CN107446832B - 一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌。本发明通过PCR获得来自枯草芽孢杆菌突变菌的耐热植酸酶突变基因A‑2，并将A‑2构建到pPIC9质粒上，得到重组质粒pPIC9‑A‑2，并转化到毕赤酵母GS115，筛选得到高表达耐热植酸酶的重组菌，所表达的耐热植酸酶在80℃保温处理30min，相对活性仍剩余75％左右，90℃处理30min，酶活仍存留25％以上，耐热性良好，可以广泛用于食品、饲料等行业。

Description

一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌。

背景技术：

磷是动物机体必须的矿物元素，植物组织中的磷大部分是以植酸(肌醇六磷酸)或植酸盐的形式存在，肌醇六磷酸分子可以螯合金属离子，以螯合物的形式存在，其溶解度很低，作用相当于抗营养因子，很难被单胃动物吸收，未被充分利用的磷，通过动物排泄物进入水体最终导致水体富营养化。

植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸盐的一类酶的总称，在动物饲料中添加植酸酶，可以提高饲料中磷的利用率，减少磷的排出对环境的污染。1996年FDA确认植酸酶在食品中应用是安全的，可在动物饲料中使用，植酸酶已成为第三大饲用酶。可以通过微生物来大量合成植酸酶，添加到饲料中供动物体利用，以解决单胃动物缺乏能够利用植酸盐的植酸酶的问题，但是饲料加工过程中的热处理要求植酸酶有一定耐热性。而目前还面临植酸酶高昂生产成本、低植酸酶产率以及耐热性不足的问题。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种耐热性提高的植酸酶突变体及其毕赤酵母工程菌菌株。所述植酸酶突变体来自一株经紫外诱变获得的枯草芽孢杆菌BS2，将植酸酶突变体编码基因A-2从BS2中克隆并构建重组质粒后，在毕赤酵母GS115中进行表达，从而获得毕赤酵母工程菌菌株。

在本发明中采用如下定义：

1.氨基酸和DNA核酸序列的命名法

使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。

2.植酸酶突变体的标识

采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体中突变的氨基酸。如Gln166Asn，表示位置166的氨基酸由野生型的Gln替换成Asn，位置的编号对应于SEQ IDNo.2中野生型植酸酶的氨基酸序列编号；同样采用“原始碱基位置替换的碱基”来表示突变体中突变的碱基，位置的编号对应于SEQ ID No.1中野生型植酸酶的核苷酸序列编号。

在本发明中，A-1表示野生型植酸酶的编码基因，A-2表示植酸酶突变体的编码基因，信息如下表。

所述植酸酶突变体的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.4所示；

所述植酸酶突变编码基因A-2的核苷酸序列为SEQ ID No.3所示；

用于表达所述植酸酶的表达载体为pPIC9，用于所述表达载体转化的微生物宿主细胞为毕赤酵母GS115；

所述毕赤酵母工程菌是将植酸酶突变编码基因A-2连接表达载体pPIC9，并在毕赤酵母GS115中表达所得；

本发明还提供上述植酸酶突变体在饲料领域的应用。

本发明的实验步骤具体如下：

1、将植酸酶突变体的编码基因A-2进行酶切，连接至表达载体pPIC9，得到重组载体；

2、将重组载体转化入毕赤酵母GS115中，得到植酸酶突变体的生产菌株GS115/pPIC 9-A-2；

3、以GS115/pPIC 9-A-2为生产菌株发酵生产植酸酶。

所述植酸酶突变体的酶学性质如下：

(1)pH:pH 4-6酶活稳定，最适作用pH5.0。

(2)温度：50℃-80℃酶活稳定，最适作用温度为70℃。

(3)耐热性：该酶在80℃保温30min酶活仍残留75％以上，90℃保温30min酶活仍存留25％以上。

有益效果：

1、本发明公布了一种全新的植酸酶突变体，该突变体具有酶活高，热稳定性好的特点。该突变体发酵液酶活可达359U/mL，较野生型植酸酶提高200％；

2、本发明获得的植酸酶在80℃保温30min酶活仍残留75％以上，90℃保温30min酶活仍存留25％以上。

附图说明：

图1菌落PCR鉴定电泳图；

其中，M为marker，泳道1为基因A-2；

图2植酸酶最适pH曲线；

图3植酸酶最适温度曲线；

图4植酸酶温度稳定性曲线。

具体实施方式：

以下通过具体实施例对本发明作出更详尽的说明，仅作为举例说明，而不作为对本发明实施范围的限定。对于本领域技术人员，在本发明原理基础上还可做出的改进，这些改进也应视为本发明保护的范围。本实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，可参照《分子克隆实验指南》。

实施例1植酸酶基因A-2的获得

土壤中分离得到一株能产植酸酶的枯草芽孢杆菌BS，经紫外诱变筛选得到一株具有耐热植酸酶活性的菌株BS2，根据其突变基因A-2的序列设计PCR引物，5'端加入酶切位点XhoⅠ，3'端加入酶切位点NotⅠ，通过PCR得到突变体基因A-2，其核苷酸序列为SEQ ID No.3。引物序列如下：

A-2-F 5'-CCGCTCGAGATGAAGGTTCCAAAAACAAT-3'

A-2-R 5'-TTGCGGCCGCCTAGCCGTCAGAACGGTCTT-3'

实施例2重组载体pPIC9-A-2的构建

分别对突变体基因A-2和质粒pPIC9进行XhoⅠ和NotⅠ酶切，回收产物，将回收后的A-2和pPIC9按比例混合，用T4连接酶在16℃条件下连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化产物涂布在LB(含氨苄霉素)固体平板上，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落至LB液体培养基，37℃培养，菌液进行菌落PCR，电泳鉴定结果如图1，测序结果显示序列正确，序列大小1.15kb。抽提重组质粒待用。

实施例3重组质粒转化毕赤酵母

1.毕赤酵母GS115感受态细胞的制备

1)挑取毕赤酵母平板单菌落，接种于5mL的YPD培养基，30℃，220r/min振荡过夜；

2)取0.5mL的过夜培养的菌液，接种于50mL新鲜配制的YPD培养基，30℃，220r/min振荡培养，使OD600值达到1.3-1.5；

3)取上述培养液于4℃，3000r/min，离心5min；

4)弃去上清液，加入50mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；

5)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入25mL冰上预冷的无菌水，振荡重悬菌体；

6)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入10mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液，重悬菌体；

7)4℃，3000r/min，离心5min，弃去上清液，吸干管壁残余液体，加入1mL冰上预冷的1mol/L的无菌山梨醇溶液(预先加入甘油至终浓度15％)，振荡混匀。

8)分装100μL/管至无菌EP罐，-70℃冰箱冰冻保藏(新鲜制备的感受态细胞效果更佳)。

2.线性化质粒的转化

抽提得到的重组质粒pPIC9-A-2用SalⅠ进行单酶切，得到线性化质粒。取新鲜制备的(或-70℃冻存的)感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻。

1)将100μL感受态细胞移出至一新的无菌EP管中，加入10μL线性化质粒，轻吹混匀，吸出转移到0.2cm型的电穿孔转化杯中；

2)转化杯置于冰浴中5-10分钟，保持低温。

3)电穿孔转化电击条件：1500V，200Ω，25μF，放电时间5ms左右，一次电击。

4)电击后，马上在电击转化杯中加入1mL 4℃预冷的1mol/L的山梨醇溶液，用移液枪吹打均匀，置于冰浴中；

5)在超净工作台上无菌操作涂布MD培养基(1.34％YNB；4×10^-5％生物素；2％葡萄糖平板)，100-200μL/板，涂好的平板30℃倒置培养3-4天；

6)在MD平板上筛选得到两株重组菌，经菌落PCR得到目的序列，测序比对显示为目的基因A-2的核苷酸序列，即所得菌株为含有pPIC9-A-2的重组菌，分别命名为P-1，P-2。

实施例4含有重组质粒pPIC9-A-2的酵母菌的诱导表达

BMGY培养基配方：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，1％甘油。

BMMY培养基配方：1％酵母浸出物，2％蛋白胨，0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，0.5％甲醇。

将重组菌P-1，P-2以及用同样方法以原始基因A-1构建的重组菌株(对照)分别接种于装有30mL BMGY培养基的三角瓶中，30℃，220r/min培养至OD600为10左右，离心收集菌体，用35mL的BMMY培养基重悬菌体，并在30℃，220r/min条件下继续培养48h，发酵液离心后测定上清中的植酸酶酶活，结果如下表：

实施例5植酸酶的酶学性质

钒钼酸铵法进行测定，酶活力的定义：在温度37℃、pH 5.50条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠溶液中释放1μmol无机磷所需的酶量为1个酶活单位(U)。

(1)最适作用pH

以实施例5所得P-2发酵液上清液为样品，以测得的植酸酶最高酶活为基准，在37℃条件下，分别在pH 3.0-8.0的缓冲液中反应，测定不同pH条件下的酶活力。由图2可知，该植酸酶在pH范围4-6酶活稳定，最适作用pH5.0。

(2)最适作用温度

以实施例5所得P-2发酵液上清液为样品，以测得的植酸酶最高酶活为基准，在pH5.0的缓冲液中，分别在30℃-90℃条件下测定酶活，计算相对酶活，结果如图3所示，P-2所产植酸酶50℃-80℃酶活稳定，最适作用温度为70℃。

(3)热稳定性

以实施例5所得P-2和对照的发酵液上清液为样品，以不作处理的植酸酶酶活为100％基准，在pH5.0缓冲液条件下，样品分别在50℃-90℃下保温处理30min，测酶活，计算剩余酶活，从图4中可以看出，80℃时，该酶相对活性剩余75％左右(对照剩余酶活为20％)，90℃时，酶活仍存留25％以上(对照剩余酶活为0)，与原始基因A-1构建的重组菌(对照)所产植酸酶相比，热稳定性有很大提高，说明该重组菌P-2所产植酸酶具有良好的耐热性，可广泛用于食品饲料行业。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一株高产耐热植酸酶的毕赤酵母工程菌

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1149

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌BS

<400> 1

atgaaggttc caaaaacaat gctgctaagc actgccgcgg gtttattgct tagcctgaca 60

gcaacctcgg tgtcggctca ttatgtgaat gaggaacatc atttcaaagt gactgcacac 120

acggagacag atccggtcgc atctggcgat gatgcagcag atgacccggc catttgggtt 180

catgaaaaac acccggaaaa aagcaagttg attacaacaa ataagaagtc agggctcgtt 240

gtgtatgatt tagacggaaa acagcttcat tcttatgagt ttggcaagct caataatgtc 300

gatctgcgct atgattttcc attgaacggc gaaaaaattg atattgctgc cgcatccaac 360

cggtccgaag gaaaaaatac aattgaagta tatgcaatag acggggataa aggaaaattg 420

aaaagcatta cagatccgaa ccatcctatt tccaccaata tttctgaggt ttatggattc 480

agcttgtatc acagccagaa aacaggagca ttttacgcat tagtgacagg caaacaaggg 540

gaatttgagc agtatgaaat tgttgatggt ggaaagggtt atgtaacagg gaaaaaggtg 600

cgtgaattta agttgaattc tcagaccgaa ggccttgttg cggatgatga gtacggaaac 660

ctatacatag cagaggaaga tgaggccatc tggaaattta acgctgagcc cggcggaggg 720

tcaaaggggc aggttgttga ccgtgcgaca ggagatcatt tgacagctga tattgaagga 780

ctgacaatct attatgcacc aaatggcaaa ggatatctca tggcttcaag tcaaggaaat 840

aacagctatg caatgtatga acggcagggg aaaaatcgct atgtagccaa ctttgagatt 900

acagatggcg agaagataga cggtactagt gacacggatg gtattgatgt tctcggtttc 960

ggacttggcc caaaatatcc gtacgggatt tttgtggcgc aggacggcga aaatattgat 1020

aacggacaag ccgtcaatca aaatttcaaa attgtatcgt gggaacaaat tgcacagcat 1080

ctcggcgaaa tgcctgatct tcataaacag gtaaatccga ggaagctgaa agaccgttct 1140

gacggctag 1149

<210> 2

<211> 382

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌BS

<400> 2

Met Lys Val Pro Lys Thr Met Leu Leu Ser Thr Ala Ala Gly Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Ala Thr Ser Val Ser Ala His Tyr Val Asn Glu Glu

20 25 30

His His Phe Lys Val Thr Ala His Thr Glu Thr Asp Pro Val Ala Ser

35 40 45

Gly Asp Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala Ile Trp Val His Glu Lys His

50 55 60

Pro Glu Lys Ser Lys Leu Ile Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu Val

65 70 75 80

Val Tyr Asp Leu Asp Gly Lys Gln Leu His Ser Tyr Glu Phe Gly Lys

85 90 95

Leu Asn Asn Val Asp Leu Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Glu Lys

100 105 110

Ile Asp Ile Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr Ile

115 120 125

Glu Val Tyr Ala Ile Asp Gly Asp Lys Gly Lys Leu Lys Ser Ile Thr

130 135 140

Asp Pro Asn His Pro Ile Ser Thr Asn Ile Ser Glu Val Tyr Gly Phe

145 150 155 160

Ser Leu Tyr His Ser Gln Lys Thr Gly Ala Phe Tyr Ala Leu Val Thr

165 170 175

Gly Lys Gln Gly Glu Phe Glu Gln Tyr Glu Ile Val Asp Gly Gly Lys

180 185 190

Gly Tyr Val Thr Gly Lys Lys Val Arg Glu Phe Lys Leu Asn Ser Gln

195 200 205

Thr Glu Gly Leu Val Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Asn Leu Tyr Ile Ala

210 215 220

Glu Glu Asp Glu Ala Ile Trp Lys Phe Asn Ala Glu Pro Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ser Lys Gly Gln Val Val Asp Arg Ala Thr Gly Asp His Leu Thr Ala

245 250 255

Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile Tyr Tyr Ala Pro Asn Gly Lys Gly Tyr

260 265 270

Leu Met Ala Ser Ser Gln Gly Asn Asn Ser Tyr Ala Met Tyr Glu Arg

275 280 285

Gln Gly Lys Asn Arg Tyr Val Ala Asn Phe Glu Ile Thr Asp Gly Glu

290 295 300

Lys Ile Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly Phe

305 310 315 320

Gly Leu Gly Pro Lys Tyr Pro Tyr Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp Gly

325 330 335

Glu Asn Ile Asp Asn Gly Gln Ala Val Asn Gln Asn Phe Lys Ile Val

340 345 350

Ser Trp Glu Gln Ile Ala Gln His Leu Gly Glu Met Pro Asp Leu His

355 360 365

Lys Gln Val Asn Pro Arg Lys Leu Lys Asp Arg Ser Asp Gly

370 375 380

<210> 3

<211> 1149

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

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gcaacctcgg tgtcggctca ttatgtgaat gaggaacatc atttcaaagt gactgcacac 120

acggagacag atccggtcgc atctggcgat gatgcagcag atgacccggc catttgggtt 180

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ggacttggcc caaaatatcc gtacgggatt tttgtggcgc aggacggcga aaatattgat 1020

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<210> 4

<211> 382

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

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1 5 10 15

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20 25 30

His His Phe Lys Val Thr Ala His Thr Glu Thr Asp Pro Val Ala Ser

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Ser Lys Gly Gln Val Val Asp Arg Ala Thr Gly Asp His Leu Thr Ala

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Lys Gln Val Asn Pro Arg Lys Leu Lys Asp Arg Ser Asp Gly

370 375 380

Claims (4)

1. 一株高产耐热型植酸酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌能够表达氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的植酸酶。

2.如权利要求1所述的一株高产耐热型植酸酶的毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述毕赤酵母工程菌是将SEQ ID No.3所示的植酸酶突变编码基因A-2连接表达载体pPIC9，并在毕赤酵母GS115中表达所得。

3.权利要求2所述一株高产耐热型植酸酶的毕赤酵母工程菌在生产植酸酶中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，采用该菌株发酵生产植酸酶的方法如下：

将权利要求2所述的毕赤酵母工程菌接种于BMGY培养基中，30℃，220r/min培养至OD600为10，离心收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，并在30℃，220r/min条件下继续培养48h即得植酸酶；

所述BMGY培养基组成为：1%酵母浸出物，2%蛋白胨，0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，1.34% YNB，4×10^-5%生物素，1%甘油；

所述BMMY培养基组成为：1%酵母浸出物，2%蛋白胨，0.1mol/L pH6.0磷酸盐缓冲液，1.34% YNB，4×10^-5%生物素，0.5%甲醇。

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