TW200819537A - Starch binding domain and use thereof - Google Patents

Description

200819537 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一澱粉吸附區域，一重組蛋白質及其組合物。本發明亦關於 • 一分離包含澱粉吸附區域之重组蛋白質的方法。 【先前技術】 利用微生物系統表現蛋白質已成為製造高價、重要醫藥蛋白質之主要來源， 而如何純化和回收重組蛋白質則為發酵製程設計上之重要考量。傳統^蛋 白質純化方法可用以純化單一產物，改良之方法，更進一步包括使用重組 蛋白質。重組蛋白質可藉由親和性管柱層析法加以舰，所欲純化之重组 蛋白質之成份可藉由其與親和性基質上結合之多肽形成共價性連結而被純 某些系統係藉由親和性管柱層析之原理來分離蛋白質。 美國專利第·758號揭露—種包含麥芽機合蛋 一 ，載體内可產生_—因下游形 八屏⑼主細胞中表現該重組蛋白質。將細胞溶離物或培養基 基質-直賴粉之管柱中並洗繼，再使用大量之麥 麟罐㈣㈣維素管柱 層載入該細心Ί❿域重組蛋白f。將細胞溶離物或培養基分 於彼此:在中性二:之=吸附區域和纖維素間之交互細^ 液，如乙二醇，、隹〜 水性父互作用所產生。一般係使用低極性溶 仃/谷離’之後再以透析和過濾移除低極性溶劑。 5 200819537 此等現行之蛋自化純之缺簡括：魏程 純化之管柱昂貴。此祕白暫祕“““ +万便且費力用於 姊化曹祕二 狀_包括：不能在某些條件之下 所士，而士心 樣本、使用之蛋白質標籤比標的蛋白 貝大而本發明之蛋白質標籤較現有之蛋白質標籤小。 【發明内容】 本發明係關於一種澱粉吸附區域(starchbinding d_in)，其具有如下顯示於 SEQ ID Nos· 1、2或3之胺基酸序列； ’、 SEQIDNo. 1 : ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTVVY ADGSDNWNNN GMIAASFSG PISGSNYEYW TFSASVKGIK EFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS ； SEQIDNo. 2 ：

ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTVIY ADGSDNWNNN GNTIAASYSA PISGSNYEYW TFSASINGIK EFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS;或

SEQ ID No. 3: ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTVIY ANGSDNWNNN GNTIAASYSA PISGSNYEYW TFSASINGIK EFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS ； 或其SEQ ID NO.l、2或3之等位變體及衍生物，其具有澱粉吸附能力者。 本發明中之澱粉吸附區域可取得自同類之碳水化合物結合模組 (Carbohydrate Binding Module)，如：CBM20 或 CBM21。本發明一實施例中， 澱粉吸附區域可取自CBM21葡萄糖澱粉酶之澱粉吸附區域。本發明較佳之 6 200819537 貝加例中’殿粉吸附區域可取自根徽屬(及办加户⑽Spp )。本發明之更佳實施 例中，澱粉吸附區域可取自根徽屬⑽/zo;my spp·)之葡萄糖澱粉酶之澱粉吸 附區域。 本發明之澱粉吸附區域包含配體結合位置(或碳水化合物結合位置），該部位 位於芳香性基圈上，而該芳香性基團則位於用以和碳水化合物結合之胺基 酸序列上第32、47、58、67、83、93和94殘基之酪胺酸或/及色胺酸上。 本發明之較佳實施例中，活性位點為殘基32酪胺酸、殘基47色胺酸、殘 基58酪胺酸、殘基83酪胺酸、殘基93酪胺酸和殘基94酪胺酸。 本發明亦關於一種重組蛋白質，其包含下列序列： (SBD)m-Ln-X-L’p-(SBD)q SBD係指澱粉吸附區域，l係指連接子，l，係指連接子，X係指目標蛋白 質或多胜肽，m係為0、1或2，η係為〇或1，p係為〇或1，q係為〇、i 或2，其中m和q不會同時為〇。 本發明之較佳實施例中’該連接子為及〇LK (及之連接子）； PH :六個組氨酸；PK :八個離胺酸；PPT : 一個蘇胺酸及四個脯胺酸_蘇胺 酸重複序列[Τ(ΡΤ)4];或58L :在載體pET39b(+)上介於限制酶切位SpeL^ Ncol間的區域。 本發明亦關於一種複合物，其包含下列序列： (SBD)m_X-(SBD)q SBD係指殿粉吸附區域，X係指碳水化合物，m係為〇、丨或2，q係為〇、 1或2，其中澱粉吸附區域係利用不同部位同時和碳水化合物結合。 本發明之較佳實施例中，其中X為碳水化合物，其結構係包含…丨，木葡萄糖 鍵結或α-1，6-葡萄糖鍵結。本發明之更佳實施例中，其碳水化合物係為募醣 7 200819537 或環狀碳水化合物。其中該澱粉吸附區域和碳水化合物係用配體結合位置 (礙水化合物結合位置)或構形方式結合。該澱粉吸附區域包含多個單位係依 據碳水化合物的大小決定。 本發明進一步關於一種用以純化如前所述包含澱粉吸附區域重組蛋白質之 方法，其包含··（a)將含有重組蛋白質之生物液體直接施加於親和性基質； 和(b)§周整溫度、pH值、離子強度、含糖濃度或酵素組成以溶離重組蛋白質。 本方法中之親和性基質在其任意部份結構，包含主鏈、側鏈或經修飾殘基 之内包含下式： (X-X)n X係指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖間之鍵結為α-1，4-鍵結或α-ΐ，6_鍵結， 且η為1或大於1。本發明之較佳實施例中，其該親和性基質為澱粉，溫度 改變範圍係指37°C或更高，且步驟〇)係於0〜25 °C下操作。 【實施方式】 以下實施例為非限制性的，僅作為本發明各個方面及特徵的典型實例。

微生物菌株及質體 以大腸桿菌及ToplOF’（T7’（proAB /aclq，/acZAM15, Τη川丨TetR>} mcrA, A(mrr-hsdRMS-mcrBC\ 80/acZAM15? AlacX74, deoR, recAl, araD139, A(ara-/ew)7697, ga/U，ga/K，(StrR) eWAl，λ_)做為載體構 築及DNA操作之寄主細胞。 以大腸桿菌 cWBI^l-CodonPlus® (DE3) (Stratagene，USA) (B F— ompT hsdS{x^ me ) dcm+ Tef galX(DE3) endA Hte [argUproL Camr] [argU ☆r/ewirStrep/Spec1*])做為生產融合蛋白質之寄主細胞。 8 200819537 腸桿菌中表現融合 載體pET-23a(+) (Novagen，USA)中之T7啟動子做為在大 蛋白質及序列分析之用。 細菌培養 將大腸桿菌培養於含有5〇0_1安比西林(_1^11叫之1^^时^(1^ 培養基[1% (w/v) tryptone，2% (w/v)酵母菌萃取物，2% (w/v)氯化7·5] 中，另以含有1.5%洋菜及50 pg/ml安比西林之固態LB培養基於3yc筛選 轉形菌株。 土、 、 實施例1 (A)質體之構築 重組載體之構築如圖一所示。eGFP、連接子及SBD片段皆以設計之引子經 由PCR增幅產生，其引子序列如表一所示。連接子序列可由以下五種候選 序列取代(i^LK: wyzae GA之連接子、PH:六個組氨酸、PK:八 個離胺酸、PPT: —個蘇胺酸及四個脯胺酸-蘇胺酸重複序列[τ(ρτ)4]及58L: 在載體pET39b(+)上介於限制酶切位an(i TVeoI間的區域）。PCR反應之 過程如下：混合l〇ng模板，0·5μ1各引子（1〇μΜ)，5 μ1反應緩衝液(10x)， 5 μΐ 去氧核苷酸(2·5 mM)，0·8 μΐ Ex Taq DNA 聚合酶(Takara Mims Bio, Japan， 5 U/μΙ)，加水至50 μ1終體積。此混合物依下列循環反應：}循環之95〇c/5 分鐘—30循環之[95°C/30秒(高溫變性），53°C/30秒(引子黏合），72。(：/20秒 至2分鐘(聚合反應and !循環之72〇c/5分鐘。 表一合成寡核苷酸引子 9 200819537

引子名稱 合成寡核苷酸引子序列 LK-F·所mffll 5，-TCCCAAGCTTTCCAAGCCCACTACTACT LK-R-Kpnl 5，-ACGGGGTACCGTTACCAGTTGGGAATGA 58L-F-所滅II 5，-CCCAAGCTTACTAGTGGTTCTGGTCATCAC 58L-R-AWeI 5，-AACATATGCATGGTTGAGGAGAAGCCCG SBD-F 却 Μ 5，-TTCGGGGTACCGCAAGTATTCCTAGCA SBD-F-iV(M 5，-GGGAATTCCATATGGCAAGTATTCCTA SBDUI 5，-TCCGCTCGAGTCATGTAGATACTTGG PK-F-/MII S^TGCGCCCAAGCTTAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGGC AAGTATTCCTAGCAGTGCTTC VK-R-Kpnl 5，-CCGGGGTACCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTTCTAGA TACTTGGTAATTGGC PH-F-所祕I 5，-TCCCAAGCTTCACCACCACCACCACCACGCAAGTATTCCTA GCAGTGCTT Vii^Kpnl 5,-ACGGGGTACCGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGTAGATACTTfiG TAATTGGC S^TCCCAAGCTTACTCCGACTCCGACTCCCjACTCCGACTCiCAA GTATTCCTAGCAGTGCTTC ?VT-R-Kpnl y-TCGGGGTACCAGTCGGAGTCGGAGTCGGAGTCGGAGTTGTA GATACTTGGTAATTGGC SBD-F-湯 I 55-GGGAATTCCATATGGCAAGTATTCCTA mFT-F-Kpnl 5，-TTTCGGGGTACCCAG AGTGAGCrGrTArT GFP-F-細 RI 59-GGAATTCATGGTGAGCAAGGGC GFP-F-Kpnl y-TArCGGGGTACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT GFP-R-HmdlII 5’-CCCAAGCTTCTTGTACAGCTCGTC 限制酶切位以底線標示。 將前一步驟取得之片段與pGEM®-T Easy載體（Promega，USA)進行接合反 應。混合100ng嵌入DNA片段，1 μΐ載體，1 μΐ接合酶緩衝_66 mM Tris-HCl (pH7.6)，6.6mMMgCl2，10mMDTT，0.1 mMATP]及 1 μ1Τ4 接合酶(Takara Mims Bio, Japan)，加二次水至10 μΐ終體積，置於16°C反應16小時。將接 合反應產物轉形至大腸桿菌勝任細胞，具有T-載體及所欲轉殖序列之轉形 10 200819537 菌株可經由藍白菌落篩選得到。大量培養選殖後之菌落，以 Miniprep Purification Kit (Protech，Taiwan)純化質體，純化後之質體以特定限 制酶裁剪後，以1%洋菜膠體電泳/lx TAE緩衝液(40 mM Tris Base，40 mM 醋酸和1 mM EDTA)於100V下分析處理後之DNA片段大小。隨後以EtBr (ethidium bromide，0·5 mg/ml)溶液進行膠體染色1〇分鐘，DNA片段即可顯 ' 示於UV燈之下。將欲付之片段以Gel/PCR DNA fragment extraction kit (Geneaid Biotech，Taiwan)純化後可供後續實驗使用。 在進行接合反應之前，載體pET-23a(+)先經由特定限制酶裁剪。爲了構築 SBD於5’端，載體先以及及oRI裁剪，含有SBD及連接子之DNA 攀 片段再以麻1及細1裁剪，含有eGFP之DNA片段則以細1及五coRi 裁剪。另一方面，爲了構築SBD於3,端，載體先以五⑺RiandJ^oI裁剪， 含有eGFP及連接子之DNA片段則以五coRI及所kdn裁剪，而含有SBD 及連接子之DNA片段以施㈣及為！裁剪。將接合反應產物獅至大腸 桿菌£·〇>/? ToplOF’勝任細胞進行DNA操作及序列確認，之後再轉形至大 腸桿菌五· co"BL21-CodonPlus®(DE3)。 (B)勝任細胞之製備及大腸桿菌轉形 以Mandel及Higa於1970年研發之氯化轉轉形技術用於製備大腸桿菌勝任 • 細胞[五.C〇//T〇pl0F，及 BL21-C〇d〇nPlUS>E3)]。將 1〇〇μ1 分裝好之冷凍大 腸捍菌細胞接種於含有50 Mg/ml四環素(她⑽㈣之5 ml LB培養基中， 於37。(：培養16小時’再取100 μ1過夜培養之細胞，培養於含有四環素之 5 ml新鮮LB培養基，於37〇c培養，待〇D6〇〇達到〇 5〜〇 6。之後以％ _

Xg於代離心5分鐘以收集細胞，再以1〇ml冰氯化麟液(i〇〇mM)重新 懸浮離心後之細胞。將重新懸浮之細胞置於冰水浴中3〇分鐘後再離心，離 心後以5〇0 μΐ含有丨5%甘油之冰氯化解液小心緩慢❸重新懸浮沉殿之細 胞約3小時，以完成勝任細胞之製備。 11 200819537 大腸桿菌之獅是將_ μ1分裝之勝餘胞和1G μ1接合反誠物混合，靜 置於冰上30分鐘，在熱休克步驟中以42°C處理此混合物90秒，再加入500 μΐ LB培養基，於37〇c培養3〇分鐘。最後於25〇c以紙· X尽離心細胞 10为鐘’並將其塗佈於含有50 pg/ml安比西林之LB平板培養基，於37°C 培養16小時。 (C) 小量製備質體 於37 C ’將重組大腸桿菌培養於lb培養基中16小時，再於4°c以16,000 xg離心5分鐘以收集細胞。質體DNA以G⑼心取腿邮哪pwifkati〇n Kit純化之。將離心後之菌體重新懸浮於200 μΐ溶液i (5〇 ^^印丁八，25

Tns pH 8·0, 50 福 glucose)中，隨後加入200 μΐ溶液II (〇.2NNaOH，1% SDS) 於微量離心管中，將離心管緩慢的上下倒置混合至溶液澄清為止，再加入 200 μΐ溶液III (KOAc，11.5%冰醋酸，pH4.8)於管中，並將管子上下倒置混 合5-6次。不溶物可於4。€以16,〇〇〇秘離心5分鐘。將上清液直接移至離 心管柱，於16,000 X公離心3〇秒。將離心後之液體棄置，加入70〇 μ1清洗 溶液(70。/。酒精)並以i6,〇〇〇xg離心1分鐘，棄置離心後之液體，再以16,〇〇〇 xg於4°C離心3分鐘以移去殘餘之酒精。將離心管柱置於新的微量離心管 上，加入50-100 μΐ無菌水，最後於4〇C，以16,000 xg離心5分鐘以溶離 DNA，並儲存於-20°C。 (D) 原位聚合酶連鎖反應 自平板培養基上挑選數個大腸桿菌轉形菌落作為PCR模板。混合轉形菌落 模板，0·3 μΐ之10 μΜ前置引子，0.3 μΐ之10 μΜ反置引子，2 μΐ之2.5 mM 去氧核苷酸(dGTP，dATP，dCTP and dTTP)，2 μΐ 之 1〇χ反應緩衝液，〇 3 μ1 之 5 U/μΙ Vio DNA 聚合酶(Mogene，USA)及 15.1 μΐ 二次水，以 peryn

Elmer Gene Amp PCR system 2400進行反應。加熱循環反應條件如下： 12 200819537 步驟 溫度 處理時間 循環數目 1 95 °C 5分鐘 1 2 95 °€ 30秒 30 53 °C 30秒 72 °C 30秒〜1分30秒 3 72 °C 7分鐘 1 (E) DNA定序 以 BigDye⑧ Terminator V3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI，USA)進行定序反 應。反應物混合後進行下列循環:1循環之96〇C/1分鐘—25循環之[96cC/3〇 秒，50°C/30 秒，60°C/2 分鐘]。將產物和 2 μ13M 醋酸納，ΡΗ 4·6，50 μΐ 95% 酒精及10 μΐ二次水混合，置於25°C/15分鐘以沉澱聚合反應之產物。於4〇c 以16,000 xg離心20分鐘，移除上層液，再加入⑽叫7〇%酒精。混合均 勻後’以16,000 xg於4。€離心5分鐘，再完全移除上清液。離心管中聚合 反應之DNA產物以真空離心5分鐘乾燥之，加入1〇 μ1 Hi-Di f〇rmamide以 溶解產物’最後以ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer進行DNA自動定序。 (F) 利用大腸桿菌表現融合蛋白 以大腸桿菌五· co//BL21-CodonPlus® (DE3)表現融合蛋白。含有融合蛋白基 因片段之質體轉形至大腸桿菌c〇// Bl^l-CodonPlus® (DE3)勝任細胞中， 以含有50 pg/ml安比西林之LB平板培養基於37。(：培養16小時進行篩選。 將單一滅洛接種於含有50 pg/ml安比西林之1 mi LB培養基，於37°C培養， 待OD6〇〇達到0.4-0.6。再加入終濃度lmM異丙基硫化半乳糖苦(iptg) 誘導蛋白質產生，於20°C培養16小時，之後收集細胞並重新懸浮於〇1 ml 結合緩衝液(50 mMNaOAc，pH 5.5)，再以超音波震盪器(Mis〇nix，USA)將細 胞打破，可溶及不可溶之融合蛋白可於4°C以“，(^吨離心川㈤匕分離之。 (G) 聚丙醯胺膠體電泳（SDS_PAGE) 13 200819537 依據Laemmli方法[25]，以lmm平板膠體，包含分離膠體(pH 8·8)及焦集膠 體(pH 6.8)，進行不連續聚丙醯胺膠體電泳。樣品以樣品緩衝液[1〇〇 ^ Tris-HCl (pH 6·8)，200 mM DTT，4% SDS，0.2% 溴紛藍，及 2〇〇/0 甘油]於 99°C處理10分鐘，12% (w/v)聚丙醯胺膠體電泳以Electrical Supply MP-250，於25 mA分析60分鐘。 以可馬式藍溶液(2·5%可馬士亮藍R-250,45 %曱醇，及10%醋酸)漂染電 泳分析完之膠片15分鐘，將膠片置於退染缓衝液I (40%曱醇及1〇%醋酸） 中退染1小時，再置於退染缓衝液11(7%甲醇及5%醋酸)中，移除剩下的染 劑。蛋白質分子量標諸(Fermentas，USA)亦於同時分析之。 (H) 蛋白質濃度定量 樣品之蛋白質濃度以二辛可寧酸試劑套組(BCA Assay Kit，Pierce，USA)定 量之’以牛血清蛋白(bovine serum albumin)為標準品。 (I) 以直鏈澱粉樹脂層析法純化融合蛋白 將直鍵殿粉樹脂倒入2.5 X 10公分管柱中，將離心後含有融合蛋白之大腸桿 菌細胞以結合緩衝液(50 mMNaOAc，pH 5.5)重新懸浮，再以超音波震盪。 於4°C以16,000xg離心15分鐘後，保留上清液以進行層析法。將管柱以8 倍管柱體積之結合缓衝液清洗後，將澄清的細胞溶出物以流速lml/min注入 管柱中。將管柱以12倍管柱體積之結合緩衝液清洗後，再將融合蛋白以溶 離緩衝液(10 mM甘胺酸/NaOH，pH 11.0)析出。 (J) 結果 為了增加以SBD為親和性標戴之應用潛力及研發不同之多胜狀連接子對於 蛋白質表現及純化之效用，將eGFP及SBD與不同連接子如58L、办LK、 PH、PK及PPT建構重組克隆，如圖一所示。十個融合蛋白中，其中五镇 融合蛋白之SBD位於iV端，其餘則位於C端。位於#端之SBD，於大腸 才干囷中可大篁表現可溶之SBD-58L-eGFP、SBD-i?0LK-eGFP及 200819537

SBD-PH-eGFP ’ 而 SBD_PK-eGFP 及 SBD-PPT-eGFP 貝^以内涵顆粒方式表 現。當 SBD位於 C端時，e〇FP-58L_SBD、eGFP-i?oLK-SBD 及 eGFP_PH-SBD 亦可於可溶性分層中大量表現，但eGFp_PK_SBD及eGFp_ppT_SBD之表現 亦會導致内涵顆粒產生。大量表現不可溶之SBD-PK_eGFp及 SBD-PPT-eGFP 與 eGFP-PK-SBD 及 eGFP-PPT-SBD，分別如圖二、圖三所 不。大量表現之 SBD-PK-eGFP、SBD-PPT-eGFP、eGFP-PK-SBD 及 eGFP-PPT-SBD之分子量，以12%聚丙醯胺膠體電泳分析後，粗估為4〇尬以 六個融合蛋白（SBD-58L-eGFP、SBD JoLK-eGFP、SBD-PH-eGFP、 办LK-SBD 及 eGFP-PH-SBD)於大腸桿菌[五.⑺" BL21-C〇d〇nPlu’ (DE3)]中於20°C誘導16小時，而成功的表現可溶性融合 蛋白。細胞以離心方式收集，重新懸浮於結合緩衝液(5〇福Na〇Ac，ρΗ 5·5) 以超音波震盪，利用離心方式收集含有大量表現之可溶性融合蛋白上層 液，再注入充填直鏈殿粉樹脂之親合性層析管柱中，以溶離緩衝液(1〇 glycine/NaOH，pH 11.0)自管柱中溶離純化融合蛋白。純化之重組蛋白以12% 聚丙醯胺膠體電泳分析，如圖四所示。從！ L重組細胞培養液中，約可取得 100-150 mg之純化融合蛋白，以進行下列分析。 實施例2 (A) pH值對於吸附能力之效用 在測試pH值對於吸附能力效用之實驗中，將純化的融合蛋白(16 _)於25% 攪動入含不同pH值，含終濃度〇·ΐ mg/ml之玉米澱粉緩衝液中(sigma_Aldrich， EC 232-679-6, USA)約1小時。結合測試在pH 2 m·〇之緩衝液[1〇〇碰甘胺 酸/鹽酸(pH 2-3)，100 mM醋酸鈉/醋酸(pH 4-5)，1〇〇 mM IS^HPCVNal^PC^ (ρΗ6-7)，10GmMTriS/HCl(pH8)，lGGmM甘胺酸/氫氧化鈉中進 行。以二辛可寧酸試劑套組(BCA assay)測定於上層液中未吸附之融合蛋白 於吸附前及吸附後之濃度。loo%融合蛋白之相對吸附能力以1)115〇時之測定 值為基準。 15 200819537 (B)溫度對於吸附能力之效用 在測試溫度對於澱粉吸附能力效用之實驗中，將純化的融合蛋白(16μΜ)於 4°C、25°C及37°C攪動入含有終濃度〇·1 mg/ml玉米澱粉之吸附緩衝液⑼ mM NaOAc，pH 5.5)約3小時。以二辛可寧酸試劑套組(BCA assay)測定於上 層液中未吸附之融合蛋白於吸附前及吸附後之濃度。1〇〇〇/0融合蛋白之相對 吸附能力以4°C之測定值為基準。 (C)以攪拌法純化

授掉純化法疋沿用純化isoamylase (Fang，T Y et al·，（1994)五卿16, 247-252)之方法。將含有融合蛋白之大腸 桿菌之細胞懸浮於吸附緩衝液(5〇 mM Na〇Ac，pH 5 5)中，再以超音波震 蘯。之後於4°C以16,000 xg離心15分鐘，捨棄不溶之沉澱物。以1 ml溶 離緩衝液(10 mM甘胺酸/氫氧化鈉，pH n.o)清洗5〇 mg玉米澱粉(Sigma，eC 232-679-6)二次，再以1 mi二次水清洗。之後以16,〇〇〇χ《離心5分鐘去除 二次水。含有融合蛋白之1 ml上層液和5〇 mg澱粉混合後，於25。〇連續 攪拌3小時。將上層液於4〇c u 16，_ Xg離心1〇分鐘去除，殿粉沉殿以 1 ml吸附緩衝液清洗三次，再以25〇 μ1溶離緩衝液溶離四次，保留清洗及 溶離之分層液供聚丙浠胺膠體電泳及其它分析。 (D)以澱粉管柱層析法純化 此純化方式沿用含有粗㈣之漏斗式錢·以純化

Pseudomonas amyloderamosa isoamylase (Lin, L. L. et al., (1994) Lett Appl Microbiol Λ9, 383 385)之方法。將含有融合蛋白之大腸桿菌細胞懸浮於吸附緩衝液(5〇 mMNaOAc,pH5.5)t » ° 4°C ίλ 16,000 15 棄不溶之沉澱物。將2〇〇 mg之玉米崎(sigma)以2时溶離 ，⑼福甘胺酸/氫氧化鈉，pH n.騎洗三次，再以2 W二次。殿 液(5〇mMNa〇AC，PH5.5)清洗三次，再懸浮於吸 並將、填充於5_ml可拋棄式針筒中，其中針頭已被移除 、將I氏置於底挪方止婦流失。超音波震烫後，收集3此細胞可溶分 16 200819537 層液，加入澱粉管柱中，以地心引力帶動液體流動。以6 ml吸附緩衝液洗 去非專一性吸附蛋白，再以3 ml溶離緩衝液溶離融合蛋白。清洗及溶離步 驟可以位於底部之另一之針筒吸取以加速之。保留清洗及溶離之分層液供 聚丙焊胺膠體電泳及其它分析。 (E) 以改良之澱粉管柱層析法純化

此澱粉管柱層析法結合流體化床吸附法(fluidized bed adsorption，Hicketier， M. and Buchholz, K. (2002) J Biotechnol 93, 253-268; Roy? L et al, (2000) Pm/20, 162-168)並改良之。將含有融合蛋白之大腸桿菌細胞 懸浮於吸附緩衝液(50 mMNaOAc，pH 5.5)中，再以超音波震蘯。之後於4〇C _ 以16,000 x客離心15分鐘，捨棄不溶之沉澱物。以3 ml溶離緩衝液(1〇 mM glycine/NaOH，pH 1L0)清洗600 mg之玉米澱粉(Sigma)三次，再以二次水清 洗三次。澱粉沉澱以3 πύ吸附緩衝液(5〇 mMNaOAc，pH 5·5)清洗三次，最 後懸浮於吸附緩衝液中。將澱粉溶液充填於5-ml可拋棄式針筒中，其中針 頭已被移除，並將濾紙置於底部以防止澱粉流失。此一改良之澱粉管柱設 計如圖五所示。超音波震盪後之細胞可溶分層液以蠕動式幫浦pl (Amersham Pharmacia Biotech，USA)依1 ml/min流速強迫注入激粉管柱之底 部，以6ml吸附緩衝液洗去非專一性吸附蛋白，再以溶離緩衝液溶離融合 蛋白。保留清洗及溶離之分層液供聚丙烯胺膠體電泳及其它分析。 參 (F) 結果 pH值及溫度對於粗澱粉吸附之效用 SBD本身於pH 5.0-6.0時即對粗澱粉具有良好的吸附能力，其吸附作用在 低於pH 5.0或咼於pH 6·0時則會被破壞。因此選擇融合蛋白 SBD-PH-eGFP ’在25°C時’於不同pH值下測試吸附反應，其麵為ρΗ 2.0-11.0’以確認含有SBD之融合蛋白，於不同ρΗ值之下仍保有吸附能力。 如圖/、所示’ SBD-PH-eGFP與玉米澱粉之最佳吸附能力產生於ρΗ4·〇-5·0， 最弱吸附能力產生於pH 1L0時。此相對吸附能力是&ρΗ 5 〇時之吸附能 17 200819537 力為100%來計算。融合蛋白與粗澱粉於pH 4 0-8 0時之吸附能力十分良 好，而當pH值低於4或南於8時，吸附能力則快速下降。 除此之外，於不同溫度下，測定純化之融合蛋白於吸附缓衝液(5() _ NaOAc，pH5.5)中之吸附能力，如圖七所示。其對於玉米澱粉之最佳吸附效 用溫度為4°C;於25°C時下列融合蛋白sBD-58L-eGFP、SBD-i^LK-eGFP、 SBD-PH-eGFP、eGFP-58L-SBD、eGFP-i?〇LK-SBD 及 eGFP-PH-SBD 對於 玉米澱粉相對之吸附能力分別降至92%、94%、95%、eg%、8i❻/。及74〇/〇。 吸附能力於37°C時更進一歩被干擾。於37〇c時下列融合蛋白 SBD-58L-eGFP、SBD也LK-eGFP、SBD-PH-eGFP、eGFP-58L-SBD、 eGFP-i^LK-SBD及eGFP-PH-SBD對於玉米澱粉相對之吸附能力分別降至 14%、37%、9%、21%、16%及8%。因此，為了達成玉米澱粉及融合蛋白 之高效吸附能力，溫度範圍必須介於4°C及25°C ;同時又考慮到實驗系統 降溫之成本，因此選用25°C進行後續之實驗。 實施例3 (A)以NMR光譜決定結構

NMR資料以Bruker Avance 600 MHz或800 MHz光譜儀分析之。為了決定 結構，將1 mMi?oCBM21 (未標記、15N-標記或13C，UN-雙標記)溶於10 mM 醋酸納，pH 4·5，以於25°C進行NMR實驗。蛋白質濃度以二辛可寧酸試 劑套組(Bio-Rad Protein Assay)定量。骨架歸屬(assignment)乃以 HNCA， HN(CO)CA、HNCACB、CBCA(CO)NH、HNCO 及 HN(CA)CO 實驗進行 (Cavanagh，J· et al·，（1996) iVoiem iVMR 切ec加少，Academic Press Inc·)。由 於i?oCBM21含有相對較高比例之芳香族殘基，其芳香族支鏈之歸屬由 HBCBCGCDHD 及 HBCBCGCDCEHE 實驗協助完成(Yamazaki，T· et al·， (1993) «/· Jm· C/zem· 115，11054-11055)。其餘原子之歸屬則由 homonuclear two-dimensional nuclear Overhauser enhancement spectroscopy (NOESY)及 15N heteronuclear single-quantum coherence-NOESY 200819537 (HSQC-NOESY)經由化學鍵相關光譜(through-bond correlation spectra)協助 元成。利用 Homonuclear double quantum-filtered correlated spectroscopy (DQF-COSY)，homonuclear total correlation spectroscopy (TOdSY)及 i5N HSQC-TOCSY以取得化學鍵相關光譜(through-bond correlations)。其混合期 如下：TOCSY光譜為90 ms，NOESY光譜為50，100或150 ms。所有二 維光譜皆以512 tl增量記錄之，而204812複合物之資料取樣點則以TopSpin 1·3 (Brnker)處理。NOESY光譜產生之距離限制以i〇〇_ms混合期記錄之。 以二維15N HSQC光譜記錄於25°C溶解於99% D20 36小時之冷凍乾燥 7?oCBM21，以鑑別被保護之醯胺質子。及〇CBM21在冷凍乾燥後無法快速 溶解，因此要加入過量之DzO以溶解蛋白質。過量之d20以冷凍乾燥去除， 以產生500_μ1樣品。氫鍵限制得自於HSQC醯胺質子保護作用，由周圍NOE 訊號及 HNCOm (through-hydrogen bond eoherence)(Cordier，F·，and Grzesiek，S· (1999)·/· dw· C7^m· 121，1601-1602)確認之。雙平面角限制 以 TALOS 程式(Comilescu，G· et al·，(1999)/所(9膨/鳩视 13, 289-302)伴隨 著N、HA、CA、CB及C原子之化學位移所取得。以Sodium 2,2-dimethyl-2-silapentane-5-sulphonate (DSS)做為質子化學位移之内部基 準，異核化學位移則以設定之Y15N//H = 0.101329118及fC/^H = 0.251449530為基準。办CBM21化學位移以編號BMRB7083存入Biological Magnetic Resonance Data Bank (BMRB)。 (B)結構計算及分析

部份歸屬峰列表及化學位移表以SPARKY程式(Goddard，T. D.，and Kneller， D.G· (1999))之手動歸屬法完成。其波峰強度依設定之peak fitting protocol， 依據Lorentzian line shapes完成。i?oCBM21 結構計算以CNS 1.1 (Brnnger，A. T. et al, (1998) Acta Cryst D54? 905-921)>^ARIA 2.0 (Nilges, M. et al.5 (1997) X M9/·所ο/· 269, 408-422)依torsion angle dynamics (TAD)及standard simulated annealing protocols進行(Nilges，M· et al”（1988) 239, 129-136)。此 等計算完成後，利用OPLS力場進行explicit water refinement ( Linge，J. P. et al”（2003) PratezVw 50, 496·506)。自200個結構中，選取15個具最低能量結構 200819537 者做進一步之分析。以pR〇CHECK nmr (Lask〇wski，R A 过 Μ，（1993) 乂 却#· Oyw· 26,283_291)分析其品質。組合結構之原子座標以編號(accessi〇n ID) 2DJM存入Protein Data Bank (pdb)。 (C)化學位移擾動 爲了了解i?oCBM21之配體結合殘基及交互作用，利用麥芽三糖、麥芽七糖 及β·環狀糊精研究化學位移擾動。製備100_碰麥芽三糖及麥芽七糖為標準 液，而製備20-mM β-環狀糊精為標準液，因其溶解度低。將办CBM21 (丨 以各單獨配體選汰，利用二維15NHSqC實驗以監控其交互作用。套用下列 公式以計算1Η及15N之加權平均化學位移改變Δδ^ = [(ΔδΐΗΝ)2 + (0·17Δδ15Ν)2]1/2 ( Saitoh，Τ· et al·，（2006)所〇/ C7/e所 281，10482-10488)。 (D)結構比較 用以比較SBD結構之CBMs來自於A吨er glucoamylase⑷CBM20) (Sorimachi, K. et al.5 (1996) J Mol Biol 259, 970-987) ^ Thermoactinomyces vulgaris R-47 α-amylase I (ΓνΟΒΜ34 I) (Abe? A. et al.9 (2004) JMol Biol 335? 811-822) ^ Bacillus halodurans maltohexaose-forming amylase {BhCQMIS and 仙CBM26) (Boraston，A· B· et al·，（2006) / C/zem 281，587-598)及

Klebsiella pneumoniae pullulanase (KpCBM4l) (Mikami, B. et al.? (2006) J Mol 伽/ 359, 690-707)。結構重疊分析以網站伺服器“FAST，，進行(zhu，j·，and Weng，Ζ· (2005) Praieim1 58, 618-627)。 嵌合模擬 利用 AutoDock3.05 (Monis，G· Μ· et al·，（1998)』C7z吵 19, 1639-1662)模擬澱粉分子之於結合點之結合模式。Cyclomaltohexaicosaose 之三維結構由PDB (code: 1C58)下載。在不同模擬中，碳水化合物分子嵌合 於不同結合點。親合性網格設定為90 X 90 X 90，以程式autogrid計算，於 0.375 A間隔下，依三維置中於結合點（Morris，G M· et al·，（1998) 〇/； Compwto如如/ 19, 1639-1662) 〇 利用 Lamarckian genetic algorithm 20 200819537 (LGA)研究構形。對位於二個結合點中任一處之之碳水化合物，進行励組 trials，其中族群大小為每組150個樣品。最初之位置及構形為隨機選擇。 其轉換步驟為2·0 A，旋轉步驟為50°。其它嵌合係數如下：mutatkm^ate = 0.02，crossover rate = 0·8，elitism == 1，local search rate = 〇·〇6，依 1 miiu〇n energy evaluations。從100組trials所得之最終構形叢集，以15人夕轵抬古 差(RMSD)容忍度決定之。 X = (F)結果 NMR光譜及分子結構 7?oCBM21之15N HSQC光譜顯示一典型β_條帶之良好波峰分散模式（圖八 4。光譜質子規格寬度定為16ppm，以配合波峰。最大磁場化學位移為—1181 ppm，屬於179 Ηδΐ ;而屬於W70之Ηεΐ所造成之最大磁場化學位移為1〇8 ppm。由於及〇CBM21含有大量芳香族殘基(18/1〇6)，數個化學位移受到芳香 族環之π-電子電流之影響。靠近芳香族環之電子可能經歷π_電子電流遮蔽 (在環之上或下)或去遮蔽(位於芳香族環之平面)效應。部份歸屬化學位移曾 被BMRB目前之檢查化學位移極端值之軟體視為可疑（M〇sdey，Η. ν.过 (2004) M/_/_ 28, 341-355)，而被3_碰0如沉要求仔細的檢視。’ 例如，V39 Ηβ (0.739)之化學位移可能被γ83及W47之環所影響；N52準 (〇·775)被W47環，N97 Ηβ3 (-〇·〇9)被γΐ〇2環，！79 Ηγ12 (-0.22)被Y40環及 Υ102 Ηβ3 (0.482)被F82環所影響；結果造成此等化學位移移動磁場。於 HNeA，HNCCCOCA > eeeACCCONH，HNCACB，HNCO及HN(CA)CO 光譜 中，其骨架連續吸附力透過整個蛋白質序列持續進行，除了膽胺酸殘基^ 甘胺酸18。介於AsP17、Glyl8及Serl9之吸附力於所有骨架吸附實驗中皆不 存在’因此Glyl8醯胺中氮原子之化學轉無法明確歸屬。一條帶圖例顯示 HNCACB光譜中之骨架吸附力如圖八万所示。' *

結構計算依實驗步驟巾所述之22彳7關：2G71 NOE衍生之距離限制，1〇2 雙平面角限制及74距離限制。N_及c_卜摺板之N〇Es如圖八所示。依 ARIA最終重複計算共產生200個結構，其中ls個具最低總能量者存入pDB 21 200819537 及用於進-步分析。相對於平均結構來說 做為代表結麵九.NMR之__= 構 根均方差槪平均結截，於f_.48±Q%t===，. ^ U4 ± 〇.31 A，.

Ramachandmnpiot巾，95%之非甘紐及非脯胺酸殘基位於最適區域或其它 額外被允許之區域，98.5%位於一般允許區。大部份組合之—殘基及數個 N45及N101殘基位於不被允許區。N97及N1〇1位於環8，而翻位於環 4，此等環狀物位於办CBM21最具彈性區。 表二i?0CBM21於卩114.5及2981^水溶液中之結構統計

Experimental constraints

Total 2071 Intra-residue 973 Sequential (|I-j|=l) 509 Medium range (|I-j| <= 4) 142 Long range (|I-j|>4) 447 Hydrogen bond constraints 74 Dihedral angle constraints 102 RMSD from experimental data Distance (A) 0.0557 ±0.0077 RMSD (A) with respect to the average structure Well-defined region Backbone (N，Ca，C’） 0·48 ± 0.06 Heavy atoms 0.96 ±0.11 All residues Backbone 1·14±0·31 Heavy atoms 1.43 ±0.29 Total energy Etotal after water refinement (Kcal · mol"1) -2730 土 66 RMSD from idealized covalent geometry Bonds (A) 0.0046 ±0.0004 Angles (°) 0.546 ±0.035 Impropers (°) 0.522 土 0.046 Ramachandran analysis Residues in most favored regions 67.3% Residues in additional allowed regions 27.7% Residues in generously allowed regions 3.5%

Residues in disallowed regions 1.5% 22 200819537 &CBM21 domain包括106個殘基，其序列與其它SBD家族成員相似度低 (<25%)，然而i?〇CBM21溶液結構顯示出多數CBMs特徵：一傳統β_三明 治摺豐’及一類免疫球蛋白結構(Boraston，A. Β. et al·，（2004)历〇咖所J382 769-781)。β-三明治結構是對稱的，並由八個反向平行之卜條帶構成：y (V9-Y16)、β2 (F21-V27)、β3 (V34-D42)、β4 (I53-G60)、β5 (Y67-A74)、β6 (I79-V88)、β7 (Τ92_Ν95)及 β8 (Y102-V104)。這些 β_條帶可再分成包含 β_ 摺板(Ν_摺板)之Ν端條帶(圖九均，如β1β2β5 ;及包含β_摺板(c·摺板)之c 端條帶(圖九〇，如與β4相連之β3β6β7/8。位於N-摺板中間之條帶β2，與 βΐ及β5反向平行配對；而位於C_摺板中間之條帶β6，則與β3、β7及问 反向平行配對。位於二β-摺板之間之條帶β4，與β3及ρ5反向平行配對。 i^CBM21之疏水性核由位於Ν_摺板之V9、L11、m、γΐ6、防、125、 V27、W70 及 F72 ’ 及位於 c-摺板之 V36、V38、Y40、F82、184、Y86、 VS8、Y93、Y102及Vl〇4所組成。於β1中，殘基L11_Y14與β2非由氯鍵 相連，而是形成一突起(圖八〇。β7及β8皆以氫鍵與β6相連，其間由環8 隔開(圖八Z>)’CBM21之溶劑可接觸表面結構顯示於圖九乃及五。Ddphi 靜電電位(Rocchia，W· et al·，（2001) J· CTzem· 5 105, 6507_6514)位於其 表面。有趣的是，N-及C-摺板之表面具有十分特殊之靜電電位分布，其中 N-摺板之表面帶有較多帶負電之殘基，而^摺板之表面帶有較多帶正電之 殘基。 SBDs之結構比較 將就BM21之結構與其他不同之SBD家族成員相互比較(表三)。圖十从 顯示一級、二級、三級及四級結構之相似度。於不同SBDs家族中，依 就BM21之結構標示麟色出補之β·絲及環狀彳峨十n員拓樸 學可由結構比較辨別之：就ΒΜ2〇、廳ΒΜ25、现CBM26及办⑶丽 之結構為第-類拓樸，而就BM21，S及rvCBM34，s之結構為第二類拓樸。 此二類拓類造她，除了 -條帶必齡移使之重疊，例襲 就麵之β2;其後之相對應之條帶可一一列出、，就麵 乘、、、；條常β8可和如CBM20之條帶7重疊。 23 200819537 值得-提的是’就B獅之最終條帶於就臟丨 、 ===間物2端目對之條帶)形減鍵。所有就^ 之β-摺板白為反向平行，但 i相==丨 1:類,樸)之整體拓樸與就麵°(第-：樸)相:： ^相對之條，位移-個位置。大多數之叫SBDs屬於第二類拓樸，而c ，之驗則為第二類拓樸(柳_例外)(表三)(碰啦丨，B过此 JMol Biol 3595 690-707). V )

ium M23 !KUL 2C 5X 5紙_ :〇、：〇: 2C3G 2FHF 1 彿 13455 *

麵C德 2DJM Sequencei^nge Ϊ406 PDB numbering) Sequence icienrirv (%) 100··' Sequence similar!^ (%) 100 聽km〇R〇C3M2i (A:* ..:.0.:.: Top αΐ0|τ type II

10,6 21.6 II

7,9 16J

i?J 20.8 3J S3 63 2D.0 |、4 2J :. 3J· 5/zCBM25和5/zCBM26在pdb檔中的序列對應到開啟讀碼(〇pen⑽以驭 frame) BH0413各為第863-958胺基酸序列和第771—863胺基酸序列。 配體結合及化學位移擾動 於本實驗中測試之三種直鏈鍵結之碳水化合物(麥芽三糖，麥芽七糖，及P_ 環狀糊精)顯示相似之化學位移擾動模式；相同之胺基酸殘基在選汰中會受 影響’但其改變幅度則依碳水化合物而不同。办CBM21之15NHSQC光譜 在β-環狀糊精選汰前後為重疊(圖十一 4)，其化學位移改變及受影響之殘基 歸納於圖十一 5°i^CBM21具有顯著化學位移擾動(>〇1 ppm及〇 〇6_〇1 ppm)之殘基，標示於三維結構中(圖十一 〇)。依據此類擾動結果，受配體結 合影響之殘基可歸成三類。第一類包含殘基A41、W47、N52、Y83、K85、 K9卜D95、N96、N97及S99，其位於相對於前述SBDs之結合點一。同理， 殘基 N29、BO、A31、Y32、S33、K34、S57、F58、162、N66、Y67、E68 24 200819537 及Y69構成械之結合點二。具有_姆位移擾動改變及二碳水化合物 龄點之祕標雜編廳結耻盼—Q。有触是，_位於疏 水性核之殘基亦受配合之影響，分顺Ln、v36、v38、聊及i79。 環卜4及8為有彈性的區域，其平均根均方差>i 5 A。除了高彈性外，包 含於結合點-之環4及8具有另皆富含天冬碰(a啊殘基 (位於環4之爾6、_8、_9、奶0及奶2及環8之娜6、奶7、泌8及 N101)叙水化合物配體選汰導致天冬胺酸奶〇、N52、及泌8 大幅度之化學娜_。_ pdy_N雜物可㈣CBM澱較互作用之 分子決定點，·_·Ν環狀物的出_某些CBM21 之特fMMach〇vic， Μ· et al·，（2005)咖J 272, 5497-5513)。二個卜環狀糊精分子分別嵌合於 ACBM21結合點一及結合點二(圖十一 D)，於結合點一中，在喪合之卜環 狀糊精分子及就BM21富含天冬胺酸之環錄巾，驗介於賴糖絲之 經基02及03處；於結合點二中，N29及Υ32之支鏈以氫鍵和卜環狀糊精 相結合，此處同時也具有較大之化學位移擾動改變。 由於多數用於SBDs研究中之配體相對較小(葡萄糖數目$7)，且不含完整 之澱粉螺旋結構。為了模擬較大之直鏈澱粉分子吸附方式，利用

cyclomaltohexaicosaose 分子(Gessler，K· et al·，（1999) Proc 胸MW 5W d 96, 4246_4251) (v-直鏈澱粉，PDB code: 1C58)分別嵌合於办CBM2i之結 合點一與結合點二(圖十一五及。於嵌合複合物之結合點一，環4與v_ 直鏈澱粉的交互作用於介於G1-G13及G14-G26之螺旋槽結構間，環8與 葡萄糖殘基交互作用於螺旋槽G2_G4及G8_G1〇螺旋槽結構間。於結合點 二’環3插入螺旋槽G1_G13及gh-G26之間，而N29及Y32則與葡萄糖 殘基交互作用。環5與^直鏈澱粉構造結合於邊緣而非螺旋槽内。 實施例4 (A)材料及方法 i^GACBM21用於結晶中之濃度約為10mg/mL。办GACBM21今環狀糊精 25 200819537 (PCD)複合物結晶以莫耳濃度1:2培養，以懸式擴散結晶法進行。〗叫蛋白 貝洛液與1 μΐ結晶〉谷液混合，並與Lhbro plates中之5〇〇 μΐ結晶溶液進行平 衡敢初的L日日條件由Hampton Research Crystal Screen kits取得，之後再 進一步最佳化以得到可供繞射品質之結晶。i^GACBM21+CD複合物結晶 之X光繞射資料於台灣國家同步輻射研究中心之BL13C1儀於波長〇·9762 ‘ Α時收集。結晶置於尼龍環上，再以液態氮流於100 Κ時急凍。資料以 HKL2〇00程式處理。 (B)結果 • 複合物結晶(圖十二)在四天中於293 K以18% PEG 8_ 及0·2 Μ醋酸辞in 〇·ΐ M Na Cacodylate緩衝劑（pH 6.5)所得之最大規格為 0·2χ 0·2 χ 0·5 mm。勛GACBMll-pCD複合物結晶繞射為h8 A，屬於 orthorhombic P2JA space group，其單位細胞係數 a = 42.58 A，b = 42.71 A，c = 70.06 A，α =β = γ = 90。及及merge = 3·4%。其 Vm (Matthews 1968)估 异為2.73 A Da1 ’相對於55%溶劑時，結晶中每一個不對稱單位含有一個 釦子。在i^GACBM21-pCD複合物中(圖十三)中，一個办GACBM21分子 和β-環狀糊精分子結合。於办GACBM21々CD複合物觀察到二個結合處， 結合處一及結合處二。結合處一位於β2-β3環，包含關鍵之Y32殘基；結 合處二位於β3-β4環，包含另一個多醣辨識殘基W47。 儘管此發明已詳盡描述於實施例中，使得熟悉此一技藝者可以製造及實 施’其衍生物、變體及改良亦在不背離此發明之精神及範圍下可得。 、 熟悉此一技藝者會了解此發明已大為改進計晝之執行，可得之結果及其内 涵。實施例中之胚胎、動物、植物、微生物及其製造步驟及方法僅為代表 例，而非用以限制此一發明之範疇。熟悉此一技藝者可進一步改良及開^ 其他用途’改良包含於此發明之精神亦屬於本發明之專利申請範圍中。 26 200819537 【圖式簡單說明】 圖-顯示SBD-L-eGFP及eGFP_L_SBD重組蛋白質之載體。 圖二顯示妓丙__電泳分析於切㈣魏之sBD_pK_eGFp及 SBD-PPT_eGFP融合蛋白質之純化結果。 圖三顯示㈣_胺賴轉精於场桿菌魏之eGFp_pK獅及 eGFP-PPT-SBD融合蛋白質之純化結果。

圖四顯示娜丙_賴紐分·錢之齡蛋白質。 圖五顯示⑽良之婦層析錄祕化之結果。 圖六顯示PH值.SBD他GFp和玉麵_能力的效用。 圖七顯示溫; ‘又、蛋白質和玉米澱粉吸附能力的效用。⑷SBD位於重 組蛋白貝之N端；（B)SBD位於重組蛋白質之c端。 圖八顯示就難之職光譜1就議在iH·〜HSQC光議中 之指認西安共振圖。除了和Υ12重疊之Q1Q及和e8?重疊之观之外曰 ==嶋㈣㈣鳴咖⑽㈣⑽撕之範例 ,、▼ Ca為正相位峰(黑色），cp為負相位峰(灰色）。^及 、 N-摺板之反解行之二及結構及其如物及⑽板之環狀物。袓 NOEs，粗雙箭條帶社Ηα_Ηα N版；細魏頭為條㈣之^ 及醯胺貝子NOEs，細箭頭為條帶間之Ηα至酿胺質子卿$ 間之氯鍵。環狀區域中之職8未標示。 ~為條帶 27 200819537 圖九顯不i?i>CBM21在滚你由+ ^丄 在/奋液中之結構。J ·· ^>CBM21組合之立體视

就BM21之前示圖以N端環狀物在上、c端環狀物在下。忍及C 7^CBM21之N摺板端及c_摺板端之卜三明治摺疊圖。d及e為B及c、 表面圖示。 的 圖十顯示SBD之第-類及第二類域結構。紅、橙、黃、綠、藍、紫分別 代表在就BM21上的八個β•條帶及其在其他sbd中相對應之條帶。以紫 色標不之條帶七及八會和條帶六形錢鍵。在廳讓ς之n端前二個p 條帶間額⑽微物為粉紅n SBDs之—減構。其二赌構依前述 原則標示。5 :第-類及第二_樸結構之結構概視圖。條帶之順序如a 所述並標不於第二類拓樸結構之上端。c :第一類(如就bm2〇)及第二類 (如及oCBM21)拓樸結構之三度空間構造。 圖十-顯示就BM21之配齡合和配體嵌合之研究。」：以_ β_環狀糊 精選汰前(黑色峰)及選汰後(紅色峰)之π〇(：ΒΜ21 ihj5n異核單量子關係光 譜(HSQC spectrum)，具較大化學位移擾動之高峰以綠色箭頭標示。扒權重 平均化學位移擾動依殘基數目而改變。黑色、淺黃色、及紅色分別代表麥 芽三糖、麥芽七糖、β_環狀糊精。星號代表位於p〇ly_N l〇〇p中其化學位移 擾動改變局於0.1之天冬醯胺酸殘基(aSparagine，N)。擾動臨界值定為高於 〇·1及0.06-0.1 (橫截面）。C ··顯示位於办CBM21結構上依選汰而改變之殘 基。化學位移改變高於0·06之殘基列為顯著影響者，以綠色標示；化學位 移改變高於0.1者(因此假定其在配體結合時扮演重要角色），以柱狀結構標 示。D :顯示二個β-環狀糊精分子與π〇(^ΒΜ2ΐ之嵌合。五及厂顯示 28 200819537 cyclomaltohexaicosaose (v-直鏈殿粉)與 i?oCBM21 之後合。五、F 分別為 與V-直鏈澱粉嵌合之結構概視圖及表面圖。在E中蛋白質條帶為 黃色，V-直鏈殿粉以球-棍模式顯示。在F中蛋白質為黃色，V-直鏈澱粉為 白色。 圖十二顯示7^GACBM21-PCD複合物之結晶。 圖十三顯示i?oGACBM21-pCD之複合物。

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Claims (1)

1. 200819537 十、申請專利範圍： 1. 一種殿粉吸附區域(starch binding domain)，其具有如下顯示於SEQ ID No· 1、2或3之胺基酸序列； SEQIDNo· 1 : ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTWY ADGSDNWNNN GNIIAASFSG PISGSNYEYW TFSASVKGIK EFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS ； • SEQ IDNo. 2 ： ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTVIY ADGSDNWNNN GNTIAASYSA PISGSNYEYW TFSASINGIK EFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS ；或 SEQIDNo. 3 ：

   ASIPSSASVQ LDSYNYDGST FSGKIYVKNI AYSKKVTVIY ANGSDNWNNN GNTIAASYSA PISGSNYEYW TFSASINGIK EFYIKYEVSGKTYYDNNNSANYQVSTS ； 或其SEQ ID NO.l、2或3之等位變體和衍生物，其具有澱粉結合能力 者。 2·如專利申晴範圍第1項之澱粉吸附區域，其可取得自cbm2〇或CBM21。 3. 如專利申請範圍第2項之澱粉吸附區域，其可取得自CBM21葡萄糖澱 粉酶之殿粉吸附區域。 4. 如專利申請範圍帛3項之殿粉吸附區域，其可取得自根徽屬(廳〇声 30 200819537 spp·) 〇 5·如專利申請範圍第4項之澱粉吸附區域，其可取得自根黴屬巧my spp·)葡萄糖澱粉酶之澱粉吸附區域。 6·如專利申請範圍第5項之澱粉吸附區域，其在胺基酸序列之殘基32、47、 58、67、83、93和94之芳香性基團上具有用於碳水化合物結合之活性 位點。 7.如專利申請範圍第6項之澱粉吸附區域，其中該胺基酸殘基為酪胺酸或/ 及色胺酸。 8·如專利申請範圍第6項之澱粉吸附區域，其中該活性位點為殘基32酪胺 酸、殘基47色胺酸、殘基58酪胺酸、殘基83酪胺酸、殘基93酪胺酸 和殘基94酪胺酸。 9· 一重組蛋白質，其包含下列序列： (SBD)m_Ln-X-L，p_(SBD)q SBD係指澱粉吸附區域，l係指連接子，L’係指連接子，X係指目標蛋 白貝或多胜肽，m係為0、1或2，η係為0或1，p係為〇或1，q係為 〇、1或2，其中m和q不會同時為〇。 10·如專利申請範圍第9項之蛋白質，其中該澱粉吸附區域係如專利申請範 圍第1項之澱粉吸附區域。 11 ·如專利申請範圍第9項之蛋白質，其中該連接子為7?〇LK:灿/zopM GA之連接子；PH :六個組胺酸；ΡΚ :八個離胺酸；ΡΡΤ : —個蘇胺酸 及四個脯胺酸-蘇胺酸重複序列[Τ(ΡΤ)4];或58L ··在載體pET39b(+)上界 於限制酶切位5^1及間的區域。 31 200819537 12·—複合物，其包含下列序列： (SBD)m-X-(SBD)q SBD係指澱粉吸附區域，X係指碳水化合物，m係為〇、1或2，q係為 〇、1或2，其中澱粉吸附區域係利用不同部位同時和碳水化合物結合。 13·如專利申請範圍第12項之複合物，其中該碳水化合物之結構係包含 α_Μ·葡萄糖鍵結或α-1，6-葡萄糖鍵結。 14·如專利申請範圍第12項之複合物，其中該碳水化合物係為環狀碳水化合 物。 15·如專利申請範圍第12項之複合物，其中該澱粉吸附區域和碳水化合物係 用配體結合位置或構形方式結合。 16·如專利申請範圍第12項之複合物，其中該澱粉吸附區域包含多個單位依 據碳水化合物的大小決定。 17.—種用以純化含有如專利申請範圍第丨項澱粉吸附區域的重組蛋白質之 方法，其包含： 0)將含有重組蛋白質之生物液體直接施加於親和性基質；和 0>)肩整溫度、pH值、軒贿、含糖濃度鱗素喊以雜重組蛋白 質。 is·如專利申請範圍第π項之方法，其中該親和性基_其任意部份結構， 包含主鏈、側鏈或經修飾殘基之内包含下式： (X-X)n X係指葡萄糖分子，葡萄糖和葡萄糖間之鍵結為α_Μ_鍵結或w知鍵結 且η為1或大於1。 32 200819537 19. 如專利申請範圍第18項之方法，其中該親和性基質係為澱粉。 20. 如專利申請範圍第17項之方法，其中溫度改變範圍係指37 °C或更高。 ， 21.如專利申請範圍第17項之方法，其中步驟(a)係於0〜25 °C下操作。

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