CN116178490A - 一种高活性淀粉酶抑制活性肽及其制备方法和应用 - Google Patents
一种高活性淀粉酶抑制活性肽及其制备方法和应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116178490A CN116178490A CN202210801319.9A CN202210801319A CN116178490A CN 116178490 A CN116178490 A CN 116178490A CN 202210801319 A CN202210801319 A CN 202210801319A CN 116178490 A CN116178490 A CN 116178490A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- amylase
- active peptide
- activity
- quinoa
- active
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 81
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 50
- 239000003392 amylase inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 21
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 claims abstract description 84
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 claims abstract description 83
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 claims abstract description 83
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 claims abstract description 83
- 240000006162 Chenopodium quinoa Species 0.000 claims abstract description 56
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 49
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims abstract description 11
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 21
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 12
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 11
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 11
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 11
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 11
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 8
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000036541 health Effects 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000007873 sieving Methods 0.000 claims description 5
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 claims description 2
- 229940122816 Amylase inhibitor Drugs 0.000 claims 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 claims 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 claims 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 abstract description 9
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 abstract description 9
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 abstract description 8
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 8
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 abstract description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 abstract description 8
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 5
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 5
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 5
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 57
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 57
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 57
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 28
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 15
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 10
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 8
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- CWVRJTMFETXNAD-JUHZACGLSA-N chlorogenic acid Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)C[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CWVRJTMFETXNAD-JUHZACGLSA-N 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 3,5-dinitrosalicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1O LWFUFLREGJMOIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CWVRJTMFETXNAD-FWCWNIRPSA-N 3-O-Caffeoylquinic acid Natural products O[C@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)C[C@H]1OC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C(O)=C1 CWVRJTMFETXNAD-FWCWNIRPSA-N 0.000 description 4
- PZIRUHCJZBGLDY-UHFFFAOYSA-N Caffeoylquinic acid Natural products CC(CCC(=O)C(C)C1C(=O)CC2C3CC(O)C4CC(O)CCC4(C)C3CCC12C)C(=O)O PZIRUHCJZBGLDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CWVRJTMFETXNAD-KLZCAUPSSA-N Neochlorogenin-saeure Natural products O[C@H]1C[C@@](O)(C[C@@H](OC(=O)C=Cc2ccc(O)c(O)c2)[C@@H]1O)C(=O)O CWVRJTMFETXNAD-KLZCAUPSSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229940074393 chlorogenic acid Drugs 0.000 description 4
- FFQSDFBBSXGVKF-KHSQJDLVSA-N chlorogenic acid Natural products O[C@@H]1C[C@](O)(C[C@@H](CC(=O)C=Cc2ccc(O)c(O)c2)[C@@H]1O)C(=O)O FFQSDFBBSXGVKF-KHSQJDLVSA-N 0.000 description 4
- 235000001368 chlorogenic acid Nutrition 0.000 description 4
- BMRSEYFENKXDIS-KLZCAUPSSA-N cis-3-O-p-coumaroylquinic acid Natural products O[C@H]1C[C@@](O)(C[C@@H](OC(=O)C=Cc2ccc(O)cc2)[C@@H]1O)C(=O)O BMRSEYFENKXDIS-KLZCAUPSSA-N 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Substances CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 2
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 2
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 2
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- ILAJTKAKMVQGNJ-UPHRSURJSA-N cyclohexadecene Chemical compound C1CCCCCCC\C=C/CCCCCC1 ILAJTKAKMVQGNJ-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 108010007119 flavourzyme Proteins 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N (2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4R,5S,6R)-5-[[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4-dihydroxy-6-methyl-5-[[(1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-1-cyclohex-2-enyl]amino]-2-oxanyl]oxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-2-oxanyl]oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4-triol Chemical compound O([C@H]1O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]([C@H](O)[C@H]1O)N[C@@H]1[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)C(CO)=C1)O)C)[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O XUFXOAAUWZOOIT-SXARVLRPSA-N 0.000 description 1
- 241000554155 Andes Species 0.000 description 1
- 235000015493 Chenopodium quinoa Nutrition 0.000 description 1
- 244000298479 Cichorium intybus Species 0.000 description 1
- 235000007542 Cichorium intybus Nutrition 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000004366 Glucosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010056771 Glucosidases Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 244000167148 Justicia carnea Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000206609 Porphyra Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 229960002632 acarbose Drugs 0.000 description 1
- XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N acarviostatin I01 Natural products OC1C(O)C(NC2C(C(O)C(O)C(CO)=C2)O)C(C)OC1OC(C(C1O)O)C(CO)OC1OC1C(CO)OC(O)C(O)C1O XUFXOAAUWZOOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 238000003277 amino acid sequence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005902 aminomethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000003981 capillary liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000006959 non-competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 150000007965 phenolic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000013406 prebiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000036632 reaction speed Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明公开了一种高活性淀粉酶抑制活性肽，活性肽的序列如SEQIDNO.1所示：Met‑Met‑Phe‑Pro‑His。本发明提供的高活性淀粉酶抑制活性肽具有良好的淀粉酶抑制活性。本发明的活性肽通过合适的取向和淀粉酶上氨基酸残基相互结合，与淀粉酶上的结合位点包括活性位点以及活性位点附近的氨基酸残基同时结合；活性肽与淀粉酶相互结合的结合模式表现为快速结合但缓慢解离。这种同时结合的作用方式，使淀粉酶活性受到抑制，延长淀粉的水解时间。本发明还提供了一种高活性淀粉酶抑制活性肽的制备方法，自藜麦中分离制备得到，原料来源广泛，制备过程易于操作实现。本发明还提供了一种高活性淀粉酶抑制活性肽的应用，可将其作为淀粉酶活性抑制剂，用于保健品、食品或者药品中。
Description
技术领域
本发明涉及一种活性肽，尤其涉及一种高活性淀粉酶抑制活性肽及其制备方法和应用。
背景技术
碳水化合物是人体中主要的能量来源，血液中葡萄糖含量过高会导致一系列的代谢相关疾病发生。淀粉首先经过淀粉酶的水解作用成为小分子多糖进入到消化道中，其次在葡萄糖苷酶的作用下水解为单糖进入血液。代谢综合征如Ⅱ型糖尿病和肥胖症等可以通过抑制淀粉酶活性从而来控制或缓解症状。此外淀粉酶抑制剂在农业上也被用作杀虫剂，通过抑制昆虫淀粉酶活性使得昆虫体内淀粉无法消化吸收，从而杀灭昆虫幼虫。
藜麦(Chenopodium quinoa willd)是一种原产于南美洲安第斯山脉地区的农作物，属苋科藜属的一年生双子叶植物。根据放射性碳年代测定技术，藜麦的历史可追溯到8000年前，最早发现于玻利维亚和秘鲁交界的Titicaca湖附近。近年来随着藜麦在我国多个省份的引进，初步形成了适合不同区域的栽培方法，藜麦中蛋白质含量丰富，大约在9.1-15.7％，高于水稻和玉米等农作物，与小麦含量相当。藜麦中氨基酸组成比例与联合国粮农组织(FAO)推荐的理想蛋白质相似。由于其营养价值较高，受到了消费者的热爱，市场上出现了大量的藜麦产品，其功能性成分也逐渐成为研究的热点。国内外的学者研究发现藜麦蛋白提取物具有抗氧化、降血糖、免疫调节活性、降低高血压和益生元活性等一系列的生物活性。
目前对于藜麦的研究主要是以藜麦籽粒或藜麦中酚酸等为研究对象，没有单纯分析藜麦蛋白及蛋白水解成分多肽的生物活性，例如已有研究表明通过在单一碳水膳食中增加藜麦的摄入可以降低食物的GI值。但是其降低GI值的机理尚未进行透彻研究。因此基于藜麦蛋白具有多种生物活性的特点，开发一种结构明确且具有淀粉酶抑制活性的藜麦多肽具有较大的实际应用价值。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种高活性淀粉酶抑制活性肽，可以有效抑制淀粉酶的活性，延长淀粉的水解时间。
本发明的目的之二在于提供一种高活性淀粉酶抑制活性肽的制备方法。
本发明的目的之三在于提供一种高活性淀粉酶抑制活性肽的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种高活性淀粉酶抑制活性肽，所述活性肽的序列如SEQIDNO.1所示：Met-Met-Phe-Pro-His。
优选的，所述活性肽中组氨酸、色氨酸、脯氨酸和含硫氨基酸对淀粉酶抑制起重要作用。活性肽的C末端前一位为脯氨酸。
优选的，所述活性肽分子量为679.87Da。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
上述高活性淀粉酶抑制活性肽的制备方法，包括以下步骤：
(1)取藜麦清洗烘干后粉碎过筛得到藜麦粉；
(2)采用碱提酸沉法提取藜麦粉中的藜麦蛋白；
(3)将步骤(2)提取的藜麦蛋白用胃蛋白酶进行酶解，酶解结束后灭酶，冷却至室温后离心，取上清液冷冻干燥得到藜麦蛋白酶解产物；
(4)采用不同分子量的超滤膜对步骤(3)中的藜麦蛋白酶解产物进行分离，收集分离的各组分后分别测定对淀粉酶的抑制活性；
(5)取步骤(4)中对淀粉酶抑制活性最高的组分经液相色谱分离后测定各组分对淀粉酶的抑制活性，取对淀粉酶抑制活性最好的组分进行氨基酸序列分析，得到氨基酸序列为Met-Met-Phe-Pro-His的活性肽。
优选的，步骤(1)中过180目筛得到藜麦粉。
优选的，步骤(3)中胃蛋白酶的浓度为45000U/g，酶解时间为180min，酶解温度为37℃、pH 2.0，酶解结束后在85℃水浴20min灭酶。
优选的，步骤(3)中依次使用1kDa、3kDa、10kDa超滤膜进行过滤，根据分子量藜麦蛋白酶解产物被分离为<1kDa、1-3kDa、3-10kDa、>10kDa的各组分。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
上述高活性淀粉酶抑制活性肽的应用，所述活性肽在制备淀粉酶活性抑制剂中的应用。
优选的，所述活性肽在制备与淀粉酶相互作用位点残基为His305、Ala307、Ile235、His201、His299、Glu233、Ala198、Tyr62和Gln63的抑制剂中的应用。
所述活性肽能够与淀粉酶活性位点氨基酸结合表现出竞争性抑制，也能够与非活性位点氨基酸结合改变淀粉酶结构表现为不可逆抑制。与淀粉酶结合模式为快结合慢解离的模式。
优选的，所述活性肽在制备保健品、食品或者药品中的应用。
优选的，所述活性肽在食品、保健品或药品中的添加量为0.5-2mg/mL。
优选的，所述活性肽在制备调控血糖的保健品、食品或者药品中的应用。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：本发明提供一种高活性淀粉酶抑制活性肽，具有良好的淀粉酶抑制活性。本发明的活性肽通过合适的取向和淀粉酶上氨基酸残基相互结合，与淀粉酶上的结合位点包括活性位点以及活性位点附近的氨基酸残基同时结合；活性肽与淀粉酶相互结合的结合模式表现为快速结合但缓慢解离。这种同时结合的作用方式，使淀粉酶活性受到抑制，延长淀粉的水解时间。
本发明还提供了一种高活性淀粉酶抑制活性肽的制备方法，先自藜麦中提取藜麦蛋白，再将藜麦蛋白经水解、超滤、以及液相色谱分离纯化等过程后制备得到，原料来源广泛，制备过程易于操作实现。
本发明还提供了一种高活性淀粉酶抑制活性肽的应用，可将其作为淀粉酶活性抑制剂，用于保健品、食品或者药品中，通过抑制淀粉酶的活性发挥降血糖等作用。
附图说明
图1为不同超滤组分α-淀粉酶抑制活性图；
图2蛋白纯化系统分离纯化色谱图；
图3为蛋白纯化分离各组分的α-淀粉酶抑制活性图；
图4为α-淀粉酶抑制活性肽的二级质谱图；
图5为F5组分及肽段1至6的α-淀粉酶抑制活性图；
图6为藜麦分离蛋白、胃蛋白酶酶解成分、胰蛋白酶酶解成分、风味蛋白酶解成分以及中性蛋白酶解成分的α-淀粉酶抑制活性图；
图7为MMFPH与α-淀粉酶酶促反应动力学图；
图8为MMFPH与α-淀粉酶分子互作图；
图9为MMFPH与α-淀粉酶结合模式。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
本发明实施例以及实验例中所用淀粉酶均为α-淀粉酶，抑制活性按照如下过程测定得到：
采用3，5-二硝基水杨酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)显色法测定待测样品的α-淀粉酶抑制活性。α-淀粉酶溶于pH 7.0的PBS中，浓度为1U/mL，首先将250μL淀粉酶和250μL待测样品加入到500μL PBS缓冲液中，于37℃反应10min，再加入250μL 1％(w/v)可溶性淀粉于37℃精确控制反应5min。随后加入500μL DNS，100℃水浴10min，待冷却后加入5mL去离子水，于540nm下检测吸光度。样品对照组将淀粉酶替换为250μL PBS。空白组将待测样品替换为250μLPBS，空白对照组将淀粉酶和待测样品均替换为250μLPBS。
注：A1为样品吸光度，A2为样品对照组吸光度，A3为空白组吸光度，A4为空白对照组吸光度。
实施例1
一种高活性淀粉酶抑制活性肽，活性肽的序列如SEQIDNO.1所示：Met-Met-Phe-Pro-His，活性肽分子量为679.87Da。
上述高活性淀粉酶抑制活性肽的制备过程如下：
(1)取藜麦清洗烘干后利用超微粉碎机粉碎并过180目筛得到藜麦粉；
(2)藜麦粉用无水乙醇以质量体积比(M:V)1:5混合均匀，脱脂6h，脱脂结束后在通风橱挥发12h，得到脱脂藜麦粉。将脱脂藜麦粉用纯水复溶，藜麦粉与纯水的比例为1:20，用1M NaOH调节pH至9.5，50℃搅拌提取2h后，在4℃下，4500r/min离心30min，收集上清。将离心后的沉淀进行二次浸提，步骤与一次浸提相同，提取1h后离心，将两次上清液合并。调节上清液pH至4.8(藜麦蛋白的等电点)，随后在4℃下，4500r/min离心30min，收集沉淀，并用纯水复溶，再用1M HCl和1M NaOH调节pH至中性并透析过夜。将透析后样品冷冻干燥48h，冻干粉-20℃保存备用。得到藜麦蛋白；
(3)将步骤(2)提取的藜麦蛋白用胃蛋白酶进行酶解，胃蛋白酶浓度为45000U/g蛋白，酶解时间均为180min，酶解条件为：酶解温度为37℃、pH 2.0；酶解结束后在85℃水浴20min灭酶。待酶解液冷却至室温后，在4℃，4500r/min离心30min，取上清液冷冻干燥，得到藜麦蛋白酶解物，-20℃保存备用。
(4)依次使用1kDa、3kDa、10kDa超滤膜将步骤(3)的胃蛋白酶酶解产物进行分离，酶解产物根据分子量分成<1kDa、1-3kDa、3-10kDa、>10kDa的组分，各超滤组分冻干后测定α-淀粉酶抑制活性，收集分离的各组分后分别测定对α-淀粉酶的抑制活性，结果如图1所示，取抑制活性最高的组分即分子量<1kDa的酶解产物；
(5)取步骤(4)中分子量<1kDa的酶解产物经0.22μm滤膜过滤后，用AKTAPure蛋白纯化系统进一步分离纯化，采用1mL注射器通过上样环进行上样，凝胶色谱柱为SuperdexPeptide10/300GL，流动相为pH 7.2-7.4，0.05mol/L磷酸盐缓冲液(含0.15mol/LNaCl)，洗脱方式为等度洗脱，流速为0.5mL/min，检测波长为220nm，超滤组分样品浓度为10mg/mL，进样量为500μL，样品主要分为7个组分，对每个组分进行收集并冷冻干燥，最后测定各组分的α-淀粉酶抑制活性。
凝胶色谱分离色谱图如图2，在检测波长220nm下，根据出峰时间及峰形，共分离得到7个色谱峰。将这7个组分(F1-F7，按收集时间排序)分别收集，冷冻干燥后测定各组分的淀粉酶抑制活性如图3所示，样品浓度为0.5mg/mL时，F1-F7对淀粉酶抑制率分别为F1：17.86±1.90％，F2未检测到活性，F3：2.813±0.45％，F4：26.05±1.90％，F5：30.11±1.90％，F6：14.35±0.99％，F7：2.54±1.00％，其中F5组分的淀粉酶抑制活性最高，除F4外与其他组分均有显著性差异(p<0.05)，根据分离色谱图来看，F5组分的出峰时间晚于F4组分说明F5组分的分子量相对较小，并且F5组分的峰形更加完整且收集时间较短，在凝胶排阻色谱中成分更具有一致性。
F5组分氨基酸序列分析：将凝胶分离组分F5溶于超纯水，于适量样品中加入二硫苏糖醇(Dithiothreitol，DTT)溶液使其终浓度为10mmol/L，56℃水浴还原1h，加入碘乙酰胺(2-Iodoacetamide IAA)溶液使其终浓度为50mmol/L，避光反应40min。最后使用脱盐柱进行脱盐，于45℃真空离心浓缩仪上挥干溶剂。
毛细管液相色谱条件：预柱：(Acclaim PepMap RPLC C18，300μmⅹ5mm，5μm)，分析柱：(Acclaim PepMap RPLC C18，150μmⅹ150mm，1.9μm)；流动相A：0.1％甲酸，2％乙腈(Acetonitrile，CAN)；流动相B：0.1％甲酸，80％ACN；流速600nL/min；分析时间：66min；分离程序：0-2min B：4-8％，2-45min B：8-28％，45-55min B：28-40％，55-56min B：40-95％，56-66min B：95％。质谱条件：一级质谱的分辨率：70000；自动增益控制目标(AGCtarget)：3e6；最大IT：40ms；扫描范围：350-1800m/z；二级质谱的分辨率：17500；自动增益控制目标(AGCtarget)：1e5；最大IT：60ms；TopN：20；NCE/steppedNCE：27采用De Novo的方法对质谱结果进行分析，将质谱结果在PEAKS Studio 8.5软件进行分析，参数设置如下：蛋白修饰为氨基甲基化(C)(固定)、氧化(M)(可变)、乙酰化(蛋白N端)(可变)；酶切位点设置为非特异性；遗漏酶切位点限制为2；质谱误差设置为±20ppm。选择置信度高的肽段进行肽段鉴定。
高活性组分F5种共鉴定得到64条肽段，如表1所示为评分较高的肽段的序列信息，图4为序列MMFPH的二级质谱图。图5为表1中各肽段的α-淀粉酶抑制活性。
表1藜麦淀粉酶抑制活性肽段
由图6可以看出肽段1也即序列为MMFPH(Met-Met-Phe-Pro-His)的肽段α-淀粉酶的抑制活性最好，也即为本发明要求保护的活性肽。
实验例1
将实施例1步骤(2)提取的藜麦蛋白分别用胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶进行酶解，其中各酶的浓度均为45000U/g蛋白，酶解时间均为180min，酶解条件分别为：胃蛋白酶酶解温度为37℃、pH 2.0；胰蛋白酶酶解温度为37℃、pH 8.5；风味蛋白酶酶解温度为50℃、pH 7.5；中性蛋白酶酶解温度为50℃、pH 7.0。酶解结束后在85℃水浴20min灭酶。待酶解液冷却至室温后，在4℃，4500r/min离心30min，取上清液冷冻干燥，得到藜麦蛋白酶解物，-20℃保存备用。对各酶的酶解产物分别测定淀粉酶抑制活性，结果如图6所示，相同浓度下2mg/mL胃蛋白酶酶解产物的淀粉酶抑制活性为48.74±1.23％，显著高于藜麦蛋白和其他蛋白酶酶解组分(p<0.05)。
实验例2
淀粉酶酶促反应动力学实验：将α-淀粉酶溶于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，浓度为1U/mL。反应管中加入0.5mL磷酸盐缓冲液，0.25mLα-淀粉酶溶液和相同体积肽段MMFPH，肽段的浓度为2mg/mL，于37℃反应10min，加入不同质量浓度淀粉溶液(0mg/mL，0.5mg/mL，1.0mg/mL，1.5mg/mL，2.5mg/mL)于37℃精确控制反应5min，加入500μL DNS，100℃水浴10min，停止反应，冷却后加入5mL去离子水，于540nm下检测吸光度。利用Lineweaver-Burk曲线的双倒数计算米氏方程常数(Km)，如图7所示，最大酶促反应速率Vmax和多肽对α-淀粉酶抑制模型，各参数的计算方式如下：
其中V0为酶促反应初速度，即酶促反应过程中吸光值的变化率：OD/min，Vmax为达到反应的最大速度，Km为米氏常数，S为底物浓度，即淀粉的质量浓度：mg/mL。
表2肽段MMFPH对α-淀粉酶促反应动力学参数
Km和Vmax数值如表2所示，对比无抑制剂和加入肽段MMFPH的结果，发现肽段MMFPH浓度为1mg/mL时，Vmax不变，Km变大，推测在低浓度时肽段MMFPH与α-淀粉酶发生竞争性抑制。当添加肽段浓度为2mg/mL时，与不加抑制剂相比淀粉酶酶促反应的Vmax降低，Km值变大，此时肽段MMFPH对α-淀粉酶的抑制作用表现为不可逆抑制。根据文献记载：从海藻中提取得到的四肽和三肽在浓度为3-4mM时，结果显示肽段与淀粉酶之间通过酶的变构调节降低了淀粉酶的活性，肽段与淀粉酶活性部位附近的残基结合，从而阻碍了酶-底物复合物的形成(Admassu H,GasmallaMAA,Yang R J,et al.Identification ofBioactive Peptideswith alpha-Amylase InhibitoryPotential from Enzymatic Protein Hydrolysates ofRed Seaweed(Porphyra spp)[J].Journal ofAgricultural and Food Chemistry,2018,66(19):4872-4882.)。综上所述，当肽段MMFPH的浓度较低时，肽段MMFPH能与α-淀粉酶的活性部位结合，此时抑制形式表现为竞争性抑制作用；当肽段MMFPH的浓度升高时，其可以和α-淀粉酶活性部位附近的残基结合，此时抑制形式表现为非竞争性抑制。
实验例3
淀粉酶与肽段分子互作实验测试：利用Reichert 2SPR仪器进行表面等离子体共振实验，选择蛋白质通用的Dextrn羟甲基葡聚糖涂层芯片，流动相为1×PBST(136mM NaCl，268mM KCl，6mM NaH2PO4，1.76mM KH2PO4，0.5mL吐温20)，并使用流动相溶解α-淀粉酶。第一步先用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐(NHS)激活芯片表面，采用不同pH(4.0，4.5，5.0，5.5)的乙酸钠溶液稀释α-淀粉酶进行预实验，以探究α-淀粉酶固定的最佳条件，最终确定α-淀粉酶固定的最佳pH 5.0经多次上样后响应值达到2000μRIU。随后固定足够量的α-淀粉酶后，使用乙醇胺将α-淀粉酶封闭在芯片表面。
动力学实验中将肽段MMFPH用1×PBST溶解至不同浓度0.75mmol/L、1.51mmol/L、3.03mmol/L、6.05mmol/L、12.0mmol/L。用缓冲液将基线冲至水平后，在室温下，用25μL/min流速持续结合2.5min，然后解离5min，每个样品结合-解离结束后测试空白样品，待所有实验结束后使用SDS-Gly清洗芯片表面。使用TraceDrawer软件对肽段MMFPH在不同浓度下产生的结合解离曲线进行全局拟合，并计算结合(Ka)和解离(Kd)速率常数，结合亲和力通过KD＝Kd/Ka公式进行计算。
实验结果如图8所示，不同浓度的肽段MMFPH对α-淀粉酶结合的SPR测量值，肽段MMFPH与α-淀粉酶结合速率常数为1.08e4 M-1S-1，解离速率常数为2.50e1 M-1S-1，肽段MMFPH与α-淀粉酶的结合过程表现为快结合慢解离，肽段MMFPH与α-淀粉酶在mmol范围内(KD＝2.31e-3M)表现出很强的相似的结合亲和力，因此肽段MMFPH更容易在溶液中与淀粉酶发生结合作用。
实验例4
基于分子对接技术研究高活性淀粉酶抑制活性肽的作用机理：α-淀粉酶的晶体结构(PDB ID:1PIF)，多肽的结构通过PEP-FOLD3进行在线结构模拟，根据网站内部打分值选取能量最低的结构进行对接，对接前使用AutoDock Tools将淀粉酶上的水分子删掉并添加上电荷和氢原子，在X，Y，Z三个尺寸上设置的对接盒子大小为
间距为/>
酶蛋白位于对接盒子中心，对接模拟使用AutoDockVina进行计算，并根据打分结果判断对接效果最佳的结构，随后利用Pymol软件绘制AutoDockVina的结果。
本实验例通过非分子对接研究α-淀粉酶抑制活性肽MMFPH对α-淀粉酶相互作用的影响，从分子水平阐明该α-淀粉酶抑制活性肽的作用机理，结果如图9A所示，肽段MMFPH与α-淀粉酶的对接结果显示它们之间对接的结合能为-7.2kcal/mol，表明肽段与淀粉酶之间的结合是自发的。主要结合在淀粉酶的结构域A上Ca2+附近。如图9A所示，肽段被α-淀粉酶上的残基His305、Ala307、Ile235、His201、His299、Glu233、Ala198、Tyr62和Gln63包围，肽段与α-淀粉酶残基之间主要通过范德华力相互作用。α-淀粉酶上的Asp197，Glu233和Asp300是α-淀粉酶上具有重要催化作用的氨基酸残基，其中Asp在淀粉酶水解过程中作为亲和催化剂，Glu233残基作为酸碱催化剂，而Asp300起到优化底物取向的作用。其中肽段的His5残基与淀粉酶上活性位点Glu233残基之间具有相互作用如图9B所示，导致肽段MMFPH与α-淀粉酶结合时表现为竞争性抑制作用。根据文献记载：绿原酸与猪胰腺淀粉酶之间的抑制作用时发现绿原酸通过与淀粉酶上的Glu233，Asp300和Asp197形成氢键产生淀粉酶抑制效果，并且淀粉酶上Glu233与绿原酸上的O原子形成较强的氢键，其分子间的距离为
表示绿原酸对淀粉酶的主要的抑制方式是竞争性抑制作用(ZhengY,Yang W,SunW,etal.Inhibition ofporcine pancreaticα-amylase activityby chlorogenic acid[J].Journal ofFunctional Foods,2020,64:103587)，该结果与肽段MMFPH和α-淀粉酶活性位点Glu233结合相同。
根据文献记载：在菊苣叶水体物中鉴定出多种与淀粉酶具有抑制作用的化合物，部分化合物与淀粉酶的活性位点关键氨基酸具有结合作用，然而这些化合物中环十六烯并没有与关键氨基酸有任何结合却表现出了显著的抑制作用，通过与阿卡波糖的对比，研究人员得出结论，即环十六烯与淀粉酶之间的抑制作用并不是竞争性抑制(Anigboro AA,Avwioroko O J,Ohwokevwo O A,et al.Phytochemical profile,antioxidant,alpha-amylase inhibition,binding interaction and docking studies of Justicia carneabioactive compounds with alpha-amylase[J].Biophysical Chemistry,2021,269:106529)。因此推测在藜麦鉴定得到的多肽中肽段MMFPH上其他残基与淀粉酶之间的结合导致肽段MMFPH对α-淀粉酶抑制作用类型为不可逆型抑制作用。分子对接的结果对荧光光谱和酶促反应动力学的实验结果进行了验证，表明肽段MMFPH不仅与α-淀粉酶上活性位点残基产生相互作用，同时也与α-淀粉酶上其他位点残基相结合，其中包括具有荧光特性的酪氨酸，因此导致了α-淀粉酶荧光光谱的变化。
藜麦作为一种营养全面的谷物正逐渐走进人们的生活中，本发明通过蛋白酶解纯化的方法制备得到α-淀粉酶抑制活性肽MMFPH，发现其对α-淀粉酶的作用机理，通过和α-淀粉酶活性位点及非活性位点结合表现出两种不同的抑制方式。分子互作结果显示肽段MMFPH与淀粉酶结合模式为快结合慢解离的模式。分子对接结果显示肽段与淀粉酶上的残基His305、Ala307、Ile235、His201、His299、Glu233、Ala198、Tyr62和Gln63相互结合。为藜麦高活性淀粉酶抑制活性肽在相关食品、保健品和药品中的使用提供理论支持。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种高活性淀粉酶抑制活性肽，其特征在于，所述活性肽的序列如SEQ ID NO.1所示：Met-Met-Phe-Pro-His。
2.根据权利要求1所述高活性淀粉酶抑制活性肽，其特征在于，所述活性肽分子量为679.87Da。
3.如权利要求1至2任一项所述高活性淀粉酶抑制活性肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取藜麦清洗烘干后粉碎过筛得到藜麦粉；
(2)采用碱提酸沉法提取藜麦粉中的藜麦蛋白；
(3)将步骤(2)提取的藜麦蛋白用胃蛋白酶进行酶解，酶解结束后灭酶，冷却至室温后离心，取上清液冷冻干燥得到藜麦蛋白酶解产物；
(4)采用不同分子量的超滤膜对步骤(3)中的藜麦蛋白酶解产物进行分离，收集分离的各组分后分别测定对淀粉酶的抑制活性；
(5)取步骤(4)中对淀粉酶抑制活性最高的组分经液相色谱分离后测定各组分对淀粉酶的抑制活性，取对淀粉酶抑制活性最好的组分进行氨基酸序列分析，得到氨基酸序列为Met-Met-Phe-Pro-His的活性肽。
4.根据权利要求3所述高活性淀粉酶抑制活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中过180目筛得到藜麦粉。
5.根据权利要求3所述高活性淀粉酶抑制活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中胃蛋白酶的浓度为45000U/g，酶解时间为180min，酶解温度为37℃、pH2.0，酶解结束后在85℃水浴20min灭酶。
6.根据权利要求3所述高活性淀粉酶抑制活性肽的制备方法，其特征在于，步骤(4)中依次使用1kDa、3kDa、10kDa超滤膜进行过滤，根据分子量藜麦蛋白酶解产物被分离为<1kDa、1-3kDa、3-10kDa、>10kDa的各组分。
7.如权利要求1至2任一项所述高活性淀粉酶抑制活性肽的应用，其特征在于，所述活性肽在制备淀粉酶活性抑制剂中的应用。
8.根据权利要求7所述高活性淀粉酶抑制活性肽的应用，其特征在于，所述活性肽在制备与淀粉酶相互作用位点残基为His305、Ala307、Ile235、His201、His299、Glu233、Ala198、Tyr62和Gln63的抑制剂中的应用。
9.根据权利要求7所述高活性淀粉酶抑制活性肽的应用，其特征在于，所述活性肽在制备保健品、食品或者药品中的应用。
10.根据权利要求9所述高活性淀粉酶抑制活性肽的应用，其特征在于，所述活性肽在制备调控血糖的保健品、食品或者药品中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210801319.9A CN116178490A (zh) | 2022-07-08 | 2022-07-08 | 一种高活性淀粉酶抑制活性肽及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210801319.9A CN116178490A (zh) | 2022-07-08 | 2022-07-08 | 一种高活性淀粉酶抑制活性肽及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116178490A true CN116178490A (zh) | 2023-05-30 |
Family
ID=86431266
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210801319.9A Pending CN116178490A (zh) | 2022-07-08 | 2022-07-08 | 一种高活性淀粉酶抑制活性肽及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116178490A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117720621A (zh) * | 2024-02-05 | 2024-03-19 | 北京晶泰科技有限公司 | α-淀粉酶抑制肽及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1821412A (zh) * | 2001-08-27 | 2006-08-23 | 辛根塔参与股份公司 | 自加工的植物及植物部分 |
| CN109022527A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种具有降血压作用的藜麦多肽及其制备方法 |
| WO2021070696A1 (ja) * | 2019-10-08 | 2021-04-15 | ジーンフロンティア株式会社 | Ｃｔｌａ－４阻害活性を有する環状ペプチド、及びその用途 |
-
2022
- 2022-07-08 CN CN202210801319.9A patent/CN116178490A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1821412A (zh) * | 2001-08-27 | 2006-08-23 | 辛根塔参与股份公司 | 自加工的植物及植物部分 |
| CN109022527A (zh) * | 2018-08-28 | 2018-12-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | 一种具有降血压作用的藜麦多肽及其制备方法 |
| WO2021070696A1 (ja) * | 2019-10-08 | 2021-04-15 | ジーンフロンティア株式会社 | Ｃｔｌａ－４阻害活性を有する環状ペプチド、及びその用途 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 叶凯等: "响应面法酶解藜麦蛋白制备仪一淀粉酶抑制肽的工艺研究", 《中国调味品》, vol. 44, no. 12, pages 7 - 8 * |
| 周浩纯等: "藜麦α-淀粉酶抑制活性肽的分离及其机理探究", 《万方数据》, pages 1 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117720621A (zh) * | 2024-02-05 | 2024-03-19 | 北京晶泰科技有限公司 | α-淀粉酶抑制肽及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Uraipong et al. | Rice bran protein hydrolysates exhibit strong in vitro α‐amylase, β‐glucosidase and ACE‐inhibition activities | |
| CN104450839B (zh) | 具有ace抑制活性的米糠蛋白肽的制备方法 | |
| CN107164445B (zh) | 具有dpp-ⅳ抑制功能的鱼皮蛋白肽及其制备方法与应用 | |
| US20120302731A1 (en) | Protein hydrolysate, polypeptide solution and polypeptide, preparation method and use thereof | |
| CN107141336A (zh) | 具有dpp‑iv抑制活性的牦牛骨蛋白肽及制备方法 | |
| EP0567088B1 (en) | Processes for the preparation of amylase inhibitor | |
| CN110964087B (zh) | 一种河鲀活性肽及其制备方法 | |
| CN116178490A (zh) | 一种高活性淀粉酶抑制活性肽及其制备方法和应用 | |
| CN108314705B (zh) | 具有dpp-iv抑制功能的羊乳清蛋白肽、其制备方法及其应用 | |
| CN113151386B (zh) | 具有dpp-iv抑制功能的牡蛎肽及其制备方法和应用 | |
| CN106905417B (zh) | 一种二肽基肽酶-4抑制肽及其制备方法与其应用 | |
| CN114686551A (zh) | 一种豌豆蛋白源dpp-iv抑制肽及其筛选方法 | |
| CN107828842B (zh) | 一种具有抗氧化和dpp-iv抑制功能的核桃蛋白肽 | |
| CN117003845B (zh) | 小米醇溶蛋白肽及其在治疗高脂血症中的用途 | |
| CN113151388A (zh) | 一种具有抗氧化和dpp-iv抑制功能的海参肽及其制备方法 | |
| CN114891065B (zh) | 一种具有α-淀粉酶抑制活性的降血糖海参肽及其制备方法和应用 | |
| CN109369781B (zh) | 一种麒麟菜抗氧化四肽及其应用 | |
| CN113912673B (zh) | 一种芝麻来源的低苦味ace抑制肽及其制备方法和应用 | |
| CN107082796B (zh) | 一种提纯蛋白酶解物中小分子多肽的方法 | |
| CN115651064A (zh) | 一种鹰嘴豆蛋白源dpp-iv抑制肽及其应用 | |
| CN111825754B (zh) | 一种从芝麻蛋白中获得的具有降血压与降血糖活性的多肽 | |
| CN106755227B (zh) | 紫菜酶解制备活性肽金属螯合物的方法 | |
| CN113072621B (zh) | 一种牦牛骨降血压肽及其制备方法与应用 | |
| CN111499691B (zh) | Ace抑制肽p1、其应用及其制备方法 | |
| CN113144169A (zh) | 一种黄嘌呤氧化酶抑制肽及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |