CN117720621A

CN117720621A - α-淀粉酶抑制肽及其应用

Info

Publication number: CN117720621A
Application number: CN202410162962.0A
Authority: CN
Inventors: 张根卫; 黄小鲁; 赖力鹏; 刘同仁; 陈东; 王政慧; 陈克鹏; 王泉
Original assignee: Beijing Jingtai Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Jingtai Technology Co ltd
Priority date: 2024-02-05
Filing date: 2024-02-05
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2044-02-05
Also published as: CN117720621B

Abstract

本发明公开了一种α‑淀粉酶抑制肽。该肽包括8个相邻氨基酸X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈的氨基酸序列，所述肽的每个氨基酸各自独立地选自D型氨基酸或L型氨基酸，其中，X₂、X₄和X₆中的至少一位为W。本发明提供了的该肽具有α‑粉酶抑制活性，同时具备减肥和降血糖的效果，能够用于制备α‑淀粉酶抑制剂、减肥药物、降血糖药物或用于预防或治疗肥胖相关疾病的食品、保健品或药物。

Description

α-淀粉酶抑制肽及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种α-淀粉酶抑制肽及其应用。

背景技术

肥胖既是独立的疾病，又是心脑血管疾病、多种癌症、二型糖尿病和高血压等多种慢性病的重要诱因。随着社会经济的快速发展，居民生活水平的提高，加上膳食结构的显著改变和诸多不良方式的出现，肥胖已经严重危害居民的健康，成为了公共卫生关注的焦点问题。

肽类是生物药物中的一大类别，药用肽类具有明显优点。首先，肽类均直接或间接来自自然界，符合从天然产物筛选新药的潮流。其次，肽类的特异性远强于小分子，抗原性远低于蛋白质，摒弃了小分子和蛋白质药物的缺点。第三，肽分子，尤其是寡肽分子，往往能规避胃肠道消化，克服了蛋白质分子被消化酶破坏从而不能口服的弊端。最后，肽分子可能既不在肝脏代谢又不在脂肪组织累积，避免了肝脏毒性和累积毒性。

因此，需要开发具有降糖作用的肽类药物。

发明内容

基于α-淀粉酶的晶体结构，本发明提供了一系列新的α-淀粉酶抑制肽，该多肽具有α-粉酶抑制活性，同时具备减肥和降血糖的效果，安全无毒副作用，并且具有可口服前景。

本发明的一方面提供了一种肽，包括8个相邻氨基酸X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈的氨基酸序列，其中，X₂、X₄和X₆中的至少一位为W。

在一些实施方式中，所述肽的每个氨基酸各自独立地选自D型氨基酸或L型氨基酸，且满足以下条件（1）至（3）中的任一组：

（1）X₂、X₄和X₆均为W，且X₁选自D、R、L、N、S、E或V，X₃选自A、P、V、G、Y、K或R，X₅选自E、F、G、R、H或P，X₇选自D、S、R、V、W、N或Y，X₈为A；

（2）X₁选自D，X₂选自W或F，X₃选自A，X₄选自W或Y，X₅选自E或D，X₆选自W，X₇选自D，X₈选自A，且X₂和X₄中仅有一个为W；

（3）X₁选自D、E或A，X₂为F，X₃选自A、G或L，X₄选自W或Y，X₅选自D或A，X₆选自F或W，X₇选自D或E，X₈选自P、W或A，且X₄和X₆中仅有一个为W。

在一些实施方式中，所述肽包括8个相邻氨基酸X₁WX₃WX₅WX₇A的氨基酸序列，其中，X₁选自D、R、L、N、S、E或V，X₃选自A、P、V、G、Y、K或R，X₅选自E、F、G、R、H或P，X₇选自D、S、R、V、W、N或Y。

在一些实施方式中，所述肽中，X₂、X₄和X₆均为W，且X₁选自D、R、L、N、S、E或V，X₃选自A、P、V、G、Y、K或R，X₅选自E、F、G、R、H或P，X₇选自D、S、R、V、W、N或Y，X₈为A。

在一些实施方式中，所述肽中，X₂、X₄和X₆均为W，且X₁为D、X₃为A、X₅为E、X₇为D、X₈为A，或者X₁为R、X₃为P、X₅为F、X₇为S、X₈为A，或者X₁为L、X₃为V、X₅为G、X₇为R、X₈为A，或者X₁为N、X₃为G、X₅为F、X₇为R、X₈为A，或者X₁为S、X₃为Y、X₅为R、X₇为V、X₈为A，或者X₁为E、X₃为K、X₅为H、X₇为W、X₈为A，或者X₁为L、X₃为G、X₅为R、X₇为N、X₈为A，或者X₁为V、X₃为R、X₅为P、X₇为Y、X₈为A。

在一些实施方式中，所述肽包含以下任一氨基酸序列：

DWAWEWDA （SEQ ID NO: 1）、RWPWFWSA（SEQ ID NO: 2）、LWVWGWRA（SEQ ID NO:3）、NWGWFWRA（SEQ ID NO: 4）、SWYWRWVA（SEQ ID NO: 5）、EWKWHWWA（SEQ ID NO: 6）、LWGWRWNA（SEQ ID NO: 7）、VWRWPWYA（SEQ ID NO: 8）。

在一些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22-30中的任意一个或多个所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述肽包括8个相邻氨基酸X₁FX₃X₄X₅X₆X₇X₈的氨基酸序列，X₁选自D、E或A，X₃选自A、G或L，X₄选自W或Y，X₅选自D或A，X₆选自F或W，X₇选自D或E，X₈选自P、W或A，且X₄和X₆中仅有一个为W。

在一些实施方式中，所述肽中，X₁选自D、E或A，X₂为F，X₃选自A、G或L，X₄选自W或Y，X₅选自D或A，X₆选自F或W，X₇选自D或E，X₈选自P、W或A，且X₄和X₆中仅有一个为W。

在一些实施方式中，所述肽中，X₁为D，X₂为F，X₃为A，X₄为W，X₅为D，X₆为F，X₇为D，X₈为P，或X₁选自E或A，X₂为F，X₃选自G或L，X₄选自Y，X₅选自D或A，X₆为W，X₇选自D或E，X₈选自W或A。

在一些实施方式中，所述肽包括以下1）或2）中的氨基酸序列：

1）DFAWDFDP（SEQ ID NO: 9），或

2）X₁FX₃YX₅WX₇X₈，其中，X₁选自E或A，X₃选自G或L，X₅选自D或A，X₇选自D或E，X₈选自W或A。

在一些实施方式中，所述肽中，X₁为D，X₂为F，X₃为A，X₄为W，X₅为D，X₆为F，X₇为D，X₈为P。

在一些实施方式中，所述肽中，X₁选自E或A，X₂为F，X₃选自G或L，X₄选自Y，X₅选自D或A，X₆为W，X₇选自D或E，X₈选自W或A。

在一些实施方式中，所述肽包括8个相邻氨基酸X₁FX₃YX₅WX₇X₈的氨基酸序列，其中，X₁选自E或A，X₃选自G或L，X₅选自D或A，X₇选自D或E，X₈选自W或A。

在一些实施方式中，所述肽包含以下任一氨基酸序列：

DFAWDFDP（SEQ ID NO: 9）、EFGYAWEW（SEQ ID NO: 10）、AFLYDWDA（SEQ ID NO:11）。

在一些实施方式中，所述肽中，X₁为E，X₂为F，X₃为G，X₄为Y，X₅为A，X₆为W，X₇为E，X₈为W。

在一些实施方式中，所述肽中，X₁为A，X₂为F，X₃为L，X₄为Y，X₅为D，X₆为W，X₇为D，X₈为A。

在一些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQID NO：32中的任意一个或多个所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述肽中，X₁选自D，X₂选自W或F，X₃选自A，X₄选自W或Y，X₅选自E或D，X₆选自W，X₇选自D，X₈选自A，且X₂和X₄中仅有一个为W。

在一些实施方式中，所述肽包括8个相邻氨基酸DX₂AX₄X₅WDA的氨基酸序列，其中，X₂选自W或F，X₄选自W或Y，X₅选自E或D，且X₂和X₄中仅有一个为W。

在一些实施方式中，所述肽包含以下任一氨基酸序列：

DWAYEWDA（SEQ ID NO: 12）、DFAWDWDA（SEQ ID NO: 13）。

在一些实施方式中，所述肽中，X₂和X₆为W，X₁为D，X₃为A，X₄为Y，X₅为E， X₇为D，X₈为A。

在一些实施方式中，所述肽中，X₄和X₆为W，X₁为D，X₂为F，X₃为A，X₅为D，X₇为D，X₈为A。

在一些实施方式中，所述肽包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQID NO：20中的任意一个或多个所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述肽的每个氨基酸各自独立的选自D型氨基酸或L型氨基酸。

在一些实施方式中，所述肽中，X₄为D型氨基酸或L型氨基酸。

在一些实施方式中，所述肽中，X₄为D型氨基酸或L型氨基酸，X₁、X₂、X₃、X₅、X₆、X₇和X₈为L型氨基酸。

在一些实施方式中，所述肽中，X₄为D型氨基酸，X₁、X₂、X₃、X₅、X₆、X₇和X₈为L型氨基酸。

在另一些实施方式中，所述肽中，X₁至X₈均为L型氨基酸。

在一些实施方式中，所述肽为由8个氨基酸组成的多肽。

在一些实施方式中，所述肽为线性肽或环肽。

在一些实施方式中，所述肽在0.5mg/mL浓度下的体外淀粉酶抑制率为10%以上。

在一些实施方式中，所述肽具有如下SEQ ID NO: 14-32中的任意一个或多个所示的氨基酸序列。

本发明的另一方面提供了一种核酸分子，其包含编码所述肽的核苷酸序列。

本发明的另一方面提供了一种表达载体，其包含本发明所述的核酸分子。

本发明的另一方面提供了一种宿主细胞，其包含本发明所述的核酸分子或本发明所述的表达载体。

在本发明的一些实施方式中，所述宿主细胞为细菌。

本发明的又一方面提供了一种药物组合物，其包含本发明所述的肽、核酸分子、表达载体或宿主细胞；以及，药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，药物组合物可以配制用于通过特定给药途径给药。例如，药物组合物可以配制用于经口、静脉内、肿瘤内、腹膜内、皮内、皮下、鼻内或其他给药途径。

在一些实施方式中，所述药物组合物的剂型包括(但并不限于)：注射剂、气雾剂、滴丸剂、外用擦剂、控释型或缓释型或纳米制剂。

本发明的有一方面提供了所述的肽、药物组合物、核酸分子、表达载体或宿主细胞在制备α-淀粉酶抑制剂、减肥药物、降血糖药物或用于预防或治疗肥胖相关疾病的食品、保健品或药物中的应用。

在一些实施方式中，所述肥胖相关疾病包括肥胖症、心脑血管疾病、癌症、二型糖尿病、高血糖和高血压。

附图说明

图1显示了TS-1的体外酶活抑制实验结果。

图2显示了动物实验的实验流程。

图3显示了动物实验中小鼠的餐后血糖变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

图4显示了动物实验中小鼠的体重变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/KgTS-1。

图5显示了动物实验中小鼠的血液中红细胞（RBC）和血小板计数变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

图6显示了动物实验中小鼠的血液中白细胞计数体重变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

图7显示了动物实验中小鼠肝脏血的丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）含量变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

图8显示了动物实验中小鼠肾脏血的尿素氮(BUN)、肌酐-S(CRE-S)、白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)含量变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

图9显示了动物实验中小鼠的血液中氯离子（Cl）和钠离子（Na）含量变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

图10显示了动物实验中小鼠的血液中氯离子（Cl）和钠离子（Na）含量变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

图11显示了动物实验中小鼠肝脏相对重量的变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

图12显示了动物实验中小鼠其它各脏器相对重量的变化，其中，白芸豆提取物为阳性对照，Vehicle 为阴性对照，TSC-high为150mg/Kg TS-1，TSC-med为75mg/Kg TS-1，TSC-low为37.5mg/Kg TS-1。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。

术语

除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本发明所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。

除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。

本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10%的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5%的范围。

本文所使用的数值范围应被理解为已经列举了对该范围内的所有数字。例如，1至20的范围应当理解为包括来自下组的任何数字、数字组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。

本文中，所述肽的氨基酸序列中，A代表丙氨酸（Alanine，Ala），R代表精氨酸（Arginine，Arg），N代表天冬氨酸（Asparagine，Asn），D代表天冬酰胺（Aspartic acid，Asp），C代表半胱氨酸（Cysteine，Cys），Q代表谷氨酰胺（Glutamine，Gln），E代表谷氨酸（Glutamic acid，Glu），G代表甘氨酸（Glycine，Gly），H代表组氨酸（Histidine，His），I代表异亮氨酸（Isoleucine，Ile），L代表亮氨酸（Leucine，Leu），K代表赖氨酸（Lysine，Lys），F代表苯丙氨酸（Phenylalanine，Phe），P代表脯氨酸（Proline，Pro），S代表丝氨酸（Serine，Ser），T代表苏氨酸（Threonine，Thr），W代表色氨酸（Tryptophan，Trp），Y代表酪氨酸（Tyrosine，Tyr），V代表缬氨酸（Valine，Val）。除非另有说明，否则本文中提及的氨基酸（残基）可以为D型或L型。除非另有说明，否则本文中提及的氨基酸序列均从左至右为N端至C端的顺序。

本发明的肽可以包括通过对所述肽进行一个或多个保守氨基酸的替换来获得。在一些实施方式中，保守氨基酸的替换可以表示一个氨基酸残基替换成生物学上性质相似的残基。特别优选的取代在性质上通常是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些取代。例如，氨基酸通常分为四个家族：（1）酸性-天冬氨酸（N）和谷氨酸（E）；（2）碱性-赖氨酸（K）、精氨酸（R）、组氨酸（H）；（3）非极性-丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、脯氨酸（P）、苯丙氨酸（F）、蛋氨酸（M）、色氨酸（W）；（4）不带电荷的极性-甘氨酸（G）、天冬酰胺（D）、谷氨酰胺（Q）、半胱氨酸（C）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）、酪氨酸（Y）。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变化的实例包括用一个疏水残基诸如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水残基，或用一个极性残基取代另一个极性残基，诸如精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸或谷氨酰胺取代天冬酰胺等；或用结构相关的氨基酸对氨基酸的类似保守替代，所述替代对生物活性不会产生重大影响。因此，具有与参考分子基本相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质活性的少量氨基酸取代的蛋白质在参考多肽的定义范围内。

本文所用的术语“药学上可接受的载体”指药物组合物中除了活性成分之外的对受试者无毒性的成分。药学上可接受的载体包括，但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在一些实施方式中，所述药学上可接受的载剂包括：丙烯酸或甲基丙烯酸、马来酸酐和链烯基衍生物聚合物的聚合物；免疫刺激序列（ISS），诸如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列（CpG ODN）；油包水（W/O）佐剂、水包油（O/W）佐剂或油包水包油（W/O/W）佐剂，诸如弗氏佐剂、SPT乳液、MF59、ISA 206、ISA72、佐剂-65、SAF等；含有季铵盐例如DDA的阳离子脂质；细胞因子；氢氧化铝或磷酸铝；皂苷（例如Quil A、QS-21、GPI-0100）；或，其任意组合或混合物。

材料与试剂

2-Cl-CTC-高分子树脂，购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司；

哌啶，购自国药集团化学试剂有限公司；

Fmoc-L-丙氨酸（ Fmoc-Ala-OH ），Fmoc-Pbf-L-精氨酸（Fmoc-Arg(pbf)-OH），Fmoc-N-三苯甲基-L-天冬酰胺（Fmoc-Asp(OtBu)-OH），Fmoc-S-三苯甲基-L-半胱氨酸（Fmoc-Cys(Trt)-OH），Fmoc-N-三苯甲基-L-谷氨酰胺（Fmoc-Gln(Trt)-OH），Fmoc-O-叔丁基-L-谷氨酸（Fmoc-Glu(OtBu)-OH），Fmoc-甘氨酸（Fmoc-Gly-OH），N-Fmoc-N'-三苯甲基-L-组氨酸（Fmoc-His(Trt)-OH），Fmoc-L-异亮氨酸（Fmoc-Ile-OH），Fmoc-L-亮氨酸（Fmoc-Leu-OH），N-alpha-芴甲氧羰基-N-epsilon-叔丁氧羰基-L-赖氨酸（Fmoc-Lys(Boc)-OH），Fmoc-L-蛋氨酸（Fmoc-Met-OH），Fmoc-L-苯丙氨酸（Fmoc-Phe-OH），Fmoc-L-脯氨酸（Fmoc-Pro-OH），FMOC-O-叔丁基-L-丝氨酸（Fmoc-Ser(tBu)-OH）， Fmoc-O-叔丁基-L-苏氨酸（Fmoc-Thr(tBu)-OH），N-alpha-芴甲氧羰基-N-in-叔丁氧羰基-L-色氨酸（Fmoc-Trp(Boc)-OH），Fmoc-O-叔丁基-L-酪氨酸（Fmoc-Tyr(tBu)-OH），Fmoc-L-缬氨酸（Fmoc-Val-OH）均购自吉尔生化(上海)有限公司；

三氟乙酸(TFA)，HATU，N,N-二异丙基乙胺(DIEA), 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)，1,2-乙二硫醇(EDT),三异丙基硅烷(TIPS)，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）,二氯甲烷（DCM ）等化学试剂均购自安耐吉化学试剂公司；

PBS 使用1 X pH=7.2~7.4 ，购自广州洁特生物过滤股份有限公司；

胃蛋白酶 1:3000，购自索莱宝生物科技有限公司；

胰蛋白酶 1:250，采购自索莱宝生物科技有限公司；

盐酸12N，购自国药集团化学试剂有限公司；

猪胰腺α-淀粉酶使用 11u/mg，购自上海源叶生物科技有限公司；

α-淀粉酶抑制剂（芸豆）75u/mg，购自上海源叶生物科技有限公司（A17HS188175）。

实施例1 合成方法

按照如下的方法分别合成如表2中所示序列的线肽化合物和环肽化合物，并将所合成的实验肽按照如下的方法进行纯度检测。

纯度检测方法：检测仪器：安捷伦超高压液相质谱连用仪6545XT；色谱柱：ZORBAXRRHD SB-C18 2.1×50mm, 1.8um。检测条件：流动相A：0.5%的FA的水溶液，流动相B：0.5%的FA的乙腈溶液，进样量：5μL，流速：0.4mL/mim。按下表1的程序进行梯度洗脱。

表1

（1）线肽化合物的化学合成

以TS-1为例，具体线肽化合物按照如下的合成方法进行化学合成。

以TS-1为例：

选用2-Cl-CTC-高分子树脂，按照氨基酸序列Asp-Trp-Ala-Trp-Glu-Trp-Asp-Ala（DWAWEWDA）的特征，先将C端的Fmoc-Ala-OH的羧基以共价键的形式与树脂相连，然后使Fmoc-Ala-OH的氨基和Fmoc-Asp(OtBu)-OH的羧基通过缩水反应连接，除去未反应原料后，再参考前述步骤，依次添加Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH，发生缩水反应，使得树脂上的多肽片段按照多肽TS1的C端到N端的顺序，依次延伸，得到连接在树脂上的目标多肽，最后使用裂解液（TFA:EDT:TIPS:H₂O=95:2:1:2）切除树脂即得到目标多肽。

对切除后获得的产物，采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为PhenomenexC18，尺寸4.6×150mm，流动相A：含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的水；流动相B：含有0.01％TFA(v/v)的乙腈溶液；50min内B相由5.0％上升到50.0％，流速3.0 mL/min，检测波长214nm。收集液相色谱纯化产物，并经液氮速冻、冷冻干燥得到TS-1。

经MS鉴定：冷冻干燥所得TS-1纯度达96.3%，分子量：1077.42，与理论分子量（1077.42）相符，证明制备获得的TS-1与理论设计相符。

（2）环肽化合物的化学合成

以TS-9为例，具体环肽化合物按照如下的合成方法进行化学合成。

选用2-Cl-CTC-高分子树脂，按照氨基酸序列Asp-Trp-Ala-Trp-Glu-Trp-Asp-Ala（DWAWEWDA）的特征，先将C端的Ala的羧基以共价键的形式与树脂相连，然后使Ala的氨基和Asp的羧基通过缩水反应连接，除去未反应原料后，再参考前述步骤，依次添加Trp、Glu、Trp、Ala、Trp、Asp，发生缩水反应，使得树脂上的多肽片段按照多肽TS1的C端到N端的顺序，依次延伸，得到连接在树脂上的目标多肽，使用裂解液（TFA：DCM=0.5:99.5）切割树脂即得到目标多肽中间体，中间体经纯化后，使用EDCI进行环合，得到环肽中间体，使用裂解液（TFA:EDT:TIPS:H₂O=95:2:1:2）切除环肽中间体上的保护基后获得目标环肽。

对目标环肽采用高效液相色谱进行纯化，色谱柱型号为Phenomenex C18，尺寸4.6×150mm，流动相A：含有0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)的水；流动相B：含有0.01％TFA(v/v)的乙腈溶液；50min内B相由5.0％上升到50.0％，流速3.0 mL/min，检测波长214nm。收集液相色谱纯化产物，并经液氮速冻、冷冻干燥得到TS-9。

经MS鉴定：冷冻干燥所得TS-9纯度达97.3%，分子量：1059.39，与理论分子量（1059.41）相符，证明制备获得的TS-9与理论设计相符。

其余多肽可参考TS-1或TS-9的方法制备获得，经MS鉴定结果如下表2所示。

表2

注：上表的氨基酸序列中，小写字母代表D型氨基酸，大写字母代表L型氨基酸。

实施例2 体外稳定性实验

按照如下的方法对本申请的实验肽进行稳定性试验：

标准液的配制：称取20mg实验肽用20mL的PBS溶解，做标准液；将标准液使用PBS稀释4倍后，作为对照溶液；

模拟人工胃液的配制：称取胃蛋白酶10mg，用4mL的PBS溶解，并使用1N的盐酸调pH至4~5，定容至10mL；将模拟人工胃液使用PBS稀释4倍后，作为模拟胃液背景；模拟人工肠液的配制：称取胰蛋白酶10mg，用10mL的PBS溶解；

将模拟人工肠液使用PBS稀释4倍后，作为模拟肠液背景。

（1）实验肽在模拟胃液中的稳定性实验

将标准液吸取1mL，加入1mL模拟人工胃液在37℃下反应1小时，取样，用液相色谱-质谱联用仪LCMS检测实验肽的纯度及丰度；减去模拟胃液背景的LCMS检测结果，得到实验肽在模拟胃液反应液中的稳定性检测结果。

（2）实验肽在模拟肠液中的稳定性实验

将标准液吸取1mL，加入1mL模拟人工肠液在37℃下反应1小时，取样，用液相色谱-质谱联用仪（LCMS）检测实验肽的纯度及丰度；减去模拟肠液背景的LCMS检测结果，得到实验肽在模拟肠液反应液中的稳定性检测结果。

对实验肽进行稳定性实验并通过LCMS检测的结果表明，在1mg/mL胃蛋白酶溶液或胰蛋白酶溶液中，本申请的实验肽（例如TS-1）可以稳定存在1小时而不发生降解。这意味着实验肽在胃蛋白酶或胰蛋白酶的作用下不会被分解，能够维持其化学结构和活性状态。由于LCMS是一种高灵敏度的分析方法，该结果表明实验肽在胃蛋白酶溶液中的稳定性较高，可能具有潜在的口服给药潜力。

实施例3 体外长期稳定性实验

按照如下的方法对本申请的实验肽进行长期稳定性试验：

将实验肽固体、其PBS溶液分别在4℃、室温、37℃温度条件下放置，并检测是否会变质。

（1）合成肽固体稳定性试验：

（1-1）将取210mg 实验肽于PE管中密封分别放置在4℃冰箱、室温和37℃培养箱中。

（1-2）使用温度控制设备（冰箱、培养箱）将容器内的温度调整到目标温度（冰箱4℃，培养箱37℃），并保持恒温。

（1-3）在实验期间，每天观察温度控制设备（冰箱、培养箱）的温度每隔7天进行一次纯度检测。纯度检测方法：使用LCMS检测纯度，方法同实施例1中的“纯度检测方法”。

（2）合成肽在PBS溶液中稳定性实验：

（2-1）将取210mg 实验肽溶于210 mL PBS溶液，平均分成三份于PE管中密封，分别放置在4℃冰箱、室温和37℃培养箱中。

（2-2）使用温度控制设备（冰箱、培养箱）将容器内的温度调整到目标温度（冰箱4℃，培养箱37℃），并保持恒温。

（2-3）在实验期间，每天观察温度控制设备（冰箱、培养箱）的温度每隔7天进行一次纯度检测，方法同实施例1中的“纯度检测方法”。

对实验肽进行长期稳定性实验的LCMS检测结果表明，本申请的实验肽（例如TS-1）分子固体和PBS溶液在4℃、室温和37℃条件下均能稳定存在30天。这表明实验肽对不同温度条件具有较高的稳定性，适合在这些温度范围内进行储存和应用。

实施例4 体外淀粉酶抑制活性测试实验

按照如下的方法对本申请的实验肽进行体外淀粉酶抑制活性测试实验：

（1）试剂配制：

DNS试剂的配制：甲液：将6.9 g结晶苯酚溶于15.2 mL10%NaOH溶液，蒸馏水稀释至69 mL，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠；乙液：将255 g酒石酸钾钠溶于300 mL10%NaOH溶液中，再加入880 mL1%的3，5-二硝基水杨酸溶液；将甲乙二溶液混合即得黄色DNS试剂，储于棕色瓶中放置7-10 d后使用。

猪胰α-淀粉酶溶液：称取50mg 猪胰α-淀粉酶加入100mL PBS溶解后，将溶液存放于4℃冷藏箱中。这种条件可确保α-淀粉酶在14天内保持活性。

淀粉溶液：在经过称取2.0g 淀粉并加入100mL 水升温至80℃溶解，搅拌3分钟后，自然放置室温备用。淀粉溶液室温下24小时内保持活性。

阳参溶液：称取10mg α-淀粉酶抑制剂（芸豆）并加入10mL PBS溶解后，将溶液存放于4℃冷藏箱中。这种条件可确保α-淀粉酶抑制剂（芸豆）在3天内保持活性。

（2）实验分组如下：

样品组：取200 μL的猪胰α-淀粉酶溶液(浓度为5 mg/mL)与200 μL α-淀粉酶抑制剂（实验肽或α-淀粉酶抑制剂（芸豆）(阳参)）混合；

空白组：不加猪胰α-淀粉酶、α-淀粉酶抑制剂（实验肽）；

空白对照组：不加α-淀粉酶抑制剂（实验肽或阳参）；

抑制对照组：不加猪胰α-淀粉酶。

将各实验组溶液混合后，涡轮振荡器混匀，于37℃水浴锅中水浴30 min，加入2%的可溶性淀粉150 μL，于37℃水浴锅中水浴30 min。加入350 μL DNS试剂，于沸水浴中水浴10min。冷却至室温，取一定体积的液体，稀释4倍后点于96孔板中，在540 nm处下测定其吸光度值。

通过下列公式计算α-淀粉酶抑制剂的抑制率：

抑制率= {1-（A4-A3）/(A2-A1)}×100%；

其中A1、A2、A3、A4分别为540 nm下的空白组、空白对照组、抑制对照组和样品组的吸光度值（Abs）。

通过体外酶活抑制实验的结果（如表3和图1）证明，本申请的实验肽具备良好的淀粉酶抑制功能，例如TS-1的浓度达到1mg/ml时，抑制率可达44%（参见图1）。

参考实施例1的线肽化合物的化学合成方法合成对照肽TS-D1（GHWYYRCW，SEQ INDO: 33）、TS-D2（FQSPRYSQ，SEQ IN DO: 34）和TS-D3（PLPLHMLP，SEQ IN DO: 35）作为对照。

下列表3中标注抑制率为各实验肽分子在0.5mg/mL浓度下的抑制率，可见本申请的各实验肽均能够满足对淀粉酶的抑制功能，其抑制率均达到10%以上，显著高于对照肽TS-D1、TS-D2和TS-D3的抑制率。

表3

实施例5 动物实验

参照保健品《减肥功能评价方法》中肥胖模型法记载的实验方案，委托南京博思生物医药技术有限公司进行第三方样品减肥、降糖功能小鼠实验。实验流程如图2。

适应期：于屏障系统下小鼠（C57b1/6J小鼠，购自上海必凯翼生物科技有限公司）喂饲维持饲料观察7天。

造模筛选期：

将小鼠十二指肠插管造模，适应期结束后按体重随机分成2组，5只小鼠给予维持饲料（维持饲料，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，货号：AIN-93M）作为空白对照组，40只给予高热量饲料（45%脂肪供能脂肪饲料，购自江苏省协同医药生物工程有限责任公司，货号：XTFH45）作为模型组。每周记录给食量、撒食量、剩食量，称量体重1次。喂养1周后，给予高热量饲料的小鼠按体重增重排序，淘汰体重增重较低的1/3肥胖抵抗小鼠。

造模期结束后，选取造模后体重在50-100g 之间的小鼠，雄性，经1周适应性饲养（单笼单养）。对所有动物进行称重，筛选体重均一的动物，按照表4，随机分组，每组5只动物，动物食物为高热量饲料。并记录摄食量。实验持续2周。

表4

分组当天定义为D0，试验期间，动物禁食，但自由饮水。动物是采取导管灌肠法给予受试物，每日三次；07：00 到 09：00、 13：00 到 15：00、19：00 到 21：00，给动物撒食，并记录摄食量。灌肠容量为 1 mL。血糖检测方法：每日一次，待动物摄食后给药后， 0 min、90min和180 min采尾静脉血，并测量血糖。

每天观察并记录动物的一般表现，行为、中毒表现和死亡情况。

15d试验终点处死动物，采血进行以下指标检查：血常规指标测定：测定红细胞计数、血红蛋白浓度、红细胞压积、白细胞计数及分类、血小板计数、依受试物情况必要时测定网织红细胞、骨髓涂片细胞学检查等；

血液生化指标测定：丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、谷氨酰转肽酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、血糖、血清白蛋白、总蛋白、总胆固醇及甘油三酯、氯、钾、钠指标。

称重获得心脏、胸腺、肾上腺、肝、肾、脾、睾丸的绝对重量，进而计算出相对重量（脏器/体重比值）。解剖取肾周围脂肪、睾丸周围脂肪，肝周围脂肪并称重，计算脂肪/体重比。

结果表明，本申请的实验肽对餐后（即淀粉负荷）血糖值具有显著降低效果，示例性的实验肽TS-1的小鼠餐后血糖变化如图3所示，TS-1实验肽的中剂量组在给药量为阳参一半的情况下，即达到了与阳参基本相当的效果。

本申请的的实验肽对小鼠体重降低效果显著，示例性的实验肽TS-1的小鼠实验过程中体重变化如图4所示，TS-1实验肽的中剂量组在给药量为阳参一半的情况下，即达到了与阳参基本相当的效果。

对本申请的实验肽的高中低三个剂量组在实验终点处的小鼠血液进行检测，结果表明，红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、白细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞）等血常规检测未呈现任何异常；与肝肾功能相关的酶或蛋白标记物未呈现任何异常表达；其他血指标未呈现任何异常表达，示例性的实验肽TS-1的部分实验结果如图5-图10所示。

对本申请的实验肽的高中低三个剂量组在实验终点小鼠脏器进行检测，结果表明，小鼠肝、肾、心、脾、胸腺、肾上腺、睾丸等器官相对重量未呈现任何异常的改变或影响，示例性的实验肽TS-1的实验结果如图11-图12所示。

即，在上述动物实验中，通过监测高热量食物负荷小鼠的血糖变化发现，高中低剂量组实验肽（例如TS-1）对小鼠餐后血糖均有明显控制作用，且对小鼠有控制体重的作用，整个给药期间小鼠状况良好，未观测到异常毒理反应，不同剂量的实验肽组的小鼠的各项血常规血生化指标正常，脏器未发生明显变化，也未观测到明显病变或病灶的发生，表明本申请的实验肽（例如TS-1）对小鼠无毒副作用。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种肽，其特征在于，包括8个相邻氨基酸X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈的氨基酸序列，所述肽的每个氨基酸各自独立地选自D型氨基酸或L型氨基酸，其中，X₂、X₄和X₆中的至少一位为W，且满足以下条件（1）至（3）中的任一组：

2. 根据权利要求1所述的肽，其特征在于，

X₁为D，X₃为A，X₅为E，X₇为D，或者

X₁为R，X₃为P，X₅为F，X₇为S，或者

X₁为L，X₃为V，X₅为G，X₇为R，或者

X₁为N，X₃为G，X₅为F，X₇为R，或者

X₁为S，X₃为Y，X₅为R，X₇为V，或者

X₁为E，X₃为K，X₅为H，X₇为W，或者

X₁为L，X₃为G，X₅为R，X₇为N，或者

X₁为V，X₃为R，X₅为P，X₇为Y。

3.根据权利要求2所述的肽，其特征在于，所述肽包含以下任一氨基酸序列：

DWAWEWDA （SEQ ID NO: 1）、RWPWFWSA（SEQ ID NO: 2）、LWVWGWRA（SEQ ID NO: 3）、NWGWFWRA（SEQ ID NO: 4）、SWYWRWVA（SEQ ID NO: 5）、EWKWHWWA（SEQ ID NO: 6）、LWGWRWNA（SEQ ID NO: 7）、VWRWPWYA（SEQ ID NO: 8）。

4. 根据权利要求2所述的肽，其特征在于，所述肽包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：22-30中的任意一个或多个所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽中，X₁为D，X₂为F，X₃为A，X₄为W，X₅为D，X₆为F，X₇为D，X₈为P；或

X₁选自E或A，X₂为F，X₃选自G或L，X₄选自Y，X₅选自D或A，X₆为W，X₇选自D或E，X₈选自W或A。

6.根据权利要求5所述的肽，其特征在于，所述肽包含以下任一氨基酸序列：

DFAWDFDP（SEQ ID NO: 9）、EFGYAWEW（SEQ ID NO: 10）、AFLYDWDA（SEQ ID NO: 11）。

7.根据权利要求5所述的肽，其特征在于，所述肽包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32中的任意一个或多个所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽包含以下任一氨基酸序列：

DWAYEWDA（SEQ ID NO: 12）、DFAWDWDA（SEQ ID NO: 13）。

9. 根据权利要求8所述的肽，其特征在于，所述肽包含SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20中的任意一个或多个所示的氨基酸序列。

10. 根据权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽为由8个氨基酸组成的多肽；和/或

所述肽为线性肽或环肽；和/或

所述肽在0.5mg/mL浓度下的体外淀粉酶抑制率为10%以上。

11.根据权利要求1所述的肽，其特征在于，所述肽中，X₄为D型氨基酸，X₁、X₂、X₃、X₅、X₆、X₇和X₈为L型氨基酸；或者

所述肽中，X₁至X₈均为L型氨基酸。

12. 根据权利要求1至11中任一项所述的肽，其特征在于，所述肽具有SEQ ID NO: 14-32中任意一个或多个所示的氨基酸序列。

13.一种核酸分子，其包含编码权利要求1-12中任一项所述的肽的核苷酸序列。

14.一种表达载体，其包含权利要求13所述的核酸分子。

15.一种宿主细胞，其包含权利要求13所述的核酸分子或权利要求14所述的表达载体。

16.药物组合物，其包含：根据权利要求1-12中任一项所述的肽、根据权利要求13所述的核酸分子、根据权利要求14所述的表达载体或根据权利要求15所述的宿主细胞；以及，药学上可接受的载体。

17.根据权利要求1-12中任一项所述的肽、根据权利要求13所述的核酸分子、根据权利要求14所述的表达载体、根据权利要求15所述的宿主细胞或根据权利要求16所述的药物组合物在制备α-淀粉酶抑制剂、减肥药物、降血糖药物或用于预防或治疗肥胖相关疾病的食品、保健品或药物中的应用。

18.根据权利要求17所述的应用，其特征在于，所述肥胖相关疾病包括肥胖症、心脑血管疾病、癌症、二型糖尿病、高血糖和高血压。