CN102978179A

CN102978179A - 一种植酸酶及其重组表达工程菌株

Info

Publication number: CN102978179A
Application number: CN2012105256299A
Authority: CN
Inventors: 黄亦钧; 许丽红; 张慧丹; 张青; 徐娟
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2012-12-07
Publication date: 2013-03-20

Abstract

本发明涉及微生物工程技术领域，具体提供了一种植酸酶，并构建了重组表达该植酸酶的黑曲霉工程菌株，保藏编号为CCTCC NO: M 2012502。该工程菌株能高效表达植酸酶，摇瓶发酵酶活为280U/mL。本发明重组表达的植酸酶可广泛应用于饲料领域，提高养殖动物对磷的吸收能力，增加养殖效益，同时减少磷的排放，有利于环境保护。

Description

一种植酸酶及其重组表达工程菌株

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种植酸酶及其重组表达工程菌株。

背景技术

植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸水解酶（Myo-i-nositol hexaphosphate phosphohydrotase），是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称（黄遵锡，1999，食品与发酵工业）。植酸酶是一种糖蛋白，在植物、反刍动物、许多微生物包括酵母、霉菌、细菌中都能产生植酸酶。它能够解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养价值。

植酸酶作为一种新型饲料添加剂，在动物生产以及在环境保护中，都有重要的应用价值。然而植酸酶在天然材料中表达水平较低，加之天然植酸酶的某些生物学特性（如热稳定性，抗蛋白酶特性等）不能完全适合饲料加工的要求。随着生物技术的飞速发展，采用基因工程的手段，使酶的高产优质成为可能，成为酸酶研究的热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种植酸酶及其重组表达工程菌，通过构建含有植酸酶基因的表达载体，转入黑曲霉（Aspergillus niger）中，获得高效表达该植酸酶的黑曲霉工程菌株。本发明重组表达的植酸酶可广泛应用于饲料领域，能有效提高养殖动物的生产性能和对磷的吸收能力，从而减少磷的排放量，增加养殖效益。

本发明的植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

用于编码上述植酸酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明涉及一种黑曲霉工程菌,为黑曲霉LH-1（Aspergillus niger LH-1），该工程菌携带有能表达黑曲霉植酸酶基因的表达载体，已于2012年12月5日，保藏于位于武汉市武昌珞珈山武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC NO: M 2012502。

本发明另一方面涉及上述黑曲霉工程菌的应用，用于生产植酸酶。

本发明另一方面涉及上述植酸酶在饲料中的应用。

本发明构建的黑曲霉工程菌能高效表达植酸酶，摇瓶发酵酶活为280U/mL。本发明重组表达的植酸酶能有效提高肉鸡生产性能。在日粮中添加本发明重组表达的植酸酶，肉鸡各期平均日增重、料肉比都优于对照组，并且优于国外某植酸酶产品。本发明的植酸酶能提高肉鸡对磷的吸收能力，使磷的排泄量降低10.7%以上，从而有利于增加养殖效益。

附图说明

图1：pVL-phy质粒图谱。

图2：黑曲霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指处即为重组表达的植酸酶。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1 黑曲霉植酸酶基因的克隆

1.1 提取黑曲霉的总基因组DNA

将黑曲霉过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μL10M NH ₄AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。

1.2 基因克隆

以1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用如下的引物对进行扩增，引物对的上下游引物序列如下：

上游引物序列为：GCTCTAGAATGGGCGTCTCTGCTGTTCTA；

下游引物为：GCTCTAGACTAAGCAAAACACTCCGCCCAATCA；

PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。经北京华大基因研究中心测序分析，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:3第45-146位是内含子，去掉该内含子的cDNA序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

实施例2 黑曲霉工程菌的构建

2.1 表达载体构建

对1.2中得到的PCR产物先进行Xba I单酶切。同样，对黑曲霉表达质粒pGAMD也进行Xba I单酶切。利用PCR纯化试剂盒回收酶切产物。用T4连接酶把酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5α；然后通过PCR验证连接正确与否，最后将相应的阳性克隆表达质粒命名为pVL-pPhy，质粒图谱见图1。

2.2 原生质体制备

接种黑曲霉菌丝于PDA平板上生长4 天；切取直径约3cm的菌落置于约100mL CMA（2%麦芽提取物、2%葡萄糖，0.1%细菌蛋白胨）的液体培养基中，30℃，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20 mL裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.8M MgSO₄溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加10 mL 1.2M山梨醇悬浮，然后3000 rpm，离心10 min；加适量山梨醇悬浮分装（200 μL/管，10⁸个/mL）。

2.3 转化与验证

取10μg Phy-pGAMD DNA加入到200μL原生质体中，接着加入50μL 25%PEG轻轻混匀，室温静置20 min；然后加2mL 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 mL左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.059%乙酰胺，0.152%KH₂PO4，0.34%CsCl，0.052%KCl，1%葡萄糖, 21.85%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入下层基础培养基平板（0.059%乙酰胺, 0.152%KH₂PO4，0.34%CsCl，0.052%KCl，1%葡萄糖，1%琼脂粉），30℃黑暗培养数天至转化子长出。

按照实施例1中的方法提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增目的验证转化子。利用实施例1中引物进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，验证阳性转化子。所获得工程菌命名为黑曲霉LH-1（Aspergillus niger LH-1），于2012年12月5日，保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏号为：CCTCC NO: M 2012502。

实施例3 发酵与酶活测定

3.1摇瓶表达

将黑曲霉工程菌（CCTCC NO: M 2012502）接种于50mL 黑曲霉发酵培养基 (1.2％NaNO3，0.05％KCl，0.15% KH₂PO₄，0.205% MgSO₄·7H₂O，0.35％NaH₂PO₄·H₂O，7%柠檬酸钠，4.5%胰蛋白大豆肉汤，微量元素1mL，4.1%葡萄糖），30℃培养4-5天，离心取上清，进行SDS-PAGE检测分析，结果如图2所示，箭头所指处即为重组表达的植酸酶，重组蛋白大小与预测的一致。

3.2 酶活测定

酶活定义：在温度为37℃、pH为5.0的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

测定方法：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾（5.9）于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液（5.1）溶解，并定容至100ml，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸缓冲液（5.2）稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y=ax＋b）。

反应后的试样在水浴中静置10min ，在离心机（6.7）上以4000r/min 离心10min ，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计（6.3）415nm 波长处测定样品空白（A₀）和样品溶液（A）的吸光值，A-A₀ 为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。

植酸酶活性按下式计算

U=F×C /（m×30）

式中：

U — 试样中植酸酶的活性，U/g

C — 根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U 。

F — 试样溶液反应前的总稀释倍数。

m — 试样质量，g 。

30 — 反应时间，min 。

采用上述方法测得黑曲霉工程菌摇瓶发酵上清液酶活约为280U/mL。

本发明的工程菌能够高效稳定的表达植酸酶，而且，该工程菌在多次传代后，还能保持遗传上的稳定性。因此，本发明构建的菌株具有很好的应用前景。

实施例4 重组表达的植酸酶对肉鸡生产性能及钙磷代谢的影响

4.1 材料

植酸酶：本发明重组表达的植酸酶，5000U/g。国外某著名厂家植酸酶产品，每1g含植酸酶5000U。

试验动物：山东六和集团种鸡场罗斯肉鸡。

4.2 试验方法

试验选择健康、体重均匀的AA肉雏鸡576只，共分4个处理组，每个处理组144只肉鸡，每个处理组6个重复，每个重复24只鸡。试验分0～18d、18～35d两个饲养阶段，分别饲喂处理A（正对照组）、处理B（负对照组）、处理C （添加本发明重组表达的植酸酶）和处理D（国外某植酸酶产品）组日粮。各处理组日粮配方及营养成分见表1、表2。

表1 基础饲粮配方及营养水平

表2 各处理组钙、磷及加入植酸酶情况

注：表2中处理C、D组未列的其它各项与处理组B组相同。

4.2.1磷排泄量的测定

试验在第16～18d、33～35d分别统计各重复加料量和剩料量，并计算出两阶段的耗料量，以重复为单位收集上述两个阶段的全部粪便，称重后搅匀取粪样500g，再把两阶段粪样放在一起混匀，放入塑料袋中，存入冰箱，待测定磷的排放量。

4.2.2 生化指标测定

在试验结束时每个重复任取一只肉鸡静脉采血5ml，加入事先加好抗凝剂（肝素）的试管中，在3000 rpm下离心，将血浆倒入另外具塞试管，于冰箱内冷冻保存，待测定血液中碱性磷酸酶活性、血清钙、血清磷含量。

4.2.3 胫骨测定

在试验结束时，每个重复任取一只鸡采血后屠宰，取其左胫骨。剥离肉后，编号测定其长度、胫骨强度后，冷冻保存，以待测定胫骨干重、钙含量、磷含量、灰分含量。

4.3结果与分析

4.3.1不同植酸酶对肉鸡生产性能的影响

表3 两种植酸酶对肉鸡生产性能的影响

Figure 2012105256299100002DEST_PATH_IMAGE003

注：不同肩标字母代表差异显著（P＜0.05），下表同。

由表3可知，本发明重组表达的植酸酶在0-18d及18-35d两个阶段的日采食、日增重均在对照组B组基础上有显著提高（P＜0.05），料肉比显著降低（P＜0.05）。从试验结果分析，本发明重组表达的植酸酶对于生产性能的影响效果优于国外某植酸酶产品。

4.3.2 植酸酶对磷排泄量的影响

表4 添加本发明重组表达的植酸酶对磷排泄量的影响

Figure 2012105256299100002DEST_PATH_IMAGE004

与对照B组比较，采食1kg肉鸡日粮的磷排泄量处理C组、D组分别降低10.7% （P＜0.05）、7.1%（P＜0.05）。

4.3.3胫骨的试验结果

表5 添加本发明重组表达的植酸酶对肉鸡胫骨的影响

Figure 2012105256299100002DEST_PATH_IMAGE005

从表5可知，各处理组胫骨长度、灰分含量、灰中钙含量、灰中磷含量差异不显著（P＞0.05）。胫骨质量处理C组、处理D组与对照B组比较差异不显著（P＞0.05）,但其质量比对照组分别增加11.45%和8.96%。胫骨强度处理C组、D组与对照组比较均有很大程度提高且差异显著（P＜0.05）。

4.3.4血清生化指标结果

表6 添加不同植酸酶对血液生化指标的影响

由表6可知，各处理组血清钙、血清磷、血清碱性植酸酶差异不显著（P＞0.05）。血清钙的值各组差异很小，其值表现稳定；血清磷处理C组与对照组B比较有较大的改善趋势，其值波动较小；血清碱性磷酸酶各试验组较对照组有所提高，但组内变异大，没有发现明显规律。

上述实验结果表明：本发明重组表达的植酸酶能有效提高肉鸡生产性能，在日粮中添加本发明重组表达的植酸酶，肉鸡各期平均日增重、料肉比都优于对照组，并且优于国外某植酸酶产品。在日粮中添加本发明的植酸酶能提高肉鸡对磷的吸收能力，使磷的排泄量降低10.7%以上，从而有利于增加养殖效益，减少环境污染。

Claims

1.一种植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.用于编码权利要求1所述的植酸酶的核苷酸，其序列为SEQ ID NO:2。

3.用于表达权利要求1所述植酸酶的黑曲霉工程菌,其保藏编号为：CCTCC NO: M 2012502。

4.权利要求3所述的黑曲霉工程菌在生产植酸酶中的应用。

5.权利要求1所述的植酸酶作为饲料添加剂的应用。