリーバイオコンジュテーション反応を実施した。アジドｎｎＡＡ含有ＩｇＧ、Ｂ１０ Ｆ４０４ｐＡＭＦ、及びＢ１０ Ｆ４０４ＡＥＫを、以下のようにして、ひずみにより促進されるアルキン－アジド環化付加（ＳＰＡＡＣ）「クリック」ケミストリーを介してＤＢＣＯ－メイタンシンリンカー弾頭（ＳＣ２３６）にコンジュゲーションさせた。１ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを、ＰＢＳ中の１０倍モル過剰のＳＣ２３６と２２℃で１６時間反応させた。Ｂ１０ Ｆ４０４ｐＡｃＦ ＩｇＧは、以下のようにして、オキシムライゲーションを介してアミノオキシ－ＰＥＧ８－メタンにコンジュゲーションさせた。１３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧを、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）中、４０倍モル過剰のアミノオキシ－ＰＥＧ８－メタンと３０℃で７２時間反応させた。ＩｇＧをＩｄｅＳプロテアーゼで消化し、ＤＴＴで還元し、コンジュゲーション反応の程度をＬＣＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ６５２０ Ａｃｃｕｒａｔｅ－Ｍａｓｓ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳ）によって測定した。

図５に、ＤＢＣＯ－メイタンシン薬物リンカーＳＣ２３６にコンジュゲーションされたＢ１０ Ｆ４０４ｐＡＭＦのＦｃフラグメントのデコンボリューションされたＬＣＭＳスペクトルを示す。コンジュゲートの理論質量が２５２５８．０４Ｄａであるのに対して、観測された主な種は、２５２５７．９７Ｄａの質量を有している。未コンジュゲーションＦｃフラグメントの理論上の質量である２３９７４．１４Ｄａ付近には種は観察されなかった。このコンジュゲートの計算されたコンジュゲーション効率は１００％である。

実施例１８． ＳｎｕｇｇｌｅにおけるＮＮＡＡ含有ＬＣの発現のためのプラスミドの作製
非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）を含むＬＣの生産には、ＮＮＡＡの同時取り込みを伴う軽鎖の合成が必要である。Ｋ４２位置及びＥ１６１位置にＮＮＡＡを有するＬＣの発現のためのプラスミド（ｐＪ４１１－トラスツズマブＬＣ Ｋ４２ＴＡＧ Ｅ１６１ＴＡＧ）を生産するために、ＬＣ遺伝子を、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターを有するオペロンにクローニングした。ＬＣ残基Ｋ４２及びＥ１６１のコドンをＴＡＧに変異させて、ＮＮＡＡの位置を指定した。このプラスミドは高コピーのｐＵＣ複製起点を有し、カナマイシン耐性のための遺伝子を含んでいる。プラスミド配列は、クローニングによって確認した。

同時翻訳によるＮＮＡＡ取り込みには、既存のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡｔＲＳ）に対して直交性（orthogonal）であるアンバーサプレッサーｔＲＮＡ、並びにアンバーサプレッサーｔＲＮＡ及びｐＡＭＦ ＮＮＡＡを特異的に認識する直交性ＡＡｔＲＳ、の発現も必要である。これらＮＮＡＡ ＡＡｔＲＳ及びｔＲＮＡの遺伝子を、バイシストロン性オペロンとして、誘導性Ｔ７プロモーター及び構成的プロモーターＰｃ０の下流の位置で、ベクターｐＪ４３４にクローニングした。このベクターは、ｐ１５Ａ複製起点と、カルベニシリン耐性を付与するβ－ラクタマーゼ選択マーカーとを有する。これら複製起点及びマーカーの両方がｐＪ４１１と適合性がある。プラスミド配列は、クローニングによって確認した。

実施例１９． ｐ－Ａｃ－Ｐｈｅ ＬＣ発現の振とうフラスコでの例
残基Ｋ４２及び残基Ｅ１６１にｐＡｃＰｈｅを有するトラスツズマブＬＣの発現のための大腸菌株は、Ｓｎｕｇｇｌｅ株ＳＢＤＧ４１９をプラスミドｐＪ４１１－トラスツズマブＬＣ Ｋ４２ＴＡＧ Ｅ１６１ＴＡＧ及びｐＪ４３４ Ｐｃ０ ｐＡｃＰｈｅ ＲＳ－ｔＲＮＡで共形質転換することによって作製した。この株を、５０μｇ／ｍＬカナマイシン及び１００μｇ／ｍＬカルベニシリンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）中、３７℃で一晩増殖させた。午前中に、これを新鮮なＴＢ＋Ｋａｎ／Ｃａｒｂに１：５０に希釈し、ＯＤ_６００が１．５になるまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＨＣ遺伝子、ＬＣ遺伝子、ＡＡｔＲＳ遺伝子、及びｔＲＮＡ遺伝子のＴ７にドライブされる転写を、終濃度０．２％アラビノース及び２ｍＭのｐＡｃＰｈｅを培養物に添加することで誘導した。温度を２５℃に調整し、タンパク質発現は１６時間続いた。６０００×ｇで１０分間の遠心分離によって細胞を回収した。

実施例２０． ｐ－Ａｃ－Ｐｈｅ ＬＣの発現の分析
細胞を－８０℃で一晩凍結し、解凍し、０．０１ｍｇ／ｍＬリソソーム及びＢ－ＰＥＲ（商標）溶液１ｍＬあたり１μＬのベンゾナーゼヌクレアーゼを含むＢ－ＰＥＲ細菌タンパク質抽出試薬に再懸濁して大腸菌細胞を溶解し、核酸を加水分解した。室温で１０分間インキュベートした後、細胞は完全に溶解（lyze）され、核酸ポリマーに起因する粘性が低下した。この時点で、ライセートを２４，０００×ｇで１０分間遠心分離して清澄化した。ＬＣ含有上清を分析のために取っておいた。１０ｍＭのＤＴＴで還元した後、試料をＰＡＧＥゲルで分析した。

実施例２１． ｐ－Ａｃ－ＰＨＥ ＬＣの精製及びコンジュゲーション
振とうフラスコにおける発現後に、トラスツズマブＬＣ Ｋ４２ ｐＡｃＰｈｅ Ｅ１６１ｐＡｃＰｈｅを、標準的なｐｒｏＬクロマトグラフィーを使用して、ライセートから精製した。精製後、１４３ｍｇの精製ＬＣが回収された。未処理の（intact）ＬＣのＬＣＭＳ（図６）は、回収された全てのタンパク質が全長であり、誤取り込みのエビデンスがないことを示している。このことは、両方のＴＡＧ部位においてこのシンテターゼのフィデリティーが良く、切断されたタンパク質はｐｒｏＬに対する親和性がないことを意味する。精製Ｋ４２ｐＡｃＰｈｅ Ｅ１６１ｐＡｃＰｈｅ ＬＣをコンジュゲーションさせた。コンジュゲートＬＣのＬＣＭＳ（図７）は、ＬＣあたり１．９６個の薬物負荷、つまり９８％のコンジュゲーション効率を示している。

実施例２２． タンパク質生産の定量
１０ｍＭのＤＴＴで還元され、１０ｍＭのＤＴＴでの処理によってＬＣからＨＣが分離した、細胞ライセート中に存在するＨＣ及びＬＣの量を測定するために、ＨＣ及びＬＣのタンパク質濃度を、Ｓａｌｌｙ Ｓｕｅ自動ウエスタンブロット（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ社、カリフォルニア州サンノゼ）によって１２～２３０ｋＤａ分離モジュール（ＳＭ－Ｓ０００１、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｉｍｐｌｅ社）についての製造元の指示に従って測定した。還元された細胞ライセートを、０．１×試料緩衝液に１：２０に希釈した。抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（１０９－０６５－００３、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）を、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ ２に１：１５０に希釈した一次抗体として使用した。標準試料は、精製Ｈ０１抗体の０．１×試料緩衝液への段階希釈（serial dilution）を用いて調製した。

実施例２３． 代替的プロモーターを利用したＩｇＧの生産
ＩｇＧの生産には、重鎖（ＨＣ）ポリペプチド及び軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドの同時合成が必要である。ＩｇＧ発現プラスミドｐＪ４０１－ＬＣ－ＨＣ Ｂ１０を作製するために、ＨＣの遺伝子及びＬＣの遺伝子を、転写のために大腸菌ＲＮＡポリメラーゼを動員（recruit）するＴ５プロモーター（Ｔ５ｐ）（配列番号２３）を有する単一のバイシストロン性オペロンにクローニングした。このプラスミドは高コピーｐＵＣ複製起点を有し、カナマイシンで選択可能なマーカーを含む。プラスミド配列は、クローニングによって確認した。ＨＣ及びＬＣの両方とも、独立したリボソーム結合部位を有していた。

このプラスミドを用いてＢ１０を発現させるための大腸菌株を、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６０３４５号に記載されるＳｎｕｇｇｌｅを、プラスミド ｐＪ４０１－ＬＣ－ＨＣ Ｂ１０で形質転換することによって作製した。この株を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）中、３７℃で一晩増殖させた。午前中に、これを新鮮なＴＢ＋Ｋａｎに１：５０に希釈し、ＯＤ６００が１．５になるまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＨＣ遺伝子及びＬＣ遺伝子の発現を、１ｍＭの終濃度までＩＰＴＧを添加することによって誘導した。温度を２５℃に調整し、タンパク質発現は１６時間続いた。細胞を６０００ｇで１０分間の遠心分離により回収し、溶解（lyse）し、次いでＩｇＧ発現を前述したやり方で分析した。結果は表１５に見られるが、表１５は、Ｔ５プロモーターによるＢ１０ ＩｇＧの発現（「Ｂ１０ ＷＴ－Ｔ５ｐ」）は、振とうフラスコ中の他の高収量ＩｇＧと整合するものであることを意味している。Ｔ７プロモーター（Ｔ７ｐ）を用いた、従来の発現（「Ｂ１０ ＷＴ－Ｔ７ｐ」）を比較のために示す。

振とうフラスコでのタイターに基づいて、Ｂ１０ ＷＴ－Ｔ５ｐの同一株が、バイオリアクターなどの高密度発酵プロセスで生産される場合、２００ｍｇ／Ｌを超えるＢ１０ ＩｇＧ、あるいは１ｇ／Ｌを超えるＢ１０ ＩｇＧでさえも達成されることが予想される。これは、前の試験、例えば実施例１５、表４が、振とうフラスコから高密度発酵に切り替えることによって、普通は抗体生産を５倍以上増加させることができることを示しているためである。

実施例２４． 代替的オペロン構成を利用したＩｇＧの生産
ＩｇＧの生産には、重鎖（ＨＣ）ポリペプチド及び軽鎖（ＬＣ）ポリペプチドの同時合成が必要である。ＨＣのため及びＬＣのための別個のオペロンを利用してＩｇＧを生産するように、プラスミドｐＪ４１１ Ｂ１０ ＭＯをクローニングした。このベクターにおいて、ＨＣの遺伝子及びＬＣの遺伝子はそれぞれ、Ｔ７プロモーター、ＬＣ又はＨＣ遺伝子、次いでＴ７ターミネーターを有するモノシストロン性完全オペロンにクローニングされた。このプラスミドは高コピーｐＵＣ複製起点を有し、カナマイシンで選択可能なマーカーを含む。プラスミド配列は、クローニングによって確認した。ＨＣ及びＬＣの両方とも、独立したリボソーム結合部位を有していた。ＨＣとＬＣとの比率を最適化するために、ＨＣのリボソーム結合部位内に変異を加えた。それぞれ配列番号２０、２１、及び２２を含む、強い、中程度、及び弱いＨＣリボソーム結合部位を有する、３つの異なるプラスミドであるＢ１０－ＭＯ－ＳＤｓ、Ｂ１０－ＭＯ－ＳＤｍ、及びＢ１０－ＭＯ－ＳＤｗを作製した。前の研究で、ＨＣ発現よりも多くのＬＣ発現が必要であることが示されているため、ＬＣは全てのコンストラクトについて同じ強力なリボソーム結合部位（配列番号１７）を使用した。

これらのプラスミドを用いてＢ１０を発現させるための大腸菌株を、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０６０３４５号に記載されるＳｎｕｇｇｌｅを、プラスミドＢ１０－ＭＯ－ＳＤｓ（配列番号３６）、Ｂ１０－ＭＯ－ＳＤｍ（配列番号３７）、及びＢ１０－ＭＯ－ＳＤｗ（配列番号３８）で形質転換することによって作製した。この株を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含むテリフィックブロス（ＴＢ）中、３７℃で一晩増殖させた。午前中に、これを新鮮なＴＢ＋Ｋａｎに１：５０に希釈し、ＯＤ６００が１．５になるまで３７℃で増殖させた。この時点で、ＨＣ遺伝子及びＬＣ遺伝子の発現を、０．２％の終濃度へとアラビノースを添加することによって誘導した。温度を２５℃に調整し、タンパク質発現は１６時間続いた。細胞を６０００ｇで１０分間の遠心分離により回収し、溶解（lyse）し、次いでＩｇＧ発現を前述したやり方で分析した。結果は表１６に見られるが、表１６は、別個のオペロンを用いたＢ１０ ＩｇＧの高発現が、適切なＳＤ調節（tuning）及びＨＣ：ＬＣ比によって達成することができることを示している。この系列からの最良のコンストラクトについての収量は、振とうフラスコ中の他の高収量ＩｇＧと整合するものであった。実施例１に記載のバイシストロン性オペロンを用いた、従来の発現（「Ｂ１０ ＷＴ」）を比較のために示す。

前の試験、例えば実施例１５、表４が、振とうフラスコから高密度発酵に切り替えることによって、普通は抗体生産を振とうフラスコの場合のタイターと比べて５倍以上増加させることができることを示している。したがって、本実施例における結果は、Ｂ１０－ＭＯ－ＳＤｗの同一株が、バイオリアクターなどの高密度発酵セッティングで培養される場合、２００ｍｇ／Ｌを超えるＢ１０ ＩｇＧ、あるいは１ｇ／Ｌを超えるＢ１０ ＩｇＧでさえも生産できることを示している。

本願中における略号
ＯＤ５９５ｎｍ＝波長５９５ｎｍで測定した光学濃度
ＲＰＭ＝毎分の回転数
（ｖ／ｖ％）＝溶質の体積／溶液の体積（％）
（ｗ／ｗ％）＝溶質の重量／溶液の重量（％）
Ｑｓ＝Ｑｕａｎｔｕｍ ｓａｔｉｓ（所望を達成するために必要な量を加える）
ＳＤ＝Ｓｈｉｎｅ Ｄａｌｇａｒｎｏ配列又はリボソーム結合部位又はＲＢＳ
ＳＤｓ又はＲＢＳｓ＝強いリボソーム結合部位
ＳＤｍ又はＲＢＳｍ＝中程度の強さのリボソーム結合部位
ＳＤｗ又はＲＢＳｗ＝弱い強さのリボソーム結合部位

例示的な配列
大腸菌で発現されるＩｇＧのＬＣ及びＨＣのタンパク質配列
＊は非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）の位置を示す。
配列番号１（ＷＴ Ｂ１０ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLEWVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号２(ＷＴ Ｂ１０ ＬＣ又はＨ０１ ＬＣ又はトラスツズマブＬＣ)
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号３（Ｂ１０ Ｆ４０４ＴＡＧ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLEWVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS*FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号４（Ｂ１０ Ｙ１８０ＴＡＧ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLEWVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL*SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号５（Ｂ１０ Ｋ４２ＴＡＧ ＬＣ）
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPG*APKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号６（Ｂ１０ Ｙ１８０ＴＡＧ Ｆ４０４ＴＡＧ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLEWVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL*SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS*FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号７（Ｂ１０ ２４１ＴＡＧ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNTTTKSIHWVRQAPGKGLEWVGEIYPRDGITDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGWHWRSGYSYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV*LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号８（Ｈ０１ Ｙ１８０ＴＡＧ Ｆ４０４ＴＡＧ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIRTQSIHWVRQAPGKGLEWIGDIFPIDGITDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSWSWPSGMDYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL*SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS*FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号９（７２１９ ＬＣ）
MDIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAADRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHTYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号１０（７２１９ Ｆ４０４ＴＡＧ ＨＣ）
MQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFNFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSISYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGTVEHGAVYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS*FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号１１（αＰＤ１ ＨＣ）
MEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFDSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTNTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDVDYGTGSGYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCEVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号１２（αＰＤ１ ＬＣ）
MSYELTQPPSVSVSPGQTARITCSGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVMVIYKDTERPSGIPERFSGSSSGTKVTLTISGVQAEDEADYYCQSADNSITYRVFGGGTKVTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

配列番号１３（αＴｉｍ３ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIDRYYIHWVRQAPGKGLEWVAGITPVRGYTEYADSVKDRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGYVYRMWDSYDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCEVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号１４（αＴｉｍ３ ＬＣ）
MDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号１５（αＬＡＧ３ ＨＣ）
MQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSYKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREEAPENWDYALDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCEVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号１６（αＬＡＧ３ ＬＣ）
MEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGRSPFSFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号１７（ＨＣ－ＲＢＳ１；コンセンサスＲＢＳ）
AGGAGGT
配列番号１８（ＨＣ－ＲＢＳ２；第１変異体）
AAGAGAT
配列番号１９（ＨＣ－ＲＢＳ３；第２変異体）
AAAAGAT
配列番号２０（ＬＣ－ＲＢＳ１；標準のＬＣ ＲＢＳ）
AGGAGAT
配列番号２１（ＬＣ－ＲＢＳ２；第１変異体）
AAGAGAT
配列番号２２（ＬＣ－ＲＢＳ３；二重変異体）
AAAAGAT
配列番号２３（ＬＣ－ＲＢＳ４；三重変異体）
AAAATAT

配列番号２４（Ｈ０１ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIRTQSIHWVRQAPGKGLEWIGDIFPIDGITDYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSWSWPSGMDYYLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号２５（７２１９ ＨＣ）
MQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFNFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSISYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGTVEHGAVYGTDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号２６（Ｔ７プロモーター）
TAATACGACTCACTATAGGG
配列番号２７（トラスツズマブ ＨＣ）
MEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号２８（リボソーム結合配列、例えば、重鎖用のリボソーム結合配列）
AX₁GAGX₂T（ここで、Ｘ_１はＡ又はＧであり、Ｘ_２はＡ又はＧである）
配列番号２９（リボソーム結合配列、例えば、軽鎖用のリボソーム結合配列）
AX₁X₂AX₃AT（ここで、Ｘ_１はＧ又はＡであり、Ｘ_２はＧ又はＡであり、Ｘ_３はＧ又はＴである）
配列番号３０（Ｔ５プロモーター配列）
TAATTGTGAGCGGATAACAATTACGAGCTTCATGCACAGTGAAATCATGAAAAATTTATTTGCTTTGTGAGCGGATAACAATTATAATA

配列番号３１（（下線を付した）配列番号１７を含む）

配列番号３２（（下線を付した）配列番号２０を含む）

配列番号３３（（下線を付した）配列番号２１を含む）

配列番号３４（（下線を付した）配列番号２２を含む）

配列番号３５（Ｂ１０ ＷＴのためのオペロン配列；一重下線（配列番号３１）はＬＣの５’ＵＴＲをコードし、二重下線（配列番号３２）はＨＣの５’ＵＴＲをコードする）

配列番号３６（Ｂ１０－ＭＯ－ＳＤｓのためのオペロン配列；一重下線（配列番号３１）はＬＣの５’ＵＴＲをコードし、二重下線（配列番号３２）はＨＣの５’ＵＴＲをコードする）

配列番号３７（Ｂ１０－ＭＯ－ＳＤｍのためのオペロン配列；一重下線（配列番号３１）はＬＣの５’ＵＴＲをコードし、二重下線（配列番号３３）はＨＣの５’ＵＴＲをコードする）

配列番号３８（Ｂ１０－ＭＯ－ＳＤｗのためのオペロン配列；一重下線（配列番号３１）はＬＣの５’ＵＴＲをコードし、二重下線（配列番号３４）はＨＣの５’ＵＴＲをコードする）

Claims (24)

1. 重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）を含む全長抗体の製造方法であって、
   培地中で、前記ＨＣ及び前記ＬＣを生産するのに許容可能な条件下で前記ＨＣのコード配列及び前記ＬＣのコード配列を発現する大腸菌細胞を培養すること、を含み、
   前記全長抗体が、前記培地１リットルあたり少なくとも約２００ｍｇの量で生産されるか、あるいは
   前記大腸菌細胞から生み出された細胞ペレットの重量に対する生産された全長抗体の重量パーセントが、０．０５％～２０％の範囲内である、
   前記方法。
2. 前記大腸菌細胞の少なくとも一部が酸化的な細胞質を含む、請求項１に記載の方法。
3. プラスミドを前記大腸菌株に形質転換することを含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記ＨＣ及び前記ＬＣは前記大腸菌の細胞質で生産される、請求項１又は請求項３に記載の方法。
5. 生産された前記ＨＣ及び前記ＬＣを非還元的条件下でアセンブリーして、全長抗体を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記大腸菌からの生産された前記ＨＣと生産された前記ＬＣとのモル比が、約１：１～約１：３である、請求項１又は請求項５に記載の方法。
7. ＨＣ、ＬＣ、又はその両方の発現がプロモーターによって制御され、
   前記プロモーターが、Ｔ７プロモーター、又はＴ７プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーターであるか、あるいは、
   前記プロモーターが、Ｔ５プロモーター、又はＴ５プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーターである、
   請求項１～請求項６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記プラスミドが、バイシストロン性オペロンを含み、
   前記バイシストロン性オペロンが、前記ＨＣのコード配列及び前記ＬＣのコード配列を含む、あるいは
   前記プラスミドが、前記ＨＣのための第１のモノシストロン性オペロン及び前記ＬＣのための第２のモノシストロン性オペロンを含む、
   請求項１～６のうちのいずれか１項に記載の方法。
9. 前記バイシストロン性オペロンが、前記ＨＣ及び前記ＬＣの両方の発現をドライブするプロモーターを含み、
   前記プロモーターが、Ｔ７プロモーター、又はＴ７プロモーターと実質的に類似のプロモーター強度を有するプロモーターであるか、あるいは
   前記第１のモノシストロン性オペロン又は前記第２のモノシストロン性オペロンが、Ｔ７プロモーターを含む、
   請求項８に記載の方法。
10. 前記バイシストロン性オペロンが、Ｔ７ターミネーターを含むか、あるいは
    前記第１のモノシストロン性オペロン又は前記第２のモノシストロン性オペロンが、Ｔ７ターミネーターを含む、
    請求項９に記載の方法。
11. 前記大腸菌細胞が、前記ＨＣの翻訳のための第１のリボソーム結合部位及び前記ＬＣの翻訳のための第２のリボソーム結合部位を含み、前記第１のリボソーム結合部位及び前記第２のリボソーム結合部位が、前記大腸菌から生産されるＨＣ及びＬＣのモル比が１：１～１：３の範囲内になるように選択される、請求項１～請求項１０のいずれか１つに記載の方法。
12. 前記第１のリボソーム結合部位が、配列番号１７～１９からなる群から選択されるＤＮＡ配列から転写され、かつ前記第２のリボソーム結合配列が、配列番号２０～２３からなる群から選択されるＤＮＡ配列から転写される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第１のリボソーム結合部位が、配列番号１７又は配列番号１８の配列を有する、請求項１２に記載の方法。
14. 前記全長抗体の前記ＨＣ及び／又は前記ＬＣが、少なくとも１つの非天然アミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記ＨＣのコード配列及び／又は前記ＬＣのコード配列が、少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンを有するように改変されており、前記非天然アミノ酸コドンが、どの天然アミノ酸の組み込みも生じない、請求項１４に記載の方法。
16. 前記少なくとも１つの非天然アミノ酸が、前記少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンに相補的なアンチコドンを含むｔＲＮＡに積ませる（charge）ことによって導入される、請求項１４に記載の方法。
17. 前記少なくとも１つの非天然アミノ酸コドンが、アンバーコドンＴＡＧである、請求項１６に記載の方法。
18. 前記少なくとも１つの非天然アミノ酸が、パラメチルアジド－Ｌ－フェニルアラニン（ｐＡＭＦ）、ＡＥＫ、又はｐＡｃＦである、請求項１６に記載の方法。
19. 前記非天然アミノ酸のうちの少なくとも１つの３’側に隣接するコドンが、コドン最適化されている、請求項１５～請求項１８のうちのいずれか１項に記載の方法。
20. 前記全長抗体が、Ｂ１０抗体、Ｈ０１抗体、７２１９抗体、抗ＰＤ１抗体、抗Ｔｉｍ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、又は抗Ｈｅｒ２抗体である、請求項１に記載の方法。
21. 前記Ｂ１０抗体のＨＣのコード配列が、配列番号１に対する変異を含み、前記変異の結果、天然アミノ酸のコドンが非天然アミノ酸コドンに置換され、
    前記天然アミノ酸は、Ｆ４０４、Ｙ１８０、及びＦ２４１から選択される１つ又は複数のアミノ酸であり、そして
    非天然アミノ酸が、該非天然アミノ酸コドンに相補的なｔＲＮＡに積ませる（charge）ことにより、前記ＨＣに導入される、請求項２０に記載の方法。
22. 前記Ｂ１０抗体の前記ＬＣのコード配列又は前記トラスツズマブの前記ＬＣのコード配列が、配列番号２に対する少なくとも１つの変異を含み、前記少なくとも１つの変異により、天然アミノ酸のコドンが非天然アミノ酸コドンに置換され、前記天然アミノ酸が、Ｋ４２又はＥ１６１である、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。
23. 前記全長抗体の前記ＨＣ又は前記ＬＣ上の前記非天然アミノ酸にリンカーを介して弾頭部分を共有結合的に連結させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
24. 前記弾頭が、ＳＣ２３６又はアミノオキシ－ＰＥＧ８－メタンである、請求項２３に記載の方法。
    

Images