CN103667204B - 一种来源于烟曲霉的植酸酶 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种来源于烟曲霉的植酸酶，并通过将植酸酶基因导入里氏木霉中，构建了能重组表达该植酸酶的里氏木霉工程菌株。该工程菌株能高效表达植酸酶，摇瓶发酵酶活为880U/mL。本发明制备得到的植酸酶可广泛应用于饲料中，能大大提高养殖动物各期平均日增重和料肉比，且使磷的排泄量降低了13.3%，从而有利于增加养殖效益，降低对环境的污染。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种来源于烟曲霉的植酸酶及其以应用。
背景技术
植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸水解酶（Myo-i-nositol hexaphosphate phosphohydrotase），是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。植酸酶具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸盐降解为无机磷和肌醇，同时释放出植酸盐结合的其他营养物质。可广泛用作饲料添加剂。目前，利用植酸酶饲喂单胃动物的效果已经得到了验证。饲料中添加植酸酶后，可以减少5-70%无机磷的用量，粪便中磷的排放量减少了30-40%以上，不仅大大降低了植酸盐的抗营养作用，增加生产效益，还能有效的降低环境污染，因此对植酸酶的研究具有重要的意义。
目前在天然材料中植酸酶的表达水平较低，酶学性能也不能满足饲料加工的应用，采用基因工程的手段，不仅可以提高植酸酶的酶活力，还能通过构建工程菌株改造酶的部分性质，使之更加适应工业化生产的条件。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种来源于烟曲霉的植酸酶，并通过将烟曲霉来源的植酸酶基因转化入里氏木霉中，构建了能高效表达该植酸酶的里氏木霉工程菌株。经木霉表达后，植酸酶的作用温度和pH都更适合作为饲料添加剂，从而有效提高养殖动物的生产性能，减少磷的排放量，降低环境污染。
本发明一方面提供了一种植酸酶，其特征在于：
（a）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶；
（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有植酸酶活性的酶。
用于编码上述植酸酶的基因，其中一种编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
本发明另一方面涉及上述植酸酶在饲料中的应用。
有益效果
本发明提供了一种新型的植酸酶，并构建了重组表达该酶的里氏木霉工程菌株，摇瓶发酵酶活高达880U/mL。本发明制备得到的植酸酶可广泛应用于饲料中，能大大提高养殖动物各期平均日增重和料肉比，且使磷的排泄量降低了13.3%，从而有利于增加养殖效益，降低对环境的污染。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
除非在本文中另作限定，本文所用的全部技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通计数人员通常所理解的相同含义。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 3nd Ed. (Singleton et al., 2006)和COLLINS DICTIONARY BIOLOGY (Hale et al., 2003)为技术人员提供了本发明中所使用的许多术语的一般性解释。
实施例1 烟曲霉植酸酶基因的克隆
以烟曲霉（Aspergillus fumigatus）基因组总DNA为模板，利用上下游引物进行扩增。
PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，进行测序分析。结果显示，扩增产物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。经过NCBI Blast比对发现，该氨基酸序列与烟曲霉的植酸酶序列相似性为89%，为一新的等位基因。
实施例2 表达载体的构建
将实施例1中回收的扩增产物连接到pMD18-T载体，获得克隆载体pMD-TR质粒，然后用NcoI和KpnI进行双酶切，回收TR片段；取2μl回收产物与NcoI和KpnI双酶切pKDN-5载体连接过夜导入大肠杆菌DH5α，获得重组表达质粒pKDN-TR。
实施例3 转化与筛选
3.1原生质体制备
接种里氏木霉（Trichoderma reesei）菌丝于PDA平板上生长4 天；切取直径约3 cm的菌落置于约60 mlYEG（0.5%酵母粉、1%葡萄糖）的液体培养基中，30℃、200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20 ml裂解酶液（Sigma L1412）酶解2-3 小时；取出酶解液，加入0.7 M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加10-20 ml STC液（20%蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2）悬浮，3000 rpm，离心10 min；加适量STC悬浮分装（150 μl/管，108个/ml）。
转化与验证
取2μg pKDN-TR DNA加入到150μl原生质体中，接着加入500μl 25%PEG轻轻混匀，室温静置25 min；然后分2-3次再加1ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基（0.1%MgSO4, 1%KH2PO4, 0.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖），轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板（2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4, 1.5%KH2PO4, 0.06%MgSO4, 0.06%CaCl2，1.5%琼脂），28℃黑暗培养数天至转化子长出。
提取转化子基因组DNA为模板，利用引物扩增潮霉素基因验证转化子。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；55℃ 40S，72℃ 1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析。将其中一株阳性转化子命名为里氏木霉TR-01（Trichoderma reesei TR-01）。
实施例4 发酵与酶活测定
4.1 发酵验证
将阳性转化子Trichoderma reesei TR-01接种于MM发酵培养基（1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH4)2SO4，0.09%MgSO4，2%KH2PO4，0.04%CaCl2，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000）培养，28℃培养48小时，然后25℃培养48小时; 所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000 g条件下离心10 min，收集上清液；将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶上进行电泳检测，在23kDa左右处出现一条带，即为重组表达的植酸酶。
酶活测定
酶活定义：在温度为37℃、pH为5.0的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。
测定方法：准确称取0.6804g在105℃烘至恒重的基准磷酸二氢钾（5.9）于100ml容量瓶中，用乙酸缓冲液（5.1）溶解，并定容至100ml，浓度为50.0mmol/L。按表1的比例用乙酸缓冲液（5.2）稀释成不同浓度，与待测试样一起反应测定。以无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直线回归方程（y=ax＋b）。
反应后的试样在水浴中静置10min ，在离心机（6.7）上以4000r/min 离心10min ，上清液以标准曲线的空白调零，在分光光度计（6.3）415nm 波长处测定样品空白（A0）和样品溶液（A）的吸光值，A-A0 为实测吸光值。用直线回归方程计算植酸酶的活性。
植酸酶活性按下式计算
U=F×C /（m×30）
式中：
U — 试样中植酸酶的活性，U/g
C — 根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U 。
F — 试样溶液反应前的总稀释倍数。
m — 试样质量，g 。
30 — 反应时间，min 。
采用上述方法测得里氏木霉工程菌摇瓶发酵上清液酶活约为880U/mL。
本发明构建的里氏木霉工程菌能够高效重组表达烟曲霉的植酸酶，且多次传代后，依然能保持遗传稳定性。
实施例5 养殖动物饲喂实验
采购1日龄罗氏308白羽肉公鸡，分为对照组和实验组，每个处理组16个重复，每个重复8羽鸡，生产试验期为35天，其中对照组为饲喂普通商品日粮，实验组为饲喂添加本发明重组植酸酶的普通商品日粮，测量试验过程中采食量、料重比、体重的变化以及磷的排放情况，实验结果如表1和表2所示：
表1肉鸡生产性能统计结果
| 组别 | 日增重(g) | 料肉比 | 育肥指数 |
| 对照组 | 70.05±2.16 | 1.59±0.15b | 341.33±30.64 |
| 实验组 | 72.32±2.81 | 1.49±0.14a | 350.47±29.75 |
由表1所示，实验组肉鸡的料肉比比对照组降低了9%，与对照差异显著（P＜0.05），日增重、育肥指数比对照组分别提高了3.2%、2.7%。这表明通过在饲料中添加本发明重组表达的植酸酶后，肉鸡的生产性能得到了普遍提高，不仅降低了肉鸡的生产成本，还提高了肉鸡的生产效率。
表2 添加本发明重组表达的植酸酶对磷排泄量的影响
| 指 标 | 对照组 | 实验组 |
| 磷排泄量(g/kg) | 3.0±0.4a | 2.6±0.4b |
从表2可以看出，与对照组比较，添加本发明的重组表达植酸酶后，肉鸡排泄的磷量降低13.3% （P＜0.05）。说明本发明的植酸酶能有效提高肉鸡对磷的吸收利用率，减少含氮废物的排出，有利于提高饲料利用率，以及减轻对环境的污染。
SEQUENCE LISTING
<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司
<120> 一种来源于烟曲霉的植酸酶
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 207
<212> PRT
<213> Phytase protein
<400> 1
Met Asp Met Phe Thr Leu Glu Thr Ile Ser Thr Ser Thr Val Asp Thr
1 5 10 15
Lys Leu Ser Pro Phe Cys Asp Leu Phe Thr His Glu Gly Trp Ile Asn
20 25 30
Tyr Asp Tyr Leu Gln Ser Leu Asn Lys Tyr Tyr Gly His Gly Ala Gly
35 40 45
Asn Pro Leu Gly Pro Thr Gln Gly Val Gly Tyr Ala Asn Glu Leu Ile
50 55 60
Ala Arg Leu Thr His Leu Pro Val Leu Asp Asp Thr Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Thr Phe Glu Ser Asn Pro Ala Thr Phe Pro Leu Asn Ser Thr Leu Tyr
85 90 95
Ala Asp Phe Ser His Glu Lys Gly Ile Ile Ser Ile Leu Phe Ala Leu
100 105 110
Gly Leu Tyr Asn Gly Thr Lys Pro Leu Ser Ser Thr Thr Ala Glu Asn
115 120 125
Ile Thr Gln Thr Asp Gly Phe Ser Ser Ala Trp Thr Val Pro Phe Ala
130 135 140
Ser Arg Met Tyr Val Glu Met Met Gln Cys Gln Ser Glu Gln Glu Pro
145 150 155 160
Leu Val Arg Val Leu Val Asn Glu Leu Val Val Pro Leu His Gly Ser
165 170 175
Pro Val Glu Pro Leu Gly Arg Cys Thr Arg Asp Ser Phe Gln Lys Gly
180 185 190
Leu Ser Phe Ala Lys Ser Gly Gly Asp Trp Val Lys Ser Phe Pro
195 200 205
<210> 2
<211> 624
<212> DNA
<213> Phytase nucleotide
<400> 2
atggacatgt tcaccttgga gaccatctcc accagcaccg tcgacaccaa gctgtccccc
60
ttctgtgacc tgttcaccca tgaaggatgg atcaactacg actacctcca gtccctgaac
120
aaatactacg gccatggcgc aggtaacccg ctcggcccga cccagggcgt cggctacgct
180
aacgagctca tcgcccgtct cacccacttg cccgtgctcg atgacaccag ctctaaaccc
240
acattcgaat ccaacccggc tactttcccg ctcaactcca ctctctatgc ggacttttcg
300
catgaaaaag gcatcatctc tatcctcttt gctttgggtc tgtacaacgg caccaagccg
360
ctgtcttcca cgaccgcgga gaatatcacc cagaccgatg ggttctcatc tgcctggacg
420
gttcctttcg cgtcgcgcat gtacgtcgag atgatgcaat gccagtccga gcaggagcct
480
ttggtccgtg tcttggttaa tgaacttgtt gttccgctgc atggttctcc ggttgaacct
540
ttgggaagat gtacccggga tagcttccag aaggggttga gctttgctaa atctggtggt
600
gattgggtaa agtcttttcc ttag
624
Claims (4)
1.一种植酸酶，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
2.用于编码权利要求1所述植酸酶的基因。
3.权利要求2所述基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
4.权利要求1所述植酸酶在饲料中的应用。
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